MX2008000964A

MX2008000964A - Anticuerpos anti-receptor de factor de crecimiento similar a la insulina-i novedosos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2008000964A
Application number: MX2008000964A
Authority: MX
Inventors: Liliane Goetsch; Nathalie Corvaia
Original assignee: Pf Medicament
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2008-03-27
Also published as: IL188712A0; FR2888850A1; US20090265797A1; ZA200800636B; US8361461B2; BRPI0613642A2; RU2434882C2; GT200600324A; CA2616099A1; EP1907426B1; WO2007012614A3; US8945871B2; KR101343928B1; CA2616099C; KR20080032117A; AU2006274086B2; EP1907426A2; CN101238149B; NZ565248A; JP2009502129A

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos novedosos capaces de unirse especificamente al receptor de factor de crecimiento similar a insulina-I humana (IGF-IR); la invencion tambien comprende el uso de estos anticuerpos como un medicamento para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de canceres que sobreexpresan IGF-IR, estimulando ya sea por IGF1 y/o IGF2, o cualquier patologia conectada con la sobreexpresion de dicho receptor asi como en procedimientos o equipos para diagnostico de enfermedades conectadas con la sobreexpresion del IGF-IR y/o el receptor hibrido de IGF-I/insulina.

Description

ANTICUERPOS ANTI-RECEPTOR DE FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA-I NOVEDOSOS Y USOS DE LOS MISMOS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a anticuerpos novedosos capaces de unirse específicamente al receptor de factor de crecimiento similar a insulina-l humana (IGF-IR) y/o capaces de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho IGF-IR, especialmente anticuerpos monoclonales de origen de murino, quimérico y humanizado, así como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican para estos anticuerpos. En un aspecto particular, la invención se refiere a anticuerpos novedosos capaces de inhibir eficientemente no sólo la unión del ligando IGF1 a IGF-IR sino también inhibir eficientemente la unión del otro ligando, es decir, IGF2, al mismo receptor. La invención asimismo comprende el uso de estos anticuerpos como un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cánceres que sobreexpresan IGF-IR, estimulado ya sea por IGF1 y/o IGF2, o cualquier patología conectada con la sobreexpresión de dicho receptor así como en procedimientos o equipos para diagnóstico de enfermedades conectadas con la sobreexpresión del IGF-IR y/o el receptor híbrido de IGF-l/insulina. La invención finalmente comprende productos y/o composiciones que comprenden dichos anticuerpos en combinación con, por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR y/o compuestos y/o agentes anticancerosos o agentes conjugados con toxinas y su uso para la prevención y/o el tratamiento de ciertos cánceres. El receptor de factor de crecimiento similar a insulina-l llamado IGF-IR es un receptor con actividad de tirosina cinasa que tiene 70% de homología con el receptor de insulina IR. El IGF-IR es una glicoproteína de peso molecular de aproximadamente 350,000. Es un receptor hetero-tetramérico del cual cada mitad - enlazada por puentes de disulfuro - está compuesta de una subunidad a extracelular y de una subunidad ß de transmembrana. El IGF-IR se une a IGF1 y IGF2 con una afinidad muy alta (Kd #1 nM) pero es igualmente capaz de unirse a la insulina con una afinidad 100 a 1000 veces menor. Por el contrario, el IR se une a la insulina con una afinidad muy alta, aunque los IGFs sólo se unen al receptor de insulina con una afinidad 100 veces más baja. El dominio de tirosina cinasa de IGF-IR y de IR tiene una homología de secuencia muy alta aunque las zonas de homología más débil respectivamente conciernen a la región rica en cisteína situada en la subunidad a y la parte C-terminal de la subunidad ß. Las diferencias de secuencia observadas en la subunidad a están situadas en la zona de unión de los ligandos y por lo tanto están en el origen de las afinidades relativas de IGF-IR y de IR para los IGFs e insulina respectivameníe. Las diferencias en la parte C-terminal de la subunidad ß dan por resultado una divergencia en las vías de señalización de los dos receptores; El IGF-IR media los efectos mitogénicos, de diferenciación y antiapoptosis, mientras que la activación del IR principalmente implica efectos al nivel de las vías metabólicas (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999). Las proteínas de tirosina cinasa citoplásmicas son activadas por la unión del ligando al dominio extracelular del receptor. La activación de las cinasas a su vez implica la estimulación de diferentes sustratos intra-celulares, incluyendo IRS-1 , IRS-2, She y Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). Los dos sustralos IGF-IR son IRS y She que median, por la activación de numerosos efectores hacia el extremo 3', la mayoría de los efectos de crecimiento y diferenciación conectados con la unión de los IGFs a este receptor. La disponibilidad de sustratos consecuentemente puede determinar el efecto biológico final conectado con la activación del IGF-IR. Cuando IRS-I predomina, las células tienden a proliferar y a transformarse. Cuando She domina, las células tienden a diferenciarse (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274:12423-12430, 1999). Parece ser que la vía principalmente implicada por los efectos de protección contra apoptosis es la vía de fosfatidil-inositol 3 -cinasas (Pl 3 -cinasas) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31 :80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). El papel del sistema IGF en carcinogénesis ha sido el tema de investigación intensiva en los últimos diez años. Este interés siguió al descubrimiento del hecho de que además de sus propiedades mitogénicas y antiapoptosis, IGF-IR parece ser requerido para el establecimiento y el mantenimiento de un fenotipo transformado. De hecho, se ha establecido bien que una sobreexpresión o una activación constitutiva de IGF-IR conduce, en una gran variedad de células, a un crecimiento de las células independientes del soporte en medios desprovistos de suero de ternera fetal, y a la formación de tumores en ratones sin pelo. Esa, como tal, no es una propiedad única ya que una gran variedad de productos de genes sobreexpresados pueden transformar células, incluyendo un buen número de receptores de factores de crecimiento. Sin embargo, el descubrimiento crucial que ha demostrado claramente el principal papel desempeñado por IGF-IR en la transformación ha sido la demostración de que las células R, en las cuales el gen que codifica para IGF-IR ha sido inactivado, son totalmente refractarios a la transformación por difereníes ageníes que usualmeníe son capaces de transformar las células, tales como la proteína E5 de virus de papiloma de bovino, una sobreexpresión de EGFR o de PDGFR, el antígeno T de SV 40, ras activado o la combinación de estos dos últimos factores (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11217-11221 , 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69:5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164:214-221 , 1995). El IGF-IR se expresa en una gran variedad de tumores y de líneas tumorales y los IGFs amplifican el crecimiento tumoral mediante su unión a IGF-IR. Otros argumentos en favor del papel del IGF-IR en carcinogénesis proviene de estudios que usan anticuerpos monoclonales de murino dirigidos contra el receptor o que usan dominantes negalivos de IGF- IR. En realidad, los anticuerpos monoclonales de murino dirigidos contra IGF-IR inhiben la proliferación de numerosas líneas celulares en cultivo y el crecimiento de células tumorales in vivo (Arteaga C. et al., Cáncer Res., 49:6237-6241 , 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia F. et al., J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996; Scotlandi K. et al., Cáncer Res., 58:4127-4131 , 1998). Asimismo, se ha mostrado en los trabajos de Jiang et al. (Oncogene, 18:6071-6077, 1999) que un dominante negativo de IGF-IR es capaz de inhibir la proliferación tumoral. Se han descrito anticuerpos capaces de unirse específicamente al IGF-IR y se han presentado varias solicitudes de patente. Como un ejemplo, se puede mencionar la solicitud de pateníe WO 03/059951 , presenlada por el solicitante, en donde se describe un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a IGF-IR, llamado 7C10. Se pueden mencionar otras solicitudes de patente como WO 02/053596 (PFIZER INC. y ABGENIX INC.), WO 03/100008 (SCHERING CORPORATION) o WO 03/106621 (IMMUNOGEN INC.). Todas estas solicitudes reclaman anticuerpos capaces de unirse específicamente al IGF-IR y/o de inhibir su actividad. Aunque se considera como una propiedad evidente para cada uno de estos anticuerpos, nada en la especificación de estas solicitudes demuestra claramente que estos anticuerpos son capaces de inhibir eficientemente la unión de ambos ligandos naturales a IGF-IR y, muy particularmente la unión IGF2 a IGF-IR. Datos in vitro tales como la inhibición de proliferación IGF1 e IGF2 inducida se mostraron en estas solicitudes y demostraron que los anticuerpos descritos son capaces de inhibir eficientemente la proliferación inducida tanto por IGF1 como por IGF2. Sin embargo, puesto que la parte principal de los anticuerpos descritos desplegó la capacidad de inducir una regulación descendente parcial de IGF-IR, no es evidente que las propiedades antiproliferativas estén directamente enlazadas a un desplazamiento tanto de IGF1 como de IGF2 de IGF-IR. En realidad, por ejemplo, los datos mostrados en WO 03/106621 únicamente tratan con IGF1 y bajo ninguna circunstancia con una inhibición eventual de la unión de IGF2 a IGF-IR (véase ejemplo C, páginas 33-35 y figura 3, y ejemplo D, páginas 35-37 y figuras 4-6). Las mismas observaciones se pueden hacer para WO 02/053596 (véase ejemplo IV, página 78-79 y figura 3, y ejemplo Vil, página 82 y figura 4). Entre todas las solicitudes de pateníe acíualmenle ideníificadas que descpben el descubrimiento de anticuerpos monoclonales o recombinantes dirigidos contra el IGF-IR humano (hIGF-IR), sólo dos de ellas (WO 2004/087756 y WO 2005/005635) muestran realmente una eficacia de los anticuerpos, respectivamente AK1a y AK18, para inhibir la unión de [125I]IGF2 a hIGF-IR. El procedimiento experimental, idéntico en ambos casos, se basa en unión de competencia en células intactas de adenocarcinoma colorrectal humano (HT29). Aunque el procedimiento descpto es sólido, no se presentan controles positivos tales como compeíencia por ligandos de hIGF-IR naturales (IGF1 e IGF2), lo que hace que los datos sobre unión de competencia sean sospechosos. Por otra parte, sólo se mostró competencia incompleta (máximamente 80 % de inhibición de unión de [125I]IGF2 tanto para anticuerpo AK1 a como AK18), incluso a una concentración de anticuerpo alta, lo que hace al desarrollo de anticuerpos más eficaces necesario para eficacia terapéutica incrementada en humanos. Un último punto controvertido concerniente a la inhibición putativa de respuestas mediadas por IGF2 por AK1a y AK18 es la ausencia de ejemplos que muestren una inhibición de señalización estimulada por IGF2 funcional mediada por hIGF-IR. De hecho, aun cuando la competencia de unión de IGF2 está ocurriendo, debe estar asociada con una inhibición concomitante de señalización de hIGF-IR hacia el extremo 3' y tal evidencia debe ser ejemplificada para proveer evidencia mnecanística para eficacia funcional de anticuerpo. El objeto de la presente invención es poder tener disponible un anticuerpo monoclonal de murino, preferiblemente un anticuerpo quimerizado o humanizado, que reconocerá IGF-IR específicamente con gran afinidad y que también puede inhibir no sólo la unión de IGF1 a IGF-IR sino también la unión de IGF2 a IGF-IR. Este anticuerpo interactuará poco o nada en absoluto con el IR. Su unión podrá inhibir el crecimiento in vitro de líneas celulares que sobreexpresan IGF-IR al interactuar principalmente con las vías de transducción de señal activadas durante las interacciones IGF1/IGF-IR y IGF2/IGF-IR. Este anticuerpo podrá ser activo in vivo sobre todos los tipos de tumores que expresan IGF-IR incluyendo tumores de mama dependientes de estrógeno y tumores de próstata, que no es el caso para los anticuerpos monoclonales de anti-IGF-IR (escritos MAb o MAB) actualmeníe disponibles. De hecho, alR3, que se refiere al dominio de IGF-IR, inhibe totalmente el crecimiento de tumores de mama dependientes de estrógeno (MCF-7) in vitro pero no tiene efecto sobre el modelo correspondiente in vivo (Arteaga C. et al., J. Clin. Invest. 84:1418-1423, 1989). De la misma forma, el fragmento scFv-Fc derivado del 1 H7 monoclonal de murino sólo es débilmente activo sobre el íumor de mama MCF-7 y lolalmenle inactivo sobre un tumor de próstata independiente de andrógeno (Li S. L. et al., Cáncer Immunol. Immunother., 49:243-252, 2000). De manera sorprendente, los inventores de la presente han generado un anticuerpo monoclonal de murino descrito como 1-3466, que reconoce IGF-IR y correspondiendo a todos los criterios anteriormeníe indicados, es decir a un reconocimienío del receptor sobre la insulina, a un bloqueo in vitro del IGF1 y particularmente la proliferación de IGF2 inducida pero también a la inhibición in vivo del crecimiento de diferentes tumores que expresan IGF-IR entre los cuales están un osteosarcoma y tumores de próstata. Además, se ha mostrado que estos anticuerpos inhiben la fosforilación inducida por IGF1 y/o IGF2 de la tirosina de la cadena beta de IGF-IR tanto sobre células MCF-7 como HT29. Más aún, también se ha establecido que estos anticuerpos causan la ¡nternalización de dicho receptor y su degradación contraria a lo que usualmente se observa con ligandos naturales que permiten el rápido reciclaje del receptor sobre la superficie de las células. Ha sido posible caracterizar estos anticuerpos por su secuenciar peptídica y nucleica, especialmente por la secuencia de sus regiones que determinan su complementariedad (CDR) para IGF-IR. Por lo tanto, de conformidad con una primera modalidad, un tema de la presente invención es un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, dicho anticuerpo o uno de dichos fragmentos siendo capaz de unirse específicamente al factor de crecimiento similar a insulina-l humana I receptor y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor IGF-IR, caracterizado porque es capaz de inhibir la unión natural de su primer ligando IGF1 con una Cl50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.03 nM y también capaz de inhibir la unión natural e su segundo ligando IGF2 con una CI50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.1 nM. Muy particularmente, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento inmunogénico funcional del mismo, que tiene una afinidad de unión para el receptor de factor de crecimiento similar a insulina-l humana (IGF-IR), caracterizado porque bajo unión a dicho IGF-IR, inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF1 a dicho IGF-IR con una Cl50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.03 nM y también inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF2 a dicho IGF-IR con una Cl50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.1 nM. Además, la invención se refiere a un cuerpo aislado, o un fragmento monoclonal funcional del mismo, que tiene una tirosina cinasa del receptor de factor de crecimiento similar a insulina-l humana (IGF-IR) que inhibe la actividad, caracterizado porque bajo la unión de dicho IGF-IR, inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF1 a dicho IGF-IR con una Cl50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.03 nM y también inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF2 a dicho IGF-IR con una Cl50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.1 nM. En la presente soliciíud, la Cl50 ha sido determinada gráficamente como se explica en el ejemplo 2. Con respecto a la técnica más avanzada, el anticuerpo de Roche referenciado 18 (WO 2004/087756 y WO 2005/005635) tiene una Cl50 promedio tanto para IGF1 como IGF2 que es aproximadamente 0.3 nM (véase ejemplo 6 de WO 2005/005635), es decir, más que la Cl50 obtenida para el anticuerpo I-3466 (véase ejemplo 2). En la presente descripción, los términos "unir" y "fijar" tienen el mismo significado y son intercambiables. De conformidad con otra modalidad de la invención, el anticuerpo también es capaz de unir el receptor híbrido de IGF-l/insulina. En realidad, IGF-IR muestra una homología alta con el receptor de insulina (IR) que existe bajo dos ¡soformas A y B. Las secuencias de las isoformas A y B de IR, están registradas bajo los números de acceso X02160 y M10051 , respectivamente, en el NCBI Genbank. Otros datos, sin limitaciones, en relación con IR se incorporan aquí por referencia (Vintén et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:249-252; Belfiore et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, 277:39684-39695; Dumesic et al., 2004, The Journal of Endocrinology & Metabolism, 89(7):3561-3566). El IGF-IR e IR son glicoproteínas tetraméricas compuestas de dos subunidades a extracelulares y dos subunidades ß de transmembrana enlazadas por enlaces de disulfuro. Cada subunidad a, que contiene el sitio de unión a ligando es aproximadamente 130 a 135 kDa, mientras que cada subunidad ß que contiene el dominio de tirosina cinasa es aproximadamente 90 a 95 kDa. Estos receptores comparen más de 50 % en total de similitud de secuencia de aminoácidos y 84 % de similitud en el dominio de tirosina cinasa. Después de la unión a ligando, los receptores fosforilados reclutan y fosforilan proleínas de acoplamienlo, incluyendo la familia de proteína de sustrato de receptor de insulina 1 (IRSI), Gabl y She (Avruch, 1998, MoLCell. Biochem., 182, 31-48; Roth et al.. 1988, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 53, 537-543; White, 1998, Mol. Cell. Biochem. 182, 3-11 ; Laviola et al., 1997, J. Clin. Invest., 99, 830-837 ; Cheatham et al., 1995, Endocr. Rev., 16, 117-142), que conduce a la activación de diferentes mediadores intracelulares. Aunque tanto IR como IGF-IR de manera similar activan las vías de señalización mayores, existen diferencias en el reclutamiento de ciertas proteínas de acoplamiento y mediadores intracelulares entre ambos receptores (Sasaoka et al., 1996, Endocrinology 137, 4427-4434; Nakae et al., 2001 , Endocr. Rev., 22, 818-835; Dupont and Le Roith, 2001 , Horm. Res. 55, Suppl. 