CN110183534A

CN110183534A - 抗cd47抗体及其使用方法

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Publication number: CN110183534A
Application number: CN201910489021.7A
Authority: CN
Inventors: K·马斯特纳克; N·费希尔; F·卢梭; E·海利; M·科斯科-维尔博瓦
Original assignee: Novimmune SA
Current assignee: Novimmune SA
Priority date: 2012-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2019-08-30
Also published as: WO2014087248A3; CN105121467B; JP2022177319A; US20140303354A1; US11059910B2; CN105121467A; PT2925782T; AU2013353763B2; RU2019118257A; JP6392770B2; EP3725807A1; JP7563916B2; JP2019023187A; RU2015126533A; AU2018220150A1; JP2020183451A; JP2015536351A; EP2925782A2; US11840553B2; US20180355065A1

Abstract

本发明涉及抗CD47抗体及其使用方法。本发明涉及结合CD47的单克隆和/或单价抗体。本发明涉及结合CD19的单克隆和/或单价抗体。本发明还涉及具有对免疫球蛋白分子的每一结合位点的不同特异性的新颖的双特异性单克隆抗体，其中所述结合位点之一对CD47是特异性的。本发明还涉及具有对免疫球蛋白分子的每一结合位点的不同特异性的新颖的双特异性单克隆抗体，其中所述结合位点之一对CD19是特异性的。

Description

抗CD47抗体及其使用方法

本申请是申请日为2013年12月3日的中国专利申请201380071851.9“抗CD47抗体及其使用方法”的分案申请。

相关申请

本申请要求享有于2012年12月3日提交的美国临时申请号61/732452；于2013年4月28日提交的美国临时申请号61/816788；于2013年8月7日提交的美国临时申请号61/863106；于2013年9月24日提交的美国临时申请号61/881523；以及于2013年11月1日提交的美国临时申请号61/898710的权益；其每一个以其整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及结合CD47的单克隆和/或单价抗体。本发明涉及结合CD19的单克隆和/或单价抗体。本发明还涉及具有对免疫球蛋白分子的每一结合位点的不同特异性的新颖的双特异性单克隆抗体，其中所述结合位点之一对CD47是特异性的。本发明还涉及具有对免疫球蛋白分子的每一结合位点的不同特异性的新颖的双特异性单克隆抗体，其中所述结合位点之一对CD19是特异性的。

背景技术

CD47或整联蛋白相关蛋白(IAP)是在细胞-细胞通信中具有多种功能的普遍存在的50kDa跨膜糖蛋白。其与多种配体诸如整联蛋白、SIRP α(信号调节蛋白α)、SIRP γ和血小板反应蛋白相互作用(Oldenborg，P.A.，CD47：A Cell Surface Glycoprotein WhichRegulates Multiple Functions of Hematopoietic Cells in Health and Disease，ISRN Hematol.2013；2013：614619；Soto-Pantoja DR，等人，Therapeutic opportunitiesfor targeting the ubiquitous cell surface receptor CD47(2012)，Expert OpinTher Targets.2013 Jan；17(1)：89-103；Sick E，等人，CD47 Update：a multifaced actorin the tumor microenvironment of potential therapeutic interest，Br JPharmacol.2012 Dec；167(7)：1415-30)。在先天免疫系统的背景中，CD47作为自身标志物、通过结合由髓样细胞诸如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞表达的SIRP α而传递抑制性“别杀死我(don’t kill me)”信号而发挥功能。因此，CD47在生理情形中广泛表达的作用是保护健康细胞免于被先天免疫系统的消除(Oldenborg PA，等人，CD47-Signal RegulatoryProtein α(Sirp α)Regulates Fc γ and Complement Receptor-MediatedPhagocytosis，J Exp Med.2001 Apr 2；193(7)：855-62；Mattias Olsson，Role of theCD47/SIRP α interaction in regulation of macrophage phagocytosis，Departmentof Integrative Medical Biology，Section for Histology and CellBiology，University，Sweden，Thesis；Oldenborg PA.，Role of CD47 in erythroid cellsand in autoimmunity，Leuk Lymphoma.2004 Jul；45(7)：1319-27；Oldenborg PA，等人，Role of CD47 as a Marker of Self on Red Blood Cells.，Science.2000 Jun 16；288(5473)：2051-4；Brown EJ，Frazier WA.，integrin-associated protein(CD47)and itsligands.，Trends Cell Biol.2001 Mar；11(3)：130-5)。

肿瘤细胞通过过表达CD47而劫持这一免疫抑制性机制，其有效地帮助它们逃脱免疫监督和被先天免疫细胞所杀死。(Majeti R，Ch等人，CD47 is an adverse prognosticfactor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stemcells，Cell.2009 Jul 23；138(2)：286-99；S.Jaiswal等人，CD47 is upregulated oncirculating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoidphagocytosis.，Cell.2009 Jul 23；138(2)：271-85)。CD47表达在大部分人癌症中上调(例如，NHL、AML、乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌和前列腺癌)并且提高的CD47表达水平明显与侵袭性疾病和差的存活相关。(Majeti R，等人，Cell.2009 Jul23；138(2)：286-99；S.Jaiswal等人，Cell.2009 Jul 23；138(2)：271-85；Willingham SB，等人，The CD47-signal regulatory protein alpha(SIRP α)interaction is atherapeutic target for human solid tumors，Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Apr24；109(17)：6662-7；Chao MP，等人，Therapeutic antibody targeting of CD47eliminates human acute lymphoblastic leukemia.，Cancer Res.2011 Feb 15；71(4)：1374-84)。

CD47在健康组织中的广泛表达产生了治疗安全性和效率的问题：首先，用中和性单克隆抗体(Mab)靶定CD47可以影响健康组织，导致如用小鼠和食蟹猴的临床前研究中显示的严重毒性(Willingham SB，等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Apr 24；109(17)：6662-7；Weiskopf K，等人，Engineered SIRP α Variants as ImmunotherapeuticAdiuvants to Anticancer Antibodies，Science.2013 Jul 5；341(6141)：88-91)。其次，即使通过使用替代形式可以避免或减轻严重的毒性(Weiskopf K，等人，Science.2013 Jul5；341(6141)：88-91)，CD47的广泛表达仍引起经过靶介导的药物分布的CD47结合分子的快速消除，导致差的药代动力学和降低的效力。

因此，存在对于能够靶向CD47并克服这些困难的抗体和治疗的需要。

发明内容

本发明提供结合CD47的单克隆抗体。这些抗体在本文中共同称为抗CD47单克隆抗体或抗CD47 mAb。优选地，单克隆抗体对于至少人CD47是特异性的。在一些实施方案中，识别人CD47的单克隆抗体对于至少一种其他非人CD47蛋白(诸如但不限于，非人灵长类动物CD47，例如，食蟹猴CD47和/或啮齿类动物CD47)也是交叉反应性的。在一些实施方案中，这些抗CD47单克隆抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。在一些实施方案中，这些抗CD47单克隆抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。本发明还包括如本文公开的抗CD47单克隆抗体结合相同表位并且抑制CD47和SIRP α之间例如人CD47和人SIRP α之间的相互作用的抗体。

本发明还提供包括对于CD47特异性的至少一个第一臂的单价抗体和/或双特异性抗体。优选地，单价抗体和/或双特异性抗体对于至少人CD47是特异性的。在一些实施方案中，识别人CD47的单价抗体和/或双特异性抗体对于至少一种其他非人CD47蛋白(诸如但不限于，非人灵长类动物CD47，例如，食蟹猴CD47和/或啮齿类动物CD47)也是交叉反应性的。在一些实施方案中，这些抗CD47单价抗体和/或双特异性抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。在一些实施方案中，这些抗CD47单价抗体和/或抗CD47双特异性抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。本发明还包括如本文公开的抗CD47单价和/或抗CD47双特异性抗体结合相同表位并且抑制CD47和SIRP α之间例如人CD47和人SIRP α之间的相互作用的抗体。

本发明提供识别CD47和第二靶的双特异性抗体。本发明允许鉴定、产生和纯化这样的双特异性抗体，所述抗体在序列上与标准抗体难以区分并且其中结合位点之一对于CD47是特异性的且第二结合位点对于另一靶是特异性的，例如肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，TAA是表达于癌细胞的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，癌细胞选自肺癌细胞、支气管癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌、白血病癌细胞、淋巴瘤癌细胞、食管癌细胞、肝癌细胞、泌尿和/或膀胱癌细胞、肾癌细胞、口腔癌细胞、咽癌细胞、子宫癌细胞、和/或黑色素瘤癌细胞。

在一些实施方案中，合适的TAA包括但不限于：CD20、HER2、HER3、EGFR、IGF1R、c-Met、PDGFR1、CD40、CD40L、CD30、CS1、CD70、磷脂酰肌醇聚糖、间皮素、PSMA、PSCA、MUC1、CA125、CEA、FRA、EpCAM、DR5、HGFR1、和/或5T4。

CD47(分化群(Cluster of Differentiation)47)作为吞噬细胞的“不要吃掉我(don’t eat me)”信号而发挥功能，并且已知由许多肿瘤过表达(免疫逃避)。CD47与SIRP α(其过表达于吞噬细胞上)相互作用。CD47下调吞噬活性。CD47抑制树突细胞(DC)成熟和活化。CD47还参与过程诸如例如细胞凋亡、存活、增殖、粘附、迁移、和调节血管发生、血压、组织灌注、和/或血小板体内稳态。

CD47还参与癌症。例如，CD47在多种血液和实体恶性肿瘤中过表达。CD47是经证实的癌干细胞/肿瘤起始细胞标志物。认为CD47过表达可以帮助肿瘤细胞逃脱免疫监督和被先天免疫细胞所杀死。高水平的CD47还与癌症诸如例如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、和/或神经胶质瘤中差的临床结果相关。因此，靶向CD47在治疗癌症症状、延迟癌症症状的进展、或另外改善癌症症状中将是有用的。

由于CD47广泛表达，因此其对于单克隆抗体(mAb)是一个困难的靶标。尽管如此，本文描述的对于CD47特异性的抗体可用作单特异性抗体并可以用于治疗性干预或用作研究或诊断试剂。结合CD47的本发明的单特异性抗体以及免疫上有活性且仍结合CD47的这些单特异性抗体的片段包括本文描述的示例性抗体，例如5A3抗体、5A3M4抗体、5A3M3抗体、5A3M5抗体、KE8抗体、KE8-P6H5抗体(本文也称为KE8H5)、KE8-P3B2抗体(本文也称为KE8B2)、KE8-P2A2抗体(本文也称为KE8A25)、KE8F2抗体、KE8G2抗体、KE84G9抗体、KE81G9抗体、KE81A3抗体、KE8E8抗体、KE8G6抗体、KE8H3抗体、KE8C7抗体、KE8A4抗体、KE8A8抗体、KE8G11抗体、KE8B7抗体、KE8F1抗体、KE8C4抗体、KE8A3抗体、KE86G9抗体、KE8H6抗体、KA3抗体、KA3-P5G2抗体(本文也称为KA3G2)、KA3-P1A3抗体(本文也称为KA3A3)、KA3-P5C5抗体(本文也称为KA3C5)、KA3H8抗体、KA3B2抗体、KA3A2抗体、KA3D3抗体、KA3H3抗体、KC4抗体、KC4-P1G11KC4-P4C11抗体、KC4-P6B1KC4-P4F4抗体、和KC4-P2E2抗体(本文也称为KC4E2)、KC4抗体、KC4F4抗体、KC4A1抗体、KC4C11抗体、KC4E10抗体、KC4B1抗体、KC4C3抗体、KC4A4抗体、KC4G11抗体、KC4G9抗体及其片段。

结合CD47的本发明的抗体及其片段用于调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或另外干扰CD47的功能活性。CD47的功能活性包括但不限于与SIRP α相互作用。当相比于在与本文描述的抗体的结合不存在的情况下CD47-SIRP α相互作用的水平，CD47-SIRP α相互作用在所述抗体存在的情况下的水平降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，认为抗体完全调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或另外干扰CD47-SIRP α相互作用。当相比于在与本文描述的抗体的结合不存在的情况下CD47-SIRP α相互作用的水平，CD47-SIRP α相互作用在所述抗体存在的情况下的水平降低少于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为抗体部分调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或另外干扰CD47-SIRP α相互作用。

本发明还提供其中至少一个结合位点对于CD47是特异性的双特异性抗体。本发明的双特异性抗体靶定CD47和第二抗原，例如肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，双特异性抗体包括功能性Fc部分。双特异性抗体的TAA结合臂靶定CD47臂至肿瘤细胞或癌干细胞。CD47臂阻断、抑制或另外降低CD47和SIRP α之间的相互作用，由此将“吃掉我”信号传达至吞噬细胞。在一些实施方案中，双特异性抗体的TAA结合臂包括抗CD19抗体序列或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，双特性抗体展示对于两个靶的每一个的“平衡的”亲和力。在其他实施方案中，双特性抗体展示对于两个靶的每一个的“不平衡的”亲和力。例如，在抗CD47/CD19双特异性抗体中，抗CD19臂的亲和力增加。例如，在抗CD47/CD19双特异性抗体中，抗CD47臂的亲和力降低。例如，在抗CD47/CD19双特异性抗体中，抗CD19臂的亲和力增加并且抗CD47臂的亲和力降低。这些不平衡的亲和力双特异性抗体例如可用于改进对靶细胞或靶细胞的组的选择性。

在一些实施方案中，抗CD19臂的亲和力在亲和力成熟后增加至少100倍。在一些实施方案中，抗CD47臂的亲和力在亲和力去成熟(dematuration)后降低至少2倍。例如，在一些实施方案中，抗CD47臂展示对于CD47在亲和力去成熟后约2倍至低于100倍的亲和力。

包括至少一个抗CD47臂的本发明的双特异性抗体用于调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或另外干扰CD47的功能活性。CD47的功能活性包括但不限于与SIRP α相互作用。当相比于在与本文描述的双特异性抗体的结合不存在的情况下CD47-SIRP α相互作用的水平，CD47-SIRP α相互作用在所述双特异性抗体存在的情况下的水平降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，认为双特异性抗体完全调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或另外干扰CD47-SIRP α相互作用。当相比于在与本文描述的双特异性抗体的结合不存在的情况下CD47-SIRP α相互作用的水平，CD47-SIRP α相互作用在所述双特异性抗体存在的情况下的水平降低少于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为双特异性抗体部分调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或另外干扰CD47-SIRP α相互作用。

本发明的双特异性抗体的抗CD47臂可以与许多结合其他抗原例如TAA的臂一起使用。本发明的示例性抗CD47臂、抗CD47单价抗体和/或双特异性抗体包括本文称为以下的抗体：5A3抗体、5A3M4抗体、5A3M3抗体、5A3M5抗体、KE8抗体、KE8-P6H5抗体(本文也称为KE8H5)、KE8-P3B2抗体(本文也称为KE8B2)、KE8-P2A2抗体(本文也称为KE8A25)、KE8F2抗体、KE8G2抗体、KE84G9抗体、KE81G9抗体、KE81A3抗体、KE8E8抗体、KE8G6抗体、KE8H3抗体、KE8C7抗体、KE8A4抗体、KE8A8抗体、KE8G11抗体、KE8B7抗体、KE8F1抗体、KE8C4抗体、KE8A3抗体、KE86G9抗体、KE8H6抗体、KA3抗体、KA3-P5G2抗体(本文也称为KA3G2)、KA3-P1A3抗体(本文也称为KA3A3)、KA3-P5C5抗体(本文也称为KA3C5)、KA3H8抗体、KA3B2抗体、KA3A2抗体、KA3D3抗体、KA3H3抗体、KC4抗体、KC4-P1G11KC4-P4C11抗体、KC4-P6B1KC4-P4F4抗体、和KC4-P2E2抗体(本文也称为KC4E2)、KC4抗体、KC4F4抗体、KC4A1抗体、KC4C11抗体、KC4E10抗体、KC4B1抗体、KC4C3抗体、KC4A4抗体、KC4G11抗体、KC4G9抗体及其片段。在一些实施方案中，双特异性抗体的TAA结合臂包括抗CD19抗体序列或其抗原结合片段。

本发明提供具有第一臂和第二臂的分离的双特异性抗体，所述第一臂包括结合CD47的第一氨基酸序列，所述第二臂包括不结合CD47的第二氨基酸序列，其中所述双特异性抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。在一些实施方案中，第二氨基酸序列结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，双特异性抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。

