KR20070102566A - 인간 항-인터페론 감마 항체 및 이것의 사용 방법 - Google Patents

인간 항-인터페론 감마 항체 및 이것의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 인터페론 감마(hIFNγ)에 결합함으로써, IFNγ 및 이것의 수용체인 IFNγ-R 간의 상호작용을 조절하고/하거나, IFNγ의 생물학적 활성을 조절하는 완전 인간 항체 및 이것의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역 관련 질환의 예방 또는 치료, 및 면역 관련 질환과 관련된 증상의 개선에 있어 상기 항-IFNγ 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

인간 항-인터페론 감마 항체 및 이것의 사용 방법{HUMAN ANTI-INTERFERON GAMMA ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 일반적으로 완전 인간 항-인터페론 감마 항체 및 이것의 사용 방법에 관한 것이다.
인간 인터페론 감마(IFNγ, IFN-감마)는 활성화된 T-림프구 및 천연 킬러 세포에 의해 생산되는 림포카인이다. 이것은 항증식, 항바이러스성 및 면역조절 활성을 나타내고, 면역계의 대부분의 일차 세포 상에서의 IFNγ-R이라는 이형이합체성 수용체에 결합하여, 염증을 유발하는 일련의 단계적인 현상들을 촉발한다. IFNγ의 항바이러스성 및 면역조절 활성은 수많은 임상 상태들에 있어 유익한 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, IFNγ-활성이 해로운 효과를 가지는 것으로 알려진 임상 환경들도 많이 있다. 예를 들어, 자가면역 질환은 자가면역 환자로부터의 혈관 및 질환이 있는 조직에서의 높은 IFNγ 수준과 관련된다. IFNγ-활성은 또한 악액질 및 패혈성 쇼크와 같은 질환 상태들과 연관되었다.
따라서, IFNγ 활성을 표적으로 하는 치료법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 인터페론 감마(본원에서 IFN-감마라고도 칭해지는 IFNγ)에 대해 특이적으로 유도된 완전 인간 단클론 항체를 제공한다. 대표적 단클론 항체에는 NI-0501; AC1.2R3P2_A6(본원에서 "A6"라고도 칭해짐); AC1.2R3P2_B4(본원에서 "B4"라고도 칭해짐); AD1.4R4P1_B9(본원에서 "B9"라고도 칭해짐); AD1.4R4P2_C9(본원에서 "C9"라고도 칭해짐); AC1.4R4P2_C10(본원에서 "C10"라고도 칭해짐); AC1.2R3P7_D3(본원에서 "D3"라고도 칭해짐); AD1.2R2P2_D6(본원에서 "D6"라고도 칭해짐); AC1.2R2P2_D8(본원에서 "D8"라고도 칭해짐); AD1.3R3P6_E1(본원에서 "E1"이라고도 칭해짐); AD1.3R3P5_F8(본원에서 "F8"라고도 칭해짐); AD1.3R3P6_F9(본원에서 "F9"라고도 칭해짐); AD1.4R4P2_G7(본원에서 "G7"라고도 칭해짐); AD1.1R3P3_G9(본원에서 "G9"라고도 칭해짐); 및 AD1.3R3P6_G10(본원에서 "G10"라고도 칭해짐)이 포함된다. 대안적으로, 단클론 항체는 NI-0501; AC1.2R3P2_B4; AD1.4R4P1_B9; AD1.4R4P2_C9; AC1.4R4P2_C10; AC1.2R3P7_D3; AD1.2R2P2_D6; AC1.2R2P2_D8; AD1.3R3P6_E1; AD1.3R3P5_F8; AD1.3R3P6_F9; AD1.4R4P2_G7; AD1.1R3P3_G9; 또는 AD1.3R3P6_G10과 같은 에피토프에 결합하는 항체이다. 항체는 각기 본원에서 huIFNγ 항체로 칭해진다.
huIFNγ 항체는 서열 번호 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 또는 103의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부 및 서열 번호 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 또는 105의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부를 함유한다. 바람직하게, 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)은 SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5); DHSSGWYVISGMDV(서열 번호 13); DLTVGGPWYYFDY(서열 번호 21); DGWNALGWLES(서열 번호 29); SNAMS(서열 번호 43); TLTGSGGTAYYADSVEG(서열 번호 44); GTELVGGGLDN(서열 번호 45); RSFDSGGSFEY(서열 번호 64); VGSWYLEDFDI(서열 번호 69); GGNYGDYFDYFDY(서열 번호 76); 및 DFWVITSGNDY(서열 번호 89)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열; 및 TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8); EDNQRPS(서열 번호 9); QSYDGSNRWM(서열 번호 10); TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); EDNQRPS(서열 번호 17); QSNDSDNVV(서열 번호 18); DDDQRPS(서열 번호 25); QSYDSSNVV(서열 번호 26); TRSGGSIGSYYVQ(서열 번호 32); DDKKRPS(서열 번호 33); QSYDSNNLVV(서열 번호 34); TRSSGTIASNYVQ(서열 번호 39); QSYDNSNHWV(서열 번호 40); TGSGGSIATNYVQ(서열 번호 48); QSYDSDNHHVV(서열 번호 49); TGSSGSIASNYVQ(서열 번호 55); QSYDSSNQEVV(서열 번호 56); QSYDSNNFWV(서열 번호 61); TRSSGSIASNYVH(서열 번호 72); QSSDTTYHGGVV(서열 번호 73); QSYEGF(서열 번호 79); TGRNGNIASNYVQ(서열 번호 84); EDTQRPS(서열 번호 85); QSSDSNRVL(서열 번호 86); QSFDSTNLVV(서열 번호 92); AGSSGSIASNYVQ(서열 번호 97); QSYSYNNQVV(서열 번호 98); TRSSGSIVSNYVQ(서열 번호 106); EDNRRPS(서열 번호 107)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR을 갖는 경쇄를 포함한다. 항체는 IFNγ에 결합한다.
본 발명의 huIFNγ 항체는 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3) 또는 SNAMS(서열 번호 43)를 포함하는 VH CDR1 영역; 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4) 또는 TLTGSGGTAYYADSVEG(서열 번호 44)를 포함하는 VH CDR2 영역, 및 DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5); DHSSGWYVTSGMDV(서열 번호 13); DLTVGGPWYYFDY(서열 번호 21); DGWNALGWLES(서열 번호 29); GTELVGGGLDN(서열 번호 45); RSFDSGGSFEY(서열 번호 64); VGSWYLEDFDI(서열 번호 69); GGNYGDYFDYFDY(서열 번호 76); 및 DFWVITSGNDY(서열 번호 89)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역을 포함한다.
huIFNγ 항체는 TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8); TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); TRSGGSIGSYYVQ(서열 번호 32); TRSSGTIASNYVQ(서열 번호 39); TGSGGSIATNYVQ(서열 번호 48); TGSSGSIASNYVQ(서열 번호 55); TRSSGSIASNYVH(서열 번호 72); TGRNGNIASNYVQ(서열 번호 84); AGSSGSIASNYVQ(서열 번호 97); 및 TRSSGSrVSNYVQ(서열 번호 106)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; EDNQRPS(서열 번호 9); EDNQRPS(서열 번호 17); DDDQRPS(서열 번호 25); DDKKRPS(서열 번호 33); EDTQRPS(서열 번호 85) 및 EDNRRPS(서열 번호 107)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 QSYDGSNRWM(서열 번호 10); QSNDSDNVV(서열 번호 18); QSYDSSNVV(서열 번호 26); QSYDSNNLVV(서열 번호 34); QSYDNSNHWV(서열 번호 40); QSYDSDNHHVV(서열 번호 49); QSYDSSNQEVV(서열 번호 56); QSYDSNNFWV(서열 번호 61); QSSDTTYHGGVV(서열 번호 73); QSYEGF(서열 번호 79); QSSDSNRVL(서열 번호 86); QSFDSTNLVV(서열 번호 92); 및 QSYSYNNQVV(서열 번호 98)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함한다.
huIFNγ 항체는 예를 들어 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3) 또는 SNAMS(서열 번호 43)를 포함하는 VH CDR1 영역; 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4) 또는 TLTGSGGTAYYADSVEG(서열 번호 44)를 포함하는 VH CDR2 영역; DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5); DHSSGWYVISGMDV(서열 번호 13); DLTVGGPWYYFDY(서열 번호 21); DGWNALGWLES(서열 번호 29); GTELVGGGLDN(서열 번호 45); RSFDSGGSFEY(서열 번호 64); VGSWYLEDFDI(서열 번호 69); GGNYGDYFDYFDY(서열 번호 76); 및 DFWVITSGNDY(서열 번호 89)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8); TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); TRSGGSIGSYYVQ(서열 번호 32); TRSSGTIASNYVQ(서열 번호 39); TGSGGSIATNYVQ(서열 번호 48); TGSSGSIASNYVQ(서열 번호 55); TRSSGSIASNYVH(서열 번호 72); TGRNGNIASNYVQ(서열 번호 84); AGSSGSIASNYVQ(서열 번호 97); 및 TRSSGSIVSNYVQ(서열 번호 106)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; EDNQRPS(서열 번호 9); EDNQRPS(서열 번호 17); DDDQRPS(서열 번호 25); DDKKRPS(서열 번호 33); EDTQRPS(서열 번호 85) 및 EDNRRPS(서열 번호 107)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 QSYDGSNRWM(서열 번호 10); QSNDSDNVV(서열 번호 18); QSYDSSNVV(서열 번호 26); QSYDSNNLVV(서열 번호 34); QSYDNSNHWV(서열 번호 40); QSYDSDNHHVV(서열 번호 49); QSYDSSNQEVV(서열 번호 56); QSYDSNNFWV(서열 번호 61); QSSDTTYHGGVV(서열 번호 73); QSYEGF(서열 번호 79); QSSDSNRVL(서열 번호 86); QSFDSTNLVV(서열 번호 92); 및 QSYSYNNQVV(서열 번호 98)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함한다.
huIFNγ 항체의 중쇄는 예를 들어 DP47(IGHV3-23) 배선 유전자(GenBank 수탁 번호 M99660) 또는 인간 DP47 배선 유전자 서열에 상동성인 핵산 서열과 같은 배선 V(가변) 유전자로부터 유래된다. DP47(IGHV 3-23) 배선 유전자에 대한 핵산 서열은 예를 들어 하기 핵산 서열을 포함한다:
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGA(서열 번호 99).
huIFNγ 항체의 경쇄는, 예를 들어 IGLV6-57 또는 V1-22(GenBank 수탁 번호 Z73673) 또는 인간 IGLV6-57 배선 유전자 서열에 상동성인 핵산 서열과 같은 Ig 람다 경쇄 가변 영역 배선 유전자로부터 유래된다. IGLV6-57 배선 유전자에 대한 핵산 서열은 예를 들어 하기 핵산 서열을 포함한다:
AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAGCAGCAATCA(서열 번호 108)
또 다른 측면에서, 본 발명은 huIFNγ 항체를 피험체에 투여함으로써, 면역 관련 질환의 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, huIFNγ 항체는 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 유육종증, 류마티스성 관절염, 혈관염, 아토피성 피부염 및 이차적 진행성 다발성 경화증과 같은 면역 관련 질환과 관련된 증상을 치료, 예방 또는 경감시키기 위해 사용된다. 임의적으로, 피험체에, 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 및 IL-31과 같은 사이토카인, 및/또는 MIP1 알파, MIP1 베타, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF 및 프랙탈카인(fractalkine)과 같은 케모카인을 인식하는 항-사이토카인 또는 항-케모카인 제제를 포함하나 이에 한정되지 않는 2차 제제를 추가 투여한다.
피험체는 예를 들어 자가면역 질환 또는 염증성 질환과 같은 면역 관련 질환이 발병할 예후가 있거나 그러한 질환을 앓고 있는 자이다.
도 1은 huIFNγ 항체 NI-0501 및 AC1.2R3P2_A6의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 1a는 NI-0501의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 1b는 도 1a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. 상보성 결정 영역(CDR)은 도 1b에서 밑줄 그어져 있다. 도 1c NI-0501의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 1d는 도 1c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 1d에서 밑줄 그어져 있다. 도 1e는 AC1.2R3P2_A6의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 1f는 도 1e에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 1f에서 밑줄 그어져 있다. 도 1g는 AC1.2R3P2_A6의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 1h는 도 1g에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 1h에서 밑줄 그어져 있다.
도 2는 huIFNγ 항체 AC1.2R3P2_B4의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 2a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 2b는 도 2a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 2b에서 밑줄 그어져 있다. 도 2c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 2d는 도 2c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 2d에서 밑줄 그어져 있다.
도 3은 huIFNγ 항체 AD1.4R4P1_B9의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 3a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 3b는 도 3a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 3b에서 밑줄 그어져 있다. 도 3c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 3d는 도 3c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 3d에서 밑줄 그어져 있다.
도 4는 huIFNγ 항체 AD1.4R4P2_C9의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 4a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 4b는 도 4a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 4b에서 밑줄 그어져 있다. 도 4c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 4d는 도 4c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 4d에서 밑줄 그어져 있다.
도 5는 huIFNγ 항체 AC1.4R4P2_C10의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 5a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 5b는 도 5a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 5b에서 밑줄 그어져 있다. 도 5c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 5d는 도 5c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 5d에서 밑줄 그어져 있다.
도 6은 huIFNγ 항체 AC1.2R3P7_D3의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 6a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 6b는 도 6a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 6b에서 밑줄 그어져 있다. 도 6c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 6d는 도 6c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 6d에서 밑줄 그어져 있다.
도 7은 huIFNγ 항체 AD1.2R2P2_D6의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 7a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 7b는 도 7a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 7b에서 밑줄 그어져 있다. 도 7c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 7d는 도 7c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 7d에서 밑줄 그어져 있다.
도 8은 huIFNγ 항체 AC1.2R2P2_D8의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 8a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 8b는 도 8a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 8b에서 밑줄 그어져 있다. 도 8c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 8d는 도 8c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 8d에서 밑줄 그어져 있다.
도 9는 huIFNγ 항체 AD1.3R3P6_E1의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 9a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 9b는 도 9a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 9b에서 밑줄 그어져 있다. 도 9c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 9d는 도 9c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 9d에서 밑줄 그어져 있다.
도 10은 huIFNγ 항체 AD1.3R3P5_F8의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 10a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 10b는 도 10a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 10b에서 밑줄 그어져 있다. 도 10c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 10d는 도 10c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 10d에서 밑줄 그어져 있다.
도 11은 huIFNγ 항체 AD1.3R3P6_F9의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 11a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 11b는 도 11a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 11b에서 밑줄 그어져 있다. 도 11c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 11d는 도 11c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 11d에서 밑줄 그어져 있다.
도 12는 huIFNγ 항체 AD1.4R4P2_G7의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 12a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 12b는 도 12a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 12b에서 밑줄 그어져 있다. 도 12c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 12d는 도 12c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 12d에서 밑줄 그어져 있다.
도 13은 huIFNγ 항체 AD1.1R3P3_G9의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 13a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 13b는 도 13a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 13b에서 밑줄 그어져 있다. 도 13c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 13d는 도 13c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 13d에서 밑줄 그어져 있다.
도 14는 huIFNγ 항체 AD1.3R3P6_G10의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 일련의 도면들이다. 도 14a는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 14b는 도 14a에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 14b에서 밑줄 그어져 있다. 도 14c는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 도 14d는 도 14c에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. CDR은 도 14d에서 밑줄 그어져 있다.
도 15는 주변 세포질 scFv 추출물을 이용한 IFNγ-유도 리포터 유전자 발현의 억제를 나타내는 그래프이다. 정량화된 scFv 추출물은 용량 의존적 방식으로 IFNγ-유도 리포터 유전자를 억제하였다. 각 scFv 클론에 대해, 각 클론명 위의 컬럼으로 표시되는 바와 같이 다양한 농도(2.7, 0.68, 0.17, 0.043 및 0.011 nM)를 시험하였다(좌측에서 우측으로 농도가 감소됨. 하기 표 3 참고).
도 16, 패널 1-12는 scFv 추출물을 이용한 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현의 억제를 나타내는 일련의 그래프들이다. 정제된 완전 인간 scFv는 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC II 발현을 억제하였다. scFv 클론( ) 및 마우스 항-인간 IFNγ mAb 16C3(---)이 도시되어 있다.
도 17, 패널 1-7은 완전 인간 IgG 골격으로 재구성된 scFv 추출물을 이용한 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현의 억제를 나타내는 일련의 그래프들이다. 정제된 완전 IgG mAb는 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC II 발현을 억제하였다. 완전 IgG 클론(-x-), 마우스 항-인간 IFNγ mAb 16C3(-▲-), 및 R&D 시스템즈 인코포레이티드(R&D Systems, Inc.)(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) 마우스 항-인간 IFNγ MAB285(-●-)가 도시되어 있다.
도 18은 인간 IFNγ에 대한 NI-0501 huIFNγ 항체의 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 19는 A6 및 NI-0501(본원에서 "배선으로 역돌연변이된(back-mutated) A6" 또는 "역돌연변이된 A6"라고도 칭해짐) 클론에 의해 생산된 항체의 활성을 비교하는 그래프이다.
도 20은 천연(native) 인간 IFNγ에 대한 NI-0501 huIFNγ 항체의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 21a 내지 21f는 각종 종들로부터의 재조합 IFNγ와의 NI-0501 huIFNγ 항체의 결합을 나타내는 일련의 그래프들이다.
