BRPI0613642A2 - anticorpo, hibridoma murino, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, animal transgênico, processo para a produção de um enticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, composição, uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, métodos de diagnóstico para prognosticar um potencial oncogênico de uma amostra de células da próstata, e para dar seguimento ao processo de um regime terapêutico projetado para aliviar um distúrbio patológico, kit ou conjunto para a realização de um método de diagnóstico de doença, e, métodos para modular e diminuir a atividade de igf-ir em células de mamìferos responsivas ao igf-ir, para identificar um modulador de igf-ir, para detectar um parceiro de ligação para o anticorpo, e para purificar um igf-ir a partir de uma amostra - Google Patents

Abstract

ANTICORPO, HIBRIDOMA MURINO, áCIDO NUCLEICO ISOALDO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, ANIMAL TRANSGêNICO, PROCESSO PARA A PRODUçãO DE UM ANTICORPO OU UM DE SEUS FRAGMENTOS FUNCIONAIS, COMPOSIçãO, USO DE UM ANTICORPO OU UM DE SEUS FRAGMENTOS FUNCIONAIS, MéTODOS DE DIAGNóSTICO IN VITRO DA CONDIçãO PATOLóGICA, DE DIAGNóSTICO PARA PROGNOSTICAR UM POTENCIAL ONCOGêNICO DE UMA AMOSTRA DE CéLULAS DA PRóSTATA, E PARA DAR SEGUIMENTO AO PROGRESSO DE UM REGIME TERAPêUTICO PROJETADO PARA ALIVIAR UM DISTúRBIO PATOLóGICO, KIT OU CONJUNTO PARA A REALIZAçãO DE UM MéTODO DE DIAGNóSTICO DE DOENçA, E, MéTODOS PARA MODULAR E DIMINUIR A A TIVIDADE DE IGF-IR EM CéLULAS DE MAMìFEROS RESPONSIVAS AO IGF-IR, PARA IDENTIFICAR UM MODULADOR DE IGF-IR, PARA DETECTAR UM PARCEIRO DE LIGAçãO PARA O ANTI-CORPO, E PARA PURIFICAR UM IGF-IR A PARTIR DE UMA AMOSTRA. A presente invenção diz respeito a novos anticorpos capazes de ligar-se especificamente ao receptor I de fator de desenvolvimento semelhante à insulina humana (IGF-IR). A invenção também compreende o uso destes anticorpos como um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico de câncerees que sobrexpressam IGF-IR, estimulados por IGF-IR e/ou IGF2 ou qualquer patologia conectada com a sobrexpressão do dito receptor bem como em processos ou kits para o diagnósticos de doenças com a sobrexpressão do receptor híbrido de IGF-IR e/ou IGF-I / Insulina.

Description

"ANTICORPO, HIBRIDOMA MURINO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, ANIMAL TRANSGÊNICO, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO OU UM DE SEUS FRAGMENTOS FUNCIONAIS, COMPOSIÇÃO, USO DE UM ANTICORPO OU UM DE SEUS FRAGMENTOS FUNCIONAIS, MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DA CONDIÇÃO PATOLÓGICA, DE DIAGNÓSTICO PARA PROGNOSTICAR UM POTENCIAL ONCOGÊNICO DE UMA AMOSTRA DE CÉLULAS DA PRÓSTATA, E PARA DAR SEGUIMENTO AO PROGRESSO DE UM REGIME TERAPÊUTICO PROJETADO PARA ALIVIAR UM DISTÚRBIO PATOLÓGICO, KIT OU CONJUNTO PARA A REALIZAÇÃO DE UM MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA, E, MÉTODOS PARA MODULAR E DIMINUIR A ATIVIDADE DE IGF-IR EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS RESPONSIVAS AO IGF-IR, PARA IDENTIFICAR UM MODULADOR DE IGF-IR, PARA DETECTAR UM PARCEIRO DE LIGAÇÃO PARA O ANTICORPO, E PARA PURIFICAR UM IGF-IR A PARTIR DE UMA AMOSTRA"

A presente invenção diz respeito a novos anticorpos capazes de ligar-se especificamente ao receptor do fator I de desenvolvimento semelhante à insulina (IGF-IR) e/ou capazes de ligar-se especificamente a atividade de tirosina do dito IGF-IR, especialmente anticorpos monoclonais de origem em murino, quimérica e humanizada, bem como as seqüências de aminoácido e ácido nucleico que codificam estes anticorpos. Em um aspecto particular, a invenção diz respeito a novos anticorpos capazes de inibir eficazmente não apenas a ligação do ligando IGF 1 ao IGF-IR mas também inibir eficazmente a ligação do outro ligando, isto é, IGF2, ao mesmo receptor. A invenção também compreende o uso destes anticorpos como um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico de cânceres que super-expressam IGF-IR, estimulado por IGF1 e/ou IGF2 ou qualquer patologia conectada com a super-expressão do dito receptor bem como nos processo ou kits para o diagnóstico de doenças conectadas com a super- expressão do receptor híbrido de IGF-IR e/ou IGF-I / Insulina. A invenção finalmente compreende produtos e/ou composições que compreende tais anticorpos em combinação com, por exemplo, anticorpos anti-EGFR e/ou compostos e/ou agentes anticâncer ou agentes conjugados com toxinas e seu uso para a prevenção e/ou o tratamento de certos cânceres.

O receptor do fator I de desenvolvimento semelhante a insulina denominado IGF-IR é um receptor com atividade de tirosina quinase tendo 70% de homologia com o receptor de insulina IR. IGF-IR é uma glicoproteína de peso molecular de aproximadamente 350.000. Este é um receptor hetero-tetramérico do qual, cada metade ligada por pontes de bissulfeto é compostos de uma subunidade α e de uma subunidade β transmembrana. O IGF-IR liga-se ao IGFl e IGF2 com uma afinidade muito alta (Kd #1 nM) mas é igualmente capaz de ligar-se à insulina com uma afinidade de 100 a 1000 vezes menor. Contrariamente, a insulina liga-se ao IR com uma afinidade muito alta embora os IGFs liguem-se ao receptor de insulina com uma afinidade 100 vezes menor. O domínio de tirosina quinase de IGF-IR e de IR tem uma homologia de seqüência muito alta embora zonas de homologia mais fracas dizem respeito à região rica em cisteína situada na subunidade α e na parte de terminal C da subunidade β. As diferenças de seqüência observadas na subunidade α estão situadas na zona de ligação dos ligandos e estão, portanto, na origem das afinidades relativas de IGF-IR e de IR para os IGFs e insulina, respectivamente. As diferenças na parte do terminal C da subunidade β resulta em uma divergência nos trajetos de sinalização dos dois receptores; o IGF-IR realiza a mediação dos efeitos mitogênicos, diferenciação e antiapoptose, enquanto a desativação do IR principalmente envolve os efeitos no nível dos trajetos metabólicos (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999).

As proteínas tirosina quinase citoplásmicas são ativadas pela ligação do ligando ao domínio extracelular do receptor. A ativação das quinases, por sua vez, envolve o estímulo de substratos intra-celulares diferentes, incluindo IRS-1, IRS-2, Shc e Grb 10 (Peruzzi F. et aU J- Câncer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). As duas estruturas principais de IGF- IR são IRS e Shc que medeiam, pela ativação de numerosos atuadores a jusante, a maioria dos efeitos de desenvolvimento e diferenciação conectados com a ligação dos IGFs a este receptor. A disponibilidade dos substratos pode, subseqüentemente, ditar o efeito biológico final conectado com a ativação do IGF-IR. Quando o IRS-I predomina, as células tendem a proliferar-se e transformar-se. Quando o Shc domina, as células tendem a diferenciar-se (Valentinis B. et ai, J. BioL Chem. 274:12423-12430, 1999). Parece que a via principalmente envolvida com os efeitos de proteção contra a apoptose é a via fosfatidil-inositol 3-quinases (PI 3-quinases) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi F. et aL, J. Câncer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999).

O papel do sistema IGF na carcinogênese tornou-se o objetivo de pesquisa intensiva nos últimos dez anos. Este interesse seguiu a descoberta do fato que além de suas propriedades mitogênicas e antiapoptose, o IGF-IR parece ser requerido para o estabelecimento e a manutenção de um fenotipo transformado. De fato, foi bem estabelecido que a super-expressão ou uma ativação constitutiva de IGF-IR leva, em uma variedade grande de células, a um desenvolvimento das células independente do suporte em meio desprovido de soro fetal bovino e à formação de tumores em camundongos nus. Esta, por si só, não é uma propriedade única visto que uma grande variedade de produtos de genes super-expressados podem transformar células, incluindo um bom número de receptores de fatores de desenvolvimento. Entretanto, a descoberta crucial, que demonstrou claramente o papel principal desempenhado pelo IGF-IR na transformação foi a demonstração que as células R, em que o gene que codifica IGF-IR foi inativado, são totalmente refratárias para a transformação por agentes diferentes que são usualmente capazes de transformar as células, tal como a proteína E5 do papiloma vírus bovino, uma super-expressão de EGFR ou de PDGFR, o antígeno T de SY 40, ras ativado ou a combinação destas dois últimos fatores (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11217-11221, 1993; Sell C. et al, Mol. CelL BioL5 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69:5300-5303, 1995; Coppola D. et al, Mol. CelL Biol, 14:4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. CelL PhysioL, 164:214-221, 1995).

O IGF-IR é expressado em uma grande variedade de tumores e de linhas de tumores e os IGFs amplificam o desenvolvimento do tumor por intermédio de sua ligação ao IGF-IR. Outros argumentos a favor do papel do IGF-IR na carcinogênese surgem a partir de estudos usando-se anticorpos monoclonais de murinos direcionados contra o receptor ou usando-se dominantes negativos de IGF-IR. Realmente, os anticorpos monoclonais de murinos direcionados contra IGF-IR inibem a proliferação de linhas celulares numerosas na cultura e o desenvolvimento de células tumorais in vivo (Arteaga C. et al, Câncer Res., 49:6237-6241, 1989; Li et al, Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia F. et al, J. CelL Biol., 24:269-275,1996; Scotlandi K. et al, Câncer Res., 58:4127-4131, 1998). Também foi mostrado nos trabalhos de Jiang et al (Oncogene, 18:6071-6077, 1999) que um dominante negativo de IGF-IR é capaz de inibir a proliferação de tumor.

Tais anticorpos capazes de ligar-se especificamente ao IGF-IR foram descritos e diversos pedidos de patente foram completados. Como um exemplo, podemos mencionar o pedido de patente WO 03/059951, depositado pelo requerente, em que um anticorpo monoclonal capaz de ligar-se a IGF-IR, denominado 7C10, é descrito. Outros pedidos de patente podem ser mencionados como WO 02/053596 (PFIZER INC. e ABGENIX INC.), WO 03/100008 (SCHERING CORPORATION) ou WO 03/106621 (IMMUNOGEN INC.). Todos estes pedidos estão reivindicando anticorpos capazes de ligar-se especificamente ao IGF-IR e/ou inibir sua atividade.

Embora isto seja considerado como uma propriedade evidente para cada um destes anticorpos, nenhum, na especificação destes pedidos demonstra claramente que estes anticorpos sejam capazes de inibir eficazmente a ligação tanto de ligandos naturais quanto de IGF-IR e, mais particularmente a ligação de IGF2 a IGF-IR. Os dados in vitro, tais como a inibição da proliferação de IGF1 e IGF2 induzidos foram mostrados neste pedidos e demonstraram que os anticorpos descritos são capazes de inibir eficazmente a proliferação induzida tanto por IGF1 quanto por IGF2. Entretanto, como a parte principal dos anticorpos descritos apresentaram a capacidade de induzir uma sub-regulação parcial de IGF-IR, não está evidente que as propriedades antiproliferativas estão diretamente ligadas a uma substituição tanto de IGF1 quanto de IGF2 a partir de IGF-IR.

Realmente, por exemplo, os dados mostrados no WO 03/106621 estão apenas de acordo com IGFl e sob nenhuma circunstância com uma eventual inibição da ligação do IGF2 ao IGF-IR (ver Exemplo C5 páginas 33-35 e Figura 3 e Exemplo D, páginas 35-37 e Figuras 4-6).

As mesmas observações podem ser feitas a partir do WO 02/053596 (ver Exemplo IV, página 78 a 79 e Figura 3 e Exemplo VII, página 82 e Figura 4).

Entre todos os pedidos de patente presentemente identificados que descrevem a descoberta de anticorpos monoclonais ou recombinantes direcionados contra o IGF-IR humano (hIGF-IR), apenas dois destes (WO 2004/087756 e WO 2005/005635) estão realmente apresentando uma eficácia dos anticorpos, respectivamente AKla e AKl8, para inibir a ligação [125I]IGF2 ao hIGF-IR.

O procedimento experimental, idênticos em ambos os casos, está fundamentado na ligação de competição em células intactas de adenocarcinoma colo-retal humano (HT29). Embora o procedimento descrito seja examinado, nenhum controle positivo tal como competição por ligandos hIGF-IR naturais (IGF1 e IGF2) é apresentado, realizando-se os dados na ligação de competição duvidosos. Por outro lado, apenas a competição imcompleta foi mostrada (maximamente 80% de inibição de ligação de <formula>formula see original document page 7</formula> tanto para o anticorpo AKla quanto AKl 8), mesmo em alta concentração de anticorpo, realizando-se o desenvolvimento de anticorpos mais eficazes necessários para a eficácia terapêutica em seres humanos. Um último ponto controverso que diz respeito à inibição putativa de resposta mediadas por IGF2 por AKla e AKl8 é a ausência de exemplos que apresentam a inibição da sinalização estimulada por IGF2 funcional mediado por hIGF-IR. De fato, mesmo se a competição de ligação de IGF2 estiver acontecendo, isto pode ser associado com uma inibição concomitante de sinalização hIGF-IR a jusante e tal evidência pode ser exemplificada para fornecer evidência mecânica para a eficácia funcional do anticorpo.

O objetivo da presente invenção é ser capaz de, ter disponível, um anticorpo monoclonal de murino, preferivelmente um anticorpo quimerizado ou humanizado, que reconhecerá IGF-IR especificamente com afinidade grande e que também é capaz de inibir não apenas a ligação de IGFl a IGF-IR mas também a ligação de IGF2 ao IGF-IR. Este anticorpo interagirá muito pouco ou não em todos com o IR. Sua ligação será capaz de inibir o desenvolvimento in vitro das linhas celulares que super-expressam IGF-IR interagindo principalmente com os trajetos de transdução de sinal ativados durante as interações de IGFl/IGF-IR e IGF2/IGF-IR. Este anticorpo será capaz de ser ativo in vivo em todos os tipos de tumores que super- expressam IGF-IR incluindo os tumores de mama e tumores de próstata dependentes de estrogênio, que não são a causa para os anticorpos monoclonais anti-IGF-IR (escritos MAb ou MAB) correntemente disponíveis. Em efeito, aIR3, que refere-se ao domínio de IGF-IRj inibe totalmente o desenvolvimento de tumores dependentes e estrogênio da mama (MCF-7) in vitro mas é sem efeito no modelo correspondente in vivo (Arteaga C. et ai., J. Clin. Invest. 84:1418-1423, 1989). Da mesma maneira, o fragmento scFv-Fc do 1H7 monoclonal de murino é apenas fracamente ativo no tumor da mama MCF-7 e totalmente inativo em um tumor independente de androgênio da próstata (Li S. L. et al, Câncer ImmunoL Immunother., 49:243-252, 2000).

De uma maneira surpreendente, os inventores geraram um anticorpo monoclonal humano descrito como 1-3466, que reconhece IGF-IR e que corresponde a todos os critérios estabelecidos acima, isto quer dizer que um não reconhecimento do receptor na insulina, a um bloqueio in vitro do IGFl e particularmente a proliferação de IGF2 induzida, mas também à inibição in vivo do desenvolvimento de tumores diferentes que expressam IGF-IR entre os quais estão um osteosarcoma e tumores de próstata. Além disso, foi mostrado que estes anticorpos inibem a fosforilação induzida por IGFl e/ou IGF2 da tirosina da cadeia beta de IGF-IR tanto em células MCF-7 quanto HT29. Além disso, também foi estabelecido que estes anticorpos causam a internalização do dito receptor e sua degradação contraria o que é usualmente observado com os ligandos naturais que permitem a reciclagem rápida do receptor na superfície das células, foi possível caracterizar os anticorpos por sua seqüência peptídica e nucleica, especialmente pela seqüência de suas regiões que determinam sua complementaridade (CDR) para IGF-IR.

Desta maneira, de acordo com uma primeira forma de realização, um objetivo da presente invenção é um anticorpo isolado ou um de seus fragmentos funcionais, o dito anticorpo ou um de seus ditos fragmentos sendo capazes de ligar-se especificamente ao receptor do fator I do desenvolvimento semelhante à insulina humana e/ou capazes de ligar-se especificamente a atividade de tirosina do dito IGF-IR receptor, caracterizado em que este é capaz de inibir a ligação natural deste primeiro ligando IGFl com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,03 nM e também capaz de inibir a ligação natural de seu segundo ligando IGF2 com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,1 nM.

Mais particularmente, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento imunogênico funcional deste, tendo uma afinidade de ligação para o receptor do fator I de desenvolvimento semelhante à insulina (IGF-IR), caracterizado em que na ligação o dito IGF-IR, este inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGFl ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,03 nM e este também inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGF2 ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,1 nM.

Além disso, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado, ou um fragmento imunogênico funcional deste, tendo uma tirosina quinase do receptor do fator I de desenvolvimento semelhante à insulina (IGF-IR) que inibe a atividade, caracterizado em que na ligação o dito IGF-IR, este inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGFl ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,03 nM e este também inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGF2 ao dito IGF-IR com um IC5O menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,1 nM.

No presente pedido, IC50 foi determinado graficamente como explicado no exemplo 2.

Com respeito ao estabelecido na técnica, o anticorpo Roche referido 18 (WO 2004/087756 e WO 2005/005635) tem um IC50 médio tanto para IGFl e IGF2 que é de cerca de 0,3 nM (ver Exemplo 6 do WO2005/005635), isto é, mais do que o IC50 obtido para o anticorpo 1-3466 (ver Exemplo 2).

No presente relatório descritivo, os termos "ligar" e "unir" tem o mesmo significado e são inter-cambiável. De acordo com uma outra forma de realização da invenção, o anticorpo também é capaz de ligar-se ao receptor híbrido de IGF-I / Insulina.

Realmente, o IGF-IR mostra uma homologia alta com o receptor de Insulina (IR) que existe sob duas isoformas AeB.

As seqüências de IR, isoformas AeB, são registradas sob os números de acessão X02160 e Ml 0051, respectivamente, no NCBI Genbank. Outros dados, sem limitações, que dizem respeito ao IR são incorporados neste por referência (Vinten et a/., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:249- 252; Belfiore et ai, 2002, The Journal of Biological Chemistiy, 277:39684- 39695; Dumesic et al., 2004, The Journal of Endocrinology & Metabolism, 89(7):3561-3 566).

O IGF-IR e o IR são glicoproteínas tetraméricas compostas de duas subunidades α extracelulares e duas β transmembranas ligadas por ligações de bissulfeto. Cada subunidade a, contendo o local de ligação de ligando é aproximadamente de 130- a 135-kDa, visto que cada subunidade β contendo o domínio de tirosina quinase é de aproximadamente 90 a 95 kDa. Estes receptores compartilham mais do que 50% de similaridade de seqüência de aminoácido total e 84% de similaridade no domínio de tirosina quinase. Após a ligação de ligando, os receptores fosforilados recrutam e fosforilam as proteínas de redução, incluindo a família da proteína do substrato 1 de receptor de insulina (IRS1), Gabl e Shc (Avruch5 1998, MoL CelL Biochem., 182, 31-48; Roth et al, 1988, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 53, 537-543; White, 1998, VioL CelL Biochem. 182, 3-11; Laviola et ai., 1997, J. Clin. Invest., 99, 830-837; Cheatham et ai., 1995, Endocr. Rev., 16, 117-142), levando à ativação de mediadores intracelulares diferentes, embora tanto a similaridade IR quanto de IGF-IR ativam os trajetos de sinalização principal, diferenças existem no recrutamento de certas proteínas de redução e mediadores intracelulares entre ambos os receptores (Sasaoka et al., 1996, Endocrinology 137, 4427-4434; Nakae et al., 2001, Endocr. Rev., 22, 818- 835; Dupont and Le Roith, 2001, Horm. Res. 55, SuppL 2, 22-26; Koval et al., 1998, Biochem. J., 330, 923-932). Estas diferenças são a base para os efeitos metabólicos predominantes induzido pela ativação de IR e os efeitos mitogênicos, transformadores e antiapoptóticos predominantes induzidos pela ativação de (De Meyts et al., 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci., 766, 388-401; Singh et al, 2000; Prisco et al., 1999, Horm. Metab. Res., 31, 80-89; Kido et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 972-979). A Insulina liga-se com afinidade alta ao IR (100 vezes maior do que o IGF-IR), visto que os fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF1 e IGF2) ligam-se ao IGF-IR com afinidade 100 vezes mais alta do que a do IR.

O IR humano existe em duas isoformas, IR-A e IR-B, geradas pela divisão alternativa do gene IR que exclui ou inclui 12 resíduos de aminoácido codificados por um exon pequeno (exon 11) no terminal carbóxi da subunidade α de IR. A abundância relativa de isoformas de IR é regulada pelos fatores específicos de tecido e desconhecidos (Moller et al, 1989, Mol. Endocrinol., 3, 1263-1269; Mosthaf et al., 1990, EMBO J., 9, 2409-2413). O IR-B é a isoforma de IR predominante em tecidos adultos normais (tecido adiposo, fígado e músculo) que são os tecidos alvo principais para os efeitos metabólicos de insulina (Moller et al., 1989; Mosthaf et al., 1990). O IR-A é a isoforma predominante em tecidos fetais e realizam a mediação do desenvolvimento fetal em resposta ao IGF2 (Frasca et al., 1999, Mol. CelL BioLs 19, 3278-3288), como também sugerido por estudos genéticos realizados em camundongos transgênicos (DeChiara et al., 1990, Nature 345, 78-80; Louvi et al., 1997, Dev. BioL 189, 33-48). Além disso, quando as 25 células transformam-se e tornam-se malignas, a diferenciação está freqüentemente associada com uma abundância relativa de IR-A aumentada (Pandini et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, N0 42, pp39684-39695).

Atribuído o alto grau de homologia, a insulina e os meio receptores de IGF-I (compostos de uma subunidade α e uma β) pode se heterodimerizar, levando-se à formação de receptores híbridos de insulina/IGF-I (Híbrido-R) (Soos et al, 1990, Biochem J., 270, 383-390; Kasuya et al, 1993, Biochemistry 32, 13531-13536; Seely et al, 1995, Endocrinology 136, 1635-1641; Bailyes et al, 1997, Biochem J., 327, 209-215).

Ambas as isoformas IR são igualmente capazes de formar híbridos com IGF-IR. O Híbrido-R, entretanto, têm características funcionais diferentes. O Hibrido-RsB reduziu a afinidade ao IGFl e especialmente para IGF2. Em contraste, o Hibrido-RsA tem uma alta afinidade ao IGFl e também liga o IGF2 e insulina em uma faixa de concentração fisiológica. A expressão de Hibrido-RsA super-regula o sistema IGF por dois mecanismos diferentes i) ligação (com alta afinidade) e ativação tanto de IGFl e IGF2 (que não ocorre com o Híbrido-RsB), ii) ativação do trajeto de IGF-IR após a ligação de insulina. A insulina que liga-se ao Hibrido-RsA fosforila a subunidade β de IGF-IR e ativa um substrato específico de IGF-IR (CrkII) de modo que o Hibrido-RsA muda-se a insulina para a sinalização de IGF-IR (Pandini etal, 2002).

Em diversos tecidos, como fígado, baço ou placenta, Híbrido- R são mais representados por IGF-IR (Bailyes et al, 1997). Como os tecidos de tumor super-expressam ou representa uma ativação anormal, tanto IGF-IR quanto IR-A (Frasca et ai, 1999; Sciacca et ai., 1999, Oncogene 18, 2471-2479; Vella et al., 2001, MoL Pathol., 54, 121-124), O Hibrido-RsA também pode ser super-expressada em uma variedade de malignidades humanas, incluindo cânceres de tireóide e de mama fornecendo a vantagem do desenvolvimento seletivo às células malignas capazes de responder por um tipo de sinalização de IGF-IR seguindo uma estimulação por IGFl e/ou IGF2 mas também por insulina em concentrações fisiológicos (Bailyes et al, 1997; Pandini et al9 1999, Clin. Câncer Res. 5, 1935-1944; Belfiore et al, 1999, Biochimie (Paris) 81, 403-407; Frasca et ai, 1999; Sciacca et ai, 1999; Vella etaU 2001).

De acordo com a invenção, os anticorpos também são caracterizados em que estes são capazes de ligar-se ao Híbrido-R e, se necessário, preferivelmente, além disso, capaz de inibir a ligação natural da insulina dos ligandos, IGF 1 e/ou IGF-2 do Híbrido-R e/ou capazes de ligar-se especificamente a atividade de tirosina do dito Híbrido-R.

Um objetivo da invenção é um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado em que este também é capaz de inibir100% da fosforilação induzida por IGFl e/ou IGF2 da beta-cadeia de IGF-IR

(preferivelmente em células HT29).

Em um outro aspecto, o anticorpo ou um de seus fragmentos

funcionais, de acordo com a invenção é caracterizado em que este não

apresenta atividade intrínseca agonística.

O anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo

com a invenção é, além disso, caracterizado em que este é capaz de induzir,

usando-se o mesmo método de análise FACS:

i) pelo menos 30% da internalização de IGF-IR em células de

HT29, e/ou

ii) pelo menos 85% da internalização de IGF-IR em células de

MCF-7.

uma característica do anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, é a sua capacidade de induzir, usando-

se o mesmo método de análise FACS:

i) pelo menos 50% da degradação de IGF-IR em células de

HT29, e/ou

ii) pelo menos 65% da degradação de IGF-IR em células de

MCF-7.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, é caracterizado em que este é capaz de inibir a proliferação in vitro induzida tanto por IGF1 quanto IGF2 de células MCF-7 com IC50 pelo menos igual a 1 nM e preferivelmente pelo menos 0,7 e 0,5 nM respectivamente para os experimentos IGF1 e IGF2.

O anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção também é caracterizado em que este é capaz de inibir o desenvolvimento in vivo de linhas de célula tumoral.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção são preferivelmente, anticorpos monoclonais específicos, especialmente de origem em murino, quimérica ou humanizadas, que podem ser obtidas de acordo com o métodos padrão bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.

No geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem em murino, é possível referir-se às técnicas que são descritas, em particular no manual "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) u a técnica de preparação de hibridomas descritas por Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção podem ser obtidas, por exemplo, a partir de uma célula animal humanizada contra o IGF-IR ou um de seus fragmentos contendo o epítopo especialmente reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais de acordo com a invenção. O dito IGF-IR ou um de seus ditos fragmentos, podem ser especialmente produzidos de acordo com os métodos de trabalho usuais, pela recombinação genética começando com uma seqüência de ácido nucleico contida na seqüência de cDNA que codifica quanto ao IGF-IR ou pela síntese de peptídeo começando a partir de uma seqüência de aminoácidos compreendidos na seqüência de peptídeo do IGF-IR.

Os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção podem ser, por exemplo, purificados em uma coluna de afinidade em que o IGF-IR ou um de seus fragmentos contendo o epítopo especialmente reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais de acordo com a invenção foi previamente imobilizado. Mais particularmente, os ditos anticorpos monoclonais podem ser purificados por cromatografia na proteína A e/ou G, seguido ou não seguido pela cromatografia trocadora de íon focada na eliminação dos contaminantes da proteína residual bem como DNA e o LPS, por si só seguido ou não seguido pela cromatografia de exclusão em gel de Sepharose a fim de eliminar os agregados potenciais devido à presença de dímeros ou de outros multímeros. De uma maneira ainda mais preferida, todas estas técnicas podem ser usadas simultânea ou sucessivamente.

Os anticorpos quiméricos ou humanizados também estão incluídos nos anticorpos de acordo com a presente invenção.

Por anticorpo quimérico, é pretendido indicar um anticorpo que contém uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) a partir de um anticorpo de uma dada espécie em combinação com as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga à dita dada espécie.

Os anticorpos ou seus fragmentos do tipo quimérico de acordo com a invenção podem ser preparados usando-se as técnicas de recombinação genética. Por exemplo, o anticorpo quimérico pode ser produzido clonando-se um DNA recombinante contendo um promotor e uma seqüência que codifica quanto à região variável de um anticorpo monoclonal não humano, especialmente de murino de acordo com a invenção e uma seqüência que codifica quanto à região constante de anticorpo humano. Um anticorpo quimérico da invenção codificado por um tal gene recombinante será, por exemplo, uma quimera de camundongo-homem, a especificidade deste anticorpo sendo determinada pela região variável derivada do DNA de murino e seu isotipo determinado pela região constante derivada do DNA humano. Para os métodos de preparação de anticorpos quiméricos, é possível, por exemplo, referir-se ao documento Verhoeyn et al (BioEssays, 8:74, 1988).

Por anticorpo humanizado, é pretendido indicar um anticorpo que contém regiões de CDR derivadas de um anticorpo de origem não humana, s outras partes da molécula de anticorpo sendo derivadas de um (ou de diversos) anticorpos humanos. Além disso, alguns dos resíduos dos segmentos da cadeia principal (denominados FR) podem ser modificados a fim de conservar a afinidade da ligação (Jones et al, Nature, 321:522-525,1986; Verhoeyen et al, Science, 239:1534 -1536,1988; Riechmann et al,

Nature, 332:323-327,1988).

Os anticorpos humanizados de acordo com a invenção ou seus

fragmentos podem ser preparados por técnicas conhecidas pela pessoa habilitada na técnica (tal como, por exemplo, aquelas descritas nos documentos Singer et al, J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al, Biotechnol. Genet Eng. Rev., 10:1-142, 1992; ou Bebbington et al, Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Tais anticorpos humanizados de acordo com a invenção são preferidos para o seu uso em métodos de diagnóstico in vitro ou tratamento profílático e/ou terapêutico in vivo. Outros métodos de humanização são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica como, por exemplo, o método mCDR Grafting" descrito por Protein Design Lab (PDL) nos pedidos de patente EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 9 127, EP 0 566647 ou US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089 e US 5.693.761. os seguintes pedidos de patente também podem ser mencionados: US 5.639.641; US 6.054.297; US 5.886.152 e US 5.877.293. Pelo fragmento funcional de um anticorpo de acordo com a invenção, é pretendido indicar, em particular, um fragmento de anticorpo, tal como fragmentos ou diacorpos Fv, scFv (sc para cadeia simples), Fab, F(ab')2, Fab1, scFv-Fc ou qualquer fragmento cujo tempo de vida média deve ser aumentado por modificação química, tal como a adição de poli(alquileno) glicol, tal como poli(etileno)glicol ("PEGilação") (fragmentos peguilados denominados Fv-PEGj scFv-PEG, Fab-PEG5 F(ab')2- PEG ou Fabt-PEG) ("PEG" para Poli(Etileno) Glicol) ou pela incorporação em uma lipossoma, ditos fragmentos tendo pelo menos um dos CDRs característicos da seqüência SEQ ID N0 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de acordo com a invenção e especialmente, em que este é capaz de exercer, de uma maneira geral, uma atividade mesmo parcial do anticorpo a partir do qual este é derivado, tal como, em particular, a capacidade de reconhecer e ligar ao IGF- IR e, se necessário, inibir a atividade do IGF-IR.

Preferivelmente, os ditos fragmentos funcionais serão constituídos ou compreenderão uma seqüência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo do qual estes são derivados, a dita seqüência parcial sendo suficiente para reter a mesma especificidade de ligação como o anticorpo do qual este é derivado e uma afinidade suficiente, preferivelmente pelo menos igual a 1/100, de uma maneira mais preferida a pelo menos 1/10, daquele do anticorpo do qual este é derivado, com respeito ao IGF-IR.

Um tal fragmento funcional conterá, no mínimo 5 aminoácido, preferivelmente 10, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos consecutivos da seqüência do anticorpo a partir do qual este é derivado.

Preferivelmente, estes fragmentos funcionais serão fragmentos do tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diacorpos, que, no geral, têm a mesma especificidade de ligação assim como o anticorpo do qual estes são derivados. De acordo com a presente invenção, os fragmentos de anticorpo da invenção podem ser obtidos começando de anticorpos, tais como os descritos acima pelos métodos tais como digestão por enzimas, tais como pepsina ou papaína e/ou pela clivagem das pontes de bissulfeto pela redução química. De uma outra maneira, os fragmentos de anticorpo compreendidos na presente invenção podem ser obtidos por técnicas de recombinação genética também bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica ou ainda pela síntese de peptídeo por meio de, por exemplo, sintetizadores de peptídeo automáticos, tais como aqueles fornecidos pela companhia Applied Biosystems, etc..

De uma maneira mais preferida, a invenção compreende os anticorpos ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, especialmente anticorpos quiméricos ou humanizados, obtidos por recombinação genética ou pela síntese química.

Mais particularmente, de acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o anticorpo é caracterizado em que este compreende uma cadeia leve que compreende pelo menos uma complementaridade que determina a região CDR escolhida dos CDRs da seqüência SEQID N0 1, 3 ou 5 ou pelo menos um CDR cuja seqüência tem pelo menos 80% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 Ij 3 ou 5, ou em que este compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos um CDR escolhido dos CDRs da seqüência SEQ ID N0 2, 4 ou 6 ou pelo menos um CDR cuja seqüência tem pelo menos 80% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 2, 4 ou 6.

No presente relatório descritivo, os termos polipeptídeos, seqüências de polipeptídeo, peptídeos e proteínas ligadas aos compostos de' anticorpos ou à sua seqüência são intercambiáveis.

Deve ser entendido aqui que a invenção não diz respeito aos anticorpos na forma natural, isto quer dizer que estes não estão em seu ambiente natural, mas que estes foram capazes de ser isolados ou obtidos por purificação a partir de fontes naturais ou ainda obtidos por recombinação genética ou pela síntese química e que estes podem então conter aminoácidos não naturais como será descrito mais adiante.

Por região de CDR ou CDR, é entendido indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas como definido por Kabat et ai. (Kabat et ai, Seqüences of proteins of immunological interest, 5o Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, e últimas edições). Existem 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs são usados aqui a fim de indicar, de acordo com o caso, uma das regiões ou diversas ou ainda o total, destas regiões que contém a maioria dos resíduos de aminoácidos responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo ao antígeno ou o epítopo que este reconhece.

Por "porcentagem de identidade" entre as duas seqüência de ácido nucleico ou de aminoácidos no sentido da presente invenção, é pretendido indicar a porcentagem de nucleotídeos ou de resíduos de aminoácidos idênticos entre as duas seqüências a serem comparadas, obtidas após o melhor alinhamento (alinhamento ótimo), esta porcentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas seqüências sendo distribuídas aleatoriamente e por seu comprimento total. As comparações de seqüências entre as duas seqüências de ácido nucleico ou de aminoácido são realizadas tradicionalmente pela comparação destas seqüências após serem alinhadas de uma maneira ótima, a dita comparação sendo capaz de ser realizada por segmento ou "janela de comparação ". O alinhamento ótimo das seqüências para a comparação pode ser realizado, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman and Wunsch (1970) [J. Viol. BioL 48: 443], por meio do método de pesquisa por similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444), por meio de software de computador usando-se estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package5 Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI, ou ainda pelo software de comparação BLAST N ou BLAST P).

A porcentagem de identidade entre as duas seqüências de ácido nucleico ou aminoácido é determinada comparando-se estas duas seqüências alinhadas de uma maneira ótima e em que a seqüência de ácido nucleico ou se aminoácido a ser comparada possa compreender adições ou anulações com respeito à seqüência de referência para um alinhamento ótimo entre estas duas seqüências. A porcentagem de identidade é calculada determinando-se o número de posições idênticas às quais o nucleotídeo ou o resíduo de aminoácido são idênticos entre as duas seqüências, dividindo-se este número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado obtido por 100 a fim de obter a porcentagem de identidade entre estas duas seqüências.

Por exemplo, é possível usar o programa BLAST, "BLAST 2 seqüences" (Tatusova et al, "Blast 2 seqüences - a new tool for comparing protein and nucleotide seqüences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponível no site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/b12.html, os parâmetros usados sendo aqueles dados por default (em particular para os parâmetros "penalidade de fenda aberta ": 5, and "penalidade de fenda de extensão": 2; a matriz escolhida sendo, por exemplo, a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa), a porcentagem de identidade entre as duas seqüências a serem comparadas sendo calculadas diretamente pelo programa.

Por seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com uma seqüência de aminoácido de referência, aquelas tendo, com respeito à seqüência de referência, certas modificações, em particular, uma anulação, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, um truncamento ou um alongamento são preferidos. No caso de uma substituição de um ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, as substituições são preferidas em que os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos "equivalentes". A expressão "aminoácidos equivalentes" é intencionada aqui na indicação de qualquer aminoácido capaz de ser substituído por um dos aminoácidos da estrutura de base sem, entretanto, modificar essencialmente as atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e, tais como, serão definidos mais tarde, especialmente nos exemplos.

As formas de realização alternativas da invenção propõe anticorpos anti-IGF-IR tendo outras modificações de seqüência de aminoácido contidas neste. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da seqüência de aminoácido do anticorpo anti-IGF-IR são preparadas pela introdução de mudanças de nucleotídeo apropriadas no ácido nucleico de anticorpo anti-IGF-IR ou pela síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, anulações de e/ou inserções em e/ou substituição de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo anti-IGF-IR. Qualquer combinação de anulação, inserção e substituição é feita para chegar na construção final, contanto que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácido também podem alterar os processo pós-translacionais do anticorpo anti-IGF-IR, tal como mudando- se o número ou a posição dos locais de glicosilação.

Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-IGF-IR que são locais preferidos para a mutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina " como descrito por Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, Iys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para realizar a interação dos aminoácidos com antígeno IGF- IR. Aqueles locais de aminoácido que demonstram a sensibilidade funcional às substituições são então refinadas pela introdução adicional ou outras variantes em ou para os locais de substituição. Desta maneira, enquanto o local para a introdução de uma variação de seqüência de aminoácido é predeterminada, a natureza da mutação, por si não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado locals a varredura de ala ou a mutagênese aleatória são conduzidas no códon ou na região alvo e as variantes de anticorpo anti-IGF- IR são avaliadas quanto a atividade desejada.

As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila que variam em comprimento a partir de um resíduo aos polipeptídeos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como as inserções intra-seqüência de resíduos de aminoácido simples ou múltiplos. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti- IGF-IR. Com um resíduo de metionila de terminal N ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo anti-IGF-IR incluem a fusão ao terminal N- ou C- do anticorpo anti- IGF-IR a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a vida média do soro do anticorpo.

Um outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm, pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-IGF-IR substituído por um resíduo diferente. Os locais de interesse maior para a mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas as alterações de FR também são atingidas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob a parte superior de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem em atividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1 ou como ainda descrito abaixo em referência às classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos avaliados. Tabela 1

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As modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo podem ser realizadas selecionando-se substituições que diferem significantemente em seu efeito mantendo-se (a) a estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação plana ou hélica, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) a carga da cadeia secundária. Os resíduo de ocorrência natural são divididos em grupos fundamentados em propriedades de cadeia secundária comuns:

(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: gly, pro e

(6) aromático: trp, tyr, phe.

As substituições não conservadoras irão requerer uma mudança de um membro de uma destas classes para uma outra classe. Qualquer resíduo de cisteína na manutenção da conformação apropriada do anticorpo anti-IGF-IR também podem ser substituídos, no geral, com serina para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar reticulação aberrante. Contrariamente, as ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para a melhora de sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo precursor (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). No geral, as variantes resultantes selecionadas para o desenvolvimento adicional melhorarão as propriedades biológicas com relação ao anticorpo precursor a partir do qual estas são geradas. Uma maneira conveniente de gerar tais variantes substitucionais envolve a maturação por afinidade usando-se apresentação de fago. Resumidamente, diversos locais de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 locais) são submetidos à mutação para a geração de todas as substituições de aminoácido possíveis em cada local. As variantes de anticorpo geradas desta maneira são apresentadas de uma maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusões ao produto de gene III de Ml 3 empacotado dentro de cada partícula. As variantes apresentadas por fago são então avaliadas quanto à atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como divulgado aqui. A fim de identificar regiões hipervariáveis candidatas para a modificação, a mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para a identificação dos resíduos da região hipervariável que contribui significantemente à ligação de antígeno. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para a identificação dos pontos de contato entre o anticorpo e o IGF-IR humano. Tais resíduos de contato e resíduos contíguos são candidatos à substituição de acordo com as técnicas elaboradas neste. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido à avaliação como descrito aqui e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para o desenvolvimento adicional.

Um outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração, é entendido anular uma ou mais porções de carboidrato no anticorpo e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada por N ou ligada por O. ligado por N refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia secundária de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo, asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia secundária de asparagina. Desta maneira, a presença de cada uma destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um local de glicosilação potencial. A glicosilação ligada por O refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.

A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada alterando-se a seqüência de aminoácido tal que esta contenha um ou mais das seqüências de tripeptídeo descritas acima (para os locais de glicosilação ligados por N). a alteração também pode ser feita pela adição ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para os locais de glicosilação ligados por O).

As moléculas de ácido nucleico que codificam as variantes de seqüência de aminoácido do anticorpo anti-IGF-IR de objetivo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por mutegênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada ao local), mutagênese de PCR e mutagênese de cassete de uma versão variante ou não variante preparada anteriormente do anticorpo anti-IGF-IR.

Às vezes, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função atuadora, por exemplo, a fim de intensificar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser atingido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, os resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc5 desse modo permitindo a formação de ligação de bissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico gerado desta maneira pode ter a capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. ImmunoLs 148:2918-2922 (1992). Os anticorpos homodiméricos com atividade antitumor também podem ser preparadas usando-se reticuladores heterobifuncionais com descrito em Wolff et al., Câncer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser projetado tendo regiões Fc duplas e pode, desse modo, ter Iise complementar e capacidades de ADCC intensificadas. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Da mesma maneira, para aumentar a vida média do soro do anticorpo, pode se incorporar uma recuperação do epítopo de ligação do receptor no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na Pat U. S. N0 5.739.277, por exemplo. Como usado neste, o termo "recuperação do epítopo de ligação do receptor" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo, IgGh IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da vida média do soro in vivo da molécula de IgG. De uma maneira mais preferida, a presente invenção diz respeito a um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado em que este compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos dois dos três CDRs ou os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6 ou pelo menos dois de três CDRs ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N0 2, 4 e 6.

Em uma forma de realização mais preferida, um objetivo da invenção é um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, caracterizado em que este compreendem uma cadeia leve que compreende pelo menos dois dos três CDRs ou os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 1, 3 e 5 ou pelo menos dois de três CDRs ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N0 1, 3 e 5.

De uma maneira mais preferida, o anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção é caracterizado em que este compreende uma cadeia pesada que compreende os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6, ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6 e em que estes, além disso compreendem uma cadeia leve que compreende os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 1, 3 e 5 ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 1, 3 e 5.

Como estabelecido na técnica, é conhecido que a variabilidade maior (comprimento e composição) entre os 6 CDRs é observada para os 3 CDRs da cadeia pesada e, mais particularmente, o CDR-H3. Como uma conseqüência, será entendido que as características preferenciais de CDR do anticorpo da invenção são os 3 CDRs da cadeia pesada, isto é, CDRs codificados pela seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6 e mais preferivelmente, o CDR correspondente ao CDR-H3 codificado pela SEQID N0 6.

De acordo com um outro aspecto, um objetivo da presente invenção é um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado em que este não liga-se ou não liga-se de uma maneira signifícante ao receptor e insulina humana IR.

De uma maneira preferida, os ditos fragmentos funcionais de acordo com a presente invenção serão escolhidos dos fragmentos Fvj scFv, Fab, (Fab1)2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos ou qualquer fragmento funcional cuja vida média deveria ser aumentada por uma modificação química, especialmente pela PEGilação ou pela incorporação em uma lipossoma.

De acordo com um outro aspecto, a invenção diz respeito a um hibridoma de murino capaz de secretar um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção, especialmente o hibridoma de origem em murino tal como depositado no Centre National de Culture De Microorganisme (CNCM, National Center of Microorganism Culture) (Institut Pasteur, Paris, France) em 23 de junho de 2005 sob o número 1-3466, o dito hibridoma resultando da fusão de esplenócitos de Balb/c de camundongos imunizados e linhas de célula de mieloma Sp20 Ag 14.

Os anticorpos monoclonais aqui denominados 1-3466 ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado em que dito anticorpo é secretado pelo hibridoma depositado no CNCM em 23 de junho de 2005 sob o número 1-3466 é, é claro, parte da presente invenção.

Em uma forma de realização particular, a presente invenção diz respeito a um anticorpo de murino ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado em que dito anticorpo compreende uma cadeia leve da seqüência que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N0 7 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 7 e/ou em que esta compreende uma cadeia pesada da seqüência que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N0 8 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N0 8.

Também/de acordo com um aspecto particular, a presente invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado em que dito anticorpo, além disso, compreende as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao camundongo, especialmente o homem e de uma maneira preferida em que as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano são, respectivamente a região capa e gama-Is gama-2 ou gama-4.

Em uma forma de realização particular que corresponde ao isotipo IgGl, uma característica complementar do anticorpo é apresentar potencialmente funções atuadoras como ADCC (para Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo) e/ou CDC (para a Citotoxicidade Dependente de Complemento).

Também, de acordo com um aspecto particular, a presente invenção diz respeito a um anticorpo humanizado ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado em que dito anticorpo compreende uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada em que os segmentos da cadeia principal FRl a FR4 da dita cadeia leve e/ou cadeia pesada são respectivamente derivados a partir dos segmentos de cadeia principal FRl a FR4 de anticorpo humano de cadeia leve e/ou cadeia pesada.

De acordo com a forma de realização preferida, o anticorpo humanizado ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção é caracterizado em que o dito anticorpo humanizado compreendem uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N0 17 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 17 e/ou em que esta compreende uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N0 18 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N° 18.

Preferivelmente, o anticorpo humanizado ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção é caracterizado em que o dito anticorpo humanizado compreendem uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N° 17 e em que este compreende uma cadeia pesada da seqüência que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N° 18.

De acordo com um novo aspecto, a presente invenção diz respeito a um ácido nucleico isolado, caracterizado em que este é escolhido a partir dos seguintes ácidos nucleicos:

(a) um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção;

(b) um ácido nucleico complementar de um ácido nucleico tal como definido em a);

(c) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridizar sob as condições de estringência grande com pelo menos um dos CDRs da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N° 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ou com uma seqüência tendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N° 9, -10, 11, 12, 13 ou 14;

(d) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridizar sob condições de estringência grande com pelo menos a cadeia leve da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N° 15 e/ou a cadeia pesada da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N° 16 ou com uma seqüência tendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% and 98% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N° 15 e/ou 16;

(e) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridizar sob condições de estringência grande com pelo menos a cadeia leve da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N° 19 e/ou a cadeia pesada da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N° 20 ou com a seqüência tendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% and 98% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N° 19 e/ou 20.

Por ácido nucleico, nucleico ou seqüência de ácido nucleico, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, seqüência de polinucleotídeo, seqüência de nucleotídeo, termos que serão utilizados de maneira indiferente no presente relatório descritivo, é pretendido indicar uma ligação precisa de nucleotídeos, que são modificados ou não modificados, deixando um fragmento ou uma região de um ácido nucleico a ser definido, contendo ou não contendo nucleotídeos não naturais e sendo capazes de corresponder também a um DNA de filamento duplo, um DNA de filamento simples assim como os produtos de transcrição dos ditos DNAs.

Também deve ser entendido aqui que a presente invenção não diz respeito às seqüências de nucleotídeo em seu ambiente cromossômico natural, isto quer dizer, no estado natural. Este diz respeito às seqüências que foram isoladas e/ou purificadas, isto quer dizer que estas foram selecionadas direta ou indiretamente, por exemplo, copiando-se, seu ambiente sendo pelo menos parcialmente modificado. Desta maneira, também é pretendido indicar aqui, os ácidos nucleicos isolados obtidos pela recombinação genética por meio de, por exemplo, células hospedeiras ou obtidas pela síntese química.

Pelas seqüências nucleicas tendo uma porcentagem de identidade de pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98%, após alinhamento ótimo com uma seqüência preferida, é pretendido indicar a seqüência nucleica tendo, com respeito à seqüência nucleica de referência, certas modificações, tais como, em particular, uma anulação, uma truncação, um alongamento, uma fusão quimérica e/ou uma substituição, especialmente, substituição de ponto. Isto, preferivelmente diz respeito às seqüências em que as seqüências codificam quanto às mesmas seqüências de aminoácido como a seqüência de referência, desta maneira, sendo conectado com a degeneração do código genético ou seqüências complementares que são capazes de hibridizar especificamente com as seqüências de referência, preferivelmente sob as condições de estringência alta, especialmente, tal como definido abaixo.

Uma hibridização sob condições de estringência alta significa que as condições de temperatura e as condições de força iônica são escolhidas de uma tal maneira que estes permitem a manutenção da hibridização entre os dois fragmentos complementares ao DNA. Por meio de ilustração, as condições de estringência alta da etapa de hibridização para os propósitos de definir os fragmentos de polinucleotídeo descritos acima são vantajosamente o seguinte.

A hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duas etapas: (1) pré-hibridização a 42°C por 3 horas em tampão de fosfato (20 mM, pH 7,5) contendo 5 x SSC (1 x SSC corresponde a uma solução de citrato de sódio a 0,15 M de NaCl + 0,015 M de solução de citrato de sódio), 50% da formamida, 7% de sulfato de dodecila sódico (SDS), 10 x de sulfato de dextrano de Denhardt a 5% e 1% de DNA de esperma de salmão; (2) hibridização real por 20 horas em uma temperatura dependente do tamanho da sonda (isto é, 42°C, para um tamanho de sonda >100 nucleotídeos) seguido por 2 lavagens de 20 minutos a 20°C em 2x SSC + 2% de SDS5 1 lavagem de 20 minutos a 20°C em 0,1 x SSC + 0,1% de SDS. A última lavagem é realizada a 0,1 x SSC + 0,1% de SDS por 30 minutos a 60°C para um tamanho de sonda >100 nucleotídeos. As condições de hibridização de alta estringência descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido pode ser adaptado pela pessoa habilitada na técnica para oligonucleotídeos de tamanho maior ou menor, de acordo com a explicação de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2o Ed. Cold Spring Harbor).

A invenção também diz respeito a um vetor que compreende um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

A invenção visa, especialmente os vetores de clonagem e/ou expressão que contém uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a invenção.

Os vetores de acordo com a invenção preferivelmente contém elementos que permitem a expressão e/ou a secreção das seqüências de nucleotídeo em uma célula hospedeira predeterminada. Portanto, o vetor deve conter um promotor, sinais de iniciação e terminação da tradução, bem como as regiões apropriadas de regulação de transcrição. Isto deve ser capaz de ser mantido de uma maneira estável na célula hospedeira e, opcionalmente pode ter sinais particulares que especificam a secreção da proteína traduzida. Estes elementos diferentes são escolhidos e otimizados pela pessoa habilitada na técnica como uma função da célula hospedeira usada. Para este efeito, as seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção podem ser inseridas em vetores de replicação autônomos no hospedeiro escolhido ou serem vetores integrativos do hospedeiro escolhido.

Tais vetores são preparados por métodos correntemente usados pela pessoa habilitada na técnica e os clones resultantes podem ser introduzidos em um hospedeiro apropriado pelos métodos padrão, tal como lipofecção, eletroporação, choque térmico ou métodos químicos.

Os vetores de acordo com a invenção são, por exemplo, vetores de origem plasmídica e viral. Estes são úteis para a transformação de células hospedeiras a fim de clonar ou expressar as seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção.

A invenção também compreende as células hospedeiras transformadas por ou que compreendem um vetor de acordo com a invenção.

A células hospedeira pode ser escolhida de sistemas procarióticos ou eucarióticos, por exemplo, células bacterianas, mas também células de levedura ou células animais, em células de mamífero particulares. Também é possível usar células de insetos ou células vegetais.

A invenção também diz respeito a animais, exceto ser humano, que compreende pelo menos uma célula transformada de acordo com a invenção.

De acordo com um outro aspecto, um objetivo da invenção é um processo para a produção de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, caracterizado em que este compreende os seguintes estágios:

a) cultura em um meio e condições de cultura apropriadas de uma célula hospedeira de acordo com a invenção e

b) a recuperação dos ditos anticorpos ou um de seus fragmentos funcionais, desta maneira produzidos, começando do meio de cultura ou ditas células cultivadas.

As células transformadas de acordo com a invenção pode ser usada em processos para a preparação de polipeptídeos recombinantes de acordo com a invenção. Os processos para a preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção na forma recombinante, caracterizado em que estes utilizam um vetor e/ou um célula transformada por um vetor de acordo com a invenção, são, por si só compreendidos na presente invenção. Preferivelmente, uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção é cultivado sob condições que permitem a expressão do dito polipeptídeo o dito peptídeo recombinante é recuperado.

Como foi dito, a célula hospedeira pode ser escolhida de sistemas procarióticos ou eucarióticos. Em particular, é possível identificar seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção, facilitando a secreção em um tal sistema procariótico ou eucarióticos. Um vetor de acordo com a invenção que carrega uma seqüência pode, portanto, ser vantajosamente usado para a produção de proteínas recombinantes, pretendidas serem secretadas. Realmente, a purificação destas proteínas recombinantes de interesse será facilitada pelo fato de que estas estão presentes no sobrenadante da cultura celular em vez de no interior da célula hospedeira.

Também é possível preparar os polipeptídeos de acordo com a invenção pela síntese química. Um tal processo de preparação também é um objetivo da invenção. A pessoa habilitada na técnica conhece os processos de síntese química, por exemplo as técnicas que utilizam fases sólidas (ver, especialmente Steward et ai., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2° ed., (1984)) ou técnicas que usam fases sólidas parciais, pela condensação de fragmentos ou por uma síntese clássica na solução. Os polipeptídeos obtidos pela síntese química e sendo capaz de conter os aminoácidos não naturais correspondentes também estão compreendidos na invenção.

Os anticorpos ou um de seus fragmentos funcionais, capaz de ser obtido por um processo de acordo com a invenção também estão compreendidos na presente invenção.

De acordo com uma Segunda forma de realização, a presente invenção diz respeito a um anticorpo de acordo com a invenção tal como ainda descrito acima, caracterizado em que este é, além disso, capaz de ligar- se especificamente a um receptor humano da família da tirosina quinase e/ou capazes de inibir a atividade de tirosina de tal receptor.

Em uma primeira forma de realização, um tal anticorpo consiste de um anticorpo biespecífico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente à ligação de EGF no receptor do fator de desenvolvimento epidérmico humano (EGFR) e/ou inibição da atividade de tirosina do dito EGFR. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, o dito segundo motivo anti-EGFR é emitido do anticorpo monoclonal humano 225, seu derivado quimérico C225 ou qualquer anticorpo humanizado derivado de seu anticorpo 225.

Em uma segunda forma de realização, um tal anticorpo consiste de um anticorpo biespecífico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente à atividade modulada pelo receptor de HER2/neu e/ou inibição da atividade de tirosina do dito receptor de HER2/neu receptor. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, o dito segundo motivo anti-HER2/neu é emitido do anticorpo monoclonal humano 4D5 ou 2C4 ou o anticorpo humanizado Trastuzumab ou Pertuzumab.

Em uma terceira forma de realização, um tal anticorpo consiste de um anticorpo biespecífico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente a ligação do Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) no receptor de cMET e/ou ligar-se especificamente a atividade de tirosina do dito receptor de cMET.

Finalmente, em uma última de realização, um tal anticorpo consiste de um anticorpo biespecífico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente a ligação da Proteína Estimuladora de Macrófago (MSP) no receptor RON e/ou inibição da atividade de tirosina do dito receptor RON.

De acordo com uma outra forma de realização da invenção, também é considerado que o anticorpo de acordo com a invenção é capaz de interagir com qualquer tipo de receptor sendo implicado no desenvolvimento de tumores, tais como, por exemplo, sem limitação, VEGFR, FGF (Fator de Desenvolvimento de Fibroblasto), PDGF (Fator de desenvolvimento derivado de plaqueta) ou CXCR4 ou 2 (Tipo de Receptor de Quimiocina 4 ou 2).

Os anticorpos biespecíficos ou bifuncional formam uma segunda geração de anticorpos monoclonais em que duas regiões variáveis diferentes são combinados na mesma molécula (Hollinger and Bohlen, 1999, Câncer and metastasis, rev. 18:411-419). Seu uso foi demonstrado tanto no campo de diagnóstico quanto no campo da terapia a partir de sua capacidade de recrutar novas funções realizadoras ou a diversas moléculas alvo na superfície de células tumorais. Estes anticorpos podem ser obtidos pelos métodos químicos (Glennie MJ et aly 1987, J. Immunol., 139, 2367-2375; Repp R. et ai, 1995, J. Hemat., 377-382) ou métodos somáticos (Staerz U.D. e Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et ai, 1986, Method Enzymol., 121:210-228) mas também e preferivelmente pela técnica de engenharia genética que permite que a heterodimerização seja forçada e, desta maneira, facilitar o processo de purificação do anticorpo procurado (Merchand et ai, 1998 NatureBiotech., 16:677-681).

Estes anticorpos biespecíficos podem ser construídos como IgG total, como Fab'2 biespecífico, como FabtPEG ou como diacorpos ou ainda como scFv biespecífico mas também como um anticorpo biespecífico tetravalente ou dois locais de ligação estão presentes para cada antígeno alvejado (Park et ai, 2000, Mol. Immunol., 37 (18): 1123-30) ou seus fragmentos como ainda descrito acima.

Além de uma vantagem econômica do fato que a produção e a administração de um anticorpo biespecífico serem menos onerosos do que a produção de dois anticorpos específicos, o uso de tais anticorpos biespecíficos tem a vantagem de reduzir a toxicidade do tratamento. Isto ocorre porque o uso de um anticorpo biespecífico permite que a quantidade total dos anticorpos circulantes sejam reduzidos e, conseqüentemente, a possível toxicidade.

Em uma forma de realização preferida da invenção, o anticorpo biespecífico é um anticorpo bivalente ou tetravalente.

A invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende, por meio do princípio ativo, um composto que consiste de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, preferivelmente mistos com um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

Ainda, de acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica tal como ainda descrito acima compreendendo pelo menos um segundo composto escolhido dos compostos capazes de ligar-se especificamente à atividade de tirosina de IGF-IR, EGFR5 HER2/neu, VEGFR5 cMET e/ou RON.

Em um segundo aspecto preferido da invenção, dito segundo composto é escolhido a partir dos anticorpos anti-EGFR, -IGF-IR5 - HER2/neu, anti-VEGFR, -cMET e/ou -RON isolados ou seus fragmentos funcionais, capazes de inibir a atividade indutora de disseminação proliferativa e/ou antiapoptótica e/ou angiogênica e/ou metastática mediada pelos dito(s) receptor(es).

De acordo com uma outra forma de realização da invenção, a composição compreende, como o produto de combinação, para um uso simultâneo, separado ou seqüencial, pelo menos um inibidor da atividade de tirosina do IGF-IR, EGFR, HER2/neu, VEGFR, cMET e/ou RON.

Em uma outra forma de realização preferida, o dito inibidor da atividade de tirosina dos receptores é selecionado do grupo que consiste de agentes naturais derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo- ou pirrolopiridopirimidinas ou ainda quinazilinas. Tais agentes inibidores são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e descritos na literatura (Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1,25-32).

Uma outra forma de realização complementar da invenção consiste de um composição, tal como descrito acima que compreende, além disso, como um produto de combinação para o uso simultâneo, separado ou seqüencial, um agente citotóxico/citostático.

O "uso simultâneo " é entendido significar a administração dos dois compostos da composição de acordo com a invenção em uma forma farmacêutica simples e idêntica.

"Uso separado" é entendido como significando a administração, ao mesmo tempo, dos dois compostos da composição de acordo com a invenção em formas farmacêuticas distintas.

"Uso seqüencial" é entendido como significando a administração sucessiva dos dois compostos da composição de acordo com a invenção, cada um em uma forma farmacêutica distinta.

De uma maneira geral, a composição de acordo com a invenção aumenta consideravelmente a eficácia do tratamento de câncer. Em outras palavras, o efeito terapêutico do anticorpo anti-IGF-IR de acordo com a invenção é potenciado de uma maneira inesperada pela administração de um agente citotóxico. Uma outra vantagem subseqüente produzida por uma composição de acordo com a invenção diz respeito à possibilidade de usar doses de eficácia inferior de princípio ativo, permitindo os riscos de aparecimento de efeitos secundários a serem evitados ou a serem reduzidos, em particular os efeitos do agente citotóxico.

Além disso, esta composição de acordo com a invenção deve permitir o efeito terapêutico esperado a ser atingido mais rapidamente.

Por "agentes terapêuticos anticâncer" ou "agentes citotóxicos", é pretendida uma substância que, quando administrada a um paciente, trata ou evita o desenvolvimento de câncer no corpo do paciente. Como exemplos não limitantes de tais agentes, podem ser mencionados agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos antitumor, inibidores mitóticos, inibidores da função de cromatina, agentes antiangiogênese, antiestrogênios, antiandrogênios ou imunomoduladores.

Tais agentes são, por exemplo, citados a 2001 edition of VID AL, na página dedicada aos compostos ligados à coluna de cancerologia e hematologia "Citotóxicos", estes compostos citotóxicos citados com referência a este documento são citados aqui como agentes citotóxicos preferidos.

Mais particularmente, os seguintes agentes são preferidos de acordo com a invenção.

"Agente alquilante" refere-se a qualquer substância que possa reticular ou alquilar qualquer molécula, preferivelmente ácido nucleico (por exemplo, DNA), dentro de uma célula. Os exemplos de agentes alquilantes incluem nitrogênio mostarda, tal como mecloretamina, clorambucol, melfalen, cloridrato, pipobromeno, prednimustin, fosfato dissódico ou estramustina; oxazoforinas, tais como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida ou ifosfamida; aziridinas ou imina-etilenos, tais como tiotepa, trietilenoamina ou altetramina; nitrosouréia, tal como carmustina, estreptozocina, fotemustina ou lomustina; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, treosulfan ou improsulfan; triazenos, tais como dacarbazina ou complexos de platina, tais como cis-platina, oxaliplatina e carboplatina.

"Antimetabólitos" refere-se a substâncias que bloqueiam o desenvolvimento e/ou metabolismo celular por interferência em certas atividades, usualmente síntese de DNA. Os exemplos de antimetabólitos incluem metotrexato, 5-fluoruracila, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, citosina arabinosida, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina e pentostatina.

"Antibióticos antitumor" refere-se a compostos que podem prevenir e/ou inibir a síntese de DNA, RNA e/ou proteína. Os exemplos de antibióticos antitumor incluem doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina e procarbazina.

"Inibidores mitóticos" evitam a progressão normal do ciclo celular e da mitose. No geral, os inibidores de microtúbulo ou taxóides, tais como paclitaxel e docetaxel são capazes de inibir a mitose. Vinca alcalóide, tal como vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina também sã capazes de inibir a mitose.

"Inibidores da função de cromatina" ou "inibidores da topoisomerase" refere-se a substâncias que inibem a função normal de proteínas modeladoras da cromatina, tais como topoisomerase I ou topoisomerase II. Os exemplos da função de cromatina incluem, para a topoisomerase I, camptotecina e seus derivados, tais como, topotecan ou irinotecan e, para topoisomerase II, etoposida, fosfato de etoposida E teniposida.

"Agente antiangiogênese " refere-se a qualquer medicamento, composto, substância ou agente que iniba o desenvolvimento de vasos sangüíneos. Os agentes antiangiogênese incluem, mas não são limitados, de nenhuma maneira a, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, 13MS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-6515 82, esqualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina e vitaxina.

"Antiestrogênio" ou "agente antiestrogênico" refere-se a qualquer substância que reduz, antagoniza ou inibe a ação de estrogênio. Os exemplos de agentes antiestrogênio são tamoxifen, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozol, letrozol e exemestano.

"Antiandrogênios" ou "agentes antiandrogênio" refere-se a qualquer substância que reduz, antagoniza ou inibe a ação de androgênio. Os exemplos de antiandrogênios são flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, fmasterida e cimitidina.

"Imunomoduladores" são substâncias que estimulam o sistema imune.

Os exemplos de imunomodulatores incluem interferon, interleucina, tais como aldesleucina, OCT-43, denileucin diflitox e interleucina-2, fatores de necrose tumorais, tais como tasonermina ou outros imunomoduladores, tais como lentinan, sizofiran, roquinimex, pidotimod, pegademase, timopentina, poli I:C ou levamisol em conjunção com 5- fluorouracila.

Para maiores detalhes, a pessoa habilitada na técnica pode referir-se ao manual editado pela "Association Francaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique" e intitulado "traité de chimie thérapeutique, vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans Ie traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003".

Em uma forma de realização particularmente preferida, a dita composição como um produto de combinação de acordo com a invenção é caracterizado em que o dito agente citotóxico é ligado quimicamente ao dito anticorpo para o uso simultâneo.

Em uma forma de realização particularmente preferida, a dita composição de acordo com a invenção é caracterizada em que o dito agente citotóxico/citostático é escolhido a partir do inibidor de fiiso ou agentes estabilizadores, preferivelmente vinorelbina e/ou vinflunina e/ou vincristina.

A fim de facilitar a ligação entre o dito agente citotóxico e o dito anticorpo de acordo com a invenção, é especialmente possível introduzir moléculas espaçadoras entre os dois compostos a serem ligados, tais como poli(alquileno)glicóis como o polietileno glicol ou ainda aminoácidos ou em uma outra forma de realização, para usar derivados ativos dos ditos agentes citotóxicos em que foram introduzidas funções capazes de reagir com o dito anticorpo de acordo com a invenção. Estas técnicas de ligação são bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica e não serão expandidas no presente relatório descritivo.

Outros inibidores de EGFR podem, sem qualquer limitação, consistir dos anticorpos monoclonais C225 e 22Mab anti-EGFR (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA) ou os compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon)s leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner-Lambert Parke-Davis), CI-1033/PD 183, 805 (Warner-Lambert Parke-Davis), CL-3 87, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol-Myers Squibb), RC-3 940-11 (Pharmacia), BIBX-13 82 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Câncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Câncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Câncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) ou a "Vacina EGFR " (York Medicai/Centro de Imunologia Molecular).

Ainda, de acordo com uma outra forma de realização da invenção, a composição tal como descrita acima também pode compreender um outro composto de anticorpo direcionado contra o domínio extracelular do receptor de HER2/neu, como um produto de combinação para o uso simultâneo, separado ou seqüencial, pretendido para a prevenção e para o tratamento de câncer, especialmente, os cânceres que super-expressam o dito receptor de HER2/neu e o receptor IGF-IR e/ou EGFR, tal como especialmente o câncer de mama.

Referência pode ser feita, especialmente às publicações de Albanell et al (J. of the National Câncer Institute, 93(24):1830-1831, 2001) e de Lu et al (J. of the National Câncer Institute, 93(24):1852-1857, 2001) justificando o interesse inesperado na combinação de um anticorpo anti- HER2/neu com um anticorpo anti-IGF-IR de acordo com a presente invenção.

De uma maneira particular, o dito anticorpo anti-HER2/neu da composição de acordo com a invenção é o anticorpo denominado Trastuzumab (também denominado Herceptin).

A invenção, em um outro aspecto, diz respeito a uma composição caracterizada em que pelo menos um dos ditos anticorpos ou um de seus fragmentos funcionais, é conjugado com uma toxina celular e/ou um radioelemento.

Preferivelmente, a dita toxina ou o dito radioelemento é capaz de inibir pelo menos uma atividade celular de células que expressam o IGF- IR, de uma maneira mais preferida capaz de evitar o desenvolvimento ou a proliferação de da dita célula, especialmente inativando-se totalmente a dita célula.

Preferivelmente, também, a dita toxina é uma toxina enterobacteriana, especialmente Pseudomonas exotoxin A.

Os radioelementos (ou radioisótopos) preferivelmente conjugados aos utilizados para a terapia são radioisótopos que emitem raios gama e, preferivelmente, iodo131, ítrio90, ouro199, paládio100, cobre67, bismuto217 e antimônio211. Os radioisótopos que emitem raios beta e alfa também podem ser suados para a terapia.

Por toxina ou radioelemento conjugados a pelo menos um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, é pretendido indicar quaisquer meios que permitam que a dita toxina ou o dito radioelemento liguem-se ao dito pelo menos um anticorpo, especialmente pela ligação covalente entre os dois compostos, com ou sem a introdução de uma molécula de ligação.

Entre os agentes que permitem a ligação de uma maneira química (covalente), eletrostática ou não covalente de todos ou parte dos componentes do conjugado, particularmente, pode ser feita menção de benzoquinona, carbodiimida e, mais particularmente EDC (cloridreto de 1- etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobis- nitrobenzóico (DTNB), tio-acetato de N-succinimidil S-acetila (SATA), os agentes de ligação em ponte tendo um ou mais grupos fenilazida que reagem com os ultravioletas (U.V.) e preferivelmente N-[-4-(azidosalicilamino)butil]- .3,-(2'-pirídilditio)propionamida (APDP), 3-(2-piridilditio)propionato N- succinimidila (SPDP), 6-hidrazino-nicotinamida (HYNIC).

Uma outra forma de ligação, especialmente para os radioelementos, pode consistir no uso de um quelador iônico bifuncional.

Entre estes quelados, é possível mencionar os quelados derivados de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) ou de DTPA (ácido dietilenotriaminopentaacético) que foi desenvolvido para metais de ligação, especialmente metais radioativos imunoglobulinas. Desta maneira, o DTPA e seus derivados podem ser substituídos por grupos diferentes na cadeia e carbono a fim de aumentar a estabilidade e a rigidez do complexo de ligando- metal (Krejcarek et ai., 1977; Brechbiel et al., 1991; Gansow, 1991; Patente US 4.831.175).

Por exemplo, ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) e seus derivados, que foi amplamente usado na medicina e ba biologia por um longo período em sua forma livre ou na forma de um complexo com um íon metálico, tem a característica notável de formar quelados estáveis com íons metálicos e de serem ligados com as proteínas de interesse terapêutico ou diagnóstico, tais como anticorpos para o desenvolvimento de radioimunoconjugados na terapia contra o câncer (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).

Da mesma maneira, preferivelmente, o dito pelo menos um anticorpo que forma o dito conjugado de acordo com a invenção é escolhido a partir dos fragmentos funcionais, especialmente, os fragmentos amputado de seu componente de Fc, tal como os fragmentos scFv.

A presente invenção além disso, compreende o uso de uma composição de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento.

Mais particularmente, de acordo com uma outra forma de realização, a invenção diz respeito ao uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais e/ou de uma composição para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de uma doença induzido por uma super-expressão e/ou uma ativação anormal do IGF- IR e/ou conectado com uma hiperativação do trajeto de transdução do sinal mediado pela interação do IGF1 ou IGF2 com IGF-IR.

Ainda de acordo uma outra forma de forma de realização preferida, a invenção diz respeito ao uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais e/ou de uma composição para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de uma doença induzida por uma super-expressão e/ou uma ativação anormal do IGF- IR e/ou conectado com uma hiperativação do trajeto de transdução do sinal mediado pela interação do IGF2 com IGF-IR.

Preferivelmente, o dito uso de acordo com a invenção é caracterizado em que a administração do dito medicamento não induz ou induz apenas levemente os efeitos secundários conectados com a inibição do receptor de insulina IR, isto quer dizer que a inibição da interação do IR com seus ligandos naturais devido à presença do dito medicamento, especialmente por uma inibição competitiva conectada com a ligação do dito medicamento ao IR.

A presente invenção além disso, compreende o uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, preferivelmente humanizados e/ou de uma composição de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento pretendido para inibir a transformação de células normais em células com caráter tumoral, preferivelmente células dependente de IGF, especialmente, pelo menos dependente de IGF2.

A presente invenção também diz respeito ao uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, preferivelmente humanizados e/ou de uma composição de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento pretendido para inibir o desenvolvimento e/ou a proliferação de células tumorais, preferivelmente células dependentes de IGF, especialmente, pelo menos dependente de IGF2.

De uma maneira geral, um objetivo da presente invenção é o uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, preferivelmente humanizados e/ou de uma composição de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de câncer preferivelmente expressando IGF-IR e/ou de câncer preferivelmente tendo a hiperativação do trajeto de transdução do sinal mediada pela interação de IGFl e/ou IGF2 com IGF-IR, tal como, por exemplo, a super-expressão de IRS1.

O objetivo da presente invenção também é o uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, preferivelmente humanizados e/ou de uma composição de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de psoríase, psoríase cuja hiperproliferação epidérmica pode ser conectado com uma expressão ou a super-expressão de IGF-IR e/ou com a hiperativação do trajeto de transdução do sinal mediado pela interação de IGF-IR com seus ligandos naturais (Wraight C. J. et ai, Nat. Biotechnol., 2000, 18(5):521-526, Reversal of epidermal hiperproliferation in psoriasis by receptor of insulin-like growth factor antisense oligonucleotides) e/ou de EGFR com seus ligandos naturais.

A invenção também diz respeito ao uso do anticorpo ou quaisquer fragmentos funcionais destes, preferivelmente humanizados, e/ou de qualquer composição que compreende o dito anticorpo, para a preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de aterosclerose.

Entre os cânceres que podem ser prevenidos e/ou tratados, câncer de próstata, osteosarcomas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de cólon, mieloma múltiplo ou câncer de ovário ou qualquer outro câncer que super-expresse IGF-IR é preferido.

Em uma forma de realização mais preferida, devido à capacidade particular de deslocar o displace IGF2, a invenção diz respeito ao uso do anticorpo ou seu fragmento, de acordo com a invenção, para a prevenção, diagnóstico ou tratamento de câncer de cólon, como o IGF2 é conhecido ser particularmente implicado neste câncer.

Ainda, de acordo com um outro aspecto, um objetivo da presente invenção é um método de diagnóstico, preferivelmente in vitro, das doenças conectadas com uma super-expressão ou uma subexpressão, preferivelmente uma super-expressão, do IGF-IR começando a partir de uma amostra biológica em que a presença anormal de IGF-IR é suspeita, caracterizado em que a dita amostra biológica é contactada com um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, sendo possível que o dito anticorpo seja, se necessário, rotulado.

Preferivelmente, a dita doença conectada com a super- expressão do IGF-IR no dito método de diagnóstico seja cânceres.

O dito anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, pode estar presente na forma de um imunoconjugado ou de um anticorpo rotulado a fim de obter um sinal detectável e/ou quantificável.

Um objetivo da invenção é um método de diagnóstico in vitro de condição patológica caracterizado pela expressão aberrante de IGF-IR com relação à normal, o dito método compreendendo contatar uma amostra biológica suspeita de conter IGF-IR, com o anticorpo de acordo com a invenção, sob as condições que favorecem a formação de uma complexo de IGF-IR/anticorpo e detectar o dito complexo como indicando a presença do dito IGF-IR na dita amostra. Em uma forma de realização preferida, o dito anticorpo é detectavelmente rotulado.

Em um primeiro aspecto, a expressão aberrante de IGF-IR é uma super-expressão de IGF-IR. Em um segundo aspecto, a expressão aberrante de IGF-IR é uma subexpressão de IGF-IR.

Os anticorpos rotulados de acordo com a invenção ou seus fragmentos funcionais incluem, por exemplo, anticorpos denominados imuno- conjugados que podem ser conjugados, por exemplo, com enzimas, tais como peroxidase, fosfatase alcalina, α-D-galactosidase, glicose oxidase, glicose amilase, anidrase carbônica, acetilcolinoesterase, lisozima, malato desidrogenase ou glicose 6-fosfato desidrogenase ou por uma molécula, tal como biotina, digoxigenina ou 5-bromodeoxiuridina. Os rótulos fluorescentes também podem ser conjugados aos anticorpos ou a seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção e especialmente incluem fluoresceína e seus derivados, fluorocromo, rodamina e seus derivados, GFP (GFP para "Proteína Fluorescente Verde"), dansil, umbeliferona etc.. Em tais conjugados, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos funcionais podem ser preparados pelos métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Estes podem ser ligados às enzimas ou aos rótulos fluorescentes diretamente ou por intermédio de um grupo espaçador ou de um grupo de ligação, tal como um polialdeído, como glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido dietileno-triaminopentaacético (DPTA) ou na presença de agentes de ligação, tais como aqueles mencionados acima para os conjugados terapêuticos. Os conjugados contendo rótulos do tipo fluoresceína podem ser preparados pela reação com um isotiocianato.

Outros conjugados também podem incluir rótulos quimioluminescentes, tais como luminol e os dioxetanos, rótulos bioluminescentes, tais como luciferase e luciferina ou ainda rótulos radioativos, tais como iodo^123, iodo^125, iodo^126, iodo^133 bromo^77 tecnécio^99m, índio^111, índio^113m, gálio^67, gálio^68, rutênio^95, rutênio^97, rutênio^103, rutênio^105, mercúrio^107, mercúrio^203, rênio^99m, rênio^101, rênio^105, escândio^47, telúrio^121m, telúrio^122m, telúrio^125m, túlio^165, túlio^167, túlio^168, flúor^18, ítrio^199, iodo^131. Os métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica existentes para a ligação dos radioisótopos aos anticorpos diretamente ou por intermédio de um agente de quelação, tal como EDTA, DTPA mencionado acima pode ser usado para os elementos que podem ser usados no diagnóstico. Também é possível mencionar a rotulação com Na[I125] pelo método de cloramina T [Hunter W. M. e Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495] ou ainda com tecnécio99m pela técnica de Crockford et ai (Patente US 4.424.200) ou ligados por intermédio de DTPA como descrito por Hnatowich (Patente US 4,479,930).

Desta maneira, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção podem ser utilizados em um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma super-expressão ou de uma subexpressão, preferivelmente uma super-expressão, do IGF-IR em uma amostra biológica, caracterizado em que este compreende as seguintes etapas:

a) o contato da amostra biológica com um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção e

b) a demonstração do complexo IGF-IR/anticorpo possivelmente formado.

Em uma forma de realização particular, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, podem ser utilizados em um processo para a detecção e/ou a quantificação do IGF-IR em uma amostra biológica, para o monitoramento da eficácia de um tratamento profilático e/ou terapêutico de câncer dependente de IGF ou ainda de psoríase ou aterosclerose.

Mais, no geral, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção podem ser vantajosamente utilizados em qualquer situação onde a expressão do IGF-IR deve ser observada de uma maneira qualitativa e/ou quantitativa.

Preferivelmente, a amostra biológica é formada por um fluido biológico, tal como soro, sangue total, células, uma amostra de tecido ou biópsias de origem humana.

Um outro aspecto da invenção é um método de diagnóstico para predizer um potencial oncogênico de uma amostra de células de próstata, que compreende:

a) fornecer uma amostra de tecido de próstata humana e

b) determinar, na amostra, a presença de IGF-IR, a dita etapa que compreende contatar a dita amostra com o anticorpo de acordo com a invenção sob as condições que favorecem a formação de um complexo IGF- IR/anticorpo, em que presença do dito complexo indica o potencial oncogênico das ditas células no dito tecido.

Em uma outra forma de realização, a presença do dito complexo indica que o paciente está em risco de desenvolver ou início de um distúrbio patológico caracterizado pela super-expressão do dito IGF-IR.

Um objetivo da invenção também é um método para seguir o progresso de um regime terapêutico projetado para aliviar um distúrbio patológico caracterizado pela expressão anormal de expressão de IGF-IR, que compreende:

(a) testar uma amostra a partir de um paciente para a determinação de um nível de IGF-IR em um primeiro ponto de tempo;

(b) testar a dita amostra em um segundo ponto de tempo e

(c) comparar o dito segundo ponto de tempo ao nível determinado em (a) como uma determinação do efeito do dito regime terapêutico em que uma diminuição no nível de IGF-IR na dita amostra é determinante da regressão do dito distúrbio patológico no dito paciente ou um aumento no nível de IGF-IR é determinante da progressão do dito distúrbio patológico no dito paciente.

Qualquer procedimento ou teste convencionais podem ser utilizados a fim de realizar uma tal detecção e/ou dosagem. O dito teste pode ser um teste de competição ou de sanduíche ou qualquer teste conhecido pela pessoa habilitada na técnica dependente da formação de um complexo imune do tipo de antígeno de anticorpo. Seguindo as aplicações de acordo com a invenção, o anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais podem ser imobilizados ou rotulados. Esta imobilização pode ser realizada em suportes numerosos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Estes suportes podem incluir, especialmente vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon ou células naturais ou modificadas. Estes suportes podem ser solúveis ou insolúveis.

Por meio de exemplo, um método preferido realiza os processo imunoenzimáticos de acordo com a técnica ELISA, pela técnica de imunofluorescência ou radioimunoensaio (RIA) ou equivalente.

Desta maneira, a presente invenção também compreende os kits ou grupos necessários para a realização de um método de diagnóstico de doenças induzidas por uma super-expressão ou uma subexpressão do IGF-IR ou para a realização de um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma super-expressão ou de uma subexpressão do IGF-IR em uma amostra biológica, preferivelmente uma super-expressão do dito, caracterizado em que o dito kit ou grupo compreende os seguintes elementos:

a) um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção;

b) opcionalmente, os reagentes para a formação do meio favorável para a reação imunológica;

c) opcionalmente, os reagentes permitem a demonstração dos complexos IGF-IR/anticorpo produzidos pela reação imunológica.

A invenção, além disso, diz respeito ao uso de uma composição como um produto de combinação de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de câncer, especialmente cânceres para os quais o dito agente citotóxico ou o dito anticorpo anti-HER2/neu é, no geral, prescrito e especialmente, para aqueles cânceres que as células tumorais expressam ou super-expressam o IGF-IR.

Um objetivo da invenção também é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento pretendido para o alvejamento específico de um composto biologicamente ativo às células que expressam ou que super-expressam o IGF-IR.

Aqui, é pretendido que o composto biologicamente ativo indique qualquer composto capaz de modular, especialmente de inibir, a atividade celular, em particular seu desenvolvimento, sua proliferação, transcrição ou tradução de gene.

Um objetivo da invenção também é um reagente de diagnóstico in vivo que compreende um anticorpo de acordo com a invenção ou um de seus fragmentos funcionais, preferivelmente rotulados, especialmente radiorrotulados, e seu uso na formação de imagem médica, em particular para a detecção de câncer conectado com uma expressão ou a super-expressão por uma célula do IGF-IR.

A invenção também diz respeito a uma composição como um produto de combinação ou a um conjugado de anti-IGF-IR/toxina ou radioelemento, de acordo com a invenção, como um medicamento.

Preferivelmente, a dita composição como um produto de combinação ou o dito conjugado de acordo com a invenção será misturado com um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

No presente relatório descritivo, o veículo farmaceuticamente aceitável é pretendido indicar um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica que não provoca reações secundárias e que permite, por exemplo, facilitar a administração dos compostos ativos, um aumento em lifespan e/ou em sua eficácia no corpo, um aumento em sua solubilidade na solução ou ainda uma melhora em sua conservação. Estes veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados pela pessoa habilitada na técnica como uma função da natureza e do modo de administração dos compostos ativos escolhidos. Preferivelmente, estes compostos serão administrados pela via sistêmica, em particular pela via intravenosa, pela via intramuscular, intradérmica, intraperitoneal ou subcutânea ou pela via oral. De uma maneira mais preferida, a composição que compreende os anticorpos de acordo com a invenção serão administrados diversas vezes, de uma maneira seqüencial.

Seus modos de administração, dosagens e formas farmacêuticas ótimas podem ser determinadas de acordo com os critérios levados em conta no estabelecimento de um tratamento adaptado a um paciente, tal como, por exemplo, a idade e o peso do corpo do paciente, a seriedade de sua condição geral, a tolerância ao tratamento e os efeitos secundários observados.

Outras características e vantagens da invenção aparecem na continuação do relatório descritivo com os exemplos e as figuras cujas legendas são representadas abaixo. LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: Competição de ligação de [125IJ-IGF-I ao IGF-IR pelo anticorpo monoclonal 1-3466.

A ligação de [125IJ-IGF-I específica (em%) foi plotada como uma função de concentração de ligando em um gráfico semilog. Os valores de ligação específicos são as médias de experimentos realizados em triplicata.

Figura 2: Competição de ligação de [125I]-IGF-2 ao IGF-IR pelo anticorpo monoclonal 1-3466.

A ligação de [125I]-IGF-2 específica (em%) foi plotada como uma função de concentração de ligando em um gráfico semilog. Os valores de ligação específicos são as médias de experimentos realizados em triplicata.

Figuras 3A e 3B: Efeito in vitro do anticorpo 1-3466 em desenvolvimento de MCF-7 induzido por IGFl ou IGF2.

Figuras 4A e 4B: Efeito do 1-3466 Mab em IGFl (Figura 4A) ou foforilação induzida por IGF2 (Figura 4B) da cadeia β de IGF-IR em células de MCF-7.

Figuras 5A e 5B: Efeito do 1-3466 Mab em fosforilação induzida por IGFl (Figura 5 A) ou IGF2 (Figura 5B da cadeia β de IGF-IR em células de HT29.

Figuras 6A a 6C: Atividade in vivo de 1-3466 em modelos tumorais de xenoenxerto de DU145 (Figura 6A), SK-ES-I (Figura 6B), HT29 (Figura 6C), A549 (Figura 6D) e MCF-7 (Figura 6E).

Figura 7: Comparação da seqüência de aminoácidos das regiões variáveis de uma cadeia leve (VL) de camundongo 1-3466 (SEQ ID N0 7) humanizado por enxerto de CDR1-3466 (SEQ ID N0 20).

O símbolo * (asterisco) indica resíduos importantes para a manutenção da conformação de arco de CDR e o símbolo # (sustenido) indica resíduos conservados encontrados na interface VL/VH.

Figura 8: Comparação da seqüência de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas (VH) de camundongos 1-3466 (SEQ ID N0 8) e de humanizado por enxerto de CDR1-3466 (SEQ ID N0 21).

O símbolo * (asterisco) indica resíduos importantes para a manutenção da conformação de arco CDR e o símbolo # (sustenido) indica resíduos conservados encontrados na interface VL/VH.

Figura 9: Análise SDS-PAGE de anticorpos 1-3466 purificados. A legenda é a seguinte:

M: Marcador,

Linha 1: região variável humanizada 1-3466,

Lane 2: região variável de camundongo 1-3466,

Painel A: redução de SDS-PAGE,

Painel B: não redução de SDS-PAGE.

As regiões constantes tanto para camundongo quanto para humanizado 3466 são humanas.

Figura 10: Representação esquemática do ensaio de captura de biossensor.

Um IgGl Mab humano direcionado contra a porção de Fc constante, foi covalentemente ligado a um sensor de superfície CM5. Uma quantidade limitada de Mab a ser testado foi imobilizado e usado para capturar o analisado hIGF-IR-ECD. A ligação de Mab ao analisado é caracterizado pelas taxas de associação e dissociação constantes ka e kd> respectivamente. O equilíbrio da constante de equilíbrio (KD) é calculado pela razão entre taxas de dissociação e de associação constantes.

Figura 11: Sensorgrama da fase de associação e dissociação dos complexos IgGl humanizados 1-3466 / hIGF-IR-ECD para cinco concentrações diferentes de hIGF-IR-ECD.

Exemplo 1: Geração e seleção do anticorpo monoclonal humano (MAb)

Com o auxílio da geração de MAb especialmente direcionado contra IGF-IR e que não reconhece o IR, um protocolo que compreende 6 estágios de avaliação foi realizado.

Este consistiu de:

-imunizar camundongos com IGF-IR recombinante humano, a fim de gerar hibridomas,

-avaliar os sobrenadantes da cultura por ELISA na proteína recombinante que serviu para a imunização,

-testar todos os sobrenadantes de hibridomas positivos por ELISA no receptor natural super-expressado na superfície de células tumorais MCF-7,

-realizar os experimentos de ligação para a seleção de anticorpos que reconhecem especificamente o IGF-IR,

-verificar que os anticorpos selecionados neste estágio foram capazes de inibir in vitro a proliferação induzida pela proliferação de IGFl das células MCF-7,

-garantir a atividade in vivo, em camundongos nus, do candidato retido em termos de impacto no desenvolvimento do tumor MCF-7.

Todos estes estágios e resultados obtidos serão resumidamente descritos no exemplo 1.

Para o estágio de imunização, os camundongos foram injetados duas vezes, por via subcutânea, com 8 μg de IGF-IR recombinante. Três dias antes da fusão de células do baço com as células do mieloma de murino Sp2OAgl4, os camundongos receberam por uma injeção intravenosa de 3 μg do receptor recombinante. Quatorze dias após a infusão, os sobrenadantes de hibridomas foram avaliados por ELISA5 em placas sensibilizadas por IGF-IR recombinante. Os hibridomas cujos sobrenadantes foram observados positivos foram conservados e amplificados antes de serem testados pela análise FACScan a fim de verificar que os anticorpos produzidos também foram capazes de reconhecer o nativo IGF-IR. Exemplo 2: Inibição de ligação de [125I]-IGF1 e I125I]-IGF2 ao receptor de IGF-1 humano

Preparação de lisado de membrana

As células NIH 3T3 estavelmente transfectadas com o IGF-IR cDNA humano foram desenvolvidos em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Após a separação por raspagem, as células com falta de soro ainda foram coletadas por centrifugação. Os grânulos celulares foram lavados com salmoura tamponada por fosfato e recolocados em suspensão em tampão de lise: 10 mM de tampão de Tris-HCl pH 7,5 contendo inibidores de protease. Aproximadamente 1 ml de tampão foi adicionado a 25.1O^6 células. As células ainda foram submetidas à lise por 3 ciclos de congelamento- descongelamento seguido por 30 movimentos de um homogeneizador de Potter a 1.900 rpm. Após a sonificação, os núcleos e os fragmentos celulares grandes foram descartados por centrifugação a 1.000 g por 15 minutos a +4°C. As membranas celulares totais foram obtidas por centrifugação 105.000 g por 1 hora a +4°C. O grânulo de membrana foram lavados em tampão de lise e centrifugados a 105.000 g por 1 hora a +4°C. O grânulo final foi recolocado em suspensão em 50 mM de tampão de Tris-HCl contendo 150 mM de NaCl, 0,5% de IGEPAL, 0,5% de Triton X-100, 0,25% de desoxicolato de sódio e inibidores de protease e agitados durante a noite a +4°C. O material insolúvel foi separado a partir dos extratos solúveis contendo hIGF-IR por centrifugação a 10.000 g por 10 minutos a +4°C. Os lisados de membrana foram analisados quanto a concentração de proteína pelo ensaio bicincônínico e para IGF-IR por western blot.

Ensaios de ligação de [125^I]-IGF1 e [125^I]-IGF2

O anticorpo monoclonal comercialmente disponível 17-69 (Neomarkers, Fremont, CA, USA), que foi descrito reconhecer a subunidade IGF-IR alfa, foi primeiro revestido em microplacas de 96 reservatórios Protein A FlashPlate® (Perkin Elmer, Boston5 MA5 USA) para a !mobilização de IGF-IR. Duzentos μl de uma solução de anticorpo de 20 μg/ml em PBS foram adicionados a cada reservatório e incubados durante a noite a +4°C. O tampão contendo 17 a 69 residuais não ligados à proteína A foi removido por aspiração. Duzentos μl do lisado de membrana em 100 μg/ml ainda foram adicionados e incubados por 2 horas em temperatura ambiente para a imobilização de IGF-IR. As proteínas não capturadas foram removidas por aspiração. Para os ensaios de competição, a ligação de [125^I]-IGFl (Perkin Elmer, Boston, MA5 USA) ou [I25^I]-IGF2 (Amersham Biosciences, Saclay, França) em 100 pM ao IGF-IR imobilizado foi medido na presença de concentrações variantes do anticorpo monoclonal 1-3466 ou os ligandos IGF1, IGF2 e insulina (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, França) que variam de 1 pM a 1 μΜ em tampão de ligação contendo 50 mM de Hepes pH 7,6, 150 mM de NaCl5 0,05% de Tween 20, 1% de albumina de soro bovino e 1 mM de PMSF. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 horas, depois contadas em um Contador de Cintilação de Microplaca Packard Top Count. A ligação não específica foi determinada na presença de 1 μΜ de IGF 1. O anticorpo monoclonal 9G4, que não é direcionado a hIGF-IR mas especificamente reconhece uma proteína de E. coli, foi usado como controle de isotipo de IgGl de camundongo. Resultados

A porcentagem de ligação de [125IJ-IGFl and [125I]-IGF2 específica foi plotada como uma função de concentração de ligando em gráficos semilog. As concentrações dos vários inibidores requeridos para a inibição do radioligando por 50% (IC50) foram determinados graficamente a partir das curvas de competição sigmóides obtidas (Figuras 1 e 2).

Tanto os ligandos de IGFl quanto de IGF2 apresentaram eficazmente ligação de [125I]-IGF1 ao hIGF-IR imobilizado, visto que a insulina e o isotipo anticorpo de controle 9G4 foram incapazes de inibir a ligação de [125IJ-IGFl em concentração menor do que 500 nM (Figura 1). O anticorpo monoclonal 1-3466 foi capaz de inibir a ligação de [125IJ-IGFl com um IC50 de 0,021 nM (Figura 1), que é 30 vezes menor do que o IC50 determinado para o IGFl não radiorrotulado.

Além disso, o anticorpo I-3466 também apresentou uma atividade de inibição de ligação forte de [I25IJ-IGF2 para hIGF-IR imobilizado (Figura 2). Neste caso, o valor de IC50 deduzido da curva de competição foi em torno de 0,1 nM. Esta atividade de bloqueio de IGF2 de 1-3466 foi similar à atividade inibidora induzida por IGF2 (IC50 = 0,06 nM). Esta foi levemente

menor do que a atividade inibidora de IGFl (IC50 = 0,02 nM) e

significantemente maior do que aquela da insulina (IC50 - 200 nM). Como

esperado, o anticorpo de controle 9G4 não apresentou qualquer atividade de bloqueio de IGF2.

Exemplo 3: Efeito In vitro do anticorpo 1-3466 em desenvolvimento de MCF-7 induzido por IGFl ou IGF2

Como indicado acima, o IGF-IR é super-expressado por tumores numerosos mas, além disso, foi descrito que em um número significante de cânceres de mama e de cólon o sinal de proliferação é dado a este receptor por intermédio de IGF2 (algumas vezes escrito IGF-2, IGF-II ou IGFII). Portanto, é essencial garantir que o MAb 1-3466 também seja capaz de inibir o desenvolvimento induzido tanto por IGFl quanto por IGF2 em células de MCF-7 in vitro. A fim de que isto ocorra, as células foram colocadas em placas de 96 reservatórios em uma densidade de 5 χ IO4 células/reservatório em 200 μΐ de meio isento de soro (meio RPMI isento de vermelho fenol mais 1% de L-Glutamina). Vinte horas após a colocação em placas, o IGFl em uma concentração final de 50 μ^πιΐ (6,6 nM) ou IGF-2 (concentração final de 100 ng/ml (13,2 nM)) foi adicionado às células MCF-7 na presença ou na ausência de 1-3466 ou um anticorpo anti-IGF-IR não neutralizador de murino (7G3) usado como um isotipo controle por quase 52 horas adicionais.

Os anticorpos foram testados em concentrações finais que variam de 10 μ^ιηΐ (66 nM) a 0,0097 μ^ιηΐ (0,065 nM). Depois, as células foram pulsadas com 0,25 μα de [3HJtimidina por 16 horas e a magnitude de [3H]timidina incorporado no DNA foi quantificado pela contagem de cintilação. Tanto IGF-I quanto IGF-2 significantemente estimulam o desenvolvimento de célula MCF-7 (Tabela 2).

Nenhuma inibição significante foi observada quando as células foram tratadas com doses crescentes do anticorpo de controle de isotipo.

Em contraste, quando as células foram incubadas com doses crescentes do anticorpo 1-3466, uma dose significante dependente da inibição da proliferação induzida tanto por IGFl (90%) quanto por IGF2 (84%)foi observada com IC50S de 0,7 nM e 0,5 nM respectivamente (Tabela 2 e Figuras 3A e 3B).

Tabela 2

Efeito in vitro do anticorpo 1-3466 em desenvolvimento de MCF-7 induzido por IGFl (A) ou IGF2(B) <table>table see original document page 61</column></row><table>

Exemplo 4: O 1-3466 inibe a fosforilação induzida tanto por IGFl quanto por IGF2da cadeia β de IGF-Ht

As células MCF7 ou HT29 foram cultivadas por 24 horas em 5.104 células/cm2 (placas de 75 cm2, COSTAR) em 20 ml de RPMI sem vermelho fenol, misturado com 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina (respectivamente 100 U/100 μg/ml) e 10% de soro fetal bovino. Após três lavagens em PBSj as células foram incubadas por 12 horas em meio isento de vermelho fenol (RPMI) sem soro fetal bovino e misturado com 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina, albumina de soro bovino em 0,5 μg/ml (Sigma A-8022) e transferrina em 5 μg/ml (Sigma T8158).

Para a ativação, as células foram primeiro encubadas a 37°C por 15 minutos com anticorpos bloqueadores (10 μg/ml) a serem testados e então IGFl ou IGF2 foi adicionado por dois minutos adicionais. A reação foi interrompida pela aspiração do meio de incubação e as placas foram colocadas em gelo. As células foram solubilizadas pela adição de 0,5 ml de tampão de Iise (50 mM de tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCls 1% de Nonidet P40, 0,5% de desoxicolato de sódio), misturados com os inibidores de protease (1 tablete por 50 ml, Boehringer Ref.: 1697 498) e inibidores de fosfatase (Calbiochem Ref.: 524625 (1/100)). As células foram fragmentadas e a suspensão foi recuperada e colocada em um agitador a 4°C por 1,5 horas. As soluções foram centrifugadas a 12.000 rpm por dez minutos (4°C) e as concentrações de proteína dos sobrenadantes foram quantificadas por BCA.

.500 μg de proteínas do lisado celular foram misturadas com o anti-IGF-IR (Santa cruz Ref.: sc-713) para a imunoprecipitação e incubadas no agitador a 4°C por 1,5 horas. Os imunoprecipitados foram recuperados pela adição de proteína A-agarose (Boehringer Ref.: 1 134 515) e incubados a noite toda no agitador a 4°C. As pérolas de agarose foram lavadas duas vezes com 1 ml de tampão de lise, duas vezes com um tampão de lavagem 1 (50 mM de tris-HCl pH 7,5; 500 mM de NaCl; 0,1% de Nonidet P40; 0,05% de desoxicolato de sódio (Boehringer 1 332 597), misturado com inibidores de protease e inibidores de fosfatase) e uma vez com um tampão de lavagem 2 (50 mM de tris-HCl; 0,1% de Nonidet P40; 0,05% de desoxicolato de sódio (Boehringer Ref.: 1 332 597), misturado com inibidores de protease e inibidores de fosfatase 1/100). Os imunoprecipitados foram recolocados em suspensão em um tampão de Laemmli, aquecido a IOO0C por 5 minutos, os sobrenadantes foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (8% de Novex EC6015). As proteínas foram transferidas a uma membrana de nitrocelulose seguido por um imunoblot com anticorpos antifosfotirosina conjugados com HRP (BD transduction Labs PY20) ou beta anti-cadeia de IGF-IR (Santa Cruz Ref.: sc 713) seguido por um anticorpo anti-coelho conjugado com HRP. As impressões foram reveladas por quimioluminescência (Amersham RPN 2209) seguido por autorradiografia em películas Kodak X-mat AR.

As figuras 4A e 4B representam células MCF-7 não estimuladas (linha 1, painel A e B) ou estimulado com 50 ng/ml de lGFl sozinho (linha 2, painel A) ou 100 ng/ml de IGF2 (linha 2, painel B). como esperado na estimulação basal de IGF-IR foi observado em células MCF-7 enquanto uma fosforilação significante da cadeia β IGF-IR 13-foi observada quando as células MCF-7 foram incubadas com IGFl ou IGF2. Nenhuma estimulação foi observada quando as células foram tratadas com um controle de isotipo (linhas 3, painel A e B) ou com o anticorpo 1-3466 sozinho (linhas 4, painel A e B) demonstrando que o I-3466 não apresentou nenhum efeito agonístico no IGF-IR. Quando o I-3466 foi adicionado com IGFl ou IGF2, a complete inibição da fosforilação induzida por ligando foi observada (linhas 5, painel A e Β). O anticorpo 9G4 usado como o controle de isotipo foi sem qualquer efeito na fosforilação induzida por IGF1 ou IGF2 (linhas 6, painel A eB).

A mesma atividade inibidora de I-3466 foi observada em células de HT29 estimuladas por IGFl ou IGF2 (Figuras 5A e 5B). Estes resultados estão de acordo com os descritos no exemplo 2 mostrando que o I- 3466 é capaz de apresentar tanto IGFl quanto IGF2 a partir de IGF-IR.

Exemplo 5: Estudos de Internalização e degradação do IGF-Ht

Os estudos de internalização e degradação foram analisados pela análise FACS. Os estudos de internalização foram realizados usando-se um anticorpo monoclonal anti-IGF-IR biotinilado de anticorpo monoclonal (Mab) a seguir descrito como 12B1 Mab e ligação a um epítopo diferente a partir de um reconhecido pelo anticorpo I-3466. O 9G4 Mab, foi introduzido como um controle de isotipo. Ambos os anticorpos foram gerados em nosso laboratório. As células MCF-7 confluentes foram tripsinizadas e 1 x 10^6 células de cada suspensão celular foi colocada em placas de 96 reservatórios em tampão de FACS. As placas foram incubadas, 4 horas a 37°C com IGFl (50 ng/ml) ou com 30 μg/ml de I-3466, 9G4, mlgG1.

As células incubadas apenas com o tampão de FACS foram usadas para a determinação do nível basal de expressão do IGF-IR.

Então, as células foram lavadas duas vezes e 20 μg/ml de 12B1 MAb biotinilado foram adicionados à placa. Após 30 minutos de incubação a 4°C para evitar a internalização do receptor, as células foram lavadas 3 vezes a 4°C e tingido pela adição de estreptavidina Alexa Fluor® 488-conjugado (Molecular Probes Europe BV, Leiden, Países Baixos). Para os experimentos de degradação uma etapa adicional de permeabilização celular foi adicionada antes do tingimento das células com 12B1 biotinilado e estreptavidina Alexa Fluor® 488-conjugado.

A Tabela 3 mostrou que o I-3466 causa uma sub-regulação do IGF-IR tanto nas células MCF-7 quanto nas HT29 após um período de 4 horas de incubação. Nenhum período de sub-regulação foi observado quando as células foram incubadas com o 9G4 Mab, usado como um controle de isotipo.

Tabela 3

Experimentos de internalização/degradação de IGF-IR pelo anticorpo 1-3466

A- Experimento de Internalização

<table>table see original document page 64</column></row><table>

(copiar a tabela da página 49) - Linha celular ID - Mab testado - MFI 12B1- mIgGl -% de internalização

B- Experimento de Degradação

<table>table see original document page 64</column></row><table> Exemplo 6: Efeitos antitumor de I-3466 Mab em modelos tumorais de xenoenxerto de DU145, SK-ES-1, HT29, A549 e MCF-7

Para melhorar a atividade do anticorpo I-3466 no desenvolvimento tumoral in vivo, cinco modelos tumorais de xenoenxerto foram usados: o câncer de próstata DU145 independente de androgênio, o osteosarcoma SK-ES-1, o câncer de cólon HT29, o câncer de célula pulmonar não pequena A549 e o câncer de mama MCF-7. Para aquele propósito, camundongos nus de 6 a 8 semanas atímicos fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2.10^6, 5.10^7, 5.1O^6, 10.1O^6 e 5.10^6 com relação a DU- 145, SK-ES-1, HT29, A549 e MCF-7 respectivamente. Para DU145 e SK-ES- 1, os camundongos foram tratados 24 horas após a injeção celular com 200 μg de anticorpo não purificado.

O tratamento foi repetido duas vezes por semana. Com respeito ao HT29, o tratamento começou quando os tumores atingiram um volume compreendido entre 49 e 59 mm3 e os camundongos foram injetados i.p., 3 vezes por semana, com 0,5 mg de anticorpo purificado.

Para A549, os volumes tumorais iniciais foram compreendidos entre 38 e 43 mm3 e para os experimentos de MCF-7, estes foram compreendidos entre 42 e 59 mm3 no início do tratamento. O volume tumoral foi avaliado uma ou duas vezes por semana e calculado pela seguinte fórmula:

π/6 x comprimento x largura x altura.

As Figuras 6A a 6E mostraram os resultados parcialmente realizados com anticorpo não purificado indicando que o 1-3466 é capaz de inibir significantemente o desenvolvimento tumoral in vivo das 5 linhas celulares testadas.

Exemplo 7: Clonagem, produção e caracterização do anticorpo I-3466 IgGl humanizado

As regiões variáveis quimicamente sintetizadas para cadeias leves e pesadas do anticorpo humanizado 1-3466 foram amplificadas por PCR e clonadas em vetores de expressão de anticorpo carregando regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada IgGl humana, respectivamente. Os iniciadores de PCR contém 36 nucleotídeos com 15 nucleotídeos para o recozimento por infusão com a região de clonagem que sobrepõe o vetor e 21 nucleotídeos para o recozimento com as regiões variáveis. A seqüências de nucleotídeo exatas são mostradas abaixo:

Para a clonagem de região variável de cadeia leve:

IF-Humanizado I-3466-LCK-F (SEQID N° 21)

[5'-ACAGATGCC AGATGCGAC ATTGTGATGACCCAGTCC],

IF-Humanizado I-3466-LCK-R (SEQ ID N° 22)

[5'-TGCAGCCACCGTACGCTTGATCTCCACCTTGGTGCC],

para a clonagem da região variável de cadeia pesada:

IF-Humanizado I-3466-HCG1-F (SEQ ID N° 23)

[5'-ACAGGTGTCCACTCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT],

IF-Humanizado I-3466-HCG1-R (SEQ ID N° 24)

[5'-GCC CTTGGTGGATGCGGAGGAGACTGTCACCAGGGT],

Os vetores foram linearizados com a digestão de Bmtl e Fspl. A reação de infusão foi realizada de acordo com o protocolo recomendado do fornecedor. Os clones resultantes foram confirmados pelo seqüenciamento. As células de rim embriônicas humanas 293 foram transfectadas usando-se DNAs de plasmídeo de cadeia leve e pesada. O meio contendo anticorpo secretado foi coletado e concentrado. O anticorpo foi purificado por afinidade usando-se a coluna A/G de proteína e concentrado e submetido à diálise em PBS. A concentração de proteína foi determinada por OD280 nm e a pureza foi analisada por SDS-PAGE redutor e não redutor (Figura 9).

Exemplo 8: Análise BIACore de anticorpo I-3466 IgGl humanizado Equipamento e materiais

Instrumento BIAcore T100, chips biossensores CM5, tampão de HBS-EP, tampão de acetato (pH 5), tampão de Glicina-HCl (pH 1,5), kit de ligação de amina foram da BlAcore (Upsala, Suécia). O IgG Fc anti- humano foi da Jaekson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Groves USA), o domínio extracelular do receptor do fator I de desenvolvimento semelhante à insulina humana solúvel (hIGF-IR) (ECD) foi da R&D Systems (Minneapolis, USA).

Ensaio Biacore

Todos os experimentos foram realizados a 25°C em uma taxa de fluxo de 40 gl/minuto. Para preparar um ensaio BlAcore (ver Figura 10), um anticorpo IgG-Fc anti-humano (50 μg/ml em tampão de acetato, pH 5) foi imobilizado em um chip sensor de carboximetil dextrano (CM5) usando-se os procedimentos de ligação de amina como descrito pelo fabricante. As unidades de ressonância 11042 e 11111 (RU) de anticorpos anti-IgG Fc foram ligados respectivamente em Flowcells (FC) 1 e 3. O Mabs purificado a ser testado foi diluído em uma concentração de 5 μg/ml em 0,5% de P20, tampão de HBS-EP e injetado em FC3 para atingir de 500 a 1000 RU. O FCl foi usado como a célula de referência. Os sinais específicos correspondem à diferença de sinais obtidos em FC2 versus FCl. O analisado (hIGF-IR solúvel, peso molecular aparente 365 kDa) foi injetado durante 90 segundos em 5 concentrações diferentes (100, 50, 25, 12,5 e 6,25 nM) em 0,5% de P20, tampão de HBS-EP. Estas concentrações foram preparadas a partir da solução de estoque de 0,5% de P20, HBS-EP. A fase de dissociação do analisado foi monitorado por um período de 10 minutos. O tampão de funcionamento também foi injetado sob as mesmas condições como uma referência dupla. Após cada ciclo (injeção de anticorpo + hIGF-IR), ambas as Flowcells foram geradas injetando-se de 20 a 45 μΐ de tampão de Glicina-HCl (pH 1,5). Esta regeneração é suficiente para a eliminação de todos os Mabs e complexos de Mabs/hIGF-IR capturados no chip sensor.

Resultado

A ligação do Mab 1-3466 Humanizado ao analisado hIGF-IR- ECD foi caracterizado pelas taxas de associação e dissociação constantes ka e kd, respectivamente. O equilíbrio da constante de equilíbrio (KD) foi calculado pela taxa entre as taxas de dissociação e de associação constantes. Os resultados são dados na Tabela seguinte 4. O sensorgrama que corresponde às concentrações de analisado diferentes é representado na Figura 11.

Tabela 4

<table>table see original document page 68</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Pierre Fabre Medicament

<120> Novos anticorpos ANTI-IGF-IR e usos destes

<130> D23693

<140> PCT/2006/06454 3

<141> 2006-07-21

<150> FR 05/07829

<151> 2005-07-22

<150> US 60/701,622

<151> 2005-07-22

<160> 24

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 1

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15

Ala <210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 2

Asn Asn Tyr Ile Met Ser 1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 3

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 4

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 5

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr 1 5

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 6

Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro Arg Ala 1 5 10 15

Trp Phe Thr Tyr 20

<210> 7

<211> 112

<212> PRT <213> mus musculus

<400> 7

Asp He Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu A.la Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu T.l.e Lys 100 105 110

<210> 8

<211> 129

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 8

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30

He Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Scr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95

Thr Arg Asn Gin Leu Leu Thr Glv Met lie Asn Pro Leu Thr Thr Pro 100 105 110

Arg Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125

Ala

<210> 9

<2ll> 51

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 9

aaatccagtc agagtctac- cgacagtaga acccgaaaga actacttggc t

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> raus musculus

<400> 10

aataactata tcatgtct

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 11

tgggcatcca ccagggaatc t 21

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 12

accattagtg gtggtggtag ttataccttc tatccagaca gtgtgaaggg a 51

<210> 13 <211> 24

<212> DNA

<213> mus musculus

<4 00> 13

aagcaatctt ataatctgtt cacg 24

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> mus musculus

<4 00> 14

aatcaattac ttactgggat gatcaatccc ctgactacgc ctagagcctg gtttacttac 60

<210> 15

<211> 336

<212> DNA

<213> mus musculus

<4 0 0> 15

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgaactgca aatccagtca gagtctactc gacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300

ttcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336

<210> 16

<211> 387

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 16

gaagtgatgc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctaaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcaat aactatatca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtagtta taccttctat 180 ccagacagtg tgaagggacg attctccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 24 0 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt atttctgtac aaggaatcaa 300 ttacttactg ggatgatcaa tcccctgact acgcctagag cctggtttac ttactggggc 360 caagggactc tggtcactgt ctctgca 387

<210> 17 <211> 112 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Anticorpo humanizado, cadeia leve <4 00> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 18 <211> 129 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Anticorpo humanizado, cadeia pesada

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 35 40 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Thr Arg Asn Gln 100 Leu Leu Thr Gly Arg Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly 115 120

Ser

10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Tyr Thr Phe Tyr 60 Pro Asp Ser Val Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Phe 95 Cys Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro 105 110 Gln Gly Thr Leu Val 125 Thr Val Ser

<210> 19 <211> 336 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Anticorpo humanizado, cadeia leve <400> 19

ttcacctttg gcggcggcac caaggtggag atcaag <210> 20 <211> 387 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Anticorpo humanizado, cadeia pesada <400> 20

ctggctgtct ccctgggcga gcgggccacc 60 gactcccgga cccggaagaa ctacctggcc 120 aagctgctga tctactgggc ctccacccgg 180 tctggctctg gcacagactt caccctgacc 240 gtctactact gcaagcagtc ctacaacctg 300 atcaag 336

ctggcggctc cctgcggctg 60 tgtcctgggt gcggcaggcc 120 gcggctccta caccttctac 180 actccaagaa caccctgtac 240 acttctgcac ccggaaccag 300 cctggttcac ctactggggc 360 387

cagggcaccc tggtgacagt ctcctcc <210> 21 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador IF-Humanized I-3466-LCK-F para amplificação de cadeia leve de anticorpo humanizado 1-3466 <400> 21

acagatgcca gatgcgacat tgtgatgacc cagtcc 36

<210> 22 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador IF-Humanized I-3466-LCK-R para amplificação de cadeia leve de anticorpo humanizado 1-34 66 <400> 22

tgcagccacc gtacgcttga tctccacctt ggtgcc 36

<210> 23 <211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador IF-Humanized I-3466-HCG1-F para amplificação de cadeia pesada de anticorpo humanizado 1-3466

<400> 23

acaggtgtcc actcggaggt gcagctggtg gagtct 36

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador IF-Humanized 1-3466-HCG1-R para amplificação de cadeia pesada de anticorpo humanizado 1-3466

<400> 24

gcccttggtg gatgcggagg agactgtcac cagggt 36

Claims (70)

Μ&

1. Anticorpo isolado, ou um fragmento imunogênico funcional do mesmo, tendo uma afinidade de ligação para o receptor do fator I de crescimento semelhante à insulina (IGF-IR) de humano, caracterizado pelo fato de que na ligação do dito IGF-IR, este inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGFl ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,03 nM e este também inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGF2 ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,1 nM.

2. Anticorpo isolado, ou um fragmento imunogênico funcional do mesmo, tendo uma tirosina quinase do receptor do fator I de crescimento semelhante à insulina (IGF-IR) de humano que inibe a atividade, caracterizado pelo fato de que em que na ligação do dito IGF-IR, este inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGFl ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,03 nM e este também inibe a ligação do parceiro de ligação natural IGF2 ao dito IGF-IR com um IC50 menor do que 0,3 nM, preferivelmente menor do que 0,1 nM.

3. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que este também é capaz de inibir 100% da fosforilação induzida por IGFl e/ou IGF2 da cadeia beta de IGF-IR.

4. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que este não apresenta qualquer atividade agonística intrínseca.

5. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que este é capaz de induzir, usando-se o mesmo método de análise FACS: i) pelo menos 30% da internalização de IGF-IR em células de HT29, e/ou ii) pelo menos 85% da internalização de IGF-IR em células de MCF-7.

6. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que este é capaz de induzir, usando-se o mesmo método de análise FACS: i) pelo menos 50% da degradação de IGF-IR em células de HT29, e/ou ii) pelo menos 65% da degradação de IGF-IR em células de MCF-7.

7. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que este é capaz de inibir a proliferação in vitro induzida tanto por IGFl quanto por IGF2 de células MCF-7 com IC5os pelo menos iguais a 1 nM e preferivelmente pelo menos iguais a 0,7 e 0,5 nM respectivamente para o IGFl e IGF2.

8. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que este compreendem uma cadeia leve que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade CDR escolhida dos CDRs da seqüência SEQ ID N0 1, 3 ou 5 ou pelo menos um CDR cuja seqüência tem pelo menos 80% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 1, 3 ou 5 ou em que este compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos um CDR escolhido dos CDRs da seqüência SEQ ID N0 2, 4 ou 6 ou pelo menos um CDR cuja seqüência tem pelo menos 80% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 2, 4 ou 6.

9. Anticoipo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos dois dos três CDRs ou os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6 ou pelo menos dois de três CDRs ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N0 2, 4 e 6.

10. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que este compreende uma cadeia leve que compreende pelo menos dois dos três CDRs ou os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 1, 3 e 5 ou pelo menos dois de três CDRs ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 1,3 e 5.

11. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que este compreende uma cadeia pesada que compreende os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6, ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N0 2, 4 e 6 e em que estes, além disso compreendem uma cadeia leve que compreende os três CDRs da seqüência SEQ ID N0 1, 3 e 5 ou três CDRs da seqüência respectivamente tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N0 1, 3 e 5.

12. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que este não liga-se de uma maneira significante ao receptor de insulina humano (IR).

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento funcional é escolhido a partir dos fragmentos Fv, Fab, F(ab1)2, Fab', scFv, scFv-Fc e dos anticorpos ou qualquer fragmento cuja vida média deve ser aumentada, tais como fragmentos peguilados.

14. Hibridoma murino, caracterizado pelo fato de que é capaz de secretar um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13.

15. Hibridoma murino de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é depositado no CNCM, Institut Pasteur, Paris, em 23 de junho de 2005 sob o número 1-3466.

16. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é secretado pelo hibridoma como definido na reivindicação 15.

17. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou 16, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende uma cadeia leve da seqüência que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N°7 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N°7 e/ou em que esta compreende uma cadeia pesada da seqüência que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N°8 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N°8.

18. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo quimérico e, além disso, compreende as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao camundongo.

19. Anticorpo quimérico ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a dita espécie heteróloga é o ser humano.

20. Anticorpo quimérico ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 17 a 19, caracterizado pelo fato de que as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano são, respectivamente, a região capa e gama-1, gama-2 ou gama-4.

21. Anticorpo humanizado ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que este compreendem uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N017 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID N017 e/ou em que esta compreende uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N018 ou uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N018.

22. Anticorpo humanizado ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que este compreende uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID N°17 e em que este compreende uma cadeia pesada da seqüência que compreende a seqüência de aminoácido SEQID N018.

23. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que este é escolhido a partir dos seguintes ácidos nucleicos: a) um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 e de 16 a 22; b) um ácido nucleico complementar de um ácido nucleico tal como definido em a); c) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridizar sob as condições de estringência grandes com pelo menos um dos CDRs da seqüência SEQ ID N°9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ou com uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ IDN^ 10, 11, 12, 13 ou 14; d) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridizar sob as condições de estringência grande com pelo menos a cadeia leve da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N015 e/ou a cadeia pesada da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N016 ou com uma seqüência tendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a seqüência SEQ ID Nº15 e/ou 16 e e) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capazes de hibridizar sob as condições de estringência grande com pelo menos a cadeia leve da seqüência de ácido nucleico SEQID Nº19 e/ou a cadeia pesada da seqüência de ácido nucleico SEQ ID N°20 ou com uma seqüência tendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ótimo com a seqüência SEQID N019 e/ou 20.

24. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 23.

25. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor como definido na reivindicação 24.

26. Animal transgênico, com a exceção do ser humano, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma célula transformada por um vetor como definido na reivindicação 25.

27. Processo para a produção de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 e 16 a 22, caracterizado pelo fato de que este compreende os seguintes estágios: a) cultura em um meio e condições de cultura apropriadas de 20 uma célula como definida na reivindicação 25 e b) recuperação dos ditos anticorpos ou um de seus fragmentos funcionais, desta maneira produzidos começando do meio de cultura ou ditas células cultivadas.

28. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que é capaz de ser obtido por um processo como definido na reivindicação 27.

29. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com as reivindicações de 1 a 13 e de 16 a 22 e 28, caracterizado pelo fato de que este é, além disso, capaz de ligar-se especificamente a um receptor humano da família da tirosina quinase e/ou capaz de inibir a atividade de tirosina de tais receptores.

30. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que este consiste de um anticorpo bi-específico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente à ligação de EGF no receptor do fator de desenvolvimento epidérmico humano (EGFR) e/ou inibição da atividade de tirosina do dito EGFR.

31. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o dito segundo motivo de anti-EGFR é emitido do anticorpo monoclonal humano 225, seu derivado quimérico C225 ou qualquer anticorpo humanizado derivado de seu anticorpo 225.

32. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que este consiste de um anticorpo bi-específico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente à atividade modulada pelo receptor de HER2/neu e/ou inibição da atividade de tirosina do dito HER2/neu.

33. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o dito segundo motivo anti-HER2/neu é emitido do anticorpo monoclonal humano 4D5 ou 2C4 ou do anticorpo humanizado Trastuzumab ou Pertizumab.

34. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que este consiste de um anticorpo específico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente à ligação do Fator de Desenvolvimento de Hepatócito (HGF) no receptor cMET e/ou inibição da atividade de tirosina do dito receptor cMET.

35. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que este consiste de um anticorpo biespecífico que compreende um segundo motivo capaz de ligar-se especificamente a ligação da Proteína Estimuladora de Macrófago (MSP) no receptor RON e/ou inibição da atividade de tirosina do dito RON.

36. Anticorpo ou um de seus fragmentos íiincionais de acordo com as reivindicações de 1 a 13, de 16 a 22 e de 28 a 35, caracterizado pelo fato de que este é capaz de interagir com qualquer tipo de receptor sendo implicado no desenvolvimento de tumores, tais como, por exemplo, VEGFR, FGF (Fator de Desenvolvimento de Fibroblasto) ou CXCR4 ou 2 (tipo de Receptor de Quimiocina 4 ou 2).

37. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 36, caracterizado pelo fato de que o dito segundo motivo é selecionado dos fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', Fab1PEG, scFv, scFv-Fc e os diacorpos ou qualquer forma cuja vida média deve ser aumentada.

38. Anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, de 16 a 22 e de 28 a 37, caracterizado pelo fato de que é como um medicamento.

39. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende por meio do princípio ativo, um composto que consiste de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 e 28 a 38.

40. Composição de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que esta compreende, pelo menos um segundo composto escolhido dos compostos capazes de ligar-se especificamente à atividade de tirosina de IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET e/ou RON.

41. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o dito segundo composto é escolhido a partir dos anticorpos anti-EGFR, -IGF-IR, -HER2/neu, -cMET e/ou - RON isolados ou seus fragmentos funcionais, capazes de inibir a atividade indutora de disseminação proliferativa e/ou antiapoptótica e/ou angiogênica e/ou metastática mediada pelo(s) dito(s) receptor(es).

42. Composição de acordo com as reivindicações de 39 a 41, caracterizada pelo fato de que esta compreende, como produto de combinação para um uso simultâneo, separado ou seqüencial, pelo menos um inibidor da atividade de tirosina do IR, IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET e/ou RON.

43. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o dito inibidor da atividade de tirosina é selecionado do grupo que consiste de agentes naturais derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo ou pirrolopiridopirimidinas ou ainda quinazilinas.

44. Composição de acordo com as reivindicações de 39 a 43, caracterizada pelo fato de que esta compreende, além disso, como um produto de combinação para o uso simultâneo, separado ou seqüencial, um agente citotóxico/citostático.

45. Composição de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico/citostático é escolhido a partir dos agentes que interagem com o DNA, os antimetabólitos, os inibidores de topoisomerase I ou II ou o inibidor de fuso ou agentes estabilizantes ou ainda qualquer agente capaz de ser usado na quimioterapia.

46. Composição de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico/citostático é ligado quimicamente a pelo menos um dos elementos da dita composição para o uso simultâneo.

47. Composição de acordo com as reivindicações de 44 a 46, caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico/citostático é escolhido a partir do inibidor de fuso ou agentes estabilizadores, preferivelmente vinorelbina, vinflunina ou vincristina.

48. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 39 a 47, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, dos ditos anticorpos ou um de seus fragmentos funcionais, é conjugado com uma toxina celular e/ou um radioelemento.

49. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 39 a 48, caracterizada pelo fato de que é como um medicamento.

50. Uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 e 28 a 38 e/ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 39 a 49, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de uma doença conectada com uma sobrexpressão e/ou uma ativação anormal do IGF-IR e/ou conectado com uma hiperativação do trajeto de transdução do sinal mediado pela interação de IGFl ou IGF2 com IGF-IR.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a administração do dito medicamento não induz ou apenas induz levemente a efeitos secundários conectados com a inibição do receptor de insulina IR.

52. Uso de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento pretendido para inibir a transformação de células normais em células com caráter tumoral e/ou o desenvolvimento e/ou a proliferação de células tumorais, preferivelmente células dependentes de IGF, pelo menos IGF2.

53. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 52, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de câncer.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é um câncer escolhido do câncer de próstata, osteosarcomas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, mieloma múltiplo, câncer de ovário ou câncer de cólon.

55. Uso de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é câncer de cólon.

56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 52, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou para o tratamento de psoríase ou aterosclerose.

57. Método de diagnóstico in vitro da condição patológica distinguida pela expressão aberrante de IGF-IR com relação ao normal, caracterizado pelo fato de que compreende contactar uma amostra biológica suspeita de conter IGF-IR, com o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 e 28 a 38, sob as condições que favorecem a formação de um complexo de IGF-IR/anticorpo e detectar o dito complexo indicando a presença do dito IGF-IR na dita amostra.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é detectavelmente rotulado.

59. Método de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que a expressão aberrante de IGF-IR é uma sobrexpressão de IGF-IR.

60. Método de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que a expressão aberrante de IGF-IR é uma subexpressão de IGF-IR.

61. Método de diagnóstico para prognosticar um potencial oncogênico de uma amostra de células da próstata, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer uma amostra de pulmão humano ou tecido de mama e b) determinar, na amostra, a presença de IGF-IR, a dita etapa compreendendo contactar a dita amostra com o anticorpo como definido em uma das reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 ou 28 a 38 sob as condições que favorecem a formação de um complexo de IGF-IR/anticorpo, em que a presença do dito complexo indica o potencial oncogênico das ditas células no dito tecido.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a presença do dito complexo indica que o paciente está em risco de desenvolver ou início de um distúrbio patológico caracterizado pela sobrexpressão do dito IGF-IR.

63. Método para dar seguimento ao progresso de um regime terapêutico projetado para aliviar um distúrbio patológico distinguido por uma expressão anormal de IGF-IR, caracterizado pelo fato de que compreende: a) ensaiar uma amostra de um paciente para a determinação do nível de IGF-IR em um primeiro ponto de tempo; b) ensaiar a dita amostra em um segundo ponto de tempo e (c) comparar o dito nível no dito segundo ponto de tempo ao nível determinado em (a) como uma determinação do efeito do dito regime terapêutico em que uma diminuição no nível de IGF-IR na dita amostra é determinante da regressão do dito distúrbio patológico no dito paciente ou o aumento no nível de IGF-IR é determinante da progressão do dito distúrbio patológico no dito paciente.

64. Kit ou conjunto para a realização de um método de diagnóstico de doença induzida por uma sobrexpressão ou uma subexpressão do IGF-IR ou para a realização de um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma sobrexpressão ou de uma subexpressão do IGF-IR em uma amostra biológica, preferivelmente uma sobrexpressão do dito receptor, caracterizado pelo fato de que o dito kit ou conjunto compreende os seguintes elementos: a) um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações delal3,16a22e28a38; b) opcionalmente, os reagentes para a formação do meio favorável para a reação imunológica; c) opcionalmente, os reagentes permitem a demonstração de complexos de IGF-IR/anticorpo produzidos pela reação imunológica.

65. Uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 e 28 a38, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento pretendido para o alvejamento específico de um composto biologicamente ativo às células que expressam ou que sobrexpressam o IGF-IR.

66. Método para modular a atividade de IGF-IR em células de mamíferos responsivas ao IGF-IR, caracterizado pelo fato de que compreende: contactar as células com um anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 e 28 a 38 sob as condições suficientes para modular a atividade do dito IGF-IR com relação às células não responsivas ao IGF-IR.

67. Método para diminuir a atividade de IGF-IR em células de mamíferos responsivas ao IGF-IR com relação às células normais, caracterizado pelo fato de que compreende: contactar as células com um anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 e 28 a 38.

68. Método para identificar um modulador de IGF-IR, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contactar o IGF-IR com o anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a 13,16 a 22 e 28 a 38; b) contactar o complexo de (a) com uma biblioteca de composto; c) identificar um composto que interrompe o complexo de (a); e d) determinar como o composto apresenta atividade agonista ou antagonista no IGF-IR, em que esta atividade indica a identificação de um modulador de IGF-IR.

69. Método para detectar um parceiro de ligação para o anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 ou 28 a 38 na amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: a) incubar o anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a 13, 16 a 22 ou 28 a 38 com uma amostra biológica obtida a partir de um paciente que se apresenta com um distúrbio proliferativo celular distinguido pelo nível anormal de expressão e/ou ativação de IGF-IR humano sob as condições suficientes para permitir a ligação específica do anticorpo a seu parceiro de ligação e b) detectar a ligação específica, em que a ligação específica indica a presença de um parceiro de ligação na amostra.

70. Método para purificar um IGF-IR a partir de uma amostra, caracterizado pelo fato de que: a) incubar o anticorpo como definido na reivindicação 1 a 13, 16 a 22 ou 28 a 38 com uma amostra sob as condições para permitir a ligação específica do anticorpo e do receptor e b) separar o anticorpo da amostra e obter o receptor purificado.