SK5672003A3

SK5672003A3 - Humanized anti-LT-beta-R antibodies

Info

Publication number: SK5672003A3
Application number: SK567-2003A
Authority: SK
Inventors: Ellen Garber; Paul Lyne; Jose W Saldanha
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2003-10-07
Also published as: EA200300464A1; IS6779A; EA006945B1; CN1547590A; BR0114646A; CZ20031307A3; TR200300478T2; TR200602095T2; MXPA03003144A; NO20031642D0; HUP0302573A2; PL366307A1; BG107802A; AU1174702A; AR035352A1; IL155340A0; CA2425809A1; EE200300179A; NO20031642L; YU28503A

Description

i

Humanizované protilátky k ľymfotoxínovému beta receptoru

Súvisiace prihlášky

Táto prihláška je čiastočným pokračovaním U.S.S.N. 60/299,987, podanej

21.6.2001, ktorá je čiastočným pokračovaním U.S.S.N. 60/275,289, podanej

13.3.2001, ktorá je čiastočným pokračovaním U.S.S.N. 60/240,285, podanej 13.10,2000, Celý obsah vyššie uvedených patentových prihlášok je tu uvedený ako odkaz.

Oblasť vynálezu

Predkladaný vynález sa všeobecne týka humanizovaných protilátok špecifických pre lymfotoxínový beta receptor (LT^-R).

Doterajší stav techniky

Lymfotoxínový beta receptor (ďalej označovaný ako LT-p-R) je členom rodiny faktoru nekrózy nádorov, ktorý má dobre známu úlohu ako vo vývoji imunitného systému, tak pri funkčnom udržiavaní mnohých buniek imunitného systému, vrátane folikulárnych dendritických buniek a rôznych typov stromálnych buniek (Matsumoto et al., Immnunol. Rev. 156:137 (1997). Medzi známe l .

ligandy pre LT-p-R patrí ΕΤα1/β2 a druhý ligand označovaný ako LIGHT (Mauri et al. Immunity 8:21 (1998)). Bolo preukázané, že aktivácia LT-P-R indukuje apoptózu v niektorých nádorových bunkových líniách in vivo (PCT/US96/01386). Liečba činidlami agonisticky aktivujúcimi LT-P-R, ako sú špecifické humanizované anti-LT-13-R protilátky, môže byť použiteľná na liečbu alebo redukciu progresu, závažnosti alebo príznakov nádorových ochorení u jedincov (napr. ľudí).

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje humanizované protilátky proti lymfotoxínovému beta receptoru (LT-P-R) a spôsoby použitia týchto protilátok na liečbu alebo redukciu progresu, závažnosti alebo príznakov nádorových ochorení u jet '' ' dincov (napr. ľudí).

Presnejšie vynález poskytuje humanizovanú protilátku, ktorá sa špecificky viaže na LT-P-R (napr. ľudský LT-P-R). Táto protilátka obsahuje komplementárnu určujúce regióny ľahkého reťazca definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 34, 50 až 56 a 89 až 97 SEQ ID NO: 1, a/alebo komplementaritu určujúce regióny ťažkého reťazca definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 66 a 99 až 109 SEQ ID NO: 2 a okrem toho aspoň jeden (napr. 1, 2, 3, 4 alebo 5) z nasledujúcich zvyškov v ľahkom reťazci: K3, W41, 146, Q69 a Y71; alebo aspoň jeden (napr. 1, 2, 3, 4, alebo 5) z nasledujúcich zvyškov v ťažkom reťazci: F37, T40, A49, M89 a V93 (Kabatovo číslovanie).

Humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu môže obsahovať sekvenciu variabilnej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 107 SEQ ID NO:8 a/alebo sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 120 SEQ ED NO: 16. Humanizovaná protilátka môže tiež obsahovať rovnaké polypeptidové sekvencie ťažkého a/alebo ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou E46.4 (ATCC prírastkové č. PTA-3357) alebo bunkovou líniou E77.4 (ATCC prírastkové č. 3765).

V inom uskutočnení si humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu v podstate zachováva väzbové vlastnosti pôvodnej protilátky. V jednom uskutočnení sa humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu viaže na LT-P-R s funkčnou afinitou - napríklad - približne 1 pM až približne 10 pM, alternatívne približne 10 pM až približne 20 pM, alternatívne približne 20 pM až približne 30 pM, alternatívne približne 30 pM až približne 40 pM, alternatívne približne 40 pM až približne 50 pM, alternatívne približne 50 pM až približne 60 pM, alternatívne približne 60 pM až približne 70 pM, alternatívne približne 70 pM až približne 80 pM, a alternatívne približne 80 pM až približne 90 pM, kde funkčná afinita sa meria FACS podľa príkladu 8.

V inom uskutočnení je humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu naviazaná na imunotoxín (napr. A reťazec ricínu a Pseudomonas toxín}. Humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež naviazaná na chemoterapeutický liek (napr. Adriamycin, 5FU, Vinblastin, Actinomycin D, Etoposid, Cisplatin, Methotrexate a Doxorubicin) alebo na rádioizotop. Predkladaný vynález tiež zahrnuje kombinovanú terapiu, v ktorej je napríklad humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu, ktorá je naviazaná na imunotoxín, použitá v kombinácii s humanizovanou protilátkou podľa predkladaného vynálezu, ktorá je naviazaná na chemoterapeutické činidlo. Predkladaný vynález ďalej zahrnuje prostriedky vhodné na podanie cicavcovi (napríklad človeku) s nádorom, ktorý nadmerne exprimuje LTpR, kde uvedené prostriedky obsahujú (a) humanizovanú anti-LTpR protilátku buď samotnú, alebo naviazanú na chemoterapeutický liek a (b) cytotoxický faktor, kde obe tieto činidlá sú prítomné v množstve účinnom na redukciu objemu nádoru po podaní cicavcovi. Cytotoxickými faktormi môže byť napríklad TNF-a, TNF-β, IL-1, INF-γ a IL-2. Alternatívne môže byť cytotoxickým faktorom chemoterapeutický liek. Chemoterapeutickým liekom môže byť, napríklad, Adriamycin, 5FU, Vinblastin, Actinomycin D, Etoposid, Cisplatin, Methotrexate a Doxorubicin.

Protilátka podľa predkladaného vynálezu môže byť napríklad celá protilátka (t.j. s dvoma kompletnými ľahkými reťazcami a dvoma kompletnými ťažkými reťazcami) akéhokoľvek izotypu a subtypu (napr. IgM, IgD, IgGŕl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl a lgA2); alternatívne sa môže jednať o antigén-väzbový fragment (napr. Fab, F(ab’)2 a Fv) celej protilátky. Vynález tiež zahrnuje prostriedky obsahujúce farmaceutický prijateľný nosič; izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre SEQ ID NO:8; izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre SEQ ID NO: 16; izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ľahký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou E46.4 (ATCC patentové prírastkové č. PTA-3357) alebo bunkovou líniou E77.4 (ATCC patentové prírastkové č. 3765); izolovanú nuk4 leovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou E46.4 (ATCC patentové prírastkové č.PTA3357) alebo bunkovou líniou B77.4 (ATCC patentové prírastkové č. 3765); izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 - 107 SEQ ID NO:8; a izolovanú nukleovú kyselinu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 - 120 SEQ ID NO:16.

Predkladaný vynález tiež zahrnuje bunky z bunkových línií, ktoré produkujú humanizovanú anti-LTpR protilátku, vrátane, napríklad, bunkovej línie E46.4 (ATCC patentové prírastkové č. PTA-3357) a bunkovej línie E77.4 (ATCC patentové prírastkové č. 3765). V jednom uskutočnení bunková línia produkuje približne 250 mg/1 až približne 300 mg/1 uvedenej protilátky, alternatívne bunková línia produkuje približne 300 mg/1 až približne 350 mg/L uvedenej protilátky, alternatívne bunková línia produkuje približne 350 mg/1 až približne 400 mg/1 uvedenej protilátky, alternatívne bunková línia produkuje približne 400 mg/1 až približne 450 mg/1 uvedenej protilátky, alternatívne bunková línia produkuje približne 450 mg/1 až približne 500 mg/l uvedenej protilátky, alternatívne bunková línia produkuje približne 500 mg/1 až približne 550 mg/1 uvedenej protilátky a alternatívne bunková línia produkuje približne 550 mg/1 až približne 600 mg/1 uvedenej protilátky. Koncentrácia protilátky produkovanej v bunkových líniách sa meria ako titer získaný z 10-dennej kultivácie.

Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob liečby alebo redukcie progresu, závažnosti alebo príznakov nádorového ochorenia u jedinca (napr. človeka), pri ktorom je jedincovi podané účinné množstvo protilátky podľa predkladaného vynálezu. Účinné množstvo prostriedku môže byť podané v jednej dávke alebo vo viacerých dávkach. V inom uskutočnení predkladaný vynález poskytuje spôsob liečby alebo redukcie progresu, závažnosti alebo príznakov nádorového ochorenia u jedinca (napr. človeka), pri ktorom je jedincovi podané účinné množstvo protilátky podľa predkladaného vynálezu a cytotoxický faktor. Cytotoxickým faktorom môže byť, napríklad, TNF-a, TNF-β, IL-1, INF-γ, IL-2. Alternatívne môže byť cytotoxickým faktorom chemoterapeutický liek. Chemoterapeutickým liekom môže byť, napríklad, Adriamycin, 5FU, Vinblastin, Actinomycin D, Etoposid, Cisplatin, Methotrexate a Doxorubicin.