도 22는 천연 사이노몰거스(cynomolgus) IFNγ에 의해 유도된 MHC 부류 II 상향제어를 중화시키는 NI-0501 huIFNγ 항체의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 23은 전혈에서의 IFNγ-유도 IP-10 생산을 차단하는 NI-0501 huIFNγ 항체의 능력을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 인터페론 감마(IFNγ)에 대해 특이적인 완전 인간 단클론 항체를 제공한다. 항체는 본원에서 집합적으로 huIFNγ 항체로 칭해진다.
huIFNγ 항체는 예를 들어 IFNγ의 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하는 IFNγ 길항제 또는 억제제이다. IFNγ의 생물학적 활성에는 예를 들어 IFNγ 수용체(IFNγ-R)의 결합, 세포 표면 상에서의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 부류의 조절, 예컨대 감소 또는 억제, 및 세포 증식의 조절, 예컨대 감소 또는 억제가 포함된다. 예를 들어, huIFNγ 항체는 IFNγ 및 IFNγ 수용체(IFNγ-R)의 결합을 부분적으로 또는 완전히 차단함으로써, IFNγ 활성을 완전히 또는 부분적으로 억제한다. IFNγ 항체는 huIFNγ 항체의 존재 하에서의 IFNγ 활성의 수준이, 본원에 기재된 huIFNγ 항체의 부재 하에서의 IFNγ 활성의 수준에 비해, 95% 이상, 예컨대 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%만큼 감소할 때, IFNγ 활성을 완전히 억제하는 것으로 간주된다. IFNγ 항체는 huIFNγ 항체의 존재 하에서의 IFNγ 활성의 수준이, 본원에 기재된 huIFNγ 항체의 부재 하에서의 IFNγ 활성의 수준에 비해, 95% 미만, 예컨대 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90%만큼 감소할 때, IFNγ 활성을 부분적으로 억제하는 것으로 간주된다.
부가적으로, 본 발명의 huIFNγ 항체는 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현을 억제한다(예컨대, 실시예 4 및 5 참고). 바람직하게, huIFNγ 항체는 0.02 nM 이상의 농도에서 인간 흑색종 세포주 Me67.8에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현의 50% 초과 억제를 나타낸다. 예를 들어, 항체는 0.022 nM 내지 0.044 nM 범위의 농도, 예컨대 0.022 nM, 0.028 nM 또는 0.044 nM의 농도에서 Me67.8 세포주에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현의 50% 초과 억제를 나타낸다.
huIFNγ 항체는 피험체, 예컨대 인간 피험체에서 면역 반응을 조절한다. 바람직하게, huIFNγ 항체는 피험체에서 적응성 면역 반응을 조절한다. 더욱 바람직하게, huIFNγ 항체는 세포내 또는 Th1-type 또는 Th1-매개 반응으로도 알려진 세포 매개 반응을 조절한다.
예를 들어, 본원에 기재된 huIFNγ 항체는 과장된 Th1-매개 면역 반응, 예컨대 예를 들어 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 유육종증, 류마티스성 관절염, 혈관염, 아토피성 피부염 및 이차적 진행성 다발성 경화증과 같은 자가면역 또는 염증성 질환과 관련된 과장된 Th1-매개 면역 반응을 조절, 예컨대 감소, 억제 또는 방지한다. 본원에 사용되는 용어 "과장된" Th1-매개 면역 반응은 과장된 Th1 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 앓지 않는 피험체에서의 Th1 사이토카인 생산의 수준에 비해, 피험체에서의 상승된 수준의 Th1 사이토카인(들), 예컨대 IL-2, IL-3, TNF-알파(TNFα) 및 IFNγ의 존재를 지칭한다. Th1-매개 면역 반응을 과장된 반응으로 분류하기 위해, Th1 사이토카인 생산 반응의 수준을 예컨대 ELISA 또는 기타 검정법을 이용하여 분비된 사이토카인의 수준을 측정하고 분석함으로써 평가한다.
본원에 기재된 huIFNγ 항체는 IgG 이소타입에 대한 클래스 스위칭, 예컨대 IFNγ-유도 클래스 스위칭을 조절, 예컨대 억제, 감소 또는 방지한다. 이 huIFNγ 항체는 Th1-매개 반응을 조절, 예컨대 억제, 예방 또는 감소시키고, 궁극적으로 IFNγ-유도 스위칭을 감소시킨다.
본 발명의 huIFNγ 항체는 예를 들어 쥐 또는 인간 IFNγ와 같은 IFNγ(예컨대, GenBank 수탁 번호 X13274 참고) 또는 이것의 면역원성 단편, 유도체 또는 변이체를 이용하여 동물을 면역화함으로써 생산되었다. 대안적으로, 동물을 IFNγ를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 벡터로 형질도입된 세포로 면역화하여, IFNγ가 발현되어 형질도입된 세포의 표면에서 연합되도록 한다. 대안적으로, 항체는 IFNγ에 결합하기 위한 항체 또는 항원 결합 도메인 서열을 함유하는 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득된다. 이 라이브러리는 예컨대, 조립된 파지 입자의 표면 상에서 발현된 박테리오파지 코트 단백질, 및 파지 입자 내에 함유된 코딩 DNA 서열에 대한 단백질 또는 펩티드 융합체로서의 박테리오파지에서 제조된다(즉, "파지 디스플레이 라이브러리").
본 발명의 huIFNγ 항체는 예를 들어 하기 표 1에 제시된 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 표 2에 제시된 경쇄 CDR, 및 이들의 조합을 포함한다.
[표 1]
IFNγ에 결합하여 중화시키는 항체 클론으로부터의 VH 서열
[표 2]
IFNγ에 결합하여 중화시키는 항체 클론으로부터의 VL 서열
한 예시적 huIFNγ 단클론 항체가 본원에 기재된 NI-0501 항체이다. NI-0501 항체는 AC1.2R3.P2_A6 항체의 역돌연변이된 일 양태이다. 본원에 사용되는 용어 "역돌연변이된"은 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 배선 서열의 상응 위치에서 발견되는 뉴클레오티드 또는 잔기로 복귀하여 돌연변이하는 것을 지칭한다. NI-0501 항체는 서열 번호 1에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 2), 및 서열 번호 6에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함한다(도 1a-1d).
문헌 [Chothia et al. 및 E.A. Kabat et al.]에 의해 정의된 상보성 결정 영역(CDR)을 포괄하는 아미노산이 도 1b 및 1d에서 밑줄 그어져 있다. ([Chothia, C, et al, Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al, Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)] 참고). A6 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5). A6 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8); EDNQRPS(서열 번호 9); 및 QSYDGSNRWM(서열 번호 10).
또 다른 예시적 huIFNγ 단클론 항체는 본원에 기재된 AC1.2R3.P2_A6 항체("A6")이다. A6 항체는 서열 번호 102에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 103), 및 서열 번호 104에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 105)을 포함한다(도 1e-1h). 문헌 [Chothia et al. 및 E.A. Kabat et al.]에 의해 정의된 상보성 결정 영역(CDR)을 포괄하는 아미노산이 도 1f 및 1h에서 밑줄 그어져 있다. ([Chothia, C, et al, Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al, Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)] 참고). A6 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5). A6 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIVSNYVQ(서열 번호 106); EDNRRPS(서열 번호 107); 및 QSYDGSNRWM(서열 번호 10).
AC1.2R3P2_B4 항체(본원에서 "B4"라고도 칭해짐)는 서열 번호 11에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 12), 및 서열 번호 14에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 15)을 포함한다(도 2a-2d). [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 2b 및 2d에 밑줄 그어져 있다. B4 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DHSSGWYVISGMDV(서열 번호 13). B4 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSNDSDNVV(서열 번호 18).
AD1.4R4P1_B9 항체(본원에서 "B9"라고도 칭해짐)는 서열 번호 19에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 20), 및 서열 번호 22에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 23)을 포함한다(도 3a-3d). [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 3b 및 3d에 밑줄 그어져 있다. B9 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DLTVGGPWYYFDY(서열 번호 21). B9 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIVSNYVQ(서열 번호 8); DDDQRPS(서열 번호 25); 및 QSYDSSNVV(서열 번호 26).
AD1.4R4P2_C9 항체(본원에서 "C9"라고도 칭해짐)는 서열 번호 27에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 28), 및 서열 번호 30에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 31)을 포함한다(도 4a-4d). [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 4b 및 4d에 밑줄 그어져 있다. C9 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGWNALGWLES(서열 번호 29). C9 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSGGSIGSYYVQ(서열 번호 32); DDKKRPS(서열 번호 33); 및 QSYDSNNLVV(서열 번호 34).
AC1.4R4P2_C10 항체(본원에서 "C10"라고도 칭해짐)는 서열 번호 35에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 36), 및 서열 번호 37에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 38)을 포함한다(도 5a-5d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 5b 및 5d에 밑줄 그어져 있다. C10 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGSSGWYVPHWF DP(서열 번호 5). C10 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGTIASNYVQ(서열 번호 39); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSYDNSNHWV(서열 번호 40).
AC1.2R3P7_D3 항체(본원에서 "D3"라고도 칭해짐)는 서열 번호 41에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 42), 및 서열 번호 46에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 47)을 포함한다(도 6a-6d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 6b 및 6d에 밑줄 그어져 있다. D3 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SNAMS(서열 번호 43); TLTGSGGTAYYADSVEG(서열 번호 44); 및 GTELVGGGLDN(서열 번호 45). D3 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TGSGGSIATNYVQ(서열 번호 48); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSYDSDNHHVV(서열 번호 49).
AD1.2R2P2_D6 항체(본원에서 "D6"라고도 칭해짐)는 서열 번호 50에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 51), 및 서열 번호 53에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 54)를 포함한다(도 7a-7d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 7b 및 7d에 밑줄 그어져 있다. D6 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGWNALGWLES(서열 번호 29). D6 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TGSSGSIASNYVQ(서열 번호 55); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSYDSSNQEVV(서열 번호 56).
AC1.2R2P2_D8 항체(본원에서 "D8"라고도 칭해짐)는 서열 번호 57에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 58), 및 서열 번호 59에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 60)을 포함한다(도 8a-8d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 8b 및 8d에 밑줄 그어져 있다. D8 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGSSGWYVPHWF DP(서열 번호 5). D8 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSrVSNYVQ(서열 번호 8); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSYDSNNFWV(서열 번호 61).
AD1.3R3P6_E1 항체(본원에서 "E1"이라고도 칭해짐)는 서열 번호 62에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 63), 및 서열 번호 65에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 66)을 포함한다(도 9a-9d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 9b 및 9d에 밑줄 그어져 있다. E1 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 RSFDSGGSFEY(서열 번호 64). E1 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSrVSNYVQ(서열 번호 8); DDDQRPS(서열 번호 25); 및 QSYDSSNVV(서열 번호 26).
AD1.3R3P5_F8 항체(본원에서 "F8"라고도 칭해짐)는 서열 번호 67에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 68), 및 서열 번호 70에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 71)을 포함한다(도 10a-10d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 10b 및 10d에 밑줄 그어져 있다. F8 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 VGSWYLEDFDI(서열 번호 69). F8 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIASNYVH(서열 번호 72); EDNRRPS(서열 번호 9); 및 QSSDTTYHGGVV(서열 번호 73).
AD1.3R3P6_F9 항체(본원에서 "F9"라고도 칭해짐)는 서열 번호 74에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 75), 및 서열 번호 77에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 78)을 포함한다(도 11a-11d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 11b 및 11d에 밑줄 그어져 있다. F9 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 GGNYGDYFDYFDY(서열 번호 76). F9 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSYEGF(서열 번호 79).
AD1.4R4P2_G7 항체(본원에서 "G7"라고도 칭해짐)는 서열 번호 80에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 81), 및 서열 번호 82에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 83)을 포함한다(도 12a-12d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 12b 및 12d에 밑줄 그어져 있다. G7 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGWNALGWLES(서열 번호 29). G7 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TGRNGNIASNYVQ(서열 번호 84); EDTQRPS(서열 번호 85); 및 QSSDSNRVL(서열 번호 86).
AD1.1R3P3_G9 항체(본원에서 "G9"라고도 칭해짐)는 서열 번호 87에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 88), 및 서열 번호 90에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 91)을 포함한다(도 13a-13d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 13b 및 13d에 밑줄 그어져 있다. G9 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DFWVITSGNDY(서열 번호 89). G9 항체의 경쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); EDNRRPS(서열 번호 9); 및 QSFDSTNLVV(서열 번호 92).
AD1.3R3P6_G10 항체(본원에서 "G10"라고도 칭해짐)는 서열 번호 93에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역(서열 번호 94), 및 서열 번호 95에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역(서열 번호 96)을 포함한다(도 14a-14d). 문헌 [Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991]에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산이 도 14b 및 14d에 밑줄 그어져 있다. G10 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: SYAMS(서열 번호 3); AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4); 및 DGWNALGWLES(서열 번호 29). G10 항체의 중쇄 CDR은 하기 서열들을 가진다: AGSSGSIASNYVQ(서열 번호 97); EDNQRPS(서열 번호 17); 및 QSYSYNNQVV(서열 번호 98).
본 발명의 huIFNγ 항체는 서열 번호 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 또는 103의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% 이상 동일한 중쇄 가변 아미노산 서열(도 1-14) 및/또는 서열 번호 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 또는 105의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% 이상 동일한 경쇄 가변 아미노산(도 1-14)을 포함하는 항체를 또한 포함한다.
대안적으로, 단클론 항체는 NI-0501, A6, B4, B9, C9, C10, D3, D6, D8, E1, F8, F9, G7, G9 또는 G10과 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
또한, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수의 의미를 포함하고, 또한 복수 용어는 단수의 의미를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련된 용어 및 기술은 당 분야에 공지되어 통상적으로 사용되고 있는 것들이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질 전환(예컨대, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명서에 따르거나, 당업계에서 통상적으로 수행되는 바에 따르거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행한다. 상기 기술 및 과정은 일반적으로 당업계에 공지된 통상적 방법에 따르거나, 본 명세서를 통해 인용되고 논의된 각종 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌(예컨대 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)를 참고한다]에 기재된 바에 따라 수행한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약제 화학과 관련하여 사용된 용어, 그 실험 과정 및 기술은 당 분야에 공지되어 통상적으로 사용되고 있는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제형화, 전달 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
본 개시 내용과 관련하여 사용될 때, 하기 용어들은 달리 언급되지 않는 한, 다음과 같은 의미를 가지는 것으로 이해한다:
본원에 사용되는 "항체"란 면역글로불린(Ig) 분자, 즉 항원과 특이적으로 결합하는(면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 및 그러한 분자의 면역학적 활성 부분을 지칭한다. 그러한 항체는 다클론, 단클론, 키메라, 단일쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "특이적으로 결합한다" 또는 "면역반응한다"라는 표현은 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정 인자와 반응하며, 다른 폴리펩티드와는 반응(즉, 결합)하지 않거나 아주 낮은 친화도(Kd > 10-6)로 결합하는 것을 의미한다.
기본적 항체 구조 단위는 사합체인 것으로 알려져 있다. 각 사합체는 각 쌍이 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)로 이루어진, 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는, 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 항체 이소타입 IgM, IgD, IgA 및 IgE를 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 된 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, [Fundamental Immunology, Ch. 7, (Paul, W. et al., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))]을 참고한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에 사용되는 용어 "단클론 항체(MAb)" 또는 "단클론 항체 조성물"은 독특한 경쇄 유전자 생성물 및 독특한 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 단 하나의 항체 분자 종을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 특히, 단클론 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 그 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 그에 대한 독특한 결합 친화도에 의해 특성화되는 항원의 특정 에피토프에 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.
일반적으로, 인간으로부터 얻어지는 항체 분자는 분자 내에 존재하는 중쇄의 특성에 따라 서로 차이가 나는, 부류 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 어느 하나에 관련된 것이다. 어떤 부류는 IgG1, IgG2 등과 같은 하위부류를 가진다. 또한, 인간에 있어서, 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.
"항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"이라 불리우는, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 매우 다양성 있게 변화하는 부위가, "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 알려진 보다 보존적인 플랭킹 부위 사이에 존재한다. 따라서, 용어 "FR"이란 면역글로불린중 초가변 영역 사이에서 그에 인접하여 있는 것으로 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자 내에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역과 중쇄의 3개의 초가변 영역은 항원-결합 표면을 형성하도록 3차원 공간내에서 서로 상대적으로 배치되어 있다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 대하여 상보적이고, 경쇄 및 중쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 칭해진다. 각 도메인에 대한 아미노산의 명명은 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1987 및 1991)] 또는 [Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른 것이다.
본원에 사용되는 용어 "에피토프"는 면역글로불린, scFv, 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정 인자를 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정 인자를 포함한다. 에피토프 결정 인자는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 분자의 군으로 구성되며, 또한 대개 특정 3차원 구조적 특성 및 특정 하전 특성을 가진다. 항체는 해리 상수가 ≤ 1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 일컬어진다.
본원에 사용되는 용어 "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 성질"이란 면역글로불린 분자와 그 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 일어나는 형태의 비-공유결합 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있는데, 여기에서 Kd가 작다는 것은 친화도가 크다는 것을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 성질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정량화된다. 그러한 방법 중의 하나는 항원-결합 부위/항원 결합체의 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 포함하며, 이러한 속도는 결합체 파트너의 농도, 상호 작용의 친화도, 및 양방향의 속도에 균등하게 영향을 주는 기하학적 파라미터에 따라 변한다. 따라서, "온(on) 속도 상수(Kon)" 와 "오프(off) 속도 상수(Koff)"는 모두 농도 및 실제 결합 및 해리 속도를 계산하여 결정할 수 있다([Nature 361:186-87 (1993)]를 참고한다). Koff/Kon 비는 친화도와 관련되지 않은 모든 파라미터를 소거할 수 있게 하며, 해리 상수 Kd와 동등하다([Davies et al., (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)]를 참고한다). 본 발명의 항체는 방사성 리간드 결합 검정 또는 당업자에 알려진 유사한 검정법으로 측정할 경우, 평형 결합 상수(Kd)가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 10 nM, 및 가장 바람직하게는 ≤ 100 pM 내지 약 1 pM일 때, IFNγ 에피토프에 특이적으로 결합한다고 칭해진다.
