EA015589B1 - Антитела против миостатина и их применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина, к фармацевтической композиции, содержащей указанное моноклональное антитело и фармацевтически приемлемый носитель, а также к применению эффективного количества антитела для получения лекарственного средства для повышения мышечной массы или повышения плотности костной массы у индивидуума.

Description

(57) Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина, к фармацевтической композиции, содержащей указанное моноклональное антитело и фармацевтически приемлемый носитель, а также к применению эффективного количества антитела для получения лекарственного средства для повышения мышечной массы или повышения плотности костной массы у индивидуума.

015589 Β1

Область изобретения

Изобретение относится к области медицины, в частности к области моноклональных антител против миостатина. Более конкретно, изобретение относится к высокоаффинным химерным, гуманизированным антителам или антителам против миостатина человека, которые предпочтительно связываются с миостатином, а не с ΟΌΡ-11, и к применению антител для лечения, профилактики или диагностики различных заболеваний или состояний у млекопитающих или птиц.

Предпосылки создания изобретения

Члены суперсемейства белков трансформирующего фактора роста бета (ΤΟΡ-β) вовлечены в эмбриональное развитие и гомеостаз зрелых тканей. Члены суперсемейства ΤΟΡ-β имеют общую структуру, включая пептидную сигнальную последовательность, необходимую для секреции белкового и аминоконцевого фрагмента, который протеолитически отщепляет приблизительно 105-140 аминокислот от карбоксиконца большого белка-предшественника с получением зрелого белка. Зрелый белок характеризуется наличием высококонсервативных цистеиновых остатков, в то время как активная форма зрелого белка представляет собой связанный дисульфидными мостиками гомодимер протеолитически расщепленного пробелка (Огау, А., апб Маз!ои, А., 8с1епсе, 247: 1328, 1990).

Миостатин, также известный как фактор дифференцировки роста-8 (ΟΌΡ-8), является членом суперсемейства белков ΤΟΡ-β. Структура миостатина подобна структуре других членов семейства ΤΟΡ-β. Она содержит гидрофобный аминоконец, который действует как секреторный сигнал, и консервативный домен К.8КК, важный для протеолитического процессинга. Расщепление белка приводит к образованию пептида, с которым связана аминоконцевая латентность, и карбоксиконцевого зрелого сигнального пептида, который формирует биологически активный гомодимер. Миостатин в значительной степени экспрессируется в развивающейся и зрелой скелетной мышце и функционирует как отрицательный регулятор скелетной мышцы. Системная сверхэкспрессия миостатина в организме взрослой мыши приводит к мышечному истощению (21шшег5, е! а1., 8с1еисе, 296: 1486-1488, 2002), тогда как, наоборот, мыши с нокаутом миостатина характеризуются гипертрофией и гиперплазией скелетной мышцы, что приводит к увеличению мышечной массы в два или в три раза по сравнению с их однопометными мышами дикого типа и к уменьшению накопления жира (МсРйеггои, е! а1., ИаШге, 387: 83-90, 1997). Сообщалось, что нокаут мутации миостатина у человека связан мышечной гипертрофией (8сйеи1ке, е! а1., №\ν Епд. 1. Меб. 350: 2682, 2004).

В настоящее время количество средств для лечения мышечного истощения, а также расстройств или состояний, которые могут быть улучшены посредством увеличения мышечной массы и/или мышечной силы, включая, например, мышечную дистрофию, слабость, атрофию от бездействия и кахексию, а также расстройства, связанные с мышечным истощением, например болезнь почек, сердечную недостаточность или сердечное заболевание и заболевание печени, ограничено. Благодаря своей функции отрицательного регулятора роста скелетных мышц, миостатин является желаемой мишенью для терапевтического или профилактического воздействия при таких расстройствах или состояниях либо для мониторинга прогрессирования таких расстройств или состояний. Кроме своей непосредственной роли в регуляции скелетных мышц, миостатин может быть также вовлечен в другие физиологические процессы, включая преадипоцитозную дифференцировку адипоцитов (К1ш е! а1., ВВК.С, 281: 902-906, 2001), и, опосредованно, гомеостаз глюкозы (МсРйеггои, А. апб Ьее 8.-Р 6С1, 109: 595, 2002) и ингибирование образования кости (Натиск, М. Мо1. Се11 Ενοί. Вю1. 272: 388-91, 2003; Натиск е! а1., Са1с1Р Иззие 1п!. 71:63, 2002). Поэтому миостатин-специфичные антагонисты, например миостатин-специфичные антитела, могут также быть эффективными для лечения, профилактики или контроля расстройств или состояний, таких как расстройства или состояния, которые можно улучшить путем увеличения костной плотности (например, остеопороз), диабет ΙΙ типа, метаболический синдром, ожирение и остеоартрит.

Миостатин является высококонсервативным у всех видов; аминокислотная последовательность всех зрелых форм миостатина у человека, мыши, крысы, курицы, индюка и коровы имеет 100% идентичность (см. фиг. 2 и 3). Природные мутации миостатина крупного рогатого скота связаны с двойным мышечным фенотипом (МсРйеггои, е! а1. ΡΝΑ8, 94: 12457-61, 1997). Поскольку последовательность и функции миостатина являются высококонсервативными у всех видов, то антитело против миостатина является высокоперспективным средством повышения мышечной массы или лечения или профилактики указанных выше расстройств или состояний не только у людей, но и у других млекопитающих, включая, например, домашних животных (например, псовых и кошачьих), спортивных животных (например, лошадей), животных, которые служат источником пищи (например, коров, свиней и овец), и у птиц (например, кур, индюков, уток и другой пернатой дичи и домашней птицы).

Фактор дифференцировки роста-11, также называемый ΟΌΡ-11 или ВМР-11, является членом суперсемейства белков ΤΟΡ-β и является наиболее гомологичным миостатину. Идентичность аминокислотной последовательности зрелых форм миостатина человека и ΟΌΡ-11 составляет приблизительно 90%; однако ΟΌΡ-11 экспрессируется в более широком диапазоне тканей, чем ΟΌΡ-8, включая зубную пульпу, мозг, сердце, почки и легкие, а также мышечную и жировую ткань Лаказйипа. е! а1., Месй. о£ ^еνе1ορтеη!, 80: 185, 1999). Мыши с нокаутом ΟΌΡ-11 имеют множественные аномалии и умирают в

- 1 015589 течение 24 ч после рождения. В частности, у мышей отмечают наличие лишних пар ребер, отсутствие почек и дефекты желудка, селезенки и поджелудочной железы (МсРйеггоп с1 а1., №1Шгс Сепейск, 22: 260, 1999; Екцие1а апй Ьее, Осу. Βΐο1. 257: 356, 2003; Нагтоп е1 а1., ОетрЕ 131: 6163, 2004). Недавно было обнаружено, что СОЕ-11 человека управляет темпоральными окнами, на протяжении которых мультипотентные предшественники сохраняют способность продуцировать различные нейральные потомки нервной системы (К1т, 1. е1 а1., 8с1епсе 308: 1927-1930, 2005).

Существует терапевтическая необходимость в специфическом ингибировании миостатиновой активности, не ингибируя при этом или минимально ингибируя активность остальных белков суперсемейства ТСЕ-β, в частности СОЕ-11, для того чтобы минимизировать возможность нежелательных побочных эффектов, возникающих при связывании антагониста миостатина с другим белком суперсемейства ТСЕ-β. Кроме того, для диагностических целей существует необходимость в антителах против миостатина, которые не имеют перекрестного связывания или оно минимально, с другим белком суперсемейства ТСЕ-β, в частности СОЕ-11, для более правильного мониторинга или определения уровней миостатина в образце. Также существует необходимость в миостатин-специфичных антителах, которые специфически и предпочтительно связываются с миостатином с высокой аффинностью и позволяют, таким образом, минимизировать уровень дозы, что, следовательно, приводит к повышению частоты приема препарата с таким антителом по сравнению с антителом, которое связывается с миостатином с меньшей аффинностью (т.е. большим К_с). Антитело с большей аффинностью также является желательным, так как может позволить большую возможность выбора пути введения антитела пациенту, поскольку внутривенный путь введения лекарственного средства является менее желательным, чем, например, подкожный. Также существует потребность в миостатин-специфичных антителах с низкими или другими благоприятными значениями 1С₅₀ для анализа биологической активности миостатина для создания терапевтического антитела против миостатина с минимально эффективной терапевтической дозой. Также желательны антитела, специфичные к миостатину, где любой иммунный ответ на антитело, возникающий у пациента, получающего это антитело, сведен до минимума. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности и обеспечивает связанные с ними преимущества.

Краткое описание изобретения

Антитела по настоящему изобретению представляют собой химерные, гуманизированные или полностью моноклональные антитела человека против миостатина и их антигенсвязывающие части, которые являются антагонистами или нейтрализуют по крайней мере одну биологическую активность или свойство, связанное с миостатином или его частью, ш νίίτο или ш νίνο.

В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению, которые специфически и/или предпочтительно связываются с миостатином, в значительной степени менее реакционноспособны в отношении СОЕ-11, чем в отношении миостатина, т.е. моноклональное антитело по изобретению связывается с миостатином по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем с СОЕ-11, как измерено с помощью способов, известных в данной области техники, например с помощью конкурентного ЕЫ8Л, или анализа В1ЛСОЯЕ или ΚΙΝΕΧΑ для демонстраций более высокой аффинности (т.е. более низкого К_с) антитела к СОЕ-8, чем СОЕ-11. Более предпочтительно антитела по изобретению в случае экспрессии в виде ЕаЬ не связываются с СОЕ-11 выше уровней фона в любом анализе связывания, известном в данной области.

Предпочтительно антитела по изобретению специфически связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64 [ΑNΥС8СЕСЕЕVЕ^^ΚΥРНТН^VН^Α для человека], 43-57 [СЗСЕСЕЕУЕЕфКУРН или С8СЕ8ЕЕУЕБСКУРН для человека] и/или 45-59 [СЕСЕЕУЕЬрКУРНТН для человека] зрелого миостатина, или специфически связываются с полипептидом, состоящим из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина.

В одном из вариантов осуществления значение 1С₅₀ антител по изобретению менее чем или равно приблизительно 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в ш νίίτο анализе миостатин/репортер 8ВЕ (см. пример 6). Предпочтительно такие антитела по изобретению дополнительно отличаются тем, что в значительной степени менее реакционноспособны в отношении СОЕ-11, чем в отношении СОЕ-8, т.е. связываются с миостатином по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем с СОЕ-11, как измерено с помощью способов, известных в данной области, например с помощью конкурентного ЕЫ8А или анализа В1АСОВЕ или КШЕХА для демонстрации большей аффинности (т.е. более низкого К_с) антитела к СОЕ-8, чем СОЕ-11, и еще более предпочтительно антитела связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, или специфически связываются с полипептидами, состоящими из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина.

В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению отличаются сильным сродством связывания (К_с) с миостатином, т.е. менее чем приблизительно 3χ10^-8 М, 1х10^-8 М или 1х10^-9 М, предпочтительно менее чем приблизительно 9х10^-10 М, 8,7х10^-10 М или более предпочтительно менее чем приблизительно 8х10^-11 М. Альтернативно, антитела по изобретению характеризуются К с миостатином, значение которого не превышает приблизительно 3х10^-8 М, 1 χ 10^-8 М или 1 χ 10^-9 М, предпочтительно

- 2 015589 не превышает приблизительно 8,7х10^-10 М и более предпочтительно не превышает приблизительно 8х10^-11 М. Предпочтительно значения 1С₅₀ антител по изобретению, отличающихся сильным сродством связывания, как описано выше, составляют менее чем 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в ίη νίίτο анализе миостатин/репортер 8ВЕ и/или являются в значительной степени менее реакционноспособными в отношении СЭЕ-11, чем в отношении СЭЕ-8. Еще более предпочтительно антитела связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, и/или специфически связываются с полипептидом, состоящим из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина.

В другом варианте осуществления моноклональное антитело против миостатина по изобретению содержит полипептид вариабельного домена легкой цепи (ЬСУВ) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГЭ N0: 5-12. В другом варианте осуществления моноклональное антитело против миостатина по изобретению содержит полипептид вариабельного домена тяжелой цепи (НСУВ) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 13-26, 55 и 56. Последовательности, ассоциированные с каждой 8Е0 ΙΌ N0, показаны на фиг. 5-9 описания.

В другом варианте осуществления моноклональное антитело по изобретению является антителом, которое может конкурировать за связывание миостатина человека с конкурирующим антителом, как показано в анализе, известном в данной области (например, в конкурентном анализе ЕЫ8Л), где конкурирующее антитело содержит два полипептида, последовательности которых выбраны из группы, состоящей из (ί) 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 15; (ίί) 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 16 и (ίίί) 8Е0 ΙΌ N0: 10 и 26. Предпочтительно антитело по изобретению, которое конкурирует с определенным выше конкурирующим антителом, дополнительно отличается предпочтительным связыванием с СЭЕ-8 по сравнению с СЭЕ-11; еще более предпочтительно антитела связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, и/или они специфически связываются с полипептидом, состоящим из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина. Предпочтительно антитело по изобретению, которое конкурирует с определенным выше конкурирующим антителом, дополнительно отличается тем, что имеет значение К_с с миостатином менее приблизительно 3х10^-8 Μ, 1х 10^-8 Μ, 1х10^-9 М или 9х10^-10 М, 8,7х10^-10 М или 8х10^-11 М. Предпочтительно антитело по изобретению, которое конкурирует с определенным выше конкурирующим антителом, дополнительно отличается тем, что имеет значение ГС50 менее 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в ίη νίίτο анализе миостатин/репортер 8ВЕ.

В одном из вариантов осуществления антитело против миостатина по изобретению имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит области СЭВ со следующими аминокислотными последовательностями: СЭВН1 (8Е0 ΙΌ N0: 59), СЭВН2 (8Е0 ΙΌ N0: 60) и СЭВН3 (8Е0 ΙΌ N0: 61) и/или где вариабельный домен легкой цепи содержит области СЭВ со следующими аминокислотными последовательностями: СЭВБ1 (8ЕС ΙΌ N0: 57), СЭВЬ2 (8ЕС ГО N0: 30) и СЭВЬ3 (8ЕС ГО N0: 58).

Моноклональное антитело против миостатина по изобретению может дополнительно содержать константный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из [дС|. [дС₂. [дСз. [дС₄. Ι§Ά, !§Е. Ι§Μ и Ι§Ό, предпочтительно ^С₁ или Ι^₄ человека (или, по существу, человеческого происхождения). Моноклональное антитело против миостатина по изобретению может дополнительно содержать константный домен каппа- или лямбда- легкой цепи человека. Если антитело предназначено для применения в терапии человека, то константный домен имеет, по существу, человеческое происхождение. Если антитело предназначено для терапевтического использования у животного, которое не является человеком, или направлено на яйца животных, которые не являются человеком, то константный домен предпочтительно, по существу, имеет происхождение от животного, у которого антитело предназначено для применения в качестве терапевтического средства. (см., например, С1атк§оп, С. οί а1., Μοί. Iтт. 30: 11951204, 1993; заявка США № 2002/01651350 и номера доступа в СепЬапк Х69797, И03778, Х16701, Х07174, АВ016711).

В настоящем изобретении рассмотрены различные формы антител. Например, моноклональное антитело против миостатина по изобретению может содержать или состоять из интактного антитела (т.е. полноразмерного, имеющего интактный Ес-участок), по существу интактного антитела, его антигенсвязывающей части (например, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂) или одноцепочечного Εν-фрагмента. Понятно, что все подобные формы антител входят в объем описания и подразумеваются в данном случае под термином антитело. Дополнительно, антитело по изобретению может быть мечено детектируемой меткой, иммобилизовано на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением, например ферментом или молекулой полиэтиленгликоля. Дополнительно, понятно, что антитела по изобретению являются моноклональными, даже если они могут отличаться характером гликозилирования.

- 3 015589

В данном описании рассмотрены диагностическое, терапевтическое и профилактическое применения моноклональных антител по изобретению. В одном из диагностических применений изобретение относится к способу определения и/или измерения количества белка миостатина, включающему воздействие антитела против миостатина по изобретению на тестируемый образец, в котором предполагают наличие белка миостатина, и определение специфического связывания антитела с образцом. Антитело против миостатина по изобретению может использоваться для измерения уровней миостатина в тестируемых образцах путем сравнения значений тестируемого образца со стандартной кривой, созданной с помощью связывания указанного антитела с образцами с известным количеством миостатина, используя метод, доступный в данной области, например анализ ЕЫ8А. Изобретение также относится к набору, содержащему антитело по изобретению и предпочтительно инструкции по применению антитела для обнаружения белка миостатина, например, в тестируемом образце.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело против миостатина по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции моноклональное антитело против миостатина по изобретению является активным ингредиентом. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит гомогенную или по существу гомогенную популяцию моноклональных антител против миостатина по изобретению. Композиция для применения в терапии является стерильной и может быть лиофилизированной, предпочтительно укомплектованной соответствующим разбавителем.

Изобретение относится к способу ингибирования по крайней мере одной биологической активности миостатина у животного, предпочтительно у видов млекопитающих или птиц, предпочтительно у человека, при необходимости такого ингибирования, включающему введение терапевтически эффективного количества, или профилактически эффективного количества, или миостатин-нейтрализующего или миостатин-ингибирующего количества моноклонального антитела против миостатина по изобретению указанному виду млекопитающих или птиц. Изобретение также относится к способу повышения мышечной массы или лечения или профилактики заболевания или расстройства, улучшение которых может быть вызвано нейтрализацией биоактивности миостатина, который включает введение пациенту (например, человеку), при необходимости такого лечения или профилактики, терапевтически или профилактически эффективного количества моноклонального антитела по изобретению.

Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело против миостатина по изобретению для применения в производстве лекарственного средства для введения млекопитающему, предпочтительно человеку, для лечения, например, слабости, кахексии, связанной с возрастом саркопении, мышечного истощения или слабости мышц, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза, ожирения, ХОЗЛ, почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности или сердечного заболевания, метаболического синдрома и диабета второго типа у млекопитающего, предпочтительно у человека, путем введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного или профилактически эффективного количества моноклонального антитела против миостатина по изобретению.

Изобретение относится к изделию, содержащему упаковочный материал и антитело по изобретению, которое находится внутри указанного упаковочного материала, где упаковочный материал содержит листок-вкладыш, в котором предпочтительно указано, что антитело специфически нейтрализует или обладает антагонистическим действием в отношении активности миостатина, или снижает уровень миостатина. Необязательно, в листке-вкладыше дополнительно указано, что антитело предпочтительно нейтрализует или обладает антагонистическим действием против активности миостатина по отношению к активности ΟΌΡ-11 или предпочтительно снижает уровень миостатина относительно снижения уровня ΟΌΡ-11 путем предпочтительного связывания с миостатином относительно связывания с ΟΌΡ-11.

Изобретение также относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело по изобретению; вектору (или векторам), содержащим нуклеиновую кислоту, необязательно функционально связанную с контрольными последовательностями, которые распознаются клеткой-хозяином, трансформированной вектором; клетке-хозяину, содержащей вектор; способу получения антитела по изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина и, таким образом, экспрессию нуклеиновой кислоты, необязательно, выделяя антитело из культуральной среды клетки-хозяина.

- 4 015589

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана аминокислотная последовательность промиостатина человека, сигнальная последовательность которого подчеркнута, а часть белка на карбоксиконце, которая образует мономер зрелой формы миостатина, выделена жирным шрифтом.

На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность мономерного зрелого миостатина человека. Активный миостатин человека является гомодимером такого полипептида, связанным дисульфидными мостиками. Антигенный эпитоп по изобретению подчеркнут. Эта последовательность идентична последовательности зрелого миостатина мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи.

На фиг. 3 показано выравнивание аминокислотной последовательности зрелого миостатина различных видов млекопитающих и птиц.

На фиг. 4 показано выравнивание аминокислотной последовательности зрелой формы миостатина человека и СЭЕ-11 человека, где антигенный эпитоп по изобретению подчеркнут, а остатки в антигенном эпитопе, которые различаются у миостатина и СЭЕ-11, выделены жирным шрифтом.

На фиг. 5 показано выравнивание аминокислотной последовательности НСУВ с каркасным участком УН2-70. Домены СОВ выделены жирным шрифтом.

На фиг. 6 показано выравнивание аминокислотной последовательности НСУВ с каркасным участком УН4-39. Домены СОВ выделены жирным шрифтом.

На фиг. 7 и 8 показано выравнивание аминокислотной последовательности ЬСУВ с каркасным участком 02. Домены СОВ выделены жирным шрифтом.

На фиг. 9 показаны аминокислотные последовательности СОВ, ЬСУВ и НСУВ различных антител по изобретению.

На фиг. 10 показана аминокислотная последовательность ЬСУВ различных антител мыши против миостатина, каждое из которых может быть примером родительской молекулы антител по изобретению. См. заявки на патент США 60/559621 и 60/555456, которые приведены в описании в качестве ссылки.

На фиг. 11 показана аминокислотная последовательность НСУВ различных антител мыши против миостатина, каждое из которых может быть примером родительской молекулы антител по изобретению. См. заявки на патент США 60/559621 и 60/555456.

Подробное описание изобретения

Изобретение представляет моноклональные антитела против миостатина, способные специфически связываться с миостатином млекопитающих или птиц (белок или зрелый белок или их часть; мономерные или гомодимерные), где антитела дополнительно отличаются тем, что являются химерными, гуманизированными или полностью антителами человека или их антигенсвязывающими частями, способными нейтрализовать, или обладают антагонистическим действием в отношении по крайней мере одной активности миостатина ίη νΐίτο и/или ίη νίνο; предпочтительно имеют 1С₅₀ менее приблизительно 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в анализе миостатин/репортер 8ВЕ и/или предпочтительно имеют высокую связывающую аффинность с миостатином. Антитела по изобретению, кроме того, отличаются тем, что связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты остатков 40-64 зрелого миостатина (т.е. 8ЕС Ш N0: 53), и значительно менее реакционноспособны в отношении ближайшего гомолога миостатина, СЭЕ-11.

Определения

Как используется в описании, термин зрелый миостатин (см. 8ЕС Ш N0: 2 человека, мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи) относится к мономерной или гомодимерной форме белка, которая образуется в результате протеолитического расщепления в положении Лгд 266 пробелковой формы, состоящей из 375 аминокислот миостатина. Как используется в описании, термин миостатин относится к зрелому миостатину. Как используется в описании, термин промиостатин или пробелковая форма миостатина, при использовании относительно белка человека, относится к белку, содержащему последовательность, показанную в 8ЕС Ш N0: 1, в виде мономера или гомодимера.

Полноразмерное антитело, в том виде, в котором оно встречается в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей: двух тяжелых (Н) цепей (приблизительно 50-70 кДа в полноразмерной форме) и двух легких (Ь) цепей (приблизительно 25 кДа в полноразмерной форме), связанных между собой дисульфидными мостиками. Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельный домен приблизительно из 100-110 или более аминокислот, которые, в первую очередь, отвечают за распознавание антигенов. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константный домен, в первую очередь отвечающий за функцию эффектора.