在一些实施方案中，双特异性抗体以比由单价抗CD47抗体展示出的人CD47/人SIRP α相互作用的相应抑制水平的至少10倍更有效的水平来抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用，所述单价抗CD47抗体包括结合CD47的第一氨基酸序列和不结合人蛋白的第二氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体以比由单价抗CD47抗体展示出的人CD47/人SIRP α相互作用的相应抑制水平的至少100倍更有效的水平来抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用，所述单价抗CD47抗体包括结合CD47的第一氨基酸序列和不结合人蛋白的第二氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体以比由单价抗CD47抗体展示出的人CD47/人SIRP α相互作用的相应抑制水平的至少1,000倍更有效的水平来抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用，所述单价抗CD47抗体包括结合CD47的第一氨基酸序列和不结合人蛋白的第二氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括第一臂，所述第一臂在实施例4中描述的测定(且其中单价抗体5A3M3具有约13nM的IC50)中以大于5nM的IC50抑制细胞表面上的人CD47和可溶性人SIRPα之间的相互作用。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括第一臂，所述第一臂如实施例15中所述以10μg/ml的浓度在人全血中在37℃下孵育30分钟后回收大于80％。

在一些实施方案中，双特异性抗体以比由单价抗CD47抗体展示出的人CD47/人SIRP α相互作用的相应抑制水平的至少10倍、至少100倍、或至少1,000倍更有效的水平来抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用，所述单价抗CD47抗体包括结合CD47的第一氨基酸序列和不结合人蛋白的第二氨基酸序列，并且包括第一臂，所述第一臂在实施例4中描述的测定(且其中单价抗体5A3M3具有约13nM的IC50)中以大于5nM的IC50抑制细胞表面上的人CD47和可溶性人SIRP α之间的相互作用。

在一些实施方案中，双特异性抗体以比由单价抗CD47抗体展示出的人CD47/人SIRP α相互作用的相应抑制水平的至少10倍、至少100倍、或至少1,000倍更有效的水平来抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用，所述单价抗CD47抗体包括结合CD47的第一氨基酸序列和不结合人蛋白的第二氨基酸序列，并且包括第一臂，所述第一臂如实施例15中所述以10μg/ml的浓度在人全血中在37℃下孵育30分钟后回收大于80％。

在一些实施方案中，TAA为CD19。在一些实施方案中，第二氨基酸序列不结合人蛋白。

在一些实施方案中，第一氨基酸序列包括SEQ ID NO：225的可变重链互补性决定区1(CDRH1)氨基酸序列、SEQ ID NO：226的可变重链互补性决定区2(CDRH2)氨基酸序列、SEQ ID NO：227的可变重链互补性决定区3(CDRH3)氨基酸序列、选自SEQ ID NO：228-241和262-272的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)氨基酸序列、选自SEQ ID NO：242-245和273-280的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)氨基酸序列、和选自SEQ ID NO：246-261和281的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一氨基酸序列包括SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和选自SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括两个拷贝的单一重链多肽和第一轻链和第二轻链，其中第一和第二轻链是不同的。

在一些实施方案中，第一轻链的至少一部分是κ型且第二轻链的至少一部分是λ型。在一些实施方案中，第一轻链包括至少一个κ恒定区。在一些实施方案中，第一轻链进一步包括κ可变区。在一些实施方案中，第一轻链进一步包括λ可变区。在一些实施方案中，第二轻链包括至少一个λ恒定区。在一些实施方案中，第二轻链进一步包括λ可变区。在一些实施方案中，第二轻链进一步包括κ可变区。在一些实施方案中，第一轻链包括κ恒定区和κ可变区，并且其中第二轻链包括λ恒定区和λ可变区。

在一些实施方案中，恒定和可变框架区序列是人的。

本发明还提供双特异性抗体和/或单价抗体，其包括至少第一臂，所述第一臂在实施例4中描述的测定(且其中抗体5A3M3具有约13nM的IC50)中以大于5nM的IC50抑制细胞表面上的人CD47和可溶性人SIRP α之间的相互作用。

本发明还提供双特异性抗体和/或单价抗体，其包括至少第一臂，所述第一臂如实施例15中所述以10μg/ml的浓度在人全血中在37℃下孵育30分钟后回收大于80％。在一些实施方案中，双特异性抗体和/或单价抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。在一些实施方案中，双特异性抗体和/或单价抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。

本发明还提供具有第一臂和第二臂的分离的双特异性抗体，所述第一臂包括结合CD47的第一氨基酸序列，所述第二臂包括结合CD19的第二氨基酸序列，其中所述双特异性抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。

在一些实施方案中，双特异性抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。在一些实施方案中，双特异性抗体以选自比由单价抗CD47抗体展示出的人CD47/人SIRP α相互作用的相应抑制水平的至少10倍更有效、至少100倍更有效和至少1,000倍更有效的水平来抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用，所述单价抗CD47抗体包括结合CD47的第一氨基酸序列和不结合人蛋白的第二氨基酸序列。

在一些实施方案中，恒定和可变框架区序列是人的。

本发明还提供结合CD47的单价抗体。这些抗体在本文中共同称为抗CD47单价抗体或抗CD47单价(monov)mAb。本发明的单价抗体包括特异性识别CD47的一个臂和本文称为假臂(dummy arm)的第二臂。假臂包括不结合人蛋白或不另外与人蛋白交叉反应的氨基酸序列。在一些实施方案中，假臂包括不结合全血中发现的人蛋白或不另外与其交叉反应的氨基酸序列。本领域普通技术人员将理解在血液中发现的人蛋白是代表系统循环(systemcirculation)中存在的所有、或基本上所有抗原的代理物(proxy)。在一些实施方案中，假臂包括不结合实体组织中发现的人蛋白或不另外与其交叉反应的氨基酸序列。优选地，单价抗体对于至少人CD47是特异性的。在一些实施方案中，识别人CD47的单价抗体对于至少一种其他非人CD47蛋白(诸如但不限于，非人灵长类动物CD47，例如，食蟹猴CD47和/或啮齿类动物CD47)也是交叉反应性的。

本发明的单价抗体的抗CD47臂可以与任何假臂一起使用。本发明的单价抗体的示例性抗CD47臂包括本文称为以下的抗体：5A3抗体、5A3M4抗体、5A3M3抗体、5A3M5抗体、KE8抗体、KE8-P6H5抗体(本文也称为KE8H5)、KE8-P3B2抗体(本文也称为KE8B2)、KE8-P2A2抗体(本文也称为KE8A25)、KE8F2抗体、KE8G2抗体、KE84G9抗体、KE81G9抗体、KE81A3抗体、KE8E8抗体、KE8G6抗体、KE8H3抗体、KE8C7抗体、KE8A4抗体、KE8A8抗体、KE8G11抗体、KE8B7抗体、KE8F1抗体、KE8C4抗体、KE8A3抗体、KE86G9抗体、KE8H6抗体、KA3抗体、KA3-P5G2抗体(本文也称为KA3G2)、KA3-P1A3抗体(本文也称为KA3A3)、KA3-P5C5抗体(本文也称为KA3C5)、KA3H8抗体、KA3B2抗体、KA3A2抗体、KA3D3抗体、KA3H3抗体、KC4抗体、KC4-P1G11KC4-P4C11抗体、KC4-P6B1KC4-P4F4抗体、和KC4-P2E2抗体(本文也称为KC4E2)、KC4抗体、KC4F4抗体、KC4A1抗体、KC4C11抗体、KC4E10抗体、KC4B1抗体、KC4C3抗体、KC4A4抗体、KC4G11抗体、KC4G9抗体及其片段。在一些实施方案中，双特异性抗体的TAA结合臂包括抗CD19抗体序列或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，单价抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。

在一些实施方案中，单价抗体的抗CD47臂包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包括SEQ ID NO：225的可变重链互补性决定区1(CDRH1)氨基酸序列、SEQ ID NO：226的可变重链互补性决定区2(CDRH2)氨基酸序列、SEQ ID NO：227的可变重链互补性决定区3(CDRH3)氨基酸序列、选自SEQ ID NO：228-241和262-272的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)氨基酸序列、选自SEQ ID NO：242-245和273-280的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)氨基酸序列、和选自SEQ ID NO：246-261和281的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)氨基酸序列。

在一些实施方案中，单价抗体的抗CD47臂包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包括SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和选自SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，单价抗体包括两个拷贝的单一重链多肽和第一轻链和第二轻链，其中第一和第二轻链是不同的。

在一些实施方案中，恒定和可变框架区序列是人的。

本发明的双特异性抗体使用本领域已知的任何方法来产生，所述方法诸如但不限于使用交联片段、细胞杂交瘤、和/或任何多种重组体形式，诸如但不限于连接的抗体片段、强制异二聚体(forced heterodimer)、和或基于单结构域的重组体形式。双特异性形式的实例包括但不限于：基于Fab臂交换的双特异性IgG(Gramer等人，2013 MAbs.5(6))；CrossMab形式(Klein C等人，2012 MAbs 4(6))；基于强制异二聚化方法的多种形式诸如SEED技术(Davis JH等人，2010 Protein Eng Des Sel.23(4)：195-202)、静电操控(Gunasekaran K等人，J Biol Chem.2010 285(25)：19637-46.)或结入洞中(knob-into-hole)(Ridgway JB等人，Protein Eng.1996 9(7)：617-21.)或其他组的防止同二聚体形成的突变(Von Kreudenstein TS等人，2013 MAbs.5(5)：646-54.)；基于片段的双特异性形式诸如串联scFv(如BiTEs)(Wolf E等人，2005 Drug Discov.Today 10(18)：1237-44.)；双特异性四价抗体(LM等人，2012 Cancer Immunol Immunother.61(10)：1869-75.)；双亲和力重靶向分子(Moore PA等人，2011 Blood.117(17)：4542-51)、双抗体(KontermannRE等人，Nat Biotechnol.1997 15(7)：629-31)。

在一些实施方案中，双特异性抗体具有在每一结合位点上不同的特异性并包括两个拷贝的单一重链多肽和第一轻链和第二轻链，其中第一和第二轻链是不同的。

在一些抗体中，第一轻链的至少一部分是κ型且第二轻链的至少一部分是λ型。在一些抗体中，第一轻链包括至少一个κ恒定区。在一些抗体中，第一轻链进一步包括κ可变区。在一些抗体中，第一轻链进一步包括λ可变区。在一些抗体中，第二轻链包括至少一个λ恒定区。在一些抗体中，第二轻链进一步包括λ可变区。在一些抗体中，第二轻链进一步包括κ可变区。在一些抗体中，第一轻链包括κ恒定区和κ可变区，并且第二轻链包括λ恒定区和λ可变区。在一些实施方案中，恒定和可变框架区序列是人的。

这些其中至少一个结合位点对于CD47是特异性的抗CD47臂、单特异性抗CD47抗体、单价抗CD47抗体、和/或双特异性抗体含有与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变重链氨基酸序列和与选自SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变轻链氨基酸序列。

本发明提供结合CD47的单克隆抗体。例如，本发明提供单克隆抗体，其在实施例4中描述的测定(且其中抗体5A3M3具有约0.36nM的IC50)中以大于0.3nM的IC50抑制细胞表面上的人CD47和可溶性人SIRP α之间的相互作用。

本发明还提供单克隆抗体，其结合CD47并且如实施例15中所述以10μg/ml的浓度在人全血中在37℃下孵育30分钟后回收大于80％。在一些实施方案中，单克隆抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。在一些实施方案中，单克隆抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。

本发明还提供抗CD47单克隆抗体，其包括SEQ ID NO：225的可变重链互补性决定区1(CDRH1)氨基酸序列、SEQ ID NO：226的可变重链互补性决定区2(CDRH2)氨基酸序列、SEQ ID NO：227的可变重链互补性决定区3(CDRH3)氨基酸序列、选自SEQ ID NO：228-241和262-272的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)氨基酸序列、选自SEQ ID NO：242-245和273-280的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)氨基酸序列、和选自SEQ ID NO：246-261和281的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CD47单克隆抗体包括与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变重链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD47单克隆抗体包括与选自SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD47单克隆抗体包括与SEQ IDNO：114的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变重链氨基酸序列和与选自SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CD47单克隆抗体包括SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和选自SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CD47抗体包括选自以下显示的组合中的可变重链序列和可变轻链序列的组合：5A3、5A3M4、5A3M3、5A3M5、KE8、KE8F2、KE8G2、KE84G9、KE81G9、KE81A3、KE8E8、KE8G6、KE8H5、KE8A2、KE8H3、KE8C7、KE8B2、KE8A4、KE8A8、KE8G11、KE8B7、KE8F1、KE8C4、KE8A3、KE86G9、KE8H6、KA3、KA3H8、KA3A3、KA3C5、KA3B2、KA3A2、KA3D3、KA3G2、KA3H3、KC4、KC4E2、KC4F4、KC4A1、KC4C11、KC4E10、KC4B1、KC4C3、KC4A4、KC4G11、和KC4G9。

本发明提供结合CD19的单克隆抗体。这些抗体在本文中共同称为抗CD19单克隆抗体或抗CD19 mAb。优选地，单克隆抗体对于至少人CD19是特异性的。在一些实施方案中，识别人CD19的单克隆抗体对于至少一种其他非人CD19蛋白(诸如但不限于，非人灵长类动物CD19，例如，食蟹猴CD19和/或啮齿类动物CD19)也是交叉反应性的。

在一些实施方案中，抗CD19单克隆抗体包括与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变重链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD19单克隆抗体包括与选自SEQ ID NO：208、210、212、214、216、218和220的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD19单克隆抗体包括与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变重链氨基酸序列和与选自SEQ ID NO：208、210、212、214、216、218和220的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CD19单克隆抗体包括SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和选自SEQ ID NO：208、210、212、214、216、218和220的可变轻链氨基酸序列。

本发明还提供结合CD19的单价抗体。这些抗体在本文中共同称为抗CD19单价抗体或抗CD19单价(monov)mAb。本发明的单价抗体包括特异性识别CD19的一个臂和本文称为假臂(dummy arm)的第二臂。假臂包括不结合人蛋白或不另外与人蛋白交叉反应的氨基酸序列。在一些实施方案中，假臂包括不结合全血中发现的人蛋白或不另外与其交叉反应的氨基酸序列。在一些实施方案中，假臂包括不结合实体组织中发现的人蛋白或不另外与其交叉反应的氨基酸序列。优选地，单价抗体对于至少人CD19是特异性的。在一些实施方案中，识别人CD19的单价抗体对于至少一种其他非人CD19蛋白(诸如但不限于，非人灵长类动物CD19，例如，食蟹猴CD19和/或啮齿类动物CD19)也是交叉反应性的。

本发明还提供识别CD19和第二靶的双特异性抗体。在一些实施方案中，第二靶是已知与自身免疫疾病和/或炎性疾病相关或另外涉及自身免疫疾病和/或炎性疾病的抗原，所述自身免疫疾病和/或炎性疾病诸如B细胞介导的自身免疫疾病和/或炎性疾病，包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、Waldenstrom氏高丙球蛋白血症(Waldenstrom’s hypergammaglobulinaemia)、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、多发性硬化(MS)、和/或狼疮肾炎。

在一些实施方案中，合适的第二靶包括但不限于CD20、CD22、CD40、BAFFR、CD5、CD32b、ICOSL、IL6R、和/或IL21R。

本发明的识别CD19和第二靶的双特异性抗体使用本领域已知的任何方法来产生，所述方法诸如但不限于使用交联片段、细胞杂交瘤、和/或任何多种重组体形式，诸如但不限于连接的抗体片段、强制异二聚体(forced heterodimer)、和或基于单结构域的重组体形式。本发明允许鉴定、产生和纯化这样的双特异性抗体，所述抗体在序列上与标准抗体难以区分并且其中结合位点之一对于CD19是特异性的且第二结合位点对于另一靶是特异性的，例如肿瘤相关抗原(TAA)。本发明的抗体的未修饰特性使其具有类似于标准单克隆抗体的有利的制备和生物化学特征。

本发明的单克隆、单价和/或双特异性抗体可以用于治疗性干预或用作研究或诊断试剂。例如，本发明的单克隆、单价和/或双特异性抗体可以用于治疗、预防和/或延迟与异常CD47和/或异常CD47-SIRPα表达和/或活性相关的病理的进展或者减缓与此类病理相关的症状的方法中，其通过向需要此类治疗或预防的主体施用本发明的抗体。待治疗的主体例如是人。单克隆、单价和/或双特异性抗体以足以治疗、预防、延迟进展或减缓与所述病理相关的症状的量施用。