Prehľad obrázkov na pripojených výkresoch

Obr. 1 ukazuje graf cytotoxicity na WiDr bunkách. mCBEll (myšia) (kosoštvorčeky), huCBEll#2 (humanizovaná anti-LT-P-R protilátka obsahujúca verziu 2 ľahkého reťazca (VL#2) a verziu 2 ťažkého reťazca (VH#2)) (kolieska), huCBEll#4 (humanizovaná anti-LT-f3-R protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca (VL#3) a verziu 4 ťažkého reťazca (VH#4)) (hviezdičky).

Obr. 2 ukazuje graf IL-8 agonizmu na A375 bunkách. mCBEll (kosoštvorčeky), huCBEll#2 (humanizovaná anti-LT-P-R protilátka obsahujúca verziu 2 ľahkého reťazca (VL#2) a verziu 2 ťažkého reťazca (VH#2)) (koiieska), huCBEll#4 (humanizovaná anti-LT-p-R protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca (VL#3) a verziu 4 ťažkého reťazca (VH#4)) (hviezdičky).

Obr. 3 ukazuje graf znázorňujúci objem nádoru v závislosti na dňoch podávania. mCBEll (trojuholníčky), huCBEll#4 (humanizovaná anti-LT-B-R protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca (VL#3) a verziu 4 ťažkého reťazca (VH#4)) (kolieska), žiadna liečba (štvorčeky).

Obr. 4 ukazuje graf percentuálneho prežívania zvierat v závislosti na dňoch po injekcii nádoru. mCBEll (trojuholníčky), huCBEll#4 (humanizovaná anti-LT-P-R protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca a verziu 4 ťažkého reťazca) (kolieska), žiadna liečba (štvorčeky).

Obr. 5 ukazuje graf objemu nádoru v závislosti na dňoch po injekcii. HuCBEll#4 (humanizovaná anti-LT-p-R protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca (VL#3) a verziu 4 ťažkého reťazca (VH#4)) (kolieska) a kontrola bez liečby (štvorčeky).

Obr. 6 ukazuje graf objemu nádorov (vopred narastených) v závislosti na dňoch po liečbe. Kontrola (štvorčeky); huCBEll#4 (humanizovaná anti-LT-p-R protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca (VL#3) a verziu 4 ťažkého reťazca (VH#4)) v rôznych dávkach: 500 pg (kolieska), 100 pg (trojuholníčky) a pg (kosoštvorčeky); mCBEll (krížiky).

Obr. 7 ukazuje graf percentuálneho prežívania zvierat s predkultivovanými nádormi v závislosti na dňoch po liečbe. Kontrola (štvorčeky); huCBEl 1 #4 (humanizovaná anti-LT-p-R. protilátka obsahujúca verziu 3 ľahkého reťazca (VL#3) a verziu 4 ťažkého reťazca (VH#4)) v rôznych dávkach: 500 pg (kolieska), 100 pg (trojuholníčky) a 20 pg (kosoštvorčeky); mCBEll (krížiky).

Obr. 8 ukazuje graf priemernej intenzity fluorescencie verzus koncentrácie huCBEl 1#4 v logaritmickej mierke.

Podrobný opis vynálezu

Identifikácia sekvencii

Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie opisované v predkladanom vynáleze majú nasledujúce identifikačné čísla:

SEQ ID NO:1 - Aminokyselinová sekvencia mCBEll variabilného regiónu ťažkého reťazca.

SEQ ID NO:2 - Aminokyselinová sekvencia mCBEll variabilnej domény ľahkého reťazca.

SEQ ID NO:3 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaná CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 1-VL#1).

SEQ ED NO:4 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 1-VL# 1).

SEQ ID NO:5 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 2-VL#2).

SEQ ID NO:6 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 2-VL#2).

SEQ ID NO:7 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 3-VL#3).

SEQ ID N0:8 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 3-VL#3).

SEQ ID NO:9 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ťažkého reťazca (verzia 1-VH#1).

SEQ ED NO:10 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 1-VH#1).

SEQ ID NO: 11 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ťažkého reťazca (verzia 2-VH#2).

SEQ ID NO:12 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 2-VH#2).

SEQ ID NO: 13 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ťažkého reťazca (verzia 3-VH#3).

SEQ ID NO:14 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 3-VH#3).

SEQ ID NO:15 - Sekvencia nukleovej kyseliny humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ťažkého reťazca (verzia 4-VH#4).

SEQ ID NO: 16 - Aminokyselinová sekvencia humanizovaného CBE11 variabilného regiónu ľahkého reťazca (verzia 4-VH#4).

SEQ ED NO:17 - FR1 primer na vloženie Bsu36I miesta.

SEQ ID NO: 18 - FR2 primer na vloženie Ncil a Hpall miest.

SEQ ID NO:19 - FR3 primer na vloženie Bsu36I a PstI miest.

SEQ ID NO:20 - FR2 primer na vloženie Smal miesta.

SEQ ID NO:21 - FR3 primer na vloženie Pvul miesta.

SEQ ID NO:22 - FR2 primer na vloženie Smal a Hhal miest.

SEQ ID NO:23 - FR3 primer na vloženie Pvul a FspI miest.

SEQ ID NO:24 - FR1 primer na vloženie Hinfl a Nsil miest.

SEQ ID NO:25 - FR2 primer na vloženie HaelI a Hhal miest.

SEQ ID NO:26 - FR3 primer na vloženie Bsu361, Ddel a PstI miest.

SEQ ID NO:27 - FR1 primer na vloženie EcoRV miesta.

SEQ ID NO:28 - FR3 primer na vloženie Rsal miesta.

SEQ ID NO:29 - FR1 primer na vloženie EcoRV miesta.

SEQ ID NO:30 - FR2 primer na vloženie HindlII miesta.

SEQ ID NO:31 - FR3 primer na vloženie Rsal miesta.

SEQ ID NO:32 - Úplný huCBEll ľahký reťazec (verzia 3) vrátane konštantnej domény.

SEQ ID NO:33 - Úplný huCBEll ťažký reťazec (verzia 4) vrátane konštantnej domény.

Definície

Termín humanizovaná protilátka, ako je tu použitý, označuje protilátku odvodenú od nie ľudskej protilátky, obvykle myšej, ktorá si zachováva alebo významne zachováva väzbové vlastnosti pre antigén pôvodnej protilátky, ale ktorá je menej imunogénna u človeka.

Termín komplementaritu určujúci región (CDR), ako je tu použitý, označuje aminokyselinové sekvencie, ktoré dohromady definujú väzbovú afinitu a špecificitu prirodzeného Fv regiónu väzbového miesta imunoglobulínu, ako je označené Kabatom et al.,(1991).

Termín pracovný región (FR), ako je tu použitý, označuje aminokyselinové sekvencie vmedzerené medzi CDR. Tieto časti protilátky slúžia na udržovanie CDR v správnej orientácii (a umožňujú väzbu CDR na antigén).

Termín konštantný región (CR), ako je tu použitý, označuje časť protilátkovej molekuly, ktorá má efektorové funkcie. V predkladanom vynáleze sú myšie konštantné regióny nahradené ľudskými konštantnými regiónmi. Konštantné regióny chimérických alebo humanizovaných protilátok podľa predkladaného vynálezu sú odvodené od ľudských imunoglobulínov. Konštantný región ťažkého reťazca môže byť vybraný z akéhokoľvek z piatych izotypov: alfa, delta, epsilon, gamrna alebo mu. Ďalej, ťažké reťazce rôznych podtried (ako sú ťažké reťazce IgG podtried) sú zodpovedné za rôzne efektorové funkcie a tak môžu byť podľa výberu požadovaného konštantného regiónu ťažkého reťazca vyrobené protilátky s požadovanou efektorovou funkciou. Výhodnými konštantnými regiónmi sú gamrna 1 (IgGl), gamrna 3 (IgG3) a gamrna 4 (IgG4). Ešte výhodnejší je Fc región gamrna I (IgGl) izotypu. Konštantný región ľahkého reťazca môže byť kappa alebo lambda, výhodne je kappa.

Termín chimérická protilátka, ako je tu použitý, označuje protilátku obsahujúcu sekvencie získané z dvoch rôznych protilátok, ktoré sú obvykle rôzneho druhu. Najčastejšie obsahujú chimérické protilátky fragmenty ľudskej a myšej protilátky, obvykle ľudský konštantný a myší variabilný región.

Termín imunogenicita, ako je tu použitý, označuje meranie schopnosti proteínu alebo terapeutickej skupiny vyvolávať imunitnú reakciu (humorálnu alebo bunkovú) po aplikácii jedincovi. Predkladaný vynález sa týka imunogenicity humanizovaných protilátok podľa predkladaného vynálezu.

Humanizovaná protilátka so zníženou imunogenicitou je humanizovaná protilátka vykazujúca nižšiu imunogenicitu v porovnaní s pôvodnou protilátkou, napr. myšou protilátkou.

