BG107802A

BG107802A - Хуманизирани анти-lt-бета-r-антитела

Info

Publication number: BG107802A
Application number: BG107802A
Authority: BG
Inventors: Ellen A. Garber; Paul Lyne; Jose W. Saldanha
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2003-05-12
Publication date: 2004-01-30
Also published as: EA200300464A1; IS6779A; EA006945B1; CN1547590A; BR0114646A; CZ20031307A3; TR200300478T2; TR200602095T2; MXPA03003144A; NO20031642D0; HUP0302573A2; PL366307A1; AU1174702A; AR035352A1; IL155340A0; CA2425809A1; EE200300179A; NO20031642L; YU28503A; GEP20063752B

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението се отнася най-общо до хуманизирани антитела, специфични за лимфотоксин бета рецептор (LT-3-R).

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Лимфотоксин бета рецепторът (описан тук като LT-P-R) е член на семейството на тумор некрозисни фактори, чиято роля както в развитието на имунната система, така и в поддържане на функциите на клетките на имунната система, включително фоликулярните дендритни клетки и редица стромални клетъчни типове, е добре описана (Matsumoto et al., Immunol. Rev. 156:137(1997). Известните лиганди на LT-3-R включват LTal/p2 и втори лиганд, наречен LIGHT (Mauri et al., Immunity 8:21 (1998)). Показано е, че активирането на LT-p-R индуцира апоптотична смърт на определени ракови клетъчни линии in vivo (PCT/US96/01386). Лечението с агонистични LT-3-R активиращи агенти, такива като специфични aHTn-LT-3-R антитела, би било полезно за лекуване или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия в субекти (напр. хора).

РЕЗЮМЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение осигурява хуманизирани антилимфотоксин бета рецептор (ΕΤ-β-R) антитела и методи за употребата на тези антитела за лечение или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия в субекти (напр. хора).

По-специално, изобретението обхваща хуманизирано антитяло, което специфично се свързва с ΕΤ-β-R (напр. човешко LTβ-R). Това антитяло се характеризира с това, че съдържа региони, определящи комплементарност на леката верига, определени от аминокиселинни остатъци 24 до 34, 50 до 56 и 89 до 97 в SEQ ID NO: 1, и/или съдържа региони, определящи комплементарност на тежката верига, определени от аминокиселинни остатъци 31 до 35, 50 до 66 и 99 до 109 в SEQ ID NO: 2 и в допълнение поне един (напр. 1, 2, 3, 4 или 5) от следните остатъци в леката верига: КЗ, W41,146, Q69 и Y71; или поне един (напр. 1, 2, 3, 4 или 5) от следните остатъци в тежката му верига: F37, Т40, А49, М89 и V93 (общоприетото номериране по Кабат).

Хуманизираното антитяло, съгласно това изобретение, може да съдържа последователността за променливия домен на леката верига, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 107 в SEQ ID NO: 8 и/или последователността за променливия домен на тежката верига, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 120 в SEQ ID NO: 16. Хуманизираното антитяло може също така да включва последователности от тежката и/или леката верига като тези от антитялото, произвеждано от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА-3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка РТА-3765).

В друг вариант хуманизираното антитяло, съгласно това изобретение, в значителна степен запазва свързващите качества на «**' родителското антитяло. В един вариант хуманизираното антитяло, съгласно това изобретение, се свързва към LT-3-R с функционален афинитет, например от около 1 рМ до около 10 рМ, или алтернативно - от около 10 рМ до около 20 рМ, или алтернативно от около 20 рМ до около 30 рМ, или алтернативно - от около 30 рМ до около 40 рМ, или алтернативно - от около 40 рМ до около 50 рМ, или алтернативно - от около 50 рМ до около 60 рМ, или алтернативно - от около 60 рМ до около 70 рМ, или алтернативно от около 70 рМ до около 80 рМ, или алтернативно - от около 80 рМ до около 90 рМ, като функционалният афинитет се измерва чрез FACS, в съответствие с Пример 8.

В друг вариант хуманизираното антитяло, съгласно това изобретение, се свързва към имунотоксин (напр. към А веригата на рицин и токсин от Pseudomonas). Хуманизираното антитяло, съгласно това изобретение, може да бъде свързано и към химиотерапевтично лекарство (напр. адриамицин, 5-флуоро урацил (5FU), винбластин, актиномицин Д, етопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин) или към радиоизотоп. Настоящото изобретение обхваща също така комбинирана терапия, при която например хуманизираното антитяло, съгласно настоящото изобретение, което е свързано към имунотоксин, се използва в комбинация с хуманизирано антитяло, съгласно настоящото изобретение, което е свързано към химиотерапевтично лекарство. Настоящото изобретение обхваща и състав, подходящ за даване на бозайници (напр. хора) с тумор, който свръхекспресира LT3R, характеризиращ се с това, че включва а) хуманизирано aHTH-LTpR антитяло, самостоятелно или свързано към имунотоксин, или химиотерапевтично лекарство и б) цитотоксичен фактор, като всяка съставка присъства в количества за ефективно намаляване на обема на тумора при даването им на бозайника. Цитотоксичният фактор може да включва например TNF-a, TNF-β, IL-1, INF-γ, IL-2. Алтернативно, цитотоксичният фактор може да бъде химиотерапевтично лекарство. Химиотерапевтичното лекарство може да включва например адриамицин, 5FU, винбластин, актиномицин Д, етопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин.

Антитялото, съгласно това изобретение, може да бъде например цяло антитяло (т.е. с две леки вериги в пълна дължина и с две тежки вериги в пълна дължина) от който и да е изотип и подтипове (напр. IgM, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl и IgA2); алтернативно, може да бъде антиген-свързващ фрагмент г* (напр. Fab, F(ab’)₂ и Fv) от едно цяло антитяло. В това изобретение се обхваща също и състав, характеризиращ се с това, че включва фармацевтично приемлив рецептор; изолирана нуклеинова киселина, представляваща кодиращата последователност на SEQ ID NO: 8; изолирана нуклеинова киселина, представляваща кодиращата последователност на SEQ ID NO: 16; изолирана нуклеинова киселина, представляваща кодиращата последователност за леката верига на антитяло, произвеждано от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА-3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка РТА-3765); изолирана нуклеинова киселина, представляваща кодираща нуклеотидна последователност за тежката верига на антитяло, произвеждано от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА-3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка РТА-3765); изолирана нуклеинова киселина, представляваща кодираща нуклеотидна последователност за остатъци 1-107 в SEQ ID NO: 8; изолирана нуклеинова киселина, представляваща кодираща нуклеотидна последователност за остатъци 1-120 в SEQ ID NO: 16.

Настоящото изобретение обхваща също така и клетки от клетъчни линии, които произвеждат хуманизирано aHTH-LT-P-R

антитяло, включващи например клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА-3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка РТА-3765). В един вариант клетъчната линия произвежда от около 250 mg/L до около 300 mg/L от въпросното антитяло, алтернативно, клетъчната линия произвежда от около 300 mg/L до около 350 mg/L от въпросното антитяло, алтернативно, клетъчната линия произвежда от около 350 mg/L до около 400 mg/L от въпросното антитяло, алтернативно, клетъчната линия произвежда от около 400 mg/L до около 450 mg/L от въпросното антитяло, алтернативно, клетъчната линия произвежда от около 450 mg/L до около 500 mg/L от въпросното антитяло, алтернативно, клетъчната линия произвежда от около 500 mg/L до около 550 mg/L от въпросното антитяло, алтернативно, клетъчната линия произвежда от около 550 mg/L до около 600 mg/L от въпросното антитяло. Концентрацията на антитялото, произвеждано от клетъчните линии, се измерва като обединен титър от 10-дневна полу-периодична култура.

Настоящото изобретение предоставя и метод за лекуване или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия в субекти (напр. хора), характеризиращ се с това, че включва даване на субекта на ефективно количество от антитялото, съгласно това изобретение. Ефективно количество от състава може да се дава в една или повече дози. В друг вариант, настоящото изобретение осигурява метод за лекуване или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия в субекти (напр. хора), характеризиращ се с това, че включва даване на субекта на ефективно количество от антитялото, съгласно това изобретение и на цитотоксичен фактор. Цитотоксичният фактор може да включва например TNF-a, TNF-β, IL-1, INF-γ, IL-2. Алтернативно, цитотоксичният фактор може да бъде химиотерапевтично лекарство. Химиотерапевтичното лекарство може да включва например адриамицин, 5FU, винбластин, актиномицин Д, етопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 показва графика на цитотоксичността на клетки WiDr. mCBEll (миши) (ромб), huCBEll#2 (хуманизирано анти-LTβ-R антитяло, представляващо версия 2 на леката верига (VL#2) и версия 2 на тежката верига (VH#2)) (кръг), huCBEll#4 (хуманизирано анти-LT-β-R антитяло, представляващо версия 3 на леката верига (VL#3) и версия 4 на тежката верига (VH#4)) (звезда).

