TWI414532B - 抗第1型類胰島素生長因子接受器之抗體及其之使用 - Google Patents
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Description
在一般的方式中,本發明的一個主題是,一個抗體,最好是人源化的,或其功能性斷片之一的使用,及/或使用依據本發明的合成物來製備一種藥劑,用以防止或治療,最好是表達IGF-IR的癌症,及/或最好是由於IGF1及/或IGF2與IGF-IR相互作用而引發傳導的訊號轉導路徑有超活化情形的腫瘤,例如,像IRS1的過度表達。
本發明的主題同樣也是使用,最好是人源化的一個抗體,或其功能性斷片之一,及/或使用依據本發明的合成物來製備一種用以防止或治療最好是牛皮癬(psoriasis),牛皮癬表皮的超級增生可能是與IGF-IR的表達或過度表達相關聯的,及/或IGF-IR與它的自然配位體,及/或EGFR與它的自然配位體,相互作用而引發傳導的訊號轉導路徑有超活化情況相關聯(Wraight C.J.等人,Nat.Biotechnol.,2000,18(5):521-526在牛皮癬中以類胰島素生長因子I受體反義低聚核苷酸(antisense oligonucleotides)逆轉表皮的超級增生)。
本發明也是關於此抗體,最好是人源化的,或任何其功能性斷片的使用,或/及任何包含該抗體的合成物,用以製備治療或預防粥樣硬化(atherosclerosis)的藥劑。
在可以預防及/或治療的過度表達IGF-IR的腫瘤中最好是,前列腺惡性腫瘤,骨肉惡性腫瘤,肺惡性腫瘤,乳房惡性腫瘤,子宮內膜惡性腫瘤,多重骨膸惡性腫瘤,卵巢惡性腫瘤或結腸惡性腫瘤或任何其他惡性腫瘤。
在過去10年中,IGF系統在致癌原因中所扮演的角色已成為密集研究的主題。這個關注導致了一項事實的發現,即是除了它的促有絲分裂的及抗細胞自毀的性質之外,在建立且維持一轉化的顯型的過程中,IGF-IR似乎是不可或缺的。事實上,已是很確定的是,IGF-IR的一過度表現或一基本的活化會導致許多種細胞即始在沒有牛胎兒免疫血清的培養基中也會生長,也引發在裸鼠中腫瘤的形成。這個在其本身並不是一獨特的性質,因為許多以過度表現基因製成的產品可以轉換細胞,包括許多生長因子的受體。無論如何,這已經清楚顯示IGF-IR在轉換中扮演主要角色的關鍵性發現,證實了已去除IGF-IR的基因編碼活性的R-細胞,完全抗
拒通常能夠轉換細胞的不同藥劑所引發的轉換,例如牛科動物的乳頭淋瘤病毒之E5蛋白,EGFR或PDGFR的過度表現,及SV 40的T抗原,被活化的ras蛋白或最後這兩種因子的組合。(Sell C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11217-11221,1993;Sell C.等人,Mol.Cell.Biol.,14:3604-3612,1994;Morrione A.J.,Virol.,69:5300-5303,1995;Coppola D.等人,Mol.Cell.Biol.,14:4588-4595,1994;DeAngelis T等人,J.Cell.Physiol.,164:214-221,1995)。
本發明的一個主題是一種單離的抗體,或是它的一個功能性的斷片,該抗體或它的一個上述之功能性斷片可以特別與人類第一型類胰島素生長因子I受體結合,及/或可以特別抑制該IGF-IR受體之酪氨酸激酶活動,其特徵在於它能夠抑制它的第一配位體IGF1與IC50的自然結合低於0.3 nM,最好是低於0.03 nM,並且也能夠抑制它的第二配位體IGF2與一IC50的自然結合低於0.3 nM,最好是低於0.1 nM。
更特別的是,本發明關於一種單離的抗體,或是其一功能性產生免疫性的斷片,對於人類第一型類胰島素生長因子I受體(IGF-IR)具有結合親合力,其特徵在於,當與IGF-IR結合時,它抑制它的自然結合伙伴IGF1與IGF-IR的結合而其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.03 nM,並且也能夠抑制它的自然的結合伙伴IGF2與該IGF-IR的結合其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.1 nM。
除此之外,本發明係關於一種單離的抗體,或它的一功能性免疫遺傳的斷片,具有一人類第一型類胰島素生長因子I受體(IGF-IR)阻隔活動的酪氨酸激酶,其特徵是,當與IGF-IR結合時,它抑制它的自然的結合伙伴IGF1與IGF-IR的結合其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.03 nM,並且也能夠抑制它的自然的結合伙伴IGF2與該IGF-IR的結合而其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.1 nM。
本發明係關於新穎抗體,特別是能夠與人類第一型的類胰島素生長因子受體(IGF-IR)結合,及/或特別能夠抑制該IGF-IR的酪氨酸激酶活動,尤其是鼠類的,嵌合的及人源化的原單株抗體,以及對於這一些抗體所編碼的氨基酸及核酦序列。在一特別的方面是,本發明係關於可以有效地抑制不僅是IGF1的配位體與IGF-IR的結合,同時
也可以有效地抑制其他配位體,也就是IGF2,與同樣受體的結合的新穎抗體。本發明同樣地包括使用這些抗體為藥劑來做因IGF1及/或IGF2所剌激而過度表現IGF-IR之腫瘤,或與該受體過度表現相關聯的任何病變之預防及/或治療,以及用來診斷與IGF-IR及/或IGF-I/胰島素混種受體過度表現相關病變的程序或配套工具。本發明最後包括了產品及/或,由這樣的抗體與,例如,抗-EGFR抗體及/或抗癌藥劑或與毒素結合的藥劑組合而成的化合物及/或混合物,及他們防止及/或治療某些惡性腫瘤的應用。
被稱為IGF-IR的該第一型類胰島素生長因子受體是一具有酪氨酸激酶活動,且與胰島素受體IR有70%的相似度的受體(IGF-IR)。IGF-IR是一分子重量大約為350,000的糖蛋白類。它是一個每一半部是由二硫鍵所連接的異四聚體結構的受體,包括一個細胞外的α-次單元及一個跨膜的β-次單元。IGF-IR以一非常高的親和力(Kd#1 nM)與IGF1及IGF2結合,但是可以低於100到1000倍的親和力以相同能力與胰島素結合。相反地,雖然該胰島素生長因子IGF只有以低於百倍親和力與胰島素受體結合,但該IR受體與胰島素以一非常高的親和力結合。IGF-IR及IR受體的酪氨酸激酶範圍具有一非常高的序列相似性,雖然較差相似度的區域分別關係到位於α-次單元及β-次單元的C-終端部份的胱氨酸充足的區域。在α-次單元中所觀察到的序列差異是位於配位體的結合區域,因此分別是在IGF-IR及IR對IGFs及胰島素相對親合度的起源處。在β-次單元的C-終端部份的差異導致這兩個受體的訊號路徑的分歧;IGF-IR調解有絲分裂,分化作用及細胞程序死亡的效果,然而該IR的活化主要牽涉到新陳代謝的路徑水準的效果(Baserga等人,Biochim.Biophys.Acta,1332:F105-126,1997;Baserga R.,Exp.Cell.Res.,253:1-6,1999)。
利用配位體與該受體的細胞外區域結而活化該細胞質的酪氨酸激酶蛋白質。激酶的活化輪而參與不同的細胞內基質的激化,包括IRS-1,IRS-2,Shc及Grb 10(Peruzzi F.等人.,J.Cancer Res.Clin.Oncol.,125:166-173,1999)。這兩個IGF-IR主要的基質是利用對許多下游效應物之活化而進行調控的IRS及Shc,大多數的生長及分化作用的效果與IGFs貼合到這受體有關。此基質的可利用性最後可主導與IGF-IR的活化有關的生物效果。當IRS-1佔優勢時,細胞傾向增生並且轉型。當Shc主導時,細胞傾向變異(Valentinis B.等人,J.Biol.Chem.274:12423-12430,1999).(Prisco M.等人,Horm.Metab.Res.,31:80-89,1999;Peruzzi F.等人,J.Cancer Res.Clin.Oncol.,125:166-173,1999)。似乎主要關係到保護以對抗細胞自毀效應的路徑是肌醇磷脂3-激酶(PI 3-激酶)路徑(Prisco M.
等人,Horm.Metab.Res.,31:80-89,1999;Peruzzi F.等人J.Cancer Res.Clin.Oncol.,125:166-173,1999).
在過去10年中,IGF系統在致癌原因中所扮演的角色已成為密集研究的主題。這個關注導致了一項事實的發現,即是除了它的促有絲分裂的及抗細胞自毀的性質之外,在建立且維持一轉化的顯型的過程中,IGF-IR似乎是不可或缺的。事實上,已是很確定的是,IGF-IR的一過度表現或一基本的活化會導致許多種細胞即始在沒有牛胎兒免疫血清的培養基中也會生長,也引發在裸鼠中腫瘤的形成。這個在其本身並不是一獨特的性質,因為許多以過度表現基因製成的產品可以轉換細胞,包括許多生長因子的受體。無論如何,這已經清楚顯示IGF-IR在轉換中扮演主要角色的關鍵性發現,證實了已去除IGF-IR的基因編碼活性的R-細胞,完全抗拒通常能夠轉換細胞的不同藥劑所引發的轉換,例如牛科動物的乳頭淋瘤病毒之E5蛋白,EGFR或PDGFR的過度表現,及SV 40的T抗原,被活化的ras蛋白或最後這兩種因子的組合。(Sell C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11217-11221,1993;Sell C.等人,Mol.Cell.Biol.,14:3604-3612,1994;Morrione A.J.,Virol.,69:5300-5303,1995;Coppola D.等人,Mol.Cell.Biol.,14:4588-4595,1994;DeAngelis T等人,J.Cell.Physiol.,164:214-221,1995)。
IGF-IR在許多種的腫瘤及腫瘤株(lines)中表現,而IGFs經由附著到IGF-IR而擴大了腫瘤的成長。其他贊成IGR-IR在腫瘤形成中扮演角色的主張是來至許多使用鼠科單株抗體直接對抗受體,或採用IGF-IR的負顯性基因的研究中獲得證據。實際上,直接用以對抗IGF-IR的鼠科單細胞生殖之抗體能抑制在培養液中許多細胞株的增生及腫瘤細胞在體內的生長(Arteaga C.等人,Cancer Res.,49:6237-6241,1989;Li等人,Biochem.Biophys.Res.Com.,196:92-98,1993;Zia F.等人,J.Cell.Biol.,24:269-275,1996;Scotlandi K.等人,Cancer Res.,58:4127-4131,1998).它同樣已經在Jiang等人的研究中顯示(Oncogene,18:6071-6077,1999)IGF-IR的一個IGF-IR負顯性基因可以抑制腫瘤的增生。
這類可特別與IGF-IR結合的抗體已經被描述過,而且一些專利申請案已經被提出了。例如,我們提到一件由本申請人所提出的專利申請案WO 03/059951,其中一個可以與IGF-IR結合而被稱為7C10之單株抗體被介紹過。其他可以被提到的專利申請案是WO 02/053596(PFIZER INC.and ABGENIX INC.),WO 03/100008(SCHERING
CORPORATION)或WO 03/106621(IMMUNOGEN INC.).所有這些申請案皆聲稱其抗體特別可與IGF-IR結合及/或抑制其活動。
雖然它被認為是這些抗體中的每一個抗體的明顯特性,但是在這些申請案的說明書中並沒有清楚地顯示這些抗體能夠有效地抑制兩個自然配位體與IGF-IR的結合,及更特別是IGF2與IGF-IR的結合。在這些申請案中展示了,例如抑制IGF1及IGF2所引發在體外增生的資料,並且證實這個被描述的抗體能夠有效抑制IGF1及IGF2兩者所引發的增生。但是,因為這個被描述抗體的主要的部份展示了引發部份IGF-IR的向下調降,這抗增生的特性是否因為IGF1及IGF2兩者與IGF-IR之間位移有關聯並不明確。事實上,例如,在WO 03/106621中所展示的資料只關係到IGF1,而決不關係到最終抑制IGF2與IGF-IR的結合(參考例子C,33-35頁及圖3,及例子D,35-37頁及圖4-6)。
相同的觀察在WO 02/053596中發現(參閱例IV,78-79頁及圖3,及例VII,第82頁及圖4)。
在所有目前被確認描述用來對抗人類IGF-IR(hIGF-IR)單株的或基因重組的抗體之發現的專利申請文件中,它們只有兩件(WO 2004/087756及WO 2005/005635)確實顯示這抗體的效力,分別是AK1a及AK18,,以抑制[125I]IGF2與hIGF-IR之結合。
在兩個案例中皆相同的實驗程序是基於在對人類結腸直腸腺癌(HT29)完整無缺細胞結合的競爭上;雖然所描述的程序是合理的,沒有積極的控制,例如自然hIGF-IR配位體(IGF1及IGF2)的競爭被提出來,使得關於競爭結合的資料令人懷疑。另一方面,即使是用來發展對人類治療擴大效果所需要更有效的高濃度的抗體中,也只有不完全的競爭被展示出來(對AK1及AK18兩種抗體而言最大80%抑制[125I]IGF2的結合)。一個有關於推定AK1a及AK18可抑制IGF2-控制之反應的最後爭議點是由於其缺少例子以顯示一個由hIGF-IR控制的功能性的IGF2-激發的訊號。的確,即始IGF2結合的競爭狀況正在發生,它必須與一相伴下游的hIGF-IR訊號相互關聯,而且這樣的證據必須以例子說明以便提供抗體功能性效果機制上的證據。
本發明的目的是能夠使用一鼠科單株抗體,最好是一嵌合的或人源化的抗體,它會識別特別具有強大親合力的IGF-IR,並且也能夠抑制不僅是IGF1與IGF-IR的結合,同時也可以阻止IGF2與IGF-IR的結合。這個抗體與IR-的相互作用很少,甚至不作用。它的結合將能夠抑制過度表現IGF-IR的細胞株的體外的生長,這乃是主要與在IGF1/IGF-IR及IGF2/IGF-IR相互作用期間所激發的訊號轉導通路的相互作用而達成。
這個抗體將可以在表現IGF-IR的所有型式腫瘤的體內活躍,包括雌激素相關的乳癌及前列腺癌,它不是目前能使用的該抗-IGF-IR單株抗體(被簡稱MAb或MAB)的案例。實際上,在IGF-IR範圍中的αIR3可完全抑制雌激素相關的乳房腫瘤(MCF-7)在體外的成長,但是在相關的模型之體內則沒有效果(Arteaga C.等人,J.Clin.Invest.84:1418-1423,1989).以同樣的方式,由鼠科單細胞生殖的1H7所得到的scFv-Fc斷片只在乳房MCF-7的腫瘤上微弱地活動,而在前列腺男性荷爾蒙無關的腫瘤上是完全沒有作用的(Li S.L.等人,Cancer Immunol.Immunother.,49:243-252,2000).