Легкие цепи разделяют как каппа и лямбда, и они характеризуются конкретным константным доменом, что хорошо известно в данной области. Тяжелые цепи разделяют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как 1дС, 1дМ, 1дА, 1дЭ и 1дЕ соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например 1дС1, 1дС₂, 1дС₃, 1дС₄, 1дА! и 1дА₂. Каждый тип тяжелых цепей отличается конкретным константным доменом, известным в данной области. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов антител хорошо известны в данной области. Каждая тяжелая цепь состоит из Ν-концевого вариабельного домена тяжелой цепи (в данном случае НСУВ) и константного домена тяжелой цепи. Константный домен тя

- 5 015589 желой цепи состоит из трех доменов (СН1, СН2 и СН3) для 1дС, Ι§Ό и 1дА и 4 доменов (СН1, СН2, СН3 и СН4) для 1дМ и 1дЕ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (в данном случае ЬСУВ) и константного домена тяжелой цепи, СЬ. Домены НСУВ и ЬСУВ могут быть дополнительно разделены на участки гипервариабельности, названные участками, определяющими комплементарность (СОВ), перемежающиеся с более консервативными участками, названными каркасными участками (РВ). Каждый НСУВ и ЬСУВ состоит из трех СОВ и четырех РВ, расположенных в следующем порядке от аминоконца к карбоксиконцу: РВ1, СЭРЕ РВ2, СЭВ2. РВ3, СЭВ3. РВ4. В данном случае 3 СОВ тяжелой цепи называются СПИНЕ СЭВН2 и СОВН3, а 3 СОВ легкой цепи называются СЭВЬ1, СЭВЬ2 и СЭВЬ3. СОВ содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимосвязи с антигеном. Распределение аминокислот в каждом домене осуществляют в соответствии с хорошо известными правилами [например, КаЬа1, 8сс.|испес5 οί Рго1еФ5 οί 1ттипо1од1са1 1и1еге81, Ναΐίοηαΐ ФЛШЦех οί Неа1Ф, ВеФекйа, Мй. (1991) или ΟιοΦία иитЬепид кскете а§ йекспЬей ίη Α1-Εαζί1<αηί е1 а1., ί. Мо1. Βίο1. 273: 927-948, 1997, см. также интернет-сайт Ыίρ:гогого.шЬ^с.^йд.ас.ик/~аий^его/Ь^ο^ηί.ο^д/аЬ8]. На функциональные возможности антитела связывать конкретный антиген в значительной степени влияют шесть СЭВ.

Термин антитело в отношении к моноклональному антителу против миостатина по изобретению (или просто моноклональное антитело по изобретению), как используется в данном описании, относится к моноклональному антителу. Моноклональное антитело, как используется в данном описании, относится к химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иное. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению существует в гомогенной или по существу гомогенной популяции. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных технологий, хорошо известных в данной области, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций этих технологий или других технологий, хорошо известных в данной области. Моноклональное антитело относится к антителу, полученному из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу его получения. Моноклональное антитело может быть интактным антителом (содержащим полный или полноразмерный участок Рс), по существу интактным антителом или частью или фрагментом антитела, содержащими антигенсвязующую часть, например фрагмент РаЬ, фрагмент РаЬ' или фрагмент Р(аЬ')₂ химерного, гуманизированного или антитела человека.

Вариабельные домены каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Таким образом, интактное антитело 1дС имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифичных антител, два сайта связывания являются одинаковыми. Как используется в данном изобретении, антигенсвязывающая часть, или антигенсвязывающий участок, или антигенсвязывающий фрагмент используются взаимозаменяемо и относятся к части молекулы антитела в пределах вариабельного домена, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу специфичность и аффинность по отношению к антигену. Антигенсвязывающая часть антитела включает каркасные аминокислотные остатки, необходимые для поддержания соответствующей конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно СОВ антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет мышиное происхождение или по существу мышиное происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными для повышения конкретной активности (см., например, фиг. 9). Предпочтительно каркасные участки антител по изобретению имеют человеческое или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 85, 90, 95, 97 или 99%). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок или СОВ антигенсвязывающего участка могут быть получены из других видов, не являющихся человеком, включая, но ими не ограничиваясь, кроликов, крыс или хомяков. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок может иметь полностью человеческое или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными для повышения конкретной активности, например аффинности или специфичности (см., например, аминокислотные положения на фиг. 9, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты).

Кроме того, моноклональное антитело, как используется в данном описании, может быть одноцепочечным фрагментом Ρν, который может быть получен путем присоединения ДНК, кодирующей ЬСУВ и НСУВ, к линкерной последовательности (см., Р1иск1Ьии, Т1е РЬа^тасο1οду οί Мοиοс1οиа1 Аиί^Ьοй^е8, νο1. 113, Вο8еиЬи^д аий ΜοοίΌ ей§., 8рпидег-Ует1ад, Νονν ΥοΦ, р. 269-315, 1994). Понятно, что вне зависимости от того, указаны ли фрагменты или части, термин антитело, как используется в данном описании, включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. Если белок сохраняет способность к специфичному или предпочтительному связыванию с предназначенной для этого мишенью (например, с эпитопом или антигеном), то он охвачен термином антитело.

- 6 015589

Популяция моноклональных антител относится к гомогенной или по существу гомогенной популяции антител (т.е. по крайней мере приблизительно 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97 или 98% или более предпочтительно по крайней мере 99% антител в популяции будут конкурировать в анализе ЕЫ8А за тот же самый антиген или эпитоп). Рамками изобретения охвачены антитела, которые могут быть гликозилированными или негликозилированными. Моноклональные антитела могут быть гомогенными, если они имеют идентичные аминокислотные последовательности, но при этом могут отличаться посттрансляционными модификациями, например характером гликозилирования.

Вариант антитела против миостатина относится в данном описании к молекуле, аминокислотная последовательность которой отличается от аминокислотной последовательности родительского антитела против миостатина в силу добавления, делеции и/или замещения одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких участках СЭВ родительского антитела. Например, вариант может содержать по крайней мере одну (например, от приблизительно одной до приблизительно десяти и предпочтительно от приблизительно двух до приблизительно пяти) замену в одном или нескольких участках СОВ родительского антитела. Идентичность или гомологичность относительно вариантной последовательности определена в данном описании как процент аминокислотных остатков в вариантной последовательности, идентичный остаткам родительского антитела после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Ни Ν-концевые, ни С-концевые или внутреннее удлинение, ни делеции или инсерции в последовательности антитела не должны интерпретироваться как влияющие на идентичность или гомологичность последовательности. Вариант сохраняет способность связываться с миостатином и предпочтительно обладает свойствами, превосходящими аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариант имеет более сильную аффинность связывания, более низкую 1С₅₀ в анализе 8ВЕ/репортер или повышенную способность ингибировать биоактивность миостатина. Вариант антитела, представляющий особый интерес, в данном случае представляет собой антитело, проявляющее по крайней мере приблизительно 2-, 5-кратное, предпочтительно по крайней мере приблизительно 10-кратное и более предпочтительно по крайней мере приблизительно 20-, 30- или 50-кратное повышение биологической активности по сравнению с родительским антителом.

Родительское антитело в данном случае представляет собой антитело, которое кодируется аминокислотной последовательностью, использующейся для получения варианта. Родительское антитело может иметь каркасный участок мыши, но предпочтительно имеет каркасный участок человека. Родительское антитело может быть мышиным (см., например, фиг. 10 и 11, приведенные в данном описании), химерным, гуманизированным или антителом человека.

Термин специфически связывается, как используется в данном описании, относится к ситуации, когда один участник пары специфического связывания не связывается в значительной степени с другими молекулами, кроме своего партнера(ов) по специфическому связыванию (т. е. перекрестная реактивность составляет менее приблизительно 35, 33, 30, 20 или 10%), как измерено способами, известными в данной области, например конкурентным ЕЬ18А или путем нахождения К_с с помощью анализа В1АСОВЕ или ΚΙΝΕΧΑ. Термин также используется, если, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который имеется у некоторого числа антигенов, в таком случае специфическое антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию с различными антигенами, несущими эпитоп. Таким образом, моноклональное антитело по изобретению специфически связывается с эпитопом, локализованным в пределах аминокислот 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелой формы миостатина.

Термин предпочтительно связывается, как используется в данном описании, относится к ситуации, когда антитело связывается со специфическим антигеном по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем с другим антигеном, как измерено способами, известными в данной области, например с помощью конкурентного анализа ЕЫ8А или путем К_с нахождения с помощью анализов В1АСОВЕ или ИМЕХА. Соответственно, моноклональное антитело по изобретению предпочтительно связывается с СЭЕ-8, а не с СЭЕ-11. Аналогично, антитело может предпочтительно связываться с одним эпитопом антигена по сравнению с другим эпитопом того же самого антигена.

Термин эпитоп относится к части молекулы, которая способна распознаваться и связываться антителом в одном или нескольких антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическим зарядом. Под ингибирующим эпитопом и/или нейтрализующим эпитопом подразумевается эпитоп, который в контексте интактной молекулы (в данном случае миостатина) и при связывании с антителом, специфическим по отношению к эпитопу, приводит к потере или к уменьшению биологической активности молекулы или организма, содержащего молекулу, ίη νίνο или ίη νίίτο.

- 7 015589

Термин эпитоп, как используется в данном описании, также относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например у мыши или человека.

Термин антигенный эпитоп, как используется в данном описании, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, как определено любым способом, хорошо известным в данной области, например при помощи обычных иммунных анализов. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут быть иммуногенными. Иммуногенный эпитоп, как используется в настоящем описании, определяется как часть полипептида, которая вызывает антительный ответ у животного, определяемый любым способом, известным в данной области (см., например, беукеи е! а1., Ргос. Иа11. Асаб. 8с1. И8А, 81: 3998-4002 (1983)).

Выражения биологическое свойство или биоактивность, активность или биологическая активность в отношении антитела по настоящему изобретению используются в данном описании взаимозаменяемо и включают, но не ограничиваются, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность нейтрализовать или усиливать активности миостатина ίη νίνο или ίη νίίτο, 1С₅₀ в анализе миостатин/репортер 8ВЕ или в другом анализе активности ίη νίίτο, стабильность антитела и иммуногенные свойства антитела ίη νίνο. Остальные идентифицируемые биологические свойства антитела включают, например, перекрестную реактивность (т. е. с гомологами пептида-мишени, не принадлежащими человеку, или с другими белками или тканями в общем) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики можно наблюдать, или измерять, или оценивать с использованием методик, известных из уровня техники, включая, но не ограничиваясь, ЕЬ18А, конкурентный ЕЬ18А, поверхностный плазменный резонанс, анализы нейтрализации ίη νίίτο и ίη νίνο без ограничений, рецепторного связывания, продукции и/или секреции цитокинов или факторов роста, развития анимального полюса Хемрик, передачи сигнала и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, в том числе от человека, примата или из любого другого источника по необходимости.

Термин активность миостатина, используемый в настоящем описании, относится к одной или более физиологически рост-регулирующим или морфогенетическим активностям, связанным с активным белком миостатина. Например, активный миостатин является отрицательным регулятором скелетной мускулатуры. Активный миостатин также может модулировать продукцию мышечно-специфических ферментов (например, креатинкиназы), стимулировать пролиферацию миобластов и модулировать дифференцировку преадипоцитов в адипоциты.

Термин ингибировать или нейтрализовать, используемый в настоящем описании, в отношении активности антитела по настоящему изобретению означает способность, по существу, противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, элиминировать, прекращать, уменьшать или обращать, например, прогрессирование или тяжесть того, что ингибируют, включая, но не ограничиваясь, биологическую активность или свойство, заболевание или состояние. Ингибирование или нейтрализация предпочтительно составляет по крайней мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или больше.

Термин выделенный при использовании в отношении нуклеиновой кислоты или белка (например, антитела) относится к последовательности нуклеиновой кислоты или белку, которые идентифицированы и отделены по крайней мере от одного контаминирующего вещества, с которым он обычно связан в его природном источнике. Предпочтительно выделенное антитело представляет собой антитело, которое, по существу, свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, фармацевтические композиции по изобретению содержат выделенное антитело, которое специфически связывается с миостатином и, по существу, свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от миостатина).

Термины нумерация по Кабату и обозначение по Кабату используются в данном описании взаимозаменяемо. Эти термины, известные в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных доменах тяжелой и легкой цепей антитела (КаЬа!, е! а1., Аил. ΝΥ Асаб. 8с1. 190: 382-93 (1971); КаЬа!, е! а1., Зециемек οί Рго!ешк οί Iттиηο1οд^са1 И'ИегекЬ ΡίίίΡ Ε6ίίίοη, и.8. ОерайтегИ οί Неа1111 апб Ηитаи ЗеМсек, ΝΙΗ ΡιιΝχηΙίοη Νο. 91-3242 (1991)).

Полинуклеотид является оперативно связанным, если он находится в оперативной связи с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Пептид является оперативно связанным с другим пептидом, когда полинуклеотиды, кодирующие их, являются оперативно связанными, предпочтительно они находятся в одной и той же открытой рамке считывания.

Термины индивидуум, индивид и пациент в данном описании используются взаимозаменяемо и относятся к животному, предпочтительно млекопитающему (включая непримата или примата), или видам птиц, включая, но не ограничиваясь, мышей, обезьян, людей, млекопитающих - сельскохозяйственных животных (например, коров, свиней, овец), млекопитающих - спортивных животных (например, лошадей) и млекопитающих - домашних питомцев (например, псовых и кошачьих); предпочтительно

- 8 015589 этот термин относится к людям. Этот термин также относится к видам птиц, включая, но не только, кур и индюков. В конкретном варианте осуществления индивидуум, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, дополнительно характеризуется заболеванием, или нарушением, или состоянием, которые могли бы быть улучшены в результате снижения уровня или снижения биоактивности миостатина. В другом варианте осуществления индивидуум, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, дополнительно характеризуется наличием у него риска развития нарушения, заболевания или состояния, которые могли бы быть улучшены в результате снижения уровня или снижения биоактивности миостатина.

Термин вектор включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, в том числе плазмиды и вирусные векторы, но не ограничиваясь ими. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, тогда как другие векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и при введении в клетку-хозияна, таким образом, реплицироваться наряду с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы здесь называются рекомбинантные векторы экспрессии (или, упрощенно, векторы экспрессии), а примеры векторов хорошо известны в данной области.

Используемые в данном описании выражения клетка, клетка-хозяин, клеточная линия и клеточная культура используются взаимозаменяемо и включают в себя индивидуальную клетку или клеточную культуру, которая является реципиентом любого выделенного полинуклеотида по настоящему изобретению или любого рекомбинатного вектора(ов), содержащих последовательность, кодирующую НСУВ, ЬСУК или моноклональное антитело по изобретению. Клетки-хозяева включают в себя потомство одной клетки-хозяина, и потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или полной комплементарности ДНК) исходной родительской клетке вследствие природных, случайных или преднамеренных мутаций и/или изменений. Клетка-хозяин включает в себя клетки, трансформированные, трансдуцированные или инфицированные ίη νίνο или ίη νίΐτο одним или более рекомбинантными векторами, или полинуклеотидом, экспрессирующим моноклональное антитело по изобретению, или его легкую или тяжелую цепь. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор по изобретению (либо стабильно встроенный в хромосому хозяина, либо нет), также может называться рекомбинантной клеткой-хозяином. Предпочтительными клетками-хозяевами для использования в изобретении являются клетки СНО (например, АТСС СВЬ-9096), N80 клетки, 8Р2/0 клетки и СО8 клетки (АТСС, например, СВЬ-1650, СВЬ-1651), НеЬа (АТСС ССЬ-2). Дополнительные клетки-хозяева для использования в изобретении включают растительные клетки, дрожжевые клетки, другие клетки млекопитающих и клетки прокариот.

Характеристика антител.

Настоящее изобретение относится к выделенным, моноклональным антителам, которые специфически связываются с миостатином с высокой аффинностью. Антитела по изобретению предпочтительно представляют собой химерные, гуманизированные антитела или антитела человека или их антигенсвязывающие части и преимущественно связываются с миостатином в пределах области зрелой формы миостатина, охватывающего аминокислоты 40-64, или более предпочтительно в пределах области зрелой формы миостатина, перекрывающей аминокислоты 43-57 и/или 45-59. Дополнительно, антитела по изобретению нейтрализуют биологическую активность миостатина ίη νίνο или ίη νίίτο. Специфическое связывание моноклональных антител против миостатина по изобретению с миостатином позволяет использовать антитела по изобретению в качестве терапевтических и профилактических средств при состояниях, заболеваниях или нарушениях, связанных с миостатином, т.е. состояниях, заболеваниях или нарушениях, при которых является благоприятным снижение уровней миостатина или противодействие или ингибирование биологической активности миостатина. Кроме того, антитела по изобретению могут быть использованы для диагностики или мониторинга состояний, заболеваний или нарушений, при которых может быть полезным изменение уровня или биоактивности миостатина, или для определения уровня миостатина в образце.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина, которое связывается с миостатином или его часть, с аффинностью связывания (К_с) миостатина, приблизительно меньшей или равной 3х10^-8 М, 1х10^-8 М или 1х10^-9 М, предпочтительно менее чем приблизительно 9х10^-10 М, или 8,7х10^-10 М, или 8х10^-11 М. Предпочтительно антитела по изобретению характеризуются значением Кс в отношении миостатина не более приблизительно 3х10^-8 М, 1х 10^-8 М, 1х 10^-9 М или 9х10^-10 М и наиболее предпочтительно значением Кс в отношении миостатина приблизительно не более 8,7х10^-10 М или 8х10^-11 М. Аффинности антител могут быть определены, как описано в примерах, приведенных ниже, или с использованием любого подходящего способа, имеющегося в уровне техники.

- 9 015589

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина, которое имеет значение 1С₅₀, примерно меньшее или равное 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6, 5,2 нМ или менее в анализе миостатин/репортер ЗВЕ ίη νίΐτο, как описано в приведенных ниже примерах. Такие антитела могут быть дополнительно охарактеризованы К_с в отношении миостатина приблизительно не более 3х10^-8 М, 1 х 10^-8 М, 1х10^-9 М или 9х10^-10 М и наиболее предпочтительно значением К в отношении миостатина приблизительно не более 8,7х10^-10 М или 8х10^-11 М. Такие антитела могут быть дополнительно охарактеризованы преимущественным связыванием миостатина по сравнению с их способностью связываться с ОБЕ-11, используя любой доступный в данной области способ, например ЕБ1ЗА или конкурентный ЕБ1ЗА, или значения К_с измерены, например, с помощью анализа В1АСОВЕ или ΚΙΝΕΧΑ.

В одном варианте осуществления перекрестная реактивность моноклонального антитела по изобретению составляет примерно менее 35, 33, 30, 28, 25, 23 или 20% (более предпочтительно примерно менее 19-, 18-, 17-, 16-, 15-, 14-, 13-, 12-, 11-, 10-, 9-, 8-, 7- или 6-, еще более предпочтительно примерно менее 5- или 4-процентную перекрестную реактивность) с белком, не являющимся миостатином (таким как, например, ОБЕ-11), или с пептидом, не являющимся миостатином, состоящим по крайней мере из 15, 14, 13, 12, 11, 10 или 9 последовательных аминокислот, как измерено с помощью стандартных способов уровня техники, таких как ЕЫЗА или конкурентный ЕБ1ЗА анализ, или значения К_с измерены, например, с помощью В1АСОКЕ или КШЕХА.

Предпочтительно антитело по изобретению связывается с миостатином по крайней мере в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем он связывается с СБЕ-1Е как определено, например, в конкурентном ЕЫЗА, В1АСОКЕ или КШЕХА анализе. Наиболее предпочтительно антитела по изобретению не связываются с ОБЕ-11 на уровнях, превышающих фоновые уровни, при использовании любого анализа связывания, доступного для специалиста в данной области. Моноклональное антитело по изобретению связывается с мономерной или димерной формой миостатина или его частью, содержащей аминокислоты, перекрывающие остатки 40-64, 43-57 и/или 45-59, или зрелый миостатин.

Предпочтительно миостатин и ОБЕ-11 полипептид, тестируемые на предпочтительное связывание с антителом по изобретению, оба, являются гомодимерными формами зрелого белка, преимущественно происходящего из млекопитающих или птиц, еще более предпочтительно получены от человека. Однако миостатин и ОБЕ-11 полипептид, тестируемые на предпочтительное связывание с антителом по изобретению, могут представлять собой мономерную форму зрелого белка или форму протеина, или полипептид, содержащий часть зрелого белка, перекрывающую аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелой формы белка.

Моноклональные антитела против миостатина по изобретению связываются с антигенным эпитопом, локализация которого была обнаружена в пределах аминокислот 40-64 (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 53 для человека) зрелого миостатина, предпочтительно в пределах аминокислот 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина. Кроме того, иммуногенный эпитоп миостатина по изобретению расположен в пределах аминокислот 40-64 зрелого миостатина (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 53 для человека), предпочтительно в пределах аминокислот 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина любого вида млекопитающих или птиц. Иммуногенный эпитоп по изобретению также считается антигенным эпитопом. Антигенный эпитоп может иметь дополнительные остатки миостатина вне аминокислот 40-64 зрелого миостатина, но для моноклональных антител по изобретению эти дополнительные остатки не требуются для специфического связывания с миостатином. Кроме того, остатки миостатина вне аминокислот 40-64 могут влиять на конформационную структуру антигенного домена и таким образом изменять связывание антитела по изобретению с антигенным эпитопом. Предпочтительно моноклональные антитела по изобретению, по существу, не реагируют (т.е. не связываются) с ОБЕ-11 по сравнению с уровнем, с которым они связываются с ОБЕ-8. Более предпочтительно моноклональные антитела по изобретению связываются с миостатином по крайней мере в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше (т. е. с большей аффинностью или большей специфичностью), чем они связываются с ОБЕ-11, как определено с помощью, например, анализа ЕЫЗА или конкурентного анализа ЕЫЗА, или значений К_с, измеренных в анализах В1АСОВЕ или КШЕХА.

Пептид, состоящий из аминокислот 40-64 (включительно), 43-57 или 45-59 зрелого миостатина, или любой пептид, состоящий из иммуногенного эпитопа, как описано в данном изобретении, может быть использован в качестве иммуногенного пептида, предпочтительно конъюгированного с белкомносителем, например КЕН, для получения моноклональных антител по изобретению, используя способы, доступные специалисту в данной области. Предполагается, что остатки цистеина в пределах этих пептидов могут быть заменены остатками серина и сохранить функцию иммуногенного эпитопа. Иммуногенный пептид может быть использован для иммунизации животных, не являющихся человеком, предпочтительно млекопитающих, более предпочтительно мышей. Для полностью антитела человека иммуногенный пептид может быть использован для иммунизации трансгенных линий мышей, у которых генная экспрессия мышиных антител супрессирована и эффективно заменена на генную экспрессию антитела человека. Затем антитела против миостатина выделяют из иммунизированного животного и подвергают скринингу с помощью хорошо известных из уровня техники способов для выделения тех антител, кото

- 10 015589 рые специфически связываются в пределах области, перекрывающей аминокислоты 40-64 зрелого миостатина, предпочтительно в пределах области, перекрывающей аминокислоты 43-57 и/или 45-59, предпочтительно подвергаемые скринингу, на аффинность связывания примерно менее 3х10^-8 М, 1х10^-8 М или 1х10^-9 М, предпочтительно примерно менее 9х10^-10 М, 8,7х10^-10 М или 8х10^-11 М, и/или подвергают скринингу на 1С₅₀, меньшее или равное приблизительно 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6, 5,2 нМ или менее в анализе миостатин/8ВЕ ίη νίίτο (см. описание анализа в примере 6, приведенном в данном описании).

Моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного способа, хорошо известного в этой области (см., например, КоЫег е! а1., №1Шгс. 256: 495, 1975), или могут быть получены при помощи способов рекомбинантных ДНК (например, как в патенте США № 4816567) или других способов, имеющихся в этой области. В общем, гибридому можно получить путем слияния подходящей иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как 8Р2/0) с клетками иммунизированного животного, продуцирующими антитела. Клетки, продуцирующие антитела, предпочтительно представляют собой клетки селезенки или лимфатических узлов, полученные от животных, иммунизированных представляющим интерес антигеном. Слитые клетки (гибридомы) могут быть выделены с использованием селективных условий культивирования и клонированы с помощью предельных разведений. Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, исследуют на продукцию моноклональных антител, направленных против этого антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют с помощью иммунопреципитации или анализом связывания ίη νίίτο, такого как радиоиммунный анализ (В1А) или ЕБ18А. Клетки, которые продуцируют антитела с желаемыми характеристиками связывания, могут быть отобраны при помощи подходящего скринингового анализа. Способы такого выделения и скрининга хорошо известны в этой области.

Могут быть использованы другие подходящие способы получения или выделения антител, которые связываются в пределах области, перекрывающей аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, в том числе антитела человека или искусственные антитела, включая, например, способы, в которых отбирают рекомбинантное антитело (например, одноцепочечный Εν или ЕаЬ) из библиотеки, или которые основаны на иммунизации трансгенных животных (например, мышей), способных продуцировать набор антител человека (см., например, .ЕакоЬоуЦк е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 90: 2551-2555, 1993; 1акоЬоу11к е! а1., На!иге, 362: 255-258, 1993; ЬопЬегд е! а1., патент США № 5545806; 8игат е! а1., патент США № 5545807).

Одноцепочечные антитела и химерные, гуманизированные или примитизированные (СЭВпривитые) антитела, а также химерные или СЭВ-привитые одноцепочечные антитела и подобные им антитела, содержащие части, полученные из различных видов, также охватываются настоящим изобретением и термином антитело. Различные части этих антител могут быть соединены вместе химически при помощи общепринятых методик, синтетически или могут быть получены в виде смежного белка с использованием методов генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, которые кодируют химерную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для продуцирования смежного белка. См. например, патент США № 4816567; европейский патент № 0125023 В1; патент США № 4816397; европейский патент № 0120694 В1; XVО 86/01533; европейский патент № 0194276 В1; патент США № 5225539; европейский патент № 0239400 В1 и патенты США № 5585089 и 5698762. См. также №тешап, В. е! а1. ВюТесбпо1оду, 10: 1455-1460, 1993, в отношении приматизированного антитела, и Ьабпег е! а1., патент США № 4946778 и Вий, В.Е. е! а1., 8с1епсе, 242: 423-426, 1988, в отношении одноцепочечных антител.

Кроме того, также могут быть получены функциональные части антител, включая антигенсвязывающие части химерных, гуманизированных антител, или антител человека, или одноцепочечных антител. Функциональные части вышеупомянутых антител сохраняют по крайней мере одну антигенсвязывающую функцию и/или биологическую функцию или биоактивность антитела полной длины, от которого они получены. Предпочтительные функциональные части сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего антитела полной длины (например, способность связывать зрелую форму миостатина млекопитающего). Особенно предпочтительные функциональные части или фрагменты сохраняют способность ингибировать одну или более функций или биологических активностей, характерных для зрелого миостатина млекопитающих, таких как активность связывания, сигнальная активность и/или стимулирование клеточного ответа. Например, в одном варианте осуществления функциональная часть или фрагмент может ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или несколькими его лигандами и/или могут ингибировать одну или более рецептор-опосредованных функций.

- 11 015589

Части или фрагменты антител, способные связываться со зрелым миостатином или его частью (предпочтительно в пределах аминокислот 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина), включают в себя, но не ограничиваются, фрагменты Εν, ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')₂ и охватываются изобретением. Такие фрагменты могут быть получены путем ферментного расщепления или с помощью рекомбинатных технологий. Например, расщепление папаином или пепсином может привести к образованию ЕаЬ или Е(аЬ')2 фрагментов соответственно. Наименьшим антигенсвязывающим фрагментом является Εν, состоящий из НСУВ и БСУВ доменов. Фрагмент ЕаЬ состоит из НСУВ-СН1 и ЬСУВ-СЬ доменов, ковалентно связанных дисульфидной связью между константными доменами. Для преодоления тенденции нековалентно связанных доменов НСУВ и ЬСУВ в Εν диссоциировать при совместной экспрессии в клетке-хозяине может быть сконструирован так называемый одноцепочечный (кс) Εν фрагмент (ксЕу), в котором гибкий и соразмерно длинный полипептид связывается либо С-концом НСУВ с Ν-концом ЬСУВ или С-концом ЬСУВ с Ν-концом НСУВ. Наиболее часто используемый линкер представлял собой (С1у₄8ет)₃ пептид из 15 остатков, но из уровня техники также известны другие линкеры. Антитела также могут быть получены в различных усеченных формах с использованием генов антител, в которые один или более стопкодонов были введены выше природным стоп-сайтом. Например, может быть создан химерный ген, кодирующий Е(аЬ')₂ часть тяжелой цепи, для включения ДНК последовательностей, кодирующих домен СН1 и шарнирный участок тяжелой цепи.

Было доказано, что отбор фрагментов антител из библиотек при помощи технологий обогащения, таких как фаговый дисплей (МайЬете ЭЛ. апб \Уе11к 1.А. 8с1епсе. 260: 1113-7, 1993), рибосомный дисплей (Напек, е! а1., Ргос. Май. Асаб. 8сх (И8А), 95: 14130-5, 1998), бактериальный дисплей (8атие1коп Р., е! а1., 1оитпа1 о£ Вю1есЬпо1о§у. 96: 129-54, 2002) или дрожжевой дисплей (К1еке М.С., е! а1., Рго1ет Епдшеегшд, 10: 1303-10, 1997), является удачной альтернативой классической гибридомной технологии (последние обзоры: Ь1й1е М. е! а1., 1ттипо1о§у Тобау, 21: 364-70, 2000).

Варианты антител.

Мышиное моноклональное антитело или антитело человека (полученное, например, у трансгенных мышей), полученное против иммуногенного эпитопа (аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина) по изобретению или против белка, содержащего иммуногенный эпитоп по изобретению, является родительским антителом. Мышиное родительское антитело может быть дополнительно изменено для создания химерной или гуманизированной формы антитела с использованием способов, хорошо известных в данной области. Такие химерные или гуманизированные антитела могут служить в качестве родительских антител для дальнейших изменений или мутагенеза. Родительские антитела по изобретению могут быть дополнительно подвержены мутагенезу, например, в пределах домена(ов) СЭВ (см., например, фиг. 9) для создания варианта антитела с оптимизированными свойствами, представляющими интерес, например аффинностью связывания, 1С₅₀, специфичностью и т.д. Предпочтительным является вариант антитела с аминокислотной заменой, у которого удален по крайней мере один аминокислотный остаток молекулы родительского антитела и на место которого вставлен другой остаток. Сайты наибольшего интереса для заместительного мутагенеза включают области СЭВ, но изменения ЕВ также рассматриваются. Предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности антитела, то могут быть внесены более существенные изменения, т.е. неконсервативные аминокислотные замены, и продукты подвергнут скринингу.

Пригодным для получения заменяющих вариантов способом является созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Кратко, несколько участков СЭВ области подвергают мутации для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом участке. Варианты антител, полученные таким образом, появляются в моновалентном виде из нитевидных фаговых частиц как слияния с продуктом гена III М13, упакованные в каждой частице. Варианты фагового дисплея затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания, специфичность, 1С₅₀), как описано в данном изобретении. Для идентификации участков СЭВ области, подходящих для модификации, могут быть произведены аланиновые сканирования мутагенов аланином для идентификации остатков СЭВ области, которые вносят значительный вклад в связывание антигенов. Альтернативно или дополнительно, полезным может быть анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для идентификации мест контакта антитела и миостатина. Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются кандидатами для замещения в соответствии с методиками, разработанными в данном изобретении или известными в данной области. Альтернативно или дополнительно, может быть проведен неспецифический мутагенез одной или нескольких последовательностей СЭВ в одном или нескольких положениях остатков либо когда СЭЯ оперативно связан с вариабельным доменом, либо когда СЭЯ не связан с другой последовательностью вариабельного домена, и затем измененный СЭВ возвращают в вариабельный домен с использованием технологии рекомбинантной ДНК. После того как были получены и экспрессированы такие варианты антител, набор вариантов подвергают скринингу, как описано в данном изобрении, а антитела с лучшими свойствами в одном или нескольких релевантных анализах могут быть отобраны для дальнейшей разработки.

- 12 015589

Любые цистеиновые остатки, не вовлеченные в поддержание надлежащей конформации антитела против миостатина по изобретению, могут быть замещены в основном серином для улучшения стойкости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного связывания. Наоборот, к антителу может быть добавлена цистеиновая связь(и) для улучшения его стабильности (в особенности, если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Ρν).

Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет исходный профиль гликозилирования антитела. Под изменением подразумевается делеция одной или нескольких углеводных групп, находящихся в антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в родительском антителе.

Гликозилирование антител является либо Ν-связанным, либо О-связанным. Ν-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидная последовательность аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями, распознаваемыми при ферментном присоединении углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Поэтому присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также может быть использован 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно проводить путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или несколько из вышеописанных трипептидных последовательностей (для Ν-связанных сайтов гликозилирования). Изменение может также быть выполнено путем добавления или замены одного или нескольких сериновых или треониновых остатков последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).

Последовательность.

Предпочтительное моноклональное антитело по изобретению содержит ЬСУК, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 5-12, и/или НСУК, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 13-26, 55 и 56 03-138 (см. фиг. 5-9, приведенные в данном описании). Кроме того, моноклональное антитело по изобретению представляет собой антитело, которое конкурентно ингибировано в результате связывания зрелого миостатина человека (или его части) с моноклональным антителом, содержащим два полипептида с последовательностями, показанными в группе, состоящей из (ί) 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 15; (ίί) 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 16 и (ίίί) 8Е0 ΙΌ N0: 10 и 26. Такое конкурентное ингибирование между антителами можно измерить при помощи анализов, хорошо известных специалисту в данной области, например конкурентного анализа ЕЫ8А.

В другом варианте осуществления моноклональное антитело против миостатина по изобретению содержит (ί) полипептид ЬСУК с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 5-12, и (ίί) полипептид НСУК с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 13-26, 55 и 56. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид ЬСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 5, дополнительно содержит полипептид НСУК с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 13-20. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид ЬСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 6, дополнительно содержит полипептид НСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 14. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид ЬСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 7, дополнительно содержит полипептид НСУК с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 21-25 и 56.

Предпочтительно антитело, содержащее полипептид ЬСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 10, дополнительно содержит полипептид НСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 26 или 55. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид НСУК с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 55, дополнительно содержит полипептид ЬСУК с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 8-12.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что антитела по изобретению не ограничиваются конкретными последовательностями НСУК и ЬСУК, показанными на фиг. 5-9 в данном описании, но также включают в себя варианты этих последовательностей, которые сохраняют антигенсвязывающую способность. Такие варианты могут быть получены из представленных последовательностей, используя методики, известные в данной области и описанные выше.

В другом варианте вариантов осуществления антитело против миостатина по изобретению имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит области СЭК со следующими аминокислотными последовательностями: СЭКН1 (8ЕС ΙΌ N0: 59), СЭКН2 (8ЕС ΙΌ N0: 60) и СЭКН3 (НЕС) ΙΌ N0: 61); и/или где вариабельный домен легкой цепи содержит области СЭК со следующими аминокислотными последовательностями: СЭКШ (НЕС) ΙΌ N0: 57), СЭКЬ2 (НЕС) ΙΌ N0: 30 или 52) и СЭКЬ3 (НЕС) ΙΌ N0: 58). Предпочтительно СЭК тяжелой цепи антитела по изобретению показаны на фиг. 5, 6 или 9, а СЭК легкой цепи антитела по изо

- 13 015589 бретению показаны на фиг. 7, 8 или 9, и СОВ находятся в антителе в положении СЭВ, определенном на фигурах. Например, одно антитело по изобретению имеет СЭВЙЛ с 8 ЕС ГО N0: 27, СЭВЙ2 с 8ЕС ГО N0: 30, СЭВЬ3 с 8ЕС ГО N0: 31, СЭВН1 с 8ЕС ГО N0: 36, СЭВН2 с 8ЕС ГО N0: 43 и СЭВН3 с 8Е0 ГО N0: 47 (как у антитела 1С7.1 на фиг. 9).

Дополнительно предполагается, что антитело против миостатина по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий область СЭВН1 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8 ЕС ГО N0: 36-42, и/или область СЭВН2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 43-46, и/или область СЭВН3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 47-51. В другом варианте осуществления антитело против миостатина по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий область СЭВЬ1 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 27-29, и/или область СЭВЙ2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 30 или 52, и/или область СЭВЙ3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8 ЕС ГО N0: 31-35. В предпочтительном варианте осуществления антитело против миостатина по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий область СЭВН1 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 36-42, и/или область СЭВН2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 43-46, и/или область СЭВН3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 47-51, и дополнительно содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий область СЭВЙ1 участок с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 27-29, и/или область СЭВЙ2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 30 или 52, и/или область СЭВЙ3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0: 31-35.

Структурой, несущей СЭВ по изобретению, в основном будет последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или его значительная часть, в которой расположена СЭВ в месте, соответствующем СЭВ природных НСУВ и ЬСУВ (КаЬа! с1 а1., 8сс.|испсс5 οί РгсИспъ οί 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. И8 Эср1 οί НН8, 1991). Предпочтительно три гипервариабельных домена (СЭВ) для каждой цепи, легкой и тяжелой, представлены в каркасной области, т.е. в виде смежной последовательности, представленной следующей формулой: РВ1-СЭВ1-РВ2-СЭВ2-РВ3-СЭВ3-РВ4. РВ1, РВ2, РВ3 и РВ4 тяжелой цепи или легкой цепи объединяются с образованием полного каркаса при расположении в виде смежной последовательности с СЭВ в указанном порядке.

Помимо последовательностей СЭВ, ЬСУВ и НСУВ дополнительно содержат каркасную последовательность. В гуманизированном антителе, предназначенном для терапевтического использования у людей, каркасная последовательность предпочтительно полностью или по существу происходит от человека (т.е. по крайней мере 85, 87, 90, 92, 95, 96, 97, 98 или 99% происхождение от человека). Предпочтительно каркасная область легкой цепи гуманизированного антитела, антитела человека или химерного антитела по изобретению представляет собой 02, как показано на фиг. 7, состоящий из РВ1 с 8ЕС ГО N0: 65, РВ2 с 8ЕС ГО N0: 66, РВ3 с 8ЕС ГО N0: 67 и РВ4 с 8ЕС ГО N0: 68. Предпочтительно каркасная область тяжелой цепи гуманизированного антитела, антитела человека или химерного антитела по изобретению представляет собой УН2-70 или УН4-39, как показано на фиг. 5 и 6 соответственно. Каркас УН2-70 состоит из РВ1 с 8ЕС ГО N0: 69, РВ2 с 8ЕС ГО N0: 70, РВ3 с 8ЕС ГО N0: 71 и РВ4 с 8ЕС ГО N0: 72. УН4-39 состоит из РВ1 с 8ЕС ГО N0: 73, РВ2 с 8ЕС ГО N0: 74, РВ3 с 8ЕС ГО N0: 75 и РВ4 с 8Е0 ГО N0: 76. В антителе, предназначенном для использования у животного, не являющегося человеком, последовательность каркасной области может, по существу, происходить из генома человека (предпочтительно используемого у животного, не являющегося человеком, на стадии эмбриона или новорожденного) или из генома животного, у которого он используется терапевтически.

В одном варианте осуществления антитело против миостатина по изобретению, в котором весь вариабельный домен или его часть ограничены конкретной последовательностью, показанной здесь посредством 8Е0 ГО N0, дополнительно характеризуется тем, что является химерным, гуманизированным антителом или полностью антителом человека или его антигенсвязывающей частью, которая противодействует или нейтрализует по крайней мере одну активность миостатина ίπ νίνο или ίπ νίίτο. Антитело против миостатина по изобретению, в котором весь вариабельный домен или его часть ограничены конкретной последовательностью, показанной здесь посредством 8Е0 ГО N0, дополнительно характеризуется тем, что оно предпочтительно связывается с СЭР-8, а не с СЭР-11. Более предпочтительно такие антитела связываются с миостатином по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем связываются с СЭР-11. Наиболее предпочтительно такие антитела, когда экспрессируются в виде РаЬ, не связываются с СЭР-11 выше фоновых уровней.

- 14 015589

Антитело против миостатина по изобретению, в котором весь вариабельный домен или его часть ограничены конкретной последовательностью, показанной здесь посредством 8ЕО ΙΌ N0, дополнительно характеризуется (ί) связыванием пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 53, предпочтительно пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 62; и/или (ίί) наличием 1С₅о, меньшим или равным приблизительно 25, 20, 16, 10, 9, 6, 5,7 нМ в анализе миостатин/репортер 8ВЕ ίη νίίτο; и/или (ίίί) наличием аффинности связывания (К_с) с миостатином приблизительно менее 3х10^-8 М, 1х 10^-8 М или 1 х 10^-9 М, предпочтительно приблизительно менее 9х10^-10 М, или 8,7х10^-10 М, или 8х10^-11 М; альтернативно характеризуется как Кс с миостатином не выше, чем приблизительно 3х10^-8 М, 1 х 10^-8 М, 1 х 10^-9 М или 9х10^-10 М; более предпочтительно Ки не выше приблизительно 8,7х10^-10 М и наиболее предпочтительно Кс не выше чем приблизительно 8х10^-11 М.

Экспрессия антител.

Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, которые экспрессируют антитело против миостатина по изобретению или его часть. Создание и выделение клеточных линий, продуцирующих моноклональное антитело по изобретению, можно осуществить с использованием стандартных методик, известных в данной области. Предпочтительные клеточные линии включают С08, СНО, 8Р2/0, N80 и дрожжи (доступное из общественных депозитариев, таких как АТСС, Ашепсап Туре Си11ите Со11ес1юп, Мапаккак, УЛ).

Может быть использован широкий ряд экспрессионных систем хозяев для экспрессии антитела по настоящему изобретению, включая прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы экспрессии (такие как дрожжи, бакуловирус, растительные клетки, клетки млекопитающих и клетки других животных, клетки трансгенных животных и гибридомные клетки), а также системы экспрессии фагового дисплея. Примером подходящего бактериального вектора экспрессии является рИС119, а подходящим эукариотическим вектором экспрессии является модифицированный рсЭНЛ3.1 вектор с ослабленной системой селекции ЭНЕК. Остальные системы экспрессии антител также известны в данной области и рассмотрены в данном описании.

Антитело по изобретению может быть получено путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клеткухозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т. д. одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими ДНК-фрагменты, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы такие легкие и/или тяжелые цепи экспрессировались в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепь могут быть экспрессированы независимо от различных промоторов, с которыми они оперативно связаны в одном векторе, или, альтернативно, тяжелая цепь и легкая цепь могут зкспрессироваться независимо от различных промоторов, с которыми они оперативно связаны в двух векторах - один из них экспрессирует тяжелую цепь, а второй - легкую. Необязательно, тяжелая цепь и легкая цепь могут зкспрессироваться в различных клетках-хозяевах.

Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой эти антитела могут быть выделены или очищены. Стандартные технологии рекомбинатных ДНК используют для получения генов легкой и тяжелой цепей антитела, включения этих генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева. Такие стандартные технологии рекомбинантных ДНК описаны, например, у 8ашЬтоок, Етйксй, апб Машабк (Ебк.), Мо1еси1аг С1оп1пд; А ЬаЬота1огу Мапиа1, 8есопб Ебйюп, Со1б 8ртшд НагЬог, КУ., 1989; АикиЬе1, е! а1. (Ебк.) Ситтеп! Рто1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Отеепе РиЬйкЫпд Аккоаа1ек, 1989.

Выделенная ДНК, кодирующая область НСУК, может быть конвертирована в ген тяжелой цепи полной длины путем оперативного связывания НСУК-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константного домена тяжелой цепи человека известны в данной области. См., например, КаЬа!, е! а1., 8ециепсек оГ Рто1ешк оГ 1тшипо1од1са1 1п!егек!, ΕίΠΙι Ебйюп, и.8. Эераг1шеп1 оГ Неа1111 апб Нитап 8еМсек, МН РиЬйсабоп №. 91-3242 (1991). Фрагменты ДНК, которые охватывают эти области, могут быть получены, например, с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константный домен тяжелой цепи может быть любого типа (например, 1дО, 1дА, 1дЕ, 1дМ или Ι§Ό), класса (например, Ι§Οι, Ι§0₂, Ι§0₃ и Ι§0₄) или подкласса и любым его аллотипным вариантом, как описано у КаЬа! (кирга). Альтернативно, антигенсвязывающая часть может быть фрагментом ЕаЬ, фрагментом ЕаЬ', фрагментом Е(аЬ')₂, Еб или одноцепочечным фрагментом Εν (ксЕ\^г). Для гена фрагмента ЕаЬ тяжелой цепи ДНК кодирующая НСУК может быть оперативно связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный домен тяжелой цепи СН1.

- 15 015589

Выделенная ДНК, кодирующая область ЬСУК, может быть преобразована в ген легкой цепи полной длины (а также в ген ЕаЬ легкой цепи) путем оперативного связывания ДНК, кодирующей ЬСУК, с другой молекулой ДНК, кодирующей константный домен легкой цепи, СЬ. Последовательности генов константного домена легкой цепи человека известны в данной области. См., например, КаЬа!, кирга. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены при помощи стандартной ПЦРамплификации. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа или лямбда.

Для создания гена ксРу фрагменты ДНК, кодирующие НСУК и ЬСУК, оперативно связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (01у₄-8ег)₃, таким образом, чтобы последовательности НСУК и ЬСУК могли экспрессироваться в виде смежного одноцепочечного белка с областями ЬСУК и НСУК, соединенными гибким линкером. См., например, В1гб, е! а1., 8с1епсе, 242: 423-6, 1988; Нийоп, е! а1., Ргос. №111. Асаб. δα. И8Л, 85: 5879-83, 1988; МсСаГГеПу, е! а1., ЫаЩге, 348: 552-4, 1990.

Для экспрессии антитела по изобретению ДНК кодирующую часть или полную длину легкой и/или тяжелой цепи, полученную, как описано выше, вводят в вектор экспрессии таким образом, чтобы ген был оперативно связан с транскрипционными и трансляционными контрольными последовательностями. Были выбраны вектор экспрессии и контрольные последовательности экспрессии, совместимые с используемой клеткой-хозяином экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, чаще, оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вводят в вектор экспрессии стандартными способами. Дополнительно, рекомбинатный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела против миостатина из клетки-хозяина. Ген легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела против миостатина может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид является оперативно связанным в рамке с геном аминоконца цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом.

Кроме гена(ов) тяжелой и/или легкой цепи антитела, рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению несет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена(ов) цепи антитела в клетке-хозяине. Термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), при необходимости, которые контролируют транскрипцию либо трансляцию гена(ов) цепи антитела. Создание вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают в себя вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (СМУ), обезьяньего вируса 40 (8У40), аденовируса (например, главного позднего промотора аденовируса (ЛбМЬР)) и вируса полиомы.