2, 22-26; Koval et al., 1998, Biochem. J., 330, 923-932). Estas diferencias son la base para los efectos metabólicos predominantes inducidos por la activación de IR y los efectos mitogénicos, transformantes y anti-apoptóticos predominantes inducidos por la activación de IGF-IR (De Meyts et al., 1995, Ann. N. Y. Acad. Sci., 766, 388- 401 ; Singh et al., 2000; Prisco et al., 1999, Horm. Metab. Res., 31 , 80-89; Kido et al., 2001 , J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 972-979). La insulina se une con alta afinidad al IR (100 veces mayor que al IGF-IR), mientras que los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF1 e IGF2) se unen al IGF-IR con afinidad 100 veces mayor que al IR. El IR humano existe en dos isoformas, IR-A e IR-B, generadas por empalme alternativo del gen IR que ya sea excluye o incluye 12 residuos de aminoácidos codificados por un exón pequeño (exón 11 ) en el carboxiterminal de la subunidad a de IR. La abundancia relativa de isoformas de IR es regulada por factores específicos de tejido y desconocidos (Moller et al., 1989, Mol. Endocrinol., 3, 1263-1269; Mosthaf et al., 1990, EMBO J., 9, 2409-2413). IR-B es la isoforma IR predominante en tejidos de adulto normales (tejido adiposo, hígado y músculo) que son los tejidos objetivo mayores para los efectos metabólicos de la insulina (Moller et al., 1989; Mosthaf et al., 1990). El IR-A es la isoforma predominante en tejidos fetales y medfia el crecimiento fetal en respuesta a IGF2 (Frasca et al., 1999, Mol. Cell. Biol., 19, 3278-3288), como también es sugerido por estudios genéticos llevados a cabo en ratones transgénicos (DeChiara et al., 1990, Nature 345, 78-80; Louvi et al., 1997, Dev. Biol. 189, 33-48). Más aún, cuando las células se transforman y se vuelven malignas, la desdiferenciación a menudo está asociada con una abundancia relativa de IR-A incrementada (Pandini et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, N° 42, pp39684-39695). Dado el alto grado de homología, los semi-receptores de insulina e IGF-I (compuesto de una subunidad a y una ß) se pueden heterodimerizar, conduciendo a la formación de receptores híbridos de insulina/IGF-l (Híbrido-R) (Soos et al., 1990, Biochem J., 270, 383-390; Kasuya et al., 1993, Biochemistry 32, 13531-13536; Seely et al., 1995, Endocrinology 136, 1635-1641 ; Bailyes et al., 1997, Biochem J., 327, 209-215). Ambas isoformas de IR son igualmente capaces de formar híbridos con IGF-IR. El híbrido-R, sin embargo, tiene diferentes características funcionales. El híbrido-RsB tiene afinidad reducida para IGF1 y especialmente para IGF2. Por el contrario, el híbrido-RsA tiene una alta afinidad para IGF1 y también se une a IGF2 e insulina a un intervalo de concentración fisiológica. La expresión de híbrido-RsA regula ascendentemente el sistema IGF por dos mecanismos diferentes: i) unión (con alta afinidad) y activación tanto por IGF1 como por IGF2 (que no ocurre con el híbrido-RsB), ii) la activación de la vía de IGF-IR después de la unión de insulina a Hybrid-RsA fosforila la subunidad ß de IGF-IR y activa un sustrato específico de IGF-IR (Crkll) por lo que el híbrido-RsA desplaza la insulina a señalización de IGF-IR (Pandini et al., 2002). En varios tejidos, como el hígado, bazo o placenta, el híbrido-R está más representado que IGF-IR (Bailyes et al., 1997). A medida que los tejidos tumorales sobreexpresan, o presentan una activación anormal, tanto IGF-IR como IR-A (Frasca et al., 1999; Sciacca et al., 1999, Oncogene 18, 2471-2479; Vella et al., 2001 , Mol. Pathol., 54, 121-124), el híbrido-RsA también puede ser sobreexpresado en una variedad de malignidades humanas, incluyendo cánceres de tiroides y mama que proveen una ventaja de crecimiento selectiva a las células malignas capaz de responder por señalización de IGF-IR después de una estimulación por IGF1 y/o IGF2 pero también por insulina a concentraciones fisiológicas (Bailyes et al., 1997; Pandini et al., 1999, Clin. Cáncer Res. 5, 1935-1944; Belfiore et al., 1999, Biochimie (Paris) 81 , 403-407; Frasca et al., 1999; Sciacca et al., 1999; Vella et al., 2001 ). De conformidad con la invención, los anticuerpos también son caracterizados porque son capaces de unirse al híbrido-R y, si es necesario, preferiblemente además capaz de inhibir la unión natural de los ligandos insulina, IGF1 y/o IGF-2 de híbrido-R y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho híbrido-R. Un objeto de la invención es un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque también es capaz de inhibir 100 % de la fosforilación inducida por IGF1 y/o IGF2 de la cadena beta de IGF-IR (preferencialmente sobre células HT29). En otro aspecto, el anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención se caracteriza porque no presenta ninguna actividad intrínseca agonística.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, se caracteriza además porque es capaz de inducir, usando el mismo método de análisis de FACS: i) por lo menos 30 % de la internalización de IGF-IR sobre células HT29, y/o ii) por lo menos 85 % de la internalización de IGF-IR sobre células MCF-7. Una característica del anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, es su capacidad de inducir, usando el mismo método de análisis de FACS: i) por lo menos 50 % de la degradación de IGF-IR sobre células HT29, y/o ii) por lo menos 65 % de la degradación de IGF-IR sobre células MCF-7. En otra modalidad, el anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, se caracteriza porque es capaz de inhibir tanto la proliferación in vitro de células MCF-7 inducida por IGF1 como por IGF2 con CI5os por lo menos igual a 1 nM y preferencialmente por lo menos OJ y 0.5 nM respectivamente para experimentos de IGF1 y IGF2. El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención también se caracteriza porque es capaz de inhibir el crecimiento in vivo de líneas de células tumorales. Los anticuerpos de conformidad con la presente invención son preferiblemente anticuerpos monoclonales específicos, especialmente de origen de murino, quimérico o humanizado, que se puede obtener de conformidad con los métodos estándares bien conocidos por el experto en la técnica. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen de murino, es posible referirse a técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kohier y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención se pueden obtener, por ejemplo, de una célula animal inmunizada contra el IGF-IR, o uno de sus fragmentos que contiene el epítope específicamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención. El IGF-IR, o uno de sus fragmentos, puede ser especialmente producido de conformidad con los métodos de trabajo usuales, por recombinación genética empezando con una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica para el IGF-IR o por síntesis de péptido empezando a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia de péptido del IGF-IR. Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención pueden ser, por ejemplo, purificados sobre una columna de afinidad sobre la cual el IGF-IR o uno de sus fragmentos que contienen el epítope específicamente reconocido por los anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención ha sido previamente inmovilizado. Muy particularmente, los anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por cromatografía sobre proteína A y/o G, seguido o no seguido por cromatografía de intercambio de iones destinada a eliminar los contaminantes de proteína residual así como el ADN y el LPS, como tales seguido o no seguido por cromatografía de exclusión sobre gel de Sepharose para eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. De una manera aún más preferida, la totalidad de estas técnicas puede usarse simultáneamente o sucesivamente. Anticuerpos quiméricos o humanizados también se incluyen en anticuerpos de conformidad con la presente invención. Por anticuerpo quimérico se pretende indicar un anticuerpo que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie dada en combinación con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie dada. Los anticuerpos o sus fragmentos de tipo quimérico de conformidad con la invención se pueden preparar usando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico se puede producir clonando un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica para la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, especialmente murino, de conformidad con la invención y una secuencia que codifica para la región constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de la invención codificado por dicho gen recombinante será, por ejemplo, una quimera de ratón-humano, la especificidad de este anticuerpo está determinada por la región variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos, es posible, por ejemplo, referirse al documento Verhoeyn et al. (BioEssays, 8.J4, 1988). Por anticuerpo humanizado se pretende indicar un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molécula de anticuerpo siendo derivadas de uno de los (o e varios) anticuerpos humanos. Más aún, algunos de los residuos de los segmentos de la estructura de base (llamada FR) pueden ser modificados a fin de conservar la afinidad de la unión (Jones et al., Nature, 321 :522- 525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Los anticuerpos humanizados de conformidad con la invención o sus fragmentos se pueden preparar mediante técnicas conocidas por el experto en la técnica (tales como, por ejemplo, aquellas descritas en los documentos de Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Dichos anticuerpos humanizados de conformidad con la invención son preferidos para su uso en métodos de diagnóstico in vitro, o tratamiento profiláctico y/o terapéutico in vivo. Otro método de humanización son conocidos por el experto en la técnica como, por ejemplo, el método de "injerto de CDR" descrito por Protein Design Lab (PDL) en las solicitudes de patente EP 0 451 261 , EP 0 682 040, EP 0 9 127, EP 0 566 647 o US 5,530.101 , US 6,180.370, US5,585,089 y US, 5,693,761. También se pueden mencionar las siguientes solicitudes de patente: US 5,639,641 ; US 6,054,297; US 5,886,152 y US 5,877,293. Por fragmento funcional de un anticuerpo de conformidad con la invención, se pretende indicar en particular un fragmento de anticuerpo, tal como Fv, scFv (sc para una sola cadena), fragmentos Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento de los cuales el tiempo de vida media habría sido incrementado por modificación química, tal como la adición de poli(alquilen)glicol tal como poli(etilen)glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados llamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2- PEG o Fab'-PEG) ("PEG" para poli(etilen)glicol), o mediante la incorporación en un liposoma, de dichos fragmentos que tienen por lo menos una de las CDRs características de secuencia SEQ ID No. 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 de conformidad con la invención, y, especialmente, porque es capaz de ejercer de una manera general una actividad aún parcial del anticuerpo del cual desciende, tal como en particular la capacidad para reconocer y para unirse a IGF-IR y, si es necesario, para inhibir la actividad del IGF-IR. Preferiblemente, dichos fragmentos funcionales serán constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo de la cual se derivan, dicha secuencia parcial siendo suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual desciende y una afinidad suficiente, preferiblemente por lo menos igual a 1/100, de una manera preferida a por lo menos 1/10, de la del anticuerpo del cual desciende, con respecto al IGF-IR. Dicho fragmento funcional contendrá como mínimo 5 aminoácidos, preferiblemente 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual desciende. Preferiblemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, que generalmente tienen la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual descienden. De conformidad con la presente invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden obtener empezando de anticuerpos tales como los que se describen por métodos tales como digestión por enzimas, tales como pepsina o papaína y/o por digestión de los puentes de disulfuro por reducción química. De otra manera, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invención se pueden obtener mediante técnicas de recombinación genética también bien conocidas por el experto en la técnica o bien por síntesis de péptido por medio de, por ejemplo, sintetizadores de péptido automáticos tales como aquellos provistos por la compañía Applied Biosystems, etc. De una manera más preferida, la invención comprende los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la presente invención, especialmente anticuerpos quiméricos o humanizados, obtenidos por recombinación genética o por síntesis química. Muy particularmente, de conformidad con una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo se caracteriza porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad CDR escogida de las CDRs de secuencia SEQ ID No. 1 , 3 ó 5, o por lo menos una CDR cuya secuencia tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 1 , 3 ó 5, o porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR escogida de las CDRs de secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6, o por lo menos una CDR cuya secuencia tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6. En la presente descripción, los términos polipéptidos, secuencias de polipéptido, péptidos y proteínas fijadas a compuestos de anticuerpo o a su secuencia son intercambiables. Cabe entender aquí que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir no están en su ambiente natural han podido ser aislados u obtenidos por purificación de fuentes naturales, o bien obtenidos por recombinación genética, o por síntesis química, y pueden contener aminoácidos no naturales como se describirá más adelante. Por región CDR o CDR, se pretende indicar las variables ed hiperregión de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas como se define en Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a. Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 , y ediciones posteriores). Existen 3 CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs se usa aquí para indicar, de conformidad con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso todas, estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítope que reconoce. Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos en el sentido de la presente invención, se pretende indicar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que han de ser comparadas, obtenidos después de la mejor alineación (alineación óptima), este porcentaje siendo puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias siendo distribuidas aleatoriamente y sobre su longitud completa. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos son tradicionalmente llevadas a cabo comparando estas secuencias después de haberlas alineado de una manera óptima, dicha comparación pudiéndose llevar a cabo por segmento o por "ventana de comparación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede llevar a cabo, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), por medio de software de computadora usando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, o bien por software de comparación BLAST N o BLAST P). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de una manera óptima y en las cuales la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos que ha de ser comparada puede comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima eníre estas dos secuencias. El porcentaje de idenlidad se calcula delerminando el número de posiciones idéníicas para las cuales el nucleótido o el residuo de aminoácido es idéntico enlre las dos secuencias, dividiendo esíe número de posiciones idénlicas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por ejemplo, es posible usar el programa BLAST, " secuencias BLAST 2 " (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf7bl2.html, los parámetros usados son aquellos dados por omisión (en particular para los parámetros "sanción de espacio abierto": 5, y "sanción de espacio de extensión": 2; la matriz escogida siendo, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se han de comparar siendo calculadas directamente por el programa. Por secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 %, preferiblemente 85 %, 90 %, 95 % y 98 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, aquellas que tienen, con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una deleción, adición o substitución de por lo menos un aminoácido, una truncación o un alargamiento son preferidas. En el caso de una sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren sustituciones en las cuales los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". La expresión "aminoácidos equivalentes" está destinada aquí a indicar cualquier aminoácido capaz de ser sustituido con uno de los aminoácidos de la estructura de base, sin embargo, sin modificar esencialmente las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y como tal se definirá más adelante, especialmente en los ejemplos. Modalidades alternativas de la invención proponen anticuerpos anti-IGF-IR que tienen otras modificación(es) de secuencia de aminoácidos contenida(s) en las mismas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anlicuerpo anti-IGF-IR se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo anti-IGF-IR, o por síntesis de péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o substituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IGF-IR. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procedimientos post-traduccionales del anticuerpo anti-IGF-IR, tal como cambiando el número o posición de sitios de glicosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anli-IGF-IR que son lugares preferidos para mutagénesis se llama "mutagenésis por escudriñamiento de alanina" como se describe en Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (v.gr., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o negativamente cargado (muy preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno de IGF-IR. Estos lugares de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones después son refinadas al introducir variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido es predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una muíación en un siíio dado, escudriñamiento de ala o mutagénesis aleatoria se conduce en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpo anti-IGF-IR expresadas son escudriñadas para actividad deseada. Inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-IGF-IR, con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-IGF-IR incluyen la fusión al N- o C-terminal del anticuerpo anti-IGF-IR a una enzima (v.gr., para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-IGF-IR reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen las variables de hiperregión, pero también se contemplan alteraciones de FR. Sustituciones conservativas se muestran en el cuadro 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan por resultado un cambio en actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en el cuadro 1 , o como se describe adicionalmente más adelante en referencia a clases de aminoácidos, se pueden introducir y los productos se pueden determinar selectivamente.