한 인간 단클론 항체가, 본 발명의 인간 단클론 항체(예컨대, 단클론 항체 NI-0501, A6, B4, B9, C9, C10, D3, D6, D8, El, F8, F9, G7, G9 또는 G1O)가 IFNγ 항원 폴리펩티드에 결합하는 것을 방해하는지의 여부를 확인함으로써, 상기 인간 단클론 항체가 본 발명의 인간 단클론 항체와 동일한 특이성을 갖는지 여부를 과도한 실험없이도 결정할 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 본 발명의 단클론 항체에 의한 결합의 감소로서 나타나는 바와 같이, 시험되는 인간 단클론 항체가 본 발명의 인간 단클론 항체와 경쟁한다면, 두 단클론 항체는 동일하거나 밀접하게 연관된 에피토프에 결합한다. 한 인간 단클론 항체가 본 발명의 인간 단클론 항체의 특이성을 가졌는지 여부를 결정하는 또 다른 방법은, 본 발명의 단클론 항체를 그것이 통상적으로 반응성인 IFNγ 항원-폴리펩티드와 함께 예비인큐베이션한 다음 시험하고자 하는 인간 단클론 항체를 가하여, 시험 단클론 항체가 그의 IFNγ 항원 폴리펩티드에 결합하는 능력에 있어서 억제를 받는지 여부를 결정하는 것이다. 시험되는 인간 단클론 항체가 억제를 받는다면, 아마도 그 단클론 항체는 본 발명의 단클론 항체와 동일하거나 기능적으로 등가의 에피토프 특이성을 가질 것이다.
IFNγ 단백질과 같은 단백질, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체, 동족체 또는 오르쏘로그(ortholog)에 대해 유도된 단클론 항체를 생산하기 위해 당 분야에 공지된 각종 절차들이 사용된다(예컨대, 본원에 참고로 인용되는 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E. and Lane D. 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참고). 완전 인간 항체란, CDR을 포함하는 경쇄 및 중쇄의 전체 서열이 모두 인간 유전자로부터 유래된 것인 항체 분자이다. 그러한 항체를 본원에서는 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"라 한다. 인간 단클론 항체는, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 방법으로 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체는 또한 트라이오마(trioma) 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술([Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72] 참고); 및 인간 단클론 항체를 생산하는 EBV 하이브리도마 기술([Cole, et al., 1985, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참고)로도 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체는, 인간 하이브리도마를 이용하거나([Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030] 참고), 또는 시험관 내에서 인간 B-세포를 엡슈타인 바(Epstein Barr) 바이러스로 형질전환시켜([Cole, et al., 1985, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참고) 이용되거나 생산될 수 있다.
항체는 주로 면역혈청의 IgG 분획을 제공하는, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용한 친화도 크로마토그래피 등과 같은 공지된 기술로 정제한다. 후속하여, 또는 다른 방법으로서, 모색 면역글로불린의 표적인 특이적 항원 또는 그의 에피토프를 칼럼 상에 고정시키고, 면역친화도 크로마토그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제할 수 있다. 면역글로불린의 정제는, 예를 들어 [D. Wilkinson, The Scientist, The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28]에 논의되어 있다.
예컨대, 면역 관련 질환을 치료하는데 있어서의 유효성을 증진시키기 위해 본 발명의 항체를 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내로 도입시킴으로써, 이 영역에서 사슬 간 디술파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이합체성 항체는 개선된 내부화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다([Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992); 및 Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)] 참고). 다른 방식으로는, 항체가 이중의 Fc 영역을 갖도록 공학처리하여 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 갖도록 한다([Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)] 참고).
본 발명은 또한 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 huIFNγ 단편, 단일쇄 huIFNγ 항체, 이중특이적 huIFNγ 항체 및 이형접합체 huIFNγ 항체를 포함한다.
이중특이적 항체는 적어도 두 개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 IFNγ에 대한 것이다. 제2의 결합 표적은 다른 어떠한 항원이라도 무방하나, 유리하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초한다([Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)] 참고). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 할당으로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 열 개의 상이한 항체 분자들의 가능한 혼합물을 생산하며, 이들 중 단지 하나가 올바른 이중특이적 구조를 가진다. 올바른 항체 분자의 정제는 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 절차가 [WO 93/08829(1993년 5월 13일 공개); 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 하는 것이 바람직하다. 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및, 필요에 따라, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 개별적인 발현 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 유기체 내로 동시에 형질도입된다. 이중특이적 항체의 제조에 관한 더욱 구체적인 사항에 대해서는, 예를 들어 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참고한다.
WO 96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 공학처리하여 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이형이합체의 퍼센티지를 극대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 교체한다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 보다 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보완적 "동공"이 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 동형이합체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비해 이형이합체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술이 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]은 온전한 항체를 단백질 분해 절단하여 F(ab')2 단편을 생성시키는 절차를 기재하고 있다. 이러한 단편들은 근접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디술파이드 형성을 방지하기 위해, 디티올 착물화제 나트륨 아르세나이트 존재 하에 환원된다. 생성된 Fab' 단편들은 이어서 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원되어 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
부가적으로, Fab' 단편은 이. 콜라이(E. coli)로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]은 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 제조를 기재하고 있다. 각 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되어, 시험관 내에서 지정 화학적 결합을 행하여 이중특이적 항체를 형성하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양액으로부터 이중특이적 항체를 직접 생산하고 단리하는 각종 기술들이 기재되어 왔다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 루신 지퍼를 이용하여 생산되어 왔다([Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)] 참고). Fos 및 Jun 단백질로부터의 루신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 상이한 두 항체의 Fab' 부분에 결합시켰다. 항체 동형이합체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 후, 재산화시켜 항체 이형이합체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동형이합체를 생산하는데 사용될 수도 있다. [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)]에 기재된 "다이아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 메카니즘을 제공하였다. 단편은 중쇄 가변 도메인(VH)과, 동일한 사슬 상에 두 개의 도메인을 쌍 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 그에 연결된 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍 형성하게 됨으로써 두 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv(sFv) 이합체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]를 참고한다.
2개 초과의 결합 위치를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다[Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
예시적인 이중특이적 항체는 적어도 하나가 본 발명의 단백질 항원에서 유래되는 것인, 두 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 면역글로불린 분자의 항-항원성 암(arm)이 T-세포 수용체 분자(예컨대, CD2, IFNγ, CD28 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(IFNγ2) 및 FcγRIII(CD16)와 같은 림프구상의 촉발 분자에 결합하는 암과 결합하여 특정 항원을 발현하는 세포에 세포성 방어 메카니즘을 집중하도록 할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 특정 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 유도하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 항원-결합 암과 세포독성제 또는 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 같은 방사성 핵종 킬레이터에 결합하는 암을 가진다. 또 다른 관심 이중특이적 항체는 본원에 기재된 단백질 항원에 결합하고, 조직 인자(TF)에도 또한 결합한다.
이형접합체 항체도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이형접합체 항체는 두 개의 공유 결합된 항체로 이루어진다. 그러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화하거나(미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염증의 치료(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)를 위해 제안되어 왔다. 이들 항체는 가교결합제를 사용하는 것을 포함하는 방법들을 비롯한, 단백질 합성 화학 분야에 공지된 방법으로 시험관 내 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술파이드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성될 수 있다. 이러한 목적에 적당한 시약의 예에는 이미노티올레이트, 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 미국 특허 제4,676,980호에 기재된 것들이 포함된다.
본 발명은 또한 독소(예컨대, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편)와 같은 세포독성제, 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 기원), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데씬 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 샤란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 방사성 접합체 항체의 생산을 위해 각종 방사성 핵종이 이용가능하다. 그 예에는, 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re 등이 포함된다.
항체와 세포독성제의 접합체는 각종 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, l,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 핵종을 항체에 접합시키기 위한 한 예시적인 킬레이트제이다(WO94/11026 참고).
당업자는 생성된 항체 또는 본 발명의 다른 분자에 매우 다양한 종류의 가능한 잔기들을 커플링할 수 있다는 것을 인식할 것이다(예컨대, 전 개시내용이 본원에 참고로 인용되는 ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)]를 참고한다).
커플링은 항체와 다른 잔기가 그들 각각의 활성을 보유하는 한, 두 분자를 결합시키는 임의의 화학적 반응에 의해 달성된다. 이러한 연결은 공유 결합, 친화도 결합, 인터캘레이션, 배위 결합 및 착화를 포함하는 다수의 화학적 메카니즘을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 존재하는 측쇄를 직접 축합시키거나 외부 브릿지 분자를 혼입시켜 달성된다. 다수의 이가 또는 다가 연결제가 본 발명의 항체와 같은 단백질 분자를 다른 분자에 커플링하는데 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제는 티오에스테르, 카르보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민과 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 상기 열거에는 당 분야의 공지된 커플링제의 다양한 종류를 제한적으로 열거한 것이 아니라, 보다 통상적인 커플링제를 예시한 것에 지나지 않는다([Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 및 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참고). 바람직한 링커가 문헌에 기재되어 있다. (또한, 예를 들어 MBS (M-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 기재하고 있는 [Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)]를 참고한다). 또한, 올리고펩티드 링커를 통해 항체에 커플링된 할로겐화 아세틸 히드라지드의 사용을 기재하고 있는 미국 특허 제5,030,719호를 참고한다. 특히 바람직한 링커는 (i) EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드; (ii) SMPT (4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(피어스 케미칼 코포레이션(Pierce Chem. Co.), Cat. # 21558G); (iii) SPDP(숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트(피어스 케미칼 코포레이션, Cat # 21651 G); (iv) 술포-LC-SPDP(술포숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드]헥사노에이트(피어스 케미칼 코포레이션 Cat. #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 술포-NHS(N-히드록시술포-숙신이미드: 피어스 케미칼 코포레이션, Cat. #24510)를 포함한다.
상기한 링커들은 상이한 특징을 갖는 성분을 함유하므로, 상이한 물리화학적 성질을 갖는 접합체를 얻게 된다. 예를 들어, 알킬 카르복실레이트의 술포-NHS 에스테르는 방향족 카르복실레이트의 술포-NHS 에스테르보다 더 안정하다. NHS-에스테르 함유 링커는 술포-NHS 에스테르보다 덜 용해성이다. 또한, 링커 SMPT는 입체 장애 디술파이드 결합을 함유하고 있어, 더욱 안정하게 접합체를 형성할 수 있다. 디술파이드 결합은 일반적으로 다른 결합보다 덜 안정적이어서 시험관 내에서 절단되어 보다 적은 양의 접합체만이 남게 된다. 특히, 술포-NHS는 카르보디이미드 커플링의 안정성을 증진시킬 수 있다. 카르보디이미드 커플링(예컨대, EDC)은 술포-NHS와 함께 사용될 때, 카르보디이미드 커플링 반응 단독의 경우보다 가수분해에 보다 저항성인 에스테르를 형성한다.
본원에 사용되는 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"란 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 조합을 의미하고, 그 기원에 따라서 (1) 자연 상태에서 "단리된 폴리뉴클레오티드"가 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 결합되어 있지 않거나, (2) 자연 상태에서는 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있거나, (3) 보다 큰 서열의 일부로서 자연 상태에서는 나타나지 않는 것이다.
본원에 사용되는 용어 "단리된 단백질"이란 cDNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원의 단백질, 또는 그들의 조합으로서, 그의 기원 또는 유도된 공급원에 따라, "단리된 단백질"은 (1) 자연 상태에서 발견되는 단백질과 결합되어 있지 않거나, (2) 같은 공급원으로부터의 다른 단백질, 예를 들어 해양 단백질이 제거된 상태이거나, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연 상태에서는 발견되지 않는 것이다.
용어 "폴리펩티드"는 천연 단백질, 단편 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 총괄적으로 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 따라서, 천연 단백질 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종들이다. 본 발명에 따라 바람직한 폴리펩티드는 도 1b, 2B, 3B 및 4B에 나타낸 인간 중쇄 면역글로불린 분자, 도 1d, 2D, 3D 및 4D에 나타낸 인간 경쇄 면역글로불린 분자, 및 중쇄 면역글로불린 분자와, 카파 경쇄 면역글로불린 분자와 같은 경쇄 면역글로불린 분자와의 조합, 및 그 반대의 조합에 의해 형성된 항체 분자, 및 그들의 단편 및 유사체를 포함한다.
물체에 적용되어 본원에 사용되는 용어 "천연 발생"이란 어떤 물체가 천연 상태에서 발견될 수 있는 사실을 칭한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스 포함)중에 존재하고, 인간에 의해서 실험실에서 또는 어떤 다른 방식으로 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생적이다.
본원에 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"이란 성분들이 의도된 방식대로 기능하도록 배치된 상대적인 위치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 상용적인 조건 하에 달성되도록 하는 방식으로 코딩 서열이 결찰되어 있는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "조절 서열"이란 그에 결찰되어 있는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 수행하는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 그러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라지는데, 원핵 생물에서 그러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하며, 진핵 생물에서는 그러한 서열이 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소 한도에서, 발현 및 프로세싱을 위해 그의 존재를 필요로 하는 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 리더 서열 및 융합 파트너 서열과 같이 그의 존재가 유리한 추가의 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"란 염기 길이 10개 이상의 뉴클레오티드의 고분자 붕소를 말하며, 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이들 뉴클레오티드의 변형된 형태를 포함한다. 이 용어는 DNA 단일 및 이중 가닥 형태를 모두 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 천연 발생적 또는 비천연 발생적 올리고뉴클레오티드 연결기에 의해 서로 연결된 천연 발생적 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 200개 이하의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 하위군이다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 10 내지 60개 염기 길이, 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40개 염기 길이이다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 프로브에 있어서와 같이 보통 단일 가닥이지만, 유전자 변이주를 제작하는데 사용하는 경우 등에는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본원에 사용되는 용어 "천연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오티드"란 변형되거나 치환된 당 기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드 연결기"란 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다([LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108, F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991); Stec et al., 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990)] 참고). 올리고뉴클레오티드는 필요한 경우 검출용 표지를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "선택적으로 혼성화하다"란 검출가능하게 또한 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이들의 단편은 비특이적 핵산에 검출가능한 양으로 결합되는 것을 최소화하는 혼성화 및 세척 조건하에 핵산 가닥에 선택적으로 혼성화된다. 당 분야에 알려져 있고 본원에 논의된 바와 같이, 선택적 혼성화 조건을 달성하는데 고도로 엄격한 조건을 사용할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그들의 단편과 관심 핵산 사이의 핵산 서열 상동성은 80% 이상일 것이며, 더욱 전형적으로는 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 및 100%로 그 상동성이 증가될수록 바람직하다. 두 아미노산 서열 간에 부분적 또는 완전한 동일성이 있으면 그 두 아미노산 서열은 상동성이다. 예를 들어, 85% 상동성이란 두 서열을 최대 매칭을 위해 정렬하였을 때 아미노산의 85%가 동일한 것을 의미한다. 매칭을 최대화시킬 때 (매칭시킨 두 서열 중 어느 하나에 존재하는) 갭이 허용되며, 갭 길이는 5개 이하가 바람직하며, 2개 이하가 더욱 바람직하다. 대안적으로 또한 바람직하게는, 변이 데이터 매트릭스와 6 이상의 갭 패널티를 설정한 ALIGN 프로그램을 사용했을 때, 두 단백질 서열(또는 그로부터 유도된 길이 30개 아미노산 이상의 폴리뉴클레오티드 서열)이 5를 초과하는 정렬 점수(표준 편차 단위)를 나타낸다면, 본원에 그 용어가 사용될 때, 그 두 단백질 서열은 상동적이다([Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110(제5권, National Biomedical Research Foundation (1972)), 및 본권에 대한 부록 2, pp. 1-10] 참고). 보다 바람직하게는, ALIGN 프로그램을 사용하여 두 개의 아미노산 서열 또는 그 부분을 최적으로 정렬시켰을 때 아미노산이 50% 이상 동일한다면, 그 두 서열 또는 부분이 상동적이라 한다. 본원에 사용되는 "..에 상응한다"라는 것은 어떤 하나의 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열 전체 또는 그 부분과 상동적임(즉, 엄격하게 진화적으로 관련된 것이 아니라 동일하다는 것)을 의미하거나, 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 이와는 대조적으로, "상보적"이라 함은 상보 서열이 기준 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부와 상동성인 것을 말한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 상응하고, 기준 서열 "GTATA"에 상보적이다.