Фигура 2 показва графика на агонистичното действие на IL-8 върху клетки А375. шСВЕН (ромбове), huCBEll#2 (хуманизирано aHTH-LT^-R антитяло, представляващо версия 2 на леката верига (VL#2) и версия 2 на тежката верига (VH#2)) (кръг), huCBEll#4 (хуманизирано aHTH-LT^-R антитяло, представляващо версия 3 на леката верига (VL#3) и версия 4 на тежката верига (VH#4)) (звезди).

Фигура 3 показва графика на зависимостта на обема на тумора от дните на даване. mCBEll (триъгълници), huCBEll#4 (хуманизирано анти-ЕТф-В антитяло, представляващо версия 3 на леката верига (VL#3) и версия 4 на тежката верига (VH#4)) (кръгове), без лечение (квадрати).

Фигура 4 показва графика на зависимостта на преживаемостта на животните от дните на пост-туморно инжектиране. mCBEll (триъгълници), huCBEll#4 (хуманизирано aHTH-LT^-R антитяло, представляващо версия 3 на леката верига и версия 4 на тежката верига) (кръгове), без лечение (квадрати).

Фигура 5 показва графика на зависимостта на обема на тумора от дните на пост-инжектиране. НиСВЕ11#4 (хуманизирано анти-LTβ-R антитяло, представляващо версия 3 на леката верига (VL#3) и версия 4 на тежката верига (VH#4)) (кръгове) и контрола без лечение (квадрати).

Фигура 6 показва графика на зависимостта на обема на предварително израсналия тумор от дните на пост-лекуване. Контрола (квадрат); huCBEll#4 (хуманизирано анти-ЬТ-З-Я антитяло, представляващо версия 3 на леката верига (VL#3) и версия 4 на тежката верига (VH#4)) при различни дози: 500 pg (кръгове) и 20 pg (ромбове); mCBEl 1 (кръстчета).

Фигура 7 показва графика на процента преживели животни с предварително израснали тумори в зависимост от дните на постлекуване. Контрола (квадрат); huCBEll#4 (хуманизирано анти-LTβ-R антитяло, представляващо версия 3 на леката верига (VL#3) и версия 4 на тежката верига (VH#4)) при различни дози: 500 pg (кръгове), 100 pg (триъгълници) и 20 pg (ромбове); шСВЕН (кръстчета).

Фигура 8 показва графика на средната интензивност на флуоресценция като функция на концентрациите на huCBEll#4 в логаритмична скала.

ДЕТАЙЛНО ОПИСАНИЕ

Идентификационни номера на последователностите

Реферираните в спецификацията нуклеотидни и аминокиселинни последователности са означени със следните идентификационни номера:

SEQ ID N0:1 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от тежката верига на mCBEl 1.

SEQ ID N0:2 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на mCBEl 1.

SEQ ID N0:3 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 1-VL&1).

SEQ ID N0:4 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 1-VL#1).

SEQ ID N0:5 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 2-VL#2).

SEQ ID N0:6 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 2-VL#2).

SEQ ID N0:7 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 3-VL#3).

SEQ ID N0:8 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 3-VL&3).

SEQ ID N0:9 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от тежката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 1-VH#1).

SEQ ID N0:10 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 1-VH#1).

SEQ ID N0:11 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от тежката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 2-VH#2).

SEQ ID N0:12 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 2-VH#2).

SEQ ID N0:13 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от тежката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 3-VH&3).

SEQ ID N0:14 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 3-VH&3).

SEQ ID N0:15 - Нуклеотидна последователност на променливия регион от тежката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 4-VH#4).

SEQ ID N0:16 - Аминокиселинна последователност на променливия регион от леката верига на хуманизирано СВЕ11 (версия 4-VH#4).

SEQ ID NO: 17 - FR1 праймер за въвеждане на Bsu36I място за срязване.

SEQ ID N0:18 - FR2 праймер за въвеждане на Neil и HpalI места за срязване.

SEQ ID N0:19 - FR3 праймер за въвеждане на Bsu36I HPstI места за срязване.

SEQ ID N0:20 FR2 праймер за въвеждане на Smal място за срязване.

SEQ ID N0:21 - FR3 праймер за въвеждане на Pvul място за срязване.

SEQ ID N0:22 - FR2 праймер за въвеждане на Smal и Hhal места за срязване.

SEQ ID N0:23 - FR3 праймер за въвеждане на PvuII и FspI места за срязване.

SEQ ID N0:24 - FR1 праймер за въвеждане на Hinfl и Nsil места за срязване.

SEQ ID N0:25 - FR2 праймер за въвеждане на Haell и Hhal места за срязване.

SEQ ID N0:26 - FR3 праймер за въвеждане на Bsu36I, Ddel и PstI места за срязване.

SEQ ID N0:27 - FR1 праймер за въвеждане на EcoRV място за срязване.

SEQ ID N0:28 - FR3 праймер за въвеждане на Rsal място за f- срязване.

SEQ ID N0:29 - FR1 праймер за въвеждане на EcoRV място за срязване.

SEQ ID N0:30 - FR2 праймер за въвеждане на Hindlll място за срязване.

SEQ ID N0:31 - FR3 праймер за въвеждане на Rsal място за срязване.

SEQ ID N0:32 - Пълна лека верига на huCBEl 1 (версия 3), включително постоянния домен.

SEQ ID N0:33 - Пълна тежка верига на huCBE 11 (версия 4), включително постоянния домен.

Дефиниции

Терминът хуманизирано антитяло, употребен тук, се отнася до антитяло, получено от нехуманизирано антитяло, обикновено мише, което запазва или запазва в значителна степен способността за свързване с антиген на родителското антитяло, но което е в по-малка степен имуногенно в хора.

Терминът регион, определящ комплементарност (РОК), употребен тук, се отнася до аминокиселинни последователности, които заедно определят афинитета на свързване и специфичността на природния Fv регион на нативно място за свързване в имуноглобулин, както е определено от Rabat et al (1991).

Терминът регион на рамката (РР), употребен тук, се отнася до аминокиселинни последователности, вмъкнати между РОК. Тези части от антитялото служат за поддържане на РОК в подходящата ориентация (позволяват на РОК да свързва антигена).

Терминът постоянен регион (ПР), употребен тук, се отнася за част от молекулата на антитялото, която изпълнява ефекторни функции. В настоящото изобретение мишите постоянни региони се заменят с човешки постоянни региони. Постоянните региони на въпросните химерни или хуманизирани антитела произлизат от човешки имуноглобулини. Постоянният регион от тежката верига може да бъде избран измежду всеки един от петте изотипа: алфа, делта, епсилон, гама или мю. По-нататък, тежки вериги от различни субкласове (такива като субкласовете тежки вериги на IgG) са отговорни за различните ефекторни функции и по този начин, чрез избор на желания постоянен регион от дадена тежка верига могат да се произвеждат антитела с желани ефекторни функции. Предпочитани постоянни региони са гама 1 (IgGl), гама 3 (IgG3) и

гама 4 (IgG4). По-предпочитан е Fc региона на изотип гама 1 (IgGl). Постоянният регион на леката верига може да бъде от тип капа или ламбда, за предпочитане от тип капа.

Терминът химерно антитяло, употребен тук, се отнася за антитяло, съдържащо последователности, произхождащи от две различни антитела, които обикновено са от различни видове. Найчесто химеричните антитела представляват фрагменти от човешки и миши антитела, обикновено човешки постоянен и миши променлив регион.

Терминът имуногенност, употребен тук, се отнася да измерване на способността на насочен белтък или терапевтична единица да предизвикват имунен отговор (хуморален или клетъчен), когато се дават на реципиент. Настоящото изобретение е свързано и с имуногенността на въпросните хуманизирани антитела.

Хуманизираното антитяло с намалена имуногенност се отнася до хуманизирано антитяло, показващо намалена имуногенност по отношение на родителското антитяло, т.е. мишето антитяло.

Хуманизираното антитяло, което в значителна степен запазва способността за свързване на родителското антитяло се означава като хуманизирано антитяло, което запазва способността за специфично свързване на антиген, разпознат от родителското антитяло, използвано за произвеждане на това хуманизирано антитяло.