在一些实施方案中，本文描述的单克隆、单价和/或双特异性抗体与一种或多种另外的药剂或另外药剂的组合联合同使用。合适的另外药剂包括目前用于预期的应用诸如例如癌症、炎症和/或自身免疫疾病的药物疗法和/或手术疗法。在一些实施方案中，单克隆、单价和/或双特异性抗体可以与利妥昔单抗联合使用。

在一些实施方案中，将单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂配制入单一治疗组合物中，并且将单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂同时施用。或者，将单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂彼此分开，例如，各自配制入分开的治疗组合物中，并且将单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂同时施用，或者将单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂在治疗方案期间在不同时刻施用。例如，在施用另外药剂之前施用单克隆、单价和/或双特异性抗体，在施用另外药剂之后施用单克隆、单价和/或双特异性抗体，或者以交替方式施用单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂。如本文所述，将单克隆、单价和/或双特异性抗体和另外药剂以单一剂量或以多个剂量施用。

使用本发明的抗体治疗和/或预防的病理包括例如癌症或任何其他与异常CD47表达和/或活性相关的疾病或病症。

本发明还提供产生对两个靶的每一个展示“不平衡的”亲和力的双特异性抗体。例如，在抗CD47/CD19双特异性抗体的一些实施方案中，使用亲和力成熟将抗CD19臂的亲和力增加。例如，在抗CD47/CD19双特异性抗体的一些实施方案中，使用亲和力去成熟将抗CD47臂的亲和力降低。例如，在抗CD47/CD19双特异性抗体的一些实施方案中，使用亲和力成熟将抗CD19臂的亲和力增加并且使用亲和力去成熟将抗CD47臂的亲和力降低。这些不平衡的亲和力双特异性抗体例如可用于改进对靶细胞或靶细胞的组的选择性。

根据本发明的药物组合物可以包括本发明的抗体和载体。这些药物组合物可以包括在试剂盒中，例如诸如诊断试剂盒。

附图说明

图1是抗CD47抗体5A3的可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO：116)与其最接近的种系序列(SEQ ID NO：282)(根据IMGT命名法的人IGKV1-33)之间的序列比对的图示。

图2是描绘如在CD47/SIRP α结合测定中与亲本抗体5A3相比的5A3-M3和5A3-M5抗体变体的阻断效力的图。

图3是描绘由流式细胞术(灰色柱)所评估的，如由纯化的CD47单克隆抗体(Mab)与用人CD47转染的CHO细胞的结合所示，各种CD47 Mab的特异性的图。CD47 MAb不结合未转染的CHO细胞(黑色柱)。

图4是描绘如由流式细胞术(灰色柱)所评估的，如通过纯化的CD47 Mab与HEK293-P细胞结合所示，CD47 MAb结合至天然CD47和特异性的图。结合至用hCD-47特异性siRNA稳定转染的HEK293-P细胞显著降低(黑色柱)。

图5是描绘结合至天然人CD47和与食蟹猴CD47的交叉反应性的图。评价了纯化的CD47 Mab与人(浅灰色柱)和食蟹猴(深灰色柱)PBMC CD4+T细胞的结合。

图6是描绘如CD47-SIRP α抑制测定中所测试的(如实施例4中所述，重组可溶性人SIRP α与表达hCD47的CHO细胞的结合的竞争性抑制)，CD47 Mab阻断CD47-SIRP α相互作用的效力的图。显示了在剂量应答实验中获得的IC50值。将CD47 Mab通过家族分组并从较高至较低效力来分类。将本发明的抗体的中和活性与商购的CD47抗体B6H12的相比较。

图7是描绘CD47抗体的血细胞凝集活性的图示。血细胞凝集作为以在孔的下缘周围的底部处的新月形形式的RBC的结块沉积物而得到证实，而未凝集的不会形成聚集物并且均匀地分布于孔表面面积。图7证实5A3、Ke8、和Ka3家族的高亲和力CD47 Mab诱导血细胞凝集；与其他三个家族不同，在该实验中测试的Kc4家族抗体不诱导血细胞凝集。

图8是描绘用Raji细胞和原始抗CD19克隆1B7、第一轮亲和力成熟后鉴定的克隆D11、和从第二轮亲和力成熟得到的最终克隆L7B7_c2完成的FACS结合测定的剂量-应答曲线的图。

图9A-9C是CD47xCD19 BsAb与细胞表面的两个靶共连接的能力的一系列图。图9A-9C中的图呈现用结合CD19阴性B-NHL细胞(DS-1)和CD19阳性伯基特淋巴瘤细胞(Raji)的单价和双特异性抗体生成的FACS概况。所有抗体是人IgG1形式并且以所示的四种浓度测试。

图10是描绘单价和双特异性抗体的SIRP α阻断活性的一系列图。图10证实CD19和CD47在靶细胞表面上的共连接，通过显示由CD47xCD19 BsAbs的CD47-SIRP α相互作用的中和是CD19依赖性的。实验以一式四份完成，显示平均值和SEM。将剂量-应答移植曲线用GraphPad软件拟合。

图11A-11C显示用CD47xCD19 κ λ体(黑色)或相应的CD47单价抗体(灰色)生成的ADCC剂量-应答曲线。用CD19 Mab C2的ADCC显示对比(虚线)。ADCC测定用整个人PBMC作为效应细胞和Calcein AM染色的Raji(图11A，11C)或Ramos(图11B)作为靶细胞(效应物与靶比例：50)进行。细胞毒性从靶细胞的钙黄绿素释放程度来计算。显示了特异性细胞杀死+/-SD的百分比。实验一式两份完成。图11A-11B证实CD47xCD19 BsAbs以CD19依赖性方式杀死CD19阳性细胞的能力，这是因为相应的CD47单价抗体效力低得多或根本无效力。图11C证实用CD47xCD19抗体的Raji细胞的杀死效力与利妥昔单抗是相当的，并比CD19 Mab C2高得多。

图12是描绘在剂量-应答ADCP实验中与相应的CD47单价抗体(灰色线)相比的本发明的CD47xCD19 κ λ体的三个(黑色线)的吞噬活性的图。用CD47 Mab B6H12(在人IgG1背景，黑色虚线)和用CD19 Mab C2(灰色虚线)的吞噬作用显示比较。ADCP实验用从外周血单核细胞分化的人巨噬细胞和Raji作为靶细胞(效应物：靶比例1∶5)进行，通过FACS评估吞噬作用。显示了吞噬至少一种靶细胞的巨噬细胞的百分比。CD47xCD19 κ λ体在CD19依赖性方式分析中吞噬CD19阳性细胞，这是因为相应的CD47单价抗体效力低得多或根本无效力。

图13是描绘在NOD/SCID小鼠中在Raji B细胞淋巴瘤异种移植物中多种抗体的活性的图。在肿瘤移植物已达到约0.1cm³后开始抗体治疗并在D25结束。治疗组(n＝5)如插图中所示。显示平均肿瘤体积/治疗组+/-SD的演变。图13显示了BsAB的效力与B6H12或利妥昔单抗的效力相似，并且肿瘤消除是CD19依赖性的，因为相应的单价效力更低。

图14是描绘高亲和力和中等亲和力CD47抗体在红细胞上有效吸附的图。在BsAb的情况下，该现象限于具有高亲和力CD47臂的分子，诸如5A3。

发明详述

本发明还提供包括对于CD47特异性的至少一个第一臂的单价抗体和/或双特异性抗体。优选地，单价抗体和/或双特异性抗体对于至少人CD47是特异性的。在一些实施方案中，识别人CD47的单价抗体和/或双特异性抗体对于至少一种其他非人CD47蛋白(诸如但不限于，非人灵长类动物CD47，例如，食蟹猴CD47和/或啮齿类动物CD47)也是交叉反应性的。在一些实施方案中，这些抗CD47单价抗体和/或抗CD47双特异性抗体抑制CD47和信号调节蛋白α(SIRP α)之间的相互作用。在一些实施方案中，这些抗CD47单价抗体和/或抗CD47双特异性抗体抑制人CD47和人SIRP α之间的相互作用。本发明还包括如本文公开的抗CD47单价和/或抗CD47双特异性抗体结合相同表位并且抑制CD47和SIRP α之间例如人CD47和人SIRP α之间的相互作用的抗体。

本发明的双特异性抗体允许两个抗体臂同时结合至细胞表面上的两种抗原(称为共连接(co-engagement))，其导致由于抗体亲抗原性机制的亲和力的累加性或协同性增加。结果是，共连接赋予向表达两种抗原的细胞相比于仅表达一种单一抗原的细胞高的选择性。此外，双特异性抗体的两个臂与它们相应靶的亲和力可以以结合至靶细胞主要由抗体臂之一驱动的方式来设置。在一些实施方案中，双特异性抗体包括结合CD47的第一臂和结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二臂，其中所述第二臂以高亲和力结合TAA，并且第一臂以低亲和力结合CD47，即TAA共连接时足以抑制CD47/SIRP α的亲和力。这种设计允许本发明的双特异性抗体相比于正常细胞优先抑制癌症中的CD47。在本文提供的实例中，具有以低亲和力结合CD47的第一臂和以高亲和力结合CD19的第二臂的双特异性抗体(称为CD47xCD19双特异性)允许相比于正常细胞优先抑制癌症中的CD47。除了两个抗原结合臂之外，CD47xTAA双特异性抗体需要有功能的Fc部分以补充巨噬细胞和/或其他免疫效应细胞。完全人双特异性IgG形式(诸如本文描述的κ λ体形式)非常适合于生成双重靶向CD47 x TAA双特异性抗体。如本文提供的实例中所显示的，双重靶向的双特异性抗体共连接CD47和CD19的能力导致结合CD19阳性细胞的亲和力和CD47-SIRP α相互作用的CD19依赖性中和中的显著增加。这继而转变为由CD47xCD19双特异性抗体介导的有效且选择性的癌细胞杀死，如在本文提供的ADCC和ADCP实验中所证实的。

其中至少一个结合位点对于CD47是特异性的本发明的示例性抗CD47单克隆、单特异性抗CD47抗体、抗CD47单价抗体、和/或双特异性抗体包括例如5A3抗体、5A3M4抗体、5A3M3抗体、5A3M5抗体、KE8抗体、KE8-P6H5抗体(本文也称为KE8H5)、KE8-P3B2抗体(本文也称为KE8B2)、KE8-P2A2抗体(本文也称为KE8A25)、KE8F2抗体、KE8G2抗体、KE84G9抗体、KE81G9抗体、KE81A3抗体、KE8E8抗体、KE8G6抗体、KE8H3抗体、KE8C7抗体、KE8A4抗体、KE8A8抗体、KE8G11抗体、KE8B7抗体、KE8F1抗体、KE8C4抗体、KE8A3抗体、KE86G9抗体、KE8H6抗体、KA3抗体、KA3-P5G2抗体(本文也称为KA3G2)、KA3-P1A3抗体(本文也称为KA3A3)、KA3-P5C5抗体(本文也称为KA3C5)、KA3H8抗体、KA3B2抗体、KA3A2抗体、KA3D3抗体、KA3H3抗体、KC4抗体、KC4-P1G11KC4-P4C11抗体、KC4-P6B1KC4-P4F4抗体、和KC4-P2E2抗体(本文也称为KC4E2)、KC4抗体、KC4F4抗体、KC4A1抗体、KC4C11抗体、KC4E10抗体、KC4B1抗体、KC4C3抗体、KC4A4抗体、KC4G11抗体、KC4G9抗体、及其免疫活性的和/或抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明的示例性抗CD47单克隆、单特异性抗CD47抗体、抗CD47单价抗体、和/或双特异性抗体包括选自表1、2和3中所示的CDR序列的重链和轻链互补性决定区(CDR)的组合，其中表1、2和3中显示的CDR根据IMGT命名法进行确定。

在一些实施方案中，本发明的示例性抗CD47单克隆、单特异性抗CD47抗体、抗CD47单价抗体、和/或双特异性抗体包括来自表1的重链CDR序列和两组选自表2和3中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的轻链CDR的组合。

在一些实施方案中，本发明的示例性抗CD47单克隆、单特异性抗CD47抗体、抗CD47单价抗体、和/或双特异性抗体包括来自表1的重链CDR序列和第一组选自表2中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的轻链CDR和第二组选自表3中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的轻链CDR的组合。

表1：抗CD47重链CDR

。

表2：抗CD47 κ轻链CDR

。

表3：抗CD47 λ轻链CDR

。

本文描述的示例性抗CD47、抗CD19单价和双特异性抗体的每一种包括通用重链(HC)、抗CD47和抗CD19抗体的一个κ链和一个λ链、单价和双特异性抗体的一个κ和一个λ轻链(LC)，如下文列出的氨基酸和相应的核酸序列中所示。下文描述的示例性抗CD47、抗CD19单价和双特异性抗体的每一种包括通用可变重链(VH)、抗CD47和抗CD19抗体的一个κ可变轻结构域和一个λ可变轻结构域、单价和双特异性抗体的一个κ和一个λ可变轻结构域(VL)，如下文列出的氨基酸和相应的核酸序列中所示。

尽管本文中将下文的抗体序列作为实例提供，但应理解这些序列可用于使用多种领域公认的技术来生成双特异性抗体。双特异性形式的实例包括但不限于：基于Fab臂交换的双特异性IgG(Gramer等人，2013 MAbs.5(6))；CrossMab形式(Klein C等人，2012 MAbs 4(6))；基于强制异二聚化方法的多种形式诸如SEED技术(Davis JH等人，2010 Protein EngDes Sel.23(4)：195-202)、静电操控(Gunasekaran K等人，J Biol Chem.2010 285(25)：19637-46.)或结入洞中(knob-into-hole)(Ridgway JB等人，Protein Eng.1996 9(7)：617-21.)或其他组的防止同二聚体形成的突变(Von Kreudenstein TS等人，2013 MAbs.5(5)：646-54.)；基于片段的双特异性形式诸如串联scFv(如BiTEs)(Wolf E等人，2005 DrugDiscov.Today 10(18)：1237-44.)；双特异性四价抗体(LM等人，2012 CancerImmunol Immunother.61(10)：1869-75.)；双亲和力重靶向分子(Moore PA等人，2011Blood.117(17)：4542-51)、双抗体(Kontermann RE等人，Nat Biotechnol.1997 15(7)：629-31)。

示例性抗CD47、抗CD19单价和双特异性抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)。

＞通用-HC-NT(SEQ ID NO：1)

＞通用-HC-AA(SEQ ID NO：2)

。

抗CD47、抗CD19单价和双特异性抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)。

＞通用-VH-NT(SEQ ID NO：113)

＞通用-VH-AA(SEQ ID NO：114)

。

抗CD47抗体

5A3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：3中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：4)。

5A3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：115中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：116)。

5A3-M4抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：5中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：6)。

5A3-M4抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：117中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：118)。

5A3-M3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：7中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：8)。

5A3-M3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：119中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：120)。

5A3-M5抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：9中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：10)。

5A3-M5抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：121中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：122)。

Ke8抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：11中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：12)。

Ke8抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：123中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：124)。

Ke8H5抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：13中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：14)。

Ke8H5抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：125中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：126)。

Ke8B2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：15中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：16)。

Ke8B2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：127中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：128)。

Ke8A2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：17中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：18)。

Ke8A2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：129中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：130)。

Ke8E8抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：19中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：20)。

Ke8E8抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：131中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：132)。

Ke8H3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：21中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：22)。

Ke8H3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：133中显示的核酸序列编码的1κ可变轻结构域(SEQID NO：134)。

Ke8G6抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：23中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：24)。

Ke8G6抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：135中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：136)。

Ke8A3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：25中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：26)。

Ke8A3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：137中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：138)。

Ke81A3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：27中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：28)。

Ke81A3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：139中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：140)。

Ke8A8抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：29中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：30)。

Ke8A8抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：141中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：142)。

Ke8C7抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：31中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：32)。

Ke8C7抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：143中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：144)。

Ke8G2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：33中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：34)。

Ke8G2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：145中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：146)。

Ke81G9抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：35中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：36)。

Ke81G9抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：147中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：148)。

Ke8F2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：37中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：38)。

Ke8F2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：149中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：150)。

Ke8B7抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：39中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：40)。

Ke8B7抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：151中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：152)。

Ke8C4抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：41中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：42)。

Ke8C4抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：153中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：154)。

Ke8F 1抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：43中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：44)。

Ke8F 1抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：155中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：156)。

Ke8G 11抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：45中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：46)。

Ke8G11抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：157中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：158)。

Ke8H6抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：47中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：48)。

Ke8H6抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：159中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：160)。

Ke84G9抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：49中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：50)。