두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 관계를 기술하기 위하여, "기준 서열," "비교 윈도우," "서열 동일성," "서열 동일성(%)" 및 "실질적인 동일성" 등의 용어를 사용한다. "기준 서열"이란 서열 비교의 기초로 사용되는 정의된 서열로서, 보다 큰 서열의 하위군, 예를 들어 서열 목록에 주어진 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편일 수 있거나 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 기준 서열의 길이는 적어도 18개 뉴클레오티드 또는 6개 아미노산이며, 빈번하게는 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 8개 아미노산, 또는 종종 적어도 48개 뉴클레오티드 또는 16개 아미노산이다. 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 각각 (1) 두 분자 사이에서 유사한 서열 (즉, 완전 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 부분)을 포함할 수 있고, 또한 (2) 두 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에서 차이가 많이 나는 서열을 추가로 포함할 수 있기 때문에, 둘 (또는 그 이상)의 분자간의 서열 비교는 전형적으로는 서열 유사성의 국지적 영역을 찾아내고 비교하는 "비교 윈도우"에 걸쳐 두 분자간의 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에 사용되는 "비교 윈도우"란 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 적어도 18개의 연속되는 뉴클레오티드 또는 6개의 아미노산 서열의 기준 서열과 비교될 수 있는, 적어도 18개의 연속적 뉴클레오티드 위치 또는 6개의 아미노산 위치로 된 관념적인 서열 절편을 지칭하는 것으로, 두 서열의 최적 정렬을 위해서는 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 부분은 (추가 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교할 때 20% 이하의 추가, 결실, 치환 등(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우의 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 국지적 상동성 알고리즘[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)], 상동성 정렬 알고리즘[Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)], 유사도 방법을 위한 검색[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)], 이러한 알고리즘의 컴퓨터화 적용[위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 릴리이즈 7.0 중 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 진웍스(Geneworks), 또는 맥 벡터(Mac Vector) 소프트웨어 팩키지], 또는 검사에 의해 수행될 수 있으며, 각종 방법에 의해 산출된 최량의 정렬(즉, 비교 윈도우에 걸쳐 가장 높은 퍼센트의 상동성을 나타내는 것)을 선택한다.
용어 "서열 동일성"이란 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비교 윈도우에 걸쳐 동일(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 방식에 기초하여 동일)하다는 것을 말한다. "서열 동일성(%)"이란 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기(예컨대, A, T, C, G, U 또는 I), 또는 잔기가 나타나 매칭을 이루는 위치의 수를 결정하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우 내 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과 값에 100을 곱하여 서열 동일성(%)을 구함으로써 계산될 수 있다. 본원에 사용되는 "실질적인 동일성"이란 적어도 18개 뉴클레오티드(6개 아미노산) 위치의 비교 윈도우, 빈번하게는 적어도 24 내지 48개 뉴클레오티드 (8 내지 16개 아미노산) 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 기준 서열과 비교할 때, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95% 이상의 서열 동일성(%), 보다 통상적으로는 99% 이상의 서열 동일성(%)을 갖는 서열을 포함하는 경우의 특성을 나타내는 것으로, 여기에서 서열 동일성(%)은 기준 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 그의 총 20% 이하에 그치는 결실 또는 추가를 포함할 수 있는 서열과 비교하여 계산한다. 기준 서열은 보다 큰 서열의 하위군일 수 있다.
본원에 사용되는 20가지의 통상적 아미노산과 그의 약어는 종래의 방법에 따른 것이다([Immunology - A Synthesis (제2판, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991))] 참고). 20가지의 통상적 아미노산의 입체이성질체(예컨대, D-아미노산), α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산과 같은 비천연 아미노산 및 기타 통상적이지 않은 아미노산이 본 발명의 폴리펩티드의 적절한 성분으로 사용될 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예에는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, 0-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(예컨대, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본원에 사용되는 사용되는 폴리펩티드 명명법에서, 표준 사용법 및 규칙에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향은 카르복시 말단 방향이다.
유사하게, 달리 언급되지 않는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향이다. 생장하는 RNA 전사물의 5'에서 3' 부가 방향을 전사 방향이라 하고, RNA와 같은 서열을 가지며 RNA 전사물의 5' 말단에 대하여 5'인 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "상류 서열"이라 하며, RNA와 같은 서열을 가지며 RNA 전사물의 3' 말단에 대하여 3'인 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "하류 서열"이라 한다.
폴리펩티드에 적용되는 용어 "실질적인 동일성"이란 두 개의 펩티드 서열이 디폴트 갭 중량을 사용한 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.
보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 교체 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산, 및 아스파라긴-글루타민이다.
본원에 논의된 바와 같은, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에 있어서의 미소한 변화는, 그러한 아미노산 서열의 변화가 75% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 90%, 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 99% 이상을 그대로 유지하는 것인 한, 본 발명의 범주에 드는 것으로 구상된다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 구상된다. 보존적 치환은 아미노산의 측쇄에 있어서 서로 관련된 아미노산 족 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩되는 아미노산은 일반적으로, (1) 아스파르테이트, 글루타메이트로 이루어진 산성 아미노산; (2) 리신, 아르기닌, 히스티딘으로 이루어진 염기성 아미노산; (3) 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판으로 이루어진 비-극성 아미노산; 및 (4) 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신으로 이루어진 하전되지 않은 극성 아미노산 족으로 분류된다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 리신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 기타 아미노산 족으로서, (i) 지방족-히드록시 족의 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드-함유 족의 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 족의 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신; (iv) 방향족 족의 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다. 예를 들어, 루신이 이소루신 또는 발린으로, 아스파르테이트가 글루타메이트로, 트레오닌이 세린으로 단리 치환되거나, 또는 어떠한 아미노산이 구조적으로 관련이 있는 아미노산으로 유사하게 치환되는 경우, 특히 이러한 치환이 프레임워크 위치 내의 아미노산을 포함하지 않는 경우라면, 생성된 분자의 결합 또는 특성에 중대한 영향을 미치지 않을 것이라고 기대하는 것이 당연하다. 아미노산의 변화가 기능적 아미노산 펩티드를 생성하는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 비활성을 검정하여 쉽게 결정할 수 있다. 검정법은 본원에 상세히 기재되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 바람직한, 단편 또는 유사체의 아미노- 및 카르복시-말단은 기능적 도메인의 경계 부근에 있다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공지 또는 등록된 서열 데이터베이스와 비교하여 확인할 수 있다. 바람직하게, 컴퓨터화 비교 방법을 사용하여 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 나타나는 서열 모티프 또는 예상 단백질 구조 도메인을 찾아낼 수 있다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 동정하는 방법은 [Bowie et al., Science 253:164 (1991)]에 나타나 있다. 따라서, 상기한 예들은 당업자가 본 발명에 따라서 구조적 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용할 수 있는 서열 모티프 및 구조를 인식할 수 있다는 것을 보여준다.
바람직한 아미노산 치환은, (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키는 치환, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키는 치환, (3) 단백질 결합체를 형성하는 결합 친화도를 변화시키는 치환, (4) 결합 친화도를 변화시키는 치환, 및 (4) 그러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여 또는 수정하는 치환이다. 유사체는 천연 펩티드 서열이 아닌 여러 가지 변이 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 서열에 (바람직하게는 분자간 접촉점을 형성하는 도메인 외측의 폴리펩티드 부분에) 단일 또는 다중 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)을 만들 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다(예컨대, 치환된 아미노산은 모 서열에서 일어나는 나선형 구조를 깨거나 모 서열을 특징짓는 다른 이차 구조를 방해하는 경향이 나타나지 않을 것이다). 당 분야에서 인식된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et al., Nature 354:105 (1991)]에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 용어 "폴리펩티드 단편"이란, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 가지나, 잔여 아미노산 서열이, 예컨대 전장 cDNA 서열로부터 근원이 되는 천연 아미노산의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 말한다. 단편은 전형적으로는 5, 6, 8 또는 10개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 14개 이상의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 길이, 보통 50개 이상의 아미노산 길이, 더욱 더 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다. 본원에 사용되는 용어 "유사체"란 근원이 되는 아미노산 서열의 일부와 실질적으로 동일한 25개 아미노산 이상의 절편으로 이루어지는 것으로서, (1) 적절한 결합 조건하에 IFNγ에 특이적으로 결합하는 특성, (2) 적절한 IFNγ 결합을 블록킹하는 능력, 또는 (3) 시험관 내 또는 생체 내에서 IFNγ-발현 세포 성장을 억제하는 능력 중 한 가지 이상을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드 유사체는 전형적으로는 천연 서열과 관련하여 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 20개 이상 아미노산 길이, 바람직하게는 50개 이상 아미노산 길이이며, 종종 전장 천연 폴리펩티드와 같은 길이일 수 있다.
펩티드 유사체는 통상적으로 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 의약 산업 분야에서 사용된다. 이와 같은 비-펩티드 화합물 유형은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"로 칭해진다([Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS ρ.392 (1985); 및 Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987)]. 그러한 화합물은 종종 컴퓨터화 분자 모델링을 이용하여 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동등한 치료 또는 예방 효과를 얻기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 당업계 공지의 방법에 의해, 하나 이상의 펩티드 연결기가 --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH2--, CH(OH)CH2-- 및 --CH2SO--로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합으로 임의로 치환된다. 공통 서열의 하나 이상의 아미노산 서열을 같은 유형의 D-아미노산으로 체계적으로 치환하는 것(예컨대, L-리신 대신에 D-리신)은 보다 안정한 펩티드를 얻기 위해 사용할 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변형을 포함하는 속박형 펩티드는 당업계에 공지된 방법([Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)] 참고)으로, 예를 들어 펩티드를 고리화하는 분자내 디술파이드 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 가하여 제조할 수 있다.
본원에 사용되는 "제제(agent)"란 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 물질로부터의 추출물을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "표지" 또는 "표지된"이란 검출가능한 마커의 혼입으로서, 예를 들어 방사성 표지된 아미노산을 혼입하고 있거나, 폴리펩티드에 마킹된 아비딘(예컨대, 광학 또는 칼로리 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기를 결합시킴에 의한 상기 혼입을 지칭한다. 특정 경우에, 표지나 마커 자체가 치료 활성이 있는 것일 수도 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 여러 가지 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이를 사용할 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예는 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예컨대, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예컨대, FITC, 로다민, 란탄계열 형광체), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제, p-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광제, 비오티닐성, 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예컨대, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 표지는 가능한 입체 장애를 감소시키기 위하여 여러 길이의 스페이서 암을 통하여 부착될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "약제학적 제제 또는 약물"이란 환자에 적절하게 투여했을 때 원하는 치료 효과를 유도해 낼 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 기타 화학 용어는 [The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 예시된 바와 같이, 통상적인 용법에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "신생물 형성 방지제"는 인간에서 신생물, 특히, 암종, 육종, 림프종과 같은 악성 (암) 병변부 또는 백혈병의 발전 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 물질을 지칭한다. 전이 억제는 빈번하게 신생물 형성 방지제의 성질이다.
본원에 사용되는 "실질적으로 순수한"이란 대상이 되는 종이 우세하게 존재하는 종이고(즉, 몰 기준으로 조성물 중 다른 개별 종 보다 다량이고), 실질적으로 순수한 분획이란 바람직하게는 존재하는 모든 거대 분자 종 중에서 대상이 되는 종이 (몰 기준으로) 적어도 약 50% 이상을 차지하는 조성물을 지칭한다.
일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 대상 종이 조성물 내 존재하는 모든 거대 분자 종의 약 80%를 초과하는 양, 보다 바람직하게는 약 85%, 90%, 95% 및 99%를 초과하는 양으로 포함된 것이다. 가장 바람직하게, 대상 종은 조성물이 실질적으로 독특한 거대 분자종 만으로 이루어진, 실질적 균질의 상태(통상적 검출 방법으로는 조성물 중에 오염물 종을 검출해 낼 수 없는 상태)로 정제된다.
용어 환자란 인간 및 수의 동물을 포함한다. 용어 피험체에는 인간 및 기타 포유동물이 포함된다.
인간 항체 및 항체의 인간화
huIFNγ 항체는, 예를 들어 하기 제공되는 실시예에 기재된 절차를 이용하여 발생된다. IgG huIFNγ 항체는, 예를 들어 scFv 클론을 IgG 포맷으로 전환시킴으로써 발생된다(예컨대, 실시예 6 참고). 대안적으로, 예를 들어 오직 인간 서열만을 함유하는 항체를 사용한 파지-디스플레이법을 사용하여 huIFNγ 항체를 개발한다. 그러한 접근법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 본원에 참고로 인용되는 WO92/01047 및 미국 특허 제6,521,404호에 기재되어 있다. 이 접근법에서, 경쇄와 중쇄의 무작위 쌍을 수반하는 파지의 조합 라이브러리를 IFNγ 또는 그의 단편의 천연 또는 재조합 공급원을 사용하여 스크리닝한다.
huIFNγ 항체는, 적어도 하나의 단계가 트랜스제닉, 비인간 동물을 인간 IFNγ 단백질로 면역화시키는 것인 방법에 의해 생산된다. 이 이종 비인간 동물의 내생 중쇄 및/또는 카파 경쇄 좌위의 일부가 불능화되어, 항원에 반응하여 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 생산하는데 요구되는 재배열을 할 수 없다. 게다가, 적어도 하나의 인간 중쇄 좌위 및 적어도 하나의 인간 경쇄 좌위를 동물에 안정하게 형질도입한다. 따라서, 투여된 항원에 반응하여 인간 좌위가 재배열하여 그 항원에 대하여 면역특이적인 인간 가변 영역을 코딩하는 유전자를 제공한다. 따라서, 면역화 시에, 이종 마우스는 완전 인간 면역글로불린을 분비하는 B-세포를 생산한다.
이종 비인간 동물을 생산하는 각종 기술들이, 예컨대 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호를 포함하여, 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 전략으로, 이종(인간) 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 숙주 배선(예컨대, 정자 또는 난자) 내로 도입하고, 개별적인 단계에서 상응하는 숙주 유전자를 상동 재조합을 통해 불활성화시킴으로써 비기능적으로 만든다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 적절한 진핵 또는 원핵 미생물 중에서 재구성하고, 생성된 DNA 단편을 적절한 숙주, 예를 들어 수정된 마우스 난자의 전핵 또는 배아 줄기 세포에 도입한다. 숙주 고유의 면역 글로불린 좌위의 불활성화는 숙주 세포, 특히 배아 줄기세포 또는 수정된 난자의 전핵에서 상동 재조합에 의해 적절한 좌위를 표적화 파괴하여 달성된다. 표적화 파괴는 표적 좌위에 병변 또는 결실을 도입하거나, 표적 좌위에서 결실을 일으키는 동시에 그 좌위에, 예를 들어 선별 마커를 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 배아 줄기세포의 경우, 부분적으로는 변형된 배아 줄기세포로부터 유래하고, 배선을 통해 유전자 변형을 전달할 수 있는 키메라 동물이 생산된다. 인간 면역글로불린 좌위가 도입된 숙주와 불활성화된 내생 좌위를 갖는 동물주를 교배하면, 순수하게 이종, 예컨대 인간의 항체를 생산하는 동물을 얻는다.
한 대안적 전략으로, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 좌위의 적어도 일부를 사용하여, 배아 줄기세포중 상동 재조합에 의하여 상응하는 내생 면역글로불린 좌위를 직접 대체한다. 그 결과, 내생 면역글로불린이 불활성화되는 동시에 교체된다. 이어서, 배아 줄기세포 유래된 세포가 배선에 기여할 수 있는 키메라 동물이 생산된다.
예를 들어, 인간 항-IFNγ 항체를 발현하는 B 세포 클론을 이종 비인간 동물로부터 제거하고, 당업계에 알려진 각종 방법으로 불멸화시킨다. 그러한 B 세포는 동물의 혈액, 또는 비제한적으로는 비장, 편도, 림프절 및 골수와 같은 림프 조직으로부터 직접 유래할 수 있다. 생성된 불멸화 B 세포는 시험관 내에서 증량 및 배양되어 다량의, 임상적으로 적용할 수 있는 양의 huIFNγ 항체를 생산한다. 대안적으로, 하나 이상의 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 회수하여, 비제한적으로는 포유동물 배양계를 포함하는 분화하는 세포 유형에서 발현시켜, 단일쇄 Fv 분자로 이루어진 항체를 직접 얻거나, 그의 개개의 사슬을 얻을 수 있다.
게다가, 이종 비인간 동물에 의해 생산되는 전체 세트의 완전 인간 항-IFNγ 항체를 스크리닝하여, 최적의 특성을 갖는 하나의 클론을 동정할 수 있다. 그러한 특성은, 예를 들어 인간 IFNγ 단백질에 대한 결합 친화도, 상호작용의 안정성 및 완전 인간 항-IFNγ 항체의 이소타입을 포함한다. 이어서, 원하는 특성을 갖는 전체 세트로부터 선택된 클론을, 최종적으로 그러한 특성을 갖는 항체를 생산하기 위한 한 추가 조작을 위해, 통상적 재조합 또는 트랜스제닉 기술을 사용하여 다른 세포계에서 원하는 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 공급원으로서 사용한다.
이 일반적 전략은 1994년에 공개된 첫번째 제노마우스(XenoMouse)TM 주의 생산과 관련하여 입증되었다. [Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994)]를 참고한다. 이러한 접근법은 미국 출원 제07/466,008호(1990년 1월 12일 출원), 제07/610,515호(1990년 11월 8일 출원), 제07/919,297호(1992년 1월 24일 출원), 제07/922,649호(1992년 7월 30일 출원), 제08/031,801호(1993년 3월 15일 출원), 제08/112,848호(1993년 8월 27일 출원), 제08/234,145호(1994년 4월 28일 출원), 제08/376,279호(1995년 1월 20일 출원), 제08/430,938호(1995년 4월 27일 출원), 제08/464,584호(1995년 6월 5일 출원), 제08/464,582호(1995년 6월 5일 출원), 제08/463,191호(1995년 6월 5일 출원), 제08/462,837호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,853호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,857호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,859호(1995년 6월 5일 출원), 제08/462,513호(1995년 6월 5일 출원), 제08/724,752호(1996년 10월 2일 출원) 및 제08/759,620(1996년 12월 3일 출원), 및 미국 특허 제6,162,963호, 제6,150,584호, 제6,114,598호, 제6,075,181호 및 제5,939,598호, 및 일본 특허 제3 068 180 B2호, 제3 068 506 B2호, 및 제3 068 507 B2호에 상세히 논의되고 기재되어 있다. 또한, [Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997); Green and Jakobovits, J. Exp. Med.: 188:483-495 (1998)]을 참고한다. 또한, 유럽 특허 EP 0 463 151 B1(1996년 6월 12일 허여), 국제 특허출원 WO 94/02602(1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 WO 96/34096(1996년 10월 31일 공개), WO 98/24893(1998년 6월 11일 공개) 및 WO 00/76310(2000년 12월 21일 공개)를 참고한다.