За предпочитане е, хуманизираното антитяло да показва същият или в значителна степен същият афинитет и готовност за свързване към антигена както родителското антитяло. В идеалния случай афинитетът на антитялото не бива да е по-малък от 10 % от афинитета на родителското антитяло, за предпочитане не по-малко от 30 % и в най-добрия вариант - не по-малко от 50 % от този на родителското антитяло. В науката са известни методи за анализ на афинитета на свързване с антиген и те включват анализ за отчитане на 1/2 от максималния афинитет на свързване, анализ на конкурентна основа и анализ на Scatchard. В приложението са описани подходящи анализи за оценка на свързването на антигена.

Настоящото изобретение е насочено към хуманизирани моноклонални антитела, които свързват човешки LT-P-R и тяхната употреба като терапевтични агенти. Настоящото изобретение е насочено и към нуклеотидни последователности, които кодират въпросните хуманизирани антитела, и тяхната експресия в рекомбинантни клетки-гостоприемник. По-специално, настоящото изобретение е насочено към хуманизирани антитела, получени от миши СВЕ11, който специфично се свързва с човешки LT-3-R.

Мишият СВЕ11 (тСВЕИ) е миши IgGl, капа антитяло изолирано от мишка, имунизирана със слят белтък човешки LT-p-RIg (Browning et al., J. Immunol. 154:33 (1995)). mCBEll активира функционално LT-p-R както in vitro, така и in vivo (PCT/US96/01386) и изолирането му и антитуморните му качества са описани (Browning et al., J. Exp. Med. 183:867 (1996). Хибридомната клетъчна линия, която произвежда шСВЕ 11, е предварително депозирана в Американската Колекция за Типови Култури (АТСС), в съответствие с клаузите на Будапещенския Договор, от Заявителите на настоящото изобретение и заведена под номер НВ 11793 (PCT/US96/01386). Заявителите са показали също така, че кръстосаното свързване на рецептор LT-β с различни агонистични анти-LT-P-R антитела го активира (т.е. той може да наподобява ефектите на природните лиганди) (PCT/US96/01386). Активирането на рецептора на свой ред е показано, че инхибира туморния растеж на редица туморни модели in vivo, за които рецепторът LT-β се експресира. LT-β рецепторът е показано, че се експресира в редица ракови клетки, включително например Не Малки Клетки

Белодробни Ракови Клетки (НМКБРК), Колоректални Ракови Клетки (КРК), Клетки от Рак на Гърдата, както и в клетки от простатата, стомаха, кожата, корема, езофагуса и пикочния мехур. Не ограничаващи примери за тумори, които се инхибират от агонистични ΕΤ-β-R антитела, включват следните масивни тумори: НТ29 аденокарцинома на дебелото черво, НТЗ карцином на шийката на матката, АЗ 75 меланома, MDA-231 рак на гърдата и първични тумори на дебелото черво. Ето защо агонистичните LT-3-R антитела притежават качества, които ги правят полезни за лечението на заболявания, при които активирането на ΕΤ-β-R и/или модулирането на взаимодействието ΕΤ-β-R / ΕΤ-β-R лиганд е желателно, включително например, за лекуване или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия в субекти (напр. хора).

Хуманизирането на тСВЕИ моноклонално антитяло, включително анализите по моделиране и обратните мутации, необходими за запазване в значителна степен качествата на свързване на mCBEl 1 моноклоналното антитяло, са описани тук. Анализ по моделиране на мишите променливи региони

РОК съдържа остатъците, които с най-голяма вероятност свързват антигена и трябва да се запазят в наново моделираното антитяло. РОК се определят по последователността съгласно Rabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5^th Edition, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. РОК се класифицират в канонични класове (Chothia et al., 1989 Nature, 342, 877-883), при които ключови остатъци определят в голяма степен структурната конформация на РОК примката. Тези остатъци почти винаги се запазват в наново моделираното антитяло. Полипептидната последователност на променливия домен от леката верига на тСВЕИ е показана и в нея РОК е подчертана и позиционните номера на остатъците са обозначени съгласно общоприетото номериране по Кабат:

1	DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKAGQDIK SYLSWYQQKP
41	WKSPKILIYY ATRLADGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLES
81	DDTATYYCLQ HGESPWTFGG GTKLEIK
(SEQ	ID N0:1)

Полипептидната последователност на промеливия домен от тежката верига на шСВЕП е показана по-долу и в нея РОК е подчертана и позиционните номера на остатъците са обозначени съгласно общоприетото номериране по Кабат.

1	EVQLVESGGG	LVKPGGSLKL	SCAASGFTFS	DYYMYWFRQT
41	PEKRLEWVAT	ISDGGSYTYY	PDSVKGRFTI	SRDNAKNNLY
81	LQMSSLKSED	TAMYYCVREE	NGNFYYFDYW	GQGTTVTVSS
(SEQ	ID N0:2)

Променливите региони на леката и тежката вериги на mCBE 11 са сравнени с консенсусните последователности на миши човешки подгрупи (Johnson, G., Wu, Т. Т. Kabat Database and its application: future directions Nucleic Acid Research, 29, 205-206, 2001; Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250 (1970)) c помощта на програма FASTA. Променливият регион на леката верига на тСВЕИ е член на миша субгрупа V с идентичност 74 % на съвпадение на 110 аминокиселини и шСВЕП е член на миша субгрупа Hid с идентичност 79 % на· съвпадение на 132 аминокиселини.

Променливата лека верига отговаря на човешка субгрупа III с идентичност 71 % на съвпадение на 131 аминокиселини.

РОК, съгласно настоящото изобретение, се класифицират в канонични класове. L1 примката попада в каноничен клас 2 (примки с 11 остатъка), L2 - в клас 1 (7 остатъка) и L3 - в клас 1 (9 остатъка). Н1 примката попада в клас 1 (5 остатъка) и Н2 примката - в клас 3 (17 остатъка). НЗ примката не принадлежи към никой каноничен клас.

Остатъците от частта между променливите региони на леката и тежка вериги са определени (Chothia et al., 1985 J. Mol. Biol., 186, 651-663). Те обикновено се запазват в наново моделираното антитяло. В mCBEl 1 няколко от тези остатъци са нетипични за тази междинна област, а именно S34, 146, L89 К91 във VL и Y35, F37, V93, Е95 във VH.

Нетипичните рамкови остатъци бяха определени чрез анализ на всички миши и човешки последователности от променливите Q региони, съдържащи се във версията от септември 1999 на база данните на Kabat [NCBI, NIH]. Смята се, че разликите, специфични за шСВЕИ, могат да служат за индикация на соматични мутации, които повишават активността на свързване, ако тези разлики са близко до мястото на свързване. Нетипичните миши остатъци, разположени отдалечено от мястото на свързване, и нетипичните човешки остатъци бяха отстранени, за да не създадат имуногенни епитопи в наново моделираното антитяло. Нетипичните рамкови остатъци, открити в шСВЕИ бяха КЗ, МИ, Y12, W41, Q69, S72, D81, Т83 в леката верига и F37, Т40, Е42, А49, N77 в тежката верига. V Докато повечето от тези остатъци не бяха запазени в хуманизираните СВЕ11 антитела, някои от тези нетипични рамкови остатъци бяха запазени, включително например F37 и А49 в тежките вериги.

Моделиране на структурата на променливите региони

Леката и тежката вериги, съгласно настоящото изобретение, бяха съпоставени с база-данни за определяне на структурните рамки, които трябва да се използват, за конструиране на триизмерните модели на леката и тежката вериги на mCBEl 1. Използвайки BLAST беше установено, че леката верига показва 93 % идентичност на

последователността с моноклонално мише антитяло 5g9 (IAHW) и че тежката верига показва 81 % идентичност на последователността с миши IGGA2 Fab фрагмент (Fab 17/9) (11FH). Използвайки пакета за молекулярно моделиране SyByl (Tripos Inc.) триизмерните структури на леката и тежката верига бяха построени с помощта на 5g9 от леката верига и IGGA2 Fab фрагмента от тежката верига, съответно. Структурната цялост на моделите беше оценена на конзола и беше приета като смислена.

Дизайн на наново моделираните променливи региони

Беше използван подходът подобие на хомоложността за подбор на рамките на човешки акцептор, който да “приеме” тВСЕП РОК. База-данните по Kabat и база-данните на NCBI, ENTRZ (The National Institute of Health) бяха изследвани c помощта на софтуеърната програма BLAST. Изборът на рамки на човешки акцептор беше направен въз основа на идентичност на последователностите на рамките за шСВЕН и човешките рамки (с изключение на рамките за предварително хуманизираните антитела).

Евентуалният избор на човешки рамки беше измежду антитела TNF-ATCL (kabat ID 004770) срещу туморен некрозисен фактор алфа (Griffiths et al., 1993 EMBO J. 12:725-734) за променливата лека (VL) верига (човешка капа субгрупа I) и антитяло FLA-IgG’CL (kabat id 040003) с неизвестна специфичност (Malisan et al., 1996 Blood 87:717-724) за променливата тежка (VH) верига (човешка субгрупа III). Човешките VL и VH рамки притежават разлики от 15 и 11 остатъка в сравнение с мишите последователности.