Humanizovaná protilátka v podstate si zachovávajúca väzbové vlastnosti pôvodnej protilátky označuje humanizovanú protilátku, ktorá si zachováva schopnosť špecifickej väzby na antigén rozpoznávaný pôvodnou protilátkou použitou na produkciu takej humanizovanej protilátky. Výhodne má humanizovaná protilátka rovnakú alebo v podstate rovnakú afinitu a aviditu väzby na antigén ako pôvodná protilátka. Ideálne nie je afinita protilátky menšia než 10 % afinity pôvodnej protilátky, lepšie nie je menšia než približne 30 %, a najlepšie nie je nižšia než 50 % afinity pôvodnej protilátky. Spôsoby testovania väzbovej afinity pre antigén sú dobre známe v odbore a patrí medzi ne test polovice maximálnej väzby, kompetičné testy a Scatchardova analýza. Vhodné testy väzby na antigén sú opísané v predkladanom vynáleze.

Predkladaný vynález sa týka humanizovaných monoklonálnych protilátok, ktoré sa viažu na ľudský LT-p-R, a ich použitia ako terapeutických činidiel. Predkladaný vynález sa ďalej týka sekvencií nukleovej kyseliny, ktoré kódujú humanizované protilátky, a ich expresie v rekombinantných hostiteľských bunkách. Presnejšie sa predkladaný vynález týka humanizovaných protilátok odvodených od myšej CBE11, ktoré sa špecificky viažu na ľudský LT-P-R.

Myšia CBE11 (mCBEll) je myšia IgGl kappa protilátka izolovaná od myší imunizovaných ľudským LT-P-R-Ig fúznym proteínom (Browning et al., J. Immunol. 154: 33 (1995)). mCBEll funkčne aktivuje LT-p-R ako in vitro, tak in vivo (PCT/US96/01386) a bola opísaná jej izolácia a protinádorové vlastnosti (Browning et al., J. Exp. Med. 183:867 (1996). Hybridná bunková línia, ktorá produkuje mCBEll, bola uložená v American Type Culture Collection (ATCC) v súlade Budapeštianskou zmluvou a bolo jej priradené ATCC prírastkové č. HB 11793. (PCT/US96/01386). Predkladatelia vynálezu tiež preukázali, že zosietenie LT-P receptoru rôznymi agonistami anti-LT-P-R protilátky aktivuje LT-β receptor (t.j. napodobuje účinky prirodzeného ligandu) (PCT/US96/ 01386), Aktivácia receptoru potom inhibuje rast nádorov in vivo v mnohých nádorových modeloch s expresiou LT-β receptoru. Bola preukázaná expresia LT-β receptoru na rôznych nádorových bunkách, vrátane napríklad nádorových bunkách malobunkového karcinómu pľúc (NSCLC), kolorektáineho karcinómu (CRC), karcinómu prsníku a karcinómov prostaty, žalúdku, kože, pažeráka a močového mechúra. Príklady nádorov, ktoré agonistické LT-P-R protilátky inhibujú, sú nasledujúce solídne nádory: HT29 adenokarcinóm čreva, HT3 karcinóm čipku maternice, A375 melanóm, MDA-231 karcinóm prsníku a primárne nádory hrubého čreva. Tak majú agonistické LT-P-R protilátky vlastnosti, ktoré umožňujú ich použitie na liečbu rôznych ochorení, u ktorých je žiaduca LT-p-R aktivácia a/alebo modulácia interakcií LT-P-R/LT-P-R ligandov, vrátane liečby alebo redukcie progresu, závažnosti alebo príznakov nádorových ochorení u jedinca (napr. človeka).

Humanizovanie mCBEll monoklonálnych protilátok, vrátane modelovania a spätných mutácií nutných na zachovanie väzbových vlastností mCBEll monoklonálnej protilátky, je tu opísané ďalej.

Modelovanie myších variabilných regiónov

CDR obsahujú zvyšky s najväčšou pravdepodobnosťou väzby na antigén a preto musia byť zachované v novo pripravenej protilátke. CDR sú definované sekvenciou podľa Kabata et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5. vydanie, United States Department of Health a Human Services, United States Government Printing Office, 1991. CDR spadajú do kanonických tried (Chothia et al, 1989 Náture, 342, 877-883), kde kľúčové zvyšky určujú v značnej miere štrukturálnu konformáciu CDR slučky. Tieto zvyšky sú skoro vždy zachované v novo pripravenej protilátke. Polypeptidová sekvencia ľahkého reťazca variabilnej domény mCBEll je uvedená ďalej, s počiarnutými CDR a s číslovaním pozície zvyškov podľa Kabatovho systému:

1	DIKMTQSPSS	MYASLGERVT	ITCKAGODIK	SYLSWYQQKP
41	WKSPKILIYY	ATRLADGVPS	RFSGSGSGQD	YSLTISSLES
81	DDTATYYCLO	HGESPWTFGG	GTKLEIK
(SEQ	ID NO:1)

Polypeptidová sekvencia ťažkého reťazca variabilnej domény mCBEll je uvedená ďalej, s podčiarknutými CDR a s číslovaním pozície zvyškov podľa Kabatovho systému:

EVQLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS DYYMYWFRQT

PEKRLEWVAT ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY

LQMSSLKSED TAMYYCVREE NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO:2)

Variabilný ľahký a ťažký reťazec mCBEll sa porovnávali s konvenčnou sekvenciou pre myšie a ľudské podskupiny (Johnson, G., Wu, T. T. Kabat Databasis and its applications: future directions Nucleic Acids Research, 29, 205206, 2001; Wu a Kabat, I. Exp. Med. 132:211-250 (1970)) s použitím programu FASTA. mCBEll variabilný ľahký reťazec patrí do podskupiny V so 74% identitou v 110 aminokyselinovom presahu a mCBEll variabilný ťažký reťazec patrí do myšej podskupiny Illd so 79% identitou v 132 aminokyselinovom presahu. Variabilný ľahký reťazec zodpovedá ľudskej podskupine I s 66% identitou v 113 aminokyselinovom presahu. Variabilný ťažký reťazec zodpovedá ľudskej podskupine III so 71% identitou v 131 aminokyselinovom presahu.

CDR podľa predkladaného vynálezu boli klasifikované do kanonických tried. L1 slučka spadá do kanonickej triedy 2 (11 zvyšková slučka), L2 do triedy 1 (7 zvyškov) a L3 do triedy 1 (9 zvyškov). Hl slučka spadá do triedy 1 (5 zvyškov) a H2 slučka spadá do triedy 3 (17 zvyškov). H3 slučka nepatrí do žiadnej kanonickej triedy.

Boli definované zvyšky na rozhraní medzi variabilným ľahkým a ťažkým reťazcom (Chothia et al, 1985 J. Mol. Biol., 186, 65 1-663). Tieto zvyšky sú obvykle zachované v novo vytvorenej protilátke. V mCBEll je niekoľko týchto zvyškov na rozhraní neobvyklých, konkrétne S34, 146, L89, 1391 vo VL a Y35, F37, V93, E95 vo VH.

Neobvyklé zvyšky pracovného regiónu boli určené analyzovaním všetkých myších a ľudských sekvencií variabilného reťazca vo verzii Kabátovej databázy zo septembra 1999 [NCBI. NIH]. Predpokladá sa, že mCBEll špecifické odlišnosti môžu ukazovať na niektoré somatické mutácie, ktoré zosilňujú väzbovú aktivitu, pokiaľ sú tieto odlišnosti v blízkosti väzbového miesta. Neobvyklé myšie zvyšky ďalej od väzbového miesta a neobvyklé ľudské zvyšky boli odstránené v prípade, že by mohli vytvoriť imunogénne epitopy v novo vytvorenej protilátke. Neobvyklými zvyškami v pracovnom regióne v mCBEll boli K3, Mll, Y12, W41, Q69, S72, D81, T83 v ľahkom reťazci: a F37, T40, E42, A49, N77 v ťažkom reťazci. Aj keď väčšina týchto zvyškov nebola zachovaná v humanizovanej CBE11 protilátke, boli niektoré z týchto ne13 obvyklých zvyškov pracovného regiónu zachované, vrátane napríklad F37 a A49 v ťažkých reťazcoch.

Modelovanie štruktúry variabilných regiónov

Ľahké a ťažké reťazce podľa predkladaného vynálezu boli porovnávané s neprekrývajúcimi sa databázami na určenie štrukturálneho rámca, ktorý by mal byť použitý na konštrukciu trojrozmerných modelov ľahkých a ťažkých reťazcov mCBEll. S použitím BLAST bolo zistené, že ľahký reťazec má 93% identitu sekvencie s monoklonálnou myšou protilátkou 5g9 (IAHW), a že ťažký reťazec má 81% identitu sekvencie s myším IgGA2 Fab fragmentom (Fab 17/9) (1IFH). S použitím programu na molekulárne modelovanie Sybyl (Tripos Inc.) boli konštruované trojrozmerné štruktúry pre ľahký a ťažký reťazec, s použitím ľahkého reťazca 5g9 a ťažkého reťazca IgGA2 Fab fragmentu, v príslušnom poradí. Štrukturálna integrita modelov bola hodnotená na výpočtovej konzole a bolo zistené, že je prijateľná.

Návrh upravených variabilných regiónov

Homologické párovanie bolo použité na výber ľudských akceptorových pracovných regiónov pre „akceptovanie“ mCBEll CDR. Ako Kabatova databáza, tak neprekrývajúce sa databázy od NCBI, ENTRZ (The National Institutes of Health) sa prehľadávali s použitím programu BLAST. Výber ľudských akceptorových pracovných regiónov bol uskutočnený podľa identity sekvencie medzi mCBEll pracovnými regiónmi a ľudskými pracovnými regiónmi (s vylúčením pracovných regiónov zo skôr humanizovaných protilátok).