한 대안적 접근법으로, 다른 이는 "미니좌위(minilocus)법"을 사용할 수 있다. 미니좌위 접근법에서, 외래 Ig 좌위로부터의 조각(개개의 유전자)을 함입시켜 외래 Ig 좌위를 모방한다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 영역 및 제2의 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)을 동물에 삽입하기 위한 작제물로 형성시킨다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,545,807호(Surani 등에게 허여), 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,877, 397호, 제5,874,299호, 및 제6,255,458호(각각 Lonberg 및 Kay에게 허여됨), 미국 특허 제5,591,669호 및 제6,023,010호(Krimpenfort 및 Berns에게 허여됨), 미국 특허 제5,612,205호, 제5,721,367호 및 제5,789,215호(Berns 등에게 허여), 및 미국 특허 제5,643,763호(Choi and Dunn, 및 GenPharm International에 허여), 국제 미국 출원 일련번호 제07/574,748호(1990년 8월 29일 출원), 제07/575,962호(1990년 8월 31일 출원), 제07/810,279호(1991년 12월 17일 출원), 제07/853,408호(1992년 3월 18일 출원), 제07/904,068호(1992년 6월 23일 출원), 제07/990,860호(1992년 12월 16일 출원), 제08/053,131호(1993년 4월 26일 출원), 제08/096,762호(1993년 7월 22일 출원), 제08/155,301호(1993년 11월 18일 출원), 제08/161,739호(1993년 12월 3일 출원), 제08/165,699호(1993년 12월 10일 출원), 제08/209,741호(1994년 3월 9일 출원)에 기재되어 있다. 또한, 유럽 특허 EP 0 546 073 B1, 국제 특허 출원 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 및 미국 특허 제5,981,175호, 및 [Taylor et al., 1992; Chen et al., 1993; Tuaillon et al., 1993; Choi et al., 1993; Lonberg et al., (1994); Taylor et al., (1994); Tuaillon et al., (1995); Fishwild et al,, (1996)]을 참고한다.
미니좌위법의 한 이점은 빠른 속도로 Ig 좌위의 일부를 포함하는 구조물을 생산하여 동물내로 삽입할 수 있다는 것이다. 그러나, 이론상으로 한 중요 단점은, 소수의 V, D 및 J 유전자를 함입함으로써 불충분한 다양성이 도입될 수 있다는 것이다. 실제로, 공개된 연구는 이러한 관건을 지지하는 것으로 보인다. 미니좌위법을 이용하여 생산된 동물의 B-세포 분화 및 항체 생산은 장애가 있는 것으로 보여진다. 따라서, 본 발명을 둘러싼 연구는 보다 큰 다양성을 얻고 동물의 면역 레파토리를 재구성하기 위해, 일관되게 큰 부분의 Ig 좌위를 도입하는 방향으로 진행되어 왔다.
마이크로셀 융합에 의해 큰 조각의 염색체 또는 전체 염색체가 도입된 마우스로부터의 인간 항체의 발생도 또한 입증되었다. 유럽 특허 출원 제773 288호 및 제843 961호를 참고한다.
인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응은 산업계로 하여금 키메라 또는 다른 방식으로 인간화된 항체를 제조하도록 하였다. 키메라 항체가 인간 불변 영역 및 면역 가변 영역을 가지고 있기는 하지만, 특정 인간 항-키메라 항체(HACA) 반응이 특히 항체를 장기적으로 또는 다량으로 투여하는 경우에 일어날 것으로 예상된다. 따라서, HAMA 또는 HACA 반응의 염려 및/또는 효과를 없애기 위해서는 IFNγ에 대한 완전 인간 항체를 제공하는 것이 바람직할 것이다.
감소된 면역원성을 갖는 항체의 생산은 적절한 라이브러리를 사용한 인간화 및 디스플레이 기술에 의해서도 달성될 수 있다. 쥐 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 당업계에 공지된 기술로 인간화 또는 영장류화될 수 있다. (예컨대, [Winter and Harris, Immunol Today 14:43 46 (1993); 및 Wright et al., Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)] 참고). 관심 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인 및/또는 프레임워크 도메인을 상응하는 인간 서열로 교체하기 위하여, 재조합 DNA 기술로 공학처리할 수 있다(WO 92102190 및 미국 특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호 및 제5,777,085호 참고). 또한, 키메라 면역글로불린 유전자를 제작하기 위해 Ig cDNA를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다([Liu et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987); 및 J. Immunol. 139:3521 (1987)] 참고). 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포로부터 mRNA를 단리하여 cDNA를 생산하는데 사용한다. 관심 cDNA를 특이적 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시킬 수 있다(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참고). 대안적으로는, 라이브러리를 만들어서 관심 서열을 단리하도록 스크리닝한다. 이어서, 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 인간 불변 영역 서열에 융합한다. 인간 불변 영역 유전자의 서열은 [Kabat et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication No. 91-3242]에서 찾아볼 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 공지된 클론으로부터 쉽게 얻을 수 있다. 이소타입의 선택은 보체 고정, 또는 항체 의존성 세포성 세포독성에서의 활성과 같은 원하는 이펙터 기능에 따른다. 바람직한 이소타입은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 즉 카파 또는 람다 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 이어서, 키메라 인간화된 항체를 통상적 방법으로 발현시킨다.
Fv, F(ab')2 및 Fab와 같은 항체 단편은 온전한 단백질을, 예컨대 프로테아제 또는 화학적 절단에 의해 절단하여 제조할 수 있다. 다른 방법으로는 절단된(truncated) 유전자를 설계한다. 예를 들어, F(ab')2 단편의 일부를 코딩하는 키메라 유전자는 H 사슬의 CH1 도메인 및 힌지 영역을 코딩하는 DNA 서열, 및 절단된 분자를 만들기 위한 그 뒤에 이어지는 번역 중지 코돈을 포함할 것이다.
H 및 L, J 영역의 공통 서열은 후에 V 영역 절편을 인간 C 영역 절편에 결합시키기 위한 J 영역 내로 유용한 제한 부위를 도입하기 위해 프라이머로서 사용될 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용될 수 있다. C 영역 cDNA는 인간 서열과 유사한 위치에 제한 부위를 배치시키기 위해 부위 지정 변이유발에 의해 변형될 수 있다.
발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, YAC, EBV 유도 에피좀 등을 포함한다. 편리한 벡터는 기능적으로 완전 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것으로서, 임의의 VH 또는 VL-31 서열이나 쉽게 삽입되어 발현될 수 있도록 공학처리된 적절한 제한 부위를 갖는 것이다. 그러한 벡터에서, 스플라이싱은 보통 삽입된 J 영역 중 스플라이스 제공자 부위와 인간 C 영역에 선행하는 스플라이스 억셉터 부위 사이에서 일어나며, 또한 인간 CH 엑손 내에 있는 스플라이스 영역에서 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역 하류의 본래의 염색체 부위에서 일어난다. 생성된 키메라 항체는, 예를 들어 SV-40 초기 프로모터와 같은 레트로바이러스 LTR(Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), 라우스(Rous) 육종 바이러스 LTR(Gorman et al., P.N.A.S. 79:6777 (1982)), 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl et al., Cell 41: 885 (1985))을 포함하는 강력 프로모터에 연결될 수 있다. 또한, 인식되어지는 바와 같이, 본래의 Ig 프로모터 등을 사용할 수 있다.
또한, 인간 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여, 디스플레이 유형 기술, 즉 비제한적으로는 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 기타 디스플레이 기술로 생산하여, 생성된 분자를 당 분야에 잘 알려진 기술로 친화도 성숙과 같이 추가로 성숙되도록 할 수 있다([Wright and Harris, 이하동문; Hanes and Plucthau, PEAS USA 94:4937-4942(1997)(리보솜 디스플레이); Parmley and Smith, Gene 73:305-318 (1988) (파아지 디스플레이); Scott, TIB5 17:241-245 (1992); Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990); Russel et al., Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993); Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130:43-68 (1992); Chiswell and McCafferty, TIBTECH; 10:80-8A (1992); 및 미국 특허 제5,733,7430호] 참고). 디스플레이 기술이 인간의 것이 아닌 항체를 생산하는데 사용되는 경우, 그러한 항체는 상기한 바와 같이 인간화될 수 있다.
이러한 기술 등을 사용하여 IFNγ 발현 세포, IFNγ 자체, IFNγ의 유형들, 그의 에피토프 또는 펩티드, 및 이들에 대한 발현 라이브러리에 대한 항체를 생산할 수 있으며(예컨대, 미국 특허 제5,703,057호 참고), 이들은 상기한 활성에 대하여 상기한 방법으로 후에 스크리닝할 수 있다.
다른 치료제의 설계 및 생성
본 발명에 따라서, 또한 IFNγ에 관하여 본원에서 생산되고 특성화된 항체의 활성에 기초하여, 항체 잔기를 초월한 다른 치료제 형태를 설계할 수 있다. 그러한 형태는 이중특이적 항체와 같은 진화된 항체, 면역 독소, 및 방사성 표지된 치료제, 펩티드 치료제의 생산, 유전자 치료, 특히 내분자, 안티센스 치료제, 및 소분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 이중특이적 항체와 관련하여, (i) 하나는 IFNγ에 대한 특이성을 갖고 다른 하나는 제2의 분자에 대한 특이성을 갖는, 서로 접합된 두 개의 항체, (ii) IFNγ에 대해 특이성을 나타내는 하나의 사슬과 제2의 분자에 특이성을 나타내는 제2의 사슬을 갖는 하나의 항체, 또는 (iii) IFNγ 및 다른 분자에 대해 특이성을 나타내는 단일쇄 항체를 포함하는 이중특이적 항체가 생산될 수 있다. 그러한 이중특이적 항체는 (i) 및 (ii)형에 관해서는 문헌[Fanger et al., Immunol Methods 4:72-81 (1994); 및 Wright and Harris, 이하동문] 등에도 기재된 공지된 기술을 사용하여, (iii)형에 대해서는 문헌[Traunecker et al., Int. J. Cancer (부록) 7:51-52 (1992)]에 공지된 기술을 사용하여 생산된다.
면역독소와 관련하여, 당업계에 알려진 기술을 사용하여 항체가 면역 독소로 작용하도록 변형될 수 있다(예컨대, [Vitetta, Immunol Today 14:252 (1993); 및 미국 특허 제5,194,594호] 참고). 방사성 표지된 항체의 제조와 관련하여, 그러한 변형도 또한 공지된 기술을 사용하여 쉽게 제조할 수 있다. 예컨대, [Junghans et al., Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686, 2nd edition, Chafher and Longo, eds., Lippincott Raven (1996); 미국 특허 제4,681,581호, 제4,735,210호, 제5,101,827호, 제5,102,990호(RE 35,500), 제5,648,471호, 및 제5,697,902호]를 참고한다. 각 면역 독소 및 방사성 표지된 분자는 IFNγ를 발현하는 세포, 및 특히 본 발명의 항체가 유효한 세포를 사멸시킬 것이다.
치료제 펩티드의 생성과 관련하여, IFNγ 및 그에 대한 항체, 예컨대 본 발명의 항체와 관련된 구조 정보를 이용하거나, 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 IFNγ에 대한 치료제 펩티드를 생산할 수 있다. 펩티드 치료제의 설계 및 스크리닝은 문헌[Houghten et al., Biotechniques 13:412-421 (1992); Houghten, PNAS USA 82:5131-5135 (1985); Pinalla et al., Biotechniques 13:901-905 (1992); Blake and Litzi-Davis, BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)]와 관련하여 논의되어 있다. 면역 독소와 방사성 표지된 분자도 또한 제조될 수 있는데, 항체와 관련하여 상기 논의된 펩티드 잔기와 관련하여 유사한 방식으로 제조될 수 있다. 질병 과정에서 IFNγ 분자(또는 스플라이스 변이체와 같은 한 형태 또는 다른 형태)가 기능적으로 활성이라고 가정하면, 종래의 기술을 사용하여 그에 대한 유전자 및 안티센스 치료제를 설계하는 것이 가능할 것이다. 그러한 형태는 IFNγ의 기능을 조절하는데 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체는 그와 관련된 기능적 검정법의 설계 및 사용을 용이하게 한다. 안티센스 치료제를 위한 설계 및 전략은 국제 특허 출원 WO 94/29444에 상세히 논의되어 있다. 유전자 치료를 위한 설계 및 전략은 잘 알려져 있다. 그러나, 특히, 내분자(intrabody)를 사용하는 유전자 치료 기술이 특히 유리한 것으로 밝혀질 것이다. 예컨대, [Chen et al., Human Gene Therapy 5:595-601 (1994); 및 Marasco, Gene Therapy 4:11-15 (1997)]를 참고한다. 유전자 치료제의 일반적인 설계 및 고려해야 할 사항이 또한 국제 특허 출원 WO 97/38137에 논의되어 있다.
IFNγ 분자의 구조 및 이것의 본 발명에 따른 항체와 같은 다른 분자와의 상호작용으로부터 얻어진 지식 및 기타 지식을 사용하여 추가의 치료제 형태를 합리적으로 설계할 수 있다. 이와 관련하여, 약물 발견의 노력에 초점을 두도록, X-선 결정법, 컴퓨터-지원(보조) 분자 모델링(CAMM), 정량적 및 정성적 구조-활성 관계(QSAR)과 같은 합리적인 약물 설계 기술 및 유사 기술을 사용할 수 있다. 합리적 설계는 IFNγ의 활성을 변화시키거나 조절하는데 사용할 수 있는 분자 또는 그의 특이적 형태와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 합성 구조물을 예측할 수 있게 한다. 그러한 구조는 화학적으로 합성되거나 생물학적 계에서 발현될 수 있다. 이러한 접근법은 [Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)]에서 검토되었다. 또한, 조합 라이브러리를 설계하고, 합성하고, 고생산량 스크리닝과 같은 스크리닝 프로그램에 사용할 수 있다.
치료제 투여 및 제형
본 발명에 따라서 치료제는 적절한 담체, 부형제, 및 개선된 전도, 전달, 허용성 등을 제공하기 위하여 제제에 혼입되는 기타 보조제 등과 함께 투여될 것임이 인지될 것이다. 적절한 많은 제형들이 모든 약학 화학자에게 알려진 제형화 기술에서 찾아볼 수 있다([Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)], 특히 [Chapter 87 by Blaug, Seymour]). 이러한 제형에는, 예를 들어 분제, 페이스트, 연고제, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포를 함유하는 (양이온성 또는 음이온성) 지질(예컨대, 리포펙틴(Lipofectin)TM, DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 젤, 및 카르보왁스를 함유하는 반-고체 혼합물이 포함된다. 제형이 중의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고, 제형이 생리학적으로 허용가능하고 투여 경로에 적합하다면, 상기한 혼합물 중 어느 것이나 본 발명에 따른 치료법에 적합할 수 있다. 또한, 약학 화학자들에게 알려진 제형, 부형제 및 담체 등에 관련된 추가의 정보를 제공하기 위해, [Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000); Wang W., "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000); Charman W. N. "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000); Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)], 및 여기에 인용된 문헌들을 참고한다.
본 발명의 huIFNγ 항체를 포함하는 본 발명의 치료 제형은 자가 면역 질환 또는 염증성 질환과 같은 면역 관련 질환과 관련된 증상을 치료 또는 완화시키기 위해 사용된다.
예를 들어, 크론병(CD)을 앓는 피험체에 huIFNγ 항체를 투여하는 것은 질환 유발 면역 세포에 직접 작용함으로써, 면역계의 억제를 최소로 하면서 급속한 개입을 제공할 수 있다. 전신성 홍반성 루푸스를 앓는 피험체에 huIFNγ 항체를 투여하는 것은, 질환의 원인이 될 수 있는 면역 세포를 변형시킬 수 있는 기회를 제공하는 또 다른 의료적 조치이다. 건선을 앓는 피험체에 완전 인간 단백질인 huIFNγ 항체를 투여하는 것은, 충분히 입증되지 않은 원치 않는 부작용(예컨대, 간 손상)을 가지는 더욱 공격적인 의약품(예컨대, 메토트렉세이트)으로 환자를 치료해야 하는 필요성을 없앤다. 류마티스성 관절염을 앓는 피험체에 huIFNγ 항체를 투여하는 것은 질환 유도 Th1-매개 반응의 상류 발생 및 기능을 조절할 기회를 제공하는 또 다른 의료적 조치이다.