Обратни мутации на човешките рамки

Най-непредвидимата процедура при хуманизирането на моноклонални антитела е идентифицирането на критичните рамкови остатъци от родителското антитяло (т.е. в настоящия случай, родителското тяло е с миши произход), които трябва да се запазят, за да се запазят в значителна степен способностите за свързване на родителското антитяло, като същевременно се намали до минимум потенциалната имуногенност на полученото антитяло. Особено важно е да се запазят каноничните остатъци, междинните остатъци участващи в пакетирането, и нетипичните миши остатъци, които са близо до мястото на свързване. В допълнение, важни са остатъците в «Зоната на Верние» (които образуват платформа, върху която се разполага РОК) (Foot & Winter, 1992 J. Mol. Biol. 224, 487-499) и тези, близко до РОК НЗ. Мутациите, възвръщащи родителското антитяло (т.е. обратни мутации от човешки рамкови остатъци към миши) се означават тук като обратни мутации.

Конструирани са три версии на наново моделирана променливата лека верига (hu-CBEl 1 VL) и четири версии на наново моделирана променлива тежка верига (hu-CBEl 1 VH). По принцип първата версия съдържа най-много обратни мутации и третата версия съдържа най-малко (т.е. тя е най-хуманизирана), с изключение на четвъртата версия на hu-CBEl 1 VH. Настоящото изобретение обсъжда и хуманизирани антитела, получени от тСВЕН, които съдържат променливи леки вериги, избрани измежду променливите леки вериги, описани по-долу (т.е. VL#1, VL#2, VH#2 или VH#4) в различни комбинации.

(А) Лека верига:

Q (глутамин)->К (лизин) Запазен в първата версия, тъй като предишни опити по наново моделиране са показали (напр. Kolbinger et al, 1993 Prot. Eng., 6, 971-980), че може би е важен за свързването на антигена или за конформацията на РОК.

G (глициh)->W (триптофан) Запазен в първата и втората версии.

L (левцин)->1 (изолевцин) Запазен в първата и втората версии, това е едновременно остатък от междинната част и от зоната на Верние. В допълнение, това е нетипичен остатък, срещащ се 9 пъти в мишите последователности и веднъж в човешките. Вероятно повлиява пакетирането на променливите вериги и може би влиза в контакт с РОК.

Т (треонин)->(2 (глутамин) Този остатък е от зоната на Верние и може да повлияе конформацията на РОК. Промяната от късо Т на по-дълго Q може също така да означава, че той влиза в контакт с антигена. Q е нетипичен остатък, срещащ се 58 пъти в мишка и два пъти в човек. Запазен е в първата версия.

F (фенилаланин)->У (тирозин) Този остатък е с канонична позиция е беше запазен при всички версии. Той е относително нетипичен за човешките последователности, срещащ се само 25 пъти.

(Б) Тежка верига:

V (валин)->Р (фенилаланин) Запазен е в първата, втората и четвъртата версии. F в тази позиция е нетипичен, срещащ се само 15 пъти в мишка и 18 пъти в човек. Той е също така остатък от междинната част.

А (аланин)->Т (треонин) Запазен беше в първата версия. Мутации в тази позиция бяха опитани в 5 предишни опита по хуманизиране, въпреки че никога не е описана промяна на А в Т. Един пример е промяната на А в S при фината обработка на ВгЕ-3 (Couto et al, 1994 Hybridoma, 13, 215-219), при която афинитета на свързване беше подобрен, въпреки че причината за това никога не беше установена. В този случай тежката верига беше също от човешка субгрупа III.

S (серин) ->А (аланин) Този остатък е в РОК и зоната на Верние и беше запазен във всички версии.

V (валин)->М (метионин) Беше запазен в първата версия. Тази позиция беше подложена на обратно мутиране в няколко експеримента по хуманизиране. Беше запазен в първата версия.

А (аланин)->У (валин) Тази позиция е едновременно в междинния участък и в зоната на Верние. Беше запазен в първата и втората версии.

Аминокиселинната и нуклеотидна последователности на всяка от различните версии на променливите лека и тежка вериги са както следва:

Наново моделирани променливи леки вериги

Наново моделирани променлива лека верига на СВИ - версия 1 лека верига (VL#1) (Плазмид pAND066)

GATATTAAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT б 0

DIKMTQSPSSLSASVGDRVT ааЗ

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA120

ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP

121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA18 0

WKAPKILIYYATRLADGVPS аа41 аа46

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT2 4 0

RFSGSGSGQDYTLTISSLQP ааб9 аа71

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA3 0 0

EDFATYYCLQHGES PWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321

G Τ K L Е I K

SEQ ID ЕЮ:3-представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VL# 1.

SEQ ID N0:4- представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VL# 1.

Наново моделирани променлива лека верига на СВ 11 - версия 2 лека верига (VL#2) (Плазмид pAND070)

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 6 0

DIQMTQSPSSLSASVGDRVT

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120

ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP

121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180 WKAPKILIYYATRLADGVPS аа41 аа46

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240

RFSGSGSGTDYTLTISSLQP аа71

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300

EDFATYYCLQHGESPWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321

G Τ К L Е I К

SEQ ID N0:5- представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VL#2.

SEQ ID N0:6- представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VL#2.

Наново моделирани променлива лека верига на СВ11 - версия 3 лека верига (VL#3) (Плазмид pAND074)

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 6 0

DIQMTQSPSSLSASVGDRVT

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120

ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP

121 GGGAAAGCGCCTAAGCCTCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180

GKAPKLLIYYATRLADGVPS

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 24 0

RFSGSGSGTDYTLTISSLQP аа71

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300

EDFATYYCLQHGES PWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321

G Т К L Е I К

SEQ ID N0:7- представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VL#3.

SEQ ID N0:8- представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VL#3.

Наново моделирани променливи тежки вериги

Наново моделирани променлива тежка верига на СВ11 - версия 1 тежка верига (УН#1) (Плазмид pAND067)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60

EVQLVESGGGLVKPGGSLRL

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGACT120

SCAASGFTFSDYYMYWFRQT аа37 аа4 0

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT180 PGKGLEWVATISDGGSYTYY аа49

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC2 4 0

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG30 0

LQMSSLRAEDTAMYYCVREE аа89 аа93

01 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA3 6 0 NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID N0:9- представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH# 1.

SEQ ID N0:10- представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH# 1.

Наново моделирани променлива тежка верига на СВ11 - версия 2 тежка верига (УН#2) (Плазмид pAND071)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60

EVQLVESGGGLVKPGGSLRL б1 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC12 Ο

SCAASGFTFSDYYMYWFRQA aa37

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT18 Ο PGKGLEWVATI SDGGSYTYY aa4 9

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC240

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG3 0 0

LQMSSLRAEDTAVYYCVREE aa93

SEQ ID N0:11- представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH#2.

SEQ ID N0:12- представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH#2.

Наново моделирана променлива тежка верига на СВ11 - версия 3 тежка верига (УН#3) (Плазмид pAND075)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 EVQLVESGGGLVKPGGSLRL

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTGCGCCAGGCC12 0

SCAASGFTFSDYYMYWVRQA

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT180

PGKGLEWVATISDGGSYTYY aa4 9

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC24 0

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG3 0 0

LQMSSLRAEDTAVYYCAREE

SEQ ID N0:13- представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH#3.

SEQ ID N0:14- представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH#3.

Наново моделирана променлива тежка верига на СВ11 - версия 4 тежка верига (УН#4) (Плазмид pAND090)

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC12 0

SCAASGFTFSDYYMYWFRQA аа37

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT180

PGKGLEWVATISDGGSYTYY aa49

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC24 0

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG3 0 0

LQMSSLRAEDTAVYYCAREE

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA3 6 0 NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID N0:15- представлява нуклеотидната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH#4.

SEQ ID N0: представлява аминокиселинната последователност на посочената по-горе наново моделирана VH#4.

Бяха изготвени антитела, състоящи се от различни версии на леката и тежката вериги, и използвани за по-нататъшни изследвания. Например, беше изготвено антитяло, състоящо се от наново моделирана лека променлива верига на huCBEl 1, версия 3 (VL#3) и наново моделирана тежка променлива верига на huCBEll 4, версия 4 (VH4), наречено huCBl 1#4 или hCBEl 1, и клетъчните линии Е46.4 и Е77.4, произвеждащи антитялото бяха депозирани в АТСС (номер на АТСС патентна заявка РТА-3357 и 3765, съответно).