Konečný výber ľudských pracovných regiónov bol uskutočnený z protilátky TNF-Al’CL (Kabat ID 004770) proti ľudskému faktoru nekrózy nádorov alfa (Griffiths et al., 1993 EMBO J. 12:725-734) pre variabilný ľahký (VL) reťazec (ľudská kappa podskupina I) a protilátky FLA-IgG’CL (Kabat ID

040003) neznámej špecificity (Malisan et al, 1996 Blood 87:717-724) pre va14 riabilný ťažký (VH) reťazec (ľudská podskupina III). Ľudské VL a VH pracovné regióny obsahovali 15 a 11 odlišných zvyškov v porovnaní s myšou sekvenciou.

Spätné mutácie ľudských pracovných regiónov

Najviac nepredvídateľnou procedúrou pri humanizácii monoklonálnych protilátok je identifikácia kritických zvyškov pracovného regiónu z pôvodnej protilátky (t.j. v danom prípade je pôvodná protilátka myšia), ktoré musia byť zachované na významné zachovanie väzbových vlastností pôvodnej protilátky pri súčasnej minimalizácii potenciálnej imunogenicity vzniknutej protilátky. Predovšetkým významné je zachovanie kanonických zvyškov, zvyškov na prechode a neobvyklých myších zvyškov, ktoré sú v tesnej blízkosti väzbového miesta. Ďalej sa berú do úvahy zvyšky vo „Vernierovej zóne“ (ktorá tvorí základ, na ktorom spočívajú CDR) (Foote & Winter, 1992 J. Mol. Biol. 224, 487499) a zvyšky v blízkosti CDR 1-13. Mutácie späť na pôvodnú protilátku (t.j. mutácie z ľudského pracovného regiónu na myší) sú tu označované ako spätné mutácie.

Boli pripravené tri verzie upraveného variabilného ľahkého reťazca (huCBE11 VL) a štyri verzie upraveného variabilného ťažkého reťazca (hu-CBEll VH). Všeobecne, prvá verzia obsahovala najviac spätných mutácií a tretia verzia najmenej spätných mutácií (t.j. bola najviac humanizovaná), s výnimkou štvrtej verzie huCBEll VH. Predkladaný vynález poskytuje humanizované protilátky odvodené od mCBEll, ktoré obsahujú variabilný ľahký reťazec vybraný zo skupiny zahrnujúcej variabilné ľahké reťazce opísané ďalej (t.j. VL#X, VL#2 alebo VL#3) a variabilný ťažký reťazec vybraný zo skupiny zahrnujúcej variabilné ťažké reťazce opísané ďalej (t.j. VH#1, VH#2, VH#3 alebo VH#4), v akejkoľvek kombinácii.

(A) Ľahký reťazec:

Q (glutamín)->K (lyzín) je zachované v prvej verzii, pretože predchádzajúce pokusy ukázali (napr. Kolbinger et al, 1993 Prot. Eng., 6, 971-980), že môže byť významný pre väzbu na antigén alebo konformáciu CDR.

G (glycín)->W (tryptofan) Je zachované v prvej a druhej verzii.

L (leucin)->I (izoleucin) Je zachované v prvej a druhej verzii, pretože sa jedná o zvyšok ako na prechode, tak vo Vernierovejj zóne. Ďalej ide o neobvyklý zvyšok vyskytujúci sa 9-krát v myšej sekvencii a raz v ľudskej. Je pravdepodobné, že môže ovplyvňovať konformáciu variabilného reťazca a že môže kontaktovať CDR.

T (threonín)->Q (glutamín) Tento zvyšok je vo Vernierovej zóne a môže ovplyvňovať konformáciu CDR. Zmena z krátkeho T na dlhší Q môže byť tiež zmenou kontaktujúcou antigén. Q je neobvyklý a vyskytuje sa 58-krát u myši a 2-krát u človeka. Je zachovaný v prvej verzii.

F (fenylalanín)->Y (tyrozín) Tento zvyšok je v kanonickej pozícii a je zachovaný vo všetkých verziách. Je tiež relatívne neobvyklý a v ľudskej sekvencii sa vyskytuje 25-krát.

(B) Ťažký reťazec

V (valín)->F (fenylalanín) je zachovaný v prvej, druhej a štvrtej verI zii. F v tejto pozícii je neobvyklý a vyskytuje sa len 15-krát u myši a 18-krát u človeka. Jedná sa tiež o prechodový zvyšok.

A (alanín)->T (threonín) Je zachované v prvej verzii. Mutácia v tejto pozícii sa vyskúšala vo všetkých 5 predchádzajúcich humanizačných pokusoch, aj keď sa nikdy nejednalo o zmenu z A na T. Jedným príkladom je zmena z A na S pri príprave BrE-3 (Couto et al, 1994 Hybridoma, 13, 215-219), keď došlo ku zvýšeniu väzbovej afinity, aj keď dôvod nebol nikdy určený. V tomto prípade bol ťažký reťazec tiež z ľudskej podskupiny III.

S (serín)->A (alanín) Tento zvyšok je pod CDR a vo Vernierovej zóne a bol zachovaný vo všetkých verziách.

V (valín)->M (methionín) Je zachované v prvej verzii. Táto pozícia bola spätne mutovaná v niekoľkých humanizačných pokusoch. Je zachovaná v prvej verzii.

A (alanín)->V (valín) Táto pozícia je ako prechodovým zvyškom, tak zvyškom vo Vernierovej zóne. Je zachovaná v prvej a druhej verzii.

Pripravené aminokyselinové a nukleokyselinové sekvencie každé z rôznych verzií variabilného ľahkého a ťažkého reťazca sú nasledujúce:

Upravené variabilné ľahké reťazce

Upravený variabilný ľahký reťazec CBE11 - verzia 1 ľahkého reťazca (VL#1) (Plazmid pAND066)

GATATTAAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 DIKMTQSPSSbSASVGDRVT aa3

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120 ITCKAGQDIKSYDSWYQQKP

121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 WKAPKILIYYATRDADGVPS aa41 aa46

BI AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 RFSGSGSGQDYTLTISSLQP aa69 aa71

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300 EDFATYYCLQHGESPWTF GG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321 G T K L E I K

SEQ ID NO:3 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VL#1 uvedenú vyššie.

SEQ ID NO:4 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VL#.l uvedenú vyššie.

Upravený variabilný ľahký reťazec CBE11 - verzia 2 ľahkého reťazca (VL#2) (Plazmid pAND070)

GATATCCAGATGACCC AGTCTCCATC ATCCTTGTCTGC ATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 6 0 DIQMTQSPSSbSASVGDRVT

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120 IŤc'käGQDI KSYbSWYQQK P

121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 WKAPKILIYYATRLADGVPS aa41 a a. 4 6

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 RFSGSGSGTDYTLTISSLQP aa71

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCT ACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300 EDFATYYCli Q HGES P W T F G G

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321 G T K b E I K

SEQ ID NO:5 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VL#2 uvedenú vyššie.

SEQ ED NO:6 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VL#2 uvedenú vyššie.

Upravený variabilný ľahký reťazec CBE11 - verzia 3 ľahkého reťazca (VL#3)(Plazmid pAND074)

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 DIQMTQSPSSbSASV GDRVT

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120 IT CKAGQD IKSYbSWYQQKP

121 GGGAAAGCGCCTAAGCCTCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 GKAPKbblYYATRbADGVPS

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 l RFSGSGSGTDYTbTlSSbQP aa71

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300 :

EDFATYYCbQHGESPWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321 i

G T K L E I K

SEQ ID N0:7 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VL#3 uvedenú vyššie.

SEQ ED NO:8 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VL#3 uvedenú vyššie.

Upravené variabilné ťažké reťazce:

Upravený variabilný ťažký reťazec CBE11 - verzia 1 ťažkého reťazca (VH#l) (Plazmid pAND067)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTČ 60 EVQLVESGGGLVKPGGSLRIj

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGACT 120 SCAASGFTFSDYYMYWFRQT aa37 aa40

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180 PGKGIiEWVATlSDGGSYTYY aa49

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240 PDSVKGRFTISRDNAKNSIiY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300 b Q M S S b R A EDTAMYYCVREE aaS9 aa93

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:9 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VH#1 uvedenú vyššie.

SEQ ED NO:10 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VH#1 uvedenú vyššie.

Upravený variabilný ťažký reťazec CBE11 - verzia 2 ťažkého reťazca (VH#2) (Plazmid pAND071)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 EVQLVESGGGI/VKPGGSLRIj

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120 SCAASGFTFSDYYMYWFRQA aa37

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 100 PGKGLEWVATISDGGSYT YY aa49

101 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240 PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300 LQMSSLRABDTAVYYCVREE aa93

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 NGNFYYFDYWGQGTTVTVS s

SEQ ID NO: 11 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VH#2 uvedenú vyššie.

SEQ ED NO:12 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VH#2 uvedenú vyššie.

Upravený variabilný ťažký reťazec CBE11 - verzia 3 ťažkého reťazca (VH#3) (Plazmid pAND075)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 EV QLVESGGGLVK PGGSLRL

61.. TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTGCGCCAGGCC 120 SCAASGFTFSDYYMYWVRQA

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 1Θ0 PGKGLEWVATISDGGSYTYY aa49

101 CCAGAC AGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240 PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGC AGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGC AAGAGAGGAG 300 L Q M S SLRAEDTAVYYCAREE

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360 H G N F YYFDYWGQGTTVTV SS

SEQ ID NO: 13 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VH#3 uvedenú vyššie.

SEQ ED NO: 14 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VH#3 uvedenú vyššie.