Ke84G9抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：161中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：162)。

Ke8A4抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：51中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：52)。

Ke8A4抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：163中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：164)。

Ke86G9抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：53中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：54)。

Ke86G9抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：165中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：166)。

Ka3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：55中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：56)。

Ka3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：167中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：168)。

Ka3A2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：57中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：58)。

Ka3A2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：169中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：170)。

Ka3H3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：59中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：60)。

Ka3H3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：171中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：172)。

Ka3A3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：61中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：62)。

Ka3A3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：173中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：174)。

Ka3H8抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：63中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：64)。

Ka3H8抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：175中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：176)。

Ka3B2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：65中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：66)。

Ka3B2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：177中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：178)。

Ka3C5抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：67中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：68)。

Ka3C5抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：179中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：180)。

Ka3G2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：69中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：70)。

Ka3G2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：181中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：182)。

Ka3D3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：71中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：72)。

Ka3D3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：183中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：184)。

Kc4抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：73中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：74)。

Kc4抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：185中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：186)。

Kc4G11抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：75中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：76)。

Kc4G11抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：187中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：188)。

Kc4C11抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：77中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：78)。

Kc4C11抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：189中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：190)。

Kc4A1抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：79中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：80)。

Kc4A1抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：191中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：192)。

Kc4A4抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：81中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：82)。

Kc4A4抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：193中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：194)。

Kc4E10抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：83中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：84)。

Kc4E10抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：195中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：196)。

Kc4G9抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：85中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：86)。

Kc4G9抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：197中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：198)。

Kc4C3抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：87中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：88)。

Kc4C3抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：199中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：200)。

Kc4F4抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：89中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：90)。

Kc4F4抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：201中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：202)。

Kc4B 1抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：91中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：92)。

Kc4B1抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：203中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：204)。

Kc4E2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：93中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：94)。

Kc4E2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)并包括由SEQ ID NO：205中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQID NO：206)。

抗CD19抗体

C2抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。

C2抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：208)。

A6抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：97中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：98)。

A6抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：209中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：210)。

C6抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：99中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：100)。

C6抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：211中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：212)。

C9抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：101中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：102)。

C9抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：213中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：214)。

B 11抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：103中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：104)。

B11抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：215中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：216)。

D11抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。

D11抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：218)。

B7抗体包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)并包括由SEQ ID NO：107中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：108)。

B7抗体包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)并包括由SEQ ID NO：219中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：220)。

假轻链

假轻链1(SEQ ID NO：110)由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码。

＞假-LC1-NT(SEQ ID NO：109)

＞假LC1-AA(SEQ ID NO：110)

。

假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码。

＞假-VL1-NT(SEQ ID NO：221)

＞假-VL1-AA(SEQ ID NO：222)

。

假轻链2(SEQ ID NO：112)由SEQ ID NO：111中显示的核酸序列编码。

＞假-LC2-NT(SEQ ID NO：111)

＞假-LC2-AA(SEQ ID NO：112)

。

假可变轻结构域2(SEQ ID NO：224)由SEQ ID NO：223中显示的核酸序列编码。

＞假-VL2-NT(SEQ ID NO：223)

＞假-VL2-AA(SEQ ID NO：224)

。

单价抗体

在一些实施方案中，单价抗体5A3包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：3中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：4)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体5A3包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ IDNO：114)、由SEQ ID NO：115中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：116)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体5A3-M3包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：7中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：8)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体5A3-M3包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：119中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：120)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体5A3-M5包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：9中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：10)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体5A3-M5包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：121中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ IDNO：122)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ke8包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：11中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：12)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ke8包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：123中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：124)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ke8A2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：17中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：18)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ke8A2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：129中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：130)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ke8B2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：15中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：16)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ke8B2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：127中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：128)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ke8G 11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：45中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：46)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ke8G11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：157中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ IDNO：158)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ke8C4包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：41中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：42)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ke8C4包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：153中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：154)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ke8A3包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：25中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：26)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ke8A3包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：137中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：138)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ka3包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：55中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：56)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ka3包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：167中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：168)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ka3A3包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：61中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：62)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ka3A3包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：173中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：174)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ka3G2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：69中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：70)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ka3G2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：181中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：182)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体Ka3H3包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：59中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ ID NO：60)和由SEQ ID NO：109中显示的核酸序列编码的λ假轻链1(SEQ ID NO：110)。在一些实施方案中，单价抗体Ka3H3包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQID NO：114)、由SEQ ID NO：171中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：172)和由SEQ ID NO：221中显示的核酸序列编码的λ假可变轻结构域1(SEQ ID NO：222)。

在一些实施方案中，单价抗体C2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：111中显示的核酸序列编码的κ假轻链2(SEQ ID NO：112)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，单价抗体C2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ IDNO：114)、由SEQ ID NO：223中显示的核酸序列编码的κ假可变轻结构域2(SEQ ID NO：224)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：208)。

双特异性抗体

在一些实施方案中，双特异性抗体5A3xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：3中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ IDNO：4)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体5A3xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：115中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ IDNO：116)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M3xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：7中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：8)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M3xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：119中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：120)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M3xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：7中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ IDNO：8)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M3xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：119中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ IDNO：120)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M5xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：9中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：10)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M5xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：121中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：122)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M5xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：9中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ IDNO：10)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体5A3-M5xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：121中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：122)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：11中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ IDNO：12)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：123中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：124)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8A2xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：17中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：18)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8A2xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：129中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：130)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8B2xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：15中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：16)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8B2xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：127中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：128)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8G11xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：45中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：46)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8GxC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：157中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：158)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8C4xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：41中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：42)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8C4xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：153中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：154)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8C4xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：41中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：42)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8C4xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：153中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：154)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8A3xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：25中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：26)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8A3xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：137中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：138)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8A3xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：25中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：26)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ke8A3xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：137中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：138)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：55中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ IDNO：56)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：167中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQID NO：168)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：55中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQ IDNO：56)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：167中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ IDNO：168)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ ID NO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3A3xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：61中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：62)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3A3xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：173中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：174)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3G2xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：69中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：70)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3G2xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：181中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：182)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3G2xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：69中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：70)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3G2xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：181中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：182)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：208)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3H3xD11包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：59中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：60)和由SEQ ID NO：105中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3H3xD11包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：171中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：172)和由SEQ ID NO：217中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：218)。

在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3H3xC2包括由SEQ ID NO：1中显示的核酸序列编码的通用重链(SEQ ID NO：2)、由SEQ ID NO：59中显示的核酸序列编码的κ轻链(SEQID NO：60)和由SEQ ID NO：95中显示的核酸序列编码的λ轻链(SEQ ID NO：96)。在一些实施方案中，双特异性抗体Ka3H3xC2包括由SEQ ID NO：113中显示的核酸序列编码的通用可变重结构域(SEQ ID NO：114)、由SEQ ID NO：171中显示的核酸序列编码的κ可变轻结构域(SEQ ID NO：172)和由SEQ ID NO：207中显示的核酸序列编码的λ可变轻结构域(SEQ IDNO：208)。

定义：

除非另有定义，否则在本发明上下文中使用的科技术语均具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语也应该包括复数形式并且复数术语也应该包括单数形式。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关使用的命名法及其技术是众所周知的且本领域中通常使用的那些。使用标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶反应和纯化技术根据制造商说明书进行，或如同本领域中通常进行的或如本文所描述的。前述技术和程序通常根据本领域中众所周知的和如描述于多个一般性的和在整个本说明书中引用并讨论的更具体的参考文献中的常规方法进行。参见，例如Sambrook等Molecular Cloning：A LABORATORY MANUAL(第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本文描述的与分析化学、合成有机化学、和医学和药物化学相关使用的术语学及其实验室程序及技术是众所周知的且在本领域中经常使用的那些。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、及患者的治疗。

如根据本公开所用，以下术语，除非另有说明，均应理解为具有以下含义：

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合(与其免疫反应)抗原的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与......免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应并且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(K_d＞10^-6)结合。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb(结构域抗体)、单链、F_ab、F_ab′和F_(ab′)2片段、scFVs、和F_ab表达文库。

基础抗体结构单元已知包含四聚体。每一四聚体由相同的两对多肽链构成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每一链的氨基末端包括主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端部分确定主要负责效应子功能的恒定区。通常，获自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任一种，其由于分子中存在的重链性质而彼此不同。某些类别还具有亚类，诸如IgG₁、IgG₂及其他。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。

如本文所用的术语“单克隆抗体(MAb)”或“单克隆抗体组合物”指含有仅一个分子种类的由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的抗体分子群。尤其是，单克隆抗体的互补性决定区(CDR)在群的所有分子中是相同的。MAb含有能够与表征为对其独特的结合亲和力的抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点。

术语“抗原结合位点”或“结合部分”指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。称为“高变区”的重链和轻链的V区内的三段高度差异的序列位于称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼序列之间。因此，术语“FR”指天然位于免疫球蛋白的高变区之间和邻接免疫球蛋白的高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此放置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链的每一个的三个高变区称为“互补性决定区”或“CDR”。对每一结构域的氨基酸指定与Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest的定义一致(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))，或Chothia&LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987)，Chothia等人Nature 342：878-883(1989)。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv、或T细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面分组的分子(诸如氨基酸或糖侧链)组成并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可以针对多肽的N末端或C末端肽产生。当解离常数为≤1μM；例如≤100nM，优选≤10nM且更优选≤1nM时，抗体特异性结合抗原。

如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”指在免疫球蛋白分子和所述免疫球蛋白对其是特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的解离常数(K_d)的形式表示，其中更小的K_d表示更大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域公知的方法来定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合体形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合体配偶体的浓度、相互作用的亲和力、和同样在两个方向上影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数(on rateconstant)”(K_on)和“解离速率常数(off rate constant)”(K_off)可以通过计算浓度和结合和解离的实际速率来测定。(参见Nature 361：186-87(1993))。K_off/K_on的比率允许删除所有与亲和力无关的参数，并等于解离常数K_d。(通常参见Davies等人(1990)Annual RevBiochem 59：439-473)。如通过测定诸如放射性配体结合测定或本领域技术人员已知的类似测定所测量的，当平衡结合常数(K_d)为≤1μM，例如，≤100nM，优选≤10nM，且更优选≤1nM时，本发明的抗体特异性结合其靶。

如本文所用的术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA、或合成来源的多核苷酸或其一些组合，其由于其起源，所述“分离的多核苷酸”(1)不伴随其中在自然界中发现所述“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或一部分，(2)与其在自然界中不相连的多核苷酸可操作地连接，或(3)不作为更大序列的一部分存在于自然界中。根据本发明的多核苷酸包括编码重链免疫球蛋白分子的核酸分子和编码本文所述的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。

术语“分离的蛋白”本文指cDNA、重组RNA、或合成来源的蛋白或其一些组合，其由于其起源或衍生来源(source of derivation)，所述“分离的蛋白”(1)不伴随自然界中发现的蛋白，(2)不含来自相同来源的其他蛋白，例如无海洋蛋白，(3)由不同种类的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。

术语“多肽”本文用作通用术语来指多肽序列的天然蛋白、片段、或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽属(genus)中的种(species)。根据本发明的多肽包括如本文所述的重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子(诸如κ轻链免疫球蛋白分子，且反之亦然)及其片段和类似物的组合形成的抗体分子。

术语“天然存在的”如本文所用应用于对象来指对象在自然界中可发现的事实。例如，存在于可以从自然界的来源中分离的生物(包括病毒)中且尚未在实验室中由人或以其他方式有目的的改变的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

术语“可操作地连接”如本文所用来指所述的组分的位置处于这样的关系中，其允许它们以其预期的方式来行使功能。以这样的方式将控制序列“可操作地连接至”编码序列，所述方式即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“控制序列”如本文所用来指对于实现它们所连接的编码序列的表达和加工必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质依赖于宿主生物而不同，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在在最小程度上包括其存在对表达和加工是必需的所有组分，并且还能够包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文所指的术语“多核苷酸”意指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合硼(polymeric boron)，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。术语包括单链和双链形式的DNA。

如本文所用，二十个常见氨基酸及其缩写按照常规用法。参见Immunology-ASynthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland Mass.(1991))。二十个常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常见氨基酸也可以是本发明的多肽的合适组分。非常见氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和规定，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。

当应用至多肽时，术语“实质上的同一性”表示当通过诸如程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重最佳比对时，两条肽序列具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性，并且最优选至少99％序列同一性。

优选地，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代而不同。

保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺的侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。

如本文所讨论，抗体和免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小改变应理解为涵盖于本发明中，条件是氨基酸序列中的改变保持至少75％，优选至少80％、90％、95％和最优选99％。尤其是，考虑保守氨基酸取代。保守取代是在与其侧链相关的氨基酸家族内发生的那些取代。遗传编码的氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他家族的氨基酸包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂族-羟基家族；(ii)精氨酸和谷氨酰胺，其为含酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂族家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳族家族。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸、用谷氨酸单独取代天冬氨酸、用丝氨酸单独取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸将不会对所产生的分子的结合或特性产生大的影响，尤其是如果所述取代不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活来确定。测定在本文详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物优选的氨基末端和羧基末端出现在靠近功能结构域的边界。结构和功能结构域可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共的或专有的序列数据库来鉴定。优选地，使用计算机化的比较方法来鉴定出现在具有已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠为已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253：164(1991)。因此，以上实例证实本领域技术人员可以识别可以用于定义本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。

优选的氨基酸取代是以下那些，其：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变对形成的蛋白复合体的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修饰此类类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包括除天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，单个或多个氨基酸取代(优选地，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中(优选地，在形成分子间接触的结构域外部的多肽的部分中)进行。保守的氨基酸取代应基本上不会改变亲本序列(parent sequence)的结构特征(例如，取代氨基酸应该趋于不打破在亲本序列中形成的螺旋，或不破坏为亲本序列的特征的其他类型的二级结构)。本领域技术公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures andMolecular Principles(Creighton，编辑，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等Nature 354：105(1991)。

如本文所用，术语“标记”或“标记的”指掺入可检测的标记物，例如，通过掺入放射标记的氨基酸或连接至可以由标记的抗生物素蛋白(例如，含有荧光标记物或可以通过光学或量热法检测的酶促活性的链霉抗生物素)检测的生物素基部分的多肽上。在某些情况下，标记和标记物还可以是治疗的。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的并可以使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、由二级报道分子识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链成对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记由各种长度的间隔臂连接以降低潜在的空间位阻。如本文所用的术语“药剂或药物”指当适当地施用于患者时能够诱导期望的治疗作用的化合物或组合物。

其他化学术语本文根据本领域常规用法来使用，如由The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985))所示例的。

如本文所用，“基本上纯”意指目标种类是存在的主要种类(即，在摩尔的基础上，其比组合物中任何其他单独种类更为丰富)，并且优选基本上纯化的级分是这样的组合物，其中目标种类包含至少约50％(在摩尔基础上)的所有存在的大分子种类。

通常，基本上纯的组合物将包含多于约80％的组合物中存在的所有大分子种类，更优选多于约85％、90％、95％和99％。最优选地，目标种类纯化至实质的同质性(污染物种类在组合物中通过常规检测方法无法检测到)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。

术语患者包括人和兽医主体(veterinary subjects)。

抗体

本领域内已知的各种程序可用于产生针对给定靶例如CD47、肿瘤相关抗原或其他靶、或针对其衍生物、片段、类似物、同源物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体。(参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow E，and Lane D，1988，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，通过引用并入本文)。

抗体通过众所周知的技术诸如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析(其主要提供免疫血清的IgG级分)来纯化。随后，或可选地，其为寻求的免疫球蛋白的靶的特异性抗原或其表位可以固定在柱上以通过免疫亲和力层析来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化的例如由D.Wilkinson(The Scientist，published by The Scientist，Inc.，Philadelphia PA，Vol.14，No.8(April 17，2000)，pp.25-28)所讨论。

在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体例如通过使用本文提供的实施例中描述的程序来生成。抗体还例如通过用在其表面上表达高水平的给定靶的细胞转染子的组合免疫BALB/c小鼠来生成。由骨髓瘤/B细胞融合体产生的杂交瘤随后针对所选靶的反应性进行筛选。

单克隆抗体例如使用杂交瘤方法诸如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些方法来制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物通常用免疫剂进行免疫来引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。

免疫剂通常将包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果期望人起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果期望非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103)。无限增殖化细胞系通常转化哺乳动物细胞，尤其是啮齿类动物、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在优选含有一种或多种抑制未融合的、无限增殖化细胞的生长或存活的物质的合适的培养基中培养。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质阻止HGPRT缺乏细胞的生长。