자가면역 질환에는, 예를 들어 후천성 면역 결핍증(AIDS, 자가면역 요소를 갖는 바이러스성 질환), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항-인지질 증상, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질병(AIED), 자가면역 림프구증식증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근증, 복강 스프루-포진상 피부염, 만성 피로 면역 이상 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경증(CIPD), 반흔성 천포창, 한랭 응집소 질환, 릉(crest) 증상, 크론병, 데고스병, 소아 피부근염, 원판상 루푸스, 필수 혼합 크리오글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린 의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직 병증, 다발성 경화증, 중증성 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다분비선 증상, 류마티스성 다발성 근통, 다발근염 및 피부근염, 일차 무감마글로불린 혈증, 일차 담낭 경변, 건선, 건선 관절염, 레이노드 현상, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 공피증(진행성 전신성 경화증(PSS), 전신성 경화증(SS)으로도 알려짐), 쇼그렌 증후군, 전신 근강직성(stiff-man) 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 다카야스 동맥염, 일시적 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베그너 육아종증이 포함된다.
염증성 질환에는, 예를 들어 만성 및 급성 염증 질환이 포함된다. 염증성 질환의 예로는 알츠하이머병, 천식, 아토피 알러지, 알러지, 죽상동맥경화증, 기관지 천식, 습진, 사구체신염, 이식편 대 숙주 질환, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 졸중, 조직 및 장기의 이식, 혈관염, 당뇨성 망막증 및 환풍기 유도 폐 손상이 포함된다.
huIFNγ 항체는 피험체, 예컨대 인간 피험체에 있어 면역 반응을 조절한다. 예를 들어, 본원에 기재된 huIFNγ 항체는 과장된 Th1-매개 면역 반응, 예컨대 예를 들어 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 유육종증, 류마티스성 관절염, 혈관염, 아토피성 피부염 및 이차적 진행성 다발성 경화증과 같은 자가면역 또는 염증성 질환과 관련된 과장된 Th1-매개 면역 반응을 조절, 예컨대 감소, 억제 또는 예방한다. 과장된 Th1-매개 면역 반응에서, Th1 사이토카인(들), 예컨대 IL-2, IL-3, TNF-알파(TNFα) 및 IFNγ는 과장된 Th-1 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 앓지 않는 피험체에서의 Th1 사이토카인 생산 수준보다 높은 수준으로 피험체 내에 존재한다. Th1-매개 면역 반응을 과장된 반응으로 분류하기 위해, Th1 사이토카인 생산 반응의 수준을, 예컨대 ELISA 또는 기타 검정법을 이용하여 분비된 사이토카인의 수준을 측정 및 분석함으로써 평가한다.
본원에 기재된 huIFNγ 항체는 또한 IgG 이소타입에 대한 클래스 스위칭, 예컨대 IFNγ-유도 클래스 스위칭을 조절, 예컨대 억제, 감소 또는 예방한다. 이 huIFNγ 항체는 Th1-매개 반응을 조절, 예컨대 억제, 예방 또는 감소시키고, 궁극적으로 IFNγ-유도 스위칭을 감소시킨다.
한 실시양태에서, 면역 관련 질환을 치료하기 위해 사용되는 huIFNγ 항체 조성물은 다양한 항-사이토카인 제제 또는 항-케모카인 제제 중 임의의 것과 조합하여 투여된다. 적당한 항-사이토카인 또는 항-케모카인 제제는 예를 들어 사이토카인, 예컨대 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 및 IL-31, 및/또는 케모카인, 예컨대 MIP1 알파, MIP1 베타, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF 및 프랙탈카인을 인식한다.
본 발명은 또한 면역 관련 질환과 관련된 증상을 치료 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 자가면역 질환 및 염증성 질환의 증상을 치료 또는 경감시키기 위해 사용된다. 면역 관련 질환과 관련된 증상에는 예를 들어 염증, 열, 식욕 부진, 체중 감소, 복부 증상, 예컨대 복부 통증, 설사 또는 변비, 관절 통증 또는 관절 통증 또는 관절통(arthralgia), 피로, 발진, 빈혈, 한기에 대한 극심한 민감성(레이노드 현상), 근육 약화, 근육 피로, 피부 또는 조직 톤의 변화, 호흡 감축 또는 기타 이상 호흡 패턴, 가슴 통증 또는 가슴 근육의 경축, 이상 심장 박동 속도(예컨대, 상승 또는 저하), 광 민감성, 흐릿하거나 기타 이상 형태의 시력, 감소된 기관 기능이 포함된다.
huIFNγ 항체의 치료 제형을 면역 관련 질환, 예컨대 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓는 피험체에 투여한다. 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓는 피험체를 당업계에 공지된 방법에 의해 확인한다. 예를 들어, 크론병, 루푸스 또는 건선과 같은 자가면역 질환을 앓는 피험체를 신체 검사, 방사능 검사 및 혈액, 소변 및 대변 분석과 같은 임의의 다양한 임상적 및/또는 실험적 시험을 이용하여 면역 상태를 평가함으로써 확인한다. 예를 들어, 루푸스를 앓는 환자를 항-핵 항체 시험(ANA)을 이용하여 세포 핵에 대한 자가항체가 혈액 내에 존재하는지의 여부를 결정함으로써 확인한다. 크론병을 앓는 환자를 예컨대, 상부위장관(GI) 계 및/또는 대장내시경을 이용하여 소장 및 대장을 각기 평가함으로써 확인한다. 건선을 앓는 환자를 예컨대 적용된 피부 패치로부터 취한 조직을 현미경으로 관찰함으로써 확인하고, 한편 류마티스성 관절염을 앓는 환자는 예컨대 혈액 시험 및/또는 x-선, 또는 기타 영상화 평가를 이용하여 확인한다.
임의의 다양한 실험적 또는 임상적 결과가 달성될 경우, 면역 관련 질환, 예컨대 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓는 환자에게 huIFNγ 항체를 투여한다. 예를 들어, 면역 관련 질환, 예컨대 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓는 환자에게 huIFNγ 항체를 투여함은, 그 질환과 관련된 증상들 중 하나 이상이 경감, 감소 또는 억제되거나, 더욱 악화, 즉 더 열한 상태로 진전되지 않을 경우, 성공적인 것으로 간주된다. 면역 관련 질환, 예컨대 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓는 환자에게 huIFNγ 항체를 투여함은, 그 질환, 예컨대 자가면역 질환이 진정상태로 들어가거나, 더욱 악화, 즉 더 열한 상태로 진전되지 않을 경우, 성공적인 것으로 간주된다.
진단 및 예방용 제형
본 발명의 완전 인간 항-IFNγ MAb를 진단 및 예방용 제형에 사용한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 huIFNγ MAb를 상기한 자가 면역 질환 중의 하나로 발전할 위험이 있는 환자에 투여한다. 환자가 상기 자가 면역 질환들 중 하나 이상을 나타내게 되는 소인은 유전자형, 혈청학적 또는 생화학 마커를 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 자가면역 질환들 중 하나 이상으로 진단된 인간 개인에게 huIFNγ 항체를 투여한다. 진단 시, 자가 면역의 효과를 완화시키거나 역전시키기 위하여 huIFNγ 항체를 투여한다.
본 발명의 항체는 또한 환자 샘플 중 IFNγ를 검출하는데 유용하며, 따라서 진단제로서 유용하다. 본 발명의 huIFNγ 항체는 환자 샘플 중 IFNγ 수준을 검출하기 위한, 예를 들어 ELISA와 같은 시험관 내 검정법에 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 huIFNγ 항체를 고체 지지체(예컨대, 미량적정의 웰(들))에 고정시킨다. 고정화된 항체는 시험 샘플 중에 존재할 수 있는 임의의 IFNγ를 위한 포획 항체로서 작용한다. 고정화된 항체를 환자 샘플과 접촉시키기 전에, 고체 지지체를 헹구고 밍크 단백질 또는 알부민과 같은 차단 단백질로 처리하여 분석물이 비특이적으로 흡착되는 것을 방지한다.
후속하여, 웰을 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플로 처리하거나, 표준 함량의 항원을 함유하는 용액으로 처리한다. 그러한 샘플은, 예를 들어 병원학적 진단제로 간주되는 일정 수준의 순환 항원을 갖는 것으로 의심되는 피험체로부터의 혈청 샘플일 수 있다. 시험 샘플 또는 표준 용액을 헹군 후, 고체 지지체를 검출가능하게 표지화된 제2의 항체로 처리한다. 표지화된 제2 항체는 검출 항체로 작용한다. 검출 가능한 표지의 수준을 측정하고, 시험 샘플 중 IFNγ 항원의 농도를 표준 샘플로부터 작성된 표준 곡선과 비교하여 결정한다.
시험관 내 진단 검정에서 본 발명의 huIFNγ 항체를 사용하여 얻어진 결과에 기초하여, IFNγ 항원의 발현 수준에 기초하여 개체에 있어서의 질병(예컨대, 자가면역 또는 염증성 질환)의 단계를 결정할 수 있음이 인지될 것이다. 주어진 질병에 대하여, 질환 발전의 각 단계에 있고/있거나 질환 치료의 각 시점에 있는 것으로 진단된 피험체로부터 혈액 샘플을 채취한다. 각 진행 또는 치료 단계에 대해 통계학적으로 유의적인 결과를 제공하는 다수의 샘플을 사용하여, 각 단계의 특징으로 간주될 수 있는 항원의 농도 범위를 정한다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌은, 각 간행물이나 문헌에 대하여 전체적으로 본원에 포함되는 것으로 구체적으로 또한 개별적으로 언급되는 것과 같이 전체적으로 본원에 모두 인용된다. 간행물과 특허 문헌의 인용이 그들 중 어느 것도 선행 기술에 속한다는 것을 시인하는 것은 아닐 뿐만 아니라, 그 내용 및 일자와 관련하여서도 아무 것도 시인하는 것이 아니다. 본 발명을 지금 명세서를 통해 서면의 형식으로 기재하였지만, 본 발명이 각종 실시양태로 실시될 수 있다는 점과, 상기 상세한 설명 및 하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 제시되었을 뿐 이후 청구범위를 한정하려는 목적으로 제시된 것이 아님을 당업자는 인식할 것이다.
수행된 실험 과정 및 수득된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 본 발명을 예시할 목적으로 제공되는 것이므로, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: 인간 인터페론 감마의 클로닝, 발현 및 정제
클로닝.
인간 인터페론 감마(hIFNγ, huIFNγ)의 성숙 서열에 상응하는 서열을 특정 올리고뉴클레오티드를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 인간 cDNA로부터 증폭시켰다. 증폭 생산물을 겔-정제하여, pET41c 발현 벡터(노바겐(Novagen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 클로닝하였다. 벡터를 hIFNγ의 C-말단에 아비택(Avitag)TM(아비디티(Avidity), 미국 콜로라도주 덴버 소재) 및 옥타-히스티딘 택을 도입하도록 추가 변형시켜, 단백질을 생체 내 비오틴화하고, IMAC(고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피)에 의해 정제하였다.
발현.
E. 콜라이 BL21 세포에 아비택TM 서열의 생체 내 비오틴화에 필요한 BirA 효소를 코딩하는 pACYC 184-BirA 벡터 및 pET41 c-hIFNγ를 함께 형질도입하였다. 카나마이신(50 μg/ml) 및 클로람페니콜(10 μg/ml)에 대한 내성이 있는 단일 콜로니를 선택하여, LB 내 스타터 배양물(Kan 50 μg/ml/Cm 10 μg/ml)을 접종하는데 사용하였고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
그 다음 날, 배양물을 사용하여, 50 μM 비오틴으로 보충된 LB의 400 ml 배양물(Kan 50 μg/ml/Cm 10 μg/ml)을 접종(1:100 희석)하였다. 배양물을 0.6의 OD600에 도달할 때까지 진탕하면서(240 rpm), 37℃에서 배양하였다. 그 시점에, 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 1 mM의 최종 농도가 되도록 첨가하였고, 배양물을 동일한 조건 하에서 3시간 동안 추가 인큐베이션하였다. 세포를 20분 동안 4000 rpm에서 원심분리하였고, 펠릿을 -20℃에서 냉동시켰다. 이 조건 하에서, 본질적으로 모든 hIFNγ는 불용성이었고, 봉입체(inclusion bodies) 내에서 발견되었다.
정제.
박테리아 펠릿을 해동시켜, 8 ㎕의 벤조네이즈(Benzonaze)(노바겐)을 함유하는 8 ml의 버그버스터(Bugbuster)에 재현탁시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 용액을 30분 동안 4℃에서 15'00Og에서 원심분리하였다. 봉입체를 함유하는 펠릿을 7 ml의 가용화 완충액(50 mM Tris-HCL pH 7.4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM β-메르캅토에탄올, 6 M 구아니딘-HCl)에 재현탁시켰다. 재현탁된 물질을 15,00O g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다.
NiSO4가 로딩되고 가용화 완충액으로 평형화된 2개의 5 ml 하이 트랩 킬레이팅 칼럼(Hi Trap Chelating column)(아머샴(Amersham), 영국 버킹검샤이어 소재)을 제조자의 사용설명서에 따라 함께 연결하였다. 원심분리 단계 후 상등액을 0.45 μm 막 상에서 여과하였고, 1 ml/분으로 액체이송 펌프의 보조 하에 칼럼 상에 로딩하였다. 이어서, 칼럼을 온-칼럼 단백질 리폴딩 및 용리를 위한 AKTA 프라임 크로마토그래피 시스템에 두었다. 고정화된 단백질을 1 ml/분으로 35 ml의 가용화 완충액으로 세정하였다. 100% 리폴딩 완충액에 도달할 때까지, 리폴딩 완충액(50 mM Tris-HCL pH 7.4, 300 mM NaCl)의 농도를 증가시키는 가용화 완충액의 선형 구배를 1시간 동안 1 ml/분으로 적용하였다. 이어서, 칼럼을 25 ml의 리폴딩 완충액으로 추가로 세정하였다. 이어서, 리폴딩된 단백질을 용리 완충액(50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 400 mM 이미다졸)으로 칼럼으로부터 용리하였다. 단백질 함유 분획을 합하여, PBS로 평형화된 PD1O 칼럼(아머샴) 상에서 탈염하였다. 이어서, 탈염된 단백질을 분취하여, -80℃에서 저장하였다.
실시예 2: 세포 표면 상에서 인터페론 감마를 발현하는 세포
(ATCC로부터 입수가능한) 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 c-myc-태그가 있는 인간 IFNγ cDNA를 안정하게 형질도입하였다. cDNA를 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 pCDNA 3.1 플라스미드(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 서브클로닝하였다. 형질도입물을 이 항생제를 이용하여 선택하였고, 항-6xHis(시그마(Sigma)) 항체를 이용하여 유세포분류법에 의해 연속적 세포 분류를 수행하였다. 인간 IFNγ의 표면 발현을 항-IFNγ mAb(클론 B27, 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 미국 뉴저지주 프랭클린 소재)를 이용하여 유세포분류법을 통해 확인하였다.
실시예 3: 인간 scFv 라이브러리의 스크리닝
인간 scFv 라이브러리의 구축 및 취급에 관한 일반적 절차가 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 [Vaughan et al.,(Nat. Biotech. 1996, 14:309-314)]에 기재되어 있다. 인간 scFv의 라이브러리를 하기 절차에 따라 hIFNγ에 대해 스크리닝하였다.
액상 선택.
캠브리지 앤티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)(영국 캠브리지 소재)로부터 입수한 scFv 파지 라이브러리(1012 Pfu)의 분취물을 회전 믹서에서 1시간 동안 실온에서 3%(w/v) 탈지유를 함유하는 PBS로 차단하였다. 이어서, 차단된 파지를 회전 믹서에서 실온에서 1시간 동안 스트렙타비딘 자기 비이드(다이날(Dynal) M-280) 상에서 탈선택하였다. 이어서, 탈선택된 파지를 회전 믹서에서 실온에서 2시간 동안 생체 내 비오틴화 hEFNγ(100 nM)와 함께 인큐베이션하였다. 비이드를 자기 스탠드를 이용하여 포착한 후, PBS/0.1% Tween 20으로 4회 세정하고, PBS로 3회 세정하였다. 이어서, 비이드를 10 ml의 지수적 성장 TG1 세포에 직접 첨가하였고, 천천히 진탕하면서(100 rpm), 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 감염된 TG1의 분취물을 선택 산출량을 적정하기 위해 연속 희석하였다. 나머지 감염된 TG1를 15분 동안 3000 rpm으로 회전시키고, 0.5 ml 2xTY-AG(100 μg/ml 암피실린 및 2% 포도당 함유의 2xTY 배지)에 재현탁시키고, 2xTYAG 아가 생체검정 플레이트에 전착시켰다. 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 10 ml의 2xTYAG를 플레이트에 첨가하였고, 세포를 표면으로부터 긁어내어, 50 ml의 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다. 50% 글리세롤을 함유하는 2xTYAG를 최종 농도가 17% 글리세롤이 되도록 세포 현탁액에 첨가하였다. 선택 실행회(round)의 분취물을 -80℃에서 유지시켰다.
세포 표면 선택.