Upravený variabilný ťažký reťazec CBE11 - verzia 4 ťažkého reťazca VH#4) (Plazmid pAND090)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 EVQLVESGGGLVK P G G S L K L

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120 SCAASGFTFSDYYMYWF RQAaa37

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180 PGKGLEWVA TISDGGSYTYY aa49

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240. PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG 3 00 L Q M S SbRAEDTAVYYCAREE

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 3 60 NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 15 reprezentuje sekvenciu nukleovej kyseliny upraveného VH#4 uvedenú vyššie.

SEQ ED NO: 16 reprezentuje aminokyselinovú sekvenciu upraveného VH#4 uvedenú vyššie.

Pripravili sa protilátky skladajúce sa z rôznych verzií ľahkého a ťažkého reťazca a tieto protilátky sa použili v ďalších testoch. Napríklad sa pripravili protilátky obsahujúce upravenú huCBEll verziu 3 ľahkého variabilného reťazca (VL#3) a upravenú huCBEll verziu 4 ťažkého variabilného reťazca (VH#4), ktoré sa označili ako huCBEll#4 alebo hCBEll, a bunkové línie E46.4 a E77.4 produkujúce protilátku sa uložili v A.T.C.C. pod prírastkovým číslom PTA3357 a 3765, v príslušnom poradí.

Vynález ďalej zahrnuje ekvivalenty a varianty upravenej VH a VL sekvencie, t.j. varianty obsahujúce jednu alebo viac konzervatívnych aminokyselinových substitúcií, ktoré významným spôsobom neovplyvňujú väzbu na LT-βR. Humanizované ΕΤ-β-R protilátky obsahujúce tieto humanizované variabilné ťažké a ľahké sekvencie môžu byť získané rekombinantnými metódami, ako sú opísané v príkladoch uskutočnení vynálezu.

Použitie

Humanizované anti-LT^-R protilátky podľa predkladaného vynálezu sú použiteľné pri liečbe ochorení, pri ktorých je aktivácia ΕΤ-β-R terapeuticky výhodná. Medzi také použitia patrí liečba, prevencia alebo redukcia progresu, závažnosti či príznakov neoplazie.

V jednom uskutočnení vynález zahrnuje spôsob liečby cicavca (t.j. človeka) s ochorením asociovaným s nežiaducou proliferáciou, kde uvedený spôsob zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva prostriedku obsahujúceho humanizovanú ΕΤ-β-R protilátku podľa predkladaného vynálezu uvedenému cicavcovi.

V inom uskutočnení vynález zahrnuje spôsob liečby cicavca (t.j. človeka) so solidným nádorom (t.j. karcinómom), ktorý nadmerne exprimuje ΕΤ-β-R, kde uvedený spôsob zahrnuje podanie humanizovanej ΕΤ-β-R protilátky, ktorá sa viaže na ΕΤ-β-R, v množstve účinnom na redukciu objemu nádoru. Nádory, ktorých proliferácia je modulovaná ΕΤ-β-R, môžu byť určené meraním úrovne expresie ΕΤ-β-R a/alebo ΕΤ-β-R ligandu (t.j. ΕΤα1β2 alebo LIGHT) v knižniciach nádorových tkanív. Nádorové knižnice, v ktorých je ΕΤ-β-R a/alebo ΕΤβ-R ligand (t.j. LTalfl2 alebo LIGHT) vysoko exprimovaný, budú kandidátmi na túto liečbu. Medzi nádory uvažované v predkladanom vynáleze patria solidné nádory, ako je napríklad nemalobunkový karcinóm pľúc (NSCLC), kolorektálny karcinóm (CRC), karcinóm prsníku, rovnako ako karcinómy prostaty, žalúdku, kože, pažeráka a močového mechúra.

Humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu, ktoré sú použité pri liečbe ochorení asociovaných s nežiaducou proliferáciou buniek, predovšet22 kým s protinádorovou terapiou, výhodne inhibujú rast nádorových buniek, ako je merané napríklad znížením objemu nádoru, o viac než približne 10 %, 20 %, 30 % alebo 40 % a najlepšie o viac než približne 50 %. Humanizované protilátky sú získané skríningom (viď napr. príklad 3). Napríklad môžu byť humanizované protilátky na použitie v predkladanom vynáleze vybrané podľa zníženia objemu nádoru v porovnaní s neliečenými kontrolnými nádormi (napr. podľa zníženia väčšieho než približne 10 %, 20 %, 30 %, 40 % alebo 50 %).

Predkladaný vynález tiež poskytuje farmaceutické prostriedky obsahujúce humanizovanú protilátku podľa predkladaného vynálezu a farmaceutický prijateľnú prísadu. Vhodné nosiče a ich použitie je opísané, napríklad, v Remington’ Pharmaceutical Sciences, 16.ed., 1980, Mack Publishing Co., ed. Oslo et al. Obvykle sa na úpravu na izotonicitu použije vhodné množstvo farmaceutický prijateľnej soli. Príklady nosičov sú pufry, ako je salinický roztok, Ringerov roztok a roztok dextrózy. pH roztoku je výhodne od približne 5 do približne 8, a lepšie od približne 7,4 do približne 7,8. Medzi ďalšie nosiče patria prípravky so spomaleným uvoľňovaním, ako sú semipermeabilné matrice tvorené pevnými hydrofóbnymi polymérmi, kde tieto matrice majú určitý tvar, ako sú napríklad lipozómy, filmy alebo mikročastice. Odborníkom v odbore bude jasné, že niektoré polyméry sú výhodné pre určitý spôsob podania a určitú koncentráciu farmaceutického prostriedku, ktorý má byť podaný.

Podanie môže byť uskutočnené injekciou (napríklad intravenóznou, intraperitoneálnou, podkožnou, intramuskulárnou) alebo iným spôsobom, ako je infúzia, ktorý zaisťuje podanie do krvného riečiska v účinnej forme.

Humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané pri liečbe ochorení v účinnej dávke. Výber konkrétneho farmaceutického prostriedku a terapeuticky účinného dávkovacieho režimu pre danú aplikáciu je dobre známy odborníkom v odbore po zvážení okolností, ako je hmotnosť a stav pacienta, rozsah ochorenia, rozsah požadovanej liečby a tolerancia pacienta. Účinná dávka môže byť napríklad približne 0,05 až približne 100 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti a deň, lepšie približne 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg alebo 25 mg na kilogram telesnej hmotnosti a deň. Alternatívne môže byť účinná dávka približne 0,05 až približne 100 miligramov, presnejšie približne 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg,0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg alebo 25 mg na kilogram telesnej hmotnosti a týždeň. Alternatívne môže byť účinná dávka 0,05 až približne 100 miligramov, presnejšie približne 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg alebo 25 mg, na kilogram telesnej hmotnosti a dva týždne. Alternatívne môže byť účinná dávka 0,05 až približne 100 miligramov, presnejšie približne 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg alebo 25 mg, na kilogram telesnej hmotnosti a tri týždne. Alternatívne môže byť účinná dávka 0,05 až približne 100 miligramov, presnejšie približne 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg alebo 25 mg na kilogram telesnej hmotnosti a štyri týždne.

Na vykonávanie predloženého vynálezu sa využívajú, pokiaľ nie je uvedené inak, bežné techniky bunkovej biológie, kultivácie buniek, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú v odbore známe. Také techniky sú opísané v literatúre. Viď napríklad Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie (Šambrook, Fritsch and Manialis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, DNA Cloning, Volumes I a II (D.N. Glover. ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. patent č. 4,683.195 (Mullis et al.,); Nucleič Acids Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984: Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 a 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vektors for Mammalian Buniek (J.H. Miller and M.P. Cabs, ed.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer a Walker, eds.), Academic Press, London,

1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Nasledujúce príklady sú uvedené na dokreslenie predkladaného vynálezu a nijako neobmedzujú jeho rozsah.

Príklady uskutočnení vynálezu:

Príklad 1: Konštrukcia a exprešia chCBEll cDNA kódujúce myšie CBB11 variabilné regióny ťažkého a ľahkého reťazca sa použijú na konštrukciu vektorov na expresiu myšej-ľudskej chiméry (chCBEll), v ktorej sú muCBEll variabilné regióny naviazané na ľudský IgGl a kappa konštantný región. Na konštrukciu chimérického ťažkého reťazca sa 0,36 kb Pstl-BstEII fragment z CBE11 ťažkého reťazca subklonu pEAG97O subklonoval do fosfatázového 2,82 kb Pstl-BstEII vektorového fragmentu z 5a8 plazmidu pre ťažký reťazec pLCB7 (5a8 je molekulárne klonovaná CD4špecifická mAb skôr charakterizovaná v Biogen), na pridanie myšej signálnej sekvencie pre ťažký reťazec a zostrihového donorového miesta do muCBEll variabilného regiónu ťažkého reťazca. V tomto plazmide, označenom ako pEAG979, sa N-koniec ťažkého reťazca líši v dvoch zvyškoch od N-koncovej sekvencie prečisteného autentického ťažkého reťazca CBE11 získaného z Edmanovej degradácie, v dôsledku použitia primeru v PCR. Na opravu N-konca ťažkého reťazca sa pEAG979 upravil mutagenézou s elimináciou jedinečného miesta (USE) s použitím Amersham Pharmacia Biotech USE mutagenézis kitu podľa návodu výrobcu. Mutované plazmidy sa identifikovali testovaním na vložené Avall, PstI a Rsal zmeny. Sekvencia ťažkého reťazca vo vzniknutom plazmide pEAG981 sa potvrdila DNA sekvenovaním. 0,44 kb Notl-HindlII fragment variabilnej domény ťažkého reťazca z pEAG98I a 1,21 kb HindlIINotl fragment z plazmidu pEAG964, obsahujúci ľudský IgGI konštantný región, sa subklonovali do Nôti miesta pCEP4 (Invitrogen) EBV expresného vektora odvodeného od plazmidu pCH269, za zisku plazmidu pEAG983.