Кроме генов тяжелой и/или легкой цепей антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинатные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетке-хозяине (например, начало репликации), и один или несколько селектируемых маркерных генов. Селектируемые маркерные гены облегчают отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор. Например, обычно селектируемый маркерный ген придает резистентность к лекарственным средствам, таким как С418, гидромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен этот вектор. Предпочтительные селектируемые маркерные гены включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) (для использования в клетках-хозяевах ΌΗΕΚминус путем селекций метотрексата/амплификацией), ген иео (для отбора 0418) и глутаминсинтетазу (08) в Οδ-негативной клеточной линии (такой как N80) для селекции/амплификации.

Для экспрессии легкой и/или тяжелой цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующий тяжелые и/или легкие цепи, вводят в клетку-хозяин с помощью стандартных технологий, например электропорации, осаждения фосфатом кальция, ΌΕΑΕ-декстран трансфекции, трансдукции, инфицирования и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительными являются эукариотические клетки и наиболее предпочтительными - клетки-хозяева млекопитающих, поскольку такие клетки, наиболее вероятно, собирают и секретируют правильно уложенное и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают в себя ооциты китайского хомячка (клетки СНО) (в том числе клетки ΌΗΕΚ-СНО, описанные у Иг1аиЬ апб СЬаДп, Ргос. №111. Асаб. 8а. И8А, 77: 4216-20, 1980, используемые с селектируемым маркером ΌΗΕΚ, например, как описано у КаиГтаи аиб 8Ьатр, 1. Мо1. Вю1. 159: 601-21, 1982, N80 миеломные клетки, СО8 клетки и 8Р2/0 клетки. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для того, чтобы дать возможность осуществить экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секрецию антитела в культуральную среду, в кото

- 16 015589 рой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть восстановлены из клетки-хозяина и/или культуральной среды с помощью стандартных способов очистки.

Клетки-хозяева также могут быть использованы для получения частей или фрагментов интактных антител, например фрагментов РаЬ или молекул зсΡν с применением общепринятых технологий. Квалифицированному специалисту будет понятно, что варианты вышеуказанной методики не выходят за пределы объема настоящего изобретения. Например, может быть желательным трансфектировать клеткухозяина с использованием ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела по изобретению. Также для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих легкую или тяжелую цепь или обе цепи, которые не являются необходимыми для связывания с миостатином, также могут быть использованы технологии рекомбинантных ДНК. Молекулы, которые экспрессируются такими усеченными молекулами ДНК, также включаются в антитела по изобретению.

В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела по изобретению рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий как легкую цепь антитела, так и тяжелую цепь антитела вводят в клетки ΌΗΡΚ-СНО путем, например, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В рекомбинантном векторе экспрессии каждый ген тяжелой и легкой цепей антитела оперативно связан с регуляторными элементами энхансера/промотора (например, полученными из 8У40, СМУ, аденовируса и т.п., таких как регуляторный элемент СМУ энхансер/АбМЬР промотор или регуляторный элемент 8У40 энхансер/АбМЬР промотор) для запуска высоких уровней генной транскрипции. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген ΌΗΡΚ, позволяющий провести отбор СНО клеток, которые были трансфектированы вектором с использованием селекции метотрексата/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для возможности осуществить экспрессию легкой и тяжелой цепей антитела и интактное антитело восстанавливают из культуральной среды. Для получения рекомбинатного вектора экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивировирования клеток-хозяев и восстановления антитела из культуральной среды используют стандартные способы молекулярной биологии. Антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению могут быть экспрессированы у животного (например, у мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека (см., например, Τау1ο^, е! а1., №.1с1ею Ас1бз Кез. 20: 6287-95, 1992).

После экспрессии интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или иные формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными способами в этой области, включая осаждение сульфатом аммония, ионообменную аффинную, обратно-фазовую, колоночную хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-электрофорез и т.п. Для фармацевтических целей предпочтительными являются, по существу, чистые иммуноглобулины, имеющие по крайней мере приблизительно 90, 92, 94 или 96% гомогенность, наиболее предпочтительной является гомогенность 98-99% или более. После очистки, частичной или до желаемой степени гомогенности, пептиды могут затем быть использованы в терапевтических либо профилактических целях в соответствии с настоящим изобретением.

Химерное антитело.

Используемый в данном описании термин химерное антитело включает моновалентные, дивалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепью. Дивалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами легкая цепь-тяжелая цепь, связанными посредством по крайней мере одного дисульфидного мостика.

Химерная тяжелая цепь антитела содержит антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепи антитела, не принадлежащего человеку, специфичного к миостатину, который оперативно связан по крайней мере счастью константного домена тяжелой цепи человека или по существу человеческого константного домена тяжелой цепи (или видов, которые отличаются от тех, из которых был получен антигенсвязывающий участок). Химерная легкая цепь антитела содержит антигенсвязывающую область, полученную полностью или по существу из легкой цепи антитела, не принадлежащего человеку, оперативно связанного по крайней мере с частью константного домена легкой цепи человека, или по существу человеческого (или видов, которые отличаются от тех, из которых был получен антигенсвязывающий участок) константного домена легкой цепи (СЬ). Антитела, фрагменты или производные, содержащие химерные тяжелые цепи и химерные легкие цепи с одинаковой или различной специфичностью связывания вариабельного домена, могут также быть получены путем соответствующего связывания отдельных полипептидных цепей в соответствии со стадиями известного способа.

Для данного подхода хозяева, которые экспрессируют химерные тяжелые цепи, культивируют отдельно от хозяев, которые экспрессируют химерные легкие цепи, а иммуноглобулиновые цепи восстанавливают отдельно, а затем связывают. Альтернативно, хозяева могут быть культивированы совместно, а цепям дают возможность связываться самопроизвольно в культуральной среде с последующим восстановлением собранного иммуноглобулина или фрагмента. Способы получения химерных антител известны в данной области (см., например, патенты США № 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397).

- 17 015589

Гуманизированные антитела.

Предпочтительно антитело по изобретению, предназначенное для использования в терапевтических целях, имело бы последовательность каркаса и константного домена (в той мере, в которой она существует в антителе), полученную от млекопитающего, у которого оно было бы использовано в качестве терапевтического средства для того, чтобы снизить вероятность того, что млекопитающее сможет вызвать иммунный ответ на лечебное антитело. Гуманизированные антитела представляют особый интерес, поскольку их считают ценными для применения в терапевтических целях и избежания антительного ответа у человека на мышиное антитело, который часто наблюдается в отношении антител грызунов. Кроме того, в гуманизированных антителах эффекторная часть является человеческой, так что она может лучше взаимодействовать с остальными частями иммунной системы человека (например, разрушать клеткимишени более эффективно посредством комплемент-зависимой цитотоксичности или антителозависимой клеточной цитотоксичности). Также введенные путем инъекции гуманизированные антитела могут иметь период полужизни, больший, чем таковой у природных антител человека, например мышиные антитела, тем самым давая возможность вводить меньшие дозы и с меньшей частотой.

Термин гуманизированное антитело, используемый в данном описании, относится к антителу, содержащему части антител различного происхождения, в котором по крайней мере одна часть имеет человеческое происхождение. Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из антитела, которое происходит не от человека, с необходимой специфичностью, такого как мышиное антитело, и из антитела человеческого происхождения, соединенных вместе химически при помощи общепринятых способов (например, синтетических) или полученных как смежные полипептиды с использованием методов генной инженерии.

Предпочтительно гуманизированное антитело имеет СЭВ, которые происходят из антитела, не принадлежащего человеку (предпочтительно мышиного моноклонального антитела), тогда как каркасная область и константный домен в той мере, в которой они присутствуют (или их значительная, или существенная часть, т.е. по крайней мере приблизительно 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), кодируются информацией последовательности нуклеиновой кислоты, которая встречается в области иммуноглобулина зародышевой линии человека (см., например, 1п1сгпаЬопа1 1тМипоСепеТ1С5 Эа1аЬа8С) или в их рекомбинированных или мутантных формах, вне зависимости от того, продуцируются ли указанные антитела в клетке человека. СЭВ гуманизированного антитела могут быть оптимизированы из СЭВ родительского антитела, не являющегося антителом человека, из которого они произошли, для получения желаемых свойств, например специфичности, аффинности и функциональной активности. Оптимизированные СЭВ могут содержать аминокислотные замены, добавления и/или делеции по сравнению с родительскими СЭВ. Например, аминокислотные положения в 8ЕО ΙΌ N0: 57, 30, 58, 59, 60 и 61, которые подчеркнуты и выделены жирным шрифтом на фиг. 9, представляют собой положения, которые были оптимизированы из родительских СЭВ, как показано на фиг. 10 и 11. Однако предполагается, что любое антитело против миостатина, не являющееся антителом человека, (ί) индуцированное против пептида, состоящего из последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 53 или 62, или (ίί) индуцированное против пептида, содержащего последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 53 или 62, и реакционноспособно в отношении пептида, состоящего из последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 53 или 62, и может служить в качестве родительского антитела, которое может быть преобразовано в гуманизированное или химерное антитело с использованием стандартных способов, доступных в этой области.

Гуманизированные формы антител, не являющихся антителами человека (например, мышиных), включают в себя интактное антитело, по существу интактное антитело, часть антитела, содержащую антигенсвязывающий сайт, или часть антитела, содержащую фрагмент ЕаЬ, фрагмент ЕаЬ', Е(аЬ')₂ или одноцепочечный фрагмент Εν. Гуманизированные антитела предпочтительно содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированном СЭВ, ни в каркасных последовательностях. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по крайней мере из одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все аминокислоты в областях СЭВ соответствуют аминокислотам иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, а все или по существу все аминокислоты в областях ЕВ являются аминокислотами консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, оптимально, также содержит по крайней мере часть константного домена иммуноглобулина (Ес), обычно иммуноглобулина человека [1опех еί а1., №1нге, 321: 522-525 (1986); В1есЬтапп еί а1., №11иге. 332: 323-329 (1988) и РгеЛа. Сигг. 0р. 8йисЕ Вю1., 2: 593-596 (1992)].

Гуманизированные антитела могут быть подвергнуты мутагенезу ш νΐίτο с использованием способов, обычно применяемых в этой области (либо при использовании животного, трансгенного для последовательностей 1д человека, соматическому мутагенезу ш νίνο), и, таким образом, аминокислотные последовательности каркасной области НСУВ и ЬСУВ доменов гуманизированных рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей, относящихся к последовательностям НСУВ и ЬСУВ зародышевых линий человека, не могут существовать в природе в наборе антител зародышевых линий человека ш νίνο. Предполагается, что такие амино

- 18 015589 кислотные последовательности каркасных областей НСУЯ и ЬСУЯ гуманизированных рекомбинантных антител являются по крайней мере на 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 98% или наиболее предпочтительно по крайней мере на 99% идентичными последовательностям зародышевых линий человека. Предпочтительно такие остатки каркасной области родительского антитела (например, мышиного антитела или, в общем, антитела, из которого получено гуманизированное антитело), которые поддерживают или влияют на структуру сайта связывания, будут оставлены. Такие остатки могут быть идентифицированы, например, при помощи рентгеновской кристаллографии родительского антитела или фрагмента РаЬ, таким образом идентифицируя трехмерную структуру антигенсвязывающего сайта.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению может содержать или может быть получено из каркасной области легкой цепи зародышевой линии человека. В конкретных вариантах осуществления последовательность легкой цепи зародышевой линии человека выбирают из УК последовательностей человека, включая, но не ограничиваясь, А1, А10, А11, А14, А17, А18, А19, А2, А20, А23, А26, А27, А3, А30, А5, А7, В2, В3, Ь1, Ь10, Ь11, Ь12, Ь14, Ь15, Ь16, Ь18, Ь19, Ь2, Ь20, Ь22, Ь23, Ь24, Ь25, Ь4/18а, Ь5, Ь6, Ь8, Ь9, 01, 011, 012, 014, 018, 02, 04 и 08. В отдельных вариантах осуществления такую каркасную область легкой цепи зародышевой линии человека выбирают из У1-11, У1-13, У1-16, У1-17, У1-18, У1-19, У1-2, У1-20, У1-22, У1-3, У1-4, У1-5, У1-7, У1-9, У2-1, У2-11, У2-13, У2-14, У2-15, У2-17, У2-19, У2-6, У2-7, У2-8, У3-2, У3-3, У3-4, У4-1, У4-2, У4-3, У4-4, У4-6, У5-1, У5-2, У5-4 и У5-6. См. РСТ \У0 2005/005604, где приведено описание различных последовательностей зародышевых линий.

В других вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению может содержать или может быть получено из каркасной области тяжелой цепи зародышевой линии человека. В конкретных вариантах осуществления этот каркас тяжелой цепи зародышевой линии человека выбирают из УН1-18, УН1-2, УН1-24, УН1-3, УН1-45, УН1-46, УН1-58, УН1-69, УН1-8, УН2-26, УН2-5, УН2-70, УН3-11, УН3-13, УН3-15, УН3-16, УН3-20, УН3-21, УН3-23, УН3-30, УН3-33, УН3-35, УН3-38, УН3-43, УН3-48, УН3-49, УН3-53, УН3-64, УН3-66, УН3-7, УН3-72, УН3-73, УН3-74, УН3-9, УН4-28, УН4-31, УН4-34, УН4-39, УН4-4, УН4-59, УН4-61, УН5-51, УН6-1 и УН7-81. См. РСТ \\'0 2005/005604, где приведено описание различных последовательностей зародышевых линий.

В конкретных вариантах осуществления вариабельный домен легкой цепи и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит каркасную область или по крайней мере часть каркасной области (например, содержащую 2 или 3 субобласти, такие как РЯ2 и РЯ3). В отдельных вариантах осуществления, по крайней мере, РЯЬ1, РЯБ2, РЯБ3 или РЯЕ4 являются полностью человеческими. В других вариантах осуществления, по крайней мере, РЯН1, РЯН2, РЯН3 или РЯН4 являются полностью человеческими. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере РЯЕ1, РЯБ2, РЯЬ3 или РЯБ4 являются последовательностями зародышевой линии (например, зародышевой линии человека) или содержат консенсусные последовательности человека для конкретной каркасной области. В других вариантах осуществления, по крайней мере, РЯН1, РЯН2, РЯН3 или РЯН4 являются последовательностями зародышевой линии (например, зародышевой линии человека) или содержат консенсусные последовательности человека для конкретной каркасной области. В предпочтительных вариантах осуществления каркасная область представляет собой каркасную область человека.

В общем, гуманизированные антитела могут быть получены путем получения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих НСУЯ и ЬСУЯ антитела, например мышиного антитела или антитела, полученного из гибридомы, которое связывает эпитоп миостатина по изобретению, идентифицируя СЭЯ в указанных НСУЯ и ЬСУЯ (не принадлежащих человеку) и прививая такие СЭЯ-кодирующие последовательности нуклеиновых кислот в выбранные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие каркасную область человека. Необязательно, область СЭЯ может быть оптимизирована с помощью случайного мутагенеза или мутагенеза в конкретных положениях для замены делеции или добавления одной или более аминокислот в СЭЯ до прививания области СЭЯ в каркасную область. Альтернативно, область СЭЯ может быть оптимизирована после вставки в каркасную область человека, используя способы, доступные специалисту в данной области. Предпочтительно аминокислотные последовательности каркасной области человека выбирают таким образом, чтобы полученное в результате антитело, вероятно, подходило для введения людям ίη νίνο. Это можно определить, например, исходя из предыдущего использования антител, содержащих такую последовательность каркасной области человека. Предпочтительно последовательность каркасной области человека сама по себе не будет в значительной степени иммуногенной.

Альтернативно, аминокислотные последовательности каркасных областей антитела, предназначенного для гуманизирования, можно сравнить с последовательностями известных последовательностей каркасной области человека, используемых для прививания СЭЯ и отобранных на основании содержащихся в них последовательностей, в значительной степени подобных последовательностям родительского антитела, например мышиного антитела, которое связывается с миостатином. Были выделены многочисленные последовательности каркасной области человека, а об их последовательностях сообщалось в уровне техники. Это повышает вероятность того, что полученное в результате СЭЯ-привитое гуманизированное антитело, содержащее СЭЯ родительского (например, мышиного) или оптимизированные СЭЯ родительского антитела, привитые в выбранные каркасные области человека (и, возможно также, кон

- 19 015589 стантный домен человека) в существенной степени сохранят антигенсвязывающую структуру и, таким образом, сохранят аффинность связывания родительского антитела. Для сохранения значительной степени антигенсвязывающей аффинности выбранные каркасные области человека будут предпочтительно такими, которые, как ожидается, подойдут для введения ίη νίνο, т.е. не иммуногенными.

В любом из способов получают ДНК последовательности, кодирующие НСУВ и ЬСУВ домены предпочтительного мышиного антитела против миостатина. Способы клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулины, хорошо известны в данной области. Такие способы могут, например, включать в себя амплификацию иммуноглобулинкодирующих последовательностей, клонируемых с использованием соответствующих праймеров путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). О праймерах, подходящих для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот иммуноглобулина, в особенности последовательностей мышиных НСУВ и ЬСУВ, сообщалось в литературе. После того как такие последовательности, кодирующие иммуноглобулин, были клонированы, они будут секвенированы способами, хорошо известными в данной области.

После прививания СОВ-кодирующих последовательностей в выбранные последовательности кодирующие каркасные области человека, полученные ДНК последовательности, кодирующие последовательности гуманизированных вариабельных тяжелых и вариабельных легких цепей, затем экспрессируют с получением гуманизированного Ρν или гуманизированного антитела, которое связывается с миостатином. Гуманизированные НСУВ и ЬСУВ могут экспрессироваться как часть целой молекулы антитела против миостатина, т. е. в виде слитого белка с последовательностями константного домена человека, кодирующие ДНК последовательности которого были получены из коммерчески доступной библиотеки или были получены с использованием, например, одного из описанных выше способов получения ДНК последовательностей или способов, известных в данной области. Однако последовательности НСУВ и ЬСУВ также могут экспрессироваться в отсутствие константных последовательностей для получения гуманизированного Ρν против миостатина. Тем не менее, слияние последовательностей константных доменов человека в вариабельном домене является потенциально желаемым, так как полученное в результате гуманизированное антитело против миостатина может обладать эффекторными функциями антигена человека.

Способы синтеза ДНК, кодирующей белок известной последовательности, хорошо известны в данной области. С использованием таких способов синтезируют ДНК последовательности, кодирующие гуманизированные последовательности НСУВ и ЬСУВ пациента (с константными доменами или без них), а затем экспрессируют в векторной системе, подходящей для экспрессии рекомбинантных антител. Это можно осуществить в любой векторной системе, предоставляющей гуманизированные НСУВ и ЬСУВ последовательности для пациента, предназначенные для экспрессируемого в виде слитого белка с последовательностями константного домена человека и для объединения с получением функциональных (связывающих антиген) антител или фрагментов антител.

Последовательности константного домена человека хорошо известны в данной области, и о них сообщалось в литературе. Предпочтительные последовательности константного домена легкой цепи человека включают каппа- и лямбда-последовательности константного домена легкой цепи. Предпочтительные последовательности константного домена тяжелой цепи человека включают 1§С₁ человека, 1дС₂ человека, 1дС₃ человека, 1дС₄ человека и их мутантные варианты, которые обеспечивают измененную эффекторную функцию, например увеличенный период полужизни ίη νίνο, сниженное связывание с рецептором Рс, измененный профиль дезамидирования и т.п.

Если таковые имеются, каркасные области человека предпочтительно получают из вариабельного домена антитела человека, имеющего последовательность, подобную последовательности, аналогичной или эквивалентной области антигенсвязывающей области донора (т.е. родительского антитела). Другие источники каркасных областей частей гуманизированного антитела, происходящих от человека, включают вариабельные консенсусные последовательности человека (см., например, ΚΌΐΐΒόοϊΌΐίβΙι. С.А. е1 а1. Рго1ет Εηд^ηее^^ηд, 4: 773-783 (1991); СаЛет е1 а1., ХУО 94/04679. Например, последовательность антитела или вариабельного домена, которую используют для получения части, не принадлежащей человеку, может быть сравнима с последовательностями человека, как описано у КаЬа! е1 а1. 8едиенсе5 οί Ρτοίδίηδ οί Iттиηο1οд^са1 Шегей, ΡίΠΙι Εάίίίοη, МН, υ.8. ΟονΌΓηιικηΙ Ρτίηίίη§ ОГПсе (1991). В особенно предпочтительном варианте осуществления каркасные области цепи гуманизированного антитела получены из вариабельного домена человека, имеющего по крайней мере приблизительно 60% общей идентичности последовательности, предпочтительно по крайней мере приблизительно 70% общей идентичности последовательности и более предпочтительно по крайней мере приблизительно 85% общей идентичности последовательности с вариабельным доменом донора, который не является человеком. Человеческая часть может быть также получена из антитела человека, имеющего по крайней мере приблизительно 65% идентичности последовательности и предпочтительно по крайней мере приблизительно 70% идентичности последовательности с конкретной используемой частью (например, РВ), по сравнению с эквивалентной частью (например, РВ) донора, который не является человеком.

- 20 015589

Ссылки, дополнительно описывающие способы, которые могут быть использованы при гуманизации мышиного антитела, представляют собой, например, Онееп еί а1., Ргос. Асай. 8с1. И8А, 88: 2869,

1991; патент США № 5693761; патент США № 4816397; патент США № 5225539; компьютерные программы ΛΒΜ0Ό и ЕНСЛЭ, как описано у ^еν^ίί, Μ., I. Μοί. Βίοί. 168: 595-620, 1983; гуманизация может быть, по существу, проведена в соответствии со способом, описанным ХУйНег и соавторами Ротек еί а1., №Шге, 321: 522-525 (1986); В1есктапп еί а1., №Шге, 332: 323-327 (1988); Уейюеуеп еί а1., 8аепсе, 239: 1534-1536 (1988)].

Антитела человека.

В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены антитела человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. НοοдеηЬοοт апй ХУйНег I. Μο1. Βίο1., 227: 381 (1991); ΜπγΕκ еί а1., I. Μο1. Βίο1., 222: 581 (1991). Также доступны методики ί'οΕ еί а1. и Βοе^ηе^ еί а1. для получения моноклональных антител человека. ί’οΕ еί а1., Μοηοсίοηаί АηйЬοй^ек апй Сапсег ТИегару, А1ап В. Ыкк, р. 77 (1985) и Βοе^ηе^ еί а1., I. Шти^Е, 147(1): 86-95 (1991). Аналогично, антитела человека могут быть получены путем введения локусов иммуноглобулина человека трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. После иммунизации, например, антигеном, содержащим иммуногенный эпитоп по изобретению, получают полный набор продукции антитела человека, который очень похож на тот, который наблюдается у людей, во всех отношениях, включая перегруппировку генов, сборку и набор антител. Этот подход описан, например, в патентах США № 5545807; 5545806; 5569825; 5589369; 5591669; 5625126; 5633425; 5661016 и в следующих научных публикациях: ΜπγΕκ еί а1., В^Тескш^^у. 10: 779-783, 1992; ЕюпЬегд еί а1., №11иге. 368: 856859, 1994; Μορτίκο^ №11иге. 368: 812-13, 1994; ЕЫиуйй еί а1., №11иге ВШескш^ду. 14: 845-51, 1996; №иЬегдег, №1иге ВюЮскгю^ду. 14: 826, 1996; Εοπ^Γβ апй Никхаг, Шет. Веν. Штидой 13: 65-93, 1995 апй ΙοΕΕοΕονίΙκ еί а1., Ргос. Асай. 8сЕ И8А, 90: 2551, 1993.