以一種令人驚奇的方式,這些發明人已經產生一個被稱為I-3466的鼠科單株抗體,它可辨識IGF-IR並且符合所有以上所述的標準,換言之,符合不能辨識在胰島素上的受體,及可在體外阻絕IGF1,特別是阻斷所引發的增生,但同樣在體內阻止表現IGF-IR的不同腫瘤之生長,其中包括骨瘤及前列腺瘤。另外,它已經展示這些抗體阻止在MCF-7及HT29兩種細胞中貝塔鏈上酪氨酸的IGF1-及/或IGF2-引發的磷酸化作用。還有,同樣也確認的是這些抗體造成該受體的內在化及其量的降低,此情況與一般觀察到可讓受體在細胞表面快速再利用的自然配體的結果是相反的。有可能將這些抗體的特徵,以其肽的及核的序列來表現,特別是以其決定IGF-IR的互補性區域(CDR)的序列來表現。如此,依據第一個實施例,本發明的一個主題是一種單離的抗體,或是它的一個功能性的斷片,該抗體或它的一個上述之功能性斷片可以特別與人類第一型類胰島素生長因子I受體結合,及/或可以特別抑制該IGF-IR受體之酪氨酸激酶活動,其特徵在於它能夠抑制它的第一配位體IGF1與IC50的自然結合低於0.3 nM,最好是低於0.03 nM,並且也能夠抑制它的第二配位體IGF2與一IC50的自然結合低於0.3 nM,最好是低於0.1 nM。
更特別的是,本發明關於一種單離的抗體,或是其一功能性產生免疫性的斷片,對於人類第一型類胰島素生長因子I受體(IGF-IR)具有結合親合力,其特徵在於,當與IGF-IR結合時,它抑制它的自然結合伙伴IGF1與IGF-IR的結合而其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.03 nM,並且也能夠抑制它的自然的結合伙伴IGF2與該IGF-IR的結合其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.1 nM。
除此之外,本發明係關於一種單離的抗體,或它的一功能性免疫遺傳的斷片,具有一人類第一型類胰島素生長因子I受體(IGF-IR)阻隔活動的酪氨酸激酶,其特徵是,當與IGF-IR結合時,它抑制它的自然的結合伙伴IGF1與IGF-IR的結合其中一
IC50低於0.3 nM,最好是低於0.03 nM,並且也能夠抑制它的自然的結合伙伴IGF2與該IGF-IR的結合而其中一IC50低於0.3 nM,最好是低於0.1 nM。
在目前的申請案中,IC50已經在例子2中解釋如何以圖型方式確定。
關於本技術的現狀,被稱為18的羅契抗體(WO 2004/087756及WO 2005/005635)對IGF1及IGF2兩者皆有一大約為0.3 nM的平均IC50值(參考WO 2005/005635中之例子6),也就是說比對抗體I-3466所得的IC50要高(參例子2)。
在目前的描述中,該術語“結合”及”附合”是有同樣意義並且可以互換的。
依據本發明另一實施例,此抗體也能夠與IGF-I/胰島素混合受體結合。
實際上,IGF-IR展示與以A及B同形體存在之兩種胰島素受體(IR)有很高的同源性。
IR受體的序列,同形體A及B,分別在NCBI基因銀行以登記號碼X02160及M10051註冊。以下其他關於IR受體的資料,沒有限制下,皆在本文中以參考(Vinten等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:249-252;/Belfiore等人,2002,The Journal of Biological Chemistry,277:39684-39695;Dumesic等人,2004,The Journal of Endocrinology & Metabolism,89(7):3561-3566)而被採用。
此IGF-IR及IR是由二硫化鍵相連的兩個細胞外的α-及兩個穿越膜的β-次單位所組成的四聚物的(tetrameric)糖蛋白類。每一個包括有配位體-結合位點的α-次單位大約是130-135-dDa,而每一個包含酪氨酸激酶區域的β-次單位大約是90-95-k Da。這些受體共同分享整個氨基酸序列超過50%的相似度,及在酪氨酸激酶區域84%的相似度。在配位體結合之後,磷酸化的受體吸收並將標籤的蛋白磷酸化,包括胰島素受體基質-1蛋白家族(IRS1),Gab1及Shc Gab1及Shc(Avruch,1998,Mol.Cell.Biochem.,182,31-48;Roth等人,1988,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,53,537-543;White,1998,Mol.Cell.Biochem.182,3-11;Laviola等人,1997,J.Clin.Invest.,99,830-837;Cheatham等人,1995,Endocr.Rev.,16,117-142),導致不同的細胞內的中介物的活化。雖然IR及IGF-IR兩者皆相同啟動主要的訊號通道,但是兩個受體之間在吸收某些標籤的蛋白質及細胞內中介物存在著差異(Sasaoka等人,1996,Endocrinology 137,4427-4434;Nakae等人,2001,Endocr.Rev.,22,818-835;Dupont及Le Roith,2001,Horm.Res.55,Suppl.2,22-26;Koval等人,1998,Biochem.J.,330,923-932)。這些差異是由IR活化所引發的主要新陳代謝效果及由IGF-IR活化所引發具優勢的有絲分裂,轉化及抗細胞程序自毀效應的基礎(De
Meyts等人,1995,Ann.N.Y.Acad.Sci.,766,388-401;Singh等人,2000;Prisco等人,1999,Horm.Metab.Res.,31,80-89;Kido等人,2001,J.Clin.Endocrinol.Metab.,86,972-979)。胰島素以高親和力與IR結合(百倍高於與IGF-IR的結合),而類胰島素生長因子(IGF1及IGF2)與IGF-IR結合之親和力百倍高於與IR的親和力。
人類的IR有兩種同形存在,IR-A及IR-B,是利用將IR基因以間隔方式剪接而產生,此基因排除或包括了在IR α-次單元羧基末端一小外顯子(外顯子11)所解碼的12個氨基酸殘基。相對大量的IR同形是由組織特定的或未知的因子所調控(Moller et al.,1989,Mol.Endocrinol.,3,1263-1269;Mosthaf et al.,1990,EMBO J.,9,2409-2413)。在正常成人組織中(脂肪組織,肝及肌肉)佔主導的IR同形是IR-B,它們是胰島素新陳代謝效果的主要目標組織(Moller等人,1989;Mosthaf等人,1990)。IR-A是在胎兒組織中佔主導的同形並且回應IGF2來調控胎兒的成長。(Frasca等人,1999,Mol.Cell.Biol.,19,3278-3288),同樣也在基因遺轉老鼠中所做的基因研究結果中透露(DeChiara等人,1990,Nature 345,78-80;Louvi等人,1997,Dev.Biol.189,33-48)。除此之外,當細胞轉化並變成惡性時,再分化作用經常有一增長的IR-A相對大量有關聯(Pandini等人,The Journal of Biological Chemistry,Vol.277,N0 42,pp39684-39695)。
在高同源性的條件下,該胰島素及IGF-I半受體(由一個α-及一個β-次單元組成)能夠雜二聚體化,導致胰島素/IGF-I混合受體(Hybrid-R)的形成(Soos等人,1990,Biochem J.,270,383-390;Kasuya等人,1993,Biochemistry 32,13531-13536;Seely等人,1995,Endocrinology 136,1635-1641;Bailyes等人,1997,Biochem J.,327,209-215)。
IR的兩種同形有相同能力與IGF-IR形成混合體。混合-R受體(Hybrid-R),無論如何,具有不同的功能性特質。混合受體Hybrid-RsB已經減低了對IGF1而特別是對IGF2的親合力。相較下,混合受體Hybrid-RsA對IGF1有一高的親合力並且在一生理濃度範圍中也與IGF2及胰島素結合。混合受體Hybrid-RsA的表現以兩種不同的機制正調了IGF系統i)由IGF1及IGF2(與混合受體Hybrid-RsB不會發生)以高親合力結合及活化,ii)在胰島素結合後對IGR-IR路徑的活化。與混合受體Hybrid-RsA結合的胰島素使IGF-IRβ-次單元磷酸分解化並且活化一IGF-IR特定的基質(CrkII),因此混合受體Hybrid-RsA將胰島素轉換成IGF-IR訊號(Pandini等人,2002)。
在一些組織中,像肝臟,脾臟或胎盤,混合受體Hybrid-R表現更超過了IGF-IR(Bailyes等人,1997)。當腫瘤組織對IGF-IR及IR-A兩者過度表現,或呈現一不
正常活化時(Frasca等人,1999;Sciacca等人,1999,Oncogene 18,2471-2479;Vella等人,2001,Mol.Pathol.,54,121-124),混合受體Hybrid-RsA也可能會以多種人類惡性腫瘤的形式過度表現,包括甲狀腺及乳癌,假設在IGF1及/或IGF2及同樣也由在生理濃度下的胰島素所刺激之後,一個有利於惡性腫瘤細胞選擇性生長優勢能由IGF-IR模式訊號回應(Bailyes等人,1997;Pandini等人,1999,Clin.Cancer Res.5,1935-1944;Belfiore等人,1999,Biochimie(Paris)81,403-407;Frasca等人,1999;Sciacca等人,1999;Vella等人,2001)。
依據本發明,抗體同樣具有的特徵是他們能夠結合到混合受體Hybrid-R,而且,若有必要,最好是能夠阻止該配位體胰島素,混合受體的IGF1及/或IGF-2自然結附合,及/或能夠特別阻止該混合受體Hybrid-R.的酪氨酸激酶活動。
本發明的一個目的是提供一抗體,或其功能性斷片之一,其特徵在於它其能夠100%抑制IGF1及/或IGF2所引發的IGF-IR貝塔(beta)鏈(最好是在HT29細胞上)的磷酸化作用。
另一方面,該抗體,或其功能性斷片之一,依據本發明其特徵在於它不呈現任何強烈促效(agonistic)內在活動。
此抗體或其功能性斷片之一,依據本發明,另外的特徵在於它能夠誘發,採用相同的FACS分析法:i)至少30%的IGF-IR在HT29細胞中內在化,及/或ii)至少85%的IGF-IR在MCF-7細胞中內在化。
依據本發明,抗體或其功能性斷片之一的一種特性是其有能力誘發,採用相同的FACS分析法:i)至少50%的IGF-IR在HT29細胞中降低,及/或ii)至少65%的IGF-IR在MCF-7細胞中降低。
在另外一實施例中,依據本發明,抗體或其功能性斷片之一的特徵是抑制IGF1及IGF2所誘發的兩種MCF-7細胞在體外的增生,其中IC50s最少等於1 nM,且最好對IGF1及IGF2實驗中至少分別是0.7及0.5 nM。
依據本發明,抗體或其功能性斷片之一另外的特徵是能夠抑制腫瘤細胞株在體內的生長。
依據本發明,此抗體最好是特定的單株抗體,特別是依對此領域熟悉的人仕皆知
的標準方法可獲得的鼠類,嵌合的或人源化的根源。
一般而言,配製單株抗體或它們功能性的斷片的抗體,特別是鼠類複製源,可以參考在“抗體”一手冊中有敍述的技巧(Harlow及Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)或參考由Kohler及Milstein(Nature,256:495-497,1975)所描述由雜交瘤製備的技巧。
依據本發明可以獲得單株抗體,例如,由一個對IGF-IR免疫處理過的動物細胞,或它們包含特別依據本發明可被該單株抗體識別的表位的功能性斷片之一。該IGF-IR或其功能性的斷片之一可依照通常的工作方法而獲得,就是開始以一包含在IGF-IR的cDNA序列碼的核酸序列之基因重組,或由一包括在IGF-IR肽序列中氨基酸序列開始的肽人工合成技術得到。
依據本發明的該單株抗體,例如,在一含有依據本發明敍述可特別由該單細胞生殖抗體表位所識別的IGF-IR或其斷片之一親和力柱上純化過之後,早先已經被去活性化。更特別是,該單株抗體可以被在蛋白質A及/或G上之色譜法所純化,接著或不繼續以目標為消除殘留蛋白質污染物及DNA及LPS的離子-交換色譜法(chromatography)方式處理,在其中繼續或不繼續在Sepharose凝膠(gel)上以排除色譜法方法來消除因為二聚體(dimmers)或其他的多聚體(multimers)的出現而造成可能的聚集。在一個更佳的方式中,可以同時或連續地使用這些全部的技術。
嵌合的或人源化的抗體同樣包在本發明中所提之抗體之中。
到嵌合抗體,它的意思是指包含有一自然可變化的(輕鏈及重鏈)區域,該區域是一個由一所給物種之抗體與該特定物種相異物種之抗體中輕鏈及重鏈固定區域組合而衍生出來的。
依據本發明之抗體或它們嵌合型式的斷片可以利用基因重組技術製備。例如,該嵌合的抗體的生產可以利用克隆或複製一個基因重組的DNA,該DNA包含一促進劑及一非人類抗體之可變化區域序列編碼,特別是依據本發明的鼠類單株抗體及對人類抗體固定區域的一序列編碼。本發明由這樣重組之基因所解碼的嵌合抗體將會是,例如,一個鼠-人嵌合體,這個抗體的具體特性是由鼠科DNA所衍生的可變化區及它由人類DNA所得到的固定區域所決定的之同種型來確定的。至於製備嵌合式抗體的方法,有可能,例如,去參考Verhoeyn等人(BioEssays,8:74,1988)等人的文件。
提到人源化的抗體,它的意思是指一個抗體,它含有一由非人類來源之抗體所衍生出的CDR區域,此抗體分子的其他部份是由一個(或由多個)人類抗體所衍生出來的。此外,一些主要骨幹(稱為FR)斷片的殘餘可以被修改,以便保存結合的親和力(Jones等人.,Nature,321:522-525,1986;Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988;Riechmann等人.,Nature,332:323-327,1988)。
依據本發明的人源化的抗體或他們的斷片可以由熟悉此領域的人仕都知道技術來製備(例如,像在Singer等人文件中所描述)(Singer等人.,J.Immun.,150:2844-2857,1992;Mountain等人,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992;或Bebbington等人,Bio/Technology,10:169-175,1992)這樣依據本發明的人源化抗體最佳的使用是在體外診療方法,或在體內的預防或治療上。其他的人源化的方法是在此行業具有熟悉技術的人仕所熟知的,例如,蛋白質設計實驗室(PDL)在其專利申請案EP 0 451 261,EP 0 682 040,EP 0 9 127,EP 0 566 647或US 5,530,101,US 6,180,370,US5,585,089及US,5,693,761中所描述的“CDR移植”方法。.