优选的无限增殖化细胞系是有效融合、由所选的产生抗体细胞支持抗体的稳定的高水平表达、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些细胞系。更优选的无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，其可以例如从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California和American Type Culture Collection，Manassas，Virginia获得。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已描述用于生产单克隆抗体。(参见Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63))。

其中培养杂交瘤细胞的培养基可以随后测定针对抗原的单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。此类技术和测定在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和力例如可以通过Scatchard analysis of Munson andPollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)来测定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是鉴定具有对靶抗原的高度特异性和高结合亲和力的抗体。

鉴定期望的杂交瘤细胞后，克隆可以通过有限稀释程序来亚克隆并通过标准方法来生长。(参见Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，AcademicPress，(1986)pp.59-103)。用于此目的的合适培养基包括例如Dulbecco的改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为腹水体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序诸如例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析从培养基或腹水流体中分离或纯化。

单克隆抗体还可以通过重组DNA方法诸如美国专利号4,816,567中描述的那些来制备。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以容易地使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分离和测序。本发明的杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA放置入表达载体中，所述表达载体随后转染入宿主细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。DNA还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源鼠序列(参见美国专利号4,816,567；Morrison，Nature368，812-13(1994))或通过共价连接至免疫球蛋白编码序列全部或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列来修饰。此类非免疫球蛋白多肽可以替换本发明抗体的恒定结构域，或可以替换本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。

本发明的单克隆抗体包括人源化的抗体或人抗体。这些抗体适合于向人施用而不会引起由人针对所施用的免疫球蛋白的免疫应答。抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其主要包含人免疫球蛋白的序列并含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化例如通过按照Winter及同事(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行。(还参见美国专利号5,225,539)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基取代。人源化抗体还包含例如在受体抗体或输入的CDR或框架序列内均未发现的残基。通常，人源化抗体包括基本上所有、至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最优还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的Fc(Jones等人，1986；Riechmann等人，1988；and Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992))。

完全人抗体是其中轻链和重链两者的整个序列包括CDR均来自人基因的抗体分子。此类抗体本文称为“人抗体”或“完全人抗体”。单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等人，1983 Immunol Today 4：72)；和EBV杂交瘤技术来制备以产生单克隆抗体(参见Cole，等人，1985 In：Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。单克隆抗体可以利用并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote，等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA 80：2026-2030)或通过用EB病毒体外转化人B细胞(参见Cole，等人，1985 In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)来产生。

此外，人抗体还可以使用另外的技术包括噬菌体展示文库来产生。(参见Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白位点引入转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠来制备。一旦攻击，观察到人抗体产生，其与在人中在所有方面看到的类似，包括基因重排、组装和抗体所有组分。该方法例如描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和Marks等人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。

人抗体可以另外使用转基因非人动物(其修饰以产生应答于抗原攻击的完全人抗体而非动物内源抗体)来产生。(参见PCT公开WO94/02602)。非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链的内源基因已被失效，并且编码人重和轻链免疫球蛋白的活性位点插入到宿主基因组中。例如，使用含有必需的人DNA区段的酵母人工染色体来并入人基因。提供所有期望的修饰的动物随后通过将含有少于修饰的全部补充的中间转基因动物杂交而作为后代获得。此类非人动物的一个实例是如PCT公开WO 96/33735和WO 96/34096中公开的称为Xenomouse^TM的小鼠。该动物产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。抗体可以在用目标免疫原免疫后例如作为多克隆抗体的制备物直接获自动物，或可选地获自来源于动物的无限增殖化B细胞诸如产生单克隆抗体的杂交瘤。另外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可以回收并表达以直接获得抗体，或可以进一步修饰以获得抗体的类似物，例如诸如单链Fv(scFv)分子。

产生缺乏内源免疫球蛋白重链的表达的非人宿主(示例为小鼠)的方法实例公开于美国专利号5,939,598中。它可以通过这样的方法获得，所述方法包括在胚胎干细胞中的至少一个内源重链基因座缺失J区段基因以防止基因座重排并防止重排的免疫球蛋白重链基因座的转录物形成，缺失通过含有编码可选择标记物的基因的靶向载体来起效；和从胚胎干细胞中产生其体细胞和生殖细胞均含有编码可选择的标记物的基因的转基因小鼠。

产生目标抗体诸如人抗体的一种方法公开于美国专利号5,916,771。该方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养物中的一个哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入到另一个哺乳动物宿主细胞中，并融合两个细胞以形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。

在对该程序进一步改进中，鉴定免疫原上的临床相关表位的方法和选择以高亲和力特异性结合相关表位的抗体的相关方法公开于PCT公开WO 99/53049。

抗体可以由含有编码上文所述的单链抗体的DNA区段的载体表达。

这些可以包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括诸如描述于WO 93/64701中的化学缀合物，其具有靶向部分(例如对细胞表面受体的配体)、和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)、病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)、诸如描述于PCT/US95/02140(WO 95/22618)的融合蛋白(其是含有靶部分(例如对靶细胞特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白)、质粒、噬菌体等。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。

优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体(pox vector)诸如天花或禽痘(orthopox or avipox)载体、疱疹病毒载体诸如单纯疱疹病毒I(HSV)载体(参见Geller，A.I.等人，J.Neurochem，64：487(1995)；Lim，F.，等人，in DNA Cloning：MammalianSystems，D.Glover，Ed.(Oxford Univ.Press，Oxford England)(1995)；Geller，A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.：U.S.A.90：7603(1993)；Geller，A.I.，等人，Proc Natl.Acad.SciUSA 87：1149(1990)、腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人，Science，259：988(1993)；Davidson，等人，Nat.Genet 3：219(1993)；Yang，等人，J.Virol.69：2004(1995)和腺伴随病毒载体(参见Kaplitt，M.G.等人，Nat.Genet.8：148(1994)。

痘病毒载体将基因引入到细胞质内。禽痘病毒载体导致核酸的仅短期表达。腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体对于将核酸引入神经细胞是优选的。腺病毒载体导致比腺伴随病毒(约4个月)更短期的表达(约2个月)，腺伴随病毒依次比HSV载体更短。所选的具体载体将取决于靶细胞和处理的条件。引入可以通过标准技术例如感染、转染、转导或转化。基因转移的模式的实例包括例如裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞微注射和病毒载体。

可以利用载体以基本上靶向任何期望的靶细胞。例如，立体定向注射可以用于将载体(例如腺病毒、HSV)导向期望位置。另外，微粒可以通过使用微泵输注系统诸如SynchroMed Infusion System脑室内(icv)输注来递送。基于总体流量的方法(称为对流)也已证实在递送大分子至脑的延展区域是有效的并可以用于递送载体至靶细胞。(参见Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-2080(1994)；Morrison等人，Am.J.Physiol.266：292-305(1994))。可以使用的其他方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，和口服或其他已知的施用途径。

双特异性抗体是对于至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在本发明中，结合特异性之一是对于靶诸如CD47或其任何片段。第二结合靶是任何其他抗原，且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。类似程序公开于WO93/08829，于1993年5月13日公开，和公开于Traunecker等人，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。

本方面的双特异性和/或单价抗体可以使用多种本领域公认的技术中的任一种，包括于2011年8月16日提交的共同待审申请WO 2012/023053(其内容通过引用以其整体并入本文)中公开的那些来制备。描述于WO 2012/023053中的方法生成结构上与人免疫球蛋白相同的双特异性抗体。这类分子由两个拷贝的独特的重链多肽、融合至恒定κ结构域的第一轻链可变区和融合至恒定λ结构域的第二轻链可变区构成。每一结合位点展示重链和轻链贡献的不同的抗原特异性。轻链可变区可以是λ或κ家族，并且优选分别融合至λ和κ恒定结构域。这是优选的以避免生成非天然多肽接头。然而，也可以通过将κ轻链可变结构域融合至恒定λ结构域(对于第一特异性)并将λ轻链可变结构域融合至恒定κ结构域(对于第二特异性)来获得本发明的双特异性抗体。WO 2012/023053中描述的双特异性抗体称为IgG κλ抗体或“κ λ体”，一种新的完全人双特异性IgG形式。该κ λ体形式允许双特异性抗体的亲和力纯化，所述双特异性抗体与具有与标准单克隆抗体难以区分并因此当与之前形式相比时有利的特征的标准IgG分子难以区分。

方法的必要步骤是鉴定具有分享相同的重链可变结构域的不同抗原特异性的两个抗体Fv区(每个由可变轻链和可变重链结构域构成)。多种方法已描述生成单克隆抗体及其片段。(参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow E，and Lane D，1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，通过引用并入本文)。完全人抗体是其中轻链和重链两者的序列包括CDR 1和2均来自人基因的抗体分子。CDR3区可以是人起源或由合成方法设计。此类抗体本文称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等人，1983 Immunol Today4：72)；和EBV杂交瘤技术来制备以产生人单克隆抗体(参见Cole，等人，1985 In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。人单克隆抗体可以利用并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote，等人，1983.Proc Natl Acad SciUSA 80：2026-2030)或通过用EB病毒体外转化人B细胞(参见Cole，等人，1985 In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)来产生。

例如，通过用靶抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫动物来生成单克隆抗体。或者，用这样的细胞免疫动物，所述细胞用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染，使得靶抗原表达并与转染细胞的表面结合。用于产生异种非人动物的多种技术是本领域熟知的。例如，参见美国专利号6,075,181和6,150,584，其以其整体通过引用并入本文。

或者，通过筛选含有结合靶抗原的抗体或抗原结合结构域序列的文库来获得抗体。该文库例如在噬菌体中制备为与表达于装配的噬菌体颗粒的表面上的噬菌体外壳蛋白和噬菌体颗粒内包含的编码DNA序列的蛋白或肽融合体(即“噬菌体展示文库”)。

由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤随后针对靶抗原的反应性进行筛选。单克隆抗体例如使用杂交瘤方法诸如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些方法来制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物通常用免疫剂进行免疫来引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。

尽管并非严格不可能，但具有相同重链可变结构域但针对不同抗原的不同抗体的偶然的鉴定是高度不可能的。实际上，在大部分情况下，重链对抗原结合表面做出大部分贡献，并且在序列上也是最可变的。具体而言，重链上的CDR3在序列、长度和结构上是最不同的CDR。因此，对不同抗原特异的两种抗体将几乎一定携带不同的重链可变结构域。

在共同待审申请WO 2012/023053中公开的方法克服了这一限制，并极大地促进通过使用抗体文库分离具有相同重链可变结构域的抗体，在所述抗体文库中重链可变结构域对于所有文库成员均是相同的并因此多样性限于轻链可变结构域。此类文库例如描述于共同待审申请WO 2010/135558和WO 201I/084255中，其每一个以其整体通过引用并入本文。然而，因为轻链可变结构域与重链可变结构域共同表达，因此两个结构域都可以对抗原结合有贡献。为了进一步促进方法，含有相同重链可变结构域和多样的λ可变轻链或κ可变轻链的抗体文库可以平行使用来体外选择针对不同抗原的抗体。该方法能够鉴定具有共同的重链但一个携带λ轻链可变结构域而另一个携带κ轻链可变结构域(其可用作生成本发明的完全免疫球蛋白形式中的双特异性抗体的结构单元)的两种抗体。本发明的双特异性抗体可以是不同的同种型且其Fc部分可以修饰以改变对不同Fc受体的结合特性和以该方式修饰抗体的效应子功能以及其药代动力学特性。修饰Fc部分的多种方法已描述并可应用于本发明的抗体。(例如参见Strohl，WR Curr Opin Biotechnol 2009(6)：685-91；美国专利号6,528,624；于2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本发明的方法还可以用于生成以缺乏Fc部分的F(ab’)2形式的双特异性抗体和抗体混合物。

共同的重链和两个不同轻链共表达入单个细胞以允许装配本发明的双特异性抗体。如果所有多肽以相同水平表达且同样好地装配以形成免疫球蛋白分子，则随后单特异性(相同轻链)和双特异性(两种不同轻链)的比例应为50％。然而，可能不同轻链以不同水平表达和/或不以相同效率装配。因此，调节不同多肽相对表达的方法用于补偿它们的固有的表达特征或不同倾向，以与共同重链装配。该调节可以经启动子强度、使用特征在于不同效率的内部核糖体进入位点(IRES)或其他类型的调节元件(其可作用于转录或翻译水平以及作用于mRNA稳定性)来实现。不同强度的不同启动子可以包括CMV(立即早期巨细胞病毒启动子)；EF1-1α(人延伸因子1α-亚基启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猿猴病毒40启动子)。来自哺乳动物和病毒起源的不同的IRES也已经描述。(参见例如Hellen CU和SarnowP.Genes Dev 2001 15：1593-612)。这些IRES可以在其长度和核糖体补充效率上极大不同。此外，可以通过引入IRES的多个拷贝进一步调整活性(Stephen等人2000 Proc Natl AcadSci USA 97：1536-1541)。表达的调节还可以通过细胞的多次连续转染以增加表达一种或另一种轻链的各个基因的拷贝数并因此修饰其相对表达来实现。本文提供的实施例证实控制不同链的相对表达对于将双特异性抗体的装配和总体产率最大化是至关重要的。

重链和两种轻链的共表达生成三种不同抗体的混合物至细胞培养上清液中：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化以获得目标分子。本文描述的方法通过使用亲和层析介质(其特异性与κ或λ轻链恒定结构域诸如CaptureSelect Fab κ和CaptureSelect Fab λ亲和基质(BAC BV，Holland)相互作用)极大地促进该纯化程序。这种多步骤亲和层析纯化方法是有效的并通常可应用于本发明的抗体。这与特定的纯化方法截然相反，所述纯化方法必须进行开发并对来源于细胞杂交瘤或其他表达抗体混合物的细胞系的每一双特异性抗体进行优化。实际上，如果混合物中的不同抗体的生物化学特征是相似的，则使用标准层析技术诸如离子交换层析对其分离可能是挑战性的，或者根本不可能。

其他合适的纯化方法包括于2012年10月19日提交的共同待审申请PCT/IB2012/003028公开为WO2013/088259中公开的那些，其内容以其整体通过引用并入本文。

在产生双特异性抗体的其他实施方案中，具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。融合体优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，包含至少部分铰链、CH2、和CH3区。优选具有含有对于至少一个融合体中存在的轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA和(如期望)免疫球蛋白轻链插入分开的表达载体内，并共转染入合适的宿主生物中。对于生成双特异性抗体的进一步细节例如见Suresh等人，Methods in Enzymology，121：210(1986)。

根据WO 96/27011中描述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可以工程化以将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包括抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。相同或相似大小的对大侧链的补偿“腔”(Compensatory“cavities”)通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上产生。这提供了提高异二聚体相对于其他不想要的末端产物诸如同二聚体的产率的机制。

从抗体片段生成双特异性抗体的技术已描述于文献中。例如，双特异性抗体可以使用化学键制备。产生的双特异性抗体可以用作用于酶的选择性固定的试剂。

从重组细胞培养物中直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术也已描述。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接至两个不同抗体的Fab′部分。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，并随后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法还可以用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已提供制备双特异性抗体片段的可选机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(V_L)相连的重链可变结构域(V_H)，所述接头非常短以致于无法允许相同链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一片段的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略也已报道。参见Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。

考虑具有多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。

示例性双特异性抗体可以结合两种不同表位，其至少一种起源于本发明的蛋白抗原。可选地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合白细胞上的引发分子诸如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28、或B7)或IgG的Fc受体(Fc γ R)，诸如Fc γ RI(CD64)、Fc γ RII(CD32)和Fc γ RIII(CD16)的臂组合，以将细胞防御机制集中在表达具体抗原的细胞上。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂导向表达具体抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA的臂。另一种目的双特异性抗体结合本文所述的蛋白抗原并且还结合组织因子(TF)。

异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体由两个共价连接的抗体构成。此类抗体例如已提出以靶向免疫系统细胞至不想要的细胞(参见美国专利号4,676,980)和用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。应考虑抗体可以使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)体外制备。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(mercaptobutyrimidate)和例如美国专利号4,676,980中公开的那些。

可以期望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，以增强例如抗体在治疗癌症和/或与异常CD47表达和/或活性相关的其他疾病或病症中的效力。例如，可以将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区，由此允许该区中链间二硫键形成。因此生成的同二聚抗体可以具有改进的内化的能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人，J.Exp Med.，176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，148：2918-2922(1992))。可选地，具有双Fc区的抗体可以工程化并由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。(参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design，3：219-230(1989))。

