KR20080032117A

KR20080032117A - 신규한 항－ｉｇｆ－ｉｒ 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20080032117A
Application number: KR1020087001940A
Authority: KR
Inventors: 릴리앙 고에뜨쉬; 나딸리 꼴바이아
Original assignee: 피에르 파브르 메디카먼트
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2008-04-14
Also published as: EP1907426B1; AR054175A1; US20090265797A1; CN101238149B; BRPI0613642A2; RU2008106751A; AU2006274086B2; GT200600324A; CA2616099C; TW200740846A; NZ565248A; WO2007012614A2; HK1116201A1; FR2888850A1; JP5185817B2; US20130125252A1; US8945871B2; WO2007012614A3; EP2380913A1; EP1907426A2

Abstract

본 발명은 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 IGF-IR을 과발현하고, IGF1 및/또는 IGF2에 의해 촉진되는 암, 또는 상기 수용체의 과발현과 관련된 모든 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 제제로서의 이들 항체의 용도 뿐만 아니라 IGF-IR 및/또는 IGF-I/인슐린 하이브리드 수용체의 과발현과 관련된 질환을 진단하기 위한 방법 또는 킷트를 포함한다.

Description

신규한 항－ＩＧＦ－ＩＲ 항체 및 이의 용도{Novel Anti-IGF-IR Antibodies and Uses Thereof}

본 발명은 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)에 특이적으로 결합할 수 있고/또는 상기 IGF-IR, 특히 생쥐, 키메라 및 인간화 기원의 단일클론 항체 뿐만 아니라 이들 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 신규한 항체에 관한 것이다. 특히, IGF-IR에 대한 리간드 IGF1의 결합을 효과적으로 저해할 수 있을 뿐만 아니라 다른 리간드, 즉, IGF2의 상기 동일한 수용체로의 결합을 효과적으로 저해할 수 있는 신규한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 IGF-IR을 과발현하고, IGF1 및/또는 IGF2에 의해 촉진되는 암, 또는 상기 수용체의 과발현과 관련된 모든 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 제제로서의 이들 항체의 용도 뿐만 아니라 IGF-IR 및/또는 IGF-I/인슐린 혼성 수용체의 과발현과 관련된 질환을 진단하기 위한 방법 또는 킷트를 포함한다. 최종적으로, 본 발명은 이러한 항체를 혼합하여 포함하는 산물 및/또는 조성물을 포함하며, 예를 들어 항-EGFR 항체 및/또는 조성물 및/또는 항-암 제제 또는 톡신과 결합한 제제를 포함하며, 이러한 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 이의 용도를 포함한다.

IGF-IR이라 일컫어지는 인슐린-유사 성장 인자 I는 인슐린 수용체 IR과 70% 상동성을 가지며 티로신 키나아제 활성을 갖는 수용체이다. IGF-IR은 분자량이 약 350,000인 당단백질이다. 이는 헤테로-테트라머 수용체로서 이의 절반-디설파이드 브릿지에 의해 연결됨-은 세포외 α-서브유니트와 막통과 β-서브유니트로 구성되어 있다. IGF-IR은 IGF1 및 IGF2에 매우 높은 친화도(Kd #1 nM)로 결합하지만, 인슐린에는 100 내지 1000배 낮은 친화도로 동일하게 결합할 수 있다. 반대로, IR은 인슐린에 매우 높은 친화도로 결합하지만, IGF는 인슐린 수용체에 100배 낮은 친화도로만 결합한다. IGF-IR 및 IR의 티로신 키나아제 도메인은 매우 높은 서열 상동성을 가지지만, 상동성이 약한 부위는 α-서브유니트 상에 위치한 시스테인-풍부 부위 및 β-서브유니트의 C-말단 부분과 각각 관련이 있다. α-서브유니트에서 관찰되는 서열의 차이는 리간드의 결합 부위에 위치하며, IGFs 및 인슐린에 대한 IGF-IR 및 IR 각각의 상대적인 친화도의 기원에 있다. β-서브유니트의 C-말단 부분에서의 차이는 두개의 수용체의 신호전달 과정에서의 차이를 유발한다; IGF-IR은 유사분열, 분화 및 항아폽토시스을 매개하지만, IR의 활성은 물질대사 과정의 레벨에서의 영향에 실질적으로 관련이 있다(Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res. 253:1-6, 1999).

세포질의 티로신 키나아제 단백질은 수용체의 세포외 도메인에 리간드가 결합함으로써 활성화된다. 키나아제의 활성화는 IRS-1, IRS-2, Shc 및 Grb10을 포함하는 다른 세포내 기질의 자극과 관련이 있다(Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). IGF-IR의 두개의 주요한 기질은 IRS 및 Shc이고, 이는 다운스트림의 수많은 작용기의 활성화에 의해 매개되며, 성장 및 분화 효 과의 대부분은 IGF가 이 수용체에 부착하는 것과 관련이 있다. 기질의 이용가능성은 결론적으로는 IGF-IR의 활성과 연관된 최종의 생물학적 효과를 말해준다. IRS-1이 우세하면, 세포는 증식하고 형질전환되는 경향이 있다. Shc가 우세하면, 세포는 분화하는 경향이 있다(Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274:12423-12430, 1999). 아폽토시스에 대항한 방어의 효과와 주로 관련이 있는 루트는 포스파티딜-이노시톨 3-키나아제(PI 3-키나아제) 루트인 것으로 간주된다(Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125;:166-173, 1999).

암형성에서의 IGF 시스템의 작용은 최근 10년의 꾸준한 연구의 산물이 되었다. 이러한 관심에 뒤따라 유사분열성 및 항아폽토시스 특성과 같은 사실이 추가로 발견되었으며, IGF-IR은 형질전환된 표현형의 확립 및 유지에 필요한 것으로 간주된다. 사실, 다양한 종류의 세포에서, IGF-IR의 과발현 또는 구성요소 활성은 우태아 혈청이 없는 배지에서 지지체와는 독립적으로 세포의 성장을 유도하고, 누드 마우스에서 종양의 형성을 유도하는 것으로 잘 확립되었다. 이것 자체는 특별한 특징이 아닌데, 그 이유는 과발현된 유전자의 매우 다양한 산물이 수많은 성장 인자 수용체를 포함하는 세포를 형질전환시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 결정적인 발견은, 형질전환에서 IGF-IR에 의해 역할을 하는 주요한 기능은 R-세포-여기서는 IGF-IR을 코딩하는 유전자가 불활성화됨-가 소 파필로마 바이러스의 E5 단백질과 같이 세포를 형질전환할 수 있고, EGFR 또는 PDGFR, SV40의 T 항원, 활성화된 ras 또는 이들 후자 인자 2개의 조합을 과발현할 수 있는 다른 제제에 의해 형질전 환에 대해 저항할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11217-11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69:5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164:214-221, 1995).

IGF-IR은 다양한 종류의 종양 및 종양주에서 발현되며, IGF는 IGF-IR에 부착하면서 종양 성장을 증식시킨다. 종양형성에서의 IGF-IR의 역할에 찬성하는 다른 주장은, 수용체에 직접 대항하는 생쥐 단일클론 항체 또는 IGF-IR의 음성 우성을 이용한 연구로부터 비롯된다. 실제로, IGF-IR에 직접 대항하는 생쥐 단일클론 항체는 배양되는 수많은 세포주의 증식을 저해하고 생체내에서 종양 세포의 성장을 저해한다(Arteaga C. eta l., Cancer Res., 49:6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia F. et al., J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996; Scotlandi K. et al., Cancer Res., 58:4127-4131, 1998). 마찬가지로 지앙 등(Jiang et al)의 연구에서도 IGF-IR의 음성 우성이 종양의 증식을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Oncogene, 18:6071-6077, 1999)

IGF-IR에 특이적으로 결합할 수 있는 항체들이 기술되었으며, 여러개의 특허도 출원되었다. 일례로서, 본 출원인에 의해 출원된 특허출원 WO 03/059951을 언급할 수 있으며, 여기에는, 소위 7C10이라고 일컫어지는 IGF-IR에 결합할 수 있는 단일클론 항체가 기술되어 있다. 다른 특허 출원으로 WO 02/053596(PFIZER INC 및

ABGENIX INC), WO 03/100008(SCHERING CORPORATION) 또는 WO 03/106621(IMMUOGEN IC)가 언급될 수 있다. 이 모든 특허들은 IGF-IR에 특이적으로 결합할 수 있거나 이의 활성을 저해할 수 있는 항체를 청구한다.

비록 이 특허가 이러한 항체들 각각에 대한 특징의 증거로 간주되지만, 이들 특허 명세서의 어느 곳에서도 이러한 항체들이 자연의 리간드 모두가 IGF-IR에 결합하는 것, 보다 구체적으로는 IGF2가 IGF-IR에 결합하는 것을 효과적으로 저해할 수 있음을 명확하게 기술하지 않고 있다. IGF1 및 IGF2 유도된 증식의 저해와 같은 시험관내 데이타는 이들 특허에 기술되었으며, 기술된 항체가 IGF1 및 IGF-유도된 증식을 효과적으로 저해할 수 있음을 증명하였다. 그러나, IGF-IR을 부분적으로 하향-조절하는 것을 포함한 특성을 나타내는 기술된 항체의 주요한 부분으로서, 항증식성 특징이 IGF-IR로부터 IGF1 및 IGF2 모두를 대체하는 것과 직접적으로 연관이 되어있다는 증거는 없다.

실제로, 예를들어 WO 03/106621에 기재된 데이타는 오직 IGF1을 다루고 있으며, IGF-IR에 IGF2가 결합하는 것을 실제적으로 저해한다는 것에 대해서는 어떠한 사실도 없다(참고, 실시예 C, 33-35페이지 및 도 3, 및 실시예 D, 35-37 페이지 및 도 4-6).

이와 유사한 관찰내용은 WO 02/053596에서 볼 수 있다(참고, 실시예 IV, 78-79페이지 및 도 3, 및 실시예 VII, 82페이지 및 도 4).

인간 IGF-IR(hIGF-IR)에 직접적으로 대항하는 단일클론 또는 재조합 항체의 발견을 기술하는 최근에 확인된 모든 특허 출원 중에서, 오직 두개(WO 2004/087756 및 WO 2005/005635)만이 항체, 즉 AK1a 및 AK18 각각이 [¹²⁵I]IGF2가 hIGF-IR에 결합하는 것을 저해함을 실제적으로 보여준다.

두가지 케이스와 동일한 실험적 방법은 인간 직장결장 샘암종(HT29) 완전 세포에 대한 경쟁 결합을 기초로 한다. 비록 기재된 방법이, 자연의 hIGF-IR 리간드(IGF1 및 IGF2)에 의한 경쟁과 같은 어떠한 양성 대조군도 존재하지 않는 것으로 들리지만, 의심되는 경쟁 결합 상에서 데이타를 만든다. 반면, 높은 농도의 항체에서도, 비완전한 경쟁만이 나타났으며(AK1a 및 AK18 항체 모두에 대한 [¹²⁵I]IGF2 결합을 최대 80% 저해), 인간에서 치료학적 효능을 진보시키기 위해 필요한 효능있는 항체를 더 많이 개발하게 한다. AK1a 및 AK18에 의한 IGF2-매개 반응의 추정의 저해에 관한 마지막 쟁점 포인트는, hIGF-IR에 의해 매개되는 기능적 IGF2-촉진된 신호의 저해를 보여주는 예가 없다는 것이다. 대신, IGF2 결합의 경쟁이 일어난다고 하더라도, 이는 다운스트림 hIGF-IR 신호의 부수적인 저해와 연관이 있어야 하며, 이러한 증거는 항체의 기능적 역할에 대한 물리학적 증거를 제공하기 위해 실험으로 확인되어야 한다.

본 발명의 목적은 사용가능한 생쥐 단일클론 항체, 바람직하게는 큰 친화도로 IGF-IR을 특이적으로 인식할 수 있으며, IGF1이 IGF-IR에 결합하는 것을 저해할 수 있을 뿐만 아니라 IGF2가 IGF-IR에 결합하는 것을 저해할 수 있는, 키메라 또는 인간화 항체를 이용하는 것이다. 이항체는 IR과 아주 미약하게 결합하거나 결합하지 않을 것이다. 이 부착은 IGF1/IGF-IR 및 IGF2/IGF-IR 상호작용 동안 활성화된 신호 전달 과정과 이론적으로 결합하여, IGF-IR을 과발현하는 세포주의 시험관내 성장을 저해할 수 있을 것이다. 이 항체는 에스트로겐-의존형 유방암 및 전립선암을 포함하는, IGF-IR을 발현하는 모든 종양 타입 상에서 생체내에서 활성을 띌 수 있을 것이나, 항-IGF-IR 단일클론 항체(이하 MAb 또는 MAB라 일컫어짐)에 대한 경우에서는 그렇지 않다. 효과면에서, IGF-IR의 도메인으로 일컫어지는 αIR3은 에스트로겐-의존성 유방암(MCF-7)의 성장을 시험관 내에서 전체적으로 저해하지만, 이에 상응하는 모델의 생체내에서는 효과가 없다(Arteaga C. et al., J. Clin. Invest. 84:1418-1423, 1989). 유사하게는, 생쥐 단일클론 1H7로부터 유래된 scFv-Fc 단편은 유방암 MCF-7 상에서만 미약하게 활성을 띄며, 안드로겐-의존성 전립선암 상에서는 모두 불활성이다(Li S. L. et al., Cancer Immunol. Immunother., 49:243-252, 2000).

놀랍게도, 본 발명자들은 IGF-IR을 인식하며 상기에 언급된 모든 조건-즉 말하자면 인슐린 상의 수용체를 인식하지 않고, IGF1 및 특히 IGF2 유도된 증식을 시험관 내에서 차단하지만, 골육종 및 전립선암 중에서 IGF-IR을 발현하는 다른 종양의 성장을 생체내에서 저해하는 조건-과 상응하는, I-3466으로 기재된 생쥐 단일클론 항체를 생산하였다. 게다가, 이러한 항체가 상기 MCF-7 및 HT29 세포 상에서 IGF-IR의 베타 체인의 IGF1- 및/또는 IGF2-유도된 티로신 인산화를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 항체가 상기 수용체의 내면화를 유도하며, 세포 표면 상의 수용체의 빠른 순환을 가능하게 하는 자연의 리간드에서 일반적으로 관찰되는 것과 반대로 분해되는 특성을 가짐을 밝혔다. 이러한 항체들은 이의 펩타이드 및 핵산 서열, 특히 IGF-IR에 대한 이의 상보성 결정 부위(CDR) 서열에 의해 특성화될 수 있다.

따라서, 본 발명의 첫번째 구현예에 따르면, 본 발명의 주제는 분리된 항체, 또는 이의 기능적 단편이며, 상기 항체 또는 이의 단편 중의 하나는 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고/또는 상기 IGF-IR 수용체의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있으며, 이의 첫번째 리간드 IGF1의 자연의 결합력을 0.3nM 미만의 IC₅₀으로, 바람직하게는 0.03nM 미만으로 저해할 수 있으며, 이의 두번째 리간드 IGF2의 자연의 결합력을 0.3 nM 미만의 IC₅₀으로, 바람직하게는 0.1nM 미만으로 저해할 수 있는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)에 대해 결합 친화도를 가진 분리된 항체, 또는 이의 기능적 면역 단편에 관한 것이며, 상기 IGF-IR에 결합하는 동안, 상기 IGF-IR에 대한 자연의 결합 파트너 IGF1의 결합을 0.3nM 미만의 IC₅₀으로, 바람직하게는 0.03nM 미만으로 저해하고, 또한 상기 IGF-IR에 대한 자연의 결합 파트너 IGF2의 결합을 0.3nM 미만의 IC₅₀으로, 바람직하게는 0.1nM 미만으로 저해하는 것을 특징으로 한다.

더불어, 본 발명은 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)의 티로신 키나아제의 저해 활성을 가진, 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편에 관한 것이며, 상기 IGF-IR에 결합하는 동안, 상기 IGF-IR에 대한 자연의 결합 파트너 IGF1의 결합을 0.3nM 미만의 IC₅₀으로, 바람직하게는 0.03nM 미만으로 저해하고, 또한 상기 IGF-IR에 대한 자연의 결합 파트너 IGF2의 결합을 0.3nM 미만의 IC₅₀으로, 바람직하게는 0.1nM 미만으로 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 출원에서, IC₅₀은 실시예 2에서 설명된 바와 같이 그래프적으로 간주된다.

종래기술 상에서 언급된 것과 관련하여, 로슈사의 항체 레퍼런스 18(WO 2004/087756 및 WO 2005/005635)은 IGF1 및 IGF2 모두에 대해 평균 IC₅₀이 약 0.3nM이며(참고, WO 2005/005635의 실시예 6), 즉 항체 I-3466(참고, 실시예 2)에 대해 얻어진 IC₅₀보다 훨씬 크다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "-에 결합하는"과 "-에 부착하는"은 동일한 의미이며, 서로 혼용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 항체는 IGF-I/인슐린 하이브리드 수용체에 결합할 수 있다.

실제적으로, IGF-IR은 두개의 이소폼(isoform) A 및 B 하에서 존재하는 인슐린 수용체(IR)과 높은 상동성을 보인다.

IR, 이소폼 A 및 B의 서열은 NCBI 유전자 은행에 각각 참조번호 X02160 및 M10051로 등록되어 있다. IR과 관련된 다른 데이타들은 무제한으로 본원에 참고문헌으로 삽입된다(Vinten et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:249-252; Belfiore et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, 277:39684-39695; Dumesic et al., 2004, The Journal of Endocrinology & Metabolism, 89(7):3561-3566).

IGF-IR 및 IR은 디설파이드 결합에 의해 연결되는 두개의 세포외 α-서브유니트 및 두개의 막통과 β-서브유니트로 이루어진 테트라머 당단백질이다. 리간드-결합 위치를 포함하는 각 α-서브유니트는 약 130- 내지 135-kDa이지만, 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 각 β-서브유니트는 약 90- 내지 95-kDa이다. 이 수용체는 모든 아미노산 서열과 50% 이상의 유사성을 가지며, 티로신 키나아제 도메인과는 84%의 유사성을 가진다. 리간드 결합후에, 인산화된 수용체가 모이고 인슐린 수용체 기질-1 단백질 패밀리(IRS1), Gab1 및 Shc(Avruch, 1998, Mol. Cell. Biochem., 182, 31-48; Roth et al., 1988, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 53, 537-543; White, 1998, Mol. Cell. Biochem. 182, 3-11; Laviola et al., 1997, J. Clin. Invest., 99, 830-837; Cheatham et al., 1995, Endocr. Rev., 16, 117-142)를 포함하는 인산화 도킹 단백질은 다른 세포내 매개체의 활성화를 유발한다. 비록 IR 및 IGF-IR 모두는 주요한 신호전달 과정을 유사하게 활성화시키지만, 특정한 도킹 단백질 및 수용체 두개간의 세포내 매개체의 모임에 있어서는 차이가 존재한다(Sasaoka et al., 1996, Endocrinology, 137, 4427-4434; Nakaeet al., 2001, Endocr. Rev., 22, 818-835; Dupont and Le Roith, 2001, Horm Res. 55, Supl. 2, 22-26; Koval et al, 1998, Biochem. J., 330, 923-932). 이러한 차이는 IR 활성화에 의해 유도되는 우세한 물질대사 효과 및 IGF-IR 활성화에 의해 유도되는 우세한 유사분열성, 형질전환성 및 항-아폽토시스 효과에 대한 기초가 된다(De Meyts et al., 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci., 766, 388-401; Singh et al., 2000; Prisco et al., 1999, Horm. Metab. Res., 31, 80-89; Kido et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 972-979). 인슐린은 IR에 높은 친화도로 결합하지만(IGF-IR에 비해 100배 더 높음), 인슐린-유사 성장 인자(IGF1 및 IGF2)은 IR에 비해 IGF-IR에 100배 더 높은 친화도로 결합한다.

인간 IR은 두개의 이소폼, IR-A 및 IR-B로 존재하며, 이는 IR α-서브유니트의 카르복시-말단에 있는 작은 엑손(엑손 11)에 의해 인코딩된 12개의 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않는 IR 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다. 상대적으로 많은 IR 이소폼은 조직 특이적 인자 및 알려져 있지 않은 인자에 의해 조절된다(Moller et al., 1989, Mol. Endocrinol., 3, 1263-1269; Mosthaf et al., 1990, EMBO J., 9, 2409-2413). IR-B는 정상 성인 조직(지방 조직, 간 및 근육)-이는 인슐린의 물질대사 작용을 하기 위한 주요한 표적 조직임-에 있는 우성의 IR 이소폼이다(Moller et al., 1989; Mosthaf et al., 1990). IR-A는 태아 조직에 있는 우성의 이소폼이며 IGF2에 대해 반응하여 태아 성장을 유도하는데(Frasca et al., 1999, Mol. Cell. Biol., 19, 3278-3288), 이는 형질전환 생쥐에서 수행된 유전학 연구에 의해서도 제시된다(Dechiara et al., 1990, Nature 345, 78-80; Louvi et al., 1997, Dev. Biol. 189, 33-48). 더불어, 세포가 형질전환하고 악성이 되면, 탈분화는 종종 상대적으로 과량으로 증가된 IR-A와 관련이 있다(Pandini et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No 42, pp39683-39695).

상동성이 높아지면, 인슐린 및 IGF-I 절반-수용체(한개의 α- 및 β-서브유니트로 구성)은 헤테로머화될 수 있으며, 인슐린/IGF-I 하이브리드 수용체(Hybrid-R)의 형성을 유도한다(Soos et al., 1990, Biochem J., 270, 383-390; Kasuya et al., 1993, Biochemistry 32, 13531-13536; Seely et al., 1995, Endocrinology 136, 1635-1641; Bailyes et al., 1997, Biochem J., 327, 209-215).

IR 이소폼 두개는 모두 IGF-IR과 하이브리드를 형성할 수 있다. 그러나, 하이브리드-R은 다른 기능적 특징을 가진다. 하이브리드-RsB는 IGF1에 대해, 특히 IGF2에 대해 감소된 친화도를 가진다. 반대로, 하이브리드-RsA는 IGF1에 대해 높은 친화도를 갖지만 IGF2 및 인슐린에는 생체 농도 범위에서 결합한다. 하이브리드-RsA의 발현은 하기 두개의 매커니즘에 의해 IGF 시스템을 상향-조절한다: i) IGF1 및 IGF2 둘다(이는 하이브리드-RsB와는 발생하지 않음)와 결합(높은 친화도로) 및 활성화, ii) 인슐린 결합후에 IGF-IR 과정의 활성화. 하이브리드-RsA에 대한 인슐린의 결합은 IGF-IR β-서브유니트를 인산화하고, IGF-IR-특이적 기질(CrkII)를 활성화시켜, 하이브리드-RsA는 인슐린을 IGF-IR 신호전달로 쉬프트시킨다(Pandini et al., 2002).

간, 비장 또는 태반과 같은 여러 조직에는, 하이브리드-R이 IGF-IR에 비해 훨씬 더 많이 존재한다(Bailyes et al., 1997). 종양 조직이 과발현되거나, 비정상적인 활성화가 유지됨에 따라, IGF-IR과 IR-A 모두(Frasca et al., 1999; Sciacca et al., 1999, Oncogene 18, 2471-2479; Vella et al., 2001, Mol. Pathol., 54, 121-124), 하이브리드-RsA는 IGF1 및/또는 IGF2 뿐만 아니라 생리학적 농도의 인슐린에 의해 촉진되고난 뒤에 타입 IGF-IR 신호전달에 의해 반응할 수있는 종양 세포에 대해 선택적인 성장의 이점을 제공하는, 갑상샘암 및 유방암을 포함하는 다양한 인간 종양에서 과발현될 수 있다(Bailyes et al., 1997; Pandini et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5, 1935-1944; Belfiore et al., 1999, Biochimie(Paris) 81, 403-407; Frasca et al., 1999; Sciacca et al., 1999; Vella et al., 2001).

본 발명에 따르면, 항체는 하이브리드-R에 결합할 수 있으며, 필요하다면 리간드가 인슐린, 하이브리드-R의 IGF1 및/또는 IGF-2에 자연적으로 부착하는 것을 저해할 수 있고 및/또는 상기 하이브리드-R의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 목적은 IGF-IR 베타-체인의 IGF1 및/또는 IGF2 유도된 인산화를 100% 저해할 수 있는(바람직하게는 HT29 세포상에서) 것을 특징으로 하는 항체, 또는 이의 기능적 단편을 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 기능적 단편은 모든 아고니스트성 내재 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편은, 동일한 FACS 분석법을 이용하였을때, 다음의 특징을 포함하는 것을 특징으로 한다:

i) HT29 세포상에서 IGF-IR의 최소한 30%가 세포내이동, 및/또는

ii) MCF-7 세포상에서 IGF-IR의 최소한 85%가 세포내이동.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편의 특징은, 동일한 FACS 분석법을 이용했을때, 다음의 특징을 포함한다:

i) HT29 세포상에서 IGF-IR의 최소한 50%가 분해, 및/또는

ii) MCF-7 세포상에서 IGF-IR의 최소한 65%가 분해.

다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편은 IGF1 및 IGF-2 모두에 의해 유도된 MCF-7 세포의 증식 저해를 시험관내에서 최소 1 nM, 바람직하게는 IGF1 및 IGF2 실험 각각에 대해 최소 0.7 및 0.5 nM의 IC₅₀으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 다른 항체 또는 이의 기능적 단편중의 하나는 종양 세포주의 성장을 생체내에서 저해할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 특이 단일클론 항체이고, 특히 생쥐, 키메라 또는 인간화 기원의 것이며, 이는 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 수득할 수 있다.

일반적으로, 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편, 특히 생쥐 기원의 것의 제조는, 매뉴얼 "항체"(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)에 기재된 기술 또는 콜러와 밀스테인의 논문(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)에 따른 하이브리도마로부터의 제조 기술을 따르면 가능하다.

예를 들어, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 IGF-IR에 대항하여 면역화된 동물 세포로부터, 또는 본 발명에 다른 상기 단일클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 이의 단편 중의 하나로부터 얻을 수 있다. 상기 IGF-IR, 또는 이의 단편 중의 하나는, IGF-IR을 코딩하는 cDNA 서열에 포함된 핵산 서열로 시작하는 유전자 재조합 또는 IGF-IR의 펩타이드 서열에 포함된 아미노산 서열로부터 시작하는 펩타이드 합성에 의해, 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 IGF-IR, 또는 본 발명에 따른 상기 단일클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 이의 단편 중의 하나가 이미 고정되어 있는 친화 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 단일클론 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서 크로마토그래피를 한 뒤, 잔류하는 단백질 불순물 뿐만 아니라 DNA와 LPS를 제거하기 위한 목적으로 이온-교환 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않으며, 그리고 난 뒤 다이머(dimer) 또는 다른 멀티머(multimer)의 존재로 인한 잠재적 응집을 제거하기 위해 세파로즈 젤 상에서 크기배제 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않음으로써 정제될 수 있다. 보다 바람직한 방법에서는, 이들 기술 모두가 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

키메라 또는 인간화 항체는 본 발명에 따른 항체에 포함될 수 있다.

키메라 항체는 주어진 종의 항체로부터 유도된 자연의 변이(경쇄 및 중쇄) 부위에, 상기 주어진 종에 대한 이종의 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 부위를 조합한 것을 포함하는 항체를 나타내는 것으로 간주된다.

본 발명에 따른 키메라 타입의 항체 또는 이의 단편은 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터, 비인간, 특히 본 발명에 따른 생쥐의 단일클론 항체의 변이 부위를 코딩하는 서열 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 재조합 유전자에 의해 인코딩되는 본 발명의 키메라 항체는 생쥐-인간 키메라일 것이며, 이 항체의 특이성은 생쥐 DNA로부터 유도된 변이 부위 및 인간 DNA로부터 유도된 불변 부위에 의해 결정되는 이의 이소타입에 의해 결정된다. 예를 들어, 가능하다면 키메라 항체를 제조하는 방법은 베호옌 등의 문헌을 참조하는 것이 가능하다(Verhoeyn et al., BioEssays, 8:74, 1988).

인간화 항체는, 비인간 기원의 항체로부터 유도되고, 이 항체 분자의 나머지 부분은 한개의(또는 여러개의) 인간 항체로부터 유도된 CDR 부위를 포함하는 항체를 표시하는 것으로 간주된다. 더불어, 골격(FR로 불림)의 단편의 잔기의 일부는 결합 친화도를 보존하기 위해 변형될 수 있다(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다(예, Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). 본 발명에 따른 인간화 항체는 시험관내 진단 방법에 사용하거나, 생체내 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기에 바람직하다. 당업자에게 공지된 다른 인간화 방법은 예를 들면, 특허출원 EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 9 127, EP 0 566 647 또는 US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 및 US 5,693,761에 있는 단백질 디자인 실험실(PDL)에서 고안한 "CDR 이식(Grafting)" 방법이다. 하기 특허 문헌도 언급될 수 있다: US 5,639,641; US 6,054,297; US 5,886,152 및 US 5,877,293. 본 발명에 따른 항체의 기능적 단편은, Fv, scFv(sc는 단일쇄(single chain)임), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아보디 또는 화학적 변형-폴리(에틸렌)글리콜과 같은 폴리(알킬렌) 글리콜의 첨가("페길레이션-PEGylation")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG 또는 Fab'-PEG)("PEG"는 폴리(에틸렌)글리콜 임)와 같음-에 의하거나 리포좀의 삽입에 의해 반감기가 증가할 수 있는 모든 단편과 같은 항체 단편을 나타내는 것으로 간주되며, 상기 단편은 본 발명에 따른 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 서열의 특징적인 CDRs 중에 최소한 하나를 가지며, 특히 IGF-IR에 결합하고 인식하는 능력 및 필요하다면 IGF-IR의 활성을 저해할 수 있는 능력처럼, 후대로 전해지는 것으로부터 항체의 매우 일부분의 활성조차도 이용할 수 있는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 기능적 단편은 항체의 변이 중쇄 또는 경쇄의 부분 서열로 구성되거나 포함할 것이며, 이 항체로부터 유도된 상기 부분 서열은 이로부터 후대로 물려진 항체와 동일한 결합 특이성을 가지며, IGF-IR에 대하여 후대로 물려진 것으로부터 항체에 대해 충분한 친화성, 바람직하게는 최소 1/100, 더욱 바람직하게는 최소 1/10 을 가진다.

이러한 기능적 단편은 최소 5개의 아미노산을 포함하며, 바람직하게는 후대로 물려지는 것으로부터의 항체 서열의 10, 15, 25, 50 및 100개의 연속적인 아미노산을 포함할 것이다.

바람직하게는, 이들 기능적 단편은 후대로 물려지는 것으로부터의 항체와 동일한 결합 특이성을 가지는 Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, F(ab'), scFv-Fc 타입 또는 디아보디 단편일 것이다. 본 발명에 따라, 본 발명의 항체 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 브릿지의 절단과 같은 방법에 의해 상기에 기술된 바와 같이 항체로부터 얻을 수 있다. 다른 방법에서, 본 발명에 포함된 항체 단편은 당업자에게 널리 공지된 유전적 재조합 기술 또는 예를들어 Applied Biosystems사에 의해 제공되는 것과 같은 자동 펩타이드 합성기를 이용한 펩타이드 합성에 의해 얻어질 수 있다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하며, 구체적으로는 유전학적 재조합 또는 화학적 합성에 의해 얻어진 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 바람직한 구현예에 다르면, 항체는 서열번호 1, 3 또는 5 서열의 CDRs로부터 선택된 최소한 하나의 상보성 결정 부위 CDR 또는 서열번호 1, 3 또는 5 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%의 동일성을 갖는 최소한 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하며, 또는 서열번호 2, 4 또는 6 서열의 CDRs로부터 선택된 최소한 하나의 상보성 결정 부위 CDR 또는 서열번호 2, 4 또는 6 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%의 동일성을 갖는 최소한 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 용어 항체 화합물에 부착한 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 서열, 펩타이드 및 단백질 또는 이의 서열은 서로 혼용하여 사용가능하다.

본 발명이 자연 형태의 항체와는 관련이 있지 않은 것으로 이해되어야 하는데, 즉 말하자면 자연의 환경에 있지는 않지만 자연의 원천으로부터 정제하여 분리 또는 수득하거나 또는 유전학적 재조합, 또는 화학적 합성에 의해 수득할 수 있으며, 후대로 추가로 물려내려질 수 있는 자연이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다.

CDR 부위 또는 CDR의 경우는, 카바트 등의 문헌(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions)에 정의된 바와 같은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 과다변이 부위를 나타내는 것으로 간주된다. 3개의 중쇄 CDRs 및 3개의 경쇄 CDRs가 존재한다. 용어 CDR 또는 CDRs는 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도에 필수적인 아미노산 잔기를 필수적으로 포함하는 부위 중의 하나 또는 일부 또는 심지어는 전체를 나타내기 위해 사용된다.

본 발명에서 두개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 "동일성 퍼센트"의 경우, 가장 우수하게 최적화(최적의 최적화)되고 난 뒤에 얻어진, 비교되어야 하는 두개의 서열 간의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 동일성의 퍼센트를 나타내며, 이 퍼센트는 순수하게는 통계자료이며 무작위로 분포되는 두개의 서열간 또는 이의 전체 길이를 통틀었을때의 차이이다. 두개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 서열의 비교는 일반적으로는 최적의 방법으로 이들을 정렬하고 난 뒤에 이들 서열을 비교함으로써 수행하며, 상기 비교는 세그먼트(segment) 또는 "비교 윈도우"에 의해 수행될 수 있다. 비교하기 위한 서열의 최적 정렬은 매뉴얼에 추가로 스미스 및 워터맨의 로컬 호몰로지 알고리즘(1981)[Ad. App. Math. 2:482], 니들맨과 운스크의 로컬 호몰로지 알고리즘(1970)[J. Mol. Miol. 48:443], 피어슨 및 립맨의 동일성 분석 방법(1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), 이들 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 소프트웨어(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 BLAST N 또는 BLAST P 비교 소프트웨어)를 이용하여 수행할 수 있다

두개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 최적의 방법으로 정렬된 이들 두개 서열을 비교함으로써 확인되며, 여기서 비교되어야 하는 핵산 또는 아미노산 서열은 두개 서열들 간의 최적의 정렬을 위한 참조 서열에 대해 추가 또는 삭제를 포함한다. 동일성 퍼센트는 두개의 서열간이 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기에 대한 동일 부위의 수를 결정하고, 비교 윈도우에서 상기 동일 부위의 수를 비교 부위의 전체 수로 나누며, 이들 두개 서열간의 동일성 퍼센트를 얻기 위해 상기 결과에 100을 곱함으로써 계산된다.

예를 들어, BLAST 프로그램인 "BLAST 2 sequences"(Tatusova et al., "Blast 2 sequences-a new tool for compaing protein and nucleotide sequences" FEMS Micribiol Lett. 174:247-250)을 사용하는 것이 가능한데, 이것은 하기 사이트에서 이용가능하고 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, 사용된 파라미터는 디폴트로 정해진 것이며(특히 특히 파라미터 "오픈 갭 패널티": 5, "익스텐션 갭 패널티": 2; 예를 들어 선택된 매트릭스인 매트릭스 "BLOSUM 62"는 프로그램에 의해 제안됨), 비교되어야 하는 두개의 서열간의 동일성 퍼센트는 이 프로그램에 의해 직접 계산된다.

아미노산 서열은 참조 서열에 대해, 특정 변형, 특히 최소 하나의 아미노산의 제거, 추가 또는 치환, 바람직하게는 절단 또는 연장을 포함하는 참조 아미노산 서열과 최소 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는다. 하나 또는 그 이상의 연속적이거나 비연속적인 아미노산(들)의 치환의 경우, 상기 치환은 치환된 아미노산이 "등가의" 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 상기 표현 "등가의 아미노산"은 대응되는 항체의 생물학적 활성을 필수적으로 변형하지 않는 기본 구조의 아미노산 중의 하나와 치환될 수 있는 모든 아미노산을 나타내기 위해 사용되며, 하기에, 특히 실시예에 상세하게 설명되는 바와 같다.

본 발명의 선택적인 구현예는 다른 아미노산 서열 변형체를 포함하는 항-IGF-IR 항체를 제안한다. 예를 들어, 이는 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수도 있다. 항-IGF-IR 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오타이드를 항-IGF-IR 항체 핵산에 변형시켜 도입하거나 또는 펩타이드 합성을 통해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항-IGF-IR 항체의 아미노산 서열로부터의 제거 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 제거, 삽입 및 치환의 모든 조합이 최종 컨스트럭트를 제조하기 위해 수행될 수 있으며, 최종 컨스트럭트는 요구되는 특성을 갖는다. 또한, 상기 아미노산 변화는 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것처럼, 항-IGF-IR 항체의 후-전사 과정을 변형시킬 수 있다.

돌연변이를 위한 바람직한 위치인 항-IGF-IR 항체의 특정 잔기 또는 부위를 확인하기 위한 유용한 방법은, Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085(1989)에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기에서, 표적 잔기의 잔기 또는 그룹이 확인되며(예, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 전하를 띈 잔기), IGF-IR 항원과 아미노산과의 상호작용에 영향을 주기 위해 중성 또는 음성 전하를 띈 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴라알라닌)에 의해 치환된다. 그리고 난 뒤, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 추가로 도입하거나 또는 치환 위치에 대한 다른 변이체에 의해 정제될 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 변이체를 도입하기 위한 위치가 예측되는 동안, 돌연변이의 특징 그 자체는 예측될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 위치에서 돌연변이 작용을 분석하기 위해 표적 코돈 또는 부위에서 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 수행되며, 발현된 항-IGF-IR 항체 변이체는 요구되는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입은 백개의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 대한 한개의 잔기로부터 그 이상의 잔기의 길이 범위를 갖는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함할 뿐만 아니라 단일 또는 복합 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-IGF-IR 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항-IGF-IR 항체의 다른 삽입 변이체는, 효소(예, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드로의 항-IGF-IR의 N- 또는 C-말단의 융합체를 포함한다.

다른 변이 타입은 아미노산 치환 변이체이다. 이 변이체는 다른 잔기에 의해 치환된 항-IGF-IR 항체 분자 내에 최소한 한개의 아미노산 잔기를 포함한다. 치환적 돌연변이 유발에 매우 효과적인 위치는 과다변이 부위를 포함하지만, FR 변형도 간주될 수 있다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 제목하에 표 1에 표시되어 있다. 만약 이러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키면, 표 1에서 "실험적 치환"이라고 일컫어지는 실질적인 변형 또는 아미노산 클래스에 대한 참조로서 하기에 추가로 기술된 것이 도입될 수 있고, 그 산물이 스크리닝될 수 있다.

[표 1]

아미노산 치환

항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은, (a) 치환 위치, 예를 들어 쉬트 또는 헬릭스 형성 부위에서 폴리펩타이드 기본골격 구조, (b) 표적 위치에 있는 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 미치는 영향이 유의적으로 다른 치환을 선별함으로써 수행될 수 있다. 자연적으로 발생하는 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하의 다음의 그룹으로 나뉜다:

(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 체인 방향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향성: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 멤버를 다른 클래스에 대해 교환할 수 있을 것이다.

또한, 항-IGF-IR 항체의 적당한 형태를 유지하는데 관계가 없는 모든 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환될 수 있으며, 분자의 산화적 안정성을 향상시키고, 비정상적인 교차연결을 저해한다. 반대로, 시스테인 결합이 항체에 추가되면 이의 안정성이 향상된다(여기서 특히 항체는 Fv 단편과 같은 항체 단편이다).

치환 변이체의 특히 바람직한 타입은 부모의 항체(예, 인간화 또는 인간 항체)의 과다변이 부위 잔기를 하나 이상 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 발생을 위해 선별된 제조된 변이체(들)는 생산된 부모 항체에 비해 향상된 생물하걱 특성을 가질 것이다. 이러한 치환적 변이체를 생산하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화 성숙을 포함한다. 상세하게는, 여러개의 과다변이성 부위 위치(예, 6-7 위치)는 각 위치에서 모든 가능한한 아미노 치환을 유발하기 위해 변이된다. 따라서, 생산된 항체 변이체는 각 입자내에 패키지된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 필라멘트성 파지 입자로부터 단일변이성 방법으로 디스플레이된다. 그리고 난 뒤, 파지-디스플레이 변이체는 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 활성(예, 결합 친화도)에 대해 스크리닝 된다. 변형에 대한 과다변이성 부위 위치 후보를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유도를 수행함으로써 항원 결합에 대해 유의적으로 기여하는 과다변이성 부위 잔기를 확인할 수 있다. 선택적으로, 또는 추가적으로는, 항체 및 인간 IGF-IR 간의 접촉 포인트를 확인하기 위해 항원-항체 컴플렉스의 결정 구조를 분석하는 것이 이점이 있을 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에 기술된 기술에 따르면 치환에 대한 후보자이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본원에 기술된 바에 따라 스크리닝하기 위해 주입되며, 하나 이상의 관련 분석에서 더 우수한 특성을 가진 항체는 이후의 발생을 위해 선별될 수 있다.

다른 타입의 항체의 아미노산 변이체는 항체의 원래 그리코시화 패턴으 변화시킨다. 변형은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물을 제거하는것 및/또는 항쳉 존재하지 않은 하나 이상의 글리코실화 위치를 삽입하는 것을 의미한다.

일반적으로, 항체의 글리코실화는 N-결합되거나 O-결합된 것이다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 부착한 것을 의미한다. 아스라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌의 3개 서열-상기 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산임-은 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부차하는 탄수화물의 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에 있는 이들 트리펩타이드 서열 중의 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 위치를 만들어낸다. O-결합된 글리코실화는 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 당 중의 하나가 하이드록시 아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착한 것을 일컫으며, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 이용될 수 있다.

항체에 글리코실화 위치가 추가되는 것은 상기에 기술된 하나 이상의 트리펩타이드 서열(N-결합된 글리코실화 위치에 대해)를 포함하는 것과 같이 아미노산 서열을 변형시킴으로써 수행된다. 또한, 상기 변형은 원래 항체의 서열(O-결합된 글리코실화 위치에 대해)에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 추가 또는 치환함으로써 만들어 진다.

표적 항-IGF-IR 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 자연의 원천으로부터 분리되거나(자연적으로 발생하는 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오타이드-매개(또는 위치-연관) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 항-IGF-IR 항체의 초기에 제조된 변이 또는 비-변이 버젼의 카세트 돌연변이유발에 의해 제조된다.

이때, 예를 들어 항체의 항원-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 상보성 의존 세포독성(CDC)을 향상시키기 위해, 효과기(effector) 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하는 것이 바람직할 것이다. 이는 항체의 Fc 부위에 하나 이상의 아미노산 치환체를 도입함으로써 수행될 수 있을 것이다. 선택적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)는 Fc 부위에 도입될 수 있을 것이며, 이에 의해 이 부위에 내부 사슬 디설파이드 결합 형성을 가능하게 한다. 따라서, 생성된 호모다이머 항체는 향상된 세포내 이동 능력 및/또는 증가된 상보성-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 참고예, Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195(1992) 및 Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922(1992). 또한, 향상된 항-암 활성을 가진 호모다이머 항체는 울프 등의 문헌(Cancer Research, 53:2560-2565(1993))에 기술된 바와 같이 헤테로이중기능성 교차-결합제를 이용하여 제조될 수 있다. 선택적으로, 항체는 이중의 Fc 부위를 포함하도록 조작될 수 있으며, 이로 인해 향상된 상보성 분해 및 ADCC 가능성을 가질 것이다. 참고예, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230(1989).

이와 같이, 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미합중국 특허 제5,739,277호에 기재된 바에 따라 항체(특히 항체 단편)에 샐베이지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 도입할 수 있을 것이다. 본원에 사용된 용처 "셀베이지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 혈청 반감기를 생체내에서 증가시키기에 필수적인 IgG 분자의 Fc 부위(예, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 에피토프를 일컫는다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 2, 4 및 6 서열의 3개의 CDRs 또는 이 3개의 CDRs 중 최소한 2개를 포함하거나, 또는 서열번호 2, 4 및 6 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 각각 갖는 3개의 CDRs 또는 이 3개의 CDRs 중 최소한 2개를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 주제는 서열번호 1, 3 및 5 서열의 3개의 CDRs 또는 이 3개의 CDRs 중 최소한 2개를 포함하거나, 또는 서열번호 1, 3 및 5 서열과 최적으로 정렬되rh 난 뒤 최소 80%의 동일성을 각각 갖는 3개의 CDRs 또는 이 3개의 CDRs 중 최소한 2개를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이다.

더욱 바람지한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 서열번호 2, 4 및 6 서열의 3개의 CDRs 또는 서열번호 2, 4 및 6 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 각각 갖는 3개의 CDRs를 포함하는 중쇄를 포함하며, 이에 추가로 서열번호 1, 3 및 5 서열의 3개의 CDRs 또는 서열번호 1, 3 및 5 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 각각 갖는 3개의 CDRs를 포함하는 경쇄를 포함한다.

종래기술에 기술된 바와 같이, 6개의 CDRs 사이의 큰 변이성(길이 및 조성)은 중쇄의 3 CDRs에서 관찰되며, 더욱 바람직하게는 CDR-H3에서 관찰된다. 그 결과로서, 본 발명의 항체의 바람직한 특징적 CDR은 중쇄의 3 CDRs이며, 즉 서열번호 2, 4 및 6에 의해 코딩된 CDRs이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 6에 의해 코딩된 CDR-H3에 상응하는 CDR인 것으로 이해될 것이다.

다른 목적에 따르면, 본 발명의 주제는 인간 인슐린 수용체 IR에 대해 유의적인 수준으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 다른 항체 또는 이의 기능적 단편이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 다른 기능적 단편은 단편 Fv, scFv, Fab, (Fab')₂, Fab', scFv-Fc 또는 디아보디, 또는 화학적 변형, 특히 페길레이션, 또는 리포좀 내로의 삽입에 의해 반감기가 증가할 수 있는 모든 기능적 단편으로ㅜ터 선택될 것이다.

다른 목적에 따르면, 본 발명은 본 발명에 다른 단일클론 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마에 관한 것이며, 특히 Centre National de Culture De Microorganisme(CNCM, National Center of Microorganism Culture)(Institut Pasteur, Paris, France)에 2005년 6월 23일자로 제 I-3466으로 기탁된 것과 같은 생쥐 기원의 하이브리도마에 관한 것이며, 이 하이브리도마는 면역화된 생쥐의 Balb/c 비장세포 및 Sp2O Ag 14 골육종 세포주를 융합한 것으로부터 제조된 것이다.

본원에서 I-3466으로 일컫어지는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편은, CNCM에 2005년 6월 23일자로 제 I-3466으로 기탁된 하이브리도마-물론 본 발명의 일부-에 의해 상기 항체가 분비되는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 생쥐 항체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이며, 이 항체는 서열번호 7 아미노산 서열을 포함하는 서열 또는 서열번호 7 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열의 경쇄를 포함하고/또는 서열번호 8 아미노산 서열을 포함하는 서열 또는 서열번호 8 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열의 중쇄를 포함한다.

특히 다른 목적에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이고, 상기 항체는 생쥐에 대해 이종인 종, 특히 인간의 항체로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 불변 부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 인간 항체로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 불변 부위는 각각 카파 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위인 것을 특징으로 한다.

동기준표본 IgG에 대한 특정 구현예에서, 항체의 부가적 특성은 ADCC(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) 및/또는 CDC(Complement Dependent Cytotoxicity)로서의 작용기 기능을 잠재적으로 나타내는 것이다.

특정 목적에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이며, 상기 항체는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 골격 단편 FR1 내지 FR4는 각각 인간 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 골격 단편 FR1 내지 FR4로부터 유도되는 것을 특징으로 한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 다른 인간화 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는, 상기 인간화 항체가 서열번호 17 아미노산 서열 또는 서열번호 17 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 서열번호 18 아미노산 서열 또는 서열번호 18 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 기능적 단편 중 하나는, 상기 인간화 항체가 서열번호 17 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 18 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

새로운 목적에 따르면, 본 발명은 하기 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 분리된 핵산에 관한 것이다.

a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편중의 하나를 코딩하는, 핵산, DNA 또는 RNA;

b) 상기 a)에 정의된 핵산의 상보적 핵산;

c) 서열번호 9, 10, 1, 12, 13 또는 14 핵산 서열의 CDRs 중 최소한 하나, 또는 서열번호 9, 10, 1, 12, 13 또는 14 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열과 매우 강력한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드의 핵산;

d) 최소한 서열번호 15의 핵산 서열의 경쇄 및/또는 서열번호 6 핵산 서열의 중쇄, 또는 서열번호 15 및/또는 16 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열과 매우 강력한 조건 하에서 혼성화 될 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드의 핵산;

e) 최소한 서열번호 19의 핵산 서열의 경쇄 및/또는 서열번호 20 핵산 서열의 중쇄, 또는 서열번호 19 및/또는 20 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열과 매우 강력한 조건 하에서 혼성화 될 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드의 핵산.

용어 핵산, 핵산 또는 핵산 서열, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 서열, 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 동일하게 사용될 것이며, 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드의 정확한 결합을 나타내는 것으로 간주되며, 핵산의 단편 또는 부위가 비자연의 뉴클레오타이드를 포함하거나 포함하지 않는 것으로 정의되게 하며, 상기 DNA의 전사 산물에 대한 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA에 대해 대응될 수 있다.

본 발명은 그의 원래의 크로모좀 환경에서, 즉 자연의 상태에서의, 뉴클레오타이드 서열에 관한 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이는 분리 및/또는 정제된 것을 의미하는데, 즉 직접 또는 간접적으로 선별된 것, 예를 들어 복제에 의해 그의 환경이 최소한 부분적으로 변형된 것을 의미한다. 따라서, 본원에서는 예를 들어 숙주세포로부터 유전적 재조합이라는 수단에 의해 수득되거나 또는 화학적 합성에 의해 수득된 분리된 핵산을 나타내는 것으로 간주된다.

바람직한 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성 퍼센트를 갖는 핵산 서열은, 참조 핵산 서열에 대해 특정한 변형, 특히 제거, 절단, 연장, 키메라 융합 및/또는 치환, 특히 포인트 치환을 갖는 핵산 서열을 나타내는 것으로 간주된다. 참조 서열로서 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열은, 참조 서열과 바람직하게는 매우 강력한 조건, 특히 하기에 기술된 조건 항에서 특이적으로 혼성화 할 수 있는 유전자 코드 또는 상보적 서열의 축퇴(degeneracy)에 연결된다.

매우 강력한 조건 하에서의 혼성은, 온조 조건 및 강한 이온 조건이 상보적 DNA의 두개의 단편 사이의 혼성화를 유지할 수 있게 하는 방법에서 선택된 것을 의미한다. 예를 들어, 상기에 기술된 폴리펩타이드 단편을 확인하는 목적을 위한 혼성화 단계의 매우 강력한 조건은 하기에 잘 기술되어 있다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 다음의 두가지 단계로 수행된다: (1) 5x SSC (1x SSC는 0.15M NaCl + 0.015 M 소듐 시트레이트 용액과 상응함), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 10x Denhardt's, 5% 덱스트란 설페이트 및 1% 연어 정자 DNA를 포함하는 포스페이트 버퍼(20 mM, H 7.5)에서 42℃로 3시간 동안 전혼성화하는 단계; (2) 프로브 크기 의존적 온도(즉:>100 뉴클레오타이드의 프로브 크기에 대해서는 42℃)에서 20시간 동안 실질적으로 혼성화한 뒤, 2x SSC+2% SDS에서 20℃로 20분 동안 2회 세척하고, 그 후 >100 뉴클레오타이드의 프로브 크기에 대해 0.1x SSC + 0.1% SDS에서 60℃로 30분 동안 1회 세척하는 단계. 정의된 크기의 폴리뉴클레오타이드에 대해 상기에 기술한 매우 강한 혼성화 조건은 삼부르크 등의 문헌(1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)에 기술된 바에 따라 더 크거나 더 작은 크기의 올리고뉴클레오타이드에 대해서도 당업자에 의해 적당히 조절될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터를 목적으로 한다.

본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 정해진 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열을 발현 및/또는 분비 가능하게 한다. 따라서, 벡터는 프로모터, 전사의 개시 및 종결 신호 뿐만 아니라 적당한 전사 조절 부위를 포함하여야 한다. 이는 숙주 세포에서 안정하게 유지될 수 있어야 하고, 번역된 단백질을 특이적으로 분비하는 특정한 신호를 선택적으로 가질 수 있어야 한다. 이들 다른 성분은 사용되는 숙주 세포의 기능에 따라 당업자에 의해 선택되고 최적화 된다. 이러한 효과를 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주에 자동적 복제 벡터로 삽입되거나, 선택된 숙주의 완전한 벡터가 될 수 있다.

이러한 벡터들은 당업자에 의해 최근에 사용된 방법으로 준비되며, 제조된 클론은 리포펙션, 전기천공법, 열충격법, 또는 화학적 방법과 같은 표준 방법에 의해 적당한 숙주로 도입될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 기원의 벡터이다. 이들은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하거나 발현하기 위해 숙주세포를 형질전환하는데 유용하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하거나, 이에 의해 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.

숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 시스템으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들면, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 동물 세포, 특히 포유동물 세포가 있다. 곤충 세포 또는 식물 세포를 이용하는 것도 가능하다.

본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 최소한 하나의 세포를 포함하는 인간을 제외한 동물에 관한 것이다.

다른 목적에 따르면, 본 발명의 주제는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 도는 이의 기능적 단편의 생산 방법에 관한 것이다:

a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 미디움 및 적당한 배양 조건에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 배양 미디움 또는 상기 배양된 세포로부터 생산되기 시작하는, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 회수하는 단계.

본 발명에 따른 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드의 제조 공정에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 형태의 폴리펩타이드의 제조 공정은 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 벡터 및/또는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하며, 이는 본 발명에 포함되는 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포는 회수되는 상기 폴리펩타이드 및 상기 재조합 펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양된다.

말한바와 같이, 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 시스템으로부터 선택될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 확인하는 것이 가능하며, 이러한 원핵세포 또는 진핵세포 시스템에서의 분비를 용이하게 한다. 따라서, 이러한 서열을 갖는 본 발명에 따른 벡터는 분비되어야 하는 재조합 단백질의 생산을 촉진할 수 있다. 효과면에서, 관심 재조합 단백질의 정제는, 숙주 세포의 내부에 있는 것보다는 세포 배양 상등액에 존재한다는 사실에 의해 용이해질 수 있을 것이다.

화학적 방법에 의해 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 제조 과정은 본 발명의 주제이다. 당업자라면 단편의 응축 또는 용액 내에서의 전통적인 합성에 의한 화학적 합성, 예를들어 고체상을 포함하는 기술(참고, Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce CHem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)) 또는 부분적인 고체상을 이용하는 기술을 잘 안다. 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있으며, 본 발명에 포함된 대응되는 비천연의 아미노산을 포함할 수 있다.

항체 또는 이의 기능적 단편중의 하나는, 본 발명에 포함된 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있다.

두번째 구현예에 따르면, 본 발명은 상기에서 추가로 기술한 바와 같은 본 발명에 따른 항체에 관한 것이며, 이는 티로신 키나아제 패밀리의 인간 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며/또는 이러한 수용체의 티로신 키나아제 활성을 저해할 수 있다.

첫번째 구현예에서, 제2 모티프를 포함하는 이중특이적 항체에 포함된 항체는 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 상에 EGF가 결합하는 것을 저해할 수 있으며/또는 상기 EGFR의 티로신 키나아제 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 더 바람직한 구현예에서, 상기 제2 항-EGFR 모티프는 생쥐 단일클론 항체 225, 이의 키메라 유도체 C255 또는 이 항체 225로부터 유도된 모든 인간화 항체로부터 얻어질 수 있다.

두번째 구현예에서, 제2 모티프를 포함하는 이중특이적 항체에 포함된 이러한 항체는 HER2/neu 수용체에 의해 조정되는 활성을 특이적으로 저해할 수 있으며/또는 상기 HER2/neu 수용체의 티로신 키나아제 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 더 바람직한 구현예에서, 상기 제2 항-HER2/neu 모티프는 생쥐 단일클론 항체 4D5 또는 2C4 또는 인간화 항체 Trastuzumab 또는 Pertuzumab로 부터 얻어질 수 있다.

세번째 구현예에서, 제2 모티프를 포함하는 이중특이적 항체에 포함된 이러한 항체는 cMET 수용체 상으로의 간세포 성장 인자(HGF)의 결합을 특이적으로 저해할 수 있으며/또는 상기 cMET 수용체의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있다.

최종적으로는, 마지막 구현예에서, 제2 모티프를 포함하는 이중특이적 항체에 포함된 이러한 항체는 RON 수용체 상으로의 대식세포 자극 단백질(MSP)의 결합을 특이적으로 저해할 수 있으며/또는 상기 RON 수용체 상의 티로신 키나아제 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 VEGFR, FGR(섬유아세포 성장 인자), PDGF(혈소판 유도된 성장 인자) 또는 CXCR4 또는 2(케모카인 수용체 타입 4 또는 2)와 같은 종양의 발달에 관련된 모든 종류의 수용체와 작용할 수 있다.

단일클론 항체의 두번째 생산으로부터의 이중특이적 또는 이중기능적 항체에는 두개의 다른 변이 부위가 동일한 분자 내에 포함된다(Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419). 이들의 용도는 새로운 작용기 기능을 보충하거나, 종양 세포의 표면 상에 여러개의 분자를 표적하는 기능으로부터의 진단 부분 및 치료학적 부분에서 설명된다. 이러한 항체는 화학적 방법(Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol., 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382) 또는 체강적(somatic) 방법(Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121:210-228)에 의해 얻어질 수 있고, 바람직하게는 포커스되는 이종다이머화를 가능하게 함으로써 항체의 정제 과정을 용이하게 하는 유전 공학적 기술에 의해 얻어질 수 있다(Merchand et al., 1998 Nature Biotech., 16:677-681).

이들 이중특이적 항체는 Fab'PEG 또는 디아보디와 같은 이중특이적 Fab'2와 같은 전체 IgG로서 컨스트럭트 될 수 있으며, 4가의(tetravalent) 이중특이적 항체 또는 표적된 각 항체(Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37(18):1123-30) 또는 상기에 추가로 기재된 바와 같은 이의 단편에 대해 존재하는 2개의 부착 위치로 컨스트럭트 될 수 있다.

이중특이적 항체의 생산 및 투여가 2개의 특정 항체를 생산하는 것에 비해 훨씬 성가시지 않다는 사실로부터의 경제적인 이점에 추가로, 이러한 이중특이적 항체의 이용은 치료의 독성을 감소시키는 이점을 가진다. 이는 이중특이적 항체의 사용이 순환하는 항체의 총량이 독성을 가능한한 감소되도록 가능하기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이중기능적 항체는 2가 또는 4가의 항체이다.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능저 단편 중의 하나로 구성되는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 것이다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 IGF-R, EGFR, HER2/neu, VEGFR, cMET 및/또는 RON의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 화합물로부터 선택된 제2 화합물을 최소한 포함하는 상기에 추가로 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 두번째 바람직한 목적에서, 상기 제2 화합물은 분리된 항-EGFR, -IGF-IR, -HER2/neu, 항-VEGFR, -cMET 및/또는 -RON 항체, 또는 이의 기능적 단편이며, 이는 상기 수용체(들)에 의해 유도된 증식성 및/또는 항-아폽토틱 및/또는 혈관성 및/또는 전이성 보급 유도제 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 동시사용, 개별 사용 또는 연속사용하기 위한 조합 산물로서 최소한 IGF-IR, EGFR, HER2/neu, VEGFR, cMET 및/또는 RON의 티로신 키나아제 활성 저해제를 포함한다.

다른 바람직한 구현예에서, 상기 수용체의 티로신 키나아제 활성 저해제는 유도된 천연의 제제, 디아닐로프탈리미드(dianilinophthalimides), 피라졸로(pyrazlo)- 또는 피로졸로피리도피리미딘(pyrrolopridopyrimidines) 또는 퀴나질린(quinazilines)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 저해제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 개시되어 있다(Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1, 25-32).

상기에 기술된 바와 같은 조성물에 포함되는 본 발명의 다른 상응하는 구현예는 동시 사용, 개별 사용 또는 연속 사용을 위한 조합 산물로서 세포독성제/세포분열억제제을 추가로 포함한다.

"동시 사용"은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 한번에 동일한 약제학적 제형으로 투여하는 것을 의미한다.

"개별 사용"은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 각각 다른 약제학적 제형으로 동시에 투여하는 것을 의미한다.

"연속 사용"은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 각각 다른 약제학적 제형으로 연속적으로 투여하는 것을 의미한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 조성물은 암 치료의 효과를 유의적으로 향상시킨다. 다르게 말하면, 본 발명에 따른 항-IGF-IR 항체의 치료학적 효과는 세포독성제의 투여에 의한 예측되지 않은 방법에서 약효를 증가시킨다. 본 발명에 따른 조성물에 의해 유발되는 수반되는 주요한 다른 이점은, 2차 작용의 출현의 위험을 회피되게 하거나 감소되도록 하게하는 활성 성분, 특히 세포독성제를 적은 양으로 사용 가능하게 한다는 것이다.

더불어, 본 발명에 따른 조성물은 예측되는 치료학적 효과가 훨씬 빨리 달성되게 할 것이다.

"항암 치료제" 또는 "세포독성제"는 환자에게 투여될 때, 환자 몸에 있는 암의 발생을 치료하거나 예방하는 물질로 간주된다. 이러한 제제의 비제한적인 예로는, 알킬화제, 항-대사제, 항암 항생제, 유사분열 저해제, 크로마틴 형성 저해제, 항-신생혈관형성제, 항-에스트로겐, 항-안드로겐 또는 면역조절제가 언급될 수 있다.

이러한 제제는 예를 들어 VIDAL 2001년판에 있는 종양학 및 혈액학 컬럼 "Cytoxoxics"에 있는 화합물에 관련된 페이지에 언급되어 있으며, 이 문헌에 참조로 인용된 이들 세포독성 화합물은 바람직한 세포독성제로서 본원에 인용된다.

더욱 구체적으로는, 본 발명에 따른 다음의 제제가 바람직하다.

"알킬화제"는 모든 분자, 바람직하게는 세포내에 있는 핵산(예, DNA)을 교차-결합하거나 알킬화할 수 있는 모든 물질을 일컫는다. 알킬화제의 예는 메클로레타민(mechlorothamine), 클로람부콜(chlorambucol), 멜팔렌(melphalen), 클로리드레이트(chlorydrate), 피포브로멘(pipobromen), 프리드니무스틴(prednimustin), 디소딕-포스페이트(disodic-phosphate) 또는 에스트라무스틴(estramustine)과 같은 질소 머스타드(nitrogen mustard); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 알트레타민(altretamine), 트로포스파미드(trofosfamide), 설포포스파미드(sulfofosfamide) 또는 이포스파미드(ifosfamide)와 같은 옥사조포린(oxazophorine); 티오테파(thiotepa), 트리에틸렌아민 또는 알테트라민(altetramine)과 같은 아지리딘(aziridines) 또는 이민-에틸렌; 카무스틴(carmustine), 스트렙토조신(streptzocin), 포테무스틴(ftemustin) 또는 로무스틴(lomustine)과 같은 나이트로소유레아(nitrosourea); 부설판(busulfan), 트레오설판(treosulfan) 또는 임프로설판(improsulfan)과 같은 알킬레-설포네이트(alkyle-sulfonates); 다카바진(dacarbazine)과 같은 트리아젠(triazene); 또는 시스-플레티늄, 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 복합체를 포함한다.

"항-대사제"는 특정 활성, 일반적으로는 DNA 합성과 관련된 세포 성장 및/또는 대사를 차단하는 물질을 일컫는다. 항-대사제의 예는 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루우라실(5-fluoruracil), 플록스유리딘(floxuridine), 5-플루오로데옥시유리딘(5-fluorodeoxyuridine), 카페시타빈(capecitabine), 사이타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine, 6-MP), 6-티오구아닌(6-thioguanine, 6-TG), 클로로데족시아데노신(chlorodesoxyadenosine), 5-아자사이티딘(5-azacytidine), 젬시타빈(gemcitabine), 클라드리빈(cladribine), 데옥시코포마이신(deoxycoformycin) 및 펜토스타틴(pentostatin)을 포함한다.

"항암 항생제"는 DNA, RNA 및/또는 단백질 합성을 억제 또는 저해할 수 있는 화합물을 일컫는다. 항암-항생제의 예는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valrubicin), 마이톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 미쓰라마이신(mithramycin), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C, 블레오마이신(bleomycin) 및 프로카바진(procarbazine)을 포함한다.

"유사분열 저해제" 세포 사이클 및 유사분열의 정상적인 과정을 억제한다. 일반적으로 미소관 저해제 또는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 탁소이드(taxoide)가 유사분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴(vinblastin), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine) 및 비노렐빈(vinorelbine)과 같은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)도 유사분열을 저해할 수 있다.

"크로마틴 기능 저해제" 또는 "토포이소머라아제 저해제"는 토포아이소머라아제 I 또는 토포아이소머라아제 II와 같은 크로마틴 모델링 단백질의 정상적인 기능을 저해하는 물질을 일컫는다. 토포아이소머라아제 I에 대한 크로마틴 기능 저해제의 예는 캄토테신(camptothecine) 및 이의 유도체-토포테칸(topotecan)과 같은-를 포함하며, 토포아이소머라아제 II에 대한 예는 에토포사이드(etoposide), 에토포사이드 포스페이트 및 테니포사이드(teniposide)를 포함한다.

"항-신생혈관형성제"는 혈관의 성장을 저해하는 모든 약물, 화합물, 물질 또는 제제를 일컫는다. 항-신생혈관형성제의 예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 라조신(razoxin), 마리마스타트(marimastat), 바티마스타트(batimastat), 프리노마스타트(prinomastat), 타노마스타트(tanomastat), 일로마스타트(ilomastat), CGS-27023A, 할로퓨지논(halofuginon), COL-3, 네오바스타트(neovstat), BMS-275291, 탈리도마이드(thalidomide), CDC 501, DMXAA, L-651582, 스쿠알라민(squalamine), 엔도스타틴(endosta수, SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터루킨-12, IM862, 안지오스타틴 및 비탁신(vitaxin)을 포함한다.

"항-에스트로겐" 또는 "항-에스트로겐제"는 에스트로겐의 활성을 감소, 상쇄 또는 저해하는 모든 물질을 일컫는다. 항-에스트로겐제의 예는 타목시펜, 토레미펜(toremifene), 라록시펜(raloxifene), 드로록시펜(drloxifene), 이오독시펜(iodoxyfene), 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole) 및 엑세메스탄(exemestane)을 포함한다.

"항-안드로겐" 또는 "항-안드로겐제"는 안드로겐의 활성을 감소, 상쇄 또는 저해하는 모든 물질을 일컫는다. 항-안드로겐의 예는 플루타마이드(flutamide), 닐루타마이드(nilutamide), 비카루타마이드(bicalutamide), 스프리로노락톤(sprironolactone), 사이프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 피나스테라이드(finasteride) 및 시미티딘(cimitidine)을 포함한다.

"면역조절제"는 면역 시스템을 자극하는 물질이다.

면역조절제의 예는 인터페론, 알데스루킨(aldesleukine), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스(denileukin diflitox) 및 인터루킨-2와 같은 인터루킨, 타소네민(tasnermine)과 같은 종양 괴사 인자 또는 렌티난(lentinan), 시조피란(sizofiran), 로퀴니멕스(roquinimex), 피도티모드(pidotimod), 페가데마스(pegademase), 싸이모펜틴(thymopentine), 폴리 I:C 또는 5-플루오로우라실과 결합한 레바미졸(levamisole)과 같은 다른 면역조절제를 포함한다.

보다 상세하게는, 당업자라면 "Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique" 및 "traite de chime therapeutique, vol.6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003" 문헌에 언급된 매뉴얼을 참조할 수 있다.

보다 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합 산물로서 상기 조성물은, 상기 세포독성제가 동시 사용되기 위해 상기 항체에 화학적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 세포독성제/세포분열저해제가 방추체 저해제 또는 안정화제, 바람직하게는 비노렐빈(vinorelbine) 및/또는 빈플루닌(vinflunine) 및/또는 빈크리스틴(vincristine)으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 세포독성제 및 상기 항체 간의 결합을 촉진시키기 위해, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리(알킬렌) 글리콜 또는 아미노산과 같이 결합되어야 하는 2개의 화합물 사이에 스페이서 분자를 도입하는 것이 특히 가능하며, 또는 다른 구현예에서는 본 발명에 따른 상기 항체와 반응할 수 있는 상기 세포독성제의 활성 유도체를 이용하는 것이 가능하다.

EGFR의 다른 저해제는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 항-EGFR 단일클론 항체 C255 및 22Mab(ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200(Merck KgaA) 또는 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839(AstraZeneca), PKI-166(Novartis), PKI-166/CGP-75166(Novartis), PTK 787(Novartis), CP 701 (Cephalon), 레플루노마이드(Pharmacia/Sugen), CI-1033(Warner-Lambert Perke-Davis), CI-1033/PD 183, 805(Warner-Lambert Parke-Davis), CL-387, 785(Wyeth-Ayerst), BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche), 나아미딘 A(Naamidine A, Bristol-Myers Squibb), RC-3940-II(Pharmacia), BIBX-1382(Boehrnger Ingelheim), OLX-103(Merck&Co), VRCTC-310(Ventech Research), EGF fusion toxin(Seragen Inc.), DAB-389(Seragen/Lilgand), ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund), RG-50864(INSERM), LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center), GW-282974(Glaxo), KT-8391(Kyowa Hakko) 또는 "EGFR 백신"(York Medical/Centro de Immunologia Moleclar)을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기에 기술된 바와 같은 조성물은 동시사용, 개별사용 또는 연속사용을 위한 혼합 산물로서, HER2/neu 수용체의 세포외 도메인에 직접 대응하는 다른 항체 화합물을 포함할 수 있으며, 이는 암, 특히 상기 HER2/neu 수용체 및 수용체 IGF-IR 및/또는 EGFR을 과발현하는 암-특히 유방암-의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.

알바넬 등의 문헌(Albanell et al., J. of the National Cancer Institute, 93(24):1830-1831, 2001) 및 루 등의 문헌(Lu et al., J. of the National Cancer Instute, 93(24):1852-1857, 2001)에 있는 참조문헌은 항-HER2/neu 항체를 본 발명에 따른 항-IGF-IR 항체와 결합하는 예측되지 않은 대상을 증명한다.

구체적인 방법에서, 본 발명에 따른 조성물의 항-HER2/neu 항체는 Trastuzumab(또는 헤르셉틴이라고도 불림)로 불리는 항체이다.

다른 목적에서, 본 발명은 조성물에 관한 것이며, 이 조성물의 항체 또는 이의 기능적 단편중의 하나의 최소한 하나가 세포 톡신 및/또는 방사성 원소와 결합하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 톡신 또는 상기 방사성 원소는 IGF-IR을 발현하는 세포의 세포 활성의 최소한 하나를 저해할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 세포의 성장 또는 증식을 저해할 수 있으며, 특히 상기 세포를 불활성화 할 수 있다.

또한, 바람직하게 상기 톡신은 엔테로박테리아 톡신이며, 특히 슈도노마스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A)이다.

치료를 위해 이용된 항체에 바람직하게 결합한 방사성 원소(또는 방사성 동위원소)는 감마선을 방출하는 방사성 동위원소이며, 바람직하게는 이오딘(iodne)¹³¹, 이트리움(yttrium)⁹⁰, 금¹⁹⁹, 팔라듐(palladium)¹⁰⁰, 구리⁶⁷, 비스무스(bismuth)²¹⁷ 및 안티모니(antimony)²¹¹이 있다. 베타선 및 알파선을 방추하는 방사성 동위원소도 치료법에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 최소한 하나의 항체 또는 이의 기능적 단편 중 하나에 결합한 톡신 또는 방사성원소는, 최소한 하나의 항체에 상기 톡신 또는 상기 방사성 원소가 결합하게 하는 모든 수단을 일컫는 것으로 간주되며, 특히 결합 분자의 도입을 이용하거나 이용하지 않고 2개의 화합물 사이를 공유결합하는 모든 수단을 일컫는다.

결합 성분의 전부 또는 일부를 화학적(공유결합), 정전기적 도는 비공유결합적으로 결합가능하게 하는 제제 중에, 언급되는 것은 특히 벤조퀴논, 카보디이미드(carbodiimide)더 구체적으로는 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimide hydrochloride), 디말레이미드(dimaleimide), 디티오비스-니트로벤조산(DTNB), N-숙시니미딜 S-아세틸 티오-아세테이트(SATA)로부터 만들어진 것이 될 수 있고, 자외선(U.V.), 바람직하게는 N-[-4-(adkwlehtkffltlfdkalsh)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피오나마이드(APDP), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 6-하이드라지노-니코틴아마이드(HYNIC)와 반응하는 하나 이상의 페닐아자이드 그룹을 가진 연결제(bridging agent)로부터 만들어진 것이 될 수 있다.

방사성 원소에 대한 연결의 다른 형태는 이중기능적 이온 킬레이터의 이용을 포함할 수 있다.

이러한 킬레이트 중에는 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid)-이는 금속, 특히 방사능 금속, 및 면역글로불린에 결합하기 위해 개발된 것임-로부터 유도된 킬레이트가 언급될 수 있다.

따라서, DTA 및 이의 유도체는 리간드-금속 복합체의 안정성 및 견고성을 증가시키기 위해 탄소 사슬 상의 다른 그룹에 의해 치환될 수 있다(Krejcarek et al., 1977; Brechbiel et al., 1991; Gansow, 1991; 미합중국 특허 제4,831,175호)

예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세틱산(DTPA) 및 이의 유도체-이는 그 자체 제형 또는 금속 이온과의 복합체를 형성한 제형으로 오랜 시간 동안 의학 및 생물학에서 널리 사용됨-는 금속 이온과 안정한 킬레이트를 형성하고 암 치료법에서 방사성면역결합체를 개발하기 위해 항체와 같은 치료학적 또는 진단적 관심 단백질과 결합할 수 있는 특징을 가진다(Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).

바람직하게는, 본 발명에 따라 상기 콘쥬게이트를 형성하는 최소한 하나의 항체는, 이의 기능적 단편, 구체적으로는 scFv 단편과 같이 그의 Fc 성분을 절단한 단편으로부터 선택된다.

더불어, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 약물 제조를 위한 용도를 포함한다.

보다 구체적으로, 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 IGF-IR의 과발현 및/또는 비정상적 활성화에 의해 유도되고/또는 IGF1 또는 IGF2와 IGF-IR 간의 상호작용에 의해 유도된 신호 전달 과정의 과다활성화와 관련이 있는 질병을 예방 또는 치료하기 위한, 약물을 제조하기 위한 항체 또는 이의 기능적 단편 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 IGF-IR의 과발현 및/또는 비정상적 활성화에 의해 유도되고/또는 IGF2와 IGF-IR 간의 상호작용에 의해 유도된 신호 전달 과정의 과다활성화와 관련이 있는 질병을 예방 또는 치료하기 위한, 약물을 제조하기 위한 항체 또는 이의 기능적 단편 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명에 다른 상기 용도는, 상기 약물의 투여가 인슐린 수용체 IR의 저해-즉, 말하자면 상기 약물의 존재로 인한 IR과 이의 천연의 리간드와의 상호작용의 저해, 특히 상기 약물이 IR에 부착하는 것과 관련된 경쟁적 저해-와 관련이 있는 제2 효과만을 약간 유도하거나 유도하지 않는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 정상세포가 종양 특징을 가진 세포, 바람직하게는 IGF-의존적인 세포, 특히 최소한 IGF2-의존적 세포로 형질전환하는 것을 저해할 수 있는 약물을 제조하기 위한, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나-바람직하게는 인간화된것- 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도를 포함한다.

본 발명은 종양 특징을 가진 세포, 바람직하게는 IGF-의존적인 세포, 특히 최소한 IGF2-의존적 세포의 성장 및/또는 증식을 저해할 수 있는 약물을 제조하기 위한, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나-바람직하게는 인간화된것- 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도를 포함한다.

일반적으로, 본 발명의 주제는 IGF-IR을 발현하는 암, 및/또는 IGF1 및/또는 IGF2와 IGF-IR의 상호작용에 의해 유도되는 신호 전달 과정이 과다 활성화된-예를 들어 IRS1의 과발현- 암을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나-바람직하게는 인간화된것- 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도이다.

또한 본 발명의 주제는 건선을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나-바람직하게는 인간화된것- 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도이며, 여기서 표피가 과다증식된 건선은 IGF-IR의 발현 또는 과발현과 연관이 있거나, IGF-IR과 이의 천연의 리간드와의 상호작용(Wraight C.J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18(5):521-526, Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like growth factor I receptor antisense oligonucleotides) 및/또는 EGFR과 이의 천연의 리간드의 상호작용에 의해 유도되는 신호 전달 과정의 과다활성화와 연관이 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 동맥경화를 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나-바람직하게는 인간화된것- 및/또는 상기 항체를 포함하는 모든 조성물의 용도에 관한 것이다.

예방 및/또는 치료될 수 있는 암 중에서, 전립선암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁내막암, 결장암, 다발성 경화증 또는 난소암 또는 IGF-IR을 과발현하는 모든 다른 암이 바람직하다.

더욱 바람직한 구현예에서, IGF2를 대체하는 능력으로 인해, 본 발명은 결장암-이는 IGF2가 특히 관련이 있음-을 예방, 진단 또는 치료하기 위한, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.

또 다른 목적에 따르면, 본 발명의 주제는 IGF-IR의 비정상적인 존재가 의심되는 생물학적 샘플로부터 유도되는 IGF-IR의 과발현 또는 저발현, 바람직하게는 과발현과 관련이 있는 질병의 시험관내 진단 방법이며, 상기 생물학적 샘플은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나와 접촉하는 것을 특징으로 하고, 필요하다면 상기 항체는 표지될 수 있다.

바람직하게는, 상기 진단 방법에서 IGF-IR의 과발현과 관련이 있는 상기 질환은 암이다.

상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는, 검출가능하거나 정량화할 수 있는 신호를 얻기 위해 표지된 항체의 형태 또는 면역콘쥬게이트의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 목적은 정상에 비해 비정상적인 IGF-IR 발현을 하는 병리적 상태를 시험관 내에서 진단하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 IGF-IR/항체 컴플렉스가 형성되기 좋은 조건하에서, IGF-IR을 포함하는 것으로 예측되는 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 항체로 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플에 있는 상기 IGF-IR의 존재를 나타내는 상기 컴플렉스를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 검출가능하게 표지된다.

첫번째 목적에서, IGF-IR의 비정상적 발현은 IGF-IR의 과발현이다. 두번째 목적에서, IGF-IR의 비정상적 발현은 IGF-IR의 저발현이다.

본 발명에 따라 표지된 항체 또는 이의 기능적 단편은 예를들면, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, α-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 글루코스 아밀라아제, 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase), 아세틸콜린에스터라아제, 라이소자임, 말레이트 디하이드로게나아제 또는 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나아제와 같은 효소와 콘쥬게이트되거나 바이오틴, 디곡시게닌(digoxygenin) 또는 5-브로모데옥시유리딘과 같은 분자에 의해 콘쥬게이트 될 수 있는 면역콘쥬게이트로 일컫어지는 항체를 포함한다. 형광물질은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편에 콘쥬게이트 될 수 있으며, 특히 플루오레신(fluorescein) 및 이의 유도체, 플루오로크롬(fluorochrome), 로다민 및 이의 유도체, GFP(녹색 형광 단백질), 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone) 등을 포함한다. 이러한 콘쥬게이트에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 이들은 효소 또는 형광 물질에 직접 결합하거나, 스페이서 그룹 또는 글루타알데하이드와 같은 폴리알데하이드, 에틸렌디아민테트라아세틱산(EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세틱산(DPTA)와 같은 연결 그룹을 매개체로 하여 결합될 수 있으며 또는 치료학적 콘쥬게이트를 위해 상기에 언급된 바와 같은 커플링제의 존재하에서 결합될 수 있다. 표지된 형광물질 타입을 포함하는 콘쥬게이트는 이소씨오시아네이트(isothiocyanate)와의 반응에 의해 제조될 수 있다.

다른 콘쥬게이트는 루미놀(luminol) 및 디오제탄(dioxetane)과 같은 화학발광 표지자, 루시퍼라아제 및 루시페린과 같은 생물-발광 표지자, 또는 이오딘(iodine)¹²³, 이오딘¹²⁵, 이오딘¹²⁶, 이오딘¹³³, 브로민⁷⁷, 테크네튬(technetium)⁹⁹ ^m, 인듐¹ ¹¹, 인듐¹¹³ ^m, 갈륨⁶⁷, 갈륨⁶⁸, 루테늄⁹⁵, 루테늄⁹⁷, 루테늄¹⁰³, 루테늄¹⁰⁵, 머큐리¹⁰⁷, 머큐리²⁰³, 레늄(rhenium)⁹⁹ ^m, 레늄¹⁰¹, 레늄¹⁰⁵, 스칸디움(scandium)⁴⁷, 텔루리움(tellurium)¹²¹ ^m, 텔루리움¹²² ^m, 텔루리움¹²⁵ ^m, 텔륨(tellurium)¹⁶⁵, 텔륨¹⁶⁷, 텔륨¹⁶⁸, 플루오린¹ ⁸, 이트리움(yttrium)¹⁹⁹, 이오딘¹³¹과 같은 방사능 표지자를 포함한다. 치료학적 방사성동위원소를 항체에 직접 결합하거나 상기에 언급된 EDTA, DTPA와 같은 킬레이팅제-방사성 원소에 사용될 수 있음-를 통해 결합하기 위해 존재하는 당업자에게 공지된 방법은 진단에 사용될 수 있다. 클로라민(chloramine) T 방법[Hunter W.M and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495]을 이용한 Na[I¹²⁵]의 표지 또는 크록포드(Crockford) 등의 특허의 기술(미합중국 특허 제4,424,200)에 의한 테크네튬(technetium)⁹⁹ ^m의 표지 또는 나토위크(Hnatowich)의 특허(미합중국 특허 제4,479,930)에 기술된 바와 같은 DTPA에 의한 부착법이 가능한 것으로 언급된다.

본 발명의 항체 또는 이의 가능적 단편은 생물학적 샘플에 있는 IGF-IR의 과발현 또는 저발현, 바람직하게는 과발현을 검출 및/또는 정량하기 위한 방법에 사용될 수 있으며, 이 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

a) 생물학적 샘플에, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편을 접촉시키는 단계; 및

b) 형성된 IGF-IR/항체 컴플렉스를 검증하는 단계.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편은 치료 효과를 모니터링하기 위해, 생물학적 샘플에 들어 있는 IGF-IR을 검출 및/또는 정량화 하기위한 방법 및/또는 IGF-의존적 암 또는 건선 또는 동맥경화증의 치료법에 사용될 수 있다.

더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편은 IGF-IR의 발현이 정량적 및/또는 정성적 방법으로 관찰되어야 하는 모든 상황에서 이용되는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 생물학적 샘플은 혈청과 같은 생물학적 액체, 전혈, 세포, 조직 샘플 또는 인간 기원의 부검물에 의해 제조된다.

본 발명의 다른 주제는 하기 단계를 포함하는, 전립선 세포 샘플의 종양발생 잠재성을 예측하기 위한 진단 방법이다:

(a) 인간 전립선 조직 샘플을 제공하는 단계; 및

(b) 상기 샘플에 있는 IGF-IR의 존재를 확인하는 단계, 상기 단계는 IGF-IR/항체 컴플렉스가 형성되기 좋은 조건하에서 본 발명에 따른 항체를 상기 샘플에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 컴플렉스의 존재는 상기 조직에 있는 상기 샘플의 종양발생 잠재성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

다른 구현예에서, 상기 컴플렉스의 존재는, 환자가 IGF-IR의 과발현을 특징으로 하는 병리적 질환의 발생 또는 시작의 위험에 처해있다는 것을 나타내어 준다.

또한, 본 발명의 목적은 IGF-IR 발현의 비정상적 발현을 특징으로 하는 병리학적 질환을 개선하기 위해 디자인된 치료학적 방법의 과정을 진행시키기 위한 방법이며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 환자의 샘플을 분석하여 첫번째 포인트에서 IGF-IR 레벨을 확인하는 단계;

(b) 상기 샘플을 두번째 포인트에서 분석하는 단계; 및

(c) 상기 치료 방법의 효과를 확인하기 위해 단계 (a)에서 확인된 레벨에 대해 상기 두번째 포인트 레벨을 비교하는 단계, 여기서 상기 샘플에 있는 IGF-IR 레벨의 감소는 상기 환자에 있는 병리적 질환의 퇴보 결정요인이고, IGF-IR 레벨의 증가는 상기 환자에 있는 병리적 질환의 진행의 결정요인이다.

모든 방법 또는 간편한 테스트는 이러한 검출 및/또는 투약을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 상기 테스트는 경쟁 테스트 또는 샌드위치 테스트, 또는 항원-항체 타입의 면역 컴플렉스 형성에 의존하는 당업자에게 공지된 모든 테스트가 될 수 있다. 본 발명에 따른 적용, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 고정되거나 표지될 수 있다. 이 고정은 당업자에게 공지된 수많은 지지체 상에서 수행될 수 있다. 이러한 지지체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론 또는 자연의 세포 또는 변형된 세포를 포함할 수 있다. 이러한 지지체는 수용성이거나 불용성일 수 있다.

실시예에서, 바람직한 방법은 면역형광물질에 의한 ELISA 테크닉 또는 방사성-면역분석(RIA) 테크닉 또는 이의 등가물에 따라 면역효소적 과정을 수행하는 것이다.

따라서, 본 발명은 IGF-IR의 과발현 및/또는 저발현에 의해 유도되는 질환의 진단 방법을 수행하거나, 생물학적 샘플에 있는 IGF-IR의 과발현 또는 저발현, 바람직하게는 상기 수용체의 과발현을 정량하기 위해 필요한 킷트 또는 세트를 포함하며, 상기 킷트 또는 세트는 하기 구성을 포함하는 것을 특징으로 한다:

a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중 하나;

b) 선택적으로, 면역 반응이 일어나기 좋은 미디움을 형성하기 위한 제제;

c) 선택적으로, 면역 반응에 의해 생산된 IGF-IR 항체 컴플렉스를 확인할 수 있게 하는 제제.

더불어, 본 발명은 암을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 본 발명에 따른 조합 산물로서의 조성물의 용도에 관한 것이며, 특히 암에는 상기 세포독성제 또는 상기 항-HER2/neu 항체가 처방되는데, 상기 암의 종양세포는 IGF-IR을 발현 또는 과발현한다.

본 발명의 주제는 생물학적으로 활성을 띄는 화합물을 IGF-IR을 발현 또는 과발현하는 세포에 특이적으로 표적하기 위한 약물을 제조하기 위한, 본 발명에 다른 항체의 용도이다.

생물학적으로 활성을 띄는 화합물은 세포 활성, 구체적으로는 이의 성장, 증식, 전사 또는 유전자 번역을 조절, 특히 저해할 수 있는 모든 화합물을 나타내는 것으로 간주된다.

또한 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나-바람직하게는 표지, 특히 방사능표지됨-를 포함하는 생체내 진단제, 및 의학 영상, 특히 세포내 IGF-IR 발현 또는 과발현과 관련된 암을 진단하는데 사용하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 조합 산물로서의 조성물 또는 약물로서 본 발명에 따른 항-IGF-IR/톡신 콘쥬게이트 또는 방사성원소에 관한 것이다.

바람직하게, 조합 산물로서의 상기 조성물 또는 본 발명에 따른 상기 콘쥬게이트는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합될 수 있다.

본 명세서에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 2차 활성을 유발하지 않는 약제학적 조성물에 들어가는 화합물 또는 화합물의 조합을 나타내며, 이는 활성 화합물의 투여를 용이하게 하고, 몸 안에서의 이의 수명 및/또는 효능을 증가시키며, 용액내에서의 용해도를 증가시키거나 이의 보관을 향상시킬 수 있게 한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 원래의 기능 및 선택된 활성 화합물의 투여 방법으로서 당업자에 의해 체택될 수 있을 것이다.

바람직하게, 이들 화합물은 전신 경로, 특히 정맥내 경로, 근육내, 피부내, 복강내 또는 피하내 투여 또는 경구투여 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직한 방법으로는, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물은 수회, 연속적으로 투여될 것이다.

투여 방법, 용량 및 최적의 약제학적 제형은, 예를 들어 환자의 나이 또는 체중, 그의 상태의 심각성, 치료에 대한 내성 및 2차 효과와 같이 환자에게 적용되는 치료법을 결정하는데 작용하는 현상에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 실시예 및 도면-이의 설명이 하기에 나타나 있음-과 함께 명세서에서 계속 설명된다.

도 1: 단일클론 항체 I-3466에 의한, IGF-IR에 대한 [¹²⁵I]-IGF-1 결합의 경쟁.

특이적 [¹²⁵I]-IGF-1 결합 (%)은 반대수 그래프 상에 리간드 농도의 함수로 플로팅되어있다. 특이적 결합 값은 3회 수행한 실험의 평균이다.

도 2: 단일클론 항체 I-3466에 의한, IGF-IR에 대한 [¹²⁵I]-IGF-2 결합의 경쟁.

특이적 [¹²⁵I]-IGF-2 결합 (%)은 반대수 그래프 상에 리간드 농도의 함수로 플로팅되어있다. 특이적 결합 값은 3회 수행한 실험의 평균이다.

도 3A 및 3B: IGF1- 또는 IGF-2 유도된 MCF-7 성장에 대한 I-3466 항체의 시험관내 영향.

도 4A 및 4B: MCF-7 세포에서의 IGF-IR β-체인의 IGF1(도 4A) 또는 IGF2(도 4B)-유도된 인산화에 대한 I-3466 Mab의 영향.

도 5A 및 5B: HT29 세포에서의 IGF-IR β-체인의 IGF1(도 4A) 또는 IGF2(도 4B)-유도된 인산화에 대한 I-3466 Mab의 영향.

도 6A 내지 6C: DU145(도 6A), SK-ES-1(도 6B), HT29(도 6C), A549(도 6D) 및 MCF-7(도 6E) 이종이식 종양 모델에서의 I-3466의 생체내 활성.

도 7: 생쥐 I-3466(서열번호 7) 및 CDR-이식 I-3466(서열번호 20)에 의해 인간화된 경쇄 변이 부위(VL)의 아미노산 서열의 비교.

기호 *(위첨자)는 CDR 루프 형태의 유지를 위해 중요한 잔기를 나타내고 기호 #(샵)은 VL/VH 간격에서 발견된 보존된 잔기를 나타낸다.

도 8: 생쥐 I-3466(서열번호 8) 및 CDR-이식 I-3466(서열번호 21)에 의해 인간화된 중쇄 변이 부위(VH)의 아미노산 서열의 비교.

기호 *(위첨자)는 CDR 루프 형태의 유지를 위해 중요한 잔기를 나타내고 기 호 #(샵)은 VL/VH 간격에서 발견된 보존된 잔기를 나타낸다.

도 9: 정제된 I-3466 항체의 SDS-PAGE 분석. 도면의 설명은 다음과 같다.

M: 마커,

레인 1: I-3466 인간화 변이 부위,

레인 2: I-3466 생쥐 변이 부위,

패널 A: 환원 SDS-PAGE,

패널 B: 비환원 SDS-PAGE.

생쥐 및 인간화 3466에 대한 불변 부위는 인간이다.

도 10: 바이오센서 캡춰 분석의 개략도.

불변 Fc 부위에 직접적으로 대항하는 인간 IgG1 Mab는 CM5 센서 표면상에 공유결합으로 부착되었다. 테스트되어야 하는 Mab의 한계량이 고정되었고 분석물 hIGF-IR-ECD를 캡춰하기 위해 사용되었다. 분석물에 대한 Mab의 결합은 결합속도 및 해리속도 상수 Ka 및 Kd로 각각 특징된다. 평형 해리 상수(KD)는 해리 및 결합 속도 상수 사이의 비율에 의해 계산된다.

도 11: 5개의 다른 농도의 hIGF-IR-ECD에 대한 IgG1 인간화 I-345/hGF-IR-ECD 컴플렉스의 결합 및 해리 상의 센소그램.

실시예 1: 생쥐 단일클론 항체( MAb )의 생산 및 선별

IGF-IR에 특이적으로 직접 대항하고 IR을 인식하지 않는 MAb를 생산하기 위한 목적으로, 6 스크리닝 단계를 포함하는 프로토콜이 수행되었다.

이는 다음으로 구성된다:

- 하이브리도마를 생산하기 위해 인간 재조합 IGF-IR로 생쥐를 면역화시키는 단계,

- 면역화를 위해 제공된 재조합 단백질상에서 ELISA를 수행하여 배양 상등액을 스크리닝하는 단계,

- MCF-7 종양 세포의 표면상에 과발현된 자연의 수용체 상체서 ELISA를 수행하여 양성 하이브리도마의 모든 상등액을 테스트하는 단계,

- 특이적으로 IGF-IR을 인식하는 항체를 선별하기 위해 결합 실험을 수행하는 단계,

- 시험관 내에서 MCF-7 세포의 유도된 IGF1 증식을 저해할 수 있는 이 단계에서 선별된 항체를 검증하는 단계,

- 종양 MCF-7의 성장 순간에 유지된 후보자의 누드 마우스에서 생체체 활성을 확보하는 단계.

이들 다른 단계 모두 및 얻어진 결과는 하기 실시예 1에 상세하게 기재될 것이다.

면역화 단계를 수행하기 위해, 생쥐에 8 ㎍의 재조합 IGF-IR을 2회 피하 투여경로로 주입하였다. 생쥐 골수종 Sp2OAg14 세포로 비장 세포를 융합하기 3일 전에, 상기 생쥐에게 3 ㎍의 재조합 수용체를 정맥주사 주입하여 투여하였다. 융합하고 난 14일 뒤에, 하이브리도마의 상등액을 재조합 IGF-IR로 감작된 플레이트 상에서 ELISA를 이용해 스크리닝하였다. 상등액이 양성으로 확인된 하이브리도마를 FACScan 분석으로 테스트하기 전에 보존하고 증폭시켜, 자연의 IGF-IR을 인식할 수 있는 생산된 항체를 검증하였다.

실시예 2: 인간 IGF -1 수용체에 대한 [ ¹²⁵ I]- IGF 및 [ ¹²⁵ I]- IGF2 결합의 저해

멤브레인 분해물의 준비

인간 IGF-IR cDNA로 안정적으로 형질감염된 NIH 3T3 세포를 10% 우태아 혈청이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 스크래핑으로 세포를 떨어뜨리고 난 뒤, 원심분리를 통해 혈청-기근된 세포를 수득하였다. 세포 펠렛을 포스페이트 버퍼 식염수로 세척하고 용해 버퍼-프로테아제 저해제를 포함하는 10 mM Tris-HCl 버퍼 pH 7.5-로 재현탁하였다. 약 1 ml의 버퍼를 25.10⁶ 세포에 첨가하였다. 3회의 냉동-행동 사이클을 수행하고 난 뒤 포터 호모게나이저에서 1,900 rpm으로 30 스트로크를 수행함으로써 세포를 추가로 용해시켰다. 소니케이션 후, +4℃에서 15분간 1,000 g에서 원심분리하여 핵 및 큰 세포 단편을 버렸다. +4℃에서 1시간 동안 105,000 g에서 원심분리하여 전체 세포 멤브레인을 얻었다. 멤브레인 펠렛을 용해 버퍼로 세척한 뒤 +4℃에서 1시간 동안 105,000 g에서 원심분리하였다. 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL, 0.5% 트리톤 X-100, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트 및 프로테아제 저해제를 포함하는 50 mM Tris-HCl 버퍼에 최종 펠렛을 재현탁하고, +4℃에서 밤새 교반하였다. 불용성 물질은 +4℃에서 10분 동안 10,000 g에서 원심분리하여 hIGF-IR을 포함하는 수용성 추출물로부터 분리하였다. 멤브레인 용해물은 비신코니 닉(bicinchoninic) 분석으로 단백질 농도를 분석하였으며 웨스턴 블랏으로 IGF-IR을 분석하였다.

[ ¹²⁵ I]- IGF1 및[ ¹²⁵ I]- IGF2 결합 분석

IGF-IR 알파-서브유니트를 인식하는 것으로 기재된 상업적으로 사용가능한 단일클론 항체 17-69(Neomarkers, Fremont, CA, USA)를 단백질 A FlashPlate® 96-웰 마이크로플레이트(Perkin Elmer, Boston, MA, USA)에 처음으로 코팅하여 IGF-IR을 고정시켰다. 20 ㎍/ml 항체가 PBS에 들어있는 용액 200 ㎕를 각 웰에 첨가한 뒤, +4℃에서 밤새 반응시켰다. 단백질 A에 부착하지 않은 나머지 17-69를 포함하는 버퍼를 아스피레이션으로 제거하였다. 100 ㎍/ml 농도의 멤브레인 용해물 200 ㎕를 추가로 첨가한 뒤 실온에서 2시간 동안 반응시켜 IGF-IR을 고정시켰다. 캡처되지 않은 단백질은 아스피레이션으로 제거하였다. 경쟁 분석을 하기 위해, 고정된 IGF-IR에 100 pM 농도로 부착한 [¹²⁵I]-IGF1(Perkin Elmer, Boston, MA, USA) 또는 [¹²⁵I]-IGF2(Amersham Biosciences, Saclay, France)는 50 mM Hepes pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1% 소 혈청 알부민 및 1 mM PMSF를 포함하는 결합버퍼에 1 pM 내지 1 μM의 다양한 농도로 존재하는 단일클론 항체 I-3466 또는 리간드 IGF1, IGF2 및 인슐린(Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) 의 존재하에서 측정하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 Packard Top 카운트 마이크로플레이트 신실레이션 카운터 상에서 계수하였다. 이중특이적 결합은 1 μM IGF1의 존재하에서 확인하였다. hIGF-IR에 대항하지 않지만 E. coli 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 9G4를 생쥐 IgG1 동기준표본(isotype) 대조군으로 사용하였다.

결과

[¹²⁵I]-IGF1 및[¹²⁵I]-IGF2의 특이 결합 퍼센트를 반로그 그래프상의 리간드 농도 함수에 플로팅하였다. 동위원소 리간드 결합을 50% 저해하는데 요구되는 다양한 저해제의 농도(IC₅₀)은 얻어진 S자 모양의 경쟁 커브로부터 그래프로 확인하였다(도 1 및 도 2).

IGF1 및 IGF2 리간드 모두는 고정된 hIGF-IR에 대한 [¹²⁵I]-IGF1 결합을 효과적으로 치환하지만, 인슐린 및 동기준표본 대조군 항체 9G4는 500 mM 보다 낮은 농도에서도 [¹²⁵I]-IGF1 결합을 저해하지 못하였다(도 1). 단일클론 항체 I-3466은 IC₅₀ 0.021 nM로 [¹²⁵I]-IGF1의 결합을 저해할 수 있었으며(도 1), 이 농도는 비동위원소 표지된 IGF1에서 확인된 IC₅₀에 비해 30배나 더 낮았다.

게다가, 항체 I-3466은 고정된 hIGF-IR에 대해 강력한 [¹²⁵I]-IGF2 결합 저해 활성을 보였다(도 2). 이 경우, 경쟁 커브로 부터 추론된 IC₅₀ 값은 약 0.1 nM이었다. I-3466의 IGF2 블로킹 활성은 IGF2에 의해 유도된 저해 활성(IC₅₀=0.06 nM)과 유사하였다. 이는 IGF1(IC₅₀=0.02 nM)의 저해 활성보다 훨씬 낮으며, 인슐 린(IC₅₀~200 nM)의 것보다 훨씬 크다. 예측한 대로, 대조군 항체 9G4는 어떠한 IGF2 블로킹 활성도 나타내지 않았다.

실시예 3: IGF1 또는 IGF2 -유도된 MCF -7 성장에 대한 I-3466 항체의 시험관내 효과

상기에 나타낸 바와 같이, IGF-IR은 수많은 종양에 의해 과발현되지만 수많은 유방암 및 결장암에서도 증식 신호가 IGF2(때로는 IGF-2, IGF-II 또는 IGFII로도 기재됨)를 통해 이 수용체에도 주어지는 것으로 기재되었다. 따라서 MAb I-3466이 시험관 내에서 MCF-7 세포상에서 IGF1 및 IGF2-유도된 성장을 모두 저해할 수 있는지 확인하는 것은 필수적이다. 이를 수행하기 위해, 200 ㎕의 무혈청 미디움(페놀 레드가 없는 RPMI 미디움 + 1% L-글루타민)에 5 x 10⁴ 세포/웰 농도로 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅하고 난 24시간 뒤에, 최종 농도 50 ㎍/ml(6.6 mM)의 IGF1 또는 IGF-2(최종 농도 100 ng/ml(13.2 nM))를 I-3466이 존재하거나 없는 MCF-7 세포에 추가하거나 또는 생쥐 비-중화 항-IGF-IR 항체(7G3)를 거의 52시간의 추가시간 동안 동기준표본으로 사용하였다.

항체는 10 ㎍/ml(66 nM) 내지 0.0097 ㎍/ml(0.065 nM)의 최종 농도에서 테스트하였다. 그리고 난 뒤, 0.25 μCi의 [³H]티미딘으로 상기 세포를 15시간 동안 펄스한 뒤 DNA에 결합된 [³H]티미딘을 액체 신틸레이션 카운팅으로 정량화하였다. IGF-1 및 IGF-2 모두는 MCF-7 세포 성장을 유의적으로 촉진시켰다(표 2).

증가량의 동기준표본 대조군 항체로 세포를 처리하여도 유의적인 저해가 관찰되지 않았다.

반대로, 증가량의 I-3466 항체로 세포를 반응시킨 경우, IGF1(90%) 및 IGF2(84%)-유도된 증식의 유의적인 농도 의존적 저해가 각각 0.7 nM 및 0.5 nM의 IC₅₀으로 관찰되었다(표 2 및 도 3A-3B).

[표 2]

IGFa (A)- 또는 IGF2 (B)-유도된 MCF -7 성장에 대한 I-3466 항체의 시험관내 효과

실시예 4: I-3466은 IGF -R β-체인의 IGF1 - 및 IGF2 -유도된 인산화를 모두 저해함

MCF7 또는 HT29 세포를 페놀 레드가 없고 5 mM의 글루타민, 페니실린/스트렙 토마이신(각각 100 U/100 ㎍/ml) 및 10% 우태아 혈청이 혼합된 20 ml의 RPMI에 5.10⁴ 세포/cm²(75 cm² 플레이트, COSTAR) 농도로 24시간 동안 배양하였다. PBS에서 3회 세척하고 난 뒤, 상기 세포를 우태아 혈청이 없고 5 mM 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 0.5 ㎍/ml 소혈청 알부민(Sigma A8022) 및 5 ㎍/ml 트랜스페린(Sigma T8158)이 혼합되어 있고 페놀 레드가 없는 미디움(RPMI)에서 12시간 동안 배양하였다.

활성화시키기 위해, 테스트되어야 하는 블로킹 항체(10 ㎍/ml)로 세포를 37℃에서 15분 동안 첫번째 반응시켰으며, IGF1 또는 IGF2를 첨가하여 추가로 2분 동안 반응시켰다. 이 반응은 배양 미디움을 아스피레이션하고 플레이트를 얼음위에 놓음으로써 중단시켰다. 프로테아제 저해제 (50 ml 당 1 정제, Boehringer Ref: 1697 498) 및 포스파타아제 저해제(Calbiochem Ref: 524625(1/100))가 혼합된 0.5 ml의 용해 버퍼(50 mM tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트)를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포를 긁어내고, 상등액을 회수한 뒤 4℃의 쉐이커에서 1.5시간 동안 놓아두었다. 용액을 12,000 rpm에서 10분간(4℃) 원심분리하고 상등액의 단백질 농도를 BCA로 정량하였다.

면역침전시키기 위해 500 ㎍의 세포 용해물을 항-IGF-IR(Santa cruz Ref:sc-713)과 혼합하여 4℃에서 1.5시간 동안 쉐이커에서 반응시켰다. 단백질 A-아가로즈(Boehinger Ref: 1 134 515)를 첨가하여 4℃에서 밤새 쉐이커에서 반응시켜 면역 침전물을 회수하였다. 상기 아가로즈 비드를 1 ml의 용해 버퍼로 2회 세척한 뒤, 세척 버퍼 1(50 mM tris-HCl pH 7.5; 500 mM NaCl; 0.1% Nonidet P40; 0.05% 소듐 데옥시콜레이트(Boehringer 1 332 597), 프로테아제 저해제 및 포스파타아제 저해제와 혼합)로 2회, 세척 버퍼 2(50 mM tris-HCl; 0.1% Nonidet P40; 0.05% 소듐 데옥시콜레이트(Boehringer Ref: 1 332 597), 프로테아제 저해제 및 포스파타아제 저해제 1/100으로 혼합)로 1회 세척하였다. 상기 면역침전물을 램리(Laemmli) 버퍼에 재현탁하고, 100℃로 5분 동안 히팅시켰다. 상등액은 폴리아크릴아마이드 SDS 젤(8% Novex EC6015) 상에서 전기영동으로 분석하였다. 단백질을 나이트로셀룰로스 멤브레인에 트랜스퍼하여, HRP에 결합된 항-포스포타이로신 항체(BD transduction Labs PY20) 또는 IGF-IR의 베타 안티-체인(Santa Cruz Ref: sc 713)으로 반응시킨 뒤 HRP에 결합된 항-토끼 항체로 반응하셔 면역블랏시켰다. 케미루미네센스(Amersham RPN 2209)를 수행한 뒤 코닥사의 X-mat AR 필름에 오토라디오그래피를 수행해 임프린트를 표시하였다.

도 4A 및 4B는 비자극되거나(레인 1, 패널 A 및 B) 50 ng/ml IGF1 단독으로 자극되거나(레인 2, 패널 A) 또는 100 ng/ml IGF2로 자극된(레인 2, 패널 B) MCF-7 세포를 나타낸다. 예측한 대로 MCF-7 세포를 IGF1 또는 IGF2 세포로 반응시킬 때 IGF-IR β-체인의 유의적인 인산화가 관찰되는 동안 MCF-7 세포에서는 어떠한 IGF-IR 자극도 관찰되지 않았다. 세포를 IgG1 동기준표본 대조군으로 처리하거나(레인 3, 패널 A 및 B) I-3466 항체 단독으로 처리한(레인 4, 패널 A 및 B) 경우 어떠한 자극도 관찰되지 않아, I-3466은 IGF-IR 상에 어떠한 항진적 효과도 나타나지 않음을 증명한다. I-3466에 IGF1 또는 IGF2이 첨가될 때, 리간드-유도된 인산화의 경 쟁적 저해가 관찰되었다(레인 5, 패널 A 및 B). 동기준표본 대조군으로 사용된 9G4 항체는 IGF1 또는 IGF2-유도된 인산화에 어떠한 영향도 주지 않았다(레인 6, 패널 A 및 B).

I-3466과 유사한 저해 활성이 IGF1 또는 IGF2로 자극된 HT29 세포에서 관찰되었다(도 5A 및 5B). 이러한 결과는 I-3466이 IGF-IR로부터 IGF1 및 IGF2를 모두 대체할 수 있음을 보여주는 실시예 2에 기재된 것과 일치한다.

실시예 5: IGF - IR 의 세포내 이동 및 분해 실험

세포내 이동 및 분해 실험은 FACS 분석으로 분석하였다. 세포내 이동 실험은 생쥐 바이오티닐화된 항-IGF-IR 단일클론 항체(Mab)-이후로부터 12B1 Mab로 기재됨-를 이용하여, I-3466 항체에 의해 인식되는 것과는 다른 에피토프에 결합시켜 수행하였다. 9G4 Mab는 동기준표본 대조군으로서 도입하였다. 상기 항체 모두는 본 실험실에서 생산하였다. 밀집하여 자란 MCF-7 세포를 트립신처리하고, 각 세포 현탁액으로부터의 1x10⁶ 세포를 96-웰 플레이트에 FACS 버퍼에 넣어 플레이팅하였다. 상기 플레이트를 IGF1(50 ng/ml) 또는 30 ㎍/ml의 I-3466, 9G4, mIgG1으로 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다.

FACS 버퍼 단독으로 반응된 세포는 IGF-IR 발현의 기준 레벨을 결정하기 위해 사용하였다.

그리고 난 뒤 상기 세포를 2회 세척하고 20 ㎍/ml의 바이오티닐화-12B1 MAb 를 상기 플레이트에 첨가하였다. 수용체 세포내 이동을 피하기 위해 4℃에서 30분 동안 반응시키고 난 뒤, 세포를 4℃에서 3회 세척하고 스트렙타비딘 Alexa Fluor® 488-콘쥬게이트(Molecular Probe Europe BV, Leiden, Netherlands)를 첨가해 염색하였다. 분해 실험을 위해, 바이오티닐화-12B1 및 스트렙타비딘 Alexa Fluor® 488-콘쥬게이트로 세포를 염색하기전에 세포 투과 단계를 추가하였다.

표 3은 I-3466이 4시간의 반응 기간 후에 MCF-7 및 HT29 세포 모두에서 IGF-IR의 하향 조절을 유발함을 보여준다. 동기준표본 대조군으로 사용된 9G4 Mab로 반응시킨 세포에서는 어떠한 하향 조절도 관찰되지 않았다.

[표 3]

I-3466 항체에 의한 IGF-IR의 세포내 이동/분해 실험

실시예 6: DU145 , SK - ES -1, HT29 , A549 및 MCF -7 이종이식 종양 모델에서의 I-3466 Mab의 항-종양 효과

생체내 종양 성장에 대한 I-3466 항체의 활성을 검증하기 위해, 5개의 이종이식 종양 모델이 사용되었다: 안드로겐 비의존 DU145 전립선암, 골육종 SK-ES-1, 결장암 HT29, 작지않은 세포 폐암 A549 및 유방암 MCF-7. 이러한 목적을 위해, 암컷 6-8주령의 가슴샘없는 누드 마우스에 DU-145, SK-ES-1, HT29, A549 및 MCF-7 각각을 2.106, 5.10⁷, 5.10⁶, 10.10⁶ 및 5.10⁶ 농도로 피하 주입하였다. DU145 및 SK-ES-1 생쥐는 세포 주입후 24시간에 200 ㎍의 비 정제된 항체를 처리하였다.

처리는 일주일에 2회 반복하였다. HT29에 대해서는 종양 부피가 49 내지 59 mm³에 도달할때 처리를 시작하였고, 생쥐에는 0.5 mg의 정제된 항체로 일주일에 3회 ip 주입하였다.

A549에 대해서는 초기 종양 부피가 38 내지 43 mm³이고, MCF-7 실험에 대해서는 초기 종양 부피가 42 내지 59 mm³ 일때 처리를 시작하였다. 종양 부피는 일주일에 1회 또는 2회 측정하였고 하기 식에 따라 계산하였다: π/6 x 길이 x 넓이 x 높이.

실시예 7: 인간화 I-3466 IgG1 항체의 클로닝 , 생산 및 특성분석

인간화 항체 I-3466의 경쇄 ac 중쇄에 대한 화학적으로 합성된 번이 부위를 PCR 증폭하고, 인간 경쇄 카파 및 중쇄 IgG1 불변 부위를 각각 포함하는 항체 발현 벡터에 클로닝하였다. PCR 프라이머는 벡터 오버랩핑 클로닝 부위와 어닐링하는 인퓨전에 대한 15 뉴클레오타이드 및 변이 부위와 어닐링하는 21 뉴클레오타이드를 갖는 36 뉴클레오타이드를 포함한다. 구체적인 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:

경쇄 변이 부위 클로닝을 위해:

IF-인간화 I-3466-LCK-F(서열번호 21)

[5'-ACAGATGCCAGATGCGACATTGTGATGACCCAGTCC],

IF-인간화 I-3466-LCK-R(서열번호 22)

[5'-TGCAGCCACCGTACGCTTGATCTCCACCTTGGTGCC],

중쇄 변이 부위 클로닝을 위해:

IF-인간화 I-3466-HCG1-F(서열번호 23)

[5'-ACAGGTGTCCACTCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT],

IF-인간화 I-3466-HCG1-R(서열번호 24)

[5'-GCCCTTGGTGGATGCGGAGGAGACTGTCACCAGGGT].

상기 벡터를 BmtI 및 FspI으로 절단하여 선형화하였다. 인-퓨전 반응은 판매자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 제조된 클론은 시퀀싱으로 확인하였다. 인간 배아 신장 293 세포는 경쇄 및 중쇄 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 분비된 항체를 포함하는 미디움을 수득한 뒤 농축하였다. 상기 항체는 단백질 A/G 컬럼을 이용하여 친화 정제하였고 농축한 뒤 PBS에서 투석하였다. 단백질 농도는 OD280 nm에서 확인하고, 정제도는 환원 및 비-환원 SDS-PAGE을 이용하여 분석하였다(도 9).

실시예 8: 인간화 I-3466 IgG1 항체의 BIACore 분석

장비 및 실험재료

BIAcore T100 장비, CM5 바이오센서 칩, HBS-EP 버퍼, 아세테이트 버퍼(pH 5), 글리신-HCl 버퍼(pH 1.5), BIAcore로부터의 아민 커플링 킷트(Upsala, Sweden). Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc사의 항-인간 IgG Fc(West Grove, USA), 수용성 인간 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(hIGF-IR), R&D 시스템사의 세포외 도메인(ECD)(Minneapolis, USA).

Biacore 분석

모든 실험은 25℃에서 40 ㎕/분의 흐름 속도에서 수행하였다. BIAcore 분석을 준비하기 위해(참고 도 10), 항-인간 IgG-Fc 항체(아세테이트 버퍼에 50 ㎍/ml 농도로 존재, pH 5)를 제조사의 방침에 따른 아민 커플링 방법을 이용하여 카복시메틸 덱스트란 센서칩(CM5)에 고정시켰다. 항-IgG Fc 항체의 11042 및 11111 공명 단위(resonance unit, RU) 각각은 플로우셀(FC) 1 및 3에 결합되었다. 테스트되어야 하는 정제된 Mabs는 0.5% P20, HBS-EP 버퍼에 5 ㎍/ml 농도로 희석하고, 500 내지 1000 RU에 도달할 때 까지 FC3 상에 주입하였다. FC1은 참조셀로서 사용되었다. 다른 신호에 상응하는 특이 신호는 FC2 대 FC1에서 얻어졌다. 분석물(수용성 hIGF-IR, 대략 분자량 365 kDa)을 0.5% P20, HBS-EP 버퍼에 5개의 다른 농도(100, 50, 25, 12.5 및 6.25 nM)로 90초 동안 주입하였다. 이러한 농도는 0.5% P20, HBS-EP 버퍼에 있는 농축 용액으로부터 준비하였다. 상기 분석물의 분해 과정은 10분 이상 동안 모니터하였다. 각 사이클(항체 + hIGF-IR 주입)을 수행하고 난 뒤, 플로우셀 모두는 20 내지 45 ㎕의 글리신-HCl 버퍼(pH 1.5)를 주입하여 재생하였다. 이 재생은 센서칩 상에 캡춰된 모든 Mabs 및 Mabs/hIGF-IR 컴플렉스을 제거하기에 충분하다.

결과

분석물 hIGF-IR-ECD에 대한 Mab 인간화 I-3466의 결합은 결합 및 분해 속도 상수 Ka 및 Kd 각각으로 확인하였다. 평형 분해 상수(KD)는 분해 및 결합 속도 상수 간의 비율로 계산하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 다른 농도의 분해물에 대한 센소그램은 도 11에 나타나 있다.

<110> Pierre Fabre Medicament <120> Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof <130> D23693 <140> PCT/2006/064543 <141> 2006-07-21 <150> FR 05/07829 <151> 2005-07-22 <150> US 60/701,622 <151> 2005-07-22 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Asn Asn Tyr Ile Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro Arg Ala 1 5 10 15 Trp Phe Thr Tyr 20 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 129 <212> PRT <213> mus musculus <400> 8 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro 100 105 110 Arg Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ala <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> mus musculus <400> 9 aaatccagtc agagtctact cgacagtaga acccgaaaga actacttggc t 51 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> mus musculus <400> 10 aataactata tcatgtct 18 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> mus musculus <400> 11 tgggcatcca ctagggaatc t 21 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> mus musculus <400> 12 accattagtg gtggtggtag ttataccttc tatccagaca gtgtgaaggg a 51 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> mus musculus <400> 13 aagcaatctt ataatctgtt cacg 24 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> mus musculus <400> 14 aatcaattac ttactgggat gatcaatccc ctgactacgc ctagagcctg gtttacttac 60 60 <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> mus musculus <400> 15 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgaactgca aatccagtca gagtctactc gacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 ttcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 16 <211> 387 <212> DNA <213> mus musculus <400> 16 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctaaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcaat aactatatca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtagtta taccttctat 180 ccagacagtg tgaagggacg attctccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt atttctgtac aaggaatcaa 300 ttacttactg ggatgatcaa tcccctgact acgcctagag cctggtttac ttactggggc 360 caagggactc tggtcactgt ctctgca 387 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody, light chain <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody, heavy chain <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro 100 105 110 Arg Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 19 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody, light chain <400> 19 gacattgtga tgacccagtc ccctgactcc ctggctgtct ccctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca agtcctccca gtccctgctg gactcccgga cccggaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaagcctgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc ctccacccgg 180 gagtctggcg tgcctgaccg gttctctggc tctggctctg gcacagactt caccctgacc 240 atctcctccc tgcaggctga ggatgtggct gtctactact gcaagcagtc ctacaacctg 300 ttcacctttg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336 <210> 20 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody, heavy chain <400> 20 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgac ctggtgcagc ctggcggctc cctgcggctg 60 tcctgtgctg cctctggctt caccttcaac aactacatca tgtcctgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atctctggcg gcggctccta caccttctac 180 cctgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggctgaggac acagctgtct acttctgcac ccggaaccag 300 ctgctgacag gcatgatcaa ccccctgacc accccccggg cctggttcac ctactggggc 360 cagggcaccc tggtgacagt ctcctcc 387 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IF-Humanized I-3466-LCK-F primer for humanized antibody I-3466 light chain amplification <400> 21 acagatgcca gatgcgacat tgtgatgacc cagtcc 36 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IF-Humanized I-3466-LCK-R primer for humanized antibody I-3466 light chain amplification <400> 22 tgcagccacc gtacgcttga tctccacctt ggtgcc 36 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IF-Humanized I-3466-HCG1-F primer for humanized antibody I-3466 heavy chain amplification <400> 23 acaggtgtcc actcggaggt gcagctggtg gagtct 36 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IF-Humanized I-3466-HCG1-R primer for humanized antibody I-3466 heavy chain amplification <400> 24 gcccttggtg gatgcggagg agactgtcac cagggt 36

Claims

인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)에 대한 결합 친화도를 가지는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편으로서, 이것이 상기 IGF-IR에 결합하는 동안, 음성 결합 파트너 IGF1이 상기 IGF-IR에 결합하는 것을 0.3 nM 미만, 바람직하게는 0.03 nM 미만의 IC₅₀으로 저해하며, 음성 결합 파트너 IGF2가 상기 IGF-IR에 결합하는 것을 0.3 nM 미만, 바람직하게는 0.1 nM 미만의 IC₅₀으로 저해하는 것을 특징으로 하는, 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR)의 티로신 키나아제 저해 활성을 가지는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편으로서, 이것이 상기 IGF-IR에 결합하는 동안, 음성 결합 파트너 IGF1이 상기 IGF-IR에 결합하는 것을 0.3 nM 미만, 바람직하게는 0.03 nM 미만의 IC₅₀으로 저해하며, 음성 결합 파트너 IGF2가 상기 IGF-IR에 결합하는 것을 0.3 nM 미만, 바람직하게는 0.1 nM 미만의 IC₅₀으로 저해하는 것을 특징으로 하는, 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, IGF1 및/또는 IGF2 유도된 IGF-IR 베타-체인의 인산화를 100% 저해할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 길항체 내재 활성도 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 FACS 분석 방법을 사용하여 하기를 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편:

i) HT29 세포 상에서 IGF-IR의 최소 30%가 세포내 이동; 및/또는

ii) MCF-7 세포 상에서 IGF-IR의 최소 85%가 세포내 이동.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 FACS 분석 방법을 사용하여 하기를 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편:

i) HT29 세포 상에서 IGF-IR의 최소 50%가 세포내 이동; 및/또는

ii) MCF-7 세포 상에서 IGF-IR의 최소 65%가 세포내 이동.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 IGF1- 및 IGF2- 모두 유도된 MCF-7 세포의 증식을 최소 1 nM의 IC₅₀으로 저해하고, 바람직하게는 IGF1 및 IGF2 대해 각각 0.7 및 0.5 nM의 IC₅₀으로 저해할 수 있는 것을 특징 으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 3 또는 5 서열의 CDRs로부터 선택된 최소한 하나의 상보성 결정 부위 CDR, 또는 서열번호 1, 3 또는 5 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%의 서열 동일성을 가진 최소한 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하거나, 또는 서열번호 2, 4 또는 6 서열로부터 선택된 최소한 하나의 CDR, 또는 서열번호 2, 4 또는 6 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%의 서열 동일성을 가진 최소한 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 4 및 6 서열의 3개의 CDRs 또는 이 3개 중에 최소한 2개를 포함하거나, 서열번호 2, 4 및 6 서열로 최적 정렬화되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 각각 갖는 3개의 CDRs 또는 이 3개 중에 최소한 2개를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 3 및 5 서열의 3개의 CDRs 또는 이 3개 중에 최소한 2개를 포함하거나, 서열번호 1, 3 및 5 서열로 최적 정렬화되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 각각 갖는 3개의 CDRs 또는 이 3개 중에 최소한 2개를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또 는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 4 및 6 서열의 3개의 CDRs, 또는 서열번호 2, 4 및 6 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%의 서열 동일성을 가진 3개의 CDRs을 포함하는 중쇄를 포함하며, 서열번호 1, 3 및 5 서열의 3개의 CDRs, 또는 서열번호 1, 3 또는 5 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소한 80%의 서열 동일성을 가진 3개의 CDRs을 포함하는 중쇄를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 인슐린 수용체(IR)에 유의적으로 부착하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 및 디아보디(diabodies) 단편, 또는 페길레이트화 단편과 같이 이의 반감기가 증가된 모든 단편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 기능적 면역 단편.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마.
제 14 항에 있어서, 2005년 6월 23일에 CNCM, Institut Pasteur, Paris에 번호 I-3466으로 기탁된 것을 특징으로 하는 생쥐 하이브리도마.
제 15 항의 하이브리도마에 의해 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
제 1 내지 13 항 또는 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 서열 또는 서열번호 7 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열의 경쇄, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 서열 또는 서열번호 8 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열의 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
제 17 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체이고, 생쥐와는 이종인 종의 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄 불변 부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
제 18 항에 있어서, 상기 이종인 종은 인간인 것을 특징으로 하는 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
제 17 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄 불변 부위는 각각 카파 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위인 것을 특징으로 하는 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18 서열로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
제 21 항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분비된 항체 또는 이의 기능적 단편.
하기 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산:

a) 제 1 항 내지 제 13 항 및 제 16 항 내지 제 22 항 중의 한 항의 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;

b) 상기 a)에 정의되 바와 같은 핵산의 상보적 핵산;

c) 서열번호 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 서열의 CDRs 중의 최소한 한개, 또는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80% 의 동일성을 가진 서열과 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화 할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드의 핵산;

d) 최소한 서열번호 15의 핵산 서열의 경쇄 및/또는 서열번호 16의 핵산 서열의 중쇄, 또는 서열번호 15 및/또는 16으로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 가진 서열과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화 할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드의 핵산; 및

e) 최소한 서열번호 19의 핵산 서열의 경쇄 및/또는 서열번호 20의 핵산 서열의 중쇄, 또는 서열번호 19 및/또는 20으로 최적으로 정렬되고 난 뒤 최소 80%의 동일성, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 가진 서열과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화 할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드의 핵산
제 23 항의 핵산을 포함하는 벡터.
제 24 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 25 항의 벡터에 의해 형질전환된 최소한 1개의 세포를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환 동물.
하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 13 항 및 제 16 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나의 생산 방법:

a) 제 25 항의 세포를 적절한 배양 조건에서 배양 배지에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 배양된 세포 또는 배지로부터 생산되기 시작한 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 회수하는 단계.
제 27 항의 방법에 의해 수득될 수 있는, 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항에 있어서, 티로신 키나아제 패밀리의 인간 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고/또는 이러한 수용체의 티로신 키나아제 활성을 저해할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 29 항에 있어서, 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR)로의 EGF의 결합 및/또는 상기 EGFR의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 제2 모티프를 포함하는 특이적 항체로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 30 항에 있어서, 상기 제2 항-EGFR 모티프는 생쥐 단일클론 항체 225, 이 의 키메라 유도체 C225 또는 이 항체 225로부터 유도된 모든 인간화 항체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 29 항에 있어서, HER2/neu 수용체에 의해 조절되는 활성 및/또는 상기 HER2/neu 수용체의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 제2 모티프를 포함하는 특이적 항체로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 32 항에 있어서, 상기 제2 항-HER2/neu 모티프는 생쥐 단일클론 항체 4D5 또는 2C4, 또는 인간화 항체 Trastuzumab 또는 Pertizumab로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 29 항에 있어서, cMET 수용체로의 간세포 성장 인자(HGF)의 결합 및/또는 상기 cMET 수용체의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 제2 모티프를 포함하는 특이적 항체로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 29 항에 있어서, RON 수용체로의 대식세포 자극 단백질(MSP)의 결합 및/또는 상기 RON 수용체의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 제2 모티프를 포함하는 특이적 항체로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기 능적 단편 중의 하나.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22항 및 제 28 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항에 있어서, VEGFR, FGF(섬유아세포 성장 인자) 또는 CXCR4 또는 2(케모카인 수용체 타입 4 또는 2)와 같은 종양의 발생에 연관되어 있는 모든 종류의 수용체와 상호작용할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 28 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 모티프는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', Fab'PEG, scFv, scFv-Fc 및 디아보디(diabodies) 단편, 또는 이의 반감기가 증가된 모든 단편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나가 약물로서 용도인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나로 구성되는 화합물을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 39 항에 있어서, 상기 조성물은 IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET 및/또는 RON의 티로신 키나아제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 화합물로부터 선택되는 최소한 제2의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 40 항에 있어서, 상기 제2 화합물은 분리된 항-EGFR, -IGF-IR, -HER2/neu, -cMET 및/또는 -RON 항체 또는 이의 기능적 단편으로부터 선택되고, 상기 수용체(들)에 의해 유도되는 증식 활성 및/또는 항-아폽토시스/또는 혈관신생형성 활성 및/또는 전이성 전염 유발 활성을 저해할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 동시적, 개별적 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 산물로서, IR, IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET 및/또는 RON의 티로신 키나아제 활성의 저해제를 최소한 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 42 항에 있어서, 상기 티로신 키나아제 활성의 저해제는 유도된 자연 제제, 디아닐리노프탈리미드(dianilinophthalimides), 피라졸로(pyrazolo)- 또는 피롤로피리도피리미딘(pyrrolopyridopyrimidines) 또는 퀴나질린(quinazilines)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 39 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 동시적, 개별적 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 산물로서 세포독성제/세포증식 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 44 항에 있어서, 상기 세포독성제/세포증식 억제제는 DNA와 결합한 제제, 항대사물질, 토포이소머라제(topoisomerase) I 또는 II 저해제, 또는 방추(spindle) 저해제 또는 안정화제 또는 화학치료에 사용될 수 있는 모든 제제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 44 항 또는 제 45 항에 있어서, 상기 세포독성제/세포증식 억제제는 동시적으로 사용하기 위해 상기 조성물의 최소한 한가지 성분에 화학적으로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제/세포증식 억제제는 방추 저해제 또는 안정화제, 바람직하게는 비노렐빈(vinorelbine), 빈플루닌(vinflunine) 또는 빈크리스틴(vincristine)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 39 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중 최소한 하나는 세포 톡신 및/또는 방사성원소와 결합되어 있는 것을 특 징으로 하는 조성물.
제 39 항 내지 제 48 항 중 어느 한항에 있어서, 이들 청구항의 조성물이 약물의 용도를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
IGF-IR의 과발현 및/또는 비정상 활성화와 연관이 있고/또는 IGF-IR과 IGF1 또는 IGF2의 상호작용에 의해 유도되는 신호 전달 과정의 과활성화와 연관이 있는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 기능적 단편, 및/또는 제 39 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
제 50 항에 있어서, 상기 약물의 투여는 인슐린 수용체 IR의 저해와 관련된 부작용을 유발하지 않거나 미약하게만 유도하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 약물의 제조는 종양 특성을 가진 세포로의 정상 세포의 형질 전환 및/또는 종양 세포, 바람직하게는 IGF-의존성, 최소한은 IGF2-의존성 세포의 증식을 저해하도록 유도하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물의 제조는 암의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 용도.
제 53 항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁 내막암, 다발성 경화증, 난소암 또는 결장암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 54 항에 있어서, 상기 암은 결장암인 것을 특징으로 하는 용도.
제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물의 제조는 건선 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 용도.
IGF-IR/항체 컴플렉스의 형성이 유리한 조건하에서, 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체로, IGF-IR을 포함하는 것으로 예측되는 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플에 있는 IGF-IR의 존재를 나타냄으로써 상기 컴플렉스를 검출하는 단계를 포함하는, 정상에 비해 IGF-IR의 발현이 비정상적인 것을 특징으로 하는 병리학적 상태의 시험관내 진단 방법.
제 57 항에 있어서, 상기 항체는 검출가능하게 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
제 57 항 또는 제 58 항에 있어서, 상기 IGF-IR의 비정상적인 발현은 IGF-IR의 과발현인 것을 특징으로 하는 방법.
제 57 항 또는 제 58 항에 있어서, 상기 IGF-IR의 비정상적인 발현은 IGF-IR의 저발현인 것을 특징으로 하는 방법.
하기 단계를 포함하는, 전립선 세포 샘플의 종양형성 잠재성을 예측하기 위한 진단 방법:

(a) 인간 폐 또는 가슴 조직 샘플을 제공하는 단계; 및

(b) 샘플에 있는 IGF-IR의 존재를 확인하는 단계, 상기 단계는 IGF-IR/항체 컴플렉스의 형성이 유리한 조건하에서, 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체로, 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 컴플렉스의 존재는 상기 조직에 있는 상기 세포의 종양형성 잠재성을 나타내는 것을 특징으로 함.
제 61 항에 있어서, 상기 컴플렉스의 존재는 환자가 상기 IGF-IR의 과발현으로 특징되는 병리학적 질환의 진행 또는 시작의 위험에 있다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 단계를 포함하는, IGF-IR이 비정상적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 병리학적 질환을 완화하기 위해 디자인된 치료학적 계획의 과정을 뒤따르는 방법:

(a) 첫번째 포인트에서, 환자로부터의 샘플을 분석하여 IGF-IR의 레벨을 확인하는 단계;

(b) 두번째 포인트에서, 상기 샘플을 분석하는 단계; 및

(c) 상기 치료학적 계획의 효과를 확인하기 위해 상기 두번째 포인트에서의 레벨을 단계 (a)에서 확인된 레벨과 비교하는 단계로서, 상기 샘플에 있는 IGF-IR의 레벨의 감소는 상기 환자에 있는 병리학적 질환의 감소의 결정요인이거나, IGF-IR의 레벨의 증가는 상기 환자에 있는 병리학적 질환의 진행의 결정요인임.
IGF-IR의 과발현 또는 저발현에 의해 유도되는 질병의 진단 방법을 수행하거나, 생물학적 샘플에 있는 IGF-IR의 과발현 또는 저발현, 바람직하게는 상기 수용체의 과발현을 검출 및/또는 정량하기 위한 과정을 수행하기 위한 킷트 또는 세트로서, 상기 킷트 또는 세트는 하기의 구성성분을 포함하는 것을 특징으로 함:

a) 제 1 항 내지 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체 또는 이의 기능적 단편중 하나;

b) 선택적으로, 면역학적 반응을 할 수 있는 미디움을 형성하기 위한 제제;

c) 선택적으로, 면역학적 반응에 의해 생산된 IGF-IR/항체 컴플렉스를 증명할 수 있게 하는 제제.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체 또는 이의 기능적 단편 중 하나의, IGF-IR을 발현 또는 과발현하는 세포에 생물학적 화성 화합물을 특이적으로 표적하기 위한 약물을 제조하기 위한 용도
비-IGF-IR 반응 세포에 비해 상기 IGF-IR의 활성을 충분히 조절할 수 있는 조건하에서 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체로 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, IGF-IR-반응성 포유동물 세포에 있는 IGF-IR 활성을 조절하는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체로 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, IGF-IR-반응성 포유동물 세포에 있는 IGF-IR 활성을 정상 세포에 비해 감소시키는 방법.
하기 단계를 포함하는 IGF-IR 조절자의 확인 방법:

a) 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체로 IGF-IR을 접촉시키는 단계;

b) 상기 단계 (a)의 컴플렉스를 화합물 라이브러리와 접촉시키는 단계;

c) 상기 단계 (a)의 컴플렉스를 파괴하는 화합물을 확인하는 단계; 및

d) 상기 화합물이 IGF-IR에서 길항제 또는 항진제 활성을 나타내는지 확인하는 단계, 여기서 이 활성은 IGF-IR 조절자의 확인을 나타냄.
제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체에 대한 결합 파트너를 검출하는 방법으로서, 이 방법은 하기 단계를 포함함: a) 항체가 이의 결합 파트너에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 충분한 조건 하에서, 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체를, 인간 IGF-IR의 비정상적인 발현 레벨 및/또는 활성을 특징으로 하는 세포 증식성 질환을 나타내는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플과 반응시키는 단계 및 b) 특이적 결합을 검출하는 단계, 상기 특이적 결합은 샘플에 있는 결합 파트너의 존재를 나타냄.
하기 단계를 포함하는, 샘플로부터 IGF-IR의 정제 방법: a) 항체 및 수용체의 특이적 결합을 가능하게 하는 조건하에서, 제 1 항 내지 제 13 항, 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 28 항 내지 제 38 항의 항체를 샘플과 반응시키는 단계, 및 b) 샘플로부터 항체를 분리하고 정제된 수용체를 수득하는 단계.