同樣也可以提到以下的專利申請案US 5,639,641;US 6,054,297;US 5,886,152及US 5,877,293。提到依據本發明抗體功能性的斷片時,它的意思特別是指,例如Fv,scFv(sc對單一鏈),Fab,F(ab’)2,Fab’,scFv-Fc斷片或雙特異性抗體(diabodies)的一個抗體斷片,或任何半衰期時間可以利用化學修正方式而增加的斷片,例如加入聚烷撐二醇(poly(alkylene)glycol)例如聚乙二醇(poly(ethylene)glycol)(“PEGylation”)(被稱為Fv-PEG,scFv-PEG,Fab-PEG,F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的奈米化的斷片(聚乙二醇Poly(Ethylene)Glycol的“PEG”,或被併入一個脂質體(liposome),該斷片至少有一個依據本發明之序列SEQ ID No.1,2,3,4,5或6中具代現性CDRs中的一個,而且,特別是,其特徵在於,它能夠以一般方式,甚至使由它所衍生下來之該抗體,進行部份活動,例如特別是辨識及結合IGF-IR的能力,而且,若有必要,抑制該IGF-IR.活動的能力。
最好是,該功能性斷片的建構或組成將包括該斷片所源自的該抗體的重或輕的可變化鏈的一部份序列,該部份序列足以保留與其源自之該抗體相同的結合力之特性,該部份序列足夠保留對IGF-IR的親和力,最好是有與其源自的抗體至少1/100,更理想的方式是至少有1/10的親和力。
這樣的功能性斷片將包含最少5個氨基酸,最好是其源自的抗體序列的10,15,25,50及100連續的氨基酸。
最好是,這些功能性的斷片是Fv,scFv,Fab,F(ab’)2,F(ab’),scFv-Fc型式或雙特異性抗體(diabodies),它通常具有與其源自的抗體相同的結合特性。依據本發明,本發明的抗體斷片的獲得是可以由以上所述的抗體開始利用以例如酶的消化方式的方法,例如胃蛋白酶,木瓜蛋白酶及/或利用化學還原將二硫鍵分裂。在另一個方式中,本發明中所包括的該抗體斷片可以用此行業中具有熟練技術人仕皆知的基因重組的技術而獲得,或其他利用以,例如,由Applied Biosystems,etc所提供的那些自動肽合成器所得的肽合成物來生產,等等。
一個更佳的方式中,本發明包括有該抗體,或他們功能性斷片,依據本發明特別是嵌合的或是人源化的抗體,乃利用基因重組或化學人工合成而獲得。
更特別地,依據本發明的一個最佳實施例,該抗體的特徵是它包括至少一個由SEQ ID No.1,3或5序列CDRs中所選取的補充確定區域CDR所組成之輕鏈,或至少一個與SEQ ID No.1,3或5在最適當排列之後其序列至少有80%相同的CDR,或其特徵在於它包括由序列SEQ ID No.2,4或6 CDRs中所選取至少一個CDR所構成之一個重鏈,或或至少一個與SEQ ID No.2,4或6在最適當排列之後其序列至少有80%相同的CDR。
在目前的敍述中,這些名詞多肽,多肽序列,肽及貼合到抗體化合物或他們序列的蛋白質皆可以互換使用的。
在此處必須要了解的是,本發明不涉及到自然形態的抗體,也就是說他們不是在他們自然的環境中而是已經能夠從自然來源以純化方式單離出或取得,或以其他基因重組,或化學合成方式而獲得,因此他們可以包含有非天然的氨基酸,這將如以後會描述的一樣。
提到CDR區域或CDR,它的意思是指如Kabat等人所定義的免疫球蛋白的重及輕鏈的超變區域(Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,5th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991,及較後期的版本later editions)。有3個重鏈CDRs及3輕鏈CDRs存在。CDR或CDR這個名詞在此用來指,依據本案例,這些包含有負責利用抗體親和力與抗原,或它能識別的該抗原決定部份結合的該氨基酸殘基的大多部份的區域之一或一些,或甚至整個區域。
在本發明的觀點中,在兩個核酸或氨基酸序列之間”相同度百分比”是指,在最好的排序之後(最適的排序)之後,用以比對的兩個序列之間的核苷或相同氨基酸殘基後所
獲得的百分比,這個百分比純綷是統計的而且這兩個序列之間的差異是任意地分散地並且是分佈在他們的整個長度上。這兩個核酸或氨基序列的比對傳統上是在將兩個序列以最當適排序之後才進行,該比對可以分段地或以”比對窗口”來進行。用以比對的序列之最適當排序除了可用人工方式進行之外,也可用史密斯及瓦特門Smith and Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]所提出的局部同源演算法,及Neddleman and Wunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]所提出的局部同源演算法,及Pearson and Lipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)所提出的相似性搜尋法,及以這些演算法為基礎所開發之電腦程式軟體(GAP,BESTFIT,FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI,或其他by BLAST N或BLAST P的比對軟體comparison software)。
在兩個核酸或氨基酸序列之間相同度百分比的決定,是將這兩個以最適當方式排列之後的序列做比較而得到,而其中用來對比的該核酸或氨基酸序列可以由參考比對的序列做增加或刪除而組成,以便在這兩個序列間獲得最適當的排序。相同度的計算是以確定相同位置的數目,在這些位置上這兩個序列間核苷酸或氨基酸的殘基是相同的,將此相同位置的數目除以在此比對窗口全部位置的數目,再將所得結果乘以100以獲得這兩個序列相同度的百分比。
例如,可以利用BLAST電腦程式,“BLAST 2序列”(Tatusova等人,“BLAST 2序列-一個用以比對蛋白質及核苷酸序列的新工具”,FEMS Microbiol Lett 174:247-250)可以在網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html,中獲取,所使用的參數是以那些空缺所提供(特別是對”開放間隙處罰”:5及”擴大間隙處罰”:2;所選用的矩陣是,例如,由此程式所提供的“BLOSUM 62”矩陣),這兩個對比的序列之間的相同度百分比直接由該電腦程式計算。
與一對照的氨基酸比較具有至少80%,90%,95%及98%相同度的氨基酸為例,那些與對照序列相比做了某些修改,特別是對至少一個氨基酸做出刪除,增加或取代,切除或加長是所要的作法。在以取代一個或更多個連續的或不連續的氨基酸的案例中,該被取代的氨基酸最好是”相等的”氨基酸來替換。“相等的氨基酸"一詞在此的目的是指任可以用一基本結構的氨基酸所取代的氨基酸,而不會實質上改變相關抗體生物的活動,而這些將在以後定義,特別是在例子中。
本發明另外的實施例提出了,在其內部有其他氨基酸序列進行了變更的抗-IGF-IR的抗體。例如,它可能想要改善結合的親和力及/或該抗體其他的生物性質。可以利用在該抗-IGF-IR的抗體核酸中引入適當的核苷酸改變,或利用肽合成而製備抗-IGF-IR的抗體之氨基酸序列變異體。這樣的改變包括,例如,由抗-IGF-IR的抗體的氨基酸序列的殘基中移除,及/或加入及/或取代等方法。任何由移除,插入,及取代所組合的方法被用來達到該最終的結構,假如最終的結構具有所要的性質。這種氨基酸的改變同樣也可能改變抗-IGF-IR的抗體的轉譯後程序,例如改變糖基化作用的數目或其位點的位置。
一種用來辨識突變發生是最好位置的抗-IGF-IR抗體的某些殘基或區域的有用方法,被稱為”丙氨酸掃描突變發生”,如Cunningham and Wells in Science,244:1081-1085(1989)所描述的。在此,一殘基或一群目標殘基被辨識(例如,帶電的arg,asp,his,lys,and glu)並且被一個中性的或帶負電的氨基酸(最理想的丙氨酸或多丙氨酸)所取代以便影響氨基酸與IGF-IR抗原間的相互作用。那些對替換顯現出功能性敏感的氨基酸位置的淨化是利用在或為該替換位置引入更多或其他的變異而達成。如此,當一個用來引入一氨基酸序列變化的位置被預先確定後,其突變的性質就不必預先確定了。例如,為了要分析在一所給位置上的一個突變的表現,在該目標密碼子或區域上進行丙氨酸掃描或隨意的突變,而且該表達的抗IGF-IR抗體的變異為了所要的活動力而被篩選。
氨基酸序列的嵌入包括長度從一殘基到幾百個或更多殘基的多肽氨基-及/或羧基-終端的融合,以及單獨一個或複數個氨基酸殘基序列內的嵌入。末端嵌入的例子包括一個具有N-末端的蛋氨醯(methionyl)殘基的抗-IGF-IR抗體,或融合到一細胞毒素的多肽之抗體。其他抗-IGF-IR抗體分子之嵌入的變異包括與抗-IGF-IR抗體之N-或C-末端的融合,及與一個酶(例如對ADEPT)的融合或一個可增加抗體血清半期的多肽的融合。
變異體的另外一種型式是一氨基酸代替變異體。這些變異體在被一個不同殘基替換的抗-IGF-IR抗體分子中至少有一氨基酸殘基。最重要的替換突變發生的位置包括該高度變化的區域,但是FR變更同樣也考量過。在表1中也以”較佳的替換”為標題展示了保守的替換。假如這樣的替換會導致生物活動的改變,那麼在表1中以“示範的替換”來命名之更大量的改變,或在以下參考氨基酸類別更進一步的描述,會被介紹而其產品被選取。
表1 氨基酸的替代物
抗體生物性質大量的修改,可以利用選擇在維持下列效果上有顯著地不同的替換來達成:(a)在替換區域的多肽骨幹的結構,例如,如一摺疊片或螺旋狀的構造(b)在目標位置上分子的電荷或疏水性質,或(c)側鏈的大部份。自然發生的殘基以一般側-鏈性質為基礎被分成以下群組;(1)疏水的:norleucine,met,ala,val,leu,ile;(2)中性親水的:cys,ser,thr(3)酸化的:asp,glu;(4)基本的:asn,gln,his,lys,arg;(5)會影響鏈定向的殘基:gly,pro;及(6)芳香的:trp,tyr,phe.
非保守的替換需要將這些綱類之一的一部份交換成另一綱類。
任何沒有涉及維持抗-IGF-IR抗體適當構造之半光胺氨酸殘基同也可以被替換,通常是以絲氨酸取代,以改善該分子的氧化的穩定性並且防止異常的交又連鎖。相反地,半光胺氨酸鍵可以被加到該抗體上以改善其穩定性(特別是在該抗體是一個如Fv斷片之抗體的情況下)。
一個特別想要的替代變異體型態包含了取代一個親代抗體(例如,一個人源化的或人類的抗體)的一個或更多個超變區域的殘基。通常,最後得到選來進一步發展的變異體將會改善相對於由其親代抗體所產生的生物特性。一個產生這樣取代的變異體的簡便方法包含了利用噬菌體展示法所得到的親和力成熟。簡言之,幾個超變區域位點(例如6-7位點)被突變以便在每一位點產生所有可能的氨基替換。如此產生的這抗體變異體當融合到包裝在每一粒子中的M13基因III的產品時,是以一單價型態從絲狀噬菌體粒子被展示。如文中所揭露的,這個以噬菌體展示的變異體接著為了它們的生物活動力(例如結合的親和力)被篩選。為了要辨識修改用的超變區位點的候選者,可以利用丙氨酸掃描誘變的方式來辨認對抗原結合有顯著幫助的超變區域殘基。另一種做法,或額外地做法,分析該抗原-抗體複合物的水晶結構以辨識抗體及人類的IGF-IR之間的接觸點是有利的。依據在文中詳細說明的技術,這樣的接觸殘基及鄰近的殘基是替換的候選者。一旦這樣的變異體被製造成時,這些變異體的名單就進行文中所述的篩選過程,而在一個或更多相關檢定中具有超級性質的抗體可以被選出以做進一步的發展。
另外一種抗體氨基酸的變異體型態改變該抗體原始的糖基化作用模式。所謂改變是指把抗體中發現的一個或更多的碳水一部份結構刪除,及/或増加一個或更多在抗體中沒有出現的糖基化作用位點。
抗體的糖基化作用典型地是以N-連接的或O-連接的。N-連接的是指碳水一半結合到天門冬素殘基的側鏈。該三肽序列天門冬素-X-絲氨酸及天門冬素-X-蘇氨酸,其中X是除了脯氨酸的任何氨基酸,是碳水一部份結構使用酵素結合到天門冬素側鏈的辨識序列。如此,在一個多肽中出現這些三肽序列之一構造了一個可能的糖基化位點。O-連接的糖基化作用是指糖N-乙醯半乳糖胺(N-aceylgalactosamine),單乳糖(galactose),或xylose結合到一個羥氨基酸,最通用的絲氨酸或蘇氨酸,雖然5-脯氨酸或5-羥基賴氨酸同樣可以被使用。
利用改變氨基酸序列的方式可以很輕易地將糖基化作用位點加到抗體上,因而使它包含一個或更多個上述的三肽序列(對N-連結的糖基化位點)。這個改變同樣可以利用増加,或更換一個或更多的絲氨酸或蘇氨酸殘基到原始的抗體序列上(對O-連結的糖基化位點)而達成。
用以編碼主要抗-IGF-IR抗體之氨基酸序列變異體的核酸分子是以在此領域中所知的多種方法來製備。這些方法包括,但不被限制的,由一個自然的來源單離出(在自然發生的氨基酸序列變異體的案例中),或以低聚核苷酸-控制的(或位點-導向的)誘變,PCR誘變,及一個較早製備的變異體之盒式誘變或一個抗-IGR-IR抗體的非-變異體款式製備而成。
有時候,可能希望將本發明的抗體有關於效應器功能方面做修改,也就是說,用以擴大依靠抗原、細胞控制的細胞毒性(ADCC)及/或抗體的依靠補體之細胞毒性(CDC)。這個可以利用在抗體的一個Fc區域中引入一個或更多的氨基酸替代物而達成。另外或額外地做法是,可以將半胱氨酸殘基引入Fc區域中,因此允許在此區域中鏈際間的二硫鍵的形成。這樣所產生的同型二聚體的抗體可能已經改善內化的能力及/或已經増加補體-控制的細胞致死以及抗體-相依的細胞的細胞毒性(ADCC)。參考See Caron等人,J.Exp Med.,176:1191-1195(1992)及Shopes,B.J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。具強化抗腫瘤活動之同型二聚體的抗體也可以利用Wolff等人,癌症研究Cancer Research,53:2560-2565(1993).等人描述的異型雙功能交叉-連鎖的方法製備。另一種方式,一個抗體可以被處理使其具有雙Fc區域因而具有擴大的補充消退病勢及ADCC的能力。參閱Stevenson等人,抗-癌症藥劑設計Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989).