本发明还涉及包含缀合至细胞毒性剂诸如毒素(例如细菌、真菌、植物、或动物起源的酶促活性毒素、或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)的抗体的免疫缀合物。

可以使用的酶促活性毒素或其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多种放射性核素可用于生产放射性缀合的抗体。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y、和¹⁸⁶Re。

抗体和细胞毒性剂的缀合物使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，所述双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二酰亚胺HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如亚苄基(tolyene)2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于缀合放射性核素至抗体的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。

本领域普通技术人员将公认许多种可能的部分可以偶联至本发明所得的抗体。(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis，Jr(eds)，Carger Press，New York，(1989)，其完整内容通过引用并入本文)。

偶联可以通过任何化学反应完成，所述化学反应将结合两个分子，只要抗体和其他部分保留其各自活性。该连接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。然而，优选的结合是共价结合。共价结合可以通过直接缩合存在的侧链或通过掺入外部桥接分子来实现。许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白分子，诸如本发明的抗体，至其他分子。例如，代表性的偶联剂可以包括有机化合物诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和环己二胺。该列表不旨在排除本领域已知的各种类别的偶联剂，而是示例更多常见的偶联剂。(参见Killen和Lindstrom，Jour.Immun.133：1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62：185-216(1982)；和Vitetta等人，Science 238：1098(1987)。

优选的接头描述于文献中。(参见例如Ramakrishnan，S.等人，Cancer Res.44：201-208(1984)，其描述使用MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。还参见美国专利号5,030,719，其描述使用借助于寡肽接头偶联至抗体的卤代的乙酰基酰肼衍生物。特别优选的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸化物；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基(pridyl)-二硫代)-甲苯(PierceChem.Co.，Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，Cat#21651G)；(iv)硫代-LC-SPDP(硫代琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)缀合至EDC的硫代-NHS(N-羟基硫代-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。

上述接头含有具有不同属性因而导致缀合物具有不同物理化学特性的组分。例如，烷基羧酸酯的硫代-NHS酯比芳香羧酸酯的硫代-NHS酯更稳定。含有接头的NHS-酯比硫代-NHS酯溶解度更低。此外，接头SMPT含有空间位阻的二硫键，并可以形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键一般说来比其他键更不稳定，因为二硫键体外切割，导致更少可获得的缀合物。尤其是硫代-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与硫代-NHS一同使用时，碳二亚胺偶联(诸如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应对水解更具有抗性的酯。

本文公开的抗体还可以配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。

特别有用的脂质体通过用包含磷脂酰胆碱、胆固醇、和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物的反向蒸发法来生成。脂质体经确定孔径的滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以如Martin等人，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)中描述经由二硫化物交换反应缀合至脂质体。

抗CD47抗体的用途

将理解的是根据本发明施用治疗实体将与合适的载体、赋形剂、和其他试剂(其掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等)施用。多种适合的制剂可以在所有药剂师已知的处方集中发现：Remington′s Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1975))，尤其是其中的由Blaug，Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂类(lipids)、含有小泡(诸如Lipofectin^TM)的脂质(lipid)(阳离子的或阴离子的)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳状液、乳状液聚乙二醇(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有聚乙二醇的半固体混合物。任何前述混合物可以根据本发明在治疗和疗法中是适合的，条件是制剂中的活性组分不会被制剂失活，并且制剂与施用途径是生理上相容的且可耐受的。还参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，Wang W.“Lyophilization anddevelopment of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman WN“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-someemerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)，Powell等人“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)及其中对关于药物化学家熟知的制剂、赋形剂和载体的额外信息的引用。

本发明的治疗制剂(其包括本发明的抗体)用于治疗或减轻与癌症相关的症状，例如但不限于，白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌和支气管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌和肾盂癌、口腔和咽癌、子宫体癌、和/或黑色素瘤。本发明还提供治疗或减轻与癌症相关的症状的方法。治疗方案通过使用标准方法鉴定主体，例如患有癌症(或处于发生癌症的风险中)的人主体来进行。

测定治疗连同任何已知的用于诊断或治疗特定免疫相关病症的方法的有效性。减轻免疫相关病症的一种或多种症状表明抗体赋予临床益处。

用于筛选具有期望的特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和其他本领域已知的免疫介导的技术。

针对靶诸如CD47、肿瘤相关抗原或其他抗原(或其片段)的抗体可以用在本领域内与这些靶的定位和/或定量相关的方法中，例如用于测量这些靶在合适的生理样品中的水平，用于诊断方法，用于成像蛋白等等)。在给定的实施方案中，将对这些靶的任何特异性的抗体、或其衍生物、片段、类似物或同源物(其含有抗体衍生的抗原结合结构域)用作药学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。

本发明的抗体可以用于使用标准技术诸如免疫亲和、层析或免疫沉淀分离特定靶。本发明的抗体(或其片段)可以作为临床测试程序的一部分在诊断上用于监测组织中的蛋白水平，例如以测定给定治疗方案的效力。检测可以通过偶联(即物理交联)抗体至可检测的物质而变得容易。可检测物质的实例包括各种酶、辐基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辐基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白，并且合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

包括多克隆、单克隆、人源化和完全人抗体的本发明的抗体可用作治疗剂。此类试剂通常将用于治疗或预防与给定靶在主体中的异常表达或活化相关的疾病或病理。将抗体制剂，优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制剂施用于主体并通常将由于其与靶结合而具有作用。施用抗体可以消除或抑制或干扰靶的信号传递功能。施用抗体可以消除或抑制或干扰靶与内源配体(靶与所述配体天然结合)的结合。例如，抗体结合靶并中和或另外抑制CD47和SIRP α之间的相互作用。

本发明的抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上所指出，这可以是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰靶的功能。待施用所需的量此外将取决于抗体对其特定抗原的结合亲和力，并还取决于所施用的抗体从其所施用的其他主体的自由体积耗尽的速率。本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的通常范围可以是但不限于约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。通常给药频率范围可以是例如从每天两次至每周一次。

本发明的抗体或其片段可以以药物组合物的形式施用用于治疗多种疾病和病症。涉及制备此类组合物的原则和考虑以及选择组分的指导例如提供于Remington：TheScience And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro，等人，编辑)MackPub.Co.，Easton，Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，And Trends，Harwood Academic Publishers，Langhorne，Pa.，1994；和Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991，M.Dekker，New York。

当使用抗体片段时，特异性结合靶蛋白的结合结构域的最小抑制性片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993))。制剂还可以含有对于待治疗的具体适应症必需的多于一种活性化合物，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。可选地，或另外，组合物可以包含增强其功能的试剂，诸如例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子合适地以对于预期目的有效的量组合存在。

活性成分还可以包入制备的微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，例如在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒、和纳米胶囊)或在粗乳剂(macroemulsion)中分别为羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以容易地通过经无菌过滤膜来实现。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射的微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白为更短的时期。

根据本发明的抗体可以用作用于检测样品中给定靶(或其蛋白片段)存在的试剂。在一些实施方案中，抗体含有可检测的标记。抗体是多克隆的，或更优选地，是单克隆的。使用完整抗体或其片段(例如F_ab、scFv、或F_(ab)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”意在涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和用生物素末端标记DNA探针，使得其可以用荧光标记的链霉抗生物素检测。术语“生物样品”意在包括分离自主体的组织、细胞和生物流体，以及主体内存在的组织、细胞和流体。因此，包括在术语“生物样品”的使用中的是血液和血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴。即，本发明的检测方法可以用于体外和体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印记、免疫沉淀和免疫荧光。检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。进行免疫测定的程序例如描述于“ELISA：Theory and Practice：Methods in Molecular Biology”，Vol.42，J.R.Crowther(Ed.)Human Press，Totowa，NJ，1995；“Immunoassay”，E.Diamandis和T.Christopoulus，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1996；and“Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays”，P.Tiissen，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985。此外，检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入主体内。例如，可以将抗体用放射性标记物标记，所述放射性标记物在主体内的存在或位置可以通过标准成像技术来检测。

药物组合物

本发明的抗体(本文也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可以掺入适合于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意在包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与药物施用是相容的。合适的载体描述于最近版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences中，其是本领域的标准参考书，其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。脂质体和非含水载体诸如不挥发性油也可以使用。使用此类介质和试剂用于药学上有活性的物质是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂范围之外，其在组合物中的使用均被考虑。还可以将补充的活性化合物掺入组合物中。

将本发明的药物组合物配制为与其旨在的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(即局部的)、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱调节，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶内。

适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水可溶的)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是流动的直至易于可注射性的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须针对微生物诸如细菌或真菌的污染作用是防腐的。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用涂料诸如卵磷脂，通过在分散的情况下维持期望的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如蔗糖、多元醇诸如甘露醇(manitol)、山梨醇、或氯化钠。可注射的组合物延长的吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达到。

无菌的可注射溶液可以通过将活性化合物以需要的量掺入具有一种上文列举的成分或其组合的合适的溶剂中(如需要，随后为过滤灭菌)来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌的媒介物含有基础分散介质和上文列出的那些中的需要的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其之前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以装在明胶胶囊内或压缩成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以掺有赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口剂的流体载体来制备，其中将流体载体中的化合物口服应用并漱口且吐出或吞下。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以包括作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或增味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。

对于通过吸入施用，化合物以来自加压的容器或分液器(其含有合适的推进剂例如气体诸如二氧化碳)或喷雾器的气溶胶喷雾的形式递送。

全身施用还可以通过透粘膜或经皮方式。对于透粘膜或经皮施用，对于待渗透的屏障合适的渗透剂可用于制剂中。此类渗透剂通常是本领域已知的且包括例如对于透粘膜使用为去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制入本领域通常已知的油膏(ointment)、药膏(salves)、凝胶或乳膏中。

化合物还可以制备为用于直肠递送的栓剂(例如，与常规栓剂基质诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式。

在一个实施方案中，将活性化合物与将保护所述化合物免于从机体快速排除的载体制备，诸如控释制剂，包括埋植剂和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。材料还可以商业获自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂质体悬浮液(包括靶向受感染的细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法例如美国专利号4,522,811中描述的进行制备。

为了容易施用和剂量的一致性，尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的主体的单一剂量的物质上分离的单位(physically discrete units)；每一单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物和必需的药物载体。对本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果以及在调配此类用于治疗个体的活性化合物的领域中固有的限制所指明且直接取决于它们。

药物组合物可以连同施用说明书一起包括在容器、包装或分液器中。

本发明将在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

具体实施方式

实施例

实施例1：人CD47的克隆、表达和纯化

克隆。将对应于人CD47(hCD47)的胞外域的序列通过聚合酶链反应(PCR)使用特定寡核苷酸从人cDNA扩增。将扩增产物凝胶纯化并克隆入pEAK8哺乳动物表达载体(EdgeBiosystems，Gaithersburg，MD)。将载体进一步修饰以在C末端引入Avitag^TM(Avidity，Denver CO)和六组氨酸标签，其允许蛋白的单位点生物素化和通过IMAC(ImmobilizedMetal Ion Affinity Chromatography)纯化。将构建体通过DNA测序进行验证。

表达。随后使用基于脂质体的转染试剂诸如TransIT-LT1(Mirus，Madison，WI)将质粒转染入哺乳动物细胞。转染步骤仅需要少量的DNA和细胞，通常为2x10⁵个细胞和2μg质粒DNA/孔，并且转染在6孔板中进行。尽管可以使用不同的哺乳动物细胞系，但在下文给出的实施例中，转染转化的人胚肾单层上皮细胞(PEAK细胞)。这些细胞稳定表达EBNA-1基因，进一步支持附加型复制过程，是半粘附的并且可以在标准条件细胞培养箱(5％CO2；37℃于添加有10％胎牛血清的DMEM培养基中)下生长。24小时后，通过添加含有0.5-2μg/mL嘌呤霉素的培养基将细胞置于选择条件下，因为携带附加型载体的细胞对这种抗生素是有抗性的。

转染后两至三周，用于接种Tri瓶(Tri-flask)或一次性CELLine生物反应器用于生产步骤。CELLine是可以在标准细胞培养箱内使用的两区室生物反应器。较小的区室(15ml)含有细胞并且与较大(一升)的含培养基的区室通过具有10kDa的截止大小的半透性膜分隔开(Bruce等人2002，McDonald等人2005)。该系统允许营养物、gazes和代谢废物的扩散，同时保留细胞和分泌的蛋白于较小区室中。在收获上清液之前，培养保持7-10天。由于培养基含有血清，因此细胞维持良好活力并且使用相同细胞和容器可以进行几次生产运行。

纯化。收获后，将细胞培养上清液通过离心澄清并经0.22μm膜过滤。来自Tri瓶的上清液使用含有具有合适的截止大小以保留目的蛋白的膜的浓缩设备诸如SartoFlow 200(Sartorius)浓缩20-40次。使用CELLine生物反应器则不需要该步骤，这是因为从细胞区室回收的体积小。此外，浓缩步骤提高目的蛋白和高分子量污染物诸如牛血清白蛋白或免疫球蛋白的浓度。相反，从CELLine生物反应器的细胞区室回收的上清液含有浓缩的重组蛋白和低水平的污染物，因为它们无法跨过分隔开反应器的两个室的10kDa膜。这种提高的重组蛋白与污染物比率极大地增强了使用IMAC的纯化效率。浓缩的上清液随后添加100mM咪唑并装载到Ni-NTA亲和层析树脂(Qiagen)上。相对高浓度的咪唑将污染物与树脂的结合降到最低。洗涤柱后，将蛋白在Prime层析系统(Amersham Pharmacia Biotech)上使用30mL咪唑梯度(20-400mM咪唑)以2mL/min的流速洗脱。洗脱液梯度进一步提高重组蛋白的纯度，但如果没有层析系统，则可以由步骤洗脱方法来替代。洗脱的级分可以通过SDS-PAGE或ELISA分析来测定它们在重组蛋白中的含量。合并目标级分并在用磷酸缓冲盐溶液或另一种合适的缓冲液平衡的PD-10柱(GE Healthcare)上脱盐。脱盐的蛋白可以随后使用多种技术定量并且其纯度可以通过SDS-PAGE分析。重组CD47使用生物素连接酶(Avidity，Denver CO)根据制造商说明书体外生物素化。脱盐后，使用链霉抗生物素磁珠和SDS-PAGE分析通过拉下测定(pull-down assay)来评估生物素化水平。

实施例2：人CD19的克隆、表达和纯化

克隆。将对应于人CD19(hCD19)的胞外域的序列通过聚合酶链反应(PCR)使用特定寡核苷酸从人cDNA扩增。将扩增产物凝胶纯化并克隆入pEAK8哺乳动物表达载体(EdgeBiosystems，Gaithersburg，MD)。将载体进一步修饰以在C末端引入Avitag^TM(Avidity，Denver CO)和六组氨酸标签，其允许蛋白的单位点生物素化和通过IMAC(ImmobilizedMetal Ion Affinity Chromatography)纯化。将构建体通过DNA测序进行验证。

表达和纯化。可溶性hCD19的表达、纯化和生物素化如实施例1中所述进行。

实施例3：使用含有固定的可变重链的人scFv文库的噬菌体展示选择

用于构建和操作展示在M13噬菌体上的人scFv文库的一般程序描述于Vaughan等人，(Nat.Biotech.1996，14：309-314)，其以其整体通过引用并入本文。用于选择和筛选的文库编码均共享相同VH结构域并仅仅在VL结构域中不同的scFv。用于生产固定的VH文库的方法及其用于鉴定和装配双特异性抗体的用途描述于US 2012/0184716和WO 2012/023053，其每一个以其整体通过引用并入本文。鉴定结合hCD19或hCD47的scFv的程序下文描述。

液相选择。将等分试样的scFv噬菌体文库(10¹² Pfu)用含有3％(w/v)脱脂奶的PBS在室温下在旋转混合仪中封闭一小时。封闭的噬菌体随后在链霉抗生物素磁珠(Dynal M-280)上在室温下在旋转混合仪上去选择一小时。去选择的噬菌体随后与体内生物素化的hCD18或hCD47(100nM)在旋转混合仪上在室温下孵育两小时。使用磁力架俘获珠，随后用PBS/0.1％Tween 20洗涤四次和用PBS洗涤3次。随后将珠直接加入10ml指数生长的TG1细胞并在37℃下缓慢摇动(100rpm)孵育一小时。将一等分试样的感染的TG1连续稀释以滴定选择输出(selection output)。剩余感染的TG1以3000rpm离心15分钟并在0.5ml 2xTY-AG(含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xTY培养基)中重悬并铺于2xTYAG琼脂Bioassay板上。在30℃下过夜孵育后，向板上加入10ml 2xTYAG并将细胞从表面上刮下并转移至50ml聚丙烯管中。将含有50％甘油的2xTYAG加入细胞悬浮液中以获得17％甘油的终浓度。将选择轮次的等分试样保持在-80℃。