캠브리지 앤티바디 테크놀로지(영국 캠브리지 소재)로부터 입수한 scFv 파지 라이브러리(1012 Pfu)의 분취물을 회전 믹서에서 1시간 동안 실온에서 3%(w/v) 탈지유를 함유하는 PBS로 차단하였다. 이어서, 차단된 파지를 빈 pDisplay 벡터(T75 플라스크 80% 융합)가 형질도입되고, 2%(w/w) 탈지유 함유 PBS로 미리 차단된 CHO 세포 상에서 37℃/5% CO2 하에서 1시간 동안 탈선택하였다. 이어서, 탈선택된 파지를 완만히 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 CHO-pDisplay-hIFNγ 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 10회 세정하였다. 10 ml의 지수적 성장 TG1을 T75 플라스크에 첨가하고, 천천히 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 결합된 파지를 용리하였다. 감염된 TG1의 분취물을 선택 산출량을적정하기 위해 연속 희석하였다. 감염된 TG1를 15분 동안 3000 rpm으로 회전시키고, 0.5 ml 2xTY-AG(100 μg/ml 암피실린 및 2% 포도당 함유의 2xTY 배지)에 재현탁시키고, 2xTYAG 아가 생체검정 플레이트에 전착시켰다. 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 10 ml의 2xTYAG를 플레이트에 첨가하였고, 세포를 표면으로부터 긁어내어, 50 ml의 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다. 50% 글리세롤을 함유하는 2xTYAG를 최종 농도가 17% 글리세롤이 되도록 세포 현탁액에 첨가하였다. 선택 실행회의 분취물을 -80℃에서 유지시켰다.
파지 구제(rescue).
이전 선택 실행회로부터 수득된 100 ㎕의 세포 현탁액을 20 ml의 2xTYAG에 첨가하여, 0.3 내지 0.5의 OD600에 도달될 때까지 교반(240 rpm) 하에 37℃에서 배양하였다. 이어서, 배양물에 3.3x1010 MK13K07 헬퍼 파지로 수퍼-감염시키고, 37℃(150 rpm)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 배지를 바꾸었고, 배지를 제거하고 펠릿을 20 ml의 2xTY-AK(100μg/ml 암피실린; 50 μg/ml 카나마이신)에 재현탁시켰다. 이어서, 배양물을 30℃(240 rpm)에서 하룻밤 동안 배양하였다.
ELISA를 위한 단클론 파지 구제.
웰당 150 ㎕의 2xTYAG 배지(2% 포도당)를 함유하는 미량적정 플레이트에 단일 클론을 취하여 5 내지 6시간 동안 37℃(100 내지 120 rpm)에서 배양하였다. M13KO7 헬퍼 파지를 각 웰에 첨가하여, 10의 복수감염(MOI)(즉, 배양물 내 각 세포에 대해 10 파지)를 수득하고, 1시간 동안 37℃(100 rpm)에서 인큐베이션하였다. 배양한 후, 플레이트를 10분 동안 3,200 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하고, 세포를 150 ㎕ 2xTYAK 배지에 재현탁시켰으며, 30℃(120 rpm)에서 하룻밤 동안 배양하였다. ELISA를 위해, 5% 탈지유를 함유하는 150 ㎕의 2x 농도 PBS를 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써, 파지를 차단하였다. 이어서, 플레이트를 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 파지 함유 상등액을 ELISA를 위해 사용하였다.
파지 ELISA.
ELISA 플레이트(맥시소르브(Maxisorb), NUNC)를 PBS 내 2 μg/ml hIFNγ로 하룻밤 동안 코팅하였다. 대조군 플레이트를 2μg/ml BSA로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 3% 탈지유/PBS로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBS 0.05% 트윈(Tween) 20으로 3회 세정한 후, 예비-차단된 파지 상등액을 옮겨, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 0.05% 트윈 20으로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 3% 탈지유/(HRP)-접합 항-M13 항체 함유 PBS(아머샴, 1:10,000 희석)를 각 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS 0.05% 트윈 20으로 5회 세정하였다. 이어서, 50 ㎕의 TMB(시그마) 및 50 ㎕의 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 중단함으로써, ELISA를 나타내었다. 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
파지 클론 서열 분석
웰당 150 ㎕의 2xTYAG 배지(2% 포도당)를 함유하는 미량적정 플레이트에 단일 클론을 두고, 하룻밤 동안 30℃(120 rpm)에서 배양하였다. 그 다음 날, 5 ㎕의 배양물을 45 ㎕의 dH2O를 함유하는 또 다른 플레이트에 옮겨, 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 -20℃에서 냉동시켰다. 해동 후, 1 ㎕의 이 현탁액을, pCANTAB6: mycseq, 5'-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3'(서열 번호 100) 및 진3리더(gene3leader), 5'-TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT-3'(서열 번호 1O1)에 대해 특이적인 프라이머로 표준 PCR 프로토콜을 이용하여 PCR 증폭을 위해 사용하였다.
PCR 반응물을 몬타지(Montage) PCRμ96 시스템(밀리포어(Millipore))을 이용하여 96웰 형식으로 정제하였다. mycseq 및 진3리더 프라이머를 이용하여 5 ㎕의 용리된 DNA의 서열을 분석하였다.
기능 시험을 위한 ScFv 주변 세포질 제조.
개별 클론을 웰당 0.9 ml의 2xTYAG 배지(0.1% 포도당)를 함유하는 딥웰(deep well) 미량적정 플레이트에 접종하여, 5 내지 6시간 동안 37℃(250 rpm)에서 배양하였다. 2xTY 배지 내, 웰당 1OO ㎕의 0.2 mM IPTG를 첨가하여, 최종 농도가 0.02 mM IPTG가 되도록 하였다. 이어서, 플레이트를 250 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 딥웰 플레이트를 2,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 조심스럽게 제거하였다. 펠릿을 150 ㎕ TES 완충액(50 mM Tris/HCl(pH 8), 1 mM EDTA(pH 8), 20% 수크로스, 완전 프로테아제 억제제(로쉐(Roche))로 보충)에 재현탁시켰다. 150 ㎕의 희석된 TES 완충액(1:5 TES:물 희석)을 첨가하고, 30분 동안 빙상 인큐베이션함으로써 저장성 쇼크를 생성시켰다. 이어서, 플레이트를 10분 동안 4000 rpm에서 원심분리하여, 세포 및 파편물질를 제거하였다. 상등액을 또 다른 미량적정 플레이트에 옮겨, 기능적 검정법 또는 ELISA에서 즉시적 시험을 위해 빙상 유지시켰다.
대규모 scFv 정제
1 ml의 2Xtyag의 스타터 배양물에 새로 도말한 2xTYAG 아가 플레이트로부터의 단일 콜로니를 접종하여, 5시간 동안 37℃(240 rpm)에서 진탕하였다. 0.9 ml의 이 배양물을 사용하여 동일한 배지의 400 ml 배양물을 접종하였고, 격렬히 교반(300 rpm)하면서 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
그 다음 날, 400 ㎕의 IM IPTG 를 첨가함으로써 배양을 유도하였고, 부가적 3시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 4℃에서 10분 동안 5,000 rpm에서 원심분리함으로써 세포를 수집하였다. 펠릿화 세포를 상기와 같은 프로테아제 억제제로 보충된 10 ml의 빙냉 TES 완충액 내에 재현탁시켰다. 15 ml의 1:5 희석된 TES 완충액을 첨가하고, 빙상에서 1시간 인큐베이션함으로써 삼투압 쇼크를 달성하였다. 세포를 4℃에서 20분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 세포 잔해물을 펠릿화하였다. 상등액을 새 튜브에 조심스럽게 옮겼다. 이미다졸을 상등액에 첨가하여, 최종 농도가 10 mM가 되도록 하였다. PBS 내 평형화된 1 ml의 Ni-NTA 수지(키아겐(Qiagen))를 각 튜브에 첨가하고, 1시간 동안 4℃(20 rpm)에서 회전 믹서 상에 인큐베이션하였다.
관을 5분 동안 2,000 rpm에서 원심분리하였고, 상등액을 조심스럽게 제거하였다. 펠릿화 수지를 10 ml의 냉(4℃) 세정 완충액 1(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0)에 재현탁시켰다. 상등액을 폴리프렙(polyprep) 칼럼(바이오래드(Biorad))에 첨가하였다. 8 ml의 냉 세정 완충액 2(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여, 중력 유동으로 칼럼을 세정하였다. scFv를 2 ml의 용리 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0로)을 이용하여 칼럼으로부터 용리하였다. 분획을 280 nm 흡광도로 분석하였고, 단백질 함유 분획을 합한 후, PBS로 평형화된 PD10 탈염 칼럼(아머샴) 상에 완충액 교환하였다. PBS 내 scFv를 SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 280 nm에서의 흡광도로 정량화하였다. 정제된 scFv를 분취하여, -20℃ 및 4℃에서 저장하였다.
실시예 4: 인터페론 감마-유도 리포터 유전자 발현의 scFv 추출물 억제
각종 huIFNγ 항체의 주변 세포질 scFv 추출물을 상기와 같이 생산하였다. 고생산율 스크린 세포 기반 검정법을 이용하여, IFNγ 활성의 단일쇄 가변 단편(scFv) 블로커를 확인하였다. IFNγ-유도성 GBP1 프로모터에 의해 유도된 리포터 유전자(반딧불 루시퍼라제)를 인간 흑색종 세포주, Me67.8에 형질도입하였다. scFv 및 IFNγ 모두를 세포 배양물에 동시에 첨가하였다. 6시간 인큐베이션한 후, 루시퍼라제 리포터 검정을 수행하였다. 반딧불 루시퍼라제의 유도를 억제하는 것으로 나타난 scFv를 추가 확인 작업을 위해 보유하였다.
수가지 scFv 추출물은 용량 의존 방식으로 IFNγ-유도 리포터 유전자를 억제하였다(도 15). 도 15에 제시된 각 scFv 클론에 대해, 각종 농도(2.7, 0.68, 0.17, 0.043 및 0.011 nM)를 각 클론명 상의 열들에 의해 나타낸 바와 같이 시험하였다(농도가 좌측에서 우측으로 감소됨). 각종 농도에서의 각 scFv 추출물에 의해 나타난 억제율(%)을 하기 표 3에 기재하였다.
[표 3]
주변 세포질 scFV 추출물에 의한 IFNγ-유도 리포터 유전자 발현의 억제율(%)
실시예 5: 인터페론 감마-유도 MHC 부류 II 발현의 scFv 억제
IFNγ-유도 MHC 부류 II 분자의 발현을 차단할 수 있는 완전 인간 IgG 항체 또는 이것의 단편을 동정하기 위해 유세포분류 검정을 이행하였다. Me67.8 세포를 도말한 후, 5 ng/ml 재조합 인간 IFNγ를 각종 농도의 후보물질 완전 인간 항-IFNγ 단클론 항체의 존재 하에 배양물에 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후, 세포를 형광 표지화된 항-인간 MHC 부류 II 항체(HLA-DR)로 염색하고, 팍스칼리버(FACSCalibur)를 이용하여 분석하였다. 따라서, 각 후보물질 항체에 대한 IC50(IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현의 50%가 억제되는 농도, 즉 50% 억제 농도)을 측정한다.
정제된 완전 인간 scFv를 상기 실시예 1에서와 같이 생산하였다. 상기 유세포분류 세포 기반 검정법을 이용하여 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현에 대한 scFv의 영향을 평가하였다. 이 scFv는 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현을 억제하였다(도 16, 패널 1-12). 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현을 억제하는 상기 scFv 클론의 능력을 본원에서 16C3으로 칭해지는 마우스 항-인간 IFNγ mAb와 비교하였다. scFv 클론(-) 및 마우스 항-인간 IFNγ mAb 16C3(---)가 도 16에 도시되어 있다.
실시예 6: scFv의 IgG 형식으로의 리포맷
정제된 완전 인간 scFv를 상기 실시예 1에서와 같이 생산하였다. 선택된 scFv의 VH 및 VL 서열을 5' 말단에 HindIII 제한 부위 및 리더 서열을 도입하는 특정 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭시켰다. Apa1 또는 AvrII 부위를 중쇄 및 경쇄 서열의 3' 말단에 각각 도입하였다. 증폭된 VH 서열을 HindIII/Apa1로 분해하여, pCon_감마1 발현 벡터(론자(LONZA), 스위스 바젤 소재)로 증폭시켰다. 증폭된 VL 서열을 HindIII/AvrII로 분해하여, pCon_람다2 발현 벡터(론자)에 클로닝하였다. 포유동물 세포에 형질도입하기 전 서열 분석에 의해 구축물을 확인하였다.
적절한 발현 벡터 내의 VH 및 VL CDNA 서열을 퓨젠 6(Fugene 6) 형질도입 시약(로쉐, 스위스 바젤 소재)을 이용하여 포유동물 세포에 형질도입하였다. 간략히, 피크 세포를 우태 혈청 함유 2 ml 배지 내, 웰당 6x105 세포의 농도로 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 후보 VH 및 VL 서열을 코딩하는 발현 벡터를 제조자의 사용설명서에 따라 휴젠 6 형질도입 시약을 이용하여 세포에 동시 형질도입하였다. 형질도입 후 1일째에, 배지를 흡출하고, 3 ml의 새 무혈청 배지를 세포에 첨가하여 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 3일간의 배양 기간 후, 상등액을 수거하여, 단백질 G 칼럼으로 IgG를 정제하였다.
리포맷된 완전 IgG를, 제조자의 사용설명서에 따라 단백질 G-세파로스(Sepharose) 4B 패스트 플로우 칼럼(시그마, 미국 몬트리올주 세인트루이스 소재)을 이용하여 형질도입된 세포로부터의 무혈청 상등액으로부터 정제하였다. 간략히, 형질도입된 세포로부터의 상등액을 이뮤노퓨어(ImmunoPure)(G) IgG 결합 완충액(피어스(Pierce), 미국 일리노이즈주 로크포드 소재)을 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 단백질 G-세파로스 4B 패스트 플로우 칼럼에 통과시켜, 용리 완충액을 이용하여 IgG를 궁극적으로 정제하였다. 이어서, 용리된 IgG 분획을 PBS에 대해 투석하였고, IgG 함량을 280 nm에서의 흡광도로 정량화하였다. 순도 및 IgG 무결성은 SDS-PAGE로 확인하였다.
실시예 7: 리포맷된 scFv에 의한 인터페론 감마-유도 MHC 부류 II 발현의 억제
scFv를 상기와 같이 IgG 형식으로 리포맷하였다. 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현에 대한 IgG 클론의 영향을 실시예 2에서 상기 기재된 유세포분류 세포 기반 검정을 이용하여 평가하였다. 도 17, 패널 1-7에 제시된 바와 같이, 이 IgG 클론은 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현을 억제하였다. 이 IgG 클론의 흑색종 세포 상에서의 IFNγ-유도 MHC 부류 II 발현 억제 능력을, 마우스 항-인간 IFNγ mAb 16C3 및 R&D 시스템즈 마우스 항-인간 IFNγ 항체 MAB285와 비교하였다. 완전 IgG 클론(-x-), 마우스 항-인간 IFNγ mAb 16C3(-▲-), 및 R&D 시스템즈 인코포레이티드(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) 마우스 항-인간 IFNγ MAB285(-●-)가 도시되어 있다.
이 IgG 클론에 대한 IC50 값을 하기 표 4에 기재하였다.
[표 4]
완전 인간 항-IFNγ 단클론 항체의 IC50 분석
IgG mAb MHC II 억제세포 기반 분석IC50
16C3 100 pM
MAB285 400 pM
AC1.2R3P2_A6 41 pM
AD14R4P1_B9 322 pM
AC1.4R4P2_C10 203 pM
AC1.2R3P2_D8 708 pM
AD1.3R3P5_F8 1525 pM
AD1.3R3P6_F9 185 pM
AD14R4P2_G7 233 pM
실시예 8: 배선 서열로의 huIFNγ 항체 클론의 역돌연변이
본원에 기재된 연구들에서, A6 클론의 핵산 및 아미노산 서열에서의 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 배선 서열에서의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 상응하도록 돌연변이하였다. 본원에서 이 과정을 "역돌연변이"라 칭한다.
A6 중쇄: 항체 A6의 면역글로불린 중 가변 유전자는 인간 배선 DP-47 또는 IGHV3-23(GenBank 수탁 번호 M99660)에 대한 100% 상동성을 가졌다. A6의 면역글로불린 중 연합(IGHJ) 영역을 6개 인간 기능적 IGHJ 영역과 비교하였다. A6의 IGHJ 영역이 IGHJ2로 확인되었으나(하기 표 5A 참고), IGHJ5-02과의 보다 양호한 전체 상동성을 가졌다(하기 표 5B 참고). 그러므로, A6의 본래의 IGHJ 영역을 IGHJ5-02의 서열에 상응하도록 돌연변이하였으나, 다만 CDR3 외측 서열에 대해서만 그러하였다. 돌연변이된 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기가 표 5A 및 5B에서 상자 안에 표시되어 있고, CDR 영역은 밑줄 그어져 있다.
[표 5A]
A6와 인간 기능적 IGHJ2 유전자 간의 비교
[표 5B]
A6와 인간 기능적 IGHJ2-02 유전자 간의 비교
A6 경쇄: 항체 A6의 면역글로불린 람다 가변 유전자(VL)는 IGLV6-57 또는 V1-22 하위군(GenBank 수탁 번호 Z73673)에 속한다. A6-VL는 IGLV6-57에 비해 7가지 돌연변이를 가지고, CDR에서 3개 돌연변이를 가지며, 골격에서 4개 돌연변이를 가진다(하기 표 6 참고). 돌연변이된 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기가 표 6에서 상자 내에 표시되어 있고, CDR 영역은 밑줄 그어져 있다.