同樣地,為了增加抗體免疫血清的半衰期,人們可以將救助受體結合表位加入該抗體中(特別是一個抗體斷片)例如,如美國專利5,739,277中所描述的一樣。如在文中所用的一樣,“救助受體結合表位”是指一個在IgG分子的Fc區域的一個表位(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4),它造成IgG分子的體內的免疫血清的半衰期的增加。
這些同等的氨基酸可以利用依靠與他們所替代的氨基酸在結構上相同度,或依靠在能夠被實施的不同抗體之間的生物活動的比較性的嚐試結果來確定。利用例子,提到在不對相關改變過的的抗體之生物活動產生深遠改變之替換的可能性。因此可能將亮氨酸(leucine)以纈氨酸(valine)或異亮氨酸(isoleucine),天冬氨酸以穀氨酸,(aspartic acid by
glutamic acid),穀胺醯胺以天冬醯胺,精氨酸以穀胺酸,精氨酸以賴氨酸(glutamine by asparagine,arginine by lysine)等等來取代,相反的替換在相同的情況下是自然可行的。
在更佳的方式中,本發明係關於一抗體或其功能性斷片之一,依據本發明,其特徵在它包括一個重鏈,它是至少由3個CDRs中的2個或由序列SEQ ID Nos 2,4及6中的3個CDRs,或至少3個CDRs中的2個或在最適度排序後與序列SEQ ID Nos 2,4及6分別具有至少80%相似性的序列中的3個CDRS所組成。
在一個更佳的實施例中,本發明係關於一抗體或其功能性斷片之一,依據本發明,其特徵在它包括一個輕鏈,它至少是由3個CDRs中的2個,或由序列SEQ ID Nos 1,3及5中的3個CDRs,或至少3個CDRs中的2個,或在最適度排序後與序列SEQ ID Nos 1,3及5分別具有至少80%相似性的序列中的3個CDR所組成。
在更佳的方式中,本發明係關於一抗體或其功能性斷片之一,依據本發明,其特徵在它包括一個重鏈,它是由序列SEQ ID Nos 2,4及6中的3個CDRs或在最適度排序後與序列SEQ ID Nos 2,4及6分別具有至少80%相似性的序列中的3個CDRS,及其特徵在此外它包括一個輕鏈,它由序列SEQ ID Nos 1,3及5中的3個CDRs或在最適度排序後與序列SEQ ID Nos 1,3及5分別具有至少80%相似性的序列中的3個CDRS。
以目前科技發展的狀況而言,眾人皆知該6個CDRs之間的最大變化(長度及組合)是對該重鏈的3個CDRs所做之觀察,更特別是對該CDR-H3。因此,可知本發明抗體的優先的特性是該重鏈的3個CDRs,也就是說,由序列SEQ ID Nos.2,4及6所編碼的CDRs及,更理想地是,相對應於由SEQ ID No.6所編碼的CDR-H3之CDR。
依據另一方面而言,本發明的一個主題是一抗體或是其功能性斷片之一,依據本發明,其特徵是它不會貼附到,或它不會大量地貼附到此人類胰島素受體IR上。
以一個較佳的方式中,依據本發明的該功能性的斷片是由斷片Fv,scFv,Fab,(Fab’)2,Fab’,scFv-Fc或雙特異性抗體,或任何以化學修改特別是以PEGylation,,或利用加入一脂質體而增加半衰期的功能性斷片中所選取的。
依據另一方面,本發明係關於一個依照本發明可以分泌單珠抗體的鼠科雜交瘤,特別是,例如2005年6月23日以編號I-3466存放在Centre National de Culture De Microorganisme(CNCM,National Center of Microorganism Culture)(Institut Pasteur,Paris,France)的鼠科源雜交瘤,該雜交瘤是由免疫老鼠的Balb/c splenocytes及Sp2O Ag 14骨膸瘤細胞珠融合所衍生出的。
在此被稱為I-3466的該單株抗體,或其功能性斷片之一,的特徵在於該抗體是由2005年6月23日以編號I-3466存放在CNCM的雜交瘤所分泌的,當然它是本發明的一部份。
在一個特別的實施例中,本發明係關於一個鼠科抗體,或其功能性斷片之一,依照本發明,其特徵在於該抗體包含一個由SEQ ID No.7氨基酸或一個與SEQ ID No.7序列在以最適當排序之後有至少80%相同之序列所組成之輕鏈,或/及其特徵在於其包括一由SEQ ID No.8氨基酸序列或一個與SEQ ID No.8序列在以最適當排序之後有至少80%相同之序列所組成之重鏈。
依照一個同樣的特別的方面,本發明係關於一個嵌合的抗體,或其功能性斷片之一,其特徵在於該抗體此外並包含由一個與老鼠,特別是人類,異源的物種所行生出的該輕鏈及重鏈固定不變的區域,而在一個較理想的方式中,其特徵是由人類抗體所衍生的該輕鏈及重鏈固定不變的區域分別是κ及γ-1,γ-2或γ-4區域。
在一相關於IgG1同形物之特別的實施例中,該抗體的一個補充物的特徵是其可能展現如ADCC對抗體依賴的細胞毒性(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity)及/或CDC對補充物依賴的細胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity)一樣的受動器功能。
依據一同樣的特別觀點,本發明是關於一人源化的抗體或其功能性斷片之一,依據本發明,其特徵在於該抗體包括一輕鏈及/或一重鏈,其中該輕鏈及/或重鏈的骨幹部份FR1到FR4分別是由人類抗體的輕鏈及/或重鏈骨幹部份FR1到FR4所衍生出來的。
依據一個理想的實施例,本發明中的該人源化的抗體或其功能性斷片之一的特徵在於該人源化抗體包含一由該氨基酸序列SEQ ID No.17組成之輕鏈,或一個在與SEQ ID No.17做最適當的排序之後而具有80%相同度的序列,或/及其特徵在於它包含一由該氨基酸序列SEQ ID No.18組成之重鏈,或一個在與SEQ ID No.18做最適當的排序之後而具有80%相同度的序列。
最好是,依據本發明該人源化的抗體,或其功能性斷片之一的特徵在於該人源化抗體包含一個由該氨基酸序列SEQ ID No.17組成之輕鏈,而且其特徵是它包含一個由該氨基酸序列SEQ ID No.18組成之重鏈。
依據一新穎的關點,本發明係關於一種單離的核酸,其特徵在於它是由下列核酸中選取出來的:
a)一核酸,DNA或RNA,為一個依據本發明抗體,或其功能性斷片之一編碼。
b)如a)中所定義的一個核酸的互補核酸;
c)一個具有至少18個核苷酸的核酸,可以在極端嚴格條件下與核酸序列SEQ ID No.9,10,11,12,13或14中至少一個CDRs,或與一個在與序列SEQ ID No.9,10,11,12,13或14;做最適當排序之後有至少80%,最好85%,90%,95%及98%相同度之序列雜交。
d)一個具有至少18個核苷酸的核酸,可以在極端嚴格條件下與核酸序列SEQ ID No15中的輕鏈,及/或與核酸序列SEQ ID No16中的重鏈,或與序列SEQ ID No.15及/或16做最適當排序之後有至少80%,最好85%,90%,95%及98%相同度之序列雜交。
e)一個具有至少18個核苷酸的核酸,可以在極端嚴格條件下至少與核酸序列SEQ ID No19中的輕鏈,及/或與核酸序列SEQ ID No.20中的重鏈,或與序列SEQ ID No.19及/或20做最適當排序之後有至少80%,最好85%,90%,95%及98%相同度之序列雜交。
當提到核酸,核或核酸序列,多核苷酸,低聚核苷酸,多核苷酸序列,核苷酸序列,在本說明書中將一般性地被用到的名詞,它的意思是指一個精準的核苷酸的連結,這些核苷酸是被修飾過的或沒有被修飾過的,允許一個斷片或一個要定義的核酸的區域,包含或不包含非自然的核苷酸,且就像對該DNAs的轉錄產品一樣,也恰好可配合一個雙股的DNA,一個單股的DNA。
在此也必須要了解的事實是,本發明不涉及核苷酸序列在它們的自然染色體環境中,也就是說他們是在自然的狀態中。它是關於已經單離及/或被純化過的序列,也就是說他們已經直接或間接被選取過了,例如利用複製,他們的環境已經至少部份地被修飾過。因此在此同樣要指出的是該單離的核酸是,例如,利用以寄主細胞基因重組或化學合成方式所獲得的。
當指核序列,在與一個較理想的序列以最適當排序後,至少有80%,最好是85%、90%、95%及98%相同度百分比時,它的意思是說,該核序列與該參考核序列比較下,具有某些修飾,例如,特別是指刪除,截斷,加長,嵌合式融合及/或取代,特別是點替換。它最好是關於一些序列,在這些序列中對相同氨基酸序列的編碼與參考序列是一樣
的,這與基因碼退化或特別可以,最好是在高嚴格度條件下,特別是如以下所定義的一樣,與該參考序列雜交的補充序列是相關聯的。
在高嚴格度條件下的一個雜交的意思指,以一種特定方式選擇該溫度條件及離子強度的條件,以便維持兩個互補的DNA斷片間的雜交。利用示範的方式,為了要定義以上所描述的多核酸斷片的目標而進行的高嚴格度條件的雜交步驟最以下列有利地的方式進行。
DNA-DNA或DNA-RNA的雜交以兩個步驟進行;(1)在42℃下在含有5x SSC(1 x SSC對應於一個0.15 M NaCl+0.015 M枸櫞酸鈉溶液)的磷酸鹽緩衝液(20 mM,pH 7.5)50%的甲醯胺(formamide),7%的鈉十二烷基硫酸鹽(sodium dodecyl sulfate)(SDS),10 x Denhardt’s,5%的葡聚糖硫酸鹽(dextran sulfate)及1%的鮭魚精液的DNA中預先雜交3小時;(2)以一由測試物尺寸所決定的溫度下(也就是說;42℃,對一個測試尺寸>100個核苷酸)進行實際雜交20個小時,接著在20℃下在2 x SSC+2% of SDS中進行2次20分鐘的清洗,在20℃下在1 x SSC+0.1% of SDS中進行1次20分鐘的清洗。最後對尺寸>100個核苷酸的測試物的沖洗是以0.1 x SSC+0.1%的SDS在60℃進行30分鐘。以上所述對一個確定尺寸的多核苷酸高嚴格度的雜交條件,可以依據Sambrook等人,(1989,分子的克隆:一實驗室手冊.第二版冷泉港a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor)的教導,被一個對此領域熟練人仕所修改為更大或更小尺寸的低聚核苷酸。
本發明同樣關係到一由依照本發明之核酸所組成之載體。
本發明的特別目標是克隆及/或包含有依據本發明之核苷酸序列之表達型載體。
根據本發明之載體最好是包含有在確定的寄主細胞中可以允許該核苷酸的表達及/或分泌的元素。因此該載體必須包含有一啟動子,轉譯的起始及終止的訊號,以及轉錄調節的適當區域。它必須在寄主細胞中維持一穩定的狀態而且可以隨意地發出具體指定該被轉錄蛋白質分泌的訊號。這些不同的元素是此行業中具熟練技術人仕依所用的寄主細胞之功能所選取及最佳化而得到。大意是說,依據本發明的核苷酸序列可以被插入所選取寄主細胞中的自主複製載體中,或與所選取的寄主細胞整合的載體。
這樣的載體是以熟悉本領域人仕目前所用的方法製備,而該所產生的克隆可以用標準的方法將其放入一適當的寄主中,例如脂質轉染法,電穿透作用,熱震盪,或化學方法。
這個依照本發明的載體,例如,質粒或病毒來源的載體。他們可用於轉換寄主細胞以便克隆或表達本發明的該核苷酸序列。
本發明同樣包含被依照本發明的一個載體所轉換成的,或包含一個本發明載體的寄主細胞。
該寄主細胞可以由原核生物的或真核的系統中選取,例如細菌細胞但同樣也可以從酵母菌細胞或動物細胞,特別是哺乳動物的細胞。同樣也可能使用昆蟲或植物細胞。
本發明同樣關於動物,除了人類,它包括至少一個依照本發明所轉換的細胞。
依據另一個方面,本發明的一個主題是生產一種本發明所述的抗體或其功能性斷片之一的程序,其特徵是它包括了以下的階段;a)依據本發明,在一個培養基中以適當的培養條件培養一寄主細胞;及b)將這樣由培養基或該被培養的細胞開始生產的抗體或他們功能性斷片之一收集起來。
依照本發明所轉換之細胞可以被用在製備依照本發明所重組的多肽之程序中。製備依據本發明重組形式之多肽的程序特徵在於,他們採用一個載體及/或一個依據本發明之載體所轉換之細胞,其本身就被包括在本發明之中。最好是,一個依據本發明被載體所轉換的細胞在允許該多肽表達並且該重組的肽被收集起來的條件下被培養。
就如已經提到的,該寄主細胞可以由原核的或真核的系統選取。特別是,有可能辨識依據本發明的核苷酸序列,方便在這樣的原核或真核系統中的分泌作用。一個依照本發明而帶有這樣序列的載體因此可以有利地被使用來生產重組的蛋白質,以方便被分泌之用。實際上,這些重要的重組蛋白質的純化將會簡便多了,其原因乃是由於他們是存在細胞培養液的浮懸物中而非在寄主細胞的內部。
同樣也可能以化學合成方式製備本發明的多肽。這樣的製備程序同樣是本發明的一個主題。熟練此技術的人仕知道該化學合成的程序,例如利用固態的技術(特別參考Steward等人.,1984,固態縮氨酸的合成,Pierce Chem.Company,Rockford,111,第二版.,(1984))或採用部份固態之技術,利用將斷片濃縮,或利用在溶液中以傳統合成的技術。以合成方式獲得且能夠包含相對應的非自然的氨基酸的多肽同樣也包括在本發明中。
可以利用本發明的一個程序獲得之抗體,或他們功能性斷片之一同樣包含在本發明。
依據第二個實施例,本發明係關於一個依據本發明,如以上進一步所描述之抗體,其特徵在於,除此之外,可以特別與一人類酪氨酸激酶家族的受體結合及/或能夠阻止這樣受體的酪氨酸激酶的活動。
在第一個實施例中,這樣一個的抗體是由包括一個能夠特別抑制EGF在人類表皮生長因子受體(EGFR)結合,及/或抑制該EGFR酪氨酸激酶活動的第二基序所組成之雙專一性抗體。在本發明的一個更佳的實施例中,該第二抗-EGFR基序是由鼠科單株抗體225所衍生出來的,它的嵌合衍生物C225或任何由這個抗體225所衍生出的人源化抗體。
在第二個實施例中,這樣一個抗體是包括一個能夠特別抑制由HER2/neu受體所控制的活動,及/或抑制該HER2/neu酪氨酸激酶活動的第二基序所組成之雙專一性抗體。在本發明的一個更佳的實施例中,該第二抗-HER2/neu基序是由鼠科單株抗體4D5 or 2C4或人源化抗體Trastuzumab或Pertuzumab所衍生出來的。
在第三個實施例中,這樣一個抗體是由包含能夠特別抑制Hepatocyte生長因子(HGF)結合到cMET受體上,及/或特別能抑制該cMET受體的酪氨酸激酶活動的第二基序所組成的雙專一性抗體。
最後,在一個最後的實施例中,這樣的抗體包含一個雙專一性抗體,它含有能夠特別抑制巨噬細胞刺激蛋白質(Macrophage Stimulating Protein)(MSP)結合到RON受體上,及/或特別能抑制該RON受體的酪氨酸激酶活動的第二基序。
依據本發明的另一個實施例,人們也認為本發明的抗體能夠和任何種類與腫瘤發展有關的受體相互作用,例如,沒有限制的,VEGFR,FGF(Fibroblast生長因子),PDGF(Platelet所衍生的生長因子)或CXCR4或2(Chemokine受體型式4或2)。
此雙專一性或雙功能性的抗體形成一個第二代的單株抗體,其中兩種不同的可變化區域被結合在同一個分子中(Hollinger及Bohlen,1999,癌症及轉移,rev.18:411-419)。它們在診斷及治療兩個領域中的應用都已經被證明,它們有能力補充新的效應功能或能夠對腫瘤細胞表面上的幾個分子進行攻撃。這些抗體可以利用化學方法(Glennie MJ等人,1987,J.Immunol.,139,2367-2375;Repp R.等人,1995,J.Hemat.,377-382),或利用體細胞的方法(Staerz U.D.and Bevan M.J.,1986,PNAS 83,1453-1457;Suresh M.R等人,1986,Method Enzymol.,121:210-228)獲得,但同樣且最好是能使雜二聚體被迫進行的基
因工程技巧(Merchand等人,1998 Nature Biotech.,16:677-681),因而方便對所尋找的抗體進行純化步驟(Merchand等人,1998 Nature Biotech.,16:677-681)。
這些雙專一性抗體可以被結構成如整個IgG,如雙專一性Fab’2,如Fab’PEG或如雙特異性抗體(diabodies)或其他雙專一性scFv,但同樣也如一四價雙專一性抗體,或對每一個標的之抗原出現兩個結合位點(Park等人,2000,Mol.Immunol.,37(18):1123-30)或是它如以上所進一步描述的斷片。
除了一個經濟優勢之事實外,也就是一個雙專一性抗體的生產及施藥是比兩個獨特的抗體要簡單的多了,使用這樣的雙專一性抗體還有一優點是可以降低治療時的毒性。這是因為一個雙專一性抗體的使用允許循環的抗體全部數量可以減低並且,最後導致它可能的毒性降低。
在本發明的一個較佳的實施例中,該雙專一性抗體是一個雙價的或四價的抗體。
本發明同樣係關於一種藥學的合成物,其包含一種依據本發明利用主動原則之抗體或其功能性斷片之一,最好是與一賦形劑或/及一藥理上可接受的載具混合在一起。
依照另外一個實施例,本發明同樣係關於一如以上所進一步描述的藥學組合物,它包含至少一個由特別可以抑制IGF-IR,EGFR,HER2/neu,VEGFR,Cmet及/或RON之酪氨酸基酶活動的化合物中所選取的第二個化合物。
在本發明中第二個較佳的觀點中,該第二個化合物的選取是由這些單離的抗-EGFR,-IGF-IR,-HER2/neu,抗-VEGFR,-Cmet及/或-RON抗體,或他們功能性的斷片中選取,他們能夠抑制增生性的及/或抗-細胞死亡及/或血管生長的,及/或由該受體控制的轉移性增生誘導物活動的。
依據本發明的另一個實施例,該合成物包括,如可供一同時,分別的或連續的使用的組合物產品,至少一個IGF-IR,EGFR,HER2/neu,VEGFR,cMET及/或RON.的酪氨酸激酶活動的抗化劑。
在另一個較佳實施例中,該受體的酪氨酸激酶活動抗化劑是由包含天然劑,dianilinophthalimides,pyrazolo-或吡咯並吡啶並嘧啶(pyrrolopyridopyrimidines)或其他quinazilines所組成之群組中選取。這樣的抑制性藥劑對熟悉此行業的人仕皆不陌生,並且在此文獻中有敍述(Ciardiello F.,Drugs 2000,Suppl.1,25-32)。
本發明的另一個輔助性的實施例包括如以上所描述的一個合成物,它進一步包括一個細胞毒素的/抑制細胞的藥劑,可供同時的,分別的或連續的使用之組合產品。
“同時使用”的意思是指本發明所述之合成物的兩種混合物的施藥是以單一及相同的藥劑形式。
“分別使用”的意思是指,本發明所述之合成物的兩種混合物的施藥是在同一時間,以不同的藥劑形式。
“連續的使用”的意思是指,本發明所述之合成物的兩種混合物連續的每一個施藥是以不同藥劑的形式。
在一般形態中,依照本發明的合成物很可觀地增加治療癌症的功效。換言之,依照本發明之抗-IGF-IR抗體之治療效果因施加細胞毒素劑有令人異想不到的潛能。主要接下來由本發明之合成物所產生的另外有利點,係關於使用更低的有效的主動原則之藥劑量,它可以避免或減低次要效應出現的危險,特別是細胞毒素劑的影響。
此外,這個依照本發明的合成物可以更快地獲得所預期的醫療效。
在一個特別優先的實施例中,依據本發明如混合物產品一樣的該合成物的特徵在於,該細胞毒素的/抑制細胞的藥劑是由可與DNA相互作用的藥劑,抗新陳代謝物,拓樸異構酶I或II抗化劑,或其他紡錘絲抗化劑或穩定劑或其他可以被用在化療法的藥劑中選取的。例如,在2001版的VIDAL中,對前面所述細胞毒素藥劑的每一個種類,其細胞毒素的/抑制細胞的藥劑皆被列舉出來,在附屬於腫瘤學及血液學“細胞毒素”專欄,而專門針對相關之化合物的一頁中,這些參考此件文獻而被提到的細胞毒素化合物,在此處是以最佳的細胞毒素藥劑被列舉出來。
這樣藥劑的例子,它被提到的烷化基劑包括抗-代謝物,抗-腫瘤抗生素,有絲分裂的抗化劑,染色質(chromatin)功能抗化劑,抗血管新生劑,抗-雌激素,抗-雄激素或免疫控制劑。
這樣的藥劑,例如,在2001版的VIDAL中有提到,附在癌症學及血液學專欄“細胞毒素Cytotoxics”上專門研究化合物的一頁中,以參考這個文件而列出的這些細胞毒素化合物在此被提出為所要的細胞抑制劑。
更特別地,依據本發明下列的藥劑是較佳的。
“烷化基劑”是指任何可以交錯連結或烷化任何分子之物質,最好是在一個細胞內的核酸(例如,DNA)。烷化基劑的例子包括了含氮芥子(nitrogen mustard)例如雙氯乙基甲胺(mechlorethamine),苯丁酸氮芥(chlorambucol),威克瘤(melphalen),chlorydrate,pipobromen,prednimustin,disodic-phosphate或estramustine;oxazophorins例如環磷醯胺
(cyclophosphamide),六甲嘧胺(altretamine),曲磷胺(trofosfamide),sulfofosfamide或異環磷醯胺(ifosfamide);氮丙啶(aziridines)或imine-ethylènes例如三胺硫磷(thiotepa),triethylenamine或altetramine;nitrosourea例如carmustine,streptozocin,fotemustin或lomustine;烷基磺酸鹽(alkyle-sulfonates)例如邁樂寧(busulfan),丁四醇磺酯(treosulfan)或improsulfan;triazenes例如達卡巴仁(dacarbazine);或鉑複合物(platinum complexes例如順-鉑(cis-platinum),歐力普(oxaliplatin)及佳鉑帝(carboplatin).
“抗-代謝物”是指利用干擾某些活動來阻止細胞生長及/或新陳代謝的物質,通常是DNA合成物。抗-代謝物的例子包括methotrexate,5-fluoruracil,floxuridine,5-fluorodeoxyuridine,capecitabine,cytarabine,fludarabine,cytosine arabinoside,6-mercaptopurine(6-MP),6-thioguanine(6-TG),chlorodesoxyadenosine,5-azacytidine,gemcitabine,cladribine,deoxycoformycin及pentostatin。
“抗-腫瘤抗生素"是指可以防止或抑制DNA,RNA及/或蛋白質合成之化合物。例如抗腫瘤抗生素包括doxorubicin,daunorubicin,idarubicin,valrubicin,mitoxantrone,dactinomycin,mithramycin,plicamycin,mitomycin C,bleomycin,及procarbazine。
“有絲分裂抗化劑”防止細胞循環的正常進展及有絲分裂、通常,microtubule抗化劑或例如paclitaxel及docetaxel的taxoide可以抑制有絲分裂。Vinca alkaloid例如vinblastine,長春花鹼(vincristine),vindesine及vinorelbine也同樣可以抑制有絲分裂。
“核染色質(Chromatin)功能抗化劑”或“拓樸異構酶topoisomerase抗化劑”是指可抑制核染色質模型chromatin modeling蛋白質的正常功能的物質,例如拓樸異構酶I(topoisomerase I)或拓樸異構酶II(topoisomerase II)。核染色質(Chromatin)功能抗化劑的例子,對拓樸異構酶I(topoisomerase I)而言包括camptothecine及它的衍生物topotecan或irinotecan,且對拓樸異構酶II(topoisomerase II)而言,包括etoposide,etoposide phosphate及teniposide。
“抗-血管新生劑”是指任何可以抑制血管生長的藥品,化合物,物質或藥劑。例舉的抗-血管新生劑包括,但絕不限制在,razoxin,marimastat,batimastat,prinomastat,tanomastat,ilomastat,CGS-27023A,halofuginon,COL-3,neovastat,BMS-275291,thalidomide,CDC 501,DMXAA,L-651582,squalamine,endostatin,SU5416,SU6668,干擾素-alpha(interferon-alpha),EMD121974,白細胞介素-12(interleukin-12),IM862,angiostatin及vitaxin。
“抗-雌激素”或“抗-雌激素劑”是指任何降低,對抗或抑制雌激素活動的物質。抗-雌激素劑的例子是tamoxifen,toremifene,raloxifene,droloxifene,iodoxyfene,anastrozole,letrozole,及exemestane。
“抗-雄激素”或“抗-雄激素劑”是指任何降低,對抗或抑制雄激素活動的物質。抗-雄激素劑的例子是flutamide,nilutamide,bicalutamide,sprironolactone,cyproterone acetate,finasteride及cimitidine。
“免疫控制劑”是指可以刺激該免疫系統物質。免疫控制劑的例子包括干擾素及白細胞介素,例如aldesleukine,OCT-43,denileukin diflitox及白細胞介素-2,腫瘤的壞死(tumoral necrose)因子,例如tasonermine或其他的免疫控制劑,例如lentinan,sizofiran,roquinimex,pidotimod,pegademase,thymopentine,poly I:C或和5-fluorouracil相關的levamisole。
更詳細的內容是,熟悉此行業的人可以參考由“Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique”編輯並且名稱為“traité de chimie thérapeutique,vol.6,Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers,edition TEC & DOC,2003”的手冊。
在一個特別理想的實施例中,依照本發明而以一混合產品的該組合物的特徵在於該細胞毒素劑是以化學方式與該抗體結合供同時的使用。
在一個特別理想的實施例中,依照本發明的該合成物的特徵在於,該細胞毒素的/抑制細胞的藥劑是從紡錘體抗化劑或穩定劑中選取的,最好是vinorelbine及/或vinflunine及/或長春花鹼(vincristine)。
為了方便該抑制細胞劑與本發明的抗體之間的連結,可以在兩個要結合的化合物之間特別引入間隔分子,例如聚(烷基)乙二醇像聚乙烯乙二醇或其他氨基酸,或,在另一個實施例中,採用活躍的抑制細胞劑之衍生物,而該衍生物中已導入可以與本發明抗體反應的多種功能。這些結合技術對熟悉此行業人仕而言是眾所皆知的,因此在目前的敍述中不再重複說明了。
其他EGFR的抗化劑,可以包括,但不受限制地,該抗-EGFR單株抗體C225及22Mab(ImClone Systems Incorporated),ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys),EMD-7200(Merck KgaA)或者該化合物ZD-1834,ZD-1838及ZD-1839(AstraZeneca),PKI-166(Novartis),PKI-166/CGP-75166(Novartis),PTK 787(Novartis),CP 701(Cephalon),
Ieflunomide(Pharmacia/Sugen),CI-1033(Warner-Lambert Parke-Davis),CI-1033/PD 183,805(Warner-Lambert Parke-Davis),CL-387,785(Wyeth-Ayerst),BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche),Naamidine A(Bristol-Myers Squibb),RC-3940-II(Pharmacia),BIBX-1382(Boehringer Ingelheim),OLX-103(Merck & Co),VRCTC-310(Ventech Research),EGF融合毒素(fusion toxin)(Seragen Inc.),DAB-389(Seragen/Lilgand),ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund),RG-50864(INSERM),LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center),WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center),GW-282974(Glaxo),KT-8391(Kyowa Hakko)或是“EGFR疫苗”(York Medical/Centro de Immunologia Molecular).