Изобретението допълнително представя еквиваленти и варианти на наново моделирани VH и VL последователности, т.е. тези, съдържащи една или повече замествания на консервативни аминокиселини, които не повлияват в значителна степен свързването на LT-P-R. Хуманизираните LT-p-R антитела, съдържащи тези хуманизирани променливи последователности от леките и тежки вериги, могат да се получат чрез рекомбинантни методи, както е описано в Примерите.

Употреби

Хуманизираните анти-LT-P-R антитела, съгласно настоящото изобретение, се употребяват при лечение на болестни състояния, при които активирането на LT-P-R е с терапевтично значение. Такива състояния включват лекуване или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия.

В един вариант на изобретението се предлага метод за лечение на бозайници (т.е. хора) в състояние, свързано с нежелана клетъчна пролиферация, чрез даване на бозайника на терапевтично ефективно количество от препарат, характеризиращ се с това, че се състои от хуманизирани LT-P-R антитела, съгласно настоящото изобретение.

В друг вариант на изобретението се предлага метод за лечение на бозайници (т.е. хора) с масивен тумор (т.е. карцином), който свръхекспресира LT-P-R, характеризиращ се с това, че включва даване на въпросния бозайник на хуманизирано LT-P-R антитяло, което се свързва с LT-P-R, в количество, ефективно да намали обема на тумора. Примери за ракови образувания, чиято клетъчна пролиферация се модулира от LT-P-R, могат да се изброят, измервайки in vitro нивото на LT-P-R и/или LT-P-R лиганд (т.е. LTccip2 или LIGHT) експресирани в библиотеки от туморни тъкани. Библиотеките от туморни тъкани, в които LT-P-R и/или LT-P-R лиганд (т.е. LTaip2 или LIGHT) се експресират силно, са кандидати за това. Типовете тумори, визирани в настоящото изобретение, включват масивни тумори, в това число, но без ограничения не малки клетки на белодробен рак (НМКБР), колоректален рак (КР), рак на гърдата, както и такъв на простатата, стомаха, кожата, корема, езофагуса и пикочния мехур.

Хуманизираните антитела, обект на настоящото изобретение, които се използват за лечение на състояния, свързани с нежелана клетъчна пролиферация, по-специално туморна терапия, преимуществено инхибиран туморен клетъчен растеж, измерен например като намаление в обема на тумора, по-високо от 10%, 20%, 30% или 40% и с най-голямо преимущество, по-голямо от 50%. Хуманизираните антитела се получават чрез скрининг (виж например обсъждането в Пример 3). Например, хуманизирани антитела за употреба, съгласно настоящото изобретение, могат да се подберат на основата на намален обем на тумора по отношение на нетретирани ракови клетки (напр. по-високи стойности от около 10%, 20%, 30%, 40% или 50%).

Настоящото изобретение осигурява също така фармацевтични С състави, характеризиращи се с това, че включват хуманизираното антитяло, съгласно настоящото изобретение, и фармацевтично приемлив носител. Подходящи носители например, и техните състави са описани в Remington’ Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., 1980, Mack Publishing Co., под редакцията на Oslo et al. Обикновено се използва подходящо количество от фармацевтично приемлива сол в състава за осигуряване на изоосмотична среда. Примери за носители включват буфери като физиологичен разтвор, разтвор на Рингер и глюкозен разтвор. pH на разтвора за предпочитане е между 5 и 8 и по-специално между 7.4 и 7.8. други носители включват Г препарати с продължително освобождаване, такивакато полупропускливи носители от твърди хидрофобни полимери, които носители са във формата на частици, напр. липозоми, филм или микрочастици. Ясно е за тези с опит в областта на техниката, че определени носители може да бъдат по-предпочитани в зависимост от например начина на даване или концентрацията на фармацевтичния състав, които ще се дава.

Даването може да стане чрез инжекция (напр. интравенозно, интраперитонеално, подкожно, интрамускулно) или чрез друг метод,

като преливане, който осигурява доставяне до кръвния ток в ефективна форма.

Хуманизираните антитела, съгласно настоящото изобретение, могат да се дават в ефективна доза за лечение на определено клинично състояние. Определянето на предпочитан фармацевтичен състав и на терапевтично ефективна доза като режим за прилагане е известно на онези с опит в тази област на техниката, имайки предвид например теглото и състоянието на пациента, степента на желаното лечение и толерантността на пациента към лечението. Например, ефективната доза би била в обхват от около 0.05 до около 100 милиграма за килограм телесно тегло на ден. По-специално, около 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, или 25 mg, за килограм телесно тегло на ден. Алтернативно, около 0.05 до около 100 милиграма, по-специално, около 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, или 25 mg, за килограм телесно тегло на седмица. Алтернативно, около 0.05 до около 100 милиграма, поспециално, около 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, или 25 mg, за килограм телесно тегло на две седмици. Алтернативно, около 0.05 до около 100 милиграма, по-специално, около 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, lmg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, или 25 mg, за килограм телесно тегло на три седмици. Алтернативно, около 0.05 до около 100 милиграма, по-специално, около 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, или 25 mg, за килограм телесно тегло на четири седмици.

Практическата част на настоящото изобретение ще използва, ако не е специално посочено, конвенционални техники на клетъчната биология, клетъчните култури, молекулярната биология, микробиологията, рекомбинантната ДНК, белтъчна химия и имунология, които са познати на тези с опит в дадената област на техниката. Такива техники са описани в литературата. Виж, например Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; U.S. Patent No 4,683,195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I.Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984, (M.J. Gait, ed.), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds ), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Следните примери се представят, за да илюстрират настоящето изобретение и не бива да се приемат като ограничаващи.

ПРИМЕРИ:

Пример 1

Конструиране и експресия на chCBEl 1

Беше използвана сДНК, кодираща СВЕ11 променливия регион от тежката и леката верига, за конструиране на вектори за експресията на миши-човешки химери (chCBEll), в които mCBEl 1 променливите региони са свързани с човешки IgGl и капа константни региони. За конструиране на химерата на тежката верига 0.36 кв Pstl-BstEII фрагмент от субклон pEAG979 на тежката верига на СВЕ11 беше субклониран в дефосфорилирания 2.82 кв Pstl-BstEII векторен сегмент от 5а8 pLCB7 плазмид на тежката верига (5а8 е молекулярно клонирано СО4-специфично моноклонално антитяло, преди това характеризирано в Biogen), за добавяне на сигнална последователност за миша тежка верига и сплайс-донорен сайт към променливия регион на тежката верига на muCBEl 1. В този плазмид, наречен pEAG979, зрелият азотен край на тежката верига се различава по 2 остатъка от N-крайната последователност на пречистената автентична СВЕ11 тежка верига, получена чрез Edman деградация, предварително определена по този начин от праймерите по време на PCR. За коригиране на N-края на тежката верига, pEAG979 беше подложен на мутагенез от типа “елиминиране на уникален сайт (ЕУС)”, използвайки кита за такъв мутагенез, предложен от Amersham Pharmacia Biotech USE, и спазвайки процедурите по употребата му, описани там. Мутираните плазмиди бяха идентифицирани чрез скрининг за интродуцирани Avail, PstI и Rsal промени. Последователността на тежката верига в получения плазмид pEAG981 беше потвърдена чрез ДНК секвениране. NotlHindlll фрагмент от променливия регион на тежката верига с големина 0.44 кв, от pEAG964 и 1.21 кв Hindlll-Notl фрагмент от pEAG964, съдържащ човешки IgGl постоянен регион, бяха субклониране в Notl сайта на рСЕР4 (Invitrogen) EBV експресионен вектор, производен на рСН269, образувайки по този начин плазмид pEAG983.

За конструиране на химера на леката верига, 0.11 кв Notl-EcoRV фрагмент от плазмид pMDR985 и 0.37 кв EcoRV-BamHI фрагмент от плазмид pEAG967, съдържащ променлив домен на леката верига на СВЕ11 бяха субклонирани в дефосфорилиран 2.94 кв Notl-BamHI векторен фрагмент на pBluescriptIISK+ клониращ вектор на Stratagene, за да се добави сигнална последователност за миша лека верига и 5’ Notl сайт в получения плазмид pEAG978.1ози плазмид беше подложен на ЕУС мутагенез използвайки кита за такъв мутагенез, предложен от Amersham Pharmacia Biotech USE, и спазвайки процедурите по г употребата му, описани тамц с мутагенни праймери, които кодират

V3K заместване, такова че да съответства на N-края на домена на автентична СВЕ11 лека верига. Мутираните плазмиди бяха идентифицирани чрез скрининг за интродуциране на Bglll, EcoRV и Msel промени. Последователността на леката верига в получения плазмид pEAG980 беше потвърдена чрез ДНК секвениране. Notl-Bgll фрагмент от променливия регион на леката верига с големина 0.41 кв, от pEAG980 и 0.68 кв BclI-Notl фрагмент от pEAG963, съдържащ домен от човешки капа постоянен регион на леката верига, бяха субклонирани в Notl сайта на рСЕР4 (Invitrogen) EBV експресионен вектор, производен на рСН269, образувайки по този начин плазмид Чш, pEAG982.