Na konštrukciu chimérického ľahkého reťazca sa 0,11 kb Notl-EcoRV fragment z plazmidu pMDR985 a 0,37 kb EcoRV-BamHI fragment z plazmidu pEAG967 variabilnej domény ľahkého reťazca CBE11 subklonovali do fosfatázového 2,94 kb Notl-BamHI fragmentu vektoru zo Stratagene pBluescriptIISK+ klonovacieho vektora, na pridanie signálnej sekvencie myšieho ľahkého reťazca a 5’ Nôti miesta do plazmidu pEAG978. Tento plazmid sa podrobil USE mutagenéze s použitím Amersham Pharmacia Biotech USE mutagenézis kitu podľa návodu výrobcu, s mutagénnymi primermi kódujúcimi V3K substitúciu na získanie autentického N-konca ľahkého reťazca CBE11, a na vloženie BglII miesta na 3‘ koniec variabilnej domény ľahkého reťazca. Mutované plazmidy sa identifikovali testovaním na vložené zmeny v BglII, EcoRV a Msel miestach. Sekvencia ľahkého reťazca vo vzniknutom plazmide pEAG98O sa potvrdila DNA sekvenovaním. 0,41 kb Notl-BglII fragment variabilnej domény ľahkého reťazca z pEAG980 a 0,68 kb fragment BclI-NotI fragment z plazmidu pEAG963, obsahujúci ľudskú konštantnú doménu kappa ľahkého reťazca, sa subklonovali do Nôti miesta pCEP4 (Invitrogen) EBV expresného vektora odvodeného od plazmidu pCH269, za zisku plazmidu pEAG982.

Expresné vektory (vektor pEAG983 pre chCBEll ťažký reťazec a vektor pEAG982 pre chCBEll ľahký reťazec) sa súčasne transfektovali do 293-EBNA buniek a transfektované bunky sa testovali na sekréciu protilátok a ich špecificitu (prázdnym vektorom - ch5c8 (molekulárne klonovaná CD 154-špecifická mAb skôr charakterizovaná v Biogen) transfektované bunky slúžili ako kontrola). Westernova hybridizácia (s použitím protilátok proti ľudskému ľahkému a ťažkému reťazcu) imunoprecipitátov proteínu A z lyzätov celých buniek a kondicionovaného média ukázala, že bunky transfektovanej chCBEll syntetizovali účinne ťažké a ľahké reťazce v koncentráciách podobných ako ch5c8transfektované bunky. FACS analýza LT-P-R-exprimujúcich HT-29 buniek farbených kondicionovaným médiom z transfektovaných buniek ukázala, že chCBEll protilátka sa viaže a produkuje podobné sfarbenie ako muCBEll, zatiaľ čo kondicionované médium z falošne transfektovaných a ch5c8-transfektovaných buniek nefarbí LT-P-R na HT-29 bunkách. Chimérické CBE11 produkované z dočasnej transfekcie sa prečistili a preukázalo sa, že indukujú sekréciu IL-8 v A375 melanómových bunkách exprimujúcich LT-P-R a že inhibujú rast WiDRr adenokarcinómových buniek u holých myší.

Príklad 2: Konštrukcia a expresia huCBEll

Návrh upravených variabilných domén na produkciu humanizovanej CBE11 (huCBEll) sa vykonal spôsobom opísaným vyššie. Výber ľudských akceptorových pracovných regiónov sa vykonal podľa homologického párovania: ľudská kappa podskupina I mAb TNF-A1 sa vybrala pre ľahký reťazec (Griffiths et al., 1993), a ľudská podskupina III mAb FLA-IgG pre ťažký reťazec (Malisan et al., 1996). Boli navrhnuté tri verzie každého variabilného ľahkého a štyri verzie variabilného ťažkého upraveného reťazca, všeobecne, prvá verzia obsahovala najviac spätných mutácií na myšiu pôvodnú sekvenciu, zatiaľ čo posledná verzia obsahovala najmenej týchto spätných mutácií (t.j. bola najviac humanizovaná”).

huCBEll variabilné regióny boli vyrobené mutagenézou s elimináciou jedinečného miesta (USE) s použitím Amersham Pharmacia Biotech USE mutagenézis kitu podľa návodu výrobcu, s použitím plazmidu chCBEll pre variabilné domény ako štartovacieho templátu. Mutagénne primery na zmeny v pracovnom regióne (FR) sú opísané ďalej. Boli použité cDNA sekvencie ľudských akceptorových pracovných regiónov (Kabatova databáza #004770 pre ľahký reťazec a Kabat #040003 pre ťažký reťazec), s vloženými silentnými mutáciami, na vyvolanie zmien v reštrikčných miestach na uľahčenie identifikácie mutovaných plazmidov. Mutované plazmidy boli identifikované testovaním na vložené zmeny v reštrikčných miestach. cDNA sekvencia pre variabilný región vo vzniknutých plazmidoch sa potvrdila sekvenovaním DNA.

VH#1 použil pEAG98I templát s nasledujúcimi primermi: FRI primér 5’ GCC TGG AGG GTC CCT GAG GCT CTC CTG TOC AGC CTC 3’ (SEQ ID NO: 17), ktorý zavádza Bsu36I miesto; FR2 primér 5’ GTT TCG CCA GAC TCC GGG AAA GGG GCT GGA GTG GGT CGC AAC 3’ (SEQ ID NO: 18), ktorý zavádza Ncil a Hpall miesta; a FR3 primér 5’ CAG AGA CAA TGC CAA GAA CAG CCT CTA CCT GCA GAT GAG CAG CCT GAG GGC TGA GGA

CAC AGC CAT G 3’ (SEQ ID NO: 19), ktorý zavádza Bsu36I a PstI miesta a odstraňuje Rsal miesto. Vzniknutý VH#1 plazmid sa označil pAND067.

VH#2 použil pAND067 templát s nasledujúcimi primermi: FR2 primer 5’ CAT GTA TTG GTT TCG CCA GGC CCC COG AAA GGG GCT GG 3’ (SEQ ID NO:20), ktoré vložili Smal miesto; a FR3 primer 5’ GGG CTG AGO ACA CAG CTG TGT ATT ACT GTG TAA GAG 3’ (SEQ ID NO:2 I), ktorý vložil PvulI miesto. Získaný VH#2 plazmid sa označil ako pAND071.

VH#3 použil plazmid pAND067 ako templát s nasledujúcimi primermi: FR2 primer 5’ GTG ACT ATT ACA TGT ATT GGG TGC GCC AGG CCC CGG GAA AGG GGC TGG AG 3’ (SEQ ID NO:22), ktorý vložil Smal a Hhal miesta; a FR3 primer 5’ GAG GGC TGA GGA CAC AGC TGT GTA TTA CTG CGC AAG AGA GGA GAA TGG TAA C 3’ (SEQ ID NO:23), ktorý vložil PvulI a FspI miesta. Získaný VH#3 plazmid sa označil ako pAND075.

Expresné vektory pre huCBEll ťažké reťazce sa pripravili subklonovaním 0,44 kb Notl-HindlII fragmentu variabilnej domény ťažkého reťazca z pAND067, pAND071, alebo pAND075, a 1,21 kb HindlII-NotI fragmentu z plazmidu pEAG964, obsahujúceho ľudský IgGl konštantný región, ktoré sa subklonovali do Nôti miesta plazmidu pCH269 odvodeného od pCEP4 EBV expresného vektora, za zisku expresných vektorov pre ťažký reťazec pAND069 (VH#I), pAND073 (VH#2), a pAND077 (VH#3).

VL#1 použil plazmid pEAG98O ako templát s nasledujúcimi primermi: FR1 primeru 5’ CTT GCA AGT GAT AGT GAG CCT GTC TCC CAC CGA TGG AGA CAA GGA TGA TOG AGA CTG GGT CAT C 3’ (SEQ ID NO:24), ktorý odstránil Hinfl a Nsil miesta; FR2 primeru 5’ CAT AAT AGA TCA GOA TCT TAG GCG CTT TCC ATG GTT TCT GCT G 3’ (SEQ ID NO:25), ktorý vložil HaelI a Hhal miesta; a FR3 primeru 5’ GTA GAC AGT AAT AAG TTO CGA AAT CCT GAG CCT GCA GCC TGC TGA TOG TFA GAG TAT AAT CTT GCC CAG ATC 3’ (SEQ ID NO:26), ktorý vložil Bsu36I, Ddel a PstI miesta. Získaný VL#1 plazmid sa označil ako pANDOóó.

VL#2 použil plazmid pANDOóó ako templát s nasledujúcimi primermi: FR1 primeru 5’ GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG

GCA CCT G 3’ (SEQ ID NO:27), ktorý vložil EcoRV miesto; a FR3 primeru 5’ CAT GGT TAG ACT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACT CCC ACT G 3’ (SEQ ID NO:28), ktorý vložil Rsal miesto. Získaný VL#2 plazmid sa označil ako pAND070.