골격 영역 내 4개 돌연변이는, Kabat 위치 43에서의 골격 2 영역 내 Ser에서 Ala로; Kabat 위치 72에서는 골격 3 영역 내 Ser에서 Thr로; Kabat 위치 79 및 80에서의 골격 3 영역 내 Lys에서 GIu로, 및 Thr에서 Ala로의 돌연변이이다. 골격 영역 내 4개 돌연변이는 먼저 개별적으로, 그 후 모두 함께 상응하는 인간 배선 잔기로 변화된다. 이 3개 잔기의 상응하는 인간 배선 아미노산으로 복귀하여 돌연변이되는 것은, A6 항체에 비해, 이것의 표적 항원으로의, 본원에서 "역돌연변이된 A6"으로 칭해지는 NI-0501 항체의 결합 친화도를 어떠한 방식으로도 변경시키지 않았다. A6 VL 서열의 CDR1 내 상응하는 배선 잔기로(Ala에서 Val로), 또한 CDR2로(Gln에서 Arg로)의 돌연변이를 수행하였고, A6 항체에 비해, NI-0501 항체(역돌연변이된 A6)의 huIFNγ에 대한 전체 친화도를 변형시키지 않는 것으로 나타났다.
[표 6]
A6과 인간 기능적 IGHV6-57 유전자 간의 비교
NI-0501 중쇄 및 경쇄의 완전 서열이 도 1a-1d에 도시되어 있다. NI-0501 항체를 생산하기 위해 역돌연변이된 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기(즉, 원래의 A6 서열로부터 변화된 뉴클레오티드 및 잔기)가 도 1a 및 1c에 밑줄 그어져 있고 이탤릭체로 되어 있다.
실시예 9: huIFNγ 항체의 친화도 및 결합 동력학
NI-0501 huIFNγ 항체의 친화도 및 결합 동력학을 비아코어(Biacore) 2000 기기(비아코어 AB, 스웨덴 우프살라 소재)로 분석하였다. NI-0501의 200 RU를 C1 비아코어 칩 상에서 EDC/NHS 화학작용에 의해 고정화하였다. 200 nM 내지 1 nM의 농도에서 HBS-EP 완충액 내 hIFNγ(R&D 시스템즈)를 통과시킴으로써 결합을 측정하였다. 유속은 100 ㎕/분이었고, 온도는 25℃로 설정되었다. 데이터를 1:1 랑그무어(Langmuir) 모델에 따라 피팅하였고, Kon, Koff 및 KD 값을 결정하였다(도 18).
실시예 10: huIFNγ 항체의 활성
NI-0501 huIFNγ 항체의 활성을 클론 A6에 의해 생산된 항체(즉, A6 huIFNγ 항체)의 활성과 비교하였다. 이 연구에서, 각 huIFNγ 항체의, 인간 흑색종 세포주, Me67.8 상에서의 재조합 인간 IFNγ(rhuIFNγ)-유도 MHC 부류 II 상향제어를 억제하는 능력을 평가하였다. 간략히, 48-72 시간 동안 NI-0501 또는 A6 huIFNγ 항체의 존재 하에 Me67.8 흑색종 세포를 rhuIFNγ와 함께 인큐베이션하였다. MHC 부류 II 상향제어를 실시예 5에 있어 상기와 같이 측정하였다. 2개의 항체는 유사한 활성을 나타냈으며, 이는 NI-0501 huIFNγ 항체에서의 역돌연변이가 항체의 활성을 변형시키지 않았음을 입증한다(도 19).
이어서, NI-0501 huIFNγ 항체의 활성을 천연 IFNγ에 대하여 시험하였다. 이 연구에서, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 48시간 동안 1 μg/ml의 마이토젠 PHA로 활성화하였고, 상등액을 천연 IFNγ의 존재 하에 ELISA를 통해 시험하였다. 이어서, 이 상등액을 사용하여, Me67.8 세포 상에서 MHC 부류 II 상향제어를 자극하였다. NI-0501는 천연 인간 IFNγ에 의해 유도된 MHC 부류 II 상향제어를 중화할 수 있었다(도 20).
실시예 11: huIFNγ 항체 결합 검정의 교차 반응성
결합 검정: NI-0501를, 샌드위치 ELISA 형식 검정을 이용하여 IFNγ에 대한 결합 능력에 대해 시험하였다. 간략히, 도 21에 제시된 각 그래프의 제목에 언급된 종으로부터의 IFNγ가 예비-코팅된 NI-0501(-▲-) 또는 대조군 항-종 IFNγ mAb(-■-)로 기록되어 있다. 그 검정에서 IFNγ에 대해 특이적인 다클론 항체를 이용하여 각 종으로부터의 IFNγ를 검출하였다. 도 21에 제시된 바와 같이, 래트 IFNγ에 대해 결합하는 NI-0501는 대조군 항체와 유사하나, 사이노몰거스 원숭이를 제외한 다른 종에 대해서는 그러하지 않다.
IFNγ 활성의 중화: 항체 NI-0501을 수가지 상이한 종들로부터의 재조합 IFNγ 단백질을 중화하거나 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 간략히, 각종 피험 종으로부터의 재조합 IFNγ를 48-72 시간 동안 NI-0501의 존재 또는 부재 하에 Me67.8 세포와 함께 배양물 내에 두었다. MHC 부류 II 상향제어를 실시예 5에서 상기 기재된 바대로 측정하였다. 사이노몰거스 IFNγ의 교차 반응성 및 중화를, 인간 흑색종 세포주, Me67.8 상에서의 MHC 부류 II 상향제어를 억제함으로써 입증하였다(도 21). NI-0501는 사이노몰거스 원숭이로부터의 IFNγ는 억제할 수 있었으나, 다른 피험 종으로부터의 IFNγ는 중화할 수 없었으며, 이는 이 종들과의 항체의 교차 반응성이 없음을 입증한다(표 7).
[표 7]
NI-0501의 교차 반응성
(nhu = 천연 인간 IFNγ
rhu = 재조합 인간 IFNγ
ncy = 천연 사이노몰거스 IFNγ
rcy = 재조합 사이노몰거스 IFNγ
rd = 재조합 개 IFNγ
rc = 재조합 고양이 IFNγ
rr = 재조합 래트 IFNγ
rm = 재조합 마우스 IFNγ
+ = 교차 반응함
- = 교차 반응하지 않음
* = 시험하지 않음)
또한, 사이노몰거스 PBMC를 48시간 동안 1 μg/ml의 마이토젠 PHA로 활성화하였고, 상등액을 천연 IFNγ의 존재 하에 ELISA를 통해 시험하였다. 이어서, 이 상등액을 사용하여, Me67.8 상에서의 MHC 부류 II 상향제어를 자극하였다. NI-0501은 천연 사이노몰거스 IFNγ에 의해 유도되는 MHC 부류 II 상향제어를 중화할 수 있었다(도 22).
실시예 12: huIFNγ 항체의 생물학적 활성
본원에 기재된 연구는 사이노몰거스 원숭이에 대한 투여 시, NI-0501 huIFNγ 항체의 생물학적 활성을 시험하기 위해 설계되었다. NI-0501은 본원에 기재된 안정성 및 약동학적 성질(PK) 연구를 위해 선택되었으며, 이는 이 huIFNγ 항체가 상기 기재된 바와 같이, 사이노몰거스 원숭이로부터의 IFNγ와 교차 반응하는 것으로 나타났기 때문이다. 다중 정맥내 주입 후 임상적 부작용을 평가하기 위해, 원숭이에 하기 용량들을 주입한다: 30 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg.
파괴된 IFNγ 유전자를 갖는 마우스에서, 감소된 수준의 IgG2a 및 증가된 수준의 IgG1이 KLH 면역화에 대한 반응으로 관찰되었고, 이는 IFNγ와 IgG 반응 간의 상호 관련을 입증한다. 13주 주요 독성 연구 중에, 원숭이를 불완전 프로인트 보조제(IFA) 내 KLH로 면역화한다. 위약으로 공동 처리된, 원숭이 내 KLH/IFA에 대한 한 전형적 면역 반응은 혈청에서 검출가능한 KLH-특이적 IgM 및 IgG 반응을 도출한다. 이 연구들은 IFA 내 KLH로 면역화된 NI-0501-처리 원숭이 내 IFNγ의 중화가 KLH-특이적 IgG 역가를 변경시키는지의 여부를 평가하기 위해 설계되었다.
실시예 13: huIFNγ 항체를 이용한 IFNγ 활성의 조절
케모카인 IP-10의 생산은 수가지 상이한 세포주에서 IFNγ에 의해 상향제어된다. 이 관찰에 기초하여, 전혈 검정을 개발하였다. 이 전혈 검정에서, 수개 제공자로부터의 전혈 샘플을 고정 농도의 IFNγ 및 상이한 농도들의 NI-0501과 혼합하였다. 인큐베이션 후, IP-10의 생산을 차단하기 위한 항-IFNγ 항체의 효능을 평가하는 수단으로서 ELISA에 의해 IP-10 수준을 측정하였다(도 23).
기타 실시양태
본 발명을 본 발명의 상세한 설명과 관련하여 기술하였지만, 상기 기재는 첨부된 특허 청구범위에 의해 정의되는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 그의 범주를 한정하려는 것이 아니다. 다른 관점, 이점 및 변형예가 하기 특허청구의 범주 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NovImmune S.A. <120> Anti-Interferon Gamma Antibodies and Methods of Use Thereof <130> 23135-409-061 <140> PCT/IB2006/001514 <141> 2006-01-27 <150> US 60/648,219 <151> 2005-01-27 <160> 118 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatggt 300 agcagtggct ggtacgtacc acactggttc gacccctggg gccagggcac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 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cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgga 300 tggaacgcgc tgggatggct tgaatcctgg ggcaagggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Trp Asn Ala Leu Gly Trp Leu Glu Ser Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 60 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cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcaa caatttttgg 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 60 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Val Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Asn Asn Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Phe Trp Val 1 5 10 <210> 62 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt 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120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcactatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgga 300 tggaacgcgc tgggatggct tgaatcctgg ggccagggga caatggtcac cgtctcgagt 360 <210> 81 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Trp Asn Ala Leu Gly Trp Leu Glu Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 aattttatgc tgactcagcc ccacgctgtg tcggagtctc 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Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Phe Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser 85 90 95 Thr Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gln Ser Phe Asp Ser Thr Asn Leu Val Val 1 5 10 <210> 93 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgga 300 tggaacgcgc tgggatggct tgaatcctgg gggaagggga ccacggtcac cgtctcgagt 360 <210> 94 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Trp Asn Ala Leu Gly Trp Leu Glu Ser Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcgccg gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccgc tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcaatctt actcttacaa caatcaggtc 300 gtgttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggt 336 <210> 96 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Ala Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ser Tyr 85 90 95 Asn Asn Gln Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Gln Ser Tyr Ser Tyr Asn Asn Gln Val Val 1 5 10 <210> 99 <211> 296 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaga 296 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized primer <400> 100 ctcttctgag atgagttttt g 21 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized primer <400> 101 ttattattcg caattccttt agttgttcct 30 <210> 102 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatggt 300 agcagtggct ggtacgtacc acactggttc gacccctggg gccggggcac cctggtcacc 360 gtctcgagt 369 <210> 103 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Val Pro His Trp Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 104 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcactc gcagcagtgg cagcattgtc agcaactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccac tgtcatctat gaggataacc ggagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaatactg cctccctcac catctctggg 240 ctggaggctg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatggcag caatcgttgg 300 atgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 <210> 105 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Val Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Glu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly 85 90 95 Ser Asn Arg Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Val Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 108 <211> 296 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcag caatca 296 <210> 109 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 accacactgg ttcgacccct ggggccgggg caccctggtc accgtctcga gt 52 <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Pro His Trp Phe Asp Pro Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 111 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 ctactggtac ttcgatctct ggggccgtgg caccctggtc actgtctcct ca 52 <210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 113 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 cacactggtt cgacccctgg ggccggggca ccctggtcac cgtctcgagt 50 <210> 114 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 His Trp Phe Asp Pro Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 115 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 50 <210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 117 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 20 25 30 Ser Tyr Asp Ser Ser Asn 35 <210> 118 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Ser Leu 1 5 10 15 Thr Ile Ser Gly Leu Glu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 20 25 30 Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Arg Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 35 40 45 Thr Val Leu Gly 50

Claims (23)

  1. (a) 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3) 또는 SNAMS(서열 번호 43)를 포함하는 VH CDR1 영역;
    (b) 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4) 또는 TLTGSGGTAYYADSVEG(서열 번호 44)를 포함하는 VH CDR2 영역, 및
    (c) DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5); DHSSGWYVISGMDV(서열 번호 13); DLTVGGPWYYFDY(서열 번호 21); DGWNALGWLES(서열 번호 29); GTELVGGGLDN(서열 번호 45); RSFDSGGSFEY(서열 번호 64); VGSWYLEDFDI(서열 번호 69); GGNYGDYFDYFDY(서열 번호 76); 및 DFWVITSGNDY(서열 번호 89)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역
    을 포함하고, IFNγ에 결합하는 단리된 완전 인간 단클론 항-IFNγ 항체 또는 이것의 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (d) TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8); TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 16); TRSGGSIGSYYVQ(서열 번호 32); TRSSGTIASNYVQ(서열 번호 39); TGSGGSIATNYVQ(서열 번호 48); TGSSGSIASNYVQ(서열 번호 55); TRSSGSIASNYVH(서열 번호 72); TGRNGNIASNYVQ(서열 번호 84); AGSSGSIASNYVQ(서열 번호 97); 및 TRSSGSIVSNYVQ(서열 번호 106)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역;
    (e) EDNQRPS(서열 번호 9); EDNQRPS(서열 번호 17); DDDQRPS(서열 번호 25); DDKKRPS(서열 번호 33); EDTQRPS(서열 번호 85) 및 EDNRRPS(서열 번호 107)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및
    (f) QSYDGSNRWM(서열 번호 10); QSNDSDNVV(서열 번호 18); QSYDSSNVV(서열 번호 26); QSYDSNNLVV(서열 번호 34); QSYDNSNHWV(서열 번호 40); QSYDSDNHHVV(서열 번호 49); QSYDSSNQEVV(서열 번호 56); QSYDSNNFWV(서열 번호 61); QSSDTTYHGGVV(서열 번호 73); QSYEGF(서열 번호 79); QSSDSNRVL(서열 번호 86); QSFDSTNLVV(서열 번호 92); 및 QSYSYNNQVV(서열 번호 98)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역
    을 더 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, IgG 이소타입인 항체.
  4. 제2항에 있어서, 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3)를 포함하는 VH CDR1 영역; 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4)를 포함하는 VH CDR2 영역; DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5)를 포함하는 VH CDR3 영역; 아미노산 서열 TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8)를 포함하는 VL CDR1 영역; 아미노산 서열 EDNQRPS(서열 번호 9)를 포함하는 VL CDR2 영역; 및 아미노산 서열 QSYDGSNRWM(서열 번호 10)을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, NI-0501인 항체.
  6. 서열 번호 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 또는 103으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하고, IFNγ에 결합하는 단리된 완전 인간 단클론 항체.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 또는 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 아미노산 서열을 더 포함하고, IFNγ에 결합하는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3)를 포함하는 VH CDR1 영역; 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4)를 포함하는 VH CDR2 영역; 아미노산 서열 DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5)를 포함하는 VH CDR3 영역; 아미노산 서열 TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8)를 포함하는 VL CDR1 영역; 아미노산 서열 EDNQRPS(서열 번호 9)를 포함하는 VL CDR2 영역; 및 아미노산 서열 QSYDGSNRWM(서열 번호 10)을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 항체.
  9. 제4항에 있어서, IgG 이소타입인 항체.
  10. 제1항의 항체 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제4항의 항체 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 증상을 경감시키는 방법으로서, 상기 증상의 경감이 필요한 피험체에, 피험체의 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 증상을 경감시키기에 충분한 양의 제1항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 피험체가 인간인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3)를 포함하는 VH CDR1 영역; 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4)를 포함하는 VH CDR2 영역; 아미노산 서열 DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5)를 포함하는 VH CDR3 영역; 아미노산 서열 TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8)를 포함하는 VL CDR1 영역; 아미노산 서열 EDNQRPS(서열 번호 9)를 포함하는 VL CDR2 영역; 및 아미노산 서열 QSYDGSNRWM(서열 번호 10)을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체가 NI-O501인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환이 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 류마티스성 관절염, 혈관염, 아토피성 피부염 및 이차적 진행성 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 항체를 정맥내 투여하는 것인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 항체를
    (a) 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 및 IL-31로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 인식하는 항-사이토카인;
    (b) IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 및 IL-31로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 인식하는 항-케모카인 제제;
    (c) MIP1 알파, MIP1 베타, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF 및 프랙탈카인(fractalkine)으로부터 선택되는 케모카인
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 제제와 함께 투여하는 것인 방법.
  19. 세포 상에서의 MHC 부류 II 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포 상에서의 MHC 부류 II 발현을 감소시키기에 충분한 양의 제1항의 항체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포가 인간 흑색종 세포인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 서열 SYAMS(서열 번호 3)를 포함하는 VH CDR1 영역; 아미노산 서열 AISGSGGSTYYADSVKG(서열 번호 4)를 포함하는 VH CDR2 영역; 아미노산 서열 DGSSGWYVPHWFDP(서열 번호 5)를 포함하는 VH CDR3 영역; 아미노산 서열 TRSSGSIASNYVQ(서열 번호 8)를 포함하는 VL CDR1 영역; 아미노산 서열 EDNQRPS(서열 번호 9)를 포함하는 VL CDR2 영역; 및 아미노산 서열 QSYDGSNRWM(서열 번호 10)을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체가 NI-0501인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 세포를
    (a) 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 및 IL-31로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 인식하는 항-사이토카인;
    (b) IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 및 IL-31로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 인식하는 항-케모카인 제제;
    (c) MIP1 알파, MIP1 베타, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF 및 프랙탈카인으로부터 선택되는 케모카인
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 제제와 접촉시키는 것인 방법.
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