Гены иммуноглобулина человека, введенные мыши, создают, таким образом, трансгенных мышей, способных отвечать на антигены антителами с последовательностями человека, которые также описаны у Вгиддетапп еί а1. Ргос. Асай. 8сЕ И8А. 86: 6709-6713 (1989). Существует несколько стратегий для создания млекопитающих, продуцирующих антитела человека. В частности, существует минилокусный подход, в котором локус экзогенного имитирован посредством включения частей (отдельных генов) из локуса (см., например, патенты США № 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650 и 5814318, 5612205, 5721367, 5789215), УАС введения больших и, по существу, зародышевых фрагментов локусов [см. Μеηйеζ еί а1. №1иге Сепейск, 15: 146-156 (1997), Сгееп апй ΓιΕοΕονίΙκ I. Ехр. Μей. 188: 483-495 (1998)] и введения целых или существенно целых локусов посредством использования микроклеточного слияния (см. европейскую патентную заявку ЕР 0843961 А1).

Для получения антитела против миостатина по изобретению может быть использована любая трансгенная мышь, способная реагировать на иммунизацию антителами, имеющими последовательности человека, с использованием способов, доступных специалисту в данной области, например, когда такую мышь иммунизируют полипептидом, содержащим иммуногенный эпитоп по изобретению.

Применение.

Антитела по настоящему изобретению применимы в терапевтических, профилактических, диагностических и исследовательских целях, как описано в данном изобретении. Антитело по изобретению может быть использовано для диагностики нарушения или заболевания, связанных с экспрессией миостатина человека. Аналогично, антитело по изобретению может быть использовано в анализе для контроля уровней миостатина у пациента, который получает лечение состояния, связанного с миостатином. Диагностические исследования включают способы, в которых используют антитело по изобретению и метку для детекции миостатина в пробе, например в жидкости организма человека или в клетке, или в тканевом экстракте. Антитела по изобретению могут быть использованы с модификацией или без нее и помечены путем ковалентного или нековалентного присоединения детектируемой группы. Детектируемой группой может быть любая группа, способная продуцировать либо непосредственно, либо опосредованно детектируемый сигнал. Например, детектируемой группой может быть радиоизотоп, такой как, например, Н, С, Р, 8 или Ι, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена. Может быть использован любой способ, известный в данной области для отдельного конъюгирования антитела с детектируемой группой, включая способы, описанные у НиШег, еί а1., №11иге. 144: 945, 1962; Эау1й, еί а1., ВюскетПйу. 13: 1014, 1974; Раш, еί а1., I. Штидой Μеίк. 40: 219, 1981 и ^дгеп, I. ШкФскет. Апй СуГОскет. 30: 407, 1982.

Ряд общепринятых протоколов для измерения миостатина, включая, например, ЕЫ8А, ΡΙΛ и ЕАС8, известны в данной области и обеспечивают базу для диагностики измененных или аномальных уровней экспрессии миостатина. Нормальные или стандартные значения экспрессии устанавливают при помощи любой методики, известной в данной области, например путем объединения пробы, содержащей полипептид миостатина, например, с антителами в условиях, подходящих для образования комплекса антиген: антитело. Антитело непосредственно или опосредованно метят детектируемым веществом для об- 21 015589 легчения выявления связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, данзил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает лю125 131 35 3 минол и примеры радиоактивных веществ включают I, I, 8 или Н (см., например, Ζο1η. Мопос1опа1 АпйЬоФек: А Мапиа1 о£ Тесйшдиек, СКС Ргекк, 1пс. (1987)).

Количество образованных стандартных комплексов подсчитывают различными способами, такими как, например, фотометрические способы. Количества полипептида миостатина, экспрессируемого у пациента, в контроле и в образцах (т.е. из биопсийных тканей) затем сравнивают со стандартными значениями. Отклонение между стандартными значениями и значениями у пациента устанавливает параметры для корреляции конкретного нарушения, состояния, синдрома или заболевания с определенным уровнем экспрессии (или его отсутствием) для полипептида миостатина.

При установлении наличия нарушения, состояния, синдрома или болезни начат протокол лечения, для мониторинга уровня экспрессии миостатина исследования повторяют регулярно. Результаты, полученные в последовательных тестах, используют для того, чтобы показать эффективность лечения на протяжении периода от нескольких дней до нескольких месяцев. Что касается конкретных нарушений (например, слабости или кахексии), то наличие измененного количества миостатина в биопсийной ткани или жидкости (например, сыворотке или моче) от пациента может указывать на предрасположенность к развитию нарушения, состояния, синдрома или заболевания до появления фактических клинических симптомов или может определять популяцию, у которой с большей вероятностью развивается терапевтический ответ на антитело по изобретению. Более точное начальное обнаружение может позволить осуществить более раннее лечение, тем самым предупреждая и/или задерживая дальнейшее прогрессирование болезни или нарушения, связанного с экспрессией миостатина, например мышечного или костного истощения.

Для удобства антитело по настоящему изобретению может быть предоставлено в наборе, упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями по проведению диагностического анализа. Если антитело помечено ферментом, то набор будет включать субстраты и кофакторы, необходимые для этого фермента (например, предшественник субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть включены другие вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут изменяться в широком диапазоне для обеспечения концентраций в растворе реагентов, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реактивы могут быть предоставлены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включая эксципиенты, которые при растворении обеспечивают раствор реактивов, имеющий соответствующую концентрацию.

Терапевтическое применение антител.

Миостатин играет роль в развитии мышц и ряде связанных с этим нарушений или заболеваний. У взрослых мРНК миостатина главным образом выявляется в скелетных мышцах, хотя более низкие концентрации также обнаружены в жировой ткани и сердечной ткани (8йагта, М., еί а1., 1 Се11 РЬукю1. 180: 1, 1999). Мыши с нокаутом миостатина имеют в два-три раза большую мышечную массу, чем их однопометные особи дикого типа. Увеличенная мышечная масса является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (МсРйеггоп, А., еί а1. №11иге. 387: 83-90, 1997 и Ζΐπ.ι, X. еί а1., ЕЕВ8 Ьейегк. 474: 71). Кроме того, мыши с нокаутом миостатина накапливают меньше жира, чем однопометные особи дикого типа, но в остальном выглядят нормальными и здоровыми. Недавно также было показано, что миостатин является важным регулятором адипогенеза (КеЬЬаргадайа, А., еί а1., Мо1. апй Се11. Вю. 23: 7230-7242, 2003). Кроме того, недавно были исследованы структура и состав костей мышей, имеющих дефицит миостатина (Натиск М.^., еί а1., 1. Оййораейю Кекеагсй. 21: 1025, 2003; Натиск, М.^., еί а1., Са1с1£ Т1ккие Ιπί. 71: 63, 2002.

Поэтому фармацевтическая композиция, содержащая антитело против миостатина по изобретению, может быть использована для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей, уменьшения мышечного истощения или может быть полезна для лечения или профилактики состояний, при которых наличие миостатина вызывает или вносит вклад в нежелательные патологические эффекты или при которых снижение уровней миостатина оказывает благоприятное терапевтическое действие у млекопитающих, предпочтительно людей, включая, но не ограничиваясь, мышечное истощение, повреждение мышц, хирургическое вмешательство, восстановление пораженных мышц, слабости, возрастную саркопению, атрофию от бездействия, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, ожирение, подавление накопления жира в организме, мышечную дистрофию любого типа, миопатию критического состояния, алкогольную миопатию, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ, или возникшую в результате хронического обструктивного заболевания легких, хронического заболева

- 22 015589 ния легких, восстановления после сепсиса, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или сердечного заболевания), метаболический синдром, послеожоговое мышечное истощение и диабет второго типа. Атрофия от бездействия может быть вызвана множеством причин или случаев, включая любое нарушение, или заболевание, или состояние, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию, или постельный режим, включая, но не ограничиваясь, трансплантацию солидных органов, замену суставов, инсульт, повреждения спинного мозга, восстановление после тяжелых ожогов, стационарный хронический гемодиализ, восстановление после сепсиса и воздействия невесомости. Поскольку миостатин имеет высококонсервативную последовательность и функцию у всех видов, антитела по изобретению могут быть использованы для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или лечения или профилактики состояний у млекопитающих, не относящихся к человеку, или птиц [например, домашних животных (например, псовых и кошачьих), спортивных животных (например, лошадей), животных - источников пищи (например, коров, свиней и овец), птиц (например, кур, индюков, остальную пернатую дичь или домашнюю птицу)], у которых наличие миостатина вызывает или вносит вклад в нежелаемые патологические эффекты или снижение уровней миостатина оказывает благоприятный терапевтический эффект.

В настоящем описании рассматривается применение моноклонального антитела против миостатина по настоящему изобретению для лечения или профилактики по крайней мере одного из вышеуказанных нарушений, при которых активность миостатина является неблагоприятной или для которых благоприятно снижение уровней биоактивного миостатина. Кроме того, рассматривается применение моноклонального антитела против миостатина по настоящему изобретению для использования в производстве лекарственного средства для лечения по крайней мере одного из вышеуказанных нарушений.

Используемый в данном описании термин лечение, лечебное воздействие и т.п. относится к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Этот эффект может быть профилактическим в смысле полной или частичной профилактики заболевания или его симптомов и/или может быть терапевтическим в смысле частичного или полного лечения заболевания и/или неблагоприятных воздействий, сопровождающих это заболевание. Лечение, как используется в данном описании, включает введение соединения по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, в частности у человека, и включает (а) профилактику возникновения заболевания у пациента, который может быть расположен к этому заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано; (Ь) ингибирование заболевания, т.е. задержку его развития; и (с) облегчение болезни, т.е. вызов регрессии заболевания или нарушения, или облегчение симптомов заболевания или его осложнений. Могут быть установлены режимы дозирования для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть введен один болюс, могут быть введены несколько разделенных доз в течение времени или доза может быть пропорционально снижена или повышена в соответствии с терапевтической ситуацией.

Фармацевтическая композиция.

Антитело по изобретению может быть включено в фармацевтические композиции, подходящие для введения пациенту. Соединения по изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентами в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному способу введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или эксципиенты, такие как диспергирующие агенты, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизаторы, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п. используют соответственно. Указанные композиции разработаны в соответствии с общепринятыми технологиями, приведенными, например, в ВетшдЮи, Т1е 8аеисе аий РгасЕсе οί Рйагтасу, 19¹¹' Еййюи, беипаго, Ей., Маск РиЫкЬшд СЬ., ЕахЮп, РА 1995, где предоставлен ряд технологий получения лекарственных средств, в общем известных специалистам.

Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело против миостатина по настоящему изобретению, может быть введена пациенту, имеющему риск развития или патологические состояния, описанные в данном изобретении, с использованием стандартных способов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев.

Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно представляет собой терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела по изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол, и массы тела пациента и способности антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у пациента. Терапевтически эффективным количеством также является количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты антитела преобладают над токсическим или вредным влиянием. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желаемого профи

- 23 015589 лактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют у пациентов до заболевания или на ранней стадии, то обычно профилактически эффективное количество может быть меньше терапевтически эффективного количества.

Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой, по крайней мере, минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимую для обеспечения терапевтической пользы пациенту. Другими словами, терапевтически эффективным количеством антитела по изобретению является количество, которое у млекопитающих, предпочтительно у людей, увеличивает мышечную массу, повышает плотность костной ткани или оказывает лечебное воздействие на состояния, при которых наличие миостатина приводит к или вносит вклад в нежелательные патологические эффекты или снижение уровней миостатина приводит к благоприятному терапевтическому эффекту у млекопитающих, предпочтительно у людей, включая, но не ограничиваясь, мышечное истощение, повреждение мышц, хирургическое вмешательство, возрастную саркопению, атрофию от бездействия, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, супрессию накопления жира в организме, мышечную дистрофию любого типа, миопатию критического состояния, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ или возникшую в результате ХОЗЛ, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или сердечного заболевания), метаболический синдром и диабет второго типа. Атрофия от бездействия может быть вызвана множеством причин или случаев, включая любое нарушение, или заболевание, или состояние, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию, или постельный режим, включая, но не ограничиваясь, трансплантацию солидных органов, замену суставов, инсульт, повреждения спинного мозга, восстановление после тяжелых ожогов, стационарный хронический гемодиализ, восстановление после сепсиса и воздействия невесомости.

Путь введения антитела по настоящему изобретению может быть пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин парентеральный, используемый в данном описании, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Предпочтительной является периферическая системная доставка путем внутривенной, или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны в данной области.

Фармацевтическая композиция, как правило, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в предоставленном контейнере, включая, например, герметично закрытый сосуд или шприц. Следовательно, фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованы после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Характерная композиция для внутривенной инфузии могла бы иметь объем 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенкса и терапевтически эффективную дозу (например, 1-100 мг/мл или более) концентрации антител. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно в медицине, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Стандартная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако предусмотрены дозы ниже или выше этого примерного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Ежедневный режим парентерального введения доз может составлять приблизительно от 0,1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно приблизительно от 0,3 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг и более предпочтительно приблизительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно приблизительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день. Прогресс можно контролировать путем периодической оценки. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до достижения желаемого подавления симптомов болезни. Однако полезными могут быть другие режимы дозирования, которые не исключены из данного описания. Желаемую дозировку можно доставлять путем введения единичного болюса, введений многократных болюсов или путем непрерывной инфузии антитела в зависимости от профиля фармакокинетического распада, которого хочет достичь практикующий специалист.

Эти предположительные количества антитела во многом зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима введения является получаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место введения антитела, конкретный тип антитела, способ введения, режим введения и другие факторы, известные практикующим врачам.

Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизация и восстановление могут приводить к потере активности антитела в различной степени. Дозировки могут быть адаптированы для коррекции. В общем, предпочтительным является значение рН от 6 до 8.

- 24 015589

Готовые изделия.

В другом варианте осуществления изобретение относится к готовому изделию, содержащему вещества, используемые для лечения или профилактики нарушений или состояний, описанных выше. Готовое изделие содержит контейнер и метку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и аналитические пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию по изобретению, которая является эффективной для профилактики или лечения нарушения или состояния и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, проницаемую для гиподермальной иглы для инъекций). Активный агент в композиции представляет собой антитело против миостатина по изобретению. Метка на контейнере или присоединенная к нему указывает на то, что композицию применяют для лечения выбранного заболевания. Готовое изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Дополнительно могут быть включены другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

Следующие примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Примеры

Пример 1. Анализы ЕЫЗА.

A. ЕаЬ против миостатина преимущественно связывают миостатин, а не ОБЕ-11.

ЕаЬ против миостатина (или МаЬ полной длины) по настоящему изобретению анализировали при помощи анализа ЕЫЗА, в котором измеряли связывание ЕаЬ со зрелым миостатином (димерной формы), нанесенным в различных концентрациях на 96-луночный планшет. Также анализировали связывание ЕаЬ с ОБЕ-11.

Каждую лунку обеих 96-луночных планшетов покрывают 200 нг/лунку рекомбинантного мышиного миостатина (К&Б системы, Са!. #788-О8/СЕ, не содержащие носитель, в карбонатном буфере, рН 9,6) или 200 нг/лунку рекомбинантного ОБЕ-11 человека (Рерго!есЕ, 1пс., Са!. #120-11, без носителя, в карбонатном буфере, рН 9,6). Планшеты инкубируют при 4°С в течение ночи. Лунки аспирируют и дважды промывают промывочным буфером (20 мМ Тпб (гидроксиметил)аминометан, рН 7,4, 0,15 М №С1, 0,1% Тгеееп-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на каждую лунку (5% растворимого молока фирмы Сагпайоп в вышеуказанном промывочном буфере) в течение 5 ч.

Тестируемые ЕаЬ или МаЬ разбавляют в блокирующем буфере при разных концентрациях, например 10, 2, 0,4, 0,08 и 0,016 мкг/мл. 50 мкл каждого раствора ЕаЬ добавляют в лунки, покрытые ОБЕ-8 и ОБЕ-11, в двух экземплярах. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. АР-конъюгированное вторичное антитело (50 мкл козьего антикаппа АР (ЗоиШегп Вю!есЕ), разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. В каждую лунку добавляют по 50 мкл хромогенного субстрата (например, АР субстрата) и оставляют развиваться при комнатной температуре. Поглощение лунок измеряют при оптической плотности 560 нм. Определяют среднее поглощение лунок двух экземпляров.

Ожидается, что все антитела по изобретению связываются планшет-связанным зрелым миостатином человека и преимущественно связываются миостатином по сравнению со связыванием с ОБЕ-11. В ОБЕ-8 простом ЕЫЗА ЕаЬ С12 имеет значение 1С₅₀ 0,25 мкг/мл и ЕаЬ 510С2 имеет значение 1С₅₀ 0,27 мкг/мл.

B. Гуманизированные оптимизированные антитела против миостатина связываются с пептидом миостатина.

В ЕЫЗА анализе антитела по изобретению связываются очищенным биотинилированным пептидом с последовательностью, которая перекрывает аминокислоты 40-64 зрелого миостатина человека (ЗЕО ΙΌ NΟ: 53) за исключением тех, в которых в положении 47 вместо цистеинового остатка находится аминомасляная кислота. Антитела по изобретению также связываются с пептидом, имеющим последовательность, показанную в ЗЕО ΙΌ NΟ: 62 (с цистеином или серином в положении 47 зрелого миостатина), а также со зрелой формой миостатина в мономерных и димерных формах.

В приводимом в качестве примера анализе ЕЫЗА 50 мкл раствора козьего антитела против каппацепей человека с концентрацией 1 мкг/мл ШЖВ, ЗоЩНегп Вю1ес11. 2060-01) в 50 мМ натрий бикарбонатном буфере, рН 8,0 используют для покрытия каждой лунки титровального микропланшета высокого связывания (Огешег ЕК 20061). Лунки аспирируют и промывают РВЗТ (РВЗ, 0,1% Ттеееп), и затем блокируют в течение 1 ч РВЗТ-ВЗА (РВЗ, 1 %> ВЗА, 0,1% Ттеееп). Затем лунки снова промывают РВЗТ. Все стадии процесса проводят при комнатной температуре. Титрования гуманизированного оптимизированного антитела против миостатина (антитела полной длины, содержащего Ес-область ^О^ транзиторно экспрессированного в 293 клетках), растворенные в РВЗТ-ВЗА, начиная с 50 нг/лунку, добавляют в лунки, планшет дополнительно инкубируют в течение 1 ч, промывают, как описано выше, и тестируют с

- 25 015589 мкл описанного выше биотинилированного пептида в концентации 50 нМ (разведенного в РВВ'ГВВА). Затем добавляют 50 мкл №и!гАМбт-АР с концентрацией 2 мкг/мл (1:1000 в РВВ0ВВА, Р1егсе 31002) и обнаружение осуществляют добавлением АР субстрата в соответствии с инструкцией производителя (Р1егсе 31002). В качестве контроля используют один буфер. Поглощение определяют при 560 нм. РаЬ 510С2 и С12 связываются с пептидом со значениями 1С₅₀ 6,73 и 5,42 нг на лунку соответственно.

Антитела по изобретению способны связываться с пептидом, состоящим из аминокислот 40-64 (ВЕС) ΙΌ ΝΟ: 53) зрелого миостатина, и/или с пептидом, содержащим аминокислоты 43-57 (ВЕС) ΙΌ ΝΟ: 62) зрелого миостатина (аминокислотой с цистеином или серином в положении 47). Однако антитела по изобретению не способны связываться (на уровнях, существенно выше фоновых) с пептидами, состоящими из аминокислот 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 или 30-42 зрелого миостатина. Зрелое антитело, называмое МаЬ 3 (см. заявки на патент иВ 60/559621 и 60/555456, включенные в данное описание), содержащее мышиные вариабельные домены (см. фиг. 10 и 11), оперативно присоединенное к Рс-области 1дО1 мыши, не связывается с пептидами, состоящими из аминокислот 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 или 30-42 зрелого миостатина, и является родительским антителом для антител по изобретению.

Гуманизированные антитела 510С2 и С12 связываются с пептидами, состоящими из аминокислот 43-57 и 45-59 зрелого миостатина (как показано в табл. 1 ниже) в одинаковой степени. Это демонстрирует то, что эпитоп по изобретению более специфично расположен в пределах пептида, охватывающего аминокислоты 45-57 зрелого миостатина. Связывание незначительно снижается, когда антитела тестируют на связывание с пептидом, состоящим из аминокислот 47-61 зрелого миостатина, демонстрируя важность аминокислот 45-46 зрелого миостатина для связывания или сохранения конформации пептида, которая делает возможным связывание. Связывание дополнительно снижается, когда антитела тестируют на связывание с пептидом, состоящим из аминокислот 49-63 зрелого миостатина, демонстрируя важность аминокислот 47-48 зрелого миостатина для связывания или сохранения конформации пептида, которая делает возможным связывание. Связывание снижается до фоновых уровней, когда антитела тестируют на связывание с пептидом, состоящим из аминокислот 39-53 зрелого миостатина, наводя на мысль о важности участка от остатков 54-57.

Таблица 1

Пептиды	Остатки	Относительное связывание	8ЕО Ю ΝΟ:
АЫУСЗСЕСЕЕУЕЬОКУРНТНиУНОА	40-64	+++	53
С5СЭЕ8 ΕΡνΕίΟΚΥΡΗ	43-57	+++	62
6ЕСЕЕУЕ1_0КУРНТН	45-59	+++	92
СЕЕУРЮКУРНТНЫ	47-61	++	93
РУРЮКУРНТНЫНО	49-63	+	94
КАМУСЗСЕСЕРУПО	39-53	-	95

* Остаток представляет собой С в миостатине.

С. ЕЫВА анализ миостатинового гуманизированного оптимизированного МаЬ.

Гуманизированные антитела полной длины против миостатина человека 510С2 и С12 тестировали в ЕЫВА анализе, в котором измеряли связывание антитела с антигеном ОЭР-8, нанесенным на планшет. Также тестировали перекрестную реактивность МаЬ с ОЭР-11. Условия отсутствия МаЬ, контроль изотипов антитела и нерелевантный белок (НОР) использовали в качестве отрицательных контролей.

Каждую лунку 96-луночных планшетов покрывают 70 мкл ΟΌΡ-8 человека (без носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6), рекомбинантного ΟΌΡ-11 человека (от Рерго!есЬ, 1ис., Са!. #120-11, без носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6) или рекомбинантного НОР человека (от Κ&Ό Вуз!етз, Са!. #294-НО/СР, без носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6). Планшеты инкубируют при 4°С в течение ночи. Лунки аспирируют и дважды промывают промывочным буфером (20 мМ Τήδ (гидроксиметил)аминометан, рН 7,4, 0,15 М №С1, 0,1% Τ\\<χίι-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на каждую лунку (5% растворимое молоко фирмы Сагиайои 1из!аи! в указанном выше промывочном буфере) в течение 4 ч при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали промывочным буфером.

МаЬ разбавляют в блокирующем буфере при концентрациях 1, 0,2, 0,04, 0,008, 0,0016 и 0,00032 мкг/мл. Используют контроль, не содержащий МаЬ, который состоит только из блокирующего буфера. Контроль изотипов антител также используют в качестве отрицательного контроля в концентрации 1 мкг/мл. Затем по 50 мкл каждого раствора МаЬ добавляют в лунки, покрытые ОЭР-8 и ОЭР-11, в двух повторениях. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером.

Затем по 50 мкл вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой (козье против 1дО НКР человека, фрагмент, специфичный к Рс-гамма, Заскзои 1ттииоКе8еагсЬ, Са!. #109-035-008), разведенный 1:2000 в блокирующем буфере, добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. Затем в каждую лунку добавляют

- 26 015589 по 50 мкл хромогенного субстрата (например, ОР1) субстрат) и оставляют для развития при комнатной температуре в течение 2,5 мин. Рекцию останавливают добавлением 100 мкл 1Ν НС1 в каждую лунку. Поглощение лунок определяют при 490 нм. Определяют среднее поглощение лунок двух повторений и эти значения представлены в табл. 2.