依照本發明又一個實施例,如以上所描述的合成物可以同樣地包括另一個對抗HER2/neu受體的細胞外區域的抗體組合物,如一個混合產品供同時的,分別的或連續的使用,目的是防止及治療癌症,特別是過度表達HER2/neu受體及受體IGF-IR及/或EGFR的腫瘤,特別是如乳癌。
特別是參考Albanell等人(國家腫瘤學會the National Cancer Institute,93(24):1830-1831,2001)的J.及Lu等人(J.of國家腫瘤學會the National Cancer Institute,93(24):1852-1857,2001)的出版物,以證明依照本發明在結合一個抗-HER2/neu抗體與一個抗-IGF-IR抗體時有出乎預料的重要性。
以一種特別的方式,依據本發明之該合成物的抗--HER2/neu抗體是被稱為Trastuzumab(同樣也被稱為Herceptin)之抗體。
本發明係關於,在另一方面,一個特徵在於,至少其中該抗體之一,或他們功能性斷片之一是與一細胞毒素及/或一個放射性元素結合的合成物。
最好是,該毒素或該放射性元素是能夠抑制表達IGF-IR細胞的至少一個細胞活動,在更理想的方式是能夠防止該細胞的生長或增生,特別是完全使該細胞失去活性。
同樣理想的是,該毒素是一個腸細菌毒素,特別是Pseudomonas外毒素(exotoxin)A。
最好是與該抗體結合用以治療之用的該放射性元素(或放射性同位素)是放射出γ射線的同位素,最好是碘131,釔90,金199,鈀100,銅67,鉍217及銻211。放射出beta及alpha射線的同位素同樣也可以用來治療之用。
當提到與至少一個抗體,或它功能性斷片之一結合的毒素或放射性元素,它的意思是指,任何允許該毒素或該放射性元素與至少該抗體之一結合的方式,特別是,藉著引入或沒有引入一連結分子,是在兩個化合物之間利用共價鍵來結合。
在這些允許以一個化學方式(共價鍵),靜電或非共價鍵方式將所有或部份結合物元素結合的藥劑中,可以特別提到苯並醌(benzoquinone),碳化二亞胺(carbodiimide)而更特是EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimide hydrochloride),dimaleimide,dithiobis-nitrobenzoic acid(DTNB),N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate(SATA),該橋接劑具有一個或更多可與紫外線(U.V.)起反應的苯基疊氮(phenylazide)族,而最好是N-[-4-(azidosalicylamino)butyl]-3’-(2’-pyridyldithio)propionamide(APDP),N-succinimid-yl 3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP),6-hydrazino-nicotinamide(HYNIC)。
另外形式的結合,特別是為放射性元素,可以包括使用雙功能的離子螯合劑(chelator)。
在這些螯合劑中,可能可提到由EDTA(ethylenediaminetetraacetic酸)或由DTPA(diethylenetriaminepentaacetic酸)所衍生的螯合劑已經發展出來做結合金屬,特別是放射性金屬,及免疫球蛋白之用。
因此,DTPA及它的衍生物可以被在碳鏈上的不同群組取代,為了是增加該配位體-金屬複合物的穩定性及堅硬性(Krejcarek等人,1977;Brechbiel等人.,1991;Gansow,1991;US專利4,831,175)
例如,diethylenetriaminepentaacetic酸(DTPA)及它的衍生物以他們自由形態或與一個金屬離子構成複合物形已經常期被廣泛地使用在醫藥及生物學上,具有顯著的特性是其可以與金屬離子形成穩定的螯合物(chelates)及可以與在治療或診斷上重要的蛋白質,例如在腫瘤治療中(Meases等人,1984;Gansow等人,1990)用以開發放射性免疫結合物的抗體相結合。
同樣較理想的是,依據本發明形成該接合物的至少一個抗體是由其功能性斷片之中,特別是由他們的Fc的元件中截取下來,例如該scFv斷片,所選擇出的。
本發明此外還包括使用依照本發明的合成物來製備一種藥劑。
更特別的是,依據另一個實施例,本發明係關於使用一個抗體或其功能性斷片之一,及/或一種合成物來製備一藥劑,用以預防或治療一種由於IGF-IR,的過度表達及/
或異常活化所引起的疾病,及/或與利用IGF1或IGF2與IGF-IR相互作用而傳導的訊號轉導路徑超活化有關聯的疾病。
依據本發明還有一較佳實施例,本發明係關於使用一個抗體或其功能性斷片之一,及/或一種合成物來製備一種藥劑用以預防或治療一種由於IGF-IR,的過度表達及/或異常活化所引起的疾病,及/或與利用由於IGF2與IGF-IR相互作用而引發傳導的訊號轉導路徑超活化情況有關聯的疾病。
最好是,依照本發明的該使用的特徵是該藥劑的施配沒有引發或只是輕微引發與抑制胰岛素受體IR,相關的次要效果,也就是說抑制因為該藥劑的出現而產生IR與其自然配位體相互作,特別是利用一與該藥劑與IR結合有關聯的競爭性的抑制。
本發明更進一步包括一個抗體,或其功能性斷片之一的使用,最好是人源化的,及/或使用依據本發明的合成物來製備一種藥劑用以阻止正常細胞轉換成具有腫瘤特性的細胞,最好是依靠IGF的,特別是至少依靠IGF2的細胞。
本發明同樣係關於一個抗體,或其功能性斷片之一的使用,最好是人源化的,及/或使用依據本發明的化合物來製備一用以阻止腫瘤細胞的生長及/或增生,最好是依靠IGF的,特別是至少依靠IGF2的細胞。
在一般的方式中,本發明的一個主題是,一個抗體,最好是人源化的,或其功能性斷片之一的使用,及/或使用依據本發明的合成物來製備一種藥劑,用以防止或治療,最好是表達IGF-IR的癌症,及/或最好是由於IGF1及/或IGF2與IGF-IR相互作用而引發傳導的訊號轉導路徑有超活化情形的腫瘤,例如,像IRS1的過度表達。
本發明的主題同樣也是使用,最好是人源化的一個抗體,或其功能性斷片之一,及/或使用依據本發明的合成物來製備一種用以防止或治療最好是牛皮癬(psoriasis),牛皮癬表皮的超級增生可能是與IGF-IR的表達或過度表達相關聯的,及/或IGF-IR與它的自然配位體,及/或EGFR與它的自然配位體,相互作用而引發傳導的訊號轉導路徑有超活化情況相關聯(Wraight C.J.等人,Nat.Biotechnol.,2000,18(5):521-526在牛皮癬中以類胰島素生長因子I受體反義低聚核苷酸(antisense oligonucleotides)逆轉表皮的超級增生)。
本發明也是關於此抗體,最好是人源化的,或任何其功能性斷片的使用,或/及任何包含該抗體的合成物,用以製備治療或預防粥樣硬化(atherosclerosis)的藥劑。在可以預防及/或治療的過度表達IGF-IR的腫瘤中最好是,前列腺惡性腫瘤,骨肉惡性
腫瘤,肺惡性腫瘤,乳房惡性腫瘤,子宮內膜惡性腫瘤,多重骨膸惡性腫瘤,卵巢惡性腫瘤或結腸惡性腫瘤或任何其他惡性腫瘤。
在一個更理想的實施例,因為有特別能力取代IGF2,本發明係關於依照本發明使用一個抗體,或其功能性斷片,來預防,診斷或治療結腸癌,因為人們知道IGF2與這個腫瘤特別有關聯的。
依據還有另一個的觀點,本發明的主題是一個方法用以診斷,最好是體外的,與一過度表達或一低度表達IGF-IR,最好是過度表達相關的疾病,由一個被懷疑有IGF-IR不正常存在的生物樣本開始,其特徵是該生物樣本與一依照本發明的一個抗體,或其功能性斷片之一接觸,若有需要有可能將該抗體標示。最好是,在該診斷方法中所述與一過度表達IGF-IR相關的該疾病是腫瘤。該抗體,或其功能性斷片之一,可以是一免疫結合物或一個標籤的抗體形式出現,因而可獲得一可偵測及/或可量化的訊號。
本發明的一個主題是一個在體外診斷病理學情況的方法,該情況的特徵是與正常相較為異常表達IGF-IR,該方法包括將由一個被懷疑有IGF-IR不正常存在的生物樣本與一依照本發明的一個抗體接觸,在有利於形成一IGF-IR/抗體合成物的條件下,並且檢測該合成物以表現該IGF-IR出現在該樣本中。在一理想的實施例中,該抗體是被標示的。
在第一個方面,IGF-IR的異常表達是IGF-IR的一種過度表達。在第二個方面,該異常表達是IGF-IR的一種低度表達。
依據本發明所標示的抗體或他們的功能性斷片包括,例如,被稱為免疫結合物的抗體,其可以與例如酵素,像過氧化物酶(peroxidase),鹼性磷酸酶類(alkaline phosphatase),α-D-半乳糖甙酶(α-D-galactosidase),葡糖氧化酶(glucose oxydase),葡糖澱粉酶(glucose amylase),碳酸酐酶(carbonic anhydrase),乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase),溶菌酶(lysozyme),蘋果酸酯脫氫酶(malate dehydrogenase)或葡糖6-磷酸鹽脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase)結合或與一個分子結合,例如生物素(biotin),digoxygenin或5-bromodeoxyuridine。瑩光的標記可以同樣與依據本發明之抗體或與他們功能性斷片結合,而特別是包括螢光素(fluorescein)及它的衍生物,螢色物(fluorochrome),若丹明(rhodamine)及它的衍生物,GFP(GFP代表“綠色瑩光蛋白質Green Fluorescent Protein”),dansyl,繖形酮(umbelliferone)等等。在這樣的結合物中,本發明的抗體或是他們的功能
性斷片是可以用熟悉此行業的人士所知道的方法來製備。他們可以與酵素,或瑩光標示物直接結合,或經由一個間隔基團(spacer group)的中間物或一個連結群組,例如一個聚乙醛(polyaldehyde),如戊二醛(glutaraldehyde),二乙胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA),diethylene-triaminepentaacetic acid(DPTA),或使用如那些以上所提到治療用的結合物之結合劑。這個包含有螢光素(fluorescein型式標示物的結合物可以利用與一個異硫氰酸鹽田(isothiocyanate)反應的方式來製備。
其他的接合物可以同樣包括化學冷光的標示例如魯米諾(luminol)及dioxetanes,及生物-冷光標示(bio-luminescent labels),例如螢光酶(luciferase)及螢光素(luciferin),或其他放射性的標示例如碘123,碘125,碘126,碘133,溴77,鎝99m,銦111,銦113m,鎵67,鎵68,釕95,釕97,釕103,釕105,汞107,汞203,錸99m,錸101,錸105,鈧47,碲121m,碲122m,碲125m,銩165,銩167,銩168,氟18,釔199,碘131。熟悉此行業技術的人仕所知道,用來將該治療放射同位素與該抗體直接地或利用以上所提到,例如EDTA,DTPA的螯合劑結合的方法,可以被用來當做診斷中使用的放射性元素。同樣也可以提到用氯胺chloramine T方法[Hunter W.M及Greenwood F.C.(1962)Nature 194:495]與Na[I125]標示,或以Crockford等人(美國專利4,424,200)的技術與其他technetium99m標示,或利用Hnatowich(美國專利4,479,930)所描述的DTPA
如此,該抗體,或他們的功能性斷片,依據本發明可以被用在檢測及/或量化一生物樣本中IGF-IR的一個過度表達或一個低度表達,最好是一過度表達,其特徵在它包括下列的步驟;a)將此生物樣本與一依據本發明之抗體,或其功能性斷片之一接觸;及b)將可能形成的IGF-IR/抗體的複合物顯示出。
在一個特別的例子中,此抗體,或他們的功能性斷片,依據本發明可以被用在檢測及/或量化一生物樣本中的IGF-IR的程序中,用於監測對一依靠IGF腫瘤或其他乾癬或脂肪沈滯引發的動脈硬化症預防的及/或治療的處理效果。
更全面而言,該抗體,或他們的功能性斷片,依據本發明可以有利地被用在任何IGF-IR的質量及/或數量需要被觀察的情況中。
最好是,此生物樣品是由一生物液體,例如血清,全部血液,細胞,一個組織樣本或人類來源的活體檢驗組織(biopsies)。
本發明的另一方面是一種診斷的方法,用以預測一個前列腺細胞樣本致癌的可能性,包括;(a)提供人類前列腺組織;及(b)在樣本中確定IGF-IR的存在,該步驟包括將該樣本依據本發明在有利於形成一個IGF-IR/抗體複合物的條件下與該抗體接觸,其中該複合物的出現代表該組織中該細胞的致癌的可能性。
在另一個實施例中,該複合物的出現代表該病人有危險發展或開始一個以過度表達該IGF-IR為特徵的病理學失調。
本發明的一個目的也是一種方法,用以追蹤,設計以減低因IGF-IR不正常表達為特徵的病理失調之治療法的進展,包括;a)在一個第一時間點檢測一個實驗樣品之樣本,以確定IGF-IR的水準;b)在一個第二時間點檢測該樣本;並且c)將第二時間點的該水準與(a)中確定之水準做比較,以確定該治療法效果,其中該樣本IGF-IR水準之降低確定了該病人的病理學失調的復原,或該樣本IGF-IR水準之增高確定了該病人的病理學失調加重。
可以使用任何程序或傳統的測試以實施這樣的測試及/或施藥。所述的測試可以是一個競爭或三明治式測試,或任何為熟知此行業的人們所知道依靠一個抗體-抗原型式成形的免疫複合物之測試法。接著依據本發明的這些應用,此抗體或它的功能性斷片之一可以被固定化或被標記。這個固定化活動可以使用熟知此行業的人仕所知道的許多支持物來實施。這些支持物特別包括玻璃,聚苯乙烯,聚丙烯,聚乙烯,葡聚糖(dextran),尼龍或天然的或修改過的細胞。這些支持物可以是可溶解或不可溶解的。
以一個例子說明的方式,一個較佳的方法利用了免疫瑩光,或放射性-免疫測定法(RIA)技術或相同技術而被應用到依據ELISA技術之免疫酶的程序中。
因此,本發明同樣包括實施一個診斷由於表達或過度表達一個IGF-IR所引發的疾病的方法,或進行一個用來檢測及/或在一個生物樣本中對過度表達或低度表達IGF-IR,最好是該受體的一個過度表達,之量化所必需的工具組或套組(sets),其特徵是該工具組或套組包括下列元件;a)一個抗體,或它功能性斷片之一,依據本發明;b)隨意地,可以形成有利於免疫學反應的該培養基之試劑;
c)隨意地,可以允許由該免疫學反應所產生的IGF-IR/抗體複合物顯示的試劑。
本發明此外還關係到使用一個依據本發明的混合物產品的合成物,以製備一種藥劑,用以防止或治療腫瘤,特別是一般以該細胞毒素劑或該抗-HER2/neu抗體為用藥來治療之腫瘤及,特別是,該腫瘤細胞是表達或過度表達該IGF-IR.的癌症。
本發明的一個主題同樣是使用本發明的一個抗體來製備一種藥劑,其特別針對表達或過度表達該IGF-IR細胞有生物性活躍的化合物為目標的藥劑。
在此所謂生物性活躍的化合物是指任何可以控制,特別是抑制細胞活動,特別是他們的生長,他們的增生,轉錄或基因轉譯的化合物。
本發明的主題同樣也是一個依據本發明之體內診斷的試劑,它包括了抗體,或它功能性斷片之一,最好是標記的,特別是放射性標記的,及它在醫學上成像的應用,特別是用來測偵與一個細胞表達或過度表達IGF-IR.有關的癌症。
本發明同樣也是關於一種混合物產品的合成物,或關於一個抗-IGF-IR/毒素結合物或放射性元素,依據本發明,當做一種藥劑。
最好是,依照本發明而為混合物產品的該合成物或該結合物將與一個賦形劑及/或一藥理上可接受的工具混合。
在目前的敍述中,藥理上可接受的工具的意思是指明一個化合物或一個化合物的組合物進入一藥品的成份中而沒有引起次要的反應,而且他們可使得,例如,這些有效的化合物施藥更方便,增加它在身體內的生命期及/或它的效力,增加在溶液中的可溶性或改善它保存情況。這些藥理上可接受的工具是大眾所知的,而且將會被此行業中熟練技術人仕對所選擇的有效化合物施藥時的特性及形態為函數來做改變。
最好是,這些化合物將會利用全身的路徑配給,特別是利用靜脈的途徑,利用肌肉的,皮膚的,內腹膜的或皮下的路徑,或從口服途徑。以一個更好的方式,包括本發明抗體的合成物以連續的方式施藥幾次。