噬菌体拯救。将来自之前选择轮次的100μl细胞悬浮液加入到20ml的2xTYAG中并在37℃下摇动(240rpm)生长直至达到0.3-0.5的OD₆₀₀。随后将培养物用3.3x 10¹⁰ MK13K07辅助噬菌体双重感染(super-infected)并在37℃(150rpm)下孵育一小时。随后将培养基交换，通过将细胞以2000rpm离心10分钟，去除培养基并将沉淀在20ml的2xTY-AK(100μg/ml氨苄青霉素；50μg/ml卡那霉素)中重悬。随后将培养物在30℃(240rpm)下生长过夜。第二天，将含有噬菌体的上清液用于下一轮选择。

细胞表面选择。将含有噬菌体的上清液用含有3％(w/v)脱脂奶的PBS在室温下在旋转混合仪上封闭一小时。封闭的噬菌体随后在不表达CD19并且之前已经用含有2％(w/v)脱脂奶的PBS封闭的Jukat T细胞上去选择一小时。随后将去选择的噬菌体与表达CD19的2x10⁷Raji细胞在室温下轻柔摇动孵育一小时。随后将细胞沉淀并用PBS洗涤十次。结合的噬菌体通过直接加入10ml指数生长的TG1至T75瓶中并在37℃缓慢摇动孵育一小时来洗脱。将一等分试样的感染的TG1连续稀释以滴定选择输出(selection output)。感染的TG1以3000rpm离心15分钟并在0.5ml 2xTY-AG(含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xTY培养基)中重悬并铺于2xTYAG琼脂Bioassay板上。在30℃下过夜孵育后，向板上加入10ml2xTYAG并将细胞从表面上刮下并转移至50ml聚丙烯管中。将含有50％甘油的2xTYAG加入细胞悬浮液中以获得17％甘油的终浓度。将选择轮次的等分试样保持在-80℃。

用于结合和功能测试的scFv周质制备物。涤单独克隆接种入含有0.9ml的2xTYAG培养基(0.1％葡萄糖)/孔的深孔微量滴定板中并在37℃下生长5-6小时(250rpm)。随后将100μl的于2xTY培养基中的0.2mM IPTG/孔加入以产生0.02mM IPTG的终浓度。随后将板在30℃下以250rpm摇动孵育过夜。将深孔板以2,500rpm离心10分钟并小心移除上清液。将沉淀重悬于150μl TES缓冲液(50mM Tris/HC1(pH8)，1mM EDTA(pH 8)，20％蔗糖，补充有完全蛋白酶抑制剂，Roche)。通过加入150μl稀释的TES缓冲液(1∶5TES∶水稀释)并在冰上孵育30分钟产生低渗休克。随后将板以4000rpm离心10分钟以去除细胞和碎片。将上清液小心地转移入另一微量滴定板中并保持在冰上用于在功能测定或结合测定中立即测试。

噬菌体克隆测序。将单个克隆置于含有150μl的2xTYAG培养基(2％葡萄糖)/孔的微量滴定板中并在30℃下(120rpm)生长过夜。第二天，将5μl培养物转移入含有45μl的dH₂O的另一板中并混合。随后将板在-20℃冷冻。融化后，将1μl的该悬浮液用于PCR扩增，使用标准PCR方案和pNDS1特异性的引物：mycseq，5’-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3’(SEQ ID NO：283)和gene3leader，5’-TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT-3’(SEQ ID NO：284)。PCR反应物在96孔格式中使用Montage PCRμ96系统(Millipore)纯化。将5μl洗脱的DNA使用mycseq和gene3leader引物进行测序。

实施例4：筛选scFv结合hCD47和scFc抑制SIRP α相互作用

结合：筛选scFv结合hCD47使用FMAT技术在同质测定中进行测试。将以下试剂在384光学板(Costar)的每一孔中混合：30μl的包被有生物素化的hCD47或对照生物素化蛋白(NusA)的链霉抗生物素聚苯乙烯珠悬浮液(Spherotech；3000珠/孔)；60μl的scFv周质制备物；10μl的检测缓冲液(含有5μg/mL的抗cmyc抗体的PBS；1∶200稀释的抗小鼠FcAlexaFluor 647)。以450rpm混合5分钟后，将384孔板在室温孵育并在1小时和3小时后在FMAT 8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems)上读取。每一scFv样品针对hCD47和NusA一式两份测试。选择表达scFv的产生对于hCD47而非NusA的特异性信号的克隆进行进一步分析。

CD47-SIRP α相互作用的抑制：还使用FMAT技术在基于珠的同质测定中筛选scFv其抑制CD47和SIRP α之间的相互作用的能力。将蛋白A聚苯乙烯珠(Spherotech)与5μg/mL山羊抗人IgG Fcy特异性的(Jackson lmmunoresearch)孵育。洗涤珠后，将5μg/mL SIRP α-Fc(R&D Systems)加入，使得融合蛋白可以在珠表面被俘获。用PBS；2％Tropix 1-block(Applied Biosystems)封闭后，将包被的30μl珠悬浮液(3000个珠/孔)加入到384光学板(Costar)的每孔中。在单独的96孔板中，将120μl的scFv周质制备物与24μl的生物素化的hCD47(300ng/ml)混合，并在室温下孵育50分钟使得scFv可以结合hCD47。孵育后，将24μl的链霉抗生物素Cy5(1μg/ml；Invitrogen)添加至混合物中并将70μl的该最终混合物添加至384孔板的每孔中的30μl珠中。在室温孵育3小时后，随后在FMAT 8200 CellularDetection System(Applied Biosystems)上读取板。将不含有scFv或含有不结合CD47的不相关scFv的对照孔包括在每一板中，使得选择表达scFv导致对照中测量的SIRP α-CD47信号降低的克隆用于进一步分析。

可选地，还使用监测可溶性SIRP α与在稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的表面上表达的hCD47相互作用的基于细胞的测定来筛选候选物。将含有3000个表达hCD47的CHO细胞的20μl的PBS-BSA 2％叠氮化物0.1％加入到384光学板(Costar)的每孔中。随后将50μl的两倍稀释的scFv周质制备物加入孔中并在室温下孵育30分钟以允许scFv结合至细胞上的CD47。孵育后，将30μl的含有10ng/ml的SIRP α-Fc(R&D systems)和抗hIgG-Fc FMATBlue偶联的抗体(1∶2000稀释)的PBS 2％BSA叠氮化物0.1％加入并再孵育3小时，随后在FMAT 8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems)上读取。

实施例5：筛选scFv结合hCD19

筛选scFv结合重组hCD19使用FMAT技术如实施例4中所述在同质测定中进行测试。

还在Raji细胞上对于结合至hCD19的天然形式进行筛选。向384光学板(Costar)的每孔中加入含有3000Raji细胞(表达CD19的人B细胞系)或Jurkat细胞(不表达CD19的人T细胞系)的30μl的PBS-BSA2％叠氮化物0.1％。随后，30μl的两倍稀释的scFv周质制备物，30μl的PBS-BSA2％和10 30μl的10X检测缓冲液(在PBS-BSA2％中1∶700稀释的Qiagen AntibodypentaHis AF647)。以450rpm混合5分钟后，将384孔板在室温孵育并在1小时和3小时后在FMAT 8200Cellular Detection System(Applied Biosystems)上读取。选择表达scFv的产生对于Raji而非Jurkat细胞的特异性信号的克隆进行进一步分析。

实施例6：固定的VH候选重新格式为IgG和在哺乳动物细胞中瞬时表达

筛选后，将针对hCD19或hCD47的scFv候选物重新格式(reformat)为IgG并通过瞬时转染入PEAK细胞来表达。所选的scFv的VH和VL序列用特异性寡核苷酸扩增并克隆入含有重链和轻链恒定区的表达载体，并通过测序验证构建。将表达载体使用Fugene 6Transfection Reagent(Roche，Basel，Switzerland)转染入哺乳动物细胞。简言之，将Peak细胞以6x 10⁵细胞/孔的浓度在6孔板中在2ml含有胎牛血清的培养基中培养。根据制造商说明书使用Fugene 6 Transfection Reagent将编码候选VH和VL序列的表达载体共转染入细胞。转染后一天，抽吸培养基，并将3ml新鲜的无血清培养基加入细胞并在37℃下培养3天。三天培养周期后，收集上清液用于根据制造商说明书在蛋白G-Sepharose 4B快速流动柱(Sigma，St.Louis，MO)上IgG纯化。简言之，将来自转染细胞的上清液在4℃下与ImmunoPure(G)IgG结合缓冲液(Pierce，Rockford IL)孵育过夜。随后将样品经过蛋白G-Sepharose4B快速流动柱并使用洗脱缓冲液随后纯化IgG。将洗脱的IgG级分随后针对PBS透析并通过在280nm吸收定量IgG含量。纯度和IgG完整性通过SDS-PAGE验证。

实施例7：抗hCD47抗体的亲和力调节

(a)抗体Ka3、Ke8和Kc4

选择在上文实施例中描述的筛选过程中鉴定的显示对于人CD47是特异性的并能够阻断CD47和SIRP α之间的相互作用的三种抗体用于亲和力成熟，以提高其亲和力和效力。所有这些抗体共享相同的可变重链但具有不同的可变轻链。Ka3和Ke8包含κ轻链(根据IMGT命名法为IGVK1-39)而Kc4包含λ轻链(IGVL2-14)。通过将多样性引入可变轻链区的CDR1、CDR2和CDR3同时重链可变区保持未修饰，生成展示scFv变体的几个噬菌体文库。对于Ka3生成覆盖7x 10⁵的理论多样性的9x10⁷个转化子的一个文库；对于Ke8生成每个部分覆盖2.4x10⁹的理论多样性的2x10⁸个转化子的两个文库，和对于Kc4生成覆盖2.6x10⁵的理论多样性的3.6x10⁷个转化子的一个文库。这些文库用于如实施例3中所述的噬菌体展示选择，除了选择严格性在轮次之间通过降低不同轮次之间hCD47的浓度而增加：10nM和1nM的hCD47分别用于第一和第二轮选择。使用实施例4中所述的测定筛选所选的变体抑制hCD47和SIRP α之间的相互作用的能力。如以下实施例中所述随后将阳性克隆重新格式为IgG并表征。这些亲和力成熟的努力导致鉴定以下抗VD47抗体：

●Kc8H6；Kc86G9；Kc8A3；Kc8C4；Kc8F1；Kc8B7；Kc8G11；Kc8A8；

Kc8A4；Kc8B2；Kc8C7；Kc8H3；Kc8A2；Kc8H5；Kc8G6；Kc8E8；Kc81A3；

Kc81G9；Kc84G9；Kc8G2；Kc8F2

●Ka3G2；Ka3D3；Ka3A2；Ka3B2；Ka3C5；Ka3A3；Ka3H8；Ka3H3

●Kc4E2；Kc4F4；Kc4A1；Kc4C11；Kc4E10；Kc4B1；Kc4C3；Kc4A4；

Kc4G11；Kc4G9。

(b)5A3抗体对亲和力调节工程化

抗CD47 5A3抗体的VL序列工程化以降低其对其靶的亲和力。将5A3-VL序列与其最接近的种系序列(germline sequence)即根据IMGT命名法的人IGKV1-33比对(图1)。使用该比对，在5A3 VL的CDRL1和CDRL2中鉴定了与种系序列不保守的几个残基。将这些氨基酸中一些突变以改变抗体的结合亲和力。5A3 CDRL3的残基也改变以调节抗体结合且同时靶向CD47上的相同表位。这些不同策略导致鉴定5A3-M3和5A3-M5候选。

这些变体首先在CD47/SIRP α结合测定中测试以确定其相比于亲本5A3抗体的阻断效力(图2)。5A3-M3和5A3-M5在抑制CD47和SIRP α之间的相互作用中均比5A3效力更低，并且5A3-M5显示出最差的抑制效力概况。

这些变体对人CD47的亲和力随后通过表面等离子共振技术评价。5A3、5A3-M3和5A3-M5抗体KD的分别为约2.36E-08、5.60E-08和2.84E-06M。这些数据证实5A3变体相比于亲本抗体以更低的亲和力结合CD47，并且5A3-M5对于人CD47具有最弱的亲和力而5A3-M3具有中等亲和力。

实施例8：CD47抗体的表征

CD47抗体与huCD47转染的CHO细胞的结合

CD47单克隆抗体(Mabs)的特异性通过流式细胞术使用用人CD47稳定转染的CHO细胞(CHO-huCD47细胞)显示。未转染的CHO细胞用作对照。简言之，将纯化的CD47 Mabs以10μg/ml的终浓度与CHO-huCD47细胞孵育30分钟。两次洗涤后，结合的CD47抗体使用Cy-5缀合的抗人Fc二级抗体(BD biosciences)检测。图3显示CD47 MAbs与hu-CD47转染的CHO细胞的显著结合，但对于未转染的CHO细胞则无结合(或背景水平的结合)，因此证实本发明的CD47MAbs的特异性。

CD47抗体与HEK293-P细胞的结合

CD47 Mabs的特异性进一步在使用具有siRNA介导的CD47基因敲低的HEK293-P细胞的实验中证实。HEK293-P细胞(Peak细胞)来源于人胚肾细胞并表达低至中等水平的CD47。Peak细胞的CD47缺乏的变体以通过用对CD47基因特异性的siRNA稳定转染它们而生成。在这些CD47敲低的PEAK细胞中CD47抗原的细胞表面表达降低多于85％(数据未显示)。图4证实所选的CD47 MAbs与未转染的Peak细胞和CD47敲低的Peak细胞的结合。CD47 Mabs与CD47siRNA转染的Peak细胞的结合显著降低，因而证实了其抗原特异性。

CD47抗体与食蟹猴CD47的交叉反应性；CD47抗体与人和食蟹猴CD4+T细胞的结合

本发明的CD47单克隆抗体与天然食蟹猴CD47交叉反应的能力通过流式细胞术测试。将CD47抗体与外周血单核细胞(PBMC)中存在食蟹猴CD4阳性的T淋巴细胞的结合与对相应人细胞群的结合相比较。简言之，食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)获自RicercaBiosciences。人PBMC使用CPT聚蔗糖管(ficoll tube)(Beckton and Dickinson)分离自血沉棕黄层(buffy coat)。对于流式细胞术分析，将PBMC与FcgR Blocking Reagent，(Miltenyi Biotech.)预孵育20分钟以在添加CD47抗体(终浓度0.005mg/ml)之前阻断Fcγ受体。30分钟的孵育期后，将细胞洗涤并与PE缀合的抗人CD4抗体(克隆L200，BDPharmingen 1/100稀释)和FMAT Blue缀合的山羊抗人Fc抗体(Jackson Immuno Research，109-005-098)反应。对于CD47结合(FL4)的MFI随后在CD4+阳性群体中通过流式细胞术来测定(在FL2上门控)。如图5所示，本发明的CD47单克隆抗体结合天然人CD47并于食蟹猴CD47交叉反应。

SIRP α阻断CD47抗体的活性

CD47的SIRP α阻断活性在CD47-SIRP α竞争性结合测定中测定。用CD47 Mabs的剂量-应答实验允许测定本发明的CD47 MAbs的每一个的IC50值。简言之，将人CD47转染的CHO细胞与His标签化的可溶性人SIRP α(终浓度，200ng/ml)和渐增浓度的CD47 Mab(3.3pM至330nM，一式四份)孵育。如实施例4中描述结合的SIRPα的检测。图6显示CD47 Mabs阻断CD47-SIRP α相互作用的效力，由IC50值表示。将CD47 Mab通过家族分组并从较高至较低效力来分类。将它们的中和活性与可商购的CD47抗体B6H12相比较。从图6中显而易见的是本发明的CD47 Mabs的中和效力在宽范围上变化。

CD47抗体的血细胞凝集活性

图7证实5A3、Ke8、和Ka3家族的高亲和力CD47 Mabs诱导血细胞凝集；与其他三个家族不同，在该实验中测试的Kc4家族抗体似乎不诱导血细胞凝集，即使强烈结合CD47且有效抑制CD47-SIRP α相互作用的抗体也是如此。