Эти данные демонстрируют, что МаЬ 510С2 и С12 связываются с миостатином, связанным на планшете. Что касается специфичности, то эти МаЬ преимущественно связываются с ΟΏΕ-8, а не ΟΏΕ11. МаЬ 510С2 показывает приблизительно 25-кратное увеличение связывания с миостатином (ΟΏΕ-8) по сравнению с ΟΏΕ-11. МаЬ С12 показывает приблизительно 5-кратное увеличение связывания с миостатином по сравнению с ΟΏΕ-11.

510С2

510С2

510С2

С12

Таблица 2

С12 С12

	ΟϋΕ-8	СОЕ-11	НСЕ	СОЕ-8	СОЕ-11	НСЕ
1 мкг/мл	1,62275	0,67645	0,0723	1,5785	1,3021	0,0665
0,2 мкг/мл	1,20585	0,24605	0,071	1,37095	0,87605	0,0543
0,04 мкг/мл	0,55695	0,11485	0,07525	0,8177	0,34495	0,0564
0,008 мкг/мл	0,2482	0,09125	0,07105	0,32805	0,11915	0,0507
0,0016 мкг/мл	0,11425	0,09385	0,07255	0,1257	0,07	0,058
0,00032 мкг/мл	0,0876	0,08245	0,0722	0,07415	0,05475	0,0554
без МаЬ	0,08645	0,0936	0,0721	0,0544	0,05185	0,0522
Изотипный контроль	0,09075	0,0919	0,0804	0,05185	0,0487	0,049

Кроме того, в ЕЫ8А было показано, что МаЬ С12 полной длины не связывается с другими представителями суперсемейства ΤΟΕ-β: ВМР-2, ВМР-3, ВМР-3Ь/ОЭЕ-10, ВМР-4, ВМР-7, ВМР-8В, Активином А, Активином В, ΤΟΕ-α, ΤΟΕ-β 1, ΤΟΕ-β2 и ΟΏΕ-3; оно продемонстрировало минимальное связывание с ВМР-5.

Предполагается, что другие антитела против миостатина по изобретению подобным образом не связываются или минимально связываюся с этими другими представителями суперсемейства ΤΟΕ-β.

Пример 3. Анализ нейтрализации миостатина.

Эктодермальные эксплантаты удаляют на стадиях 8-9 бластулы эмбрионов Хепориз при помощи стандартных процедур и культивируют в 0,5х МВ8 (1х МВ8: 88 мМ НаС1, 1 мМ КС1, 0,7 мМ СаС1₂, 1 мМ МдЗОд, 5 мМ НЕРЕ8, 2,5 мМ НаНСО₃, 1:1000 об./об. гентамицина, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением фактора роста (ΟΏΕ-8 или ΟΏΕ-11) плюс или указанного в течение 18 ч при 18°С, за это время контрольные эмбрионы достигли стадии ранней нейрули (стадия 15-16). Эксплантаты фотографировали, а длину каждого эксплантата измеряли с использованием алгоритма визуального анализа, разработанного для количественного анализа анимального полюса. Эксплантаты не обрабатывали ни фактором роста, ни ΕаЬ (контроли), введенного в шары эпидермиса. Миостатин и ΟΏΕ-11 стимулируют мезодерму в этих эктодермальных эксплантатах, что приводит к элонгации эксплантатов и формированию гантелеобразных структур. Антитела, или 1’аЬ, при анализе на нейтрализующую активность добав ляют в культуральную среду, содержащую миостатин на протяжении всего периода культивирования, и оценивают их способность ингибировать движения элонгации, индуцированные фактором роста. Миостатин добавляют к эксплантатам в концентрации 25 нг/мл. Тестируемые антитела, или 1'аЬ, добавляют в концентрации 20 мкг/мл. 1'аЬ, полученный на нерелевантный антиген, используют в качестве контроля. Коммерчески доступные моноклональные антитела против мышей могут быть проанализированы в качестве контроля, это антитело продуцируется у коз, иммунизированных очищенным мышиным ΟΏΕ-8, и производителем показано, что оно нейтрализует элонгацию анимальных полюсов Хепориз, вызванного 25 нг/мл мышиного ΟΏΕ-8 при наличии в концентрациях приблизительно 10-20 мкг/мл (В&Э 8уз!етз Са!. #МАВ788).

Для обработки изображений используют 1та§еРго (ν4.5.1.22, от Меб1а СуЬегпейсз). Для автоматизации обработки изображений записывали макрос. Макрос обрабатывает изображение и записывает длину в битах. Могут быть использованы альтернативные способы измерения, известные в данной области. Ожидается, что антитела по изобретению нейтрализуют активность ΟΏΕ-8 в анализе анимальных полюсов и не обладают нейтрализирующей активностью в отношении ΟΏΕ-11.

Пример 4. Измерение аффинности 1'аЬ.

Аффинность (К_о) и величины к_оп и к_о1т ΕаЬ против миостатина по настоящему изобретению измеряют с использованием прибора В1Асоге® 2000, содержащего сенсорный чип СМ4. В1Асоге® использует оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для детекции изменений концентраций белков молекул, которые взаимодействуют в декстрановой биосенсорной матрице. Кроме случаев, когда отмечено иное, все реагенты и материалы приобретены у В1Асоге® АВ (ирза1а, 8^ебеп). Все измерения проводят при 25°С. Образцы, содержащие Είώ, растворяют в буфере НВ8-ЕР (150 мМ хлорида натрия,

- 27 015589 мМ ЕЭТА, 0,05% (мас./об.) поверхностно-активного вещества Р-20 и 10 нМ НЕРЕ8, рН 7,4). Миостатин или СЭЕ-11 (В&Э 8ук1етк) иммобилизируют в проточных ячейках чипа СМ4 с использованием химии связывания аминов. Проточные ячейки (1-4) активируют 1:1 смесью 0,1 М Ν-гидроксисукцинимида и 0,1 М 3-(N,N-диметиламино)пропил-N-этилкарбодиимида со скоростью потока 20 мкл/мин. Миостатин или СЭЕ-11 (2,5 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, рН 4,5) вручную впрыскивали в отдельные проточные ячейки со скоростью потока 10 мкл/мин. Плотность поверхности контролировали, пока каждая проточная ячейка не достигла плотности поверхности ~150 единиц реакции (ВИ). Поверхности блокировали 50 мкл инъекцией 1 М этаноламин-НС1, рН 8,5 (10 мкл/мин). Для обеспечения полного удаления любого нековалентно связанного миостатина или СЭЕ-11 дважды впрыскивали 15 мкл 10 мМ глицина, рН 1,5. Для кинетических экспериментов использовали проточный буфер, содержащий 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 150 мМ №С1, 0,005% Р20.

Сбор данных о кинетическом связывании проводят при максимальной скорости потока (100 мкл/мин). Каждый аналитический цикл состоит из:

(ί) инъекции 250 мкл ЕаЬ (диапазон концентраций составлял 50-0,4 нМ при двукратных возрастающих разведениях) во все 4 проточные ячейки, а проточную ячейку 1 использовали в качестве эталонной;

(ίί) 20-минутной диссоциации (буферный поток);

(ш) регенерации поверхности СЭЕ-8 или СЭЕ-11 при помощи двух 15 мкл инъекций 10 мМ глицина, рН 1,5;

(ίν) 15 мкл холостой инъекции проточного буфера и (ν) 2-минутного периода стабилизации перед началом следующего цикла.

Мониторинг сигнала проводили в виде: проточная ячейка 2 минус проточная ячейка 1, проточная ячейка 3 минус проточная ячейка 1 и проточная ячейка 4 минус проточная ячейка 1. Образцы и буферную холостую пробу вводили путем инъекций дважды в произвольном порядке. Данные обрабатывали при помощи программного обеспечения ЗСВИВВЕВ (СеШег £ог Вюто1еси1аг Шегасйоп Апа1ук15, Ε'ιιιν о£ ШаЬ). Скорости ассоциации и диссоциации для каждого цикла определяют путем аппроксимации биосенсорных данных на модель простой ассоциации, используя С1атрХР (СеШег £ог Вюто1еси1аг кИегаскоп Апа1ук15, υΐ'ΐίν. о£ ШаЬ), для получения констант скорости к_оп и к_о££; константу равновесного связывания К_б рассчитывают с использованием уравнения К_б=к_о££/к_оп. Данные по аффинности, измеренные в отношении связывания миостатина с 510С2 ЕаЬ, представляют собой следующее: к_оп - 5,4х10⁵ М^-1-с^-1, ко££ - 4,67х10^-4 с^-1 и Кб (выч.) - 0,87 нМ. Связывания СЭЕ-11 с 510С2 ЕаЬ не наблюдалось.

Пример 5. Измерение аффинности МаЬк.

Измерения аффинности связывания для моноклональных антител полной длины по изобретению проводили с использованием анализа 8ар1бупе КШЕХА. КН8-активированные высокочувствительные сефарозные бусы (СЕ НеаЙЬсаге) предварительно покрывают антителом по изобретению (50 мкг антитела против миостатина на 1 мл бус) и блокируют с помощью 10 мг/мл В8А в 1 М Тпк-НСк рН 8,0. Затем 20 и 50 пМ антитела по изобретению инкубируют с различными концентрациями (например, 2,4 пМ-20 нМ, серийных разведений) миостатина в проточном буфере (РВ8, 0,005% (об./об.) Т\уееп-20 и 1 мг/мл яичного альбумина) в течение 10 ч при комнатной температуре. Для определения несвязанного антитела, находящегося в равновесном состоянии, каждый образец пропускали через бусы, покрытые миостатином. Количество антитела, связавшегося с бусами, затем количественно определяли путем пропускания раствора козьего антитела против Ес человека, меченного флуоресцеином (Су5) (1асккоп 1ттипо Векеагсй), разведенного 1:4000 в проточном буфере, через бусы. Измеренный флуоресцентный сигнал пропорционален концентрации несвязанного антитела при равновесии. Каждую концентрацию миостатина измеряют дважды. Равновесную константу диссоциации (К_с) получают по методу нелинейной регрессии конкурентных кривых с использованием составной кривой для модели односайтного гомогенного связывания (программное обеспечение КГЫЕХА) и данные представлены с интервалами надежности (С1) 95%.

Константу скорости ассоциации (к_оп) для связывания СЭЕ-8 также определяют с использованием анализа 8ар1бупе К1ЫЕХА. 20 пМ антитела перемешивают с 1 нМ СЭЕ-8 с использованием тех же условий, что описаны выше. В разные моменты времени образцы зондируют для выявления несвязанного антитела с использованием условий, описанных выше для равновесного связывания, а затем результирующую временную зависимость аппроксимируют с использованием программного обеспечения К1ЫЕХА для определения скорости ассоциации (к_оп). Константу скорости диссоциации (к_о££) рассчитывают с использованием выражения к_о££=Кбхк_оп. 510С2 и С12 полной длины (оперативно связанные с Ес-областью 1дС₄) измеряют с использованием описанного анализа, результаты которого приведены в табл. 3.

- 28 015589

Таблица 3

МаЬ	Кй, пМ (95% С1)	коп, М’1, с1 (95% С1)	когг, в’1, рассчитанный
510С2	80 (41-134)	1,38x10й (1,08-1,75x10®)	1,11x10'°
С12	108 (23-294)	7,42х104 (6,83-8,01x104)	8,02x1 0'ь

Пример 6. Анализ миостатин/репортер 8БЕ.

В этом репортерном анализе плазмида, кодирующая репортерный ген, т.е. ген люциферазы, ниже элемента связывания 8МАБ (8ВЕ), более конкретно (САОАД₂, экспрессирует белок люциферазы, когда молекула, такая как миостатин, ΟΌΡ-11, или другой представитель суперсемейства ΤΟΡ-β связывается с собственным рецептором, тем самым запуская сигналы 8МАБ, что приводит к образованию фосфорилированного комплекса 8МАБ, способного связываться с 8ВЕ. Ранее сообщалось, что последовательность САОА является ΤΟΡ-β реактивной последовательностью в промоторе ΤΟΡ-β индуцированного гена РАТ-1 (Беппег е! а1., ЕМВ0 Т, 17: 3091-3100, 1998). Количество активного миостатина, подверженного воздействию клеток, прямо пропорционально количеству образованного люциферазного фермента, которое прямо пропорционально количеству полученного и измеряемого света. Наличие ингибитора (например, антитела, которое связывается с миостатином) уменьшает количество миостатина, способного активировать 8ВЕ, что в конечном счете приводит к уменьшению образования света. Этот анализ также описан в международной публикации А0 2004/037861, которая включена в данное описание в качестве ссылки.

Также предполагается, что анализ миостатин/репортер 8ВЕ не должен быть ограничен точными условиями, описанными в данном изобретении, могут быть использованы и другие типы клеток, например клетки 293НЕК (АТСС) или клетки А204 рабсомиосаркомы (см., например, АЬшетоге, е! а1., ВВКС, 200: 965-71, 2003); могут быть использованы другие виды репортеров, например САТ, β-§α1, ΟΡΡ, и другие условия выращивания клеток и условия анализа, включая использование различных количеств миостатина в реакции. Специалист в данной области легко сможет различить, подпадает ли анализ под объем анализа миостатин/репортер 8ВЕ, он сможет для этого воспользоваться вектором, содержащим элемент 8ВЕ выше репортерного генома, введенного в клетку-хозяин, где использующий элемент 8ВЕ является чувствительным к 8МАБ, полученному в результате реакции связывания миостатина с рецептором миостатина. К.8. ТЫез, е! а1., Ого\\1Ь ЬасЮгз, 18: 251-259, 2001 описывает аналогичный анализ, в то время как Ашетоге, Б. е! а1., ВВКС, 300: 965-971, 2003 описывает ответ элемента 8ВЕ на 8МАБ, полученный в результате реакции связывания миостатина с его рецептором.

В этом анализе клетки 293Е (Ыце ВюзузШтз) в среде ОМ 1'АТЕ12 (3:1) (О1Ьсо 93-0152БК), 10% ΡВ8, 20 мМ НЕРЕ8, 4 мМ Б-глутамина засевают в количестве приблизительно 25000 клеток на лунку в покрытые внутри полилизином лунки 96-луночного планшета (ВБ Вюсоа! 35-4461) и инкубируют в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки промывают РВ8 и в каждую лунку добавляют по 50 мкл 0р!1МЕМ Ι (О1Ьсо 31985-070). Клетки трансфектируют 50 мкл следующей 8ВЕ-люциферазной ДНК смесью: (ί) 80 мкл липофектамина (О1Ьсо 11668-019) объединяют с 1,5 мл 0р!1МЕМ и оставляют стоять в течение 5 мин, затем добавляют в (ίί) пробирку, в которой 20 мкг 8ВЕ-люциферазной ДНК объединяют с 1,5 мл 0р!1МЕМ и 200 мкл реактива Р1из, перемешивают и оставляют на 5 мин. После добавления двух смесей вместе раствор энергично перемешивают и оставляют стоять в течение 30 мин перед добавлением по 50 мкл в каждую лунку. Затем клетки инкубируют в течение ночи при 37°С в 5% С0₂. Для каждого планшета с клетками, 5 мл миостатина (К&Б 8уз!етз 788-О8) разбавляют до концентрации 20 нг/мл в полной среде. Каждое тестируемое антитело по изобретению титровали в полной среде, т.е. приблизительно от 40 мкг/мл приблизительно до 50 нг/мл. Трансфекционную среду удаляют из лунок и добавляют в каждую лунку по 50 мкл разведенного антитела и по 50 мкл ΟβΡ-8 (миостатин) или ΟβΡ-11 (К&Б 8уз!етз). Планшет с клетками затем инкубируют в течение ночи при 37°С в 5% С0₂. На следующий день среду аспирируют, клетки промывают РВ8 и добавляют 75 мкл лизирующего буфера (Рготеда Е266А). Люциферазную активность измеряют в клеточном лизате, используя БислЬегазе Кеадеп! в соответствии с инструкцией производителя (Рготеда Е2620). Строили график зависимости люминесценции Бо§₁₀ концентрации МаЬ (мкг/мл) и рассчитывали значения ΙΕ₅₀ для каждого МаЬ для миостатина и ΟβΡ-11.

Моноклональные антитела 510С2 и С12 при тестировании в этих условиях с ΟβΡ-8 дают значения ΙΟ₅₀ (из среднего двух испытаний) 5,15 нМ (5,74 и 4,57 нМ) и 16,07 нМ (23,04 и 9,12 нМ) соответственно. Ни МаЬ 510С2, ни С12 не демонстрируют нейтрализующую активность в этом анализе при тестировании с ΟβΡ-11 вместо ΟβΡ-8.

- 29 015589

Пример 7. Фармакокинетика.

Фармакокинетику (РК) антител по изобретению можно оценить у мышей С57В6/8СШ в дозе 1 мг/кг после однократного внутривенного (IV) или интраперитонеального (1Р) введения. Животным вводят смесь немеченого и ¹²⁵1-меченого антитела в описанной выше дозе и концентрацию в сыворотке определяют, исходя из ¹²⁵1 радиоактивности в сыворотке и специфической активности введенной дозы. Строят график зависимости концентрации в сыворотке антитела, введенного IV или 1Р, от времени.

Пример 8. Действие ίη νίνο на мышечную массу и силу.

Для того чтобы определить, блокирует ли антитело по изобретению активность миостатина ίη νίνο, антитело по изобретению может быть протестировано у взрослых мышей 8С1Э. 8СГО мыши страдают от тяжелого комбинированного иммунодефицита и, следовательно, не вырабатывают иммунологический ответ после инъекции антитела по изобретению. Мышечную массу используют в качестве индикатора активности миостатина у мышей, которые получали лечение антителом по изобретению.

Самцов восьминедельных мышей 8СГО/С57В6 взвешивают и распределяют в соответствии с массой тела на группы по восемь особей. Антитело по изобретению в РВ8 буфере вводят путем 1Р инъекции мышам в различных дозах (т.е. 60, 10, 5 и 1 мг/кг) еженедельно. В качестве контроля использовали мышей, получавших РВ8 или не получавших лечения. Обработку продолжали в течение 4-12 недель. После обработки мышечную массу оценивали путем диссекции и взвешивания икроножных и четырехглавых мышц.

Для определения мышечной силы измеряли силу передних конечностей при помощи измерительного прибора силы сжатия (например, модель 1027 сбх, Со1итЬи5 1пЧгитсп15).

- 30 015589

Перечень последовательностей <110> Εΐί Ы11у апй Сотрапу <120> Антитела против миостатина <130> Х-17158 <140> и5 60/726,062 <141> 2005-10-12 <150> из 60/725,235 <151> 2005-10-11 <150> иЗ 60/724,670 <151> 2005-10-06 <160>87 <170> Патентная версия 3.3 <210> 1 <211>375 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400>1

МеЬ 1

С1п

Ьуз

Ьеи

Θΐη 5

Ьеи

Суз

Уа1

Туг

Не 10

Туг

Ьеи

РЬе

Мек

Ьеи 15

Не

Уа1

А1а

С1у

Рго 20

Уа1

Азр

Ьеи

Азп

С1и 25

Азп

Зег

<31и

61п

Ьуз 30

<31и

Азп

Уа1

С1и

Ьуз 35

<31и

С1у

Ьеи

Суз

Азп 40

А1а

Суз

ТЬг

Тгр

Агд 45

СПп

Азп

ТЬг

Ьуз

Зег 50

Зег

Агд

Не

С1и

А1а 55

Не

Ьуз

11е

<31п

Не 60

Ьеи

Зег

Ьуз

Ьеи

Агд 65

Ьеи

С1и

ТЬг

А1а

Рго 70

Азп

Не

Зег

Ьуз

Азр 75

Уа1

Не

Агд

(31п

Ьеи 80

Ьеи

Рго

Ьуз

А1а

Рго 85

Рго

Ьеи

Агд

С1и

Ьеи 90

Не

Азр

σΐη

Туг

Азр 95

Уа1

Θΐη

Агд

Азр

Азр 100

Зег

Зег

Азр

б1у

Зег 105

Ьеи

С1и

Азр

Азр

Азр но

Туг

Н13

А1а

ТЬг

ТЬг 115

С1и

ТЬг

Не

Не

ТЬг 120

Мек

Рго

ТЬг

С1и

Зег 125

Азр

РЬе

Ьеи

МеЪ

С1п 130

Уа1

Азр

(31у

Ьуз

Рго 135

Ьуз

Суз

Суз

РЬе

РЬе 14 0

Ьуз

РЬе

Зег

Зег

- 31 015589

Ьуз 145

Не

ΘΙη Туг

Азп

Ьуз 150

Уа1

Уа1

Ьуз А1а С1п 155

Ьеи

Тгр

11е

Туг

Ьеи 160

Агд

Рго

Уа1

С1и

ТЬг

Рго

ТЬг

ТЬг

Уа1

РЬе

Уа1

ΘΙη

11е

Ьеи

Агд

Ьеи

165

170

175

Не

Ьуз

Рго

Мер

Ьуз

Азр

<31у

ТЬг

Агд

Туг

ТЬг

С1у

Не

Агд

Зег

Ьеи

180

185

190

Ьуз

Ьеи

Азр

МеЕ

Азп

Рго

<31у

ТЬг

б1у

Не

Тгр

ΘΙη

Зег

Не

Азр

Уа1

195

200

205

Ьуз

ТЬг

Уа1

Ьеи

ΘΙη

Азп

Тгр

Ьеи

Ьуз

<31п

Рго

С1и

Зег

Азп

Ьеи

О1у

210

215

220

Не

С1и

Не

Ьуз

А1а

Ьеи

Азр

<31и

Азп

<31у

Н13

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Тпг

225

230

235

240

РЬе

Рго

С1у

Рго

61у

С1и

Азр

О1у

Ьеи

Азп

Рго

РЬе

Ьеи

61и

Уа1

Ьуз

245

250

255

Уа1

ТЬг

Азр

ТЬг

Рго

Ьуз

Агд

Зег

Агд

Агд

Азр

РЬе

С1у

Ьеи

Азр

Суз

260

265

270

Азр

С1и

Н13

Зег

ТЬг

О1и

Зег

Агд

Суз

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

275

280

285

Азр

РЬе

61и

А1а

РЬе

61у

Тгр

Азр

Тгр

Не

11е

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

290

295

300

Ьуз

А1а

Азп

Туг

Суз

Зег

С1у

С1и

Суз

С1и

РЬе

Уа1

РЬе

Ьеи

ΘΙη

Ьуз

305

310

315

320

Туг

Рго

ΗΪ8

ТЬг

ΗΪ8

Ьеи

Уа1

Н13

ΘΙη

А1а

Азп

Рго

Агд

С1у

Зег

А1а

325

330

335

<31у

Рго

Суз

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

МеЕ

Зег

Рго

11е

Азп

МеЕ

Ьеи

Туг

340

345

350

РЬе

Азп

О1у

Ьуз

С1и

ΘΙη

11е

Не

Туг

С1у

Ьуз

Не

Рго

А1а

МеЕ

Уа1

355

360

365

Уа1 Азр Агд Суз 61у Суз Зег

370 375 <210> 2 <211> 109

- 32 015589

<212> <213>	БЕЛОК Ното зарЬепз
<400>	2

Азр Рке СЬу Ьеи Азр Суз Азр СЬи

1				5
Агд	Туг	Рго	Ьеи 20	Ткг	УаЬ	Азр	Рке
1Ье	АЬа	Рго 35	Ьуз	Агд	Туг	Ьуз	АЬа 4 0
Рке	УаЬ 50	Рке	Ьеи	СЬп	Ьуз	Туг 55	Рго
Азп 65	Рго	Агд	СЬу	Зег	АЬа 70	СЬу	Рго
Рго	1Ье	Азп	Меб	Ьеи 85	Туг	Рке	Азп
Ьуз	ТЬе	Рго	АЬа 100	Меб	УаЬ	УаЬ	Азр
<210> 3 <211> 109 <212> БЕЛОК <213> 0νί3 зр.
<4оо> :	3
Азр 1	Рке	СЬу	Ьеи	Азр 5	Суз	Азр	СЬи
Агд	Туг	Рго	Ьеи 20	Ткг	УаЬ	Азр	Рке
11е	АЬа	Рго 35	Ьуз	Агд	Туг	Ьуз	АЬа 40
Рке	Ьеи	Рке	Ьеи	СЬп	Ьуз	Туг	Рго
	50					55
Азп 65	Рго	Ьуз	СЬу	Зег	АЬа 70	СЬу	Рго
Рго	ТЬе	Азп	Меб	Ьеи 85	Туг	Рке	Азп