他們施藥的方式,劑量及最佳的藥理上形式可以依照建立對一個病人治療方法時所考慮的標準,例如,年齡或病人的體重,他/她的一般情況的嚴重性,對治療的容忍度及所注意到的副作用而決定。
本發明的其他特徵及有利點出現在接下來有例子配合的敍述中以及在以下附有說明之圖示中。
目的是產生特別對抗IGF-IR而不會辨識IR的Mab,一個包含6個篩選階段的計劃按以下步驟實施。
它包括;-以人類重組的IGF-IR使老鼠免疫,為的是產生雜交腫瘤,-以提供免疫的重組蛋白質上之ELISA篩選培養液浮懸物,-以在MCF-7腫瘤細胞表面上被過度表達的自然受體上之ELISA,測試所有呈陽性的雜交腫瘤的浮懸物,-進行結合實驗以選取可以特別辨識IGF-IR之抗體,-證實在這個階段所選取的抗體能夠抑制在體外的MCF-7腫瘤細胞被誘發的IGF1之增生,-確定以對腫瘤MCF-7之生長影響為條件而保留的候選物在裸鼠體內的活動。
將會在下面的第1個例子中簡短地描述所有獲得的這些不同的階段及結果。
在該免疫階段,老鼠利用皮下的路徑被注射兩次8 μg重組的IGF-IR。在將鼠類的骨髓瘤(myeloma)Sp2OAg14細胞與脾臟細胞融合的三天前,老鼠接受由靜脈注射3μg重組的受體。在此融合的14天之後,雜交腫瘤的懸浮物在一個以重組的IGF-IR敏感處理過的玻璃板(plates)上被ELISA所篩選,。此被確定為陽性的雜交腫瘤之懸浮物在以FACScan分析法測試之前被保留並且放大,以便證實所產生的抗體同樣能夠辨識自然的IGF-IR。
與人類IGF-IR cDNA穩定轉移(transfected)的NIH 3T3細胞在補充10%小牛免疫血清的DMEM中成長。利用刮除的方式,對免疫血清強力需求的細胞利用離心力方式進一步收集。細胞的顆粒物以磷酸鹽緩衝液處理的食鹽水(phosphate buffered saline)清洗,並且在含有蛋白酶抗化劑而成份為10 mM Tris-HCl pH 7.5的緩衝溶液之溶胞作用緩衝液(lysis buffer)中再被懸浮出來(resuspended)。大約1 ml的緩衝溶液被加到25.106個細胞中。細胞進一步經由3次冷涷-融化的循環,接著以1900 rpm速度在一Potter homogeniser
中以30次來回撞擊而被溶解。在聲裂法之後,在+4℃下15分鐘時間內以1000 g的離心力去除。全部的細胞膜在+4℃.的溫度下,1個小時中以105,000 g的離心力收集。膜的顆粒在+4℃.的溫度下,1個小時中以105,000 g的離心力處理。最後的顆粒在包含150 mM氯化鈉NaCl,0.5% IGEPAL,0.5% Triton X-100,0.25%鈉deoxycholate及蛋白酶(protease)抗化劑的50 mM Tris-HCl緩衝溶液中再被懸浮出來(resuspended)。不能溶解的物質與包含有hIGF-IR的可溶解的提取物,在+4℃.的溫度下,1個小時中以10,000 g的離心力分離出來。膜溶解物以bicinchoninic檢測法分析其濃度,而以western blot分析其IGF-IR。
已被敍述能辨識IGF-IR alpha-次單元而具有商業價值的單株抗體17-69(Neomarkers,Fremont,CA,USA),首次被塗上Protein A FlashPlate® 96-well微滴盤據(microplates)(Perkin Elmer,Boston,MA,USA)以使IGF-IR失去活性。一種在PBS中20 μg/ml的200 μl在+4℃的溫度下被加入到每一個well中並且培養一整晚。此包含殘留物(residual)17-6而沒有被貼附到蛋白質A的緩衝液利用吸取法去除。濃度為100 μg/ml的200μl膜溶解物進一步被加入並且在室溫下培養2個小時,以便使IGF-IR失去活性。沒有被捕捉到蛋白以吸取法去除。對競爭性檢測,在at 100 pM條件下,使[125I]-IGF1(Perkin Elmer,Boston,MA,USA)或[125I]-IGF2(Amersham Biosciences,Saclay,France)IGF-IR失去活性的結合之測量,是在單株抗體I-3466或配位體IGF1,IGF2及胰島素(Sigma,Saint-Quentin Fallavier,France),在包含50 mM Hepes pH 7.6,150 mM NaCl,0.05% Tween 20,1%牛免疫血清albumin及1 mM PMSF變化濃度的結合緩衝液中,其範圍是從1 pM到1 μM下,進行。該玻璃板被放在室溫下培養2小時,然後在一Packard Top Count微滴盤焛爍計數器Microplate Scintillation Counter上計算。在μM of IGF1下沒有特別的結合被確定。單株抗體9G4,它並非針對hIGF-IR但特別可辨識一個大腸桿菌(E.coli)蛋白質,被用來當做是老鼠IgG1同種型(isotype)的控制。
全部特別的[125I]-IGF1及[125I]-IGF2的結合情況以配位體濃度為函數在半對數(semilog)的圖式上畫出來。需要用來抑制50%(IC50)放射性配體(radioligand)結合之不同抗化劑之濃度是利用圖1及圖2所得的Σ字型(sigmoid)競爭曲線來確定結果的。
IGF1及IGF2兩個配位體皆有效地將[125I]-IGF1結合移位到被去除活性的
hIGF-IR,因而使胰島素及同種型isotype控制抗體9G4在濃度低於500 nM(圖1)時則無法抑制[125I]-IGF1結合。單株抗體I-3466可以0.021 nM的IC50(圖1)來抑制[125I]-IGF1的結合,它是30倍低於用於確定非放射性標示的IGF1所用的C50。
還有,I-3466抗體同樣也展示[125I]-IGF2對失去活性的hIGF-IR(圖2)有一強烈的結合抑制活動。在此案例中,由競爭曲線推算出的IC50的數值大約是0.1 nM。此I-3466對IGF2阻斷活動力與IGF2(IC50=0.06 nM)所引發的抑制性活動相同。這比IGF1(IC50=0.02 nM)的抑制性活動稍微低,而較胰島素(IC50~200 nM)顯著大的多了。如所預期的,主控抗體9G4沒有展示任何IGF2阻斷活動。
如以上所指出的一樣,IGF-IR被許多的腫瘤過度表達,但已進一步被敍述過的事實是,在許多的乳房及結腸腫瘤中,增生訊號是經由IGF2(有時候被寫成IGF-2,IGF-II或IGFII)而傳給受體。因此有必要保證MAb I-3466同樣能夠抑制在MCF-7細胞上IGF1及IGF2-引發在體外的生長。為了要這樣做,細胞在一不含血淸的200 μl培養基中((不含酚紅的-RPMI培養基中加1% L-谷醯胺Glutamine)以一個濃度為5 x 104 cells/well方式塗抹在96-well玻璃板上。在塗抹在玻璃板之後24小時後,在一最後濃度為50μg/ml(6.6 nM)的IGF1或IGF-2(最後濃度為100 ng/ml(13.2 nM)兩者之一,以有或沒有I-3466或一鼠科非中性化而被當做同種型isotype控制的抗-IGF-IR抗體(7G3)加到MCF-7細胞共經過將近額外的52小時。
抗體在由10μg/ml(66 nM)到0.0097 μg/ml(0.065 nM)的最後濃度中測試。接著細胞以0.25 μCi[3H]胸苷(thymidine)脈衝16個小時,而且加入DNA中的[3H]胸苷數量是以液體閃爍(scintillation)計量方式量取。IGF-1及IGF-2兩者很明顯地刺激MCF-7細胞的生長(表2)。
當細胞以逐漸增加劑量的同種型控制抗體來處理時,並沒有觀測到顯著的抑制情況。
相較之下,當細胞以漸增加劑量的I-3466抗體培育時,一個明顯依靠藥劑量而對IGF1(90%)及IGF2(84%)兩者-所引發增生情況的抑制情形被發現,其IC50s分別為0.7 nM及0.5 nM(表2及圖3A-3B)。
表2 I-3466抗體對IGF1(A)-或IGF2(B)-所引發的MCF-7在體外生長的影響
MCF7或HT29兩種細胞之一在20 ml不含酚紅,混合了5 mM谷醯胺,青黴素/鏈黴素(分別是100 U/100 μg/ml)及10%的牛胎兒血清的RPMI液中培養24小時。在PBS中清洗3次之後,細胞在不含酚紅,沒有牛胎兒血清並混合了5 mM的谷醯胺,青黴素/鏈黴素,0.5 μg/ml(Sigma A-8022)牛血清蛋白及5 μg/ml(Sigma T8158)鐡傳遞蛋白的培養基(RPMI)中培育12個小時。
為了活化目的,細胞首先在37℃下以欲被測試的封鎖抗體(10 μg/ml)培育15分鐘,接著IGF1或IGF2兩者之一被加入測試額外的2分鐘。這個反應被吸入的培養基停止而玻璃板被放置在冰上。細胞利用加入0.5 ml的溶胞緩衝液(50 mM tris-HCl pH 7.5,150 mM氯化納NaCl,1% Nonidet P40,0.5%鈉deoxycholate)混合了蛋白酶(protease)抗化
劑(每50 ml 1個錠劑,Boehringer Ref.:1697 498)及磷酸酶類(phosphatase)抗化劑(Calbiochem Ref.:524625(1/100))而使細胞溶解。細胞被刮落而其懸浮體被收集後以4°C放在一攪拌器上1.5小時。該溶液以12,000 rpm速度做10分鐘(4℃)的離心處理,而表面懸浮的蛋白質濃度以BCA量化。
500μg的細胞溶胞浮懸物的蛋白與該抗-IGF-IR(Santa cruz Ref.:sc-713)混合用於免疫沈澱法,並且在4℃下於攪拌器中培養1.5小時。該免疫沈澱物利用添加A-瓊脂糖蛋白質(A-agarose)(Boehringer Ref.:1 134 515)方式收取,並且在4℃下於攪拌器中整夜培養。此瓊脂糖球珠以1 ml的溶解緩衝液清洗兩次,又以一種清洗緩衝液(50 mM tris-HCl pH 7.5;500 mM NaCl;0.1% Nonidet P40;0.05% sodium deoxycholate(Boehringer 1 332 597)蛋白酶抗化劑及磷酸酶類抗化劑混合)清洗兩次,並且以一種清洗緩衝液2(50 mM tris-HCl;0.1% Nonidet P40;0.05% sodium deoxycholate(Boehringer Ref.:1 332 597),與蛋白酶抗化劑及磷酸酶類抗化劑1/100混合)清洗一次。免疫沈澱物在Laemmli緩衝液中被再次懸浮出來(resuspended),加溫到100℃ 5分鐘。該浮懸物在聚丙烯醯胺SDS凝膠(8% Novex EC6015)上以電泳法分析。這些蛋白質被移轉到一氮纖維素膜,接著以結合到HRP(BD transduction Labs PY20)的抗-磷酸酪氨酸抗體進行一個免疫印跡,或IGF-IR的beta抗-鏈(anti-chain)(Santa Cruz Ref.:sc 713)接著以一個與HRP結合的抗-兔子抗體。這個印記以化學發光法(Amersham RPN 2209)被顯示,接著在Kodak X-mat AR的膠片上以放射自顯影術顯現。
圖4a及4b代表MCF-7細胞非被刺激(lanes 1,panel A and B)或單獨被50 ng/ml IGF1(第2行,panel A)或100 ng/ml IGF2(第2行,panel B刺激。如預期的一樣,當MCF-7細胞以IGF1或IGF2培養時並沒有IGF-IR基本的刺激被觀測到。當細胞以一個IgG1同種型(isotype)控制(第3行,panel A and B)或單獨以I-3466抗體(第4行,panel A and B)處理時,沒有刺激被觀查到,這樣顯示I-3466對IGF-IR上沒有展示促效的效果。當I-3466被加入IGF1或IGF2時,一個由配位體引發的磷酸化作用的完全抑制被觀測到(第5行,panel A and B)。被用來做為同位素控制之9G4抗體對IGF1或IGF2-引發的磷酸化作用沒有影響(第6行,panel A and B)
相同的I-3466抑制活動在以IGF-1或IGF2(圖5A及5B)兩者之一所刺激的HT29細胞上也被觀測到。這些結果與例2中展示I-3466能夠取代IGF-IR的IGF1及IGF2-IR兩者所敍述是一致。
內化及下降之研究是以FACS分析法來分析的。內化研究是採用一鼠科生物素處理的(biotinylated)抗-IGF-IR單株抗體(Mab)來進行,其後以12B1 Mab稱之並且與一個和由I-3466抗體所辨認的表位不同的表位結合。9G4 Mab被視為一個同種型控制物。這兩個抗體是在我們實驗室中產生的。融合性的MCF-7細胞被胰蛋白酶化並且將每一個細胞懸浮中的1x106細胞放在FACS緩衝液中96-well的玻璃板上。玻璃板在37℃下與IGF1(50 ng/ml)或與30 μg/ml of I-3466,9G4,mIgG1兩者之一培育4小時。
與FACS緩衝液單獨培育的細胞被用來確定IGF-IR表達的基本的水準。
然後細胞被清洗二次並且將20μg/ml的biotinylated-12B1 MAb加到玻璃板plate中。為了避免受體內化,在4℃下培養30分鐘後,細胞在4℃下被清洗3次並且加入streptavidin Alexa Fluor® 488-conjugate(Molecular Probes Europe BV,Leiden,Netherlands)被著色。
表3展示在4個小時的培養期間中I-3466引起IGF-IR在MCF-7及HT29兩個細胞中下降。當細胞在當做一個同種型(isotype)控制的9G4 Mab培養時沒有下降的情況被觀察到。
然後細胞被清洗兩次並且將20 μg/ml生物素處理的-12B1 MAb(biotinylated-12B1 Mab)加到該玻璃片上。在4℃下經過30分鐘的培育以避免受體內化之後,細胞在被4℃下被清洗3次並且利用添加streptavidin Alexa Fluor® 488-conjugate(Molecular Probes Europe BV,Leiden,Netherlands)來著色。為了進行退化實驗,在用biotinylated-12B1及streptavidin Alexa Fluor® 488-conjugate染色細胞之前加入一個額外的細胞浸透的程序。
表3顯示在4個小時的培育之後I-3466造成IGF-IR在MCF-7及HT29細胞上的降低.當與當作一種同形控制的9G4 Mab一起培育時,沒有觀測到降低的情況。
為了要探測I-3466抗體在體內腫瘤生長的活動情況,已經使用了5個異種移植腫瘤模型;DU145前列腺癌,骨膸癌SK-ES-1,結腸癌HT29,非-小細胞肺癌A549及乳癌MCF-7。為了那個目的,6-8-週大雌性的athymic的裸鼠以皮下方式分別地被注射2.106,5.107,及5.106,10.106及5.106的DU-145,SK-ES-1,及HT29,A549及MCF-7。對DU145及SK-ES-1,老鼠在以細胞注射200 μg沒純化的抗體後被治療24小時。
治療每星期重複兩次。關於HT29,當腫瘤達到一個局限在49到59 mm3之間的體積時就開始治療,而且老鼠每星期被注射i.p.3次0.5 mg被純化的抗體。對A549,開始的腫瘤體積被局限在38到43 mm3之間,並且在MCF-7實驗中,他們在開始治療時是被局限在42到59 mm3之間。腫瘤體積每一星期以下列公式:π/6 x長度x宽度x高度被評估一次或兩次。
圖6A-6E展示初步的以沒有純化抗體部份進行的結果,表明I-3466能夠顯著地抑制5個被測試的細胞株體內的腫瘤生長。
為人源化I-3466抗體之輕鏈及重鏈以化學方式合之可變化區域以PCR放大,並且分別地被克隆入載有人類輕鏈κ及重鏈IgG1固定區域之抗體表現載體。此PCR引子包含36個核苷酸,其中15個核苷酸用來和載體重疊克隆區域做融入之復性重組,而其中21個核苷酸用來與可變區域做復性重組之用。精確的核苷酸序列在以下展示;
對輕鏈可變區域克隆;IF-人源化的I-3466-LCK-F(SEQ ID No.21)
[5’-ACAGATGCCAGATGCGACATTGTGATGACCCAGTCC],IF-人源化的I-3466-LCK-R(SEQ ID No.22)
[5’-TGCAGCCACCGTACGCTTGATCTCCACCTTGGTGCC],對重鏈可變區域克隆;IF-人源化的I-3466-HCG1-F(SEQ ID No.23)
[5’-ACAGGTGTCCACTCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT],IF-人源化的I-3466-HCG1-R(SEQ ID No.24)
[5’-GCCCTTGGTGGATGCGGAGGAGACTGTCACCAGGGT].