Експресионните вектори (pEAG983 за тежката верига на chCBEll и pEAG982 за леката верига на chCNEll) бяха котрансфектирани в 293-EBNA клетки и трансфектираните клетки бяха изследвани за секреция на антитела и специфичност (празният вектори ch5c8 (молекулярно клонирано СО154-специфично моноклонално антитяло, преди това характеризирано ото Вю°еп)-трансфектираните клетки служат за контроли). Уестърн блот анализ (разработен с античовешки антитела към тежката и леката вериги) на белтък А имунопреципитати от лизати на цели клетки и физиологична среда, показаха че трансфектираните с chCBEl 1 клетки синтезират и ефективно секретират тежки и леки вериги на нива, подобни на ch5c8трансфектираните клетки. FACS анализ на ЕТ-Р-И-експресиращи НТ29 клетки, оцветени със среда за трансфектирани клетки, показват че антитялото chCBEll се свързва и показва модел на оцветяване, подобен на този на muCBEll, докато среда от mock- и ch5c8трансфектирани клетки не може да оцвети LT-P-R върху НТ-29 клетки. Химерични СВЕ11, продуцирани чрез временна ткрансфекция, бяха ζ*/ пречистени и показаха индукция на секреция на IL-8 от ΕΤ-β-Rекспресиращи АЗ75 меланома клетки и инхибиране на растежа на WiDRr аденокарциномни клетки в голи мишки.

Пример 2

Конструиране и експресия на huCBEl 1

Конструирането на наново моделирани променливи домени за продукция на хуманизирано СВЕ11 (huCBEll) бе проведено както е описано по-горе. Изборът на рамките за човешки рецептор бе извършен на принципа на хомоложно сходство: човешко капа mAb TNF-A 1 от субгрупа I за леката верига (Griffiths et al., 1993) и човешко mAb FLAIgG от субгрупа III за тежката верига (Malisan et al., 1996). Бяха конструирани три версии на всяка една от променливите леки и четири версии на променливите тежки наново моделирани вериги. По принцип първите версии съдържаха най-много обратни мутации към миши донорни последователности, докато последните версии съдържаха наймалко такива (т.е. те са “най-хуманизирани”).

huCBE 11 променливите региони бяха изготвени чрез мутагенез от типа елиминиране на уникални места (ЕУМ) с помощта на ЕУМ кит за мутагенез на Amersham Pharmacia Biotech, следвайки протокола в инструкциите на производителя, с помощта на плазмиди за променливия регион на chCBEll като начални матрици. Мутагенните праймери за промените на рамката (ПР) са описани по-долу. Беше използвана сДНК последователност от рамките на човешкия акцептор (Kabat database #004770 за леката верига и Rabat database #040003 за тежката верига) с внедрени тихи мутации за получаване на промени в местата за срязване, които да улеснят идентифицирането на мутиралите плазмиди. Мутантните плазмиди бяха идентифицирани чрез скрининг за внасяне на промени в местата за срязване. Последователностите на сДНК на променливия регион в получените плазмиди бяха потвърдени чрез ДНК секвениране.

VH#1 използва pEAG981 матрица със следните праймери: FR1 праймер 5’ GCC TGG AGG GTC ССТ GAG GCT СТС CTG TGC AGC СТС 3’ (SEQ ID N0:17), който внедрява Bsu36I място за срязване; FR2 праймер 5’ GTT TCG CCA GAC ТСС GGG AAA GGG GCT GGA GTG GGT CGC ААС 3’ (SEQ ID N0:18), който внедрява Neil и Hpall места; и FR3 праймер 5’ CAG AGA CAA TGC CAA GAA CAG ССТ СТА ССТ GCA GAT GAG CAG ССТ GAG GGC TGA GGA CAC AGC CAT G 3 ’ (SEQ ID NO: 19), който внедрява Bsu36I и PstI места и отстранява Rsal *- мястото за срязване. Полученият VH#1 плазмид беше означен като

PAND067.

VH#2 използва pAND067 матрица със следните праймери: FR2 праймер 5’ CAT GTA TTG GTT TCG CCA GGC CCC GGG AAA GGG GCT GG 3’ (SEQ ID N0:20), който внедрява Smal място за срязване; и FR3 праймер 5’ GGG CTG AGG АСА CAG CTG TGT ATT ACT GTG TAA GAG 3’ (SEQ ID N0:21), който внедрява PvuII място за срязване. Полученият VH#2 плазмид беше означен като pAND071.

VH#3 използва като матрица плазмид pAND067 със следните праймери: FR2 праймер 5’ GTG ACT АТТ АСА TGT ATT GGG TGC GCC AGG ССС CGG GAA AGG GGC TGG AG 3’ (SEQ ID N0:22), който внедрява Smal и Hhal места за срязване; и FR3 праймер 5’ GAG GGC TGA GGA CAC AGC TGT GTA TTA CTG CGC AAG AGA GGA

GAA TGG TAA C 3’ (SEQ ID N0:23), който внедрява PvuII и FspI места за срязване. Полученият VH#3 плазмед беше означен като pAND075.

Експресионните вектори за тежките вериги на huCBEl 1 бяха изготвени чрез субклониране на 0.44 kb Notl-Hindlll фрагменти от променливия домен на тежката верига от pAND067, pAND071, или pAND075, и 1.21 kb Hindlll-Notl фрагмент от плазмид pEAG964, съдържащ постоянен регион от човешки IgGl, субклониран в място за срязване Notl в плазмид рСЕР4 EBV - експресионен вектор, производен на плазмид рСН269, в резултат на което се получиха експресионните вектори за тежка верига pAND069 (VH#1), pAND073 (VH#2), и pAND077 (VH#3).

VL#1 използва като матрица плазмид pEAG980 със следните праймери: FR1 праймер 5’ СТТ GCA AGT GAT AGT GAC ССТ GTC ТСС CAC CGA TGC AGA CAA GGA TGA TGG AGA CTG GGT CAT С 3’ (SEQ ID N0:24), който отстранява Hinfl и Nsil места на срязване; FR2 праймер 5’ CAT ААТ AGA ТСА GGA ТСТ TAG GCG СТТ ТСС ATG GTT ТСТ GCT G 3’ (SEQ ID N0:25), който внедрява Haell и Hhal места на срязване; и FR3 праймер 5’ GTA GAC AGT ААТ AAG TTG CGA ААТ ССТ CAG GCT GCA GGC TGC TGA TGG TTA GAG TAT

ААТ СТТ GCC CAG АТС 3’ (SEQ ID N0:26), който внедрява Bsu36I, Ddel, и PstI места за срязване. Полученият плазмид VL#1 беше наречен pAND066.

VL#2 използва като матрица pAND066 със следните праймери: FR1 праймер 5’ GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG АТА ТСА ССТ CTG GCA ССТ G 3’ (SEQ ID N0:27), който внедрява EcoRV място за срязване; и FR3 праймер 5’ GAT GGT TAG AGT АТА ATC TGT АСС AGA ТСС ACT GCC ACT G 3’ (SEQ ID N0:28), който внедрява Rsal място за срязване. Полученият плазмид VL#2 беше означен като pAND070.

VL#3 използва плазмид pAND066 като матрицасъс слезните праймери: FR1 праймер 5’ GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG АТА ТСА ССТ CTG GCA ССТ G 3’ (SEQ ID N0:29), който внедрява EcoRV място за срязване; FR2 праймер 5’ САА ССТ TGT TGC АТА АТА GAT CAG AAG СТТ AGG CGC ТТТ ССС TGG ТТТ CTG CTG GTA СС 3 ’ (SEQ ID N0:30), който внедрява Hindlll място за срязване и отстранява Ncol и Styl местата за срязване; и FR3 праймер 5’ GAT GGT TAG AGT АТА ATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G 3’ (SEQ ID N0:31), който внедрява Rsal място за срязване, полученият плазмид VL#3 беше означен като pAND074.

Експресионните вектори за леките вериги на huCBEl 1 бяха изготвени чрез субклониране на 0.41 kb Notl-Bglll фрагменти от променливите домени на леката верига от pAND066, pAND070, или pAND074 и 0.68 kb BclI-Notl фрагмент от плазмид pEAG963, съдържащ постоянен домен на човешка капа лека верига, субклонирани в Notl мястото за срязване на експресионен вектор рСЕР4 EBV - производен плазмид рСН269, за да се получат експресионни вектори pAND068 (VL#1), pAND072 (VL#2), и pAND076 (VL#3).