НЬз Зег Ткг СЬи 5ег Агд Суз Суз

15

СЬи АЬа Рке СЬу Тгр Азр Тгр Не

30

Азп Туг Суз Зег С1у <31и Суз <31и

НЬз Ткг НЬз Ьеи УаЬ НЬз <31п АЬа

Суз Суз Ткг Рго Ткг Ьуз МеЬ Зег

80

СЬу Ьуз СЬи СЬп 11е 11е Туг СЬу

95

Агд Суз СЬу Суз Зег

105

НЬз Зег ТЬг СЬи Зег Агд Суз Суз

15

СЬи АЬа РЬе СЬу Тгр Азр Тгр 1Ье

30

Азп Туг Суз Зег СЬу СЬи Суз СЬи 45

НЬз Ткг НЬз Ьеи УаЬ НЬз СЬп АЬа

Суз Суз Ткг Рго Ткг Ьуз Меб Зег

80

СЬу Ьуз СЬи СЬп 1Ье 1Ье Туг СЬу

95

- 33 015589

Ьуз

11е

Рго

С1у Мей 100

Уа1

Уа1

Азр

Агд 105

Суз

С1у

Суз

Зег

<210>

4

<211>

109

<212>

БЕЛОК

<21з> :

Ното

зартепз

<400>

4

Азп

Ьеи

С1у

Ьеи

Азр

Суз

Азр

<31и

Н13

Зег

Зег

С1и

Зег

Агд

Суз

Суз

1

5

10

15

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

РЬе

С1и

А1а

РЬе

С1у

Тгр

Азр

Тгр

11е

20

25

30

Не

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

Ьуз

А1а

Азп

Туг

Суз

Зег

С1у

ΘΙη

Суз

С1и

35

40

45

Туг

МеС

РЬе

МеЬ

ΘΙη

Ьуз

Туг

Рго

Н13

ТЬг

Н13

Ьеи

Уа1

ΘΙη

ΘΙη

А1а

50

55

60

Азп

Рго

Агд

С1у

Зег

А1а

С1у

Рго

Суз

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

МеЬ

Зег

65

70

75

80

Рго

11е

Азп

Мей

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

Азр

Ьуз

ΘΙη

ΘΙη

11е

11е

Туг

61у

85

90

95

Ьуз

11е

Рго

<31у

Мер

Уа1

Уа1

Азр

Агд

Суз

С1у

Суз

Зег

100 105 <210> 5 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция

<400> 5

Азр 1

11е

ΘΙη

МеЬ

ТЬг 5

ΘΙη

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг 20

11е

ТЬг

Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

Зег

11е

Зег 30

Туг

МеЬ

Н13

Тгр

Туг 35

ΘΙη

ΘΙη

Ьуз

Рго

С1у 40

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи 45

Ьеи

11е

Туг

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

55 60

- 34 015589

С1у Зег С1у ТЬг 65

Азр

РЬе 70

ТЬг Ьеи ТЬг 11е

Зег 75

Зег

Ьеи

ΘΙη

Рго

61и 80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

Агд

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

<31у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100 105 <210> 6 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400>6

Азр 1

11е ΘΙη

МеЬ

ТЬг 5

ΘΙη

Зег Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

МеЕ

20

25

30

ΗΪ8

Тгр

Туг

ΘΙη

ΘΙη

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Уа1

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

ΘΙη

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

Агд

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 7 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400>7

Азр Не С1п МеС ТЬг ΘΙη Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 О1у

1015

- 35 015589

Азр

Агд Уа!

ТЬг 20

Не

ТЬг Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

Зег

Не

Зег 30

Туг

МеЕ

Н13

Тгр

Туг

ΘΙη

σΐη

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

ΘΙη

Рго

О1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

С1у

С1у

(31у

ТЬг

Ьуз

Уа!

С1и

Не

Ьуз

100 105 <210> 8 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный

<220>

<223> синтетическая

[ конструкция

<400> 1

3

Азр

Не

ΘΙη

МеЬ

ТЬг

ΘΙη

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

01у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

Зег

20

25

30

Н13

Тгр

Туг

ΘΙη

ΘΙη

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

ΘΙη

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа!

61и

Не

Ьуз

100

105

<210>

9

- 36 015589 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400>9

Азр 1

11е

ΘΙη МеЕ

Ткг ΘΙη 5

Зег

Рго

Зег

Зег Ьеи 10

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

Ткг

11е

Ткг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

11е

Зег

Туг

А1а

20

25

30

Нхз

Тгр

Туг

ΘΙη

ΘΙη

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

61у

О1у

Азр

Ткг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

Уа1

Рго

Зег

Агд

Рке

50

55

60

С1у

Зег

О1у

Ткг

Азр

Рке

Ткг

Ьеи

Ткг

11е

Зег

Зег

Ьеи

ΘΙη

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

Рке

А1а

Ткг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

Ткг

85

90

95

Рке

С1у

61у

С1у

Ткг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

100

105

<210>	10
<211>	106
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный

<220>

<223> синтетическая конструкция <400>10

Азр Не 01η МеЕ ТЬг ΘΙη Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у

1015

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е Ткг Суз

Зег А1а Зег Зег Зег 11е

Зег Туг МеЕ

Н±з Тгр Туг ΘΙη ΘΙη Ьуз Рго 61у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг 35 4045

Азр Ткг Зег Ьуз Ьеи А1а Агд С1у Уа1 Рго Зег Агд Рке Зег С1у Зег 50 5560

О1у Зег О1у Ткг Азр Рке Ткг Ьеи Ткг 11е Зег Зег Ьеи 01п Рго С1и

- 37 015589

65	70	75	80
Азр РЬе А1а	ТЬг Туг Туг Суз	ΘΙη ΘΙη Тгр Туг Ьеи Азп	Рго Ьеи ТЬг
	85	90	95
РЬе 61у 61у	61у ТЬг Ьуз Уа1	С1и 11е Ьуз
	100	105

<210> 11 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400>11

Азр 1

11е

ΘΙη

МеЕ

ТЬг 5

ΘΙη

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

МеЕ

20

25

30

Н13

Тгр

Туг

ΘΙη

ΘΙη

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

ΘΙη

Рго

О1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

С1и

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 12 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400>12

Азр Не ΟΙη МеЕ ТЬг 01η Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у

1015

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Т1е Зег Туг МеЕ

- 38 015589

20

25

30

ΗΪ5

Тгр

Туг

Θΐη

СЯп

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТНг

Азр

РЬе

ТНг

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РНе

А1а

ТНг

Туг

Туг

Суз

СЯп

СЯп

Тгр

Туг

РЬе

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

85

90

95

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТНг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100 105 <210> 13 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция

<400> :

13

СЯп

Уа1

ТНг

Ьеи

Агд

С1и

Зег

СЯу

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТНг

61п

1

5

10

15

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

ТНг

Суз

ТИг

РНе

Зег

СЯу

РНе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

СЯу

Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

Θΐη

Рго

Рго

СЯу

Ьуз

А1а

Ьеи

СЯи

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Н13

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

СЯп

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

ТНг

МеЕ

ТНг

Азп

МеЕ

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТНг

А1а

ТНг

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТНг

ТНг

Уа1

Не

СЯу

СЯу

СЯу

ТНг

МеЬ

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

СЯу

С1п

СЯу

ТНг

ТНг

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

- 39 015589 <210> 14 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция

<400> 14

<31η Уа1

ТНг

Ьеи

Агд

С1и

Зег

С1у

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТНг

СЯп

1

5

10

15

ТИг Ьеи

ТНг

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

РНе

Зег

С1у

РНе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

С1у Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Рго

(31у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр Ьеи

А1а

Н13

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

СЯп

Уа1

65

70

75

80

Уа1 Ьеи

ТНг

МеЕ

ТНг

Азп

МеЕ

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТНг

А1а

ТНг

Туг

Туг

85

90

95

Суз А1а

Агд

Агд

А1а

11е

ТНг

ТНг

Уа1

11е

СЯу

С1у

О1у

ТИг

РНе

Азр

100

105

110

Туг Тгр

С1у

С1п

С1у

ТИг

ТНг

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210>

15

<211>

123

<212>

БЕЛОК

<213>

искусственный

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

15

С1п Уа1

ТНг

Ьеи

Агд

С1и

Зег

<31у

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТНг

С1п

1

5

10

15

ТИг Ьеи

ТНг

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

РНе

Зег

С1у

РНе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

С1у Агд

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Т1е

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

40 45

- 40 015589

Тгр	Ьеи 50	А1а	ΗΪ3	Не	Туг	Тгр 55	Азр
Ьеи	Агд	Азп	Агд	Ьеи	ТЬг	11е	Зег
65					70
Уа1	Ьеи	ТЬг	МеЬ	ТЬг	Азп	МеЬ	Азр
				О Е

Азр	Азр	Ьуз	Агд Туг 60	Азп	Рго Зег
Ьуз	Азр	ТЬг	Зег	Ьуз	Азп	С1п	Уа1
		75					80
Рго	Уа1	Азр	ТЬг	А1а	ТЬг	Туг	Туг
	О А					О Е

105

110

100

Зег

Зег <210> 16 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 16

(31п 1

Уа1

ТЬг Ьеи

Агд 5

<31и Зег

С1у Рго А1а 10

Ьеи Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг 15

С1п

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Тгр

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

С1у

Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Н13

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Азп

МеЪ

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

11е

ТЬг

ТЬг

Уа1

11е

С1у

С1у

©1у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

С1у

С1п

<31у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 17

- 41 015589

<211> <212> <213>

124 БЕЛОК искусственный

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	17

О1п Уа1 1

ТЬг Ьеи

Агд 5

С1и

Зег

О1у

Рго

А1а 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг 15

С1п

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

61у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

С1у

Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ8

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьеи

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

ТЬг

МеР

ТЬг

Азп

Мер

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТЬг

ТЬг

Уа1

Не

С1у

С1у

61у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

<31у

С1п

<31у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 18 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> (

синтетическая

: конструкция

<400> :

18

С1п 1

Уа1

ТЬг

Ьеи

Агд 5

61и

Зег

О1у

Рго

А1а 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг 15

(31п

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи 20

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег 25

С1у

РЬе

Зег

МеЪ

Агд 30

Ьуз

Уа1

(31у

Зег

Зег 35

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд 40

Θΐη

Рго

Рго

61у

Ьуз 45

А1а

Ьеи

<31и

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ8

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

- 42 015589

50	55
Ьей 65	Агд	Азп	Агд	Ьей	ТЬг 70	Не	Зег
Уа1	Ьей	ТЬг	Мер	ТЬг 85	Азп	Мер	Азр
Суз	А1а	Агд	Агд 100	А1а	Не	ТЬг	ТЬг
Туг	Тгр	С1у 115	σΐη	С1у	ТЬг	ТЬг	Уа1 120

			60
Ьуз	Азр	ТЬг	Зег	Ьуз	Азп	С1п	Уа1
		75					80
Рго	Уа1	Азр	ТЬг	А1а	ТЬг	Туг	Туг
	90					95
Уа1	11е	С1у	61у	С1у	ТЬг	РЬе	Азр
105					110
ТЬг	Уа1	Зег	Зег

<210> 19 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 19

С1п 1

Уа1

ТЬг Ьей

Агд 5

(31и Зег

<31у Рго А1а 10

Ьей Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг 15

С1п

ТЬг

Ьей

ТЬг

Ьей

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьей

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

С1у

Зег

Зег

Т1е

Зег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Ьей

<31и

35

40

45

Тгр

Ьей

А1а

Нхз

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

С л

55

60

Ьей

Агд

Азп

Агд

Ьей

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьей

ТЬг

Мей

ТЬг

Азп

МеЬ

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТЫ

ТЬг

Уа1

Не

С1у

<31у

С1у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 20 <211> 124 <212> БЕЛОК

- 43 015589 <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция

<400> 20

С1п Уа1

ТЬг

Ьеи

Агд

С1и

Зег

С1у

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг

ΘΙη

1

5

10

15

ТЬг Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

е1у Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

ΘΙη

Рго

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр Ьеи

А1а

ΗΪ3

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ΘΙη

Уа1

65

70

75

80

Уа1 Ьеи

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Азп

МеЬ

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

85

90

95

Суз А1а

Агд

Агд

Ьуз

11е

ТЬг

ТЬг

Уа1

Не

(31у

<31у

<31у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

110

Туг Тгр

01у

ΘΙη

01у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210>

21

<211>

124

<212>

БЕЛОК

<213>

искусственный

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

21

ΘΙη Ьеи

ΘΙη

Ьеи

ΘΙη

61и

Зег

С1у

Рго

01у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

С1и

1

5

10

15

ТЬг Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

Агд

Уа1

20

25

30

С1у Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

ΘΙη

Рго

Рго

О1у

Ьуз

СЯу

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр Не

(31у

Нхз

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

55 60

- 44 015589

Ьеи 65

Агд

Азп

Агд

УаЬ

ТЬг 70

1Ье

Зег

УаЬ

Азр

ТИг 75

Зег

Ьуз

Азп

СЬп

РНе 80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег 85

Зег

УаЬ

ТИг

АЬа

АЬа 90

Азр

ТНг

АЬа

УаЬ

Туг 95

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд 100

АЬа

1Ье

ТНг

ТИг

УаЬ 105

1Ье

СЬу

СЬу

СЬу

ТНг 110

РНе

Азр

Туг

Тгр

СЬу

ΘΙη

СЬу

ТНг

Ьеи

УаЬ

ТИг

УаЬ

Зег

Зег

115 120 <210> 22 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный

<220>

<223> синтетическая

: конструкция

<400> 22

СЬп

Ьеи

СЬп

Ьеи

СЬп

СЬи

Зег

СЬу

Рго

СЬу

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Рго

Зег

СЬи

1

5

10

15

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

УаЬ

Зег

СЬу

РНе

Зег

Ьеи

Агд

МеЕ

УаЬ

20

25

30

СЬу

Зег

Зег

УаЬ

Зег

Тгр

1Ье

Агд

СЬп

Рго

Рго

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

СЬи

35

40

45

Тгр

1Ье

СЬу

НЬз

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Ьеи

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

УаЬ

ТНг

ТЬе

Зег

УаЬ

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

СЬп

РНе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

УаЬ

ТНг

АЬа

АЬа

Азр

ТНг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

85

90

95

Суз

АЬа

Агд

Агд

АЬа

1Ье

ТНг

ТНг

УаЬ

1Ье

СЬу

СЬу

СЬу

ТНг

РНе

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТНг

Ьеи

УаЬ

ТНг

УаЬ

Зег

Зег

115 120

<210> <211> <212> <213>

23 124 БЕЛОК искусственный

- 45 015589 <220>

<223> синтетическая конструкция

<400> 23

<31п Ьеи

Θ1Π

Ьеи

С1п

<31и

Зег

61у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

С1и

1

5

10

15

ТЬг Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

(31у Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

(31п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр Не

С1у

Н13

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьеи

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи Агд

Азп

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

65

70

75

80

Зег Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз А1а

Агд

Агд

А1а

11е

ТЬг

ТЬг

Уа1

11е

С1у

С1у

О1у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

но

Туг Тгр

С1у

<31п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210>

24

<211>

124

<212>

БЕЛОК

<213>

искусственный

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

24

С1п Ьеи

(31п

Ьеи

С1п

С1и

Зег

С1у

Рго

(31у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

<31и

1

5

10

15

ТЬг Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С31у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

<31у Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

(31и

35

40

45

Тгр 11е

С1у

Н1з

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

55 60

- 46 015589

Ьеи 65

Агд

Азп

Агд

Уа1

ТИг 70

Не

Зег

Уа1

Азр

ТНг 75

Зег

Ьуз

Азп

СЯп

РНе 80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег 85

Зег

Уа1

ТНг

А1а

А1а 90

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг 95

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд 100

А1а

11е

ТНг

ТНг

Уа1 105

Не

СЯу

СЯу

СЯу

ТНг но

РНе

Азр

Мей

Тгр

С1у

С1п

61у

ТНг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 25 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственный

<220>

<223> синтетическая

[ конструкция

<400> 25

<31п

Ьеи

С1п

Ьеи

СЯп

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

С1и

1

5

10

15

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

Уа1

Зег

С1у

РНе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

СЯу

Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

61п

Рго

Рго

СЯу

Ьуз

С1у

Ьеи

СЯи

35

40

45

Тгр

11е

С1у

ΗΪ3

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Уа1

ТНг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РНе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТИг

А1а

А1а

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТНг

ТНг

Уа1

Не

СЯу

61у

СЯу

ТНг

РНе

Азр

100

105

но

Ьеи

Тгр

С1у

С1п

СЯу

ТНг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115 120

<210>	26
<211>	124
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>

- 47 015589 <223> синтетическая конструкция <400> 26

(31п 1	Ьеи	σΐη	Ьеи	С1п 5	С1и	Зег	С1у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
61у	Зег	Зег 35	Уа1	Зег	Тгр	Не	Агд 40
Тгр	Не 50	С1у	Н13	Не	Туг	Тгр 55	Азр
Ьеи 65	Агд	Азп	Агд	Уа1	ТЬг 70	11е	Зег
Зег	Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег 85	Зег	Уа1	ТЬг
Суз	А1а	Агд	Агд 100	А1а	Не	ТЬг	ТЬг
Ьеи	Тгр	С1у 115	О1п	С1у	ТЬг	Ьеи	Уа1 120
<210> <211> <212> <213>	27 10 БЕЛОК Миз зр.
<400>	27
Зег 1	А1а	Зег	Зег	Зег 5	11е	Зег	Туг

МеЕ ΗΪ3

Рго	<31у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	С1и
Зег 25	С1у	РЬе	Зег	Ьеи	Агд 30	Ьуз	Уа1
σΐη	Рго	Рго	С1у	Ьуз 45	С1у	Ьеи	О1и
Азр	Азр	Ьуз	Агд 60	Ьеи	Азп	Рго	Зег
Уа1	Азр	ТЬг 75	Зег	Ьуз	Азп	Θ1Π	РЬе 80
А1а	А1а 90	Азр	ТЬг	А1а	Уа1	Туг 95	Туг
Уа1 105	Не	б1у	61у	О1у	ТЬг 110	РЬе	Азр
ТЬг	Уа1	Зег	Зег

<210> 28 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 28

Зег А1а Зег Зег Зег Не Зег Туг Зег ΗΪ3 15 10 <210> 29 <211> 123 <212> БЕЛОК

- 48 015589 <213> Миз зр.

<400> 29

Θΐη 1	Уа1	ТЬг	Ьеи	Ьуз 5	Зег	61у	Рго
Ьеи	ТЬг	Ьеи	ТЬг 20	Суз	Зег	РЬе	Зег
Мек	11е	Уа1 35	Зег	Тгр	11е	Агд	<31п 40
Ьеи	А1а 50	ΗΪ3	11е	Туг	Тгр	Азр 55	Азр
Агд 65	Зег	Агд	Ьеи	ТЬг	11е 70	Зег	Ьуз
Ьеи	Ьуз	11е	ТЬг	Зег 85	Уа1	Азр	ТЬг
А1а	Агд	Агд	С1у 100	11е	ТЬг	ТЬг	Уа1
Тгр	©1у	(31п 115	С1у	ТЬг	Зег	Уа1	ТЬг 120
<210> <211> <212> <213>	30 7 БЕЛОК Миз зр.
<400>	30
Азр 1	ТЬг	Зег	Ьуз	Ьеи 5	А1а	Агд
<210> <211> <212> <213>	31 9 БЕЛОК Миз зр.
<400>	31
61п 1	С1п	. Тгр	Туг	Агд 5	Азп	Рго	Ьеи

Уа1 Зег Зег

ТЬг

С1у	11е 10	Ьеи	С1п	Зег	Зег	С1п 15	ТЬг
О1у 25	РЬе	Зег	Ьеи	ТЬг	ТЬг 30	Зег	(31у
Зег	Зег	<31у	Ьуз	С1у 45	Ьеи	61и	Тгр
Азр	Ьуз	Агд	Туг 60	Азп	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Агд	Азп	С1п	Уа1	РЬе 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	ТЬг	Туг	Туг 95	Суз
Ьеи 105	С1у	<31у	С1у	ТЬг	МеЬ 110	Азр	Туг

<210>	32
<211>	9
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>

- 49 015589

<223>	синтетическая конструкция
<400>	32

ΘΙη ΘΙη Тгр Туг Зег Азп Рго Ьеи Ткг

1	5
<210> <211> <212> <213>	33 9 БЕЛОК искусственный

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	33

ΘΙη ΘΙη Тгр Туг Ьеи Азп Рго Ьеи Ткг

1	5
<210> <211> <212> <213>	34 9 БЕЛОК искусственный

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	34

ΘΙη ΘΙη Тгр Туг 01и Азп Рго Ьеи Ткг

1	5
<210> <211> <212> <213>	35 9 БЕЛОК искусственный

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	35

ΘΙη ΘΙη Тгр Туг Рке Азп Рго Ьеи Ткг

1	5
<210> <211> <212> <213>	36 12 БЕЛОК Миз зр.
<400>	36

Рке Зег Ьеи Агд Ьуз Уа1 61у Зег Зег Уа1 Зег

1	5 Ю
<210> <211> <212>	37 12 БЕЛОК

- 50 015589 <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 37

<31у РЬе	: Зег Ьеи Агд Ьуз Х7а1 <31у Агд	Зег	Уа1	Зег
1	5	10
<210>	38
<211>	12
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	38
<31у РЬе	ι Зег Тгр Агд Ьуз Уа1 <Э1у Зег	Зег	Уа1	Зег
1	5	10
<210>	39
<211>	12
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	39
<31у РЬе Зег МеЕ Агд Ьуз Уа1 С1у Зег	Зег	Уа1	Зег
1	5	10
<210>	40
<211>	12
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	40
<31у РЬе Зег Ьеи Агд Ьуз Уа1 (31у Зег	Зег	11е	Зег
1	5	10
<210>	41
<211>	12
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	41
61у РЬе Зег Ьеи Агд Агд Уа1 С1у Зег	Зег	Уа1	Зег

- 51 015589 <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК искусственный <220>

<223>

синтетическая конструкция <400>

<31у РЬе Зег Ьеи

Агд Мер Уа1 С1у Зег

Зег

Уа1

Зег <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Миз зр.