测定CD47 MAbs诱导红细胞的同型聚集(血细胞凝集)的能力。将10微升的人全血在在平底96孔板中以不同浓度(范围：0.003微克/ml至50微克/ml终Mab浓度)稀释于40微升于PBS中的抗体溶液中。血液-抗体混合物在37℃下不摇动孵育过夜。在孵育结束时，将板手动摇动，在约30℃倾斜，并保持静止约10分钟。

血细胞凝集的证据通过以在孔的下缘周围的底部处的新月形形式的结块沉积物形成来证实。5A3、Ke8和Ka3家族的所有但最低亲和力CD47抗体(具体是5A3M5、Ke8A3、Ka3A3)引起血细胞凝集。相反，Kc4家族的he CD47抗体未引起血细胞凝集，即使是更高亲和力的抗体(Kc4E2，Kc4F4)。

实施例9：CD19抗体亲和力成熟

(a)抗体B7

在上文实施例中描述的筛选方法过程中鉴定的抗体中，选择B7用于亲和力成熟以增加其对hCD19的亲和力。候选物B7含有λ轻链(IGLV6-57)并且通过将多样性引入可变轻链区的CDR1、CDR2和CDR3同时重链可变区保持未修饰，生成展示scFv变体的几个噬菌体文库。使用不同的多样化策略来生成包含部分覆盖4x10¹²的理论多样性的总计2x10⁹个转化子的20个文库。

(b)抗体L7B7_D11

抗体D11在上文描述的B7的亲和力成熟过程中鉴定并且以高于亲本抗体B7的亲和力结合hCD19。选择该抗体用于第二轮的其轻链的亲和力成熟。生成包含部分覆盖4x10⁹的理论多样性的2.8x10⁹个转化子的总计6个文库，并用于如上所述的噬菌体展示选择，除了将1nM的hCD19用于每一轮的选择。该第二轮亲和力成熟导致鉴定具有且改善的与CD19结合的以下抗体：L7B7_C2；L7B7_A6；L7B7_B11；L7B7_C6和L7B7_C9。

实施例10：携带λ和κ轻链的双特异性抗体的表达和纯化

在相同细胞中一条重链和两条轻链的同时表达可以导致装配三种不同抗体。同时表达可以以不同方式诸如转染表达链之一的多个载体以共表达或通过使用驱动多个基因表达的载体来实现。之前生成载体pNoviκHλ以允许共表达一条重链、一条κ轻链和一条λ轻链，如US 2012/0184716和WO 2012/023053中所述，其每一个以其整体通过引用并入本文。三个基因的表达由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动，并且载体还含有能够选择并建立稳定细胞系的谷氨酰胺合成酶基因(GS)。将抗hCD19 IgGλ或抗hCD47 IgGκ的VH和VL基因克隆在载体pNovi κHλ中，用于在哺乳动物细胞中瞬时表达。将Peak细胞以6x 10⁵细胞/孔的浓度在6孔板中在2ml含有胎牛血清的培养基中培养。使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus)根据制造商说明书将2μg质粒DNA转染入细胞中。转染的细胞的含血清上清液中的抗体浓度在生产过程中的几个时间点上使用Bio-Layer Interferometry(BLI)技术来测量。OctetRED96仪器和蛋白A生物传感器用于定量(Pall，Basel，Switzerland)。将200μL上清液用于测定IgG浓度；将生物反应器预调节(pre-conditioned)并使用10mM甘氨酸pH 1.7再生，制备在调节的(conditioned)PEAK细胞培养基中稀释的IgG校准品(calibrators)用于标准曲线生成。使用剂量应答5PL加权的Y标准曲线方程和起始斜率结合速率方程来测定浓度。根据抗体浓度，在转染后7-10天收获上清液，并以1300g离心10分钟进行澄清。纯化方法由三个亲和步骤构成。首先，用PBS洗涤CaptureSelect^TM IgG-CH1亲和基质(Life Technologies，Zug，Switzerland)并随后加入澄清的上清液中。在+4℃下孵育过夜后，将上清液以1000g离心10分钟，储存流通物(flow through)并用PBS洗涤树脂两次。随后，将树脂转移至离心柱上，并将含有50mM甘氨酸pH 2.7的溶液用于洗脱。产生几种洗脱级分，合并并使用50kDaUltra Centrifugal滤器单元(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)对PBS进行脱盐。含有来自上清液的总人IgG的终产物使用Nanodrop分光光度计(NanoDropTechnologies，Wilmington，DE)定量并在RT和20rpm下与合适体积的CaptureSelect^TM LC-kappa(Hu)亲和基质(Life Technologies，Zug，Switzerland)孵育15分钟。孵育、树脂回收、洗脱和脱盐步骤如之前所述进行。最后的亲和纯化步骤使用CaptureSelect^TM LC-lambda(Hu)亲和基质(Life Technologies，Zug，Switzerland)如对于之前两步纯化应用相同方法来进行。终产物使用Nanodrop来定量。通过电泳在变性和还原条件下分析纯化的双特异性抗体。如有制造商所述使用Agilent 2100 Bioanalyzer和Protein 80试剂盒(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA，USA)。将4μL纯化的样品与添加有二硫苏糖醇(DTT；SigmaAldrich，St.Louis，MO)的样品缓冲液混合。样品在95℃下加热5分钟并随后装载到芯片上。使用Limulus Amebocyte Lysate测试(LAL；Charles River Laboratories，Wilmington，MA)测试所有样品的内毒素污染。

实施例11：单价和双特异性抗体的表征

双重靶向的双特异性抗体结合在相同细胞表面上的两种不同抗原。两个抗体臂同时结合至细胞表面上的两种抗原(称为共连接(co-engagement))导致由于抗体亲抗原性机制的亲和力的累加性或协同性增加。结果是，共连接赋予向表达两种抗原的细胞相比于仅表达一种单一抗原的细胞高的选择性。此外，双特异性抗体的两个臂与它们相应靶的亲和力可以以结合至靶细胞主要由抗体臂之一驱动的方式来设置。例如，由以高亲和力结合肿瘤相关抗原(TAA)例如CD19的一个臂和以较低亲和力结合CD47-但足以抑制TAA共连接后的CD47/SIRP α-的第二臂构成的双重靶向κ λ体应允许相对于正常细胞在癌症中优先抑制CD47。下文(图9-13)描述的实验比较CD47xCD19双特异性κ λ体和相应的单价抗体(即，具有相同的CD47结合臂加上“假”非结合臂)的结合亲和力、CD47-SIRP α中和效力和肿瘤细胞杀伤活性。

单价和双特异性抗体与B细胞系的结合

为了证实CD47xCD19 κ λ体与靶细胞结合是CD19依赖性的，进行比较CD47xCD19 κλ体与其单价对应物的结合的一系列FACS实验。使用两种类型的细胞，CD19阳性伯基特淋巴瘤细胞系Raji(表达约65,000 CD47分子/细胞)和作为对照的CD19阴性B-NHL细胞系DS-1(表达约150,000 CD47分子/细胞)。图9A-9C证实CD47xCD19 κ λ体共连接在Raji细胞表面上的两个靶。这由(i)相比于DS-1细胞增加的对Raji细胞的亲和力和(ii)相比于CD47单价抗体增加的CD47xCD19 κ λ体的亲和力(用Raji细胞-但不是DS-1细胞观察到)显示。用CD19单价抗体、CD47单价抗体和CD47xCD19 κ λ体对Raji细胞的结合产生的FACS概况的比较清楚地证实CD47xCD19 κ λ与靶细胞的结合主要由CD 19臂驱动。

单价和双特异性抗体的SIRP α阻断活性

另一系列实验提供了CD19和CD47在靶细胞表面上的共连接的进一步证据，其通过显示由CD47xCD19 κ λ体的CD47-SIRP α相互作用的中和是CD19依赖性的。在该实验中，CD47xCD19 κ λ体和相应的单价抗体的活性在如实施例4中所述的CD47-SIRP α抑制测定中测试。图10显示CD47xCD19 κ λ体以显著高于相应的CD47单价抗体的效力抑制Raji细胞中的CD47-SIRP α相互作用。CD47-SIRP α相互作用的有效中和需要CD19共连接。用CD47xCD19BsAbs获得的IC50值比用相应的CD47单价抗体获得的值低20-1000x(参见表4)。

表4：CD47单价和双特异性抗体的IC50值

。

实施例12：由双特异性抗体介导的ADCC是CD19依赖性的。

双重靶向κ λ体共连接CD47和CD19的能力导致结合CD19阳性细胞的亲和力和CD47-SIRP α相互作用的CD19依赖性中和中的显著增加。这继而转变为由CD47xCD19 κ λ体介导的有效且选择性的癌细胞杀死，如在本实施例和以下实施例中描述的ADCC和ADCP实验中所证实的。

ADCC测定用未分离(unfractionated)的人PBMC和Raji或Ramos B细胞淋巴瘤靶细胞进行。图11中显示的剂量-应答实验证实本文提供的CD47xCD19 κ λ体以比相应的CD47单价抗体更有效的方式杀伤B细胞淋巴瘤细胞。因此，有效的ADCC依赖于CD19共连接。图11C显示用CD47xCD19 κ λ体的ADCC的效能与利妥昔单抗是相当的，并且其显著高于用CD19MabC2的ADCC的效能。

实施例13：由双特异性抗体介导的ADCP是CD19依赖性的。

图12证实本文提供的CD47xCD19 BsAbs以CD19依赖性方式吞噬CD19阳性细胞，因为相应的CD47单价抗体的效能低得多(如果存在的话)。

用从外周血单核细胞分化的人巨噬细胞和Raji作为靶细胞进行ADCP实验。将巨噬细胞与CFSE标记的Raji细胞(效应物：靶比例1∶5)在37℃下在渐增浓度的双特异性或单价抗体存在的情况下共孵育2.5小时。孵育期结束时，将生物素化的抗人CD1抗体和Strep-Cy5添加以标记巨噬细胞。随后洗涤细胞并将细胞进行FACS分析。通过双阳性事件证实吞噬作用。

图12中显示的剂量-应答实验证实CD47xCD19 κ λ体比相应的CD47单价抗体效力更高。因此，有效的ADCC依赖于CD19共连接。由双特异性抗体的CD19共连接驱动效能。此外，图12中显示的实验证实阻断CD47对于引发有效的ADCP是必需的，因为CD19 Mab C2(其以高亲和力结合靶细胞)不诱导显著的吞噬作用。

实施例14：双特异性抗体的体内抗肿瘤活性

CD47xCD19 κ λ体的抗肿瘤活性在淋巴瘤的Raji模型中评价。将2.10⁶ Raji细胞皮下植入NOD/SCID小鼠。每周三次测量肿瘤体积。肿瘤移植物达到0.1cm³后，将小鼠随机分入5组(5只小鼠/组)并开始抗体处理。该实验比较CD47xCD19 κ λ-体Ka3xD11的效果与Ka3单价抗体和两个阳性对照Mabs(CD47 Mab B6H12和利妥昔单抗)的效果。将抗体每周三次i.p.注射直至实验结束(d25)。利妥昔单抗以200μg/小鼠/注射进行施用。所有其他抗体以400μg/小鼠/注射进行施用。

如图13中所示，CD47xCD19 κ λ-体Ka3xD11的效能与已知强烈结合CD47，阻断CD47-SIRP α相互作用并抑制该淋巴瘤模型中的肿瘤生长的B6H12相似。值得注意的是，CD47xCD19 κ λ体的效能还与利妥昔单抗的效能相当。单价CD47抗体明显比CD47xCD19双特异性κ λ体的效能更低，证实肿瘤消除是CD19依赖性的。

实施例15：CD47抗体结合红细胞

具有多于50亿个细胞/ml血液和25,000 CD47分子/细胞，红细胞潜在地代表CD47结合抗体的主要抗原池。为了评价红细胞吸附的效果，将CD47抗体与全血孵育。孵育后，血浆中保留的CD47抗体的级分通过ELISA测定。

简言之，将含有抗促凝剂的200μl全血与20μl抗体(110μl/ml于PBS中)混合，并在37℃下摇动孵育30分钟。随后将血浆通过离心从与细胞分离，并通过ELISA测定未结合的抗体浓度。对于测试的每种抗体，将获得的结果与对照(其是直接掺入血浆的相同抗体)比较，并对平行测试的未结合IgG进行均一化。

图14证实高亲和力和中等亲和力CD47抗体在红细胞上有效吸附。然而，在BsAb的情况下，该现象限于具有高亲和力CD47臂的分子，诸如5A3。通常，这表明BsAb比CD47 Mabs更不易于红细胞吸附和TMDD。

其他实施方案

尽管本发明已连同其详细的说明书进行了描述，但前述描述旨在举例说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围所限定。其他方面、优点和修改均在以下权利要求的范围之内。

Claims

1.分离的单克隆抗体，其中所述抗体以等于抗CD47抗体5A3-M3的Kd至抗CD47抗体Ka3的Kd或介于其之间的单价Kd结合CD47。

2.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述Kd等于100nM至500nM或介于其之间。

3.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中

a.所述5A3-M3抗体包含：

i.含有以下的重链可变区：SEQ ID NO：225的可变重链互补决定区1(CDRH1)氨基酸序列，SEQ ID NO：226的可变重链互补决定区2(CDRH2)氨基酸序列，SEQ ID NO：227的可变重链互补决定区3(CDRH3)氨基酸序列；和

ii.含有以下的轻链可变区：SEQ ID NO：240的可变轻链互补决定区1(CDRL1)氨基酸序列，SEQ ID NO：242的可变轻链互补决定区2(CDRL2)氨基酸序列，和SEQ ID NO：246的可变轻链互补决定区3(CDRL3)氨基酸序列；和

b.所述Ka3抗体包含：

ii.含有以下的轻链可变区：SEQ ID NO：240的可变轻链互补决定区1(CDRL1)氨基酸序列，SEQ ID NO：242的可变轻链互补决定区2(CDRL2)氨基酸序列，和SEQ ID NO：254的可变轻链互补决定区3(CDRL3)氨基酸序列。

4.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述5A3-M3抗体包含SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO：120的可变轻链氨基酸序列。

5.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述Ka3抗体包含SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO：168的可变轻链氨基酸序列。

6.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是单价或二价的。

7.权利要求6的分离的单克隆抗体，其中所述单价抗体包含特异性结合CD47的第一臂和不结合任何人蛋白的第二臂。

8.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是完全人抗体。

9.双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：

a.以等于抗CD47抗体5A3-M3的Kd至抗CD47抗体Ka3的Kd或介于其之间的单价Kd结合CD47的第一结合臂；和

b.特异性结合靶的第二结合臂。

10.权利要求9的双特异性抗体，其中所述单价Kd等于100nM至500nM或介于其之间。

11.权利要求9的双特异性抗体，其中：

a.所述5A3-M3抗体包含：

b.所述Ka3抗体包含：

12.权利要求9的双特异性抗体，其中所述5A3-M3抗体包含SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO：120的可变轻链氨基酸序列。

13.权利要求9的双特异性抗体，其中所述Ka3抗体包含SEQ ID NO：114的可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO：168的可变轻链氨基酸序列。

14.权利要求9的双特异性抗体，其中所述靶是肿瘤相关抗原(TAA)。

15.权利要求14的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是CD20、HER2、HER3、EGFR、IGF1R、c-Met、PDGFR1、CD40、CD40L、CD30、CS1、CD70、磷脂酰肌醇聚糖、间皮素、PSMA、PSCA、MUC1、CA125、CEA、FRA、EpCAM、DR5、HGFR1或5T4。

16.权利要求15的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是CEA。

17.权利要求9的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两个拷贝的单一重链多肽和第一轻链和第二轻链，其中所述第一和第二轻链不同。

18.权利要求17的双特异性抗体，其中所述第一轻链是κ型且所述第二轻链是λ型。

19.权利要求17的双特异性抗体，其中所述第一轻链是λ型且所述第二轻链是κ型。

20.权利要求18的双特异性抗体，其中所述第一轻链的至少一部分是κ型且所述第二轻链的至少一部分是λ型。

21.权利要求19的双特异性抗体，其中所述第一轻链的至少一部分是λ型且所述第二轻链的至少一部分是κ型。

22.治疗与异常CD47和/或异常CD47-SIRPα表达和/或活性相关的病理、减缓所述病理的症状、预防所述病理或者延迟所述病理的进展的方法，其包括向有此需要的主体施用包含权利要求1或9的抗体的组合物。

23.权利要求22的方法，其中与异常CD47和/或异常CD47-SIRPα表达和/或活性相关的病理是癌症。

24.权利要求23的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、尿道癌、膀胱癌、肾癌、肾癌、肾盂癌、口腔癌、咽癌、子宫体癌或黑色素瘤。