Експресионните вектори бяха котрансфектирани в 293-EBNA клетки и трансфектираните клетки бяха тествани за секреция на антитела и специфичност (като негативна контрола служеха

трансфектирани с празен вектор клетки). Уестърн блот анализ (проведен с анти-човешки антитела към тежка и лека вериги) на белтък А имунопреципитати с клетъчни лизати и физиологична среда показа, че huCBEl 1-трансфектирани клетки синтезират и ефективно секретират тежки и леки вериги на нива, подобни на chCBEllтрансфектираните клетки. FACS анализ на ΕΤ-β-R -експресиращи НТ29 клетки, оцветени със физиологична среда от трансфектирани клетки показват, че в сравнение с chCBEll huCBEll#3 mAb се свързва не толкова добре, колкото huCBEll#l и huCBEll#2 mAbs (Таблица 1 подолу), където huCBEl 1#1 е (VL#1 с VH#1); huCBE#2 е (VL#2 с VH#2) и huCBEl 1#3 е (VL#3 с VH#3). Котрансфекциите от типа «смесване и напасване» предполагат, че намаляването може да се дължи на VH#3, който се различава от VH#2 по два остатъка в рамката: FR2 F37V и FR3 V93A. За да се изследват индивидуалните приноси на всяка от тези промени, бяха конструиране нови експресионни вектори за тежките вериги. Плазмид pAND089, вариант F37V на VH#2, беше изготвен чрез субклониране на 311 bp Notl-PstI фрагмент от pAND075, 126 bp PstlHindlll фрагмент от pAND071, и 1.21 kb Hindlll-Notl фрагмент от плазмид pEAG964 в Notl място за срязване от експресионен вектор рСЕР4 EBV - производен плазмид рСН269. Плазмид pAND090, вариант V93A на VH#2, беше конструиран чрез субклониране на 311 Ьр Notl-PstI фрагмент от pAND071, 126 bp Pstl-Hindlll фрагмент от pAND075, и 1.21 kb Hindlll-Notl фрагмент от плазмид pEAG964 в Notl мястото за срязване на експресионен вектор рСЕР4 EBV - производен плазмид рСН269. Тези Н2/НЗ химерични тежки вериги бяха котрансфектирани в 293-EBNA клетки с VL#2 и VL#3. FACS анализ показа, че вариантът V93A Н2 възстановява LT-p-R свързването, когато се сдвои с VL#3 (Таблица 1, по-долу). Сдвояването на pAND076 и pAND090 беше наречено huCBEl 1#4 (Таблица 1, по-долу).

Котрансфекцията на 293-EBNA клетки с chCBEll и huCBEll версии #1-4 беше мащабирана и получената физиологична среда събрана. Антителата бяха пречистени на белтък-А-сефароза. Пречистените mAbs бяха изследвани за активност.

Table 1. FACS оцветяване на НТ-29 клетки чрез chCBEl 1 и huCBEl 1

	Лека верига	Тежка верига	Относителна MFI
ChCBEll	pEAG982	pEAG983	1.00
HuCBEl 1#1	pAND068	pAND069	1.00
HuCBEl 1#2	PAND072	pAND073	1.00
HuCBEl 1#3	PAND076	pAND077	0.62
L2/H3	pAND072	pAND077	0.42
L3/H2	pAND076	pAND073	1.00
L2/F37V Н2	pAND072	pAND089	0.65
L2/V93A Н2	pAND072	pAND090	0.75
L3/F37V Н2	pAND076	pAND089	0.80
HuCBEl 1#4	PAND076	pAND090	1.00

Физиологичната среда на трансфектираните клетки беше използвана за оцветяване на НТ-29 клетки чрез инкубиране за 30 мин на лед, двукратно промиване с FACS буфер (PBS с 5% FBS и 0.05% натриев азид), оцветяване с РЕ-конюгирано анти-човешки IgG (Н + L), Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., за 30 мин на лед в FACS буфер, двукратно промиване на клетките с ACS буфер за анализ. Относителната MFI означава MFI, нормализирана, към тази, наблюдавана за chCBEll. Показаните данни представят средни стойности на две независими трансфекции.

Пример 3

IL-8 агонизъм към А375 клетки

Пречистени mAbs бяха анализирани за активност. Рузултатите от анализа за освобождаване на IL-8 върху А375 клетки на човешка меланома са показани на Фигура 1, която отразява измереното освобождаване на IL-8 при свързване на aHTH-LT-^-R антитела с LT-βR, повърхностно експресиран върху А375 клетки на човешка меланома. А375 клетките бяха посети при плътност lO^/ml в плаки с 96 гнезда, ^w съдържащи или разтворими антитела или антитела, прихванати върху кози анти човешки IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Плаките бяха инкубирани за една нощ. След това средата беше събрана и анализирана за IL-8 чрез ELISA.

Пример 4

Цитотоксичност към WiDr клетки

Резултатите от анализа на цитотоксичност с помощта на клетки WiDr от рак на дебелото черво върху разтворими aHTH-LT-p-R антитела в гнезда, покрити с античовешки IgG Fc, които показват че анти-ЕТ-βR антителата повишават цитотоксичността в раковите клетки, са у ' представени на Фигура 2. WiDr клетките бяха посети при плътност 6xl04/ml в присъствие на 80 units/ml huIFN-гама в плаки с 96 гнезда, съдържащи разтворими антитела или антитела, прихванати върху кози античовешки IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Плаките бяха инкубирани за 5 дни. МТТ добавен за 4 hrs и полученият преципитат беше разтварян за една нощ при инкубиране с 10 % SDS в 10 mM НС1, и оптичната плътност беше измерена на ридер за микроплаки.

Пример 5

Бяха изготвени антитела, характеризиращи се с това, че се състоят от наново моделирано huCBEll, версия 3 на лека променлива верига (VL#3) и наново конструирано huCBEll, версия 4 на тежка променлива верига, наречени huCBEll#4 или hCBEll, и клетъчната линия, която ги произвежда беше депозирана в А.Т.С.С. (АТСС патентна заявка РТА-3357). Пълните полипептидни последователности на всяка една от леките и тежки вериги, включително и постоянните домени, са както следва:

Последователност на зряло huCBEll, версия 3 на лека верига (SEQ ID NO: 32):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCKAGODIK SYLSWYQOKP GKAPKLLIYY

ATRLADGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCLQ HGESPWTFGG

101 GTKLEIK [RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV

151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC]

CDRs са подчертани; обратната мутация F71Y е в по-тъмен шрифт; постоянният домен е в скоби.

Последователност на зряло huCBEll, версия 4 на тежка верига (SEQ ID N0: 33):

V37F S49A

EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMYWFROA PGKGLEWVAT

ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMSSLRAED TAVYYCAREE

101 NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS [ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK

151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT

201 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP

251 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN

301 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ

351 VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPV

401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG]

CDRs са подчертани; обратните мутации V37F и S49A са в потъмен шрифт; постоянният домен е в скоби.

Голи мишки на възраст 6 седмици бяха инжектирани интраперитонеално с 100 pg от aHTH-LFA3 антитяло (1Е6), 100 pg анти/*·>.

V LTBR антитяло (huCBEl 1#4) или неинжектирани (контрола). След това животните бяха инжектирани подкожно с lxlO⁶ WIDR клетки от аденокарцином на дебелото черво. Третираните с huCBEll#4 мишки бяха повторно третирани веднъж седмично със 100 pg от антитялото и mCBEl 1 животните бяха повторно третирани само на 14 ден. Размерът на тумора беше измерван всяка седмица и обемът на туморната сфера изчисляван (Фигура 3). Животните бяха умъртвяване когато туморите достигнеха обем от 2.0 cm² (16 mm в диаметър) и тяхната смърт беше отбелязвана върху диаграмата за преживяемост (Фигура 4).

Пример 6 w Голи мишки на възраст 6 седмици бяха инжектирани интраперитонеално с 100 pg от анти-LTBR антитяло (huCBEll#4), или неинжектирани (контрола). След това животните бяха инжектирани подкожно с lxlO⁶ WIDR клетки от аденокарцином на дебелото черво. Третираните с huCBEll#4 мишки бяха повторно третирани веднъж седмично със 100 pg от huCBEll#4. Размерът на туморите беше измерван всяка седмица и обема на туморните сфери - изчисляван. Обемът на туморите, показан на Фигура 5 представлява средна стойност на 10 контролни животни и 8, третирани с huCBEll#4 животни. Седмичното третиране с huCBEll#4 значително инхибира растежа на WIDR туморите, имплантирани подкожно в голите мишки. Животните, третирани с антитела в продължение на 21 дни, продължаваха да показват намалени скорости на растеж две седмици след прекратяване на лечението.