<400>

Нхз 11е Туг Тгр

Азр Азр Азр Ьуз Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Агд

Азп <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК искусственный <220>

<223>

синтетическая конструкция <400>

Нтз 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Ьеи Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Агд

Азп <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК искусственный <220>

<223>

синтетическая конструкция <400>

Ηί3 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд

Ьеи

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Агд

Азп <210> 46 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция

- 52 015589 <400> 46

Н1з 11е	Туг Тгр Азр Азр Азр Ьеи Агд	Туг	Азп	Рго	Зег	Ьеи Агд Азп
1	5	10				15
<210>	47
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	47
Агд А1а	. 11е ТЬг ТЬг Уа1 Не О1у (Э1у	С1у	ТЬг	МеЕ	Азр	Туг
1	5	10
<210>	48
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз зр.
<400>	48
Агд А1а Не ТЬг ТЬг Уа1 11е (31у (31у	(31у	ТЬг	РЬе	Азр	Туг
1	5	10
<210>	49
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	49
Агд Ьуз Не ТЬг ТЬг Уа1 Не 61у <31у	(31у	ТЬг	РЬе	Азр	Туг
1	5	10
<210>	50
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	50
Агд А1а Не ТЬг ТЬг Уа1 Не С1у О1у	С1у	ТЬг	РЬе	Азр	МеЕ
1	5	10

<210> 51 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> искусственный

- 53 015589 <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 51

Агд А1а 11е ТЬг ТЬг Уа1

5

11е С1у <31у С1у ТЬг РЬе Азр Ьеи

<210>	52
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зартепз
<400>	52
Азр ТЬг Зег	Ъуз Ьеи А1а Уа1

5

<210> <211> <212> <213>	53 25 БЕЛОК Ното зархепз
<400>	53

А1а Азп Туг Суз

Зег С1у <31и Суз

С1и РЬе Уа1

РЬе Ьеи С1п Ьуз Туг

<210> 54 <211> 124 <212> БЕЛОК <400> 54

ΘΙη 1

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз 5

О1и

Зег

С1у

Рго

(31у 10

11е

Ьеи

ΘΙη

Зег

Зег 15

ΘΙη

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи 20

ТЬг

Суз

Зег

Уа1

Зег 25

<31у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег 30

ТЬг

Зег

С1у

МеЬ

Зег 35

Уа1

Зег

Тгр

Х1е

Агд 40

ΘΙη

Рго

Зег

61у

Ьуз 45

С1у

Ьеи

61и

Тгр

Ьеи 50

А1а

ΗΪ3

11е

Туг

Тгр 55

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд 60

Туг

Азп

Рго

Зег

Ьеи 65

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг 70

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг 75

Зег

Агд

Азп

ΘΙη

Уа1 80

РЬе

Ьеи

Ьуз

11е

ТЬг

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

90 95

- 54 015589

Суз А1а Агд Агд А1а 11е ТЬг Ткг Уа1 Ьеи С1у <31у С1у Ткг МеЕ Азр

100 105110

Туг Тгр С1у ΘΙη С1у Ткг Зег Уа1 Ткг Уа1 Зег Зег

115120 <210>55 <211>124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <400>55

ΘΙη Ьеи ΘΙη Ьеи С1п

01и

Зег

61у Рго

С1у Ьеи 10

Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

61и

1

5

Ткг

Ьеи

Зег

Ьеи

Ткг

Суз

Ткг

Уа1

Зег

С1у

Рке

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

<31у

Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

ΘΙη

Рго

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Не

61у

Н13

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Уа1

Ткг

11е

Зег

Уа1

Азр

Ткг

Зег

Ьуз

Азп

ΘΙη

Рке

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Ткг

А1а

А1а

Азр

Ткг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

Ткг

Ткг

Уа1

Не

С1у

С1у

С1у

Ткг

Рке

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

С1у

ΘΙη

О1у

Ткг

Ьеи

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210>56 <211>124 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223>	синтетическая	конструкция
<400>	56
ΘΙη Ьеи	ΘΙη	Ьеи ΘΙη	О1и Зег Θίγ Рго	С1у Ьеи Уа1 Ьуз	Рго Зег С1и
1		5		10	15

- 55 015589

ТЬг Ьеи Зег

Ьеи ТЬг Суз 20

ТЬг

Уа1

Зег <31у РЬе Зег Ьеи Агд Ьуз Уа1

25

30

С1у

Зег

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

(31у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Не

О1у

ΗΪ3

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Ьеи

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТЬг

ТЬг

Уа1

Не

(31у

61у

С1у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

но

Туг

Тгр

С1у

О1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 57 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <220>

<221> X <222> (9)..(9) <223> X представляет собой 3 или А <400> 57

Зег А1а Зег Зег Зег Не Зег Туг Хаа ΗΪ3 15 10

<210>	58
<211>	9
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственный
<220>
<223>	синтетическая конструкция

<220>
<221>	X
<222>	(5) . . (5)
<223>	X представляет собой 3, К

- 56 015589 <400>58

61η 01η Тгр Туг Хаа Азп Рго Ьеи ТЬг <210>59 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <220>

<221> X <222> (4)..(4) <223> X представляет собой Ь, N или М <220>

<221> X <222> (6) . . (6) <223> X представляет собой К, К или М <220>

<221> X <222> (9)..(9) <223> X представляет собой 3 или К <400> 59 (31у РНе Зег Хаа Агд Хаа Уа1 <31у Хаа Зег Уа1 Зег

10 <210> 60 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> искусственный <220>

<223> синтетическая конструкция <220>

<221> X <222> (8) . . (8) <223> X представляет собой К или Ь <220>

<221> X <222> (10)..(10) <223> X представляет собой Υ или Ь <40 0 >6 0

Ηί3 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Хаа Агд Хаа Азп Рго Зег Ьеи Агд Азп

1015 <210> 61 <211>14 <212> БЕЛОК

- 57 015589 <213> искусственным <220>

<223> синтетическая конструкция <220>

<221> X <222> (2) . . (2) <223> X представляет собой А или К <220>

<221> X <222> (12) . . (12) <223> X представляет собой М или Г <220>

<221> X <222> (14)..(14) <223> X представляет собой М или Ь <400> 61

Агд Хаа Не ТИг ТНг Уа1 Не С1у

1	5
<210>	62
<211>	15
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зартепз
<400>	62

(31у С31у ТНг Хаа Азр Хаа

Суз Зег С1у С1и Суз С1и РНе Уа1

1		5
<210>	63
<211>	124
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз зр.
<400>	63

РНе Ьеи 61п Ьуз Туг Рго ΗΪ3

15

С1п Уа1 ТНг Ьеи Ьуз С1и Зег С1у

1				5
ТНг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТНг	Суз	Зег	Ьеи
С1у	Меб	Зег 35	Уа1	Зег	Тгр	Не	Агд 40
Тгр	Ьеи 50	А1а	Ηίβ	Не	Туг	Тгр 55	Азр
Ьеи 65	Агд	Азп	Агд	Ьеи	ТНг 70	11е	Зег

Рго <31у Не Ьеи С1п Рго Зег <Э1п

15

Зег С1у РНе Зег Ьеи Агд ТНг Зег

30 <Э1п Зег Зег С1у Ьуз С1у Ьеи С1и

Азр Азр С1и Агд Туг Азп Рго Зег

Ьуз Азр ТНг Ьеи Агд Азп С1п Уа1

80

- 58 015589

РНе Ьеи	Ьуз	ЬЬе	ТНг 85	Зег	УаЬ	СЬу
Суз АЬа	Агд	Агд 100	АЬа	ЬЬе	ТНг	ТНг
Туг Тгр	СЬу 115	СЬп	СЬу	ТНг	Зег	УаЬ 120
<210> <211> <212> : <213> ]	64 124 БЕЛОК Миз зр.
<400>	64
СЬп УаЬ 1	ТНг	Ьеи	Ьуз 5	СЬи	Зег	СЬу
ТНг Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТНг	Суз	Зег	Ьеи
СЬу Меб	Зег 35	УаЬ	Зег	Тгр	ЬЬе	Агд 40
Тгр Ьеи 50	АЬа	НЬз	ЬЬе	Туг	Тгр 55	Азр
Ьеи Агд 65	Азп	Агд	Ьеи	ТНг 70	ЬЬе	Зег
РНе Ьеи	Ьуз	ЬЬе	ТНг 85	Зег	УаЬ	СЬу
Суз АЬа	Агд	Агд 100	АЬа	ЬЬе	ТНг	ТНг
Туг Тгр	СЬу 115	СЬп	СЬу	ТНг	Зег	УаЬ 120
<210> <211> <212> <213>	65 23 БЕЛОК Ното зарЬепз
<400>	65
Азр ЬЬе 1	СЬп	Мек	ТНг 5	СЬп	Зег	Рго

ТИг АЬа Азр ТНг АЬа ТНг Туг Туг

95

УаЬ ЬЬе СЬу СЬу СЬу ТНг Меб Азр

105 110

ТИг УаЬ Зег Зег

Рго СЬу Меб Ьеи СЬп Зег Зег СЬп

15

Зег СЬу РНе Зег Ьеи Агд ТНг Зег

30

СЬп Зег Зег СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи

Азр Азр Ьуз Агд Туг Азп Рго Зег

Ьуз Азр ТНг Ьеи Агд Азп СЬп УаЬ

80

ТНг АЬа Азр ТНг АЬа ТНг Туг Туг

95

УаЬ ЬЬе СЬу СЬу СЬу ТНг Меб Азр

105 ИО

ТНг УаЬ Зег Зег

Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу

15

- 59 015589

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз
	20
<210>	66
<211>	15
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зартепз
<400>	66
Тгр Туг	ΘΙη ΘΙη Ьуз Рго О1у Ьуз
1	5
<210>	67
<211>	32
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зархепз
<400>	67
С1у Уа1	Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
1	5
Ьеи ТЬг	Не Зег Зег Ьеи ΘΙη Рго
	20
<210>	68
<211>	10
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зархепз
<400>	68
РЬе С1у С1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и
1	5
<210>	69
<211>	24
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното заръепз
<400>	69
<31п Уа1 ТЬг Ьеи Агд <31и Зег <31у
1	5

А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг

15

Зег О1у Зег (31у ТЬг Азр РЬе ТЬг

15

С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз

30

11е Ьуз

Рго А1а Ьеи Уа1 Ьуз ТЬг О1п ТЬг

15

Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг Суз ТЬг РЬе Зег

	20
<210>	70
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното заръепз
<400>	70

Тгр 11е Агд <31п Рго Рго <31у Ьуз

А1а Ьеи С1и Тгр Ьеи А1а

1	5
<210>	71
<211>	32
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зараепз

<400> 71

Агд Ьеи ТЬг 11е Зег Ьуз Азр ТЬг

1	5
Мер ТЬг	• Азп МеЬ Азр Рго Уа1 Азр
	20
<210>	72
<211>	11
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зараепз
<400>	72
Тгр О1у ΘΙη С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг
1	5
<210>	73
<211>	25
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зараепз
<400>	73
ΘΙη Ьеи ΘΙη Ьеи ΘΙη С1и Зег С1у
1	5
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1
	20
<210>	74
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зараепз
<400>	74
Тгр 11е Агд ΘΙη Рго Рго С1у Ьуз
1	5
<210>	75
<211>	32
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зараепз
<400>	75
Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Уа1 Азр ТЬг
1	5

Зег Ьуз Азп ΘΙη Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг

15

ТЬг А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а Агд

30

Уа1 Зег Зег

Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1и

15

Зег <31у Ьеи <31и Тгр 11е <31у

Зег Ьуз Азп ΘΙη РЬе Зег Ьеи Ьуз

15

- 61 015589

Ьей Зег Зег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр

	20
<210>	76
<211>	11
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зархепз

<400> 76

Тгр С1у <31п 61у ТЬг Ьей Уа1 ТЬг

1		5
<210>	77
<211>	109
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз зр.

<400> 77

ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Агд

25	30
Уа1 Зег Зег 10

С1п 1	11е	Уа1	Ьей	ТЬг 5	С1п	Зег	Рго
С1и	Ьуз	Уа1	ТЬг 20	Мер	ТЬг	Суз	Зег
ΗΪ8	Тгр	Туг 35	61п	Θΐη	Ьуз	Рго	61у 40
Азр	ТЬг 50	Зег	Ьуз	Ьей	А1а	Зег 55	С1у
С1у 65	Зег	С1у	ТЬг	Зег	Туг 70	Зег	Ьей
Азр	А1а	А1а	ТЬг	Туг 85	Туг	Суз	С1п
РЬе	<31у	А1а	<31у 100	ТЬг	Ьуз	Ьей	С1и
<210> <211> <212> <213>	78 109 БЕЛОК Миз зр.
<400>	78
<31п 1	Уа1	Уа1	Ьей	ТЬг 5	<31п	Зег	Рго
С1и	Ьуз	Уа1	ТЬг	Ме£	ТЬг	Суз	Зег

Ьей Ьуз Агд А1а Азр

105

А1а 11е Мее Зег А1а Зег Рго С1у

	10					15
А1а 25	Зег	Зег	Зег	11е	Зег 30	Туг	Мее
ТЬг	Зег	Рго	Ьуз	Агд 45	Тгр	11е	Туг
Уа1	Рго	А1а	Агд 60	РЬе	Зег	С1у	Зег
ТЬг	11е	Зег 75	Зег	Мее	С1и	А1а	61и 80
С1п	Тгр 90	Туг	Зег	Азп	Рго	Ьей 95	ТЬг

А1а	11е 10	Мее	Зег	А1а	Зег Ьей (31у 15
А1а	Зег	Зег	Зег	Уа1	Нхз	Туг	Мее

- 62 015589

20

25

30

Нхз

Тгр

Туг

С1п

<31п

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

61у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Мек

С1и

А1а

С1и

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Тгр

Зег

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

<31у

А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100 105 <210>79 <211>109 <212> БЕЛОК <213> Миз зр <400>79

С1п 1

11е Уа1

Ьеи

ТЬг С1п 5

Зег

Рго А1а

11е 10

Мек

Зег А1а

Зег

Рго <31у 15

С1и

Ьуз

Уа1

ТЬг

Мек

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Уа1

Зег

Туг

МеЬ

20

25

30

Н13

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Зег

61у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

<31у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Мек

С1и

А1а

<31и

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

(31п

С1п

Тгр

Зег

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

<31у

А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100 105 <210> 80 <211>109 <212> БЕЛОК <213> Миз зр

- 63 015589 <400> 80

С1п 1

Не

Уа1

Ьеи

ТНг 5

С1п

Зег

Рго

А1а

Не Меб 10

Зег

А1а

Зег

Рго 15

<31у

С1и

Ьуз

Уа1

ТНг

Меб

ТНг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Уа1

Зег

Туг

Меб

20

25

30

Н13

Тгр

Туг

С1п

О1п

Ьуз

Зег

С1у

ТНг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

<31у

Уа1

Рго

Уа1

Агд

РНе

Зег

61у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТНг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Зег

Меб

С1и

А1а

С1и

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

ТНг

Туг

Туг

Суз

С1п

<31п

Тгр

Зег

Агд

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

85

90

95

<210> 81 <211> 109 <212> БЕЛОК <213> Миз зр.

<400> 81

С1п

Уа1

Уа1

Ьеи

ТНг

СЯп

Зег

Рго

А1а

Не

Меб

Зег

А1а

Зег

Рго

СЯу

1

5

10

15

С1и

Ьуз

Уа1

ТНг

Меб

ТНг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

11е

Зег

Туг

Меб

20

25

30

Н13

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

СЯу

ТНг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

СЯу

Уа1

Рго

А1а

Агд

РНе

Зег

СЯу

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТНг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Зег

Меб

СЯи

А1а

СЯи

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

ТНг

Туг

Туг

Суз

СЯп

С1п

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

85

90

95

РНе

(31у

А1а

(31у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100 105

- 64 015589

<210>

82

<211>

109

<212>

БЕЛОК

<213>

Миз !

эр.

<400>

82

61η 11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

Θΐη

Зег

Рго

А1а

11е

Мек

Зег

А1а

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

1Τ-.Ί

ГЛ!*, ηζ-

тК-ν-

ГЧ-г ΓΖ-,

Οο-ν-

7\ Ί ->

—

Ο«ν

Т1 —

О ζ-,-ν-

гл. .V

ΑΛλ-Ι-

Стхи. ЪуЗ

V СЯ.Х

ХХХХ

хис и

х ххх

О

ьЭС^Х

лхса.

к^^Х

л-

исх

лу X

χ’χς; и.

20

25

30

Ηΐ3 Тгр

Туг

Θΐη

<31п

Ьуз

Рго

01у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

11е

Туг

35

40

45

Азр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

(31у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

(31у Зег

<31у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Мек

С1и

А1а

<31и

65

70

75

80

Азр А1а

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Θΐη

С1п

Тгр

Азп

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе С1у

А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100

105

<210>

83

<211>

109

<212>

БЕЛОК

<213>

Миз

зр.

<400>

83

С1п Уа1

Уа1

Ьеи

ТЬг

<31п

Зег

Рго

А1а

11е

Мер

Зег

А1а

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и	Ьуз	Уа1	ТЬг 20	МеЕ	ТЬг	Суз	Зег
Н13	Тгр	Туг 35	<31п	01п	Агд	Зег	С1у 40
Азр	ТЬг 50	Зег	Ьуз	Ьеи	А1а	Зег 55	С1у
61у 65	Зег	(31у	ТЬг	Зег	Туг 70	Зег	Ьеи

А1а 25	Зег	Зег	Зег	Уа1	Туг 30	Туг	Мек
А1а	Зег	Рго	Ьуз	Агд 45	Тгр	11е	Туг
Уа1	Рго	А1а	Агд 60	РЬе	Зег	С1у	Зег
ТЬг	11е	Зег 75	Зег	Мек	С1и	А1а	С1и 80

- 65 015589

Азр

А1а

А1а ТЬг Туг 85

Туг Суз

ΘΙη ΘΙη Тгр 90

ТЬг Туг Азп

Рго

Ьеи ТЬг 95

РЬе

С1у А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100

105

<210> ι

84

<211>

109

<212> ί

БЕЛОК

<213> Миз зр.

<400> ι

84

С1п

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

ΘΙη

Зег

Рго

А1а

Не

МеЕ

Зег

А1а

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и

Ьуз

Уа1

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Уа1

Зег

Туг

МеЕ

20

25

30

Нхз

Тгр

Туг

ΘΙη

ΘΙη

Ьуз

Рго

С1у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

МеЕ

61и

А1а

С1и

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

ΘΙη

ΘΙη

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

С1у

А1а

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100

105

<210>

85

<211>

109

<212>

БЕЛОК

<213>

Миз зр.

<400>

85

ΘΙη

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

ΘΙη

Зег

Рго

А1а

11е

МеЕ

Зег

А1а

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

61и

С1и

Уа1

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

11е

Азп

Туг

МеЕ

20

25

30

ΗΪ3

Тгр

Туг

С1п

ΘΙη

Ьуз

Зег

61у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

55 60

С1у 65	Зег	С1у	ТНг	Зег	Туг 70	Зег	Ьеи
Азр	А1а	А1а	ТНг	Туг 85	Туг	Суз	О1п
РНе	<31у	<31у	О1у 100	ТНг	Ьуз	Ьеи	<31и
<210> 86 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> Миз зр.
<400> 86
σΐη 1	Уа1	ТНг	Ьеи	Ьуз 5	<31и	Зег	СЯу
ТНг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТНг	Суз	Зег	Ьеи
С1у	МеЬ	Зег 35	Уа1	Зег	Тгр	11е	Агд 40
Тгр	Ьеи 50	А1а	Ηίβ	11е	Туг	Тгр 55	Азр
Ьеи 65	Агд	Азп	Агд	Ьеи	ТНг 70	11е	Зег
РНе	Ьеи	Ьуз	11е	ТНг 85	Зег	Уа1	61у
Суз	А1а	Агд	Агд 100	А1а	11е	ТНг	ТНг
Туг	Тгр	С1у 115	61п	СЯу	ТНг	Зег	Уа1 120

Ьеи Ьуз Агд А1а Азр

105

ΤΪ1Γ	11е	Зег 75	Зег	МеЕ	С1и	А1а	СЯи 80
СЯп	Тгр	Азп	Зег	Азп	Рго	Ьеи	ТНг
	90					95

Рго	СЯу 10	11е	Ьеи	СЯп	Зег	Зег 15	СЯп
Зег 25	СЯу	РНе	Зег	Ьеи	Агд 30	ТНг	Зег
СЯп	Зег	Зег	01у	Ьуз 45	СЯу	Ьеи	СЯи
Азр	Азр	Ьуз	Агд 60	Туг	Азп	Рго	Зег
Ьуз	Азр	ТНг 75	Ьеи	Агд	Азп	(Яп	Уа1 80
ТНг	А1а 90	Азр	ТНг	А1а	ТНг	Туг 95	Туг
Уа1 105	11е	СЯу	СЯу	СЯу	ТНг 110	МеЬ	Азр
ТНг	Уа1	Зег	Зег

- 67 015589 <210> 87 <211> 123 <212> БЕЛОК <213> Миз зр <400> 87

ΘΙη 1 Ьеи

Уа1 ТЬг

ТЬг Ьеи

Ьеи Ьуз 5 ТЬг Суз 20

Зег Зег

О1у Ьеи

Рго С1у

Не 10 РЬе

Ьеи Зег

ΘΙη Зег

Зег ΘΙη

ТЬг С1у

Зег

С1у 25

Ьеи

ТЬг

ТЬг 30

15 Зег

МеЕ

Не

Уа1

5ег

Тгр

Не

Агд

ΘΙη

Зег

Зег

С1у

Агд

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

35

40

45

Ьеи

А1а

Н13

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Агд

Азп

ΘΙη

Уа1

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

Тгр

Не

Зег

Зег

Уа1

61у

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТЬг

ТЬг

Уа1

Не

С1у

<31у

С1у

ТЬг

МеЕ

Азр

Туг

100

105

НО

Тгр

О1у

ΘΙη

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

Claims (8)

1) пептид СЭВЫ с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 27;

1) пептид СЭВН1 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 36;

1) пептид СЭВЫ с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 27;

1) пептид СЭВН1 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 37;

1) пептид СЭВЫ с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 27, 28 или 29;

1) пептид СЭВН1 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 59;

1. Моноклональное антитело против миостатина, включающее НСУВ и ЬСУВ, где

НСУВ содержит:

2) пептид СЭВЕ2 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 30:

2) пептид СЭВН2 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 45;

2) пептид СЭВЕ2 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 30;

2) пептид СЭВН2 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 43;

2. Моноклональное антитело против миостатина, включающее НСУВ и ЬСУВ, где

НСУВ содержит:

2) пептид СЭВЕ2 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 30;

2) пептид СЭВН2 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 60;

3) пептид СЭВЕ3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 33.

3) пептид СЭВН3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 51;

ЬСУВ содержит:

3. Моноклональное антитело против миостатина, включающее НСУВ и ЬСУВ, где

НСУВ содержит:

3) пептид СЭВЕ3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 31.

3) пептид СЭВН3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 48;

ЬСУВ содержит:

3) пептид СЭВЕ3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 58.

3) пептид СЭВН3 с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 61;

ЬСУВ содержит:

4. Моноклональное антитело по любому из пп.1-3, дополнительно содержащее каркасный участок антитела человека.

5. Моноклональное антитело по любому из пп.1-4, где моноклональное антитело является полноразмерным моноклональным антителом, по существу, интактным антителом, ЕаЬ-фрагментом, Е(аЬ')₂фрагментом или одноцепочечным Εν-фрагментом.

6. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Применение эффективного количества антитела по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для повышения мышечной массы или повышения плотности костной массы у индивидуума.

8. Применение эффективного количества антитела по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики одного или нескольких состояний, выбранных из слабости, кахексии, мышечного истощения, слабости мышц, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза, ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких), почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности, диабета второго типа или метаболического синдрома.