載體與BmtI及FspI的消化作用一致。融入反應依照製造商建議的規則進行。所得到的克隆結果可以序列得到確認。人類胎兒的腎臟293細胞使用輕鏈及重鏈plasmid DNAs被transfected。含有分泌的抗體的培養基被收集並且濃縮。該抗體利用蛋白質A/G柱被親和力純化並且濃縮及在PBS中被透析、蛋白質濃度被OD280nm確定而且其純度是以還原的及非還原的SDS-PAGE(圖9)來分析。
BIAcore T100儀器,CM5生物感應晶片,HBS-EP緩衝液,acetate緩衝液(pH 5),Glycine-HCl緩衝液(pH 1.5),胺結合工具是由BIAcore(Upsala,Sweden)提供的。抗-人類IgG Fc是由Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(West Grove,USA)提供,可溶解的人類第一型類胰島素生長因子-1受體(hIGF-IR)額外-細胞組成的區域(ECD)是來自Systems(Minneapolis,USA)。
所有的實驗是在25℃以流速40 μl/每分鐘的條件下進行。為了準備一個BIAcore檢測(參考圖10),一個抗-人類IgG-Fc抗體(50 μg/ml在醋酸鹽(acetate)緩衝液,pH 5)在羧甲基葡聚糖(carboxymethyl dextran)感應晶片上採用如製造商所敍述的胺結合程序而去除其活性。抗-IgG Fc抗體的11042及11111共振單元(RU)分別被連結到Flowcells(FC)1及3。以濃度5 μg/ml在0.5% P20,HBS-EP緩衝液中稀釋欲被測試的純化之Mabs,並且將其注射到FC3以達到500 to 1000 RU。FC1被當為參考細胞使用。特別的訊號相對應於
在FC2對比(versus)FC1上所得的訊號差異。此分析物(可溶性的hIGF-IR,表觀分子重量為365kDa)在90秒內以5種不同濃度(100,50,25,12.5及6.25 nM)被注射到0.5% P20 HBS-EP緩衝液中。這些濃度在以庫存溶液在0.5% P20,HBS-EP中製造。分析物的分解階段被監測10分鐘。流動的緩衝液同樣也以相同條件注射當做一個雙重參考、在每一循環之後(抗體+hIGF-IR注射),兩種Flowcells利用注射20 to 45 μl Glycine-HCl緩衝液(pH 1.5)而再生。這個再生足夠去除所有在感覺晶片獲取的Mabs及Mabs/hIGF-IR複合物。
Mab人源化的I-3466與分析物hIGF-IR-ECD的結合之特徵是,其分別的結合及分解速率常數ka及kd。平衡分解常數(KD)是以分解及結合速率常數之間的比值計算而得到。結果是在以下的表4中展示。對應於不同分析物濃度的傳感圖在圖11中被展現。
第1圖:利用單株抗體I-3466將[125I]-IGF-1結合到IGF-IR的競爭
特別的specific[125I]-IGF-1結合(以百分比%方式)以配位體濃度為函數畫在一個半對數圖形中。特別的結合數值是三個共同進行的實驗的平均值。
第2圖;利用單株抗體I-3466將[125I]-IGF-2結合到IGF-IR的競爭
特別的[125I]-IGF-2結合(以百分比%方式)以配位體濃度為函數畫在一個半對數圖形中。特別的結合數值是三個共同進行的實驗的平均值。
第3A及3B圖;I-3466抗體對IGF1-或IGF2-所引發的MCF-7在體外生長的影響。
第4A及4B圖;I-3466 Mab對IGF1(圖4A)或IGF2(圖4B)-所引發的MCF-7細胞上IGF-IR β-鏈的磷酸化作用的影響。
第5A及5B圖:I-3466 Mab對在HT29細胞上IGF1(圖5A)或IGF2(圖5B)所引發的IGF-IR β-鏈的磷酸化作用的影響。
第6A-6C圖:I-3466在DU145(Figure 6A),SK-ES-1(Figure 6B),及HT29(Figure 6C),A549(Figure 6D)及MCF-7(Figure 6E)異種移植腫瘤模型中的活動。
第7圖:老鼠I-3466(SEQ ID No.7)及利用CDR移植所得到之人源化I-3466(SEQ ID No.20)兩者輕鏈(VL)的可變區域的氨基酸序列的比較。
此*符號(星號)代表用以維持CDR環型構造的重要殘基,而符號#(sharp)代表在VL/VH介面上所發現的留存的殘基。
第8圖:老鼠I-3466(SEQ ID No.8)及利用CDR移植所得到之人源化I-3466(SEQ ID No.21)兩者重鏈(VH)的可變區域的氨基酸序列的比較。
此*符號(星號)代表用以維持CDR環型構造的重要殘基,而符號#(sharp)代表在VL/VH介面上所發現的留存的殘基。
第9圖;對純化的I-3466抗體之SDS-PAGE做分析。該配位體是如下;M:Marker.標記基因Lane 1:I-3466人源化的可變化區域,Lane 2:I-3466老鼠的可變化區域,Panel A:降低的SDS-PAGE,Panel B:沒有降低的SDS-PAGE,
對老鼠及人源化兩者的3466的固定區域。
第10圖:以圖示方式表示該生物感應器捕追的檢定。
第11圖:hIGF-IR-ECD5種不同濃度之IgG1人源化的I-3466/hIGF-IR-ECD複合物結合及分離階段的Sensorgram。
<110> 皮爾法伯製藥公司(Pierre Fabre Medicament) 克屈利萊恩(GOETSCH Liliane) 寇威內瑟利(CORVAIA Nathalie)
<120> 抗第1型類胰島素生長因子接受器之抗體及其之使用(Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof)
<130> D23693
<150> FR 05/07829
<151> 2005-07-22
<150> US 60/701,622
<151> 2005-07-22
<160> 24
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(mus musculus)
<400> 1
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
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<213> 小鼠
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體,輕鏈
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<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體,重鏈
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體,輕鏈
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<223> 人源化抗體,重鏈
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 針對人源化抗體之IF-人源化的I-3466-LCK-F引子I-3466輕鏈放大
<400> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 針對人源化抗體之IF-人源化的I-3466-LCK-R引子I-3466輕鏈放大
<400> 22
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 針對人源化抗體之IF-人源化的I-3466-HCG1-F引子I-3466重鏈放大
<400> 23
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 針對人源化抗體之IF-人源化的I-3466-HCG1-R引子I-3466重鏈放大
<400> 24
Claims (32)
- 一種對人類的第一型類胰島素生長因子受體(IGF-IR)具有一結合親和力的單離的抗體、或其結合斷片之一,其特徵在於它包含一包含序列SEQ ID Nos.2、4及6之3個CDR的重鏈以及一包含序列SEQ ID Nos.1、3及5之3個CDR的輕鏈。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其之一結合斷片,對人類的第一型類胰島素生長因子受體(IGF-IR)具有一結合親和力,其特徵在於當與該IGF-IR結合時,它係抑制自然的結合伙伴IGF1與該IGF-IR的結合而有一IC50低於0.3 nM,且它也抑制自然的結合伙伴IGF2與該IGF-IR的結合而有一IC50低於0.3 nM。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其之一結合斷片,對人類的第一型類胰島素生長因子受體(IGF-IR)具有一結合親和力,其特徵在於當與該IGF-IR結合時,它係抑制自然的結合伙伴IGF1與該IGF-IR的結合而有一IC50低於0.03 nM,且它也抑制自然的結合伙伴IGF2與該IGF-IR的結合而有一IC50低於0.1 nM。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一,其特徵在於它包含下列特性之一:a)它亦能夠100%抑制IGF1及/或IGF2所誘發的IGF-IR貝塔-鏈(beta-chain)的磷酸化作用;及b)它可以抑制IGF1及IGF2兩者所誘發的MCF-7細胞在體外的增生(in vitro proliferation),而有IC50對IGF1及IGF2分別是至少等於1 nM及0.5 nM。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一,其特徵在於該結合斷片是由斷片Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc及雙特異性抗體(diabodies)、或如聚乙二醇化斷片之任何半衰期會被增加的斷片中所選取的。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一,其特徵在於該抗體包含有序列包含氨基酸序列SEQ ID No.7、或一個與序列SEQ ID No.7在做最適當排序之後至少有80%相同之序列的一個輕鏈,或/及其特徵在於它包含有序列包含氨基酸序列SEQ ID No.8、或一個與序列SEQ ID No.8在做最適當排序之後至少有80%相同之序列的一個重鏈。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一,其特徵在於它係由一人源化抗體組成,該抗體包含i)一包含氨基酸序列SEQ ID No.17、或與序列SEQ ID No. 17在做最適當的排序後有至少80%相同度之一序列的輕鏈,及ii)一有序列包含氨基酸序列SEQ ID No.18、或與序列SEQ ID No.18在做最適當的排序後有至少80%相同度之一序列的重鏈。
- 一種單離的核酸,其特徵在於它是由下列的核酸中所選擇出來:a)編碼如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一的一種核酸、DNA或RNA;及b)如a)項中所定義之核酸之互補核酸。
- 一種包含有如申請專利範圍第8項所述之核酸的載體。
- 一種包含有如申請專利範圍第9項所述之載體的宿主細胞。
- 一種用於生產如申請專利範圍第1項所述之抗體、或其結合斷片之一的程序,其特徵在於它包括了下列的階段:a)在一個培養基中及適當培養條件下培育一如申請專利範圍第10項所述之細胞;及b)由該培養基或該被培育的細胞開始回收如此被生產的該抗體、或其結合斷片之一。
- 一種藉由如申請專利範圍第11項所述之程序獲得的抗體、或其結合斷片之一。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一,其係當為一種藥劑。
- 一種合成物(composition),其包括作為活性成分之由如申請專利範圍第1項所述之抗體、或其結合斷片之一組成的一化合物。
- 如申請專利範圍第14項所述的合成物,其特徵在於它包含至少一由可以特別抑制IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET及/或RON的酪氨酸激酶活性的化合物中選取的第二種化合物。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之抗體、或其結合斷片之一、或如申請專利範圍第14項所述之合成物用以製備一藥劑的用途,該藥劑係用來防止或治療與IGF-IR過度表達及/或不正常活化相關聯、及/或與IGF1或IGF2和IGF-IR.相互作用所傳達信號之轉導路徑極度活化有關之疾病,其中該疾病為惡性腫瘤。
- 如申請專利範圍第16項所述的用途,其特徵在於施配該藥劑不會引發或只會輕微地引發與抑制胰島素受體IR有關的次要效果。
- 如申請專利範圍第17項所述的用途,用以製備一用來抑制正常細胞轉換成具腫瘤性質細胞及/或腫瘤細胞的生長及/或增生的藥劑。
- 如申請專利範圍第18項所述的用途,其特徵在於該惡性腫瘤是由前列腺惡性腫 瘤、骨肉惡性腫瘤、肺惡性腫瘤、乳房惡性腫瘤、子宮內膜惡性腫瘤、多重骨膸惡性腫瘤、卵巢惡性腫瘤或結腸惡性腫瘤中所選取的一種惡性腫瘤。
- 如申請專利範圍第19項所述的用途,其特徵在於該惡性腫瘤是結腸惡性腫瘤。
- 一種體外診斷特徵在於相對於正常水準下異常表達IGF-IR之病理情況的方法,包括將一被懷疑含有IGF-IR的生物樣本,在有利於形成IGF-IR/抗體複合物(complex)的條件下,與如申請專利範圍第1項所述的抗體接觸,並且檢測該複合物以顯示該IGF-IR存在該樣本中。
- 如申請專利範圍第21項所述的方法,其中該異常表達IGF-IR是過度表達IGF-IR。
- 如申請專利範圍第21項所述的方法,其中該異常表達IGF-IR是低度表達IGF-IR。
- 一種用以預測一前列腺細胞樣本的致腫瘤因子潛力的診斷方法,包括:(a)提供一人類前列腺組織樣本;及(b)在該樣本中確定IGF-IR的存在,其步驟包括將該樣本與如申請專利範圍第1項所述的抗體在有利於一IGF-IR/抗體複合物形成的條件下接觸,其中該複合物之存在表示該組織中的細胞有致腫瘤因子潛力。
- 如申請專利範圍第24項所述的方法,其中該複合物的存在代表病人有風險發展或開始一種特徵為過度表達該IGF-IR之病理上的病變。
- 一種用以進行一種方法來診斷由IGF-IR過度表達或低度表達所引發之疾病或用以進行一種程序來偵測及/或量化一生物樣本中IGF-IR的過度表達或低度表達,尤以該受體之過度表達,的套件或套組,其特徵在於該套件或套組包括下列元件:a).如申請專利範圍第1項所述的抗體、或其結合斷片之一;b).非必要地,用以構成有利於免疫反應之培養基的試劑;c).非必要地,可顯示由免疫反應所產生之IGF-IR/抗體複合物的試劑。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之抗體、或其結合斷片之一用以製備一藥劑的用途,該藥劑係用以令一生物活性化合物特定攻擊表達或過度表達IGF-IR之細胞。
- 一種控制IGF-IR反應哺乳類動物細胞中之IGF-IR活性的體外方法,包括:在足以相對於非-IGF-IR反應細胞控制該IGF-IR活性的條件下,將IGF-IR反應哺乳類動物細胞與如申請專利範圍第1項所述的抗體接觸。
- 一種相對於正常細胞降低IGF-IR反應哺乳類動物細胞中之IGF-IR活性的體外方法,包括:將該細胞與一如申請專利範圍第1項所述的抗體接觸。
- 一種識別一IGF-IR調控劑的體外方法,包括:a)將IGF-IR與如申請專利範圍第1項所述之抗體接觸;b)將(a)項中的複合物與一化合物存庫接觸;c)識別干擾(a)項複合物的一個化合物為何者;及d)確定此化合物是否對IGF-IR展現促效(agonist)或拮抗(antagonist)活性,其中這個活性表示對IGF-IR調控劑的識別。
- 一種用來檢測在一樣本中如申請專利範圍第1項所述之抗體的一結合伙伴的方法,該方法包括:a)將如申請專利範圍第1項所述的抗體與由出現特徵在於有人類IGF-IR之不正常水準的表達及/或活化之細胞增生病變(cell proliferative disorder)的病患上所取得的一生物樣本在足以允許該抗體與其結合伙伴之專一性結合的條件下一起培養;及b)檢測專一性結合,其中專一性結合表示在該樣本中有一結合伙伴的存在。
- 一種由一樣本純化IGF-IR的方法,該方法包括:a)將如申請專利範圍第1項所述的抗體與一樣本在允許該抗體與該受體之專一性結合的條件下一起培養;及b)將該抗體與該樣本分開因而獲取該純化的受體。
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