CUADRO 1 Sustituciones de aminoácidos Residuo original Sustituciones de eiemplo Sustituciones preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; asp; lys; arg gin Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gin asp Gly (G) ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg He (l) leu; val; met; ala; phe; norieucina leu Leu (L) norieucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norieucina leu Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se pueden lograr seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura de base del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o carácter hidrofóbico de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren en forma natural se dividen en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes: (1 ) hidrofóbicos: norieucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutras: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Sustituciones no conservativas incluirán el intercambio de un miembro de una de estas clases para otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo anti-IGF-IR también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrelazamiento aberrante. Por el contrario, el enlace(s) de cisteína se puede añadir al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo progenitor (v.gr., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante(s) resultante seleccionada para desarrollo posterior tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo progenitor a partir del cual se generan. Una forma conveniente para generar dichas variantes sustitucionales implica maduración de afinidad usando despliegue de fagos. En resumen, varios sitios de región hipervariable (v.gr., 6-7 sitios) son mutados para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas son desplegadas de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen lll de M13 empacadas dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas con fagos son entonces determinadas selectivamente para su actividad biológica (v.gr., afinidad de unión) como se describe aquí. A fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, la mutagénesis de escudriñamiento de alanina se puede realizar para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a unión de antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y IGF-IR humano. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de conformidad con las técnicas elaboradas aquí. Una vez que esas variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a determinación selectiva como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en una o más pruebas relevantes se pueden seleccionar para desarrollo posterior. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alterar se entiende deletar una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos es típicamente ya sea N-ligada u O-ligada. N-ligada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéplido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido muy comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicosilación N-ligados). La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del cuerpo original (para sitios de glicosilación O-ligados). Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido del presente anticuerpo anti-IGF-IR se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que ocurren naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis por cassette de una variante anteriormente preparada o una versión no variante del anticuerpo anti-IGF-IR. En ocasiones, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a funciones del efector, v.gr., para incrementar la citotoxicidad mediada por células dependientes de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, residuo(s) de cisteína se pueden introducir en la región Fc, permitiendo así la formación de enlace de disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de tener internalización mejorada y/o muerte de células mediada por complemento incrementada y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp Med, 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral también se pueden preparar usando entrelazadotes heterofuncionales como se describe en Wolf et al., Cáncer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser manipulado por ingeniería genética que tenga regiones Fc duales y de esta manera puede tener lisis de complemento incrementada y capacidades de ADCC. Véase Stervenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Asimismo, para incrementar la vida media en el suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de unión de receptor de recuperación en el anticuerpo (especialmente un fragmento del anticuerpo) como se describen en la patente de E.U.A. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se usa aquí, el término "epítope de unión de receptor de recuperación" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (v.gr., Igd, lgG2, lgG3, o lgG4) que es responsable de incrementar la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG. De una manera más preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo o no de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos dos de tres CDRs o los tres CDRs de la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o por lo menos dos de tres CDRs o tres CDRs de la secuencia respectivamente que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6. En una modalidad más preferida, un tema de la invención es un anticuerpo para uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos dos de los tres CDRs o los tres CDRs de la secuencia SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5, o por lo menos dos de tres CDRs o tres CDRs de la secuencia respectivamente que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5. De una manera más preferida, el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención se caracteriza porque comprende una cadena pesada que comprende los tres CDRs de la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o tres CDRs de la secuencia respectivamente que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6 y porque además comprende una cadena ligera que comprende los tres CDRs de la secuencia SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5, o tres CDRs de la secuencia respectivamente que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5. Como técnica más avanzada, se sabe que la variabilidad más grande (longitud y composición) entre 6 CDRs se observa para las 3 CDRs de la cadena pesada y muy particularmente, la CDR-H3. Como consecuencia, se entenderá que la CDR característica preferencial del anticuerpo de la invención es las 3 CDRs de la cadena pesada, es decir, CDRs codificadas por la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6 y, muy preferencialmente la CDR correspondiente a CDR-H3 codificada por SEQ ID No. 6. De conformidad con otro aspecto, un tema de la presente invención es un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque no se fija o no está fijado de una manera significativa al receptor de insulina humana IR. De una manera preferida, dichos aspectos funcionales de conformidad con la presente invención se escogerán de los fragmentos Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento funcional cuya vida media habría sido incrementada por una modificación química, especialmente por PEGilación, o por incorporación en un liposoma. De conformidad con otro aspecto, la invención se refiere a un hibridoma de murino capaz de secretar un anticuerpo monoclonal de conformidad con la presente invención, especialmente el hibridoma de origen de murino tal como es depositado en el Centre Nacional de Culture De Microorganismo (CNCM, Centro Nacional de Cultivo de Microorganismos) (Instituí Pasteur, Paris, Francia) el 23 de junio de 2005 bajo el número 1-3466, dicho hibridoma resultando de la fusión de esplenocitos Balb/c de ratones inmunizados y líneas de células de mieloma Sp20 Ag. El anticuerpo monoclonal aquí llamado 1-3466, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque dicho anticuerpo es secretado por el hibridoma depositado en el CNCM el 23 de junio de 2005 bajo el número 1-3466 es desde luego parte de la presente invención. En una modalidad particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo de murino o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos ID No. 7, o una secuencia que tiene 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 7, y/o porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 8, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 8. De conformidad con un aspecto particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención caracterizado porque dicho anticuerpo además comprende las regiones constantes de ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón, especialmente humano, y de una manera preferida porque las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano son respectivamente la región kappa y gamma-1 , gamma-2 o gamma-4. En una modalidad particular correspondiente al isotipo lgG1 , una característica complementaria del anticuerpo es desplegar potencialmente funciones efectoras como ADCC (para citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) y/o CDC (para citotoxicidad dependiente de complemento). De conformidad con un aspecto particular también, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada en la cual los fragmentos de la estructura de base FR1 a FR4 de dicha cadena ligera y/o cadena pesada son respectivamente derivados de segmentos de la estructura de base FR1 a FR4 de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpo humano. De conformidad con una modalidad preferida, el anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la presente invención se caracteriza porque dicho anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 17, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 17, y/o porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 18, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 18. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 17 y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 18. De conformidad con un aspecto novedoso, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se escoge de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención; b) un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico tal como se define en a); c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaces de hibridar bajo condiciones de gran astringencia con por lo menos una de las CDRs de secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14, o con una secuencia que tiene por lo menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14; d) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran astringencia con por lo menos la cadena ligera de secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 15 y/o la cadena pesada de secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 16, o con una secuencia que tiene por lo menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 15 y/o 16. c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran astringencia con por lo menos la cadena ligera de secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 19 y/o la cadena pesada de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 20, o con una secuencia que tiene por lo menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 19 y/o 20. Por ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico o nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótido, secuencia de nucleótido, términos que se utilizarán en la presente especificación, se pretende indicar un enlace preciso de nucleótidos, que son modificados o no modificados, permitiendo que se defina un fragmento o una región de un ácido nucleico que contiene o no nucleótidos no naturales y que es capaz de corresponder igual de bien a un ADN de doble cadena, un ADN de una sola cadena como a los productos de transcripción de dichos ADNs. También se debe entender aquí que la presente invención no se refiere a las secuencias de nucleótidos en su ambiente cromosómico natural, es decir en el estado natural. Se refiere a secuencias que han sido aisladas y/o purificadas, es decir que han sido seleccionadas directamente o indirectamente, por ejemplo mediante copia, su ambiente habiendo sido por lo menos parcialmente modificado. Por lo tanto, también se pretende indicar aquí los ácidos nucleicos aislados obtenidos por recombinación genética por medio, por ejemplo, de células hospedero u obtenido por síntesis química Por secuencias de nucleótido o porcentaje de identidad por lo menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, después de alineación óptima con una secuencia preferida, se pretende indicar las secuencias nucleicas que tiene, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones tal como, en particular, una deleción, una truncación, un alargamiento, una fusión quimérica y/o una sustitución, especialmente sustitución puntual. Preferiblemente, se refiere a secuencias en las cuales el código de secuencias para las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de referencia, estando ésta conectada a degeneración del código genético, o secuencias de complementariedad que son capaces de hibridar específicamente con las secuencias de referencia, preferiblemente bajo condiciones de alta astringencia, especialmente tal como se define más adelante. Una hibridación bajo condiciones de alta astringencia significa que las condiciones de temperatura y condiciones de concentración iónica se escoge de tal manera que permitan el mantenimiento de la hibridación entre fragmentos de ADN complementario. A manera de ilustración, las condiciones de alta astringencia del paso de hibridación para los propósitos de definición de los fragmentos de polinucleótido descritos anteriormente son ventajosamente las siguientes. La hibridación ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos pasos: (1 ) prehibridación a 42°C durante 3 horas en regulador de pH de fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a 0.15 M de NaCI + 0.015 M de solución de citrato de sodio), 50% de formamida, 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 10 x Denhardt's, 5% de sulfato de dextrano y 1 % de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación real para 20 horas a temperatura dependiente del tamaño de la sonda (es decir: 42°C, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos) seguido por 2 lavados de 20 minutos a 20°C en 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20°C en 0.1 x SSC + 0.1% de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0.1 x SSC + 0.1 % de SDS durante 30 minutos a 60°C para tamaño de sonda > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación de alta astringencia descritas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden ser adaptadas por un experto en la técnica para oligonucleótidos de tamaño más grande o más pequeño, de conformidad con las enseñanzas de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual 2a Ed. Cold Spring Harbor). La invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la presente invención. La invención está destinada especialmente a vectores de clonación y/o expresión que contienen una secuencia de nucleótido de conformidad con la invención. Los vectores de conformidad con la invención preferiblemente contienen elementos que permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias de nucleótidos en una célula hospedero determinada. El vector por lo tanto debe contener un promotor, señales de iniciación y terminación de traducción, así como regiones apropiadas de regulación de transcripción. Debe ser capaz de ser mantenida de una manera estable en la célula hospedero y opcionalmente puede tener señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes elementos son escogidos y optimizados por el experto en la técnica como una función de la célula hospedero usada. Para este efecto, las secuencias de nucleótido de conformidad con la invención pueden ser insertadas en vectores de replicación autónomos en el hospedero escogido, o ser vectores integrativos del hospedero escogido. Dichos vectores se preparan mediante métodos actualmente usados por el experto en la técnica, y los clones resultantes pueden ser introducidos en un hospedero apropiado por métodos estándares, tales como lipofección, electroporación, choque térmico o métodos químicos. Los vectores de conformidad con la invención son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. Son útiles para transformar células hospedero a fin de clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención. La invención también comprende las células hospedero transformadas por o que comprenden un vector de conformidad con la invención. La célula hospedero se puede escoger de sistemas procarióticos o eucarióticos, por ejemplo células bacterianas pero también células de levadura o células animales, en particular células de mamífero. También es posible usar células de insecto o células vegetales. La invención también se refiere a animales, excepto el hombre, que comprende por lo menos una célula transformada de conformidad con la invención. De conformidad con otro aspecto, el tema de la invención es un proceso para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una célula hospedero de conformidad con la invención; y b) la recuperación de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, así producidos empezando del medio de cultivo o las células cultivadas. Las células transformadas de conformidad con la invención se pueden usar en procedimientos para la preparación de polipéptidos recombinantes de conformidad con la invención. Los procedimientos para la preparación de un polipéptido de conformidad con la invención en forma recombinante, caracterizados porque utilizan un vector y/o una célula transformada por un vector de conformidad con la invención son como tales comprendidos en la presente invención. Preferiblemente, una célula transformada por un vector de conformidad con la invención es cultivada bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y el polipéptido recombinante es recuperado. Como se ha dicho, la célula hospedero se puede escoger de sistemas procarióticos o eucarióticos. En particular, es posible identificar secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención, facilitando la secreción en dicho sistema procariótico o eucariótico. Un vector de conformidad con la invención que lleva a cabo una secuencia por lo tanto puede ser ventajosamente usado para la producción de proteínas recombinantes, que se pretende que sean secretadas. De hecho, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés será facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante en el cultivo de células y no en el interior de las células hospedero.