Пример 7 huCBEll#4 забавя растежа на предварително култивирани

WIDR тумори и повишава преживаемостта на голи мишки, носещи WIDR тумори f*·-' 10⁶ WIDR клетки бяха предварително култивирани подкожно за it·»»· дни в голи мишки. Мишките бяха инжектирани подкожно с PBS или huCBEll#4 веднъж седмично или при ежеседмично редуване - с mCBEil. Теглата на туморите бяха изчислявани чрез размерите на дължината и ширината им и животните с тумори над 2000 mg бяха умъртвявани, като теглата на техните тумори в момента на умъртвяването бяха включени в статистическата обработка на данните. Чертите за грешка представляват стандартната грешка. Туморните тегла бяха изчислявани с помощта на формулата: (ширина х ширина х дължина )/2= тегло на тумора в mg. Резултатите са представени на и* Фигура 6 и показват, че huCBEll#4 може да забави in vivo предварително култивираните тумори.

Допълнително, туморите бяха развити и третирани, както е описано по-горе и беше изчислен процентът на преживаемост на животните. Резултатите са представени графично на Фигура 7 и показват, че huCBEll#4 може да индуцира продължаване на преживаемостта in vivo в мишки с предварително култивирани тумори.

Пример 8

Измерване на афинитета на anmumenamat

НТ-29 клетки бяха култивирани в DMEM, съдържаща Lглутамин, не незаменими аминокиселини, натриев пируват и 10 % зародишен серумен албумин. Клетките бяха промити веднъж с PBS и отстранени от плаките чрез инкубиране при стайна температура за пет минути с PBS + 20 П1М EDTA. Клетките бяха центрофугирани при 1000 rpm (110 х g) за пет минути и суспендирани до клетъчна плътност lx 10⁷cells/mL в PBS.

СГ HuCBEll#4 aHTH-LTPR антитяло и хуманизирано анти-СО40Ь като негативна контрола бяха разредени в PBS и беше приготвена серия от 12 последователни разреждания 1:4 до крайна концентрация в обхват 2.37 рМ - 10 μΜ. 100 μΕ клетъчна суспензия и 100 μΕ антитяло от определено разреждане бяха добавяне заедно към всяко гнездо на плака с 96 гнезда с V-образно дъно. Антитялото и клетките бяха инкубирани при 4°С за 2 часа. Плаките бяха центрофугирани при 1000 rpm (110 х g) за 10 минути при 4°С. Супернатантите бяха отстранени и клетъчните утайки промити шест-кратно със студен PBS.

Конюгат на кози античовешки IgG-фикоеритрин (Jackson V· Immunoresearch) беше разреден 1:100 в PBS и 200 pL бяха добавени към всяко гнездо. Клетките бяха инкубирани с това вторично антитяло за един час при 4°С, центрофугирани както е описано по-горе и еднократно промити със студен PBS. След това клетките бяха прехвърлени в епруветки от полистерен. Интензивността на флуоресценцията беше измерена на апарат FACS Calibur (Beckton Dickinson).

Средните стойности на флуоресценцията на оцветяването за aHTH-CD40L неспецифично свързваща се контрола бяха плотирани срещу концентрацията на антитялото в Delta Graph. Стойностите бяха приравнени на права линия и теоретичните стойности за неспецифично свързване при концентрацията на всяко антитяло бяха извлечени от всяка точка за серията разреждания на huCBEl 1#4.

След това тези стойности за специфична интензивност на флуоресценцията бяха плотирани срещу концентрациите на huCBEl 1#4 в логаритмична скала. Получената крива е под формата на f ^w симетрична камбана и отразява автоинхибирането на свързването на антитялото при високи концентрации. Лявата половина на тази крива беше представена чрез уравнение с четири параметъра, за да се определи афинитета на функционалност на антитялото. Полученото приближение представлява ЕС50 стойността на 60 рМ за свързването на huCBEl 1#4 към НТ-29 клетки.

За тези, с познания в областта на изобретението е очевидно, че редица промени и вариации могат да се направят в полипептидите, съставите и методите, съгласно изобретението, без да се надхвърля обхвата на изобретението. Така, ясно е, че настоящето изобретение покрива модификациите и вариациите му, като такива, попадащи в обхвата на приложените по-долу претенции и техните еквиваленти.

Claims

Патентни претенции

1. Хуманизирано анти-лимфотоксин-бета рецептор (ΕΤ-β-R) антитяло, чиито региони от леката верига, определящи комплементарност, се определят от аминокиселинни остатъци 24 до 34, 50 до 56 и 89 до 97 в SEQ ID N0:1, чиито региони от тежката верига, определящи комплементарност, се определят от аминокиселинни остатъци 31 до 35, 50 до 66 и 99 до 109 в SEQ ID NO: 2 и което антитяло се характеризира с това, че съдържа най-малко един от следните остатъци в леката си верига: КЗ, W41, 146, Q69 и Y71; или най-малко един от следните остатъци в тежката си верига: F37, Т40, А49, М89 и V93 (общоприетото номериране по Кабат).
2. Хуманизирано анти-лимфотоксин-бета рецептор (ΕΤ-β-R) антитяло, чиито региони от леката верига, определящи комплементарност, се определят от аминокиселинни остатъци 24 до 34, 50 до 56 и 89 до 97 в SEQ ID N0:1, чиито региони от тежката верига, определящи комплементарност, се определят от аминокиселинни остатъци 31 до 35, 50 до 66 и 99 до 109 в SEQ ID NO: 2 и което антитяло се характеризира с това, че съдържа остатък Y71 в леката си верига (общоприетото номериране по Кабат).
3. Хуманизирано анти-лимфотоксин-бета рецептор (ΕΤ-β-R) антитяло, чиито региони от леката верига, определящи комплементарност, се определят от аминокиселинни остатъци 24 до 34, 50 до 56 и 89 до 97 в SEQ ID N0:1, чиито региони от тежката верига, определящи комплементарност, се определят от аминокиселинни остатъци 31 до 35, 50 до 66 и 99 до 109 в SEQ ID NO: 2 и което антитяло се характеризира с това, че съдържа остатъци F37 и А49 в тежката си верига (общоприетото номериране по Кабат).
4. Антитяло, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че представлява последователност от домен на променливия регион от леката верига, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 107 в SEQ ID N0:8.
5. Антитяло, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че представлява последователност от домен на променливия регион от тежката верига, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 120 в SEQ ID N0:16.
6. Антитяло, съгласно претенция 4, характеризиращо се с това, че допълнително представлява последователност от домен на променливия регион от тежката верига, определена от аминокиселинни остатъци 1 до 120 в SEQ ID N0:16.
7. Антитяло, характеризиращо се с това, че съдържа същите аминокиселинни последователности от тежката и лека вериги, както антитялото, произвеждано от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА-3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка 3765).
8. Антитяло, съгласно всяка една от претенции 1-7, което в значителна степен запазва способността за свързване на родителското антитяло.
9. Антитяло, съгласно всяка една от претенции 1-7, което е допълнително свързано към имунотоксин.
10. Антитяло, съгласно всяка една от претенции 1-7, което е допълнително свързано с хймиотерапевтично лекарство.
11. Състав, характеризиращ се с това, че представлява антитяло, съгласно всяка една от претенции 1-7, и фармацевтично приемлив носител.
12. Метод за лечение или забавяне прогресирането, тежкия характер или ефектите на неоплазия в човек, характеризиращ се с това че включва даване на състава, съгласно претенция 11.
13. Изолирана аминокиселина, характеризираща се с това, че включва кодираща последователност за леката верига на антитяло, произвеждано от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка 3765).
14. Изолирана аминокиселина, характеризираща се с това, че включва кодираща последователност за тежката верига на антитяло, произвеждано от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка 3765).
15. Изолирана нуклеинова киселина, характеризираща се с това, че включва кодираща последователност за остатъци 1 до 107 от SEQ ID N0:8.
16. Изолирана нуклеинова киселина, характеризираща се с това, че включва кодираща последователност за остатъци 1 до 120 от SEQ ID N0:16.

17. Клетка от клетъчна линия Е46.4 (АТСС патентна заявка РТА3357) или клетъчна линия Е77.4 (АТСС патентна заявка 3765).

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ <110> BIOGEN, INC.

GARBER, Ellen LYNE, Paul SALDHANA, Jose W.

<120> ХУМАНИЗИРАНИ АНТИЬТ -BETA-R АНТИТЕЛА <130> A100 PCT <150> 60/240,285 <151> 2000-10-13 <150> 60/275,289 <151> 2001-03-13 <150> 60/299,987 <151> 2001-06-21 <160> 33 <170> FastSEQ 3a Windows Версия 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> миши