VL#3 použil plazmid pAND066 ako templát s nasledujúcimi primérmi: FRI primeru 5’ GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3’ (SEQ ID NO:29), ktorý vložil EcoRV miesto; FR2 primeru 5’ CAA CCT TGT TGC ATA ATA GAT GAG AAG CTT AGG CCC TGG TTT CTG Ctg GTA CC 3’ (SEQ ID NO:30), ktorý vložil HindlII miesto a odstránil Ncol a Styl miesta; a FR3 primeru 5’ GAT GGT TAG AGT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G 3’ (SEQ ID NO:31), ktoré vložili Rsal miesto. Získaný VL#3 plazmid sa označil ako pAND074.

Expresné vektory pre huCBEll ľahké reťazce sa pripravili subklonovaním 0,41 kb fragmentov Notl-BglII variabilnej domény ľahkého reťazca z pAND066, pAND070 alebo pAND074 a 0,68 kb BclI-NotI fragmentu z plazmidu pEAG963, obsahujúceho konštantnú doménu ľudského kappa ľahkého reťazca, do Nôti miesta pCH269 plazmidu odvodeného od pCEP4 EBV expresného vektora, za zisku expresných vektorov pre ľahký reťazec pAND068 (VL#1), pAND072 (VL#2) a pAND076 (VL#3).

Expresné vektory sa súčasne transfektovali do 293-EBNA buniek a transfektované bunky sa testovali na sekréciu protilátok a ich špecificitu (bunky transfektované prázdnym vektorom slúžili ako negatívna kontrola). Westernová hybridizácia (vyvíjaná s použitím protilátok proti ľahkému a ťažkému reťazcu) imunoprecipitátov lyzátov celých buniek a kondicionovaného média s proteínom A ukázala, že huCBEl 1-transfektované bunky syntetizujú a účinne vylučujú ťažké a ľahké reťazce v koncentráciách podobných ako chCBElltransfektované bunky. FACS analýza LT-P-R-exprimujúcich HT-29 buniek farbených kondicionovaným médiom z transfektovaných buniek ukázala, že huCBEl 1#3 mAb sa viaže menej než huCBEl 1#1 a huCBEl 1#2 mAbs v porovnaní s chCBEll (tabuľka 1, ďalej), kde huCBEl 1#1 (VL#1 s VH#1); huCBE#2 (VL#2 s VH#2) a huCBEl 1#3 (VL#3 s VH#3). Zmiešané a zodpovedajúce kotransfekcie ukázali, že redukcia môže byť prisúdená VH#3, ktorý sa líši od

VH#2 v dvoch zvyškoch pracovného regiónu: FR2 F37V a FR3 V93A. Na určenie jednotlivého prispenia týchto zmien sa pripravili nové expresné vektory pre ťažký reťazec. Plazmid pAND089, F37V variant VH#2, sa pripravil subklonovaním 311 bp Notl-PstI fragmentu z pAND075, 126 bp Pstl-HindlII fragmentu z pAND071 a 1,21 kb HindlII-NotI fragmentu z plazmidu pEAG964, do Nôti miesta plazmidu pCH269 odvodeného od pGEP4 EBV expresného vektora. Plazmid pAND090, V93A variant VH#2, sa pripravil subklonovaním 311 bp Notl-PstI fragmentu z pAND071, 1,26 bp Pstl-HindlII fragmentu z pAND075, a 1,21 kb HindlII-NotI fragmentu z plazmidu pEAG964, do Nôti miesta plazmidu pCH269 odvodeného od pCEP4 EBV expresného vektora. Tieto H2/H3 chimérické ťažké reťazce sa súčasne transfektovali do 293-EBNA buniek s VL#2 alebo VL#3. FACS analýza ukázala, že V93A H2 variant obnovuje väzbu na LT-βR, keď je v páre s VL#3 (tabuľka 1, vyššie). Pár pAND076 a pAND090 sa označil ako huCBEll#4 (tabuľka 1, vyššie).

Kotransfekcia 293-EBNA buniek s chCBEll a huCBEll verziami #1-4 sa rozšírila a získalo sa kondicionované médium. Protilátka sa prečistila na Protein A-Sepharose. Prečistené mAb sa testovali na aktivitu.

Tabuľka 1. FACS farbenie HT-29 buniek chCBEll a huCBEll

	Ľahký reťazec	Ťažký reťazec	Relatívny MFI
ChCBEll	pEAG982	pEAG983	1,00
HuCBEll#l	pAND068	pAND069	1,00
HuCBEll#2	pAND072	pAND073	1,00
HuCBEll#3	pAND076	pAND077	0,62
L2/H3	pAND072	pAND077	0,42
L3/H2	pAND076	pAND073	1,00
L2/F37V H2	pAND072	pAND08S	0,65
L2/V93A H2	pAND072	pAND09Q	0,75
L3/F37V H2	pAND076	pAND089	0,80
HuCBEll#4	pAND076	pAND090	1,00

Kondicionované médium z dočasne transfektovaných buniek sa použilo na farbenie HT-29 buniek pomocou inkubácie po dobu 30 minút na ľade, premytia buniek dvakrát FACS pufrom (PBS s 5% FBS a 0,05% azidom sodným), farbením FE-konjugovaným anti-ľudským IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., po dobu 30 minút na ľade vo FACS pufry, premytím buniek dvakrát FACS pufrom a resuspendovanim vo FACS pufry na analýzu. Relatívny MFI označuje priemerný MFI normalizovaný na MFI zistený pre chCBEll. Uvedené dáta predstavujú priemery z dvoch nezávislých transfekcii.

Príklad 3: IL-8 agonizmus na A375 bunkách

Prečistené mAb sa testovali na aktivitu. Výsledky testu uvoľňovania IL-8 v A375 ľudských melanómových bunkách sú uvedené na obr. 1, kde je uvedené množstvo IL-8 uvoľneného po väzbe anti-LT-P-R protilátky na LT-P-R exprimovaný na povrchu A375 ľudských melanómových buniek. A375 bunky sa umiestili v koncentrácii 10⁵/ml do 96-jamkových platní obsahujúcich buď rozpustné protilátky alebo protilátky zachytené na jamkách pokrytých kozou protilátkou proti ľudskému IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Kultivačné platne sa inkubovali cez noc. Odobralo sa kondicionované médium a analyzovalo sa na IL-8 s použitím ELISA testu.

Príklad 4: Cytotoxicita pre WiDr bunky

Výsledky testu cytotoxicity s použitím WiDr buniek karcinómu hrubého čreva uskutočnených s rozpustnou anti-LT-P-R protilátkou na jamkách pokrytých anti-ľudským IgG Fc, ktoré preukázali, že anti-LT-P-R protilátky zvyšujú cytotoxicitu nádorových buniek, sú uvedené na obr. 2. WiDr bunky sa umiestili v koncentrácii 6xl0⁴/ml v prítomnosti 80 jednotiek/ml huIFN-gamma do 96jamkových platní obsahujúcich buď rozpustné protilátky alebo protilátky zachytené na jamkách pokrytých kozou protilátkou proti ľudskému IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Kultivačné platne sa inkubovali po dobu 5 dní. MTT sa pridal na dobu 4 hodín a vzniknutá zrazenina sa rozpustila inku31 báciou cez noc s 10% SDS v 10 mM HCI, a O.D. sa odčítala na čítačke mikroplatní.

Príklad 5:

Pripravila sa protilátka skladajúca sa z upravenej huCBEll verzia 3 ľahkého variabilného reťazca (VL#3) a upravenej huCBEll verzia 4 ťažkého variabilného reťazca, označená ako huCBEll#4 alebo hCBEll, a bunková línia produkujúci protilátku sa uložila v A.T.C.C. (ATCC prírastkové č. PTA-3357). Úplné polypeptidové sekvencie každého ľahkého a ťažkého reťazca, vrátane konštantných domén, sú nasledujúce:

Sekvencia zrelej huCBEll verzie 3 ľahkého reťazca (SEQ ID NO: 32):

t DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKAGODtK SYLSW YQOKP GKAPKLLIYY 51 ATRLADGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCLQ HGESPWTFGG 101 GTKLEIK (RTV AAPSVF1FPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGECJ

CDR sú podčiarknuté; spätná mutácia F71Y je tučné; konštantné domény sú v zátvorkách.

Sekvencia zrelej huCBEll verzie 4 ťažkého reťazca (SEQ ID NO: 33):

V37F S49A

I EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMYWFRQA PGKGLEWVAT 51 ISDGGSYTYY PDSVKGRFT1 SRDNAKNSLY LOMSSLRAED TAVYYCAREE 101 NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS (ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT

201 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP

251 KDTLMfSRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 301 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAP1EKTIS KAKGQPREPQ 351 VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLŠPG]

CDR sú podčiarknuté; spätné mutácie V37F a S49A sú tučné; konštantné domény sú v zátvorkách.

6-týdnov starým holým myšiam sa intraperitoneálnou injekciou podalo 100 pg anti-LFA3 protilátky (1E6), 100 pg anti-LTBR protilátky (huCBEll#4) alebo sa im nepodala žiadna injekcia (kontrola). Zvieratám sa potom podkožné podalo lxlO⁶ WIDR buniek adenokarcinómu čreva. U myší liečených huCBE11#4 sa liečba opakovala raz za týždeň dávkou 100 pg protilátky a mCBEll zvieratám sa podávala len každý 14 deň. Veľkosť nádoru sa merala raz za týždeň a vypočítal sa objem nádoru (obr. 3). Zvieratá sa utratili, sotva objem nádoru dosiahol 2,0 cm³ (16 mm v priemere) a deň ich utratenia sa zaniesol do grafu prežívania (obr. 4).

Príklad 6

6-týdnov starým holým myšiam sa buď intraperitoneálnou injekciou podalo 100 pg anti-LTBR protilátky (huCBEll#4) alebo sa im nepodala žiadna injekcia (kontrola). Zvieratám sa potom podkožné podalo lxlO⁶ WIDR buniek adenokarcinómu čreva. U myší liečených huCBEll#4 sa liečba opakovala raz za týždeň dávkou 100 pg huCBEll#4. Veľkosť nádoru sa merala raz za týždeň a vypočítal sa objem nádoru. Objemy nádorov predstavujú priemery od 10 kontrolných zvierat a od 8 zvierat liečených huCBEll#4 (obr. 5). Liečba huCBE11#4 raz za týždeň štatisticky významne inhibuje rýchlosť rastu WIDR nádorov implantovaných podkožné u holých myší. Zvieratá liečené protilátkou do dňa 21 vykazovali trvajúce spomalenie rastu nádorov dva týždne po ukončení liečby.

Príklad 7: huCBEl 1#4 spomaľuje rast predkultivovaných WIDR nádorov a zvyšuje prežívanie holých myší s WIDR nádormi

10⁶ buniek sa kultivovalo podkožné po dobu 10 dní na holých myšiach. Myšiam sa podávali podkožné injekcie buď PBS, alebo huCBEl 1#4 raz týždne alebo mCBEll raz za dva týždne. Hmotnosti nádorov sa vypočítali zmeraní dĺžky a šírky nádorov a zvieratá s nádormi o hmotnosti viac než 2 000 mg sa utratili a hmotnosti ich nádorov v dobe sa zahrnuli do štatistického spracovania. Chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku. Hmotnosti nádorov sa vypočítali s použitím vzorca: (šírka x šírka x dížka)/2 = hmotnosť nádoru v mg. Výsledky sú uvedené v grafe na obr. 6 a ukazujú, že huCBEl 1#4 môže spomaliť rast predkultivovaných nádorov in vivo.

Okrem toho sa nádory kultivovali a liečili spôsobom uvedeným vyššie a meralo sa percentuálne prežívanie zvierat. Výsledky sú uvedené v grafe na obr. 7 a ukazujú, že huCBEl 1#4 je schopná indukovať predĺžené prežívanie in vivo u myší s predkultivovanými nádormi.

Príklad 8: Meranie afinity protilátky

HT-29 bunky sa kultivovali v DMEM doplnenom L-glutamínom, neesenciálnymi aminokyselinami, pyruvátom sodným a 10% fetálnym hovädzím sérom. Bunky sa premyli raz v PBS a odstránili sa z platne inkubáciou s PBS plus 20 mM EDTA pri teplote miestnosti po dobu 5 minút. Bunky sa odstredili pri 1 000 ot. (110 x g) počas 5 minút a resuspendovali sa na hustotu 1 x 10⁷ buniek/ml v PBS.

HuCBEl 1#4 anti-LTpR protilátka a humanizovaná anti-CD40L ako negatívna kontrola sa nariedili v PBS a pripravilo sa 12 sériových riedení 1 : 4 za zisku konečného rozmedzia koncentrácií 2,37 pM - 10 μΜ. 100 μΐ bunkovej suspenzie a 100 μΐ riedenej protilátky sa pridalo do každej jamky 96-jamkovej mikrotitračnej platne s V-dnom. Protilátka a bunky sa inkubovali pri 4 °C po dobu 2 hodín. Platňa sa odstredila pri 1 000 ot. (110 x g) počas 10 minút pri 4 °C. Supernatant sa odstránil a bunková peleta sa premyla šesťkrát chladným PBS.

Konjugát kozí-anti ľudský IgG-fykoerythrin (Jackson Immunoresearch) sa nariedil 1 : 100 v PBS a 200 μΐ sa pridalo do každej jamky. Bunky sa inkubovali s touto sekundárnou protilátkou po dobu jednej hodiny pri 4 °C, odstredili sa spôsobom opísaným vyššie a premyli sa raz v chladnom PBS. Bunky sa potom preniesli do polystyrénových testovacích skúmaviek. Intenzita fluorescencie sa merala FACS Calibur prístrojom (Beckton Dickinson).

Priemerné hodnoty intenzity fluorescencie farbenia pre anti-CD40L nonšpecifickú kontrolu sa vyniesli do grafu proti koncentrácii protilátky v Delta Graph. Hodnoty sa upravili pre priamku a teoretické hodnoty nešpecifickej väzby pre každú koncentráciu protilátky sa odčítali od všetkých získaných dát pre série riedení huCBEl 1#4.

Tieto hodnoty špecifických intenzít fluorescencie sa potom zaznamenali do grafu proti koncentrácii huCBEl 1#4 v logaritmickej mierke. Získaná krivka mala tvar zvonu a bola symetrická, čo odráža samo-inhibíciu väzby protilátky pri vysokých koncentráciách. Ľavá polovica krivky bola upravená pre štvorparametrickú rovnicu na určenie funkčnej afinity protilátky. Výsledná krivka vedie k zisku hodnoty EC50 60 pM pre väzbu huCBEl 1#4 na HT-29 bunky.

Odborníkom v odbore bude jasné, že v polypeptidoch, prostriedkoch a spôsoboch podľa predkladaného vynálezu môžu byť uskutočnené rôzne modifikácie a variácie bez odchýlenia sa od rozsahu predkladaného vynálezu. Predkladaný vynález teda zahrnuje modifikácie a variácie, ktoré spadajú do rozsahu pripojených patentových nárokov a ich ekvivalentov.

ΊΤ

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Humanizovaná protilátka proti lymfotoxínovému beta receptoru (LT-βR), ktorej komplementaritu určujúce regióny ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 34, 50 až 56 a 89 až 97 SEQ ED NO: 1 a ktorej komplementaritu určujúce regióny ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 66 a 99 až 109 SEQ ID NO: 2 a kde protilátka zahrnuje vo svojom ľahkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: K3, W41, 146, Q69 a Y71; alebo vo svojom ťažkom reťazci aspoň jeden z nasledujúcich zvyškov: F37, T40, A49, M89 a V93 (Kabatovo číslovanie).
2. Humanizovaná protilátka proti lymfotoxínovému beta receptoru (LT-βR), ktorej komplementaritu určujúce regióny ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 34, 50 až 56 a 89 až 97 SEQ ED NO: 1 a ktorej komplementaritu určujúce regióny ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 66 a 99 až 109 SEQ ID NO: 2 a kde protilátka zahrnuje vo svojom ľahkom reťazci zvyšok Y71 (Kabatovo číslovanie).
3. Humanizovaná protilátka proti lymfotoxínovému beta receptoru (LT-βR), ktorej komplementaritu určujúce regióny ľahkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 24 až 34, 50 až 56 a 89 až 97 SEQ ED NO: 1 a ktorej komplementaritu určujúce regióny ťažkého reťazca sú definované aminokyselinovými zvyškami 31 až 35, 50 až 66 a 99 až 109 SEQ ID NO: 2 a kde protilátka zahrnuje vo svojom ťažkom reťazci zvyšky F37 a A49 (Kabatovo číslovanie).
4. Protilátka podľa nároku 1, kde protilátka zahrnuje sekvenciu variabilnej domény ľahkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 107 SEQ ID NO:8.
5. Protilátka podľa nároku 1, kde protilátka zahrnuje sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 120 SEQ ID NO: 16.
6. Protilátka podľa nároku 4, kde protilátka ďalej zahrnuje sekvenciu variabilnej domény ťažkého reťazca definovanú aminokyselinovými zvyškami 1 až 120 SEQ ID No:16.
7. Protilátka, zahrnujúca rovnakú polypeptidovú sekvenciu ťažkého a ľahkého reťazca ako protilátka produkovaná bunkovou líniou E46.4 (ATCC patentové uloženie č. PTA-3357) alebo bunkovou líniou E77.4 (ATCC patentové uloženie č. 3765).
8. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde protilátka si v podstate zachováva väzbové vlastnosti pôvodnej protilátky.
9. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde protilátka je ďalej naviazaná na imunotoxín.
10. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde protilátka je ďalej naviazaná na chemoterapeutický liek.
11. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 a farmaceutický prijateľný nosič.
12. Spôsob liečenia alebo redukcie progresu, závažnosti alebo príznakov nádoru u človeka, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie prostriedku podľa nároku 11.
13. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnujúca kódujúcu sekvenciu pre ľahký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou E46.4 (ATCC patentové uloženie č. PTA-3357) alebo bunkovou líniou E77.4 (ATCC patentové uloženie č. 3765).
14. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnujúca kódujúcu sekvenciu pre ťažký reťazec protilátky produkovanej bunkovou líniou E46.4 (ATCC patentové uloženie č. PTA3357) alebo .bunkovou líniou E77.4 (ATCC patentové uloženie č. 3765).
15. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnujúca kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 107 SEQ ID NO:8.
16. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnujúca kódujúcu sekvenciu pre zvyšky 1 až 120 SEQ ID NO:16.
17. Bunka bunkovej línie E46.4 (ATCC patentové uloženie č. PTA-3357) alebo bunkovej línie E77.4 (ATCC patentové uloženie č. 3765).

O.D. 575nm ^{0 D}· ^575nm

1/9

Test cytotoxicity huCBE11