También es posible preparar los polipéptidos de conformidad con la invención mediante síntesis química. Dicho procedimiento de preparación es también un tema de la invención. El experto en la técnica conoce los procedimientos de síntesis química, por ejemplo las técnicas que utilizan fases sólidas (especialmente Steward et al., 1984, Solid phase peptide síntesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111 , 2a ed., (1984)) o técnicas que usan fases sólidas parciales, por condensación de fragmentos o por una síntesis clásica en solución. Los polipéptidos obtenidos por síntesis química y que son capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes también están comprendidos en la invención. Los anticuerpos o uno de sus fragmentos funcionales, capaces de ser obtenidos por un procedimiento de conformidad con la invención, también están comprendidos en la presente invención. De conformidad con una segunda modalidad, la presente invención se refiere a un anticuerpo de conformidad con la invención tal como se describió anteriormente, caracterizado porque además, es capaz de unirse específicamente a un receptor humano de la familia de tirosina cinasa y/o capaz de inhibir la actividad de la tirosina cinasa de dicho receptor. En una primera modalidad, dicho anticuerpo consiste en un anticuerpo bioespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la unión de EGF en el receptor de factor de crecimiento * epidérmico humano (EGFR) y/o inhibir la actividad de la tirosina cinasa de dicho EGFR. En una modalidad más preferida de la invención, el segundo motivo de anti-EGFR es emitido desde el anticuerpo monoclonal de murino 225, su derivado quimérico C225 o cualquier anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225. En una segunda modalidad, dicho anticuerpo consiste de un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la actividad modulada por el receptor de HER2/neu y/o inhibir la actividad de la tirosina cinasa de dicho receptor de HER2/neu. En una modalidad más preferida de la invención, dicho segundo motivo de anti-HER2/neu es emitido desde el anticuerpo monoclonal de murino 4D5 o 2C4 o el anticuerpo humanizado Transtuzumab o Pertuzumab. En una tercera modalidad, dicho anticuerpo consiste en un anticuerpo biespecífico comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en el receptor de cMET y/o inhibir específicamente la actividad de la tirosina cinasa de dicho receptor de cMET. Finalmente, en una última modalidad, dicho anticuerpo consiste en anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la unión de la proteína estimulante de macrófagos (MSP) en el receptor de RON y/o inhibir la actividad de la tirosina cinasa sobre dicho receptor de RON. De conformidad con otra modalidad de la invención, también se considera que el anticuerpo de conformidad con la invención es capaz de interactuar con cualquier tipo de receptor que esté implicado en el desarrollo de tumores tales como, por ejemplo, sin limitación, VEGFR, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) o CXCR4 ó 2 (receptor de quimiocina tipo 4 ó 2). Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales de una segunda generación de anticuerpos monoclonales en las cuales dos diferentes regiones variables son combinadas en la misma molécula (Hollinger y Bohlen, 1999, Cáncer and metástasis, rev. 18:411-419). Su uso ha sido demostrado tanto en el capo de diagnóstico como en el campo de terapia por su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para dirigir varias moléculas sobre la superficie de células tumorales. Estos anticuerpos se pueden obtener por métodos químicos (Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol., 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382) o métodos somáticos (Staerz U.D. y Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121 :210-228) pero también y preferencialmente mediante técnicas de ingeniería genética que permiten que la heterodimerización sea forzada y por lo tanto facilite el procedimiento de purificación del anticuerpo buscado (Merchant et al., 1998 Nature Biotech., 16:677-681 ). Estos anticuerpos biespecíficos pueden ser construidos como IgG entera, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG o como diacuerpos o bien como scFv biespecífico pero también como un anticuerpo biespecífico tetravalente o dos sitios de unión están presentes para cada antígeno dirigido (Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37 (18):1123-30) o sus fragmentos como se describió anteriormente.

Además de una ventaja económica por el hecho de que la producción y la administración de un anticuerpo biespecífico son menos onerosas que la producción de dos anticuerpos específicos, el uso de dichos anticuerpos biespecíficos tiene la ventaja de reducir la toxicidad del tratamiento. Esto se debe a que el uso de un anticuerpo biespecífico permite que la cantidad total de anticuerpos circulante sea reducida y consecuentemente la toxicidad posible. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente o tetravalente. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende por medio de un principio activo que consiste de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, preferiblemente mezclado con un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. De conformidad con otra modalidad, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica tal como se describe más adelante que comprende por lo menos un segundo compuesto escogido de los compueslos capaces de inhibir específicamenle la actividad de la tirosina cinasa de IGF-IR, EGFR, HER2/neu, VEGFR, cMET y/o RON. En un segundo aspecto preferido de la invención, el segundo compuesto se escoge de los anticuerpos anti-EGFR, -IGF-IR, -HER2/neu, anti-FEGFR, -cMET y/o -RON aislados, o sus fragmentos funcionales capaces de inhibir la actividad proliferativa y/o antiapoptótica y/o angiogénica y/o inductora de diseminación metastásica mediada por dichos receptores. De conformidad con otra modalidad de la invención, la composición comprende, como producto de combinación para un uso simultáneo, separado o secuencial, por lo menos un inhibidor de la actividad de la tirosina cinasa de IGF-IR, EGFR, HER2/neu, VEGFR, cMET y/o RON. En otra modalidad preferida, el inhibidor de la actividad de la tirosina cinasa de los receptores se selecciona del grupo que consiste de agentes naturales derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo- o pirrolopiridopirímidinas o bien quinacilinas. Dichos agentes inhibidores son bien conocidos por el experto en la técnica y se describen en la literatura (Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl, 1 , 25-32). Otra modalidad complementaria de la invención consiste en una composición tal como se describió antes que comprende, además, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial, un agente citotóxico/citostático. Por "uso simultáneo" se entiende la administración de dos compuestos de la composición de conformidad con la invención en una forma farmacéutica individual e idéntica. Por "uso separado" se entiende la administración, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composición de conformidad con la invención en distintas formas farmacéuticas. Por "uso secuencial" se entiende la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición de conformidad con la invención, cada uno en una forma farmacéutica distinta. De una manera general, la composición de conformidad con la invención incrementa considerablemente la eficacia del tratamiento de cáncer. En otras palabras, el tratamiento terapéutico del anticuerpo anti-IGF-IR de conformidad con la invención es potenciado de una manera inesperada por la administración de un agente citotóxico. Otra ventaja subsecuente importante producida por una composición de conformidad con la invención se refiere a la posibilidad de usar dosis eficaces más bajas de principio activo, que permiten que los riesgos de aparición de efectos secundarios sean evitados o reducidos, en particular los efectos del agente citotóxico. Además, esa composición de conformidad con la invención permitirá que el efecto terapéutico esperado se logre más rápidamente. Por "agentes terapéuticos anticancerosos" o "agentes citotóxicos", se pretende una sustancia que, cuando se administra a un sujeto, trata o previene el desarrollo de cáncer en el cuerpo del sujeto. Como un ejemplo no limitante de dichos agentes, se pueden mencionar agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de función de cromatina, agentes anti-angiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos o inmunomoduladores. Dichos agentes son, por ejemplo, citados en la edición de 2001 de VIDAL, en la página dedicada a los compuestos unidos a la columna de cancerología y hematología "citotóxicos", estos compuestos citotóxicos citados con referencia a este documento se citan aquí como agentes citotóxicos preferidos. Muy particularmente, los agentes son preferidos de conformidad con la invención. "Agente alquilante" se refiere a cualquier sustancia que puede entrelazar o alquilar cualquier molécula, preferiblemente ácido nucleico (vr., ADN), dentro de una célula. Ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostaza nitrogenada tal como mecloretamina, clorambucol, melfalen, clorhidrato, pipobromen, prednimustin, fosfato disódico o estramustine; oxazoforinas tales como ciclofosfamida, altretamina, trofosiamida, sulfofosfamida o ifosfamida; aziridinas o imino-etilenos tales como tiotepa, trietilenamina o altetramina; nitrosourea tales como carmustina, estreptozocin, fotemustin o lomustine; alquilen-sulfonatos tales como busulfan, treosulfan o improsulfan; triazenos tales como dacarbazine; o complejos de platino tales como cis-platin, oxaliplatin y carboplatin. "Antimetabolitos" se refiere a sustancias que bloquean el crecimiento de células y/o metabolismo al interferir con ciertas actividades, usualmente síntesis de ADN. Ejemplos de antimetabolitos incluyen metotrexato, 5-fluoruracilo, floxuridine, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabine, citarabine, fludarabine, citosina arabinósido, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicin y pentostatin. "Antibióticos antitumorales" se refieren a compuestos que pueden prevenir o inhibir ADN, ARN y/o síntesis de proteína. Ejemplos de antibióticos antitumorales incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina y procarbazina. "Inhibidores mitóticos" previenen la progresión normal del ciclo celular y mitosis. En general, inhibidores de microtúbulos o taxoides tales como paclitaxel y docetaxel son capaces de inhibir la mitosis. Los alcaloides de vinca como vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina son también capaces de inhibir la mitosis. "Inhibidores de función de cromatina" o "inhibidores de topoisomerasa" se refieren a sustancias que inhiben la función normal de proteínas de modelación de cromatina tales como topoisomerasa I o topoisomerasa II. Ejemplos de inhibidores de función de cromatina incluyen, para topisomerasa I, camptotecina y sus derivados tales como topotecan o irinotecan, y para topiisomerasa II, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido. "Agente anti-angiogénesis "se refiere a cualquier fármaco, compuesto, sustancia o agente que inhibe el crecimiento de vasos sanguíneos. Agentes anti-angiogénesis ilustrativos incluyen, pero de ninguna manera se limitan a razoxin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291 , talidomide, CDC 501 , DMXAA, L-651582, esqualamine, endostatin, SU5416, SU6668, interferón-alfa, EMDI 21974, interleucina-12, IM862, angiostatin y vitaxin.

"Anti-estrógeno" o "agente anti-estrogénico" se refiere a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la acción de un estrógeno. Ejemplos de agentes anti-estrógeno son tamoxifen, toremifen, raloxifen, droloxifen, iodoxifen, anastrozol, letrozol y exemestan. "Anti-andrógenos" o "agentes anti-androgénico" se refieren a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la acción de un andrógeno. Ejemplos de anti-androgénicos son flutamida, nilutamida, bicalutamida, sprironolactona, acetato de ciproteron, finasterida y cimitidina. "Inmunomoduladores" son sustancias que estimulan el sistema inmune. Ejemplos de inmunomoduladores incluyen interferón, interleucina tal como aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox e interleucina-2, factores de necrosis tumoral tales como tasonermina u otros inmunomoduladores tales como lentinan, sizofiran, roquinimex, pidotimod, pegademasa, tiomopentina, poli l:C o levamisole junto con 5-fluorouracilo. Para más detalle, el experto en la técnica podría referirse al manual editado por la "Association Francaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique" y titulada "traite de chimie thérapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edición TEC & DOC, 2003". En una modalidad particularmente preferida, dicha composición como un producto de combinación de conformidad con la invención se caracteriza porque dicho agente citotóxico es acoplado químicamente al anticuerpo para uso simultáneo. En una modalidad particularmente preferida, dicha composición de conformidad con la invención se caracteriza porque el agente citotóxico/citostático se escoge del inhibidor de huso o agentes estabilizadores, preferiblemente vinorelbina y/o vinflunina y/o vincristina. A fin de facilitar el acoplamiento entre el agente citotóxico y el anticuerpo de conformidad con la invención, es especialmente posible introducir moléculas separadoras entre los dos compuestos que han de ser acoplados, tales como poli(alquilen)glicoles como polietilenglicol, o bien aminoácidos, o, en otra modalidad, para usar derivados activos de dichos agentes citotóxicos en los cuales habrían sido introducidas funciones capaces de reaccionar con dicho anticuerpo de conformidad con la invención. Esas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por los expertos en la técnica y ahora se expandirán en la presente descripción. Otros inhibidores de EGFR, sin ninguna limitación, pueden consistir de anticuerpos monoclonales anti-EGFR ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA) o los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomide (Pharmacia/Sugen), Cl-1033 (Warner-Lambert Parke-Davis), CI-1033/PD 183, 805 (Warner-Lambert Parke-Davis), CL-387, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol-Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusión de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cáncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-AI 2 (Parker Hughes Cáncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cáncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT- 8391 (Kyowa Hakko) o la "EGFR Vaccine" (York Medical/Centro de Immunología Molecular). De conformidad con otra modalidad de la invención, la composición tal como se describió antes también puede comprender otro compuesto de anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular del receptor de HER2/neu, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial, destinado para la prevención y para el tratamiento de cáncer, especialmente los cánceres que sobreexpresan dicho receptor de HER2/neu y el receptor IGF-IR y/o EGFR, tal como especialmente cáncer de mama. Se puede hacer referencia especialmente a las publicaciones de Albanell et al. (J. of the National Cáncer Institute, 93(24):1830-1831 , 2001 ) y de Lu et al. (J. of the National Cáncer Institute, 93(24): 1852-1857, 2001 ) justificando un interés inesperado en la combinación de un anticuerpo anti-HER2/neu con un anticuerpo anti-IGF-IR de conformidad con la presente invención. De una manera particular, dicho anticuerpo anti-HER2/neu de la composición de conformidad con la invención es el anticuerpo denominado Trastuzumab (también llamado Herceptin). La invención se refiere, en otro aspecto, a una composición caracterizada porque por lo menos uno de dichos anticuerpos o uno de sus fragmentos funcionales es conjugado con una toxina celular y/o radioelemento. Preferiblemente, dicha toxina o radioelemento es capaz de inhibir por lo menos una actividad celular de células que expresan el IGF-IR, de una manera más preferida capaz de prevenir el crecimiento o la proliferación de dicha célula, especialmente de inactivar totalmente la célula. También preferiblemente, dicha toxina, es una toxina enterobacterian, especialmente exotoxina A de Pseudomonas. Los radioelementos (o radioisótopos) preferiblemente conjugados a los anticuerpos utilizados para la terapia son radioisótopos que emiten rayo gamma y preferiblemente yodo131, itrio90, oro199, paladio100, cobre67, bismuto217 y antimonio211. Los radioisótopos que emiten rayos beta y alfa también se pueden usar para la terapia. Por toxina o radioelemento conjugado a por lo menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, se pretende indicar cualquier medio que permita dicha toxina o radioelemento se una a por lo menos un anticuerpo, especialmente mediante acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin la introducción de una molécula enlazadora. Entre los agentes que permiten la unión de una manera química (covalente), electrostática o no covalente de todos o parte de los componentes del conjugado, se puede hacer mención particularmente de benzoquinona, carbodiimida y muy particularmente EDC (clorhidrato de 1 -etil-3-[dimetilaminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobisnitrobenzoico (DTNB), tioacetato de N-succinimidil S-acetilo (SATA), los agentes de puente que tienen uno o más grupos fenilazida que reaccionan con los ultravioleta (U.V.) y preferiblemente N-[-4-(azidosalic¡lamino)butil]-3,-(2'-piridilditio)propionamida (APDP), N-succinimid-il 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 6-hidrazino-nicotinamida (HYNIC). Otra forma de acoplamiento, especialmente para los radioelementos puede consistir en el uso de un quelatador ¡on bifuncional. Entre estos quelatadores es posible mencionar los quelatadores derivados de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o de DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) que han sido desarrollados para unir metales, especiales metales radioactivos e inmunoglobulinas. Por lo tanto, DTPA y sus derivados pueden ser sustituidos por diferentes grupos en la cadena de carbono a fin de incrementar la estabilidad y la rigidez del complejo de ligando-metal (Krejcarek et al., 1977; Brechbiel et al., 1991 ; Gansow, 1991 ; patente de E.U.A. 4,831 ,175). Por ejemplo, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y sus derivados, que se han usado ampliamente en medicina y en biología durante un largo tiempo ya sea en su forma libre, o en forma de un complejo con un ion metálico, tienen la característica remarcable de formar quelatos estables con iones metálicos y de ser acoplados con proteínas de interés terapéutico o de diagnóstico tales como anticuerpos para el desarrollo de radioimmunoconjugados en terapia de cáncer (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990). Asimismo, preferiblemente, por lo menos un anticuerpo que forma el conjugado de conformidad con la invención se escoge de sus fragmentos funcionales, especialmente los fragmentos amputados de su componente Fc tales como los fragmentos scFv. La presente invención además comprende el uso de la composición de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento. Muy particularmente, de conformidad con otra modalidad, la invención se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, y/o de una composición para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de una enfermedad inducida por una sobreexpresión y/o una activación anormal del IGF-IR, y/o conectado con una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción del IGF1 o IGF2 con IGF-IR. De conformidad con otra modalidad preferida, la invención se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, y/o de una composición para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de una enfermedad inducida por una sobreexpresión y/o una activación anormal del IGF-IR, y/o conectada con una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción del IGF2 con IGF-IR.

Preferiblemente, el uso de conformidad con la invención se caracteriza porque la administración de dicho medicamento no induce o induce sólo ligeramente efectos secundarios conectados con la inhibición del receptor de insulina IR, es decir la inhibición de la interacción del IR con sus ligandos naturales debido a la presencia de dicho medicamento, especialmente por una inhibición competitiva conectada con la unión del medicamento al IR. La presente invención además comprende el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferiblemente humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento destinado para inhibir la transformación de células normales a células con carácter tumoral, preferiblemente células dependientes de IGF, especialmente por lo menos células dependientes de IGF2. La presente invención también se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferiblemente humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento destinado para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales, preferiblemente células dependientes de IGF, especialmente por lo menos células dependientes de IGF2. De una manera general, un tema de la presente invención es el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferiblemente humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de cáncer que expresa preferiblemente IGF-IR, y/o de cáncer que tiene preferiblemente una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción de IGF1 y/o IGF2 con IGF-IR, tal como, por ejemplo, la sobreexpresión de IRSI. El tema de la presente invención es también el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferiblemente humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de psoriasis, psoriasis cuya hiperproliferación epidérmica puede ser conectada con la expresión o la sobreexpresión de IGF-IR, y/o con la hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción de IGF-IR con sus ligandos naturales (Wraight CJ. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18(5):521-526, Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like factor I receptor oligonucleotides) y/o de EGFR con sus ligandos naturales. La invención también se refiere al uso del anticuerpo, o cualesquiera fragmenlos funcionales de los mismos, preferencialmenle humanizados, y/o de cualquier composición que comprende dicho anticuerpo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de aterosclerosis. Entre los cánceres que se pueden prevenir y/o tratar, se prefiere el cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, mieloma múltiple o cáncer de ovario o cualquier otro cáncer que sobreexpresa IGF-IR. En una modalidad más preferida, debido a la capacidad particular para desplazar IGF2, la invención se refiere al uso del anticuerpo, o fragmento del mismo, de conformidad con la invención, para la prevención, diagnóstico o tratamiento de cáncer de colon, ya que se sabe que IGF2 está particularmente implicado en este cáncer. De conformidad con otro aspecto más, un tema de la presente invención es un método de diagnóstico, preferiblemente in vitro, de enfermedades conectadas con una sobreexpresión o una subexpresión, preferiblemente una sobreexpresión, del IGF-IR que empieza a partir de una muestra biológica en la cual se sospecha la presencia anormal de IGF-IR, caracterizada porque la muestra biológica es contactada con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, siendo posible que dicho anticuerpo sea, si es necesario, marcado. Preferiblemente, la enfermedad conectada con la sobreexpresión del IGF-IR en el método de diagnóstico será cánceres. El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, puede estar presente en forma de un ¡nmunoconjugado o de un anticuerpo marcado para obtener una señal detectable y/o cuantificable. Un objeto de la invención es un método de diagnóstico in vitro de condición patológica caracterizada por expresión aberrante de IGF-IR en relación con la normal, dicho método comprende poner en contacto una muestra biológica que se sospecha que contiene IGF-IR, con el anticuerpo de conformidad con la invención, bajo condiciones que favorecen la formación de un complejo IGF-IR/anticuerpo, y detectar dicho complejo como indicando la presencia del IGF-IR en la muestra. En una modalidad preferida, el anticuerpo es detectablemente marcado. En un primer aspecto, la expresión aberrante de IGF-IR es una sobreexpresión de IGF-IR. En un segundo aspecto, la expresión aberrante de IGF-IR es una subexpresión de IGF- IR. Los anticuerpos marcados de conformidad con la invención o sus fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos llamados inmunoconjugados que pueden ser conjugados, por ejemplo, con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, a-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucose amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa o por una molécula tal como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina. Los marcadores fluorescentes también pueden ser conjugados a los anticuerpos o a sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención y especialmente incluyen fluoresceina y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP para "Green Fluorescent Protein"), dansil, umbeliferota, etc. En dichos conjugados, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos funcionales se pueden preparar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden acoplar a las enzimas o a los marcadores fluorescentes directamente o por el intermediario de un grupo separador o de un grupo de enlace tal como un polialdehído, como glutaraldehído, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA), o en presencia de agentes acopladores tales como aquellos mencionados anteriormente para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen marcadores de tipo fluoresceína se pueden preparar por reacción con un isotiocianato. Otros conjugados también pueden incluir marcadores quimioluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, marcadores bio-luminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o bien marcadores radioactivos tales como yodo123, yodo 125, yodo 126, yodo 133, bromo77, tecnetio99m, indio111, indio 13m, galio67, galio68, rutenio95, rutenio97, rutenio103, rutenio105, mercurio107, mercurio203, renio99"1, renio101, renio105, escandio47, telurio121"1, telurio122"1, telurio125"1, tulio165, tulio167, tulio168, flúor18, itrio199, yodo131. Los métodos conocidos por los expertos en la técnica que existen para acoplar los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos ya sea directamente o por medio de un agente quelatador tal como EDTA, DTPA mencionados anteriormente se pueden usar para los radioelementos que se pueden usar en diagnóstico. También es posible mencionar mareaje con Na[l125] por el método de cloramina T [Hunter W.M. y Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] o bien con tecnetio99"1 por la técnica de Crockford et al. (patente de E.U.A. 4,424,200) o unido mediante DTPA como lo describe Hnatowich (patente de E.U.A. 4,479,930). Por lo tanto, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención se pueden utilizar en un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión, preferiblemente una sobreexpresión, del IGF-IR en una muestra biológica, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) el contacto de la muestra biológica con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención; y b) la demostración del complejo IGF-IR /anticuerpo posiblemente formado. En una modalidad particular, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, se pueden utilizar en un procedimiento para la detección y/o la cuantificación del IGF-IR en una muestra biológica, para el monitoreo de la eficacia de un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cáncer dependiente de IGF o bien de psoriasis o aterosclerosis. Muy generalmente, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención se pueden utilizar ventajosamente en cualquier situación en donde la expresión del IGF-IR se deba observar de una manera cualitativa y/o cuantitativa. Preferiblemente, la muestra biológica se forma por un fluido biológico, tal como suero, sangre entera, células, una muestra de tejido o biopsias de origen humano. Otro aspecto de la invención es un método de diagnóstico para predecir un potencial oncogénico de una muestra de células de próstata, que comprende: (a) proveer una muestra de tejido de próstata humano; y (b) determinar, en la muestra, la presencia de IGF-IR, dicho paso comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo de conformidad con la invención bajo condiciones que favorecen la formación de un IGF-IR/anticuerpo, en donde la presencia del complejo indica el potencial oncogénico de dichas células en el tejido. En otra modalidad, la presencia del complejo indica que el paciente está en riego de desarrollar o el inicio de un trastorno patológico caracterizado por la sobreexpresión de dicho IGF-IR. Un objeto de la invención es también un método para seguir el progreso de un régimen terapéutico diseñado para aliviar un trastorno patológico caracterizado por expresión anormal de expresión de IGF-IR, que comprende: (a) probar una muestra de un sujeto para determinar el nivel de IGF-IR en el primer punto de tiempo; (b) probar la muestra en un segundo punto de tiempo; y (c) comparar el nivel en dicho segundo punto de tiempo al nivel determinado en (a) como una determinación de efecto del régimen terapéutico en donde una disminución en el nivel de IGF-IR en dicha muestra es determinante de la regresión del trastorno patológico en el paciente o un incremento en el nivel de IGF-IR es determinante de la progresión del trastorno patológico en dicho paciente.

Cualquier procedimiento o prueba convencional se puede utilizar para llevar a cabo la detección y/o dosis. Dicha prueba puede ser una prueba de competencia o de emparedado, o cualesquiera pruebas conocidas por los expertos en la técnica dependientes de la formación de un complejo inmune del tipo anticuerpo-antígeno. Siguiendo las aplicaciones de conformidad con la invención, el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales puede ser inmovilizado o marcado. Esta inmovilización se puede llevar a cabo en numerosos soportes conocidos por los expertos en la técnica. Estos soportes especialmente pueden incluir vidrio, poliestireno, poli-propileno, polietileno, dextrano, nylon, o células naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser ya sea solubles o insolubles. A manera de ejemplo, un método preferido conlleva procedimientos inmunoenzimáticos de conformidad con la técnica de ELISA, por la técnica de inmunofluorescencia, o radioinmunoensayo (RÍA) o equivalente. Por lo tanto, la presente invención también comprende los equipos o conjuntos necesario para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedad inducida por una sobreexpresión o una subexpresión del IGF-IR o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del IGF-IR en una muestra biológica, preferiblemente una sobreexpresión del receptor, caracterizado porque el equipo o conjunto comprende los siguientes elementos: a) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención; b) opcionalmente, los reactivos para la formación de un medio favorable para la reacción inmunológica; c) opcionalmente, los reactivos permitiendo la demostración de complejos de IGF-IR/anticuerpo producidos por la reacción inmunológica. La invención además se refiere al uso de una composición como un producto de combinación de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de cáncer, especialmente cánceres para los cuales dicho agente citotóxico o dicho anticuerpo anti-HER2/neu es generalmente prescrito y, especialmente, para dichos cánceres las células tumorales expresan o sobreexpresan el IGF-IR. Un tema de la invención es también el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento destinado para la dirección específica de un compuesto biológicamente activo a células que expresan o sobreexpresan el IGF-IR. Aquí se pretende que el compuesto biológicamente activo indique cualquier compuesto capaz de modular, especialmente de inhibir, actividad de la célula, en particular su crecimiento, su proliferación, transcripción o traducción de genes. Un tema de la invención es también un reactivo de diagnóstico in vivo que comprende un anticuerpo de conformidad con la invención, o uno de sus fragmentos funcionales, preferiblemente marcados, especialmente radiomarcados, y su uso en formación de imagen médica, en particular para la detección de cáncer conectado con la expresión o la sobreexpresión por una célula del IGF-IR. La invención también se refiere a una composición como un producto de combinación o a un conjugado de anti-IGF-IR/toxina o radioelemento, de conformidad con la invención, como un medicamento. Preferiblemente, dicha composición como un producto de combinación o dicho conjugado de conformidad con la invención se mezclará con un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente descripción, se pretende que el vehículo farmacéuticamente aceptable indique un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y que sigue, por ejemplo, la facilitación de la administración del (los) compuesto(s) activo(s), un incremento en el ciclo de vida y/o en su eficacia en el cuerpo, un incremento en su solubilidad en solución o bien una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la técnica como una función de la naturaleza y del modo de administración del (los) compuesto(s) activo(s) escogidos. Preferiblemente, estos compuestos serán administrados por la vía sistémica, en particular por la vía intravenosa, por la vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la vía oral. De una manera más preferida, la composición que comprende los anticuerpos de conformidad con la invención se administrará varias veces, de una manera secuencial.

Sus modos de administración, dosis y formas farmacéuticas óptimas pueden ser determinadas de conformidad con los criterios generalmente tomados en cuenta al establecer un tratamiento adaptado a un paciente tal como, por ejemplo, la edad el peso corporal del paciente, la severidad de su condición general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios notados. Otras características y ventajas de la invención aparecen en la continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras cuya breve descripción es representada a continuación.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Competencia de unión de [125I]-IGF-I a IGF-IR por el anticuerpo monoclonal I- 3466. La unión de [125I]-IGF-I específica (en %) se gráfico como una función de concentración de ligando en una gráfica semilogarítmica. Los valores de unión específicos son las medias de los experimentos realizados por triplicado. Figura 2: Competencia de unión de [125l]-IGF-2 a IGF-IR por el anticuerpo monoclonal I- 3466. La unión de [125l]-IGF-2 específica (en %) se gráfico como una función de concentración de ligando en una gráfica semilogarítmica. Los valores de unión específicos son las medias de los experimentos realizados por triplicado. Figuras 3A y 3B: Efecto in vitro del anticuerpo 1-3466 sobre crecimiento de MCF-7 inducido ya sea por IGF1 o IGF2. Figuras 4A y 4B: Efecto del I-3466 Mab sobre fosforilación inducida ya sea por IGF1 (figura 4A) o IGF2 (figura 4B) de cadena ß de IGF-IR sobre células MCF-7. Figuras 5A y 5B: Efecto del I-3466 Mab sobre fosforilación inducida ya sea por IGF1 (figura 5A) o IGF2 (figura 5B) de cadena ß de IGF-IR sobre células HT29. Figuras 6A-6E: Actividad in vivo de 1-3466 en modelos de tumor de xenoinjerto DU145 (figura 6A), SK-ES-I (figura 6B), HT29 (figura 6C), A549 (figura 6D) y MCF-7 (figura 6E). Figura 7: Comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligeras (VL) de ratón I-3466 (SEQ ID No. 7) y de humanizado por 1-3466 con injerto de CDR (SEQ ID No. 20). El símbolo * (asterisco) indica residuos importantes para el mantenimiento de conformación de bucle de CDR y el símbolo # (sostenido) indica residuos conservados encontrados en la interfaz de VL/VH. Figura 8: Comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) de ratón 1-3466 (SEQ ID No. 8) y de humanizado por 1-3466 con injerto de CDR 1-3466 (SEQ ID No. 21 ). El símbolo * (asterisco) indica residuos importantes para el mantenimiento de conformación de bucle de CDR y el símbolo # (sostenido) indica residuos conservados encontrados en la interfaz de VL/VH. Figuras 9A y 9B: Análisis por SDS-PAGE de anticuerpos 1-3466 purificados. La leyenda es la siguiente: M: Marcador, Franja 1 : región variable humanizada I-3466, Franja 2: región variable de ratón I-3466, Figura 9A: SDS-PAGE reductor, Figura 9B: SDS-PAGE no reductor. Las regiones constantes tanto para 3466 de ratón como humanizado son humanas. Figura 10: Representación esquemática de la prueba de captura de biosensor. Una IgGI Mab humana dirigida contra la porción Fc constante, se unió covalentemente sobre una superficie del sensor CM5. Una cantidad limitada de Mab para ser probada fue inmovilizada y usada para capturar el analito hIGF-IR-ECD. La unión de Mab al analito se caracteriza por las constantes de tasa de asociación y disociación ka y kd, respectivamente. La constante de disociación de equilibrio (KD) es calculada por la relación entre constantes de tasa de asociación y disociación. Figura 11 : Sensorgrama de la fase de asociación y disociación de complejos de I-3466 humanizado de lgG1 / hIGF-IR-ECD para cinco diferentes concentraciones de hIGF-IR-ECD.

EJEMPLO 1 Generación y selección del anticuerpo monoclonal de murino (MAb) Con la finalidad de generar MAb específicamente dirigido contra IGF-IR y sin reconocer el IR, se realizó un protocolo que comprende 6 etapas de determinación selectiva. Consistió en: inmunizar ratones con IGF-IR recombinante humano, a fin de generar hibridomas, - determinar selectivamente los sobrenadantes de cultivo por ELISA sobre la proteína recombinante que sirve para inmunización, probar todos los sobrenadantes de hibridomas positivos por ELISA sobre el receptor nativo sobreexpresado sobre la superficie de células tumorales MCF-7, - realizar experimentos de unión para seleccionar anticuerpos que reconocen específicamente IGF-IR, verificar que los anticuerpos seleccionados en esta etapa sean capaces de inhibir in vitro la proliferación de IGF1 inducida de las células MCF-7, - asegurar que la actividad in vivo, en ratones sin pelo, del candidato retenida en términos de impacto sobre el crecimiento del tumor MCF-7. Todas estas diferentes etapas y resultados obtenidos se describirán brevemente más adelante en el ejemplo 1. Para la etapa de inmunización, los ratones fueron inyectados dos veces, por la vía subcutánea, con 8 µg de IGF-IR recombinante. Tres dias antes de la fusión de células del bazo con las células del mieloma de murino Sp20Ag14, los ratones recibieron una inyección intravenosa de 3 µg del receptor recombinante. Catorce días después de la fusión, los sobrenadantes e hibridomas se determinaron selectivamenle por ELISA, sobre placas sensibilizadas por IGF-IR recombinante. Los hibridomas cuyos sobrenadantes se encontraron positivos fueron conservados y amplificados antes de ser probados por análisis de FAC Sean para verificar que los anticuerpos producidos también fueran capaces de reconocer IGF-IR nativo.

EJEMPLO 2 Inhibición de unión de r125ll-IGF1 y r125H-IGF2 a receptor de IGF-I humano Preparación de lisado de membrana Células NIH 3T3 establemente transfectadas con el ADNc de IGF-IR humano se hicieron crecer en DMEM complementado con 10 % de suero de ternera fetal. Después de desprendimiento por raspado, las células carentes de suero fueron después recolectadas por centrifugación. La pastilla de células se lavó con solución salina regulada en su pH con fosfato y se volvieron a suspender en un regulador de pH de lisis: 10 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.5, que contenía inhibidores de proteasa. Aproximadamente 1 ml de regulador de pH se añadió a 25.106 células. Después las células se usaron por 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento seguidos por 30 golpes de un homogeneizador Potter a 1 ,900 rpm. Después de sonicación, los núcleos y fragmentos de células grandes fueron desechados por centrifugación a 1 ,000 g durante 15 minutos a +4°C. Las membranas celulares totales se obtuvieron por centrifugación a 105,000 g durante 1 hr a +4°C. La pastilla de membranas se lavó en regulador de pH de lisis y se centrifugó a 105,000 g durante 1 hr a +4°C. La pastilla final se volvió a suspender en 50 mM de regulador de pH Tris-HCl que contenía 150 mM de NaCI, 0.5 % de IGEPAL, 0.5 % de Tritón X-100, 0.25 % de desoxicolato de sodio e inhibidores de proteasa, y se agitó durante la noche a +4°C. El material insoluble se separó del extracto soluble que contenía hIGF-IR por centrifugación a 10,000 g durante 10 minutos a +4°C. Los lisados de membrana se analizaron para concentración de proteína por la prueba bicinconínica y para IGF-IR por Western blot.

Pruebas de unión de r125l]-IGF1 y r125l]-IGF2 El anticuerpo monoclonal comercialmente disponible 17-69 (Neomarkers, Fremont, CA, EUA), que se ha descrito que reconoce la subunidad alfa de IGF-IR, fue primero revestido sobre microplacas de 96 pozos FlashPlate® con proteína A (Perkin Elmer, Boston, MA, EUA) para inmovilizar IGF-IR. Doscientos µl de una solución de anticuerpo de 20 µg/ml en PBS se añadió a cada pozo y se incubó durante la noche a +4°C. El regulador de pH que contenía 17-69 residuales no unidos a proteína A fue removido por aspiración. Doscientos µl del lisado de membrana a 100 µg/ml se añadieron posteriormente y se incubaron durante 2 hr a temperatura ambiente para inmovilizar IGF-IR. Ninguna proteína capturada fue removida por aspiración. Para pruebas de competencia, la unión de [125I]-IGF1 (Perkin Elmer, Boston, MA, EUA) o [125I]-IGF2 (Amersham Biosciences, Saclay, Francia) a 100 pM para inmovilizar IGF-IR se midió en presencia de concentraciones variables del anticuerpo monoclonal I-3466 o los ligandos IGF1 , IGF2 e insulina (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Francia) que variaba de 1 pM a 1 µM en regulador de pH de unión que contenía 50 mM de Hepes pH 7.6, 150 mM de NaCI, 0.05% de Tween 20, 1 % de albúmina de suero de bovino y 1 mM de PMSF. Las placas se incubaron a íemperalura ambienie durante 2 hr, después se contaron en un contador de escintilación de microplaca de conteo superior Packard. No se determinó unión específica en presencia de 1 µM de IGF1. El anticuerpo monoclonal 9G4, que no es dirigido a hIGF-IR pero reconoce específicamente una proteína de E. coli, se uso como control de isotipo de lgG1 de ratón.

Resultados El por ciento de unión específica de [125I]-IGF1 y [125I]-IGF2 se gráfico como una función de la concentración de ligando en gráficas semilogarítmicas. Las concentraciones de los diversos inhibidores requeridos para inhibir la unión de radioligando por 50% (Cl50) se determinaron gráficamente a partir de las curvas de competencia sigmoidales obtenidas (figuras 1 y 2). Tanto el ligando IGF1 como el IGF2 desplazaron eficientemente la unión de [1 5I]-IGF1 a hIGF-IR inmovilizado, mientras que la insulina y el anticuerpo de control de isotipo 9G4 fueron incapaces de inhibir la unión de [125I]-IGF1 a una concentración menor que 500 nM (figura 1 ). El anticuerpo monoclonal I-3466 fue capaz de inhibir la unión de [125I]-IGF1 con una Cl50 de 0.021 nM (figura 1 ), que es 30 veces más baja que la Cl50 determinada para IGF1 no radiomarcado. Más aún, el anticuerpo 1-3466 también presentó una fuerte actividad de inhibición de unión de [125I]-IGF2 para hIGF-IR inmovilizado (figura 2). En este caso, el valor de Cl50 deducido de la curva de competencia fue de alrededor de 0.1 nM. Esta actividad bloqueadora de IGF2 de I-3466 fue similar a la actividad inhibidora inducida por IGF2 (Cl50 = 0.06 nM). Esta fue ligeramente más baja que la actividad inhibidora de IGF1 (Cl50 = 0.02 nM) y significativamente mayor que la de la insulina (CI5o ~ 200 nM). Como se esperaba, el anticuerpo de control 9G4 no mostró ninguna actividad bloqueadora de IGF2.

EJEMPLO 3 Efecto in vitro del anticuerpo 1-3466 sobre el crecimiento inducido ya sea por IGF1 o IGF2 Como se indicó anteriormente, IGF-IR es sobreexpresado por numerosos tumores pero hasta ahora se ha descrito que en un número significativo de cánceres de mama y colón, la señal de proliferación se da a este receptor mediante IGF2 (algunas veces escrito IGF-2, IGF-II o IGFII). Por lo tanto, es esencial asegurarse que MAb I-3466 también es capaz de inhibir el crecimiento inducido tanto por IGF1 como por IGF2 sobre células MCF-7 in vitro. Para hacer esto, las células se colocaron en placas de 96 pozos a una densidad de 5 x 104 células/pozo en 200 µl medio libre de suero (medio RPMI libre de rojo fenol más 1 % de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de colocarse en placas, ya sea IGF1 a una concentración final de 50 µg/ml (6.6 nM) o IGF-2 (concentración final de 100 ng/ml (13.2 nM)) se añadió a células MCF-7 ya sea en presencia o en ausencia de I-3466 o un anticuerpo anti-IGF-IR no neutralizante de murino (7G3) usado como un control de isotipo durante casi 52 horas adicionales. Los anticuerpos se probaron a concentraciones finales que variaban de 10 µg/ml (66 nM) y 0.0097 µg/ml (0.065 nM). Las células después fueron pulsadas con 0.25 µCi de [3H]timidina durante 16 horas y la magnitud de [3H]timidina incorporada en ADN se cuantificó por conteo de escintilación de líquidos. Tanto IGF-1 como IGF-2 estimularon significativamente el crecimiento de células MCF-7 (Cuadro 2). No se observó inhibición significativa cuando las células se trataron con dosis cada vez mayores del anticuerpo de control de isotipo. Por el contrario, cuando las células se incubaron con dosis cada vez mayores de anticuerpo 1-3466 una inhibición dependiente de la dosis significativa de proliferación inducida tanto por IGF1 (90%) como por IGF2 (84%) se observó con Cl50 de OJ nM y 0.5 nM respectivamente (cuadro 2 y figuras 3A-3B).

CUADRO 2 Efecto in vitro del anticuerpo I-3466 sobre crecimiento de MCF-7 inducido va sea por IGF1 (A) o IGF2 (B) EJEMPLO 4 I-3466 inhibe la fosforilación inducida tanto por IGF1 como por IGF2 de la cadena ß de IGF-IR Ya sea células MCF7 o HT29 se cultivaron durante 24 horas a 5.104 células/cm2 (placas de 75 cm2, COSTAR) en 20 ml de RPMI sin rojo fenol, se mezclaron con 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina (respectivamente 100 U/100 µg/ml) y 10% de suero de ternera fetal. Después de tres lavados en PBS, las células se incubaron durante 12 horas en medio libre de rojo fenol (RPMI) sin suero de ternera fetal y se mezclaron con 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina, albúmina de suero de bovino a 0.5 µg/ml (Sigma A-8022) y transferrina a 5 µg/ml (Sigma T8158). Para activación, las células primero fueron incubadas a 37°C durante 15 minutos con anticuerpos bloqueadores (10 µg/ml) para ser probados y después se añadió ya sea IGF1 o IGF2 durante 2 minutos adicionales. La reacción se detuvo por aspiración del medio de incubación y las placas se tendieron sobre hielo. Las células se solubilizaron mediante la adición de 0.5 ml de regulador de pH de lisis (50 mM de tris-HCl pH 7.5, 150 mM de NaCI, 1 % de Nonidet P40, 0.5% de desoxicolato de sodio), se mezclaron con inhibidores de proteasa (1 tableta por 50 ml, Boehringer Ref: 1697 498), e inhibidores de fosfatasa (Calbiochem Ref: 524625 (1/100)). Las células se rasparon y la suspensión se recuperó y se colocó en un agitador a 4°C durante 1.5 horas. Las soluciones se centrifugaron a 12,000 rpm durante diez minutos (4°C) y las concentraciones de proteína de los sobrenadantes fueron cuantificados por BCA. 500 µg de proteínas del lisado de células se mezclaron con el anti-IGF-IR (Santa cruz Ref: sc-713) para inmunoprecipitación y se incubaron en el agitador a 4°C durante 1.5 horas. Los inmunoprecipitados se recuperaron mediante la adición de proteína A-agarosa (Boehringer Ref: 1 134 515) y se incubaron toda la noche en el agitador a 4°C. Las esferas de agarosa se lavaron dos veces con 1 ml de regulador de pH de lisis, dos veces con un regulador de pH de lavado 1 (50 mM de tris-HCl pH 7.5; 500 mM de NaCI; 0.1 % de Nonidet P40; 0.05% de desoxicolato de sodio (Boehringer 1 332 597), se mezclaron con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) y una vez con un regulador de pH de lavado 2 (50 mM de tris-HCl; 0.1 % de Nonidet P40; 0.05% de desoxicolato de sodio (Boehringer Ref: 1 332 597), se mezclaron con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa 1/100). Los inmunoprecipitados se volvieron a suspender en un regulador de pH Laemmli, se calentaron a 100°C durante 5 minutos. Los sobrenadantes se analizaron por electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS (8% Novex EC6015). Las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa seguido ya sea por una inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina conjugados a HRP (BD transduction Labs PY20) o anticadena beta de IGF-IR (Santa Cruz Ref: sc 713) seguido por un anticuerpo anticonejo conjugado a HRP. Las impresiones se revelaron por quimioluminiscencia (Amersham RPN 2209) seguido por autoradiografía sobre películas Kodak X-mat AR. Las figuras 4A y 4B representan células MCF-7 no estimuladas (franjas 1 , figuras 4A y 4B) o estimuladas ya sea con 50 ng/ml de IGF1 solo (franja 2, figura 4A) o 100 ng/ml de IGF2 (franjas 2, figura 4B). Como se esperaba, no se observó estimulación basal de IGF-IR en células MCF-7 aunque una fosforilación significativa de la cadena ß de IGF-IR se observó cuando las células MCF-7 se incubaron ya sea con IGF1 o IGF2. No se observó estimulación cuando las células se trataron con un control de isotipo de IgGI (franjas 3, figuras 4A y 4B) o con el anticuerpo I-3466 solo (franjas 4, figuras 4A y 4B) demostrando que I-3466 no desplegó efecto agonístico sobre IGF-IR. Cuando I-3466 se añadió ya sea con IGF1 o IGF2, una inhibición completa de la fosforilación inducida por ligando se observó (franjas 5, figuras 4A y 4B). El anticuerpo 9G4 usado como control de isotitpo no tuvo ningún efecto sobre fosforilación inducida por IGF1 o IGF2 (franjas 6, figuras 4A y 4B). La misma actividad inhibidora de I-3466 se observó en células HT29 estimulada ya sea con IGF1 o IGF2 (figuras 5A y 5B). Estos resultados concuerdan con los descritos en el ejemplo 2 que muestran que I-3466 es capaz de desplazar tanto a IGF1 como IGF2 de IGF-IR.

EJEMPLO S Estudios de internalización y degradación de IGF-IR Estudios de internalización y degradación se analizaron mediante análisis de FACS. Los estudios de internalización se realizaron usando un anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR biotinilado de murino (Mab) descrito posteriormente como 12B1 Mab y que se une a un epítope diferente del reconocido por el anticuerpo I-3466. El 9G4 Mab, fue introducido como un control de isotipo. Ambos anticuerpos se generaron en el laboratorio de los inventores de la presente invención. Células MCF-7 confluentes fueron tripsinizadas y 1 x 106 células de cada suspensión celular se colocaron placas de 96 pozos en regulador de pH FACS. Las placas se incubaron, 4 horas a 37°C ya sea con IGF1 (50 ng/ml) o con 30 µg/ml de I-3466, 9G4, mlgG1. Las células incubadas con regulador de pH FACS solas se usaron para determinar el nivel basal de expresión de IGF-IR. Después las células se lavaron dos veces y 20 µg/ml de 12BI MAb biotinilado se añadieron a la placa. Después de 30 minutos de incubación a 4°C para evitar internalización de receptor, las células se lavaron 3 veces a 4°C y se tiñeron mediante la adición de estreptavidina Alexa Fluor® 488-conjugado (Molecular Probes Europe BV, Leiden, Países Bajos). Para experimentos de degradación se añadió un paso adicional de permeabilización de células antes de teñir las células con 12B1 biotinilado y estreptavidina Alexa Fluor® 488-conjugado. El cuadro 3 muestra que I-3466 causa una regulación descendente del IGF-IR tanto sobre células MCF-7 como HT29 después de un periodo de incubación de 4 horas. No se observó regulación descendente cuando las células se incubaron con 9G4 Mab, usado como un control de isotipo.

CUADRO 3 Experimentos de internalización/deqradación de IGF-IR por el anticuerpo 1-3466 A- Experimento de internalización B- Experimento de degradación EJEMPLO 6 Efectos antitumorales de 1-3466 Mab sobre modelos de tumor de xenoinierto DU145, SK-ES-1 , HT29, A549 y MCF-7 Para explorar la actividad de anticuerpo I-3466 sobre crecimiento tumoral in vivo, se han usado cinco modelos de tumor de xenoinjerto: el cáncer de próstata DU145 independiente de andrógeno, el osteosarcoma SK-ES-1 , el cáncer de colon HT29, el cáncer de pulmón de células no pequeñas A549 y el cáncer de mama MCF-7. Para ese propósito, ratones sin pelo de 6-8 semanas atímicos hembras recibieron inyección subcutánea con 2.106, 5.107, 5.106, 10.1O6 y 5.106 para DU-145, SK-ES-1 , HT29, A549 y MCF-7 respectivamente. Para DU145 y SK-ES-1 , los ratones fueron tratados 24 horas después de la inyección de células con 200 µg de anticuerpo no purificado. El tratamiento se repitió dos veces a la semana. Con respecto a HT29, el tratamiento empezó cuando los tumores alcanzaron u volumen comprendido entre 49 y 59 mm3 y los ratones recibieron inyección intraperitoneal 3 veces a la semana con 0.5 mg de anticuerpo purificado. Para A549, los volúmenes de tumor iniciales estuvieron comprendidos entre 38 y 43 mm3 y para experimentos de MCF-7, estuvieron comprendidos entre 42 y 59 mm3 al principio del tratamiento. El volumen del tumor se evaluó una vez o dos veces a la semana y se calculó mediante la siguiente fórmula: p/6 x longitud x anchura x altura. Las figuras 6A-6E mostraron resultados parcialmente realizados con anticuerpo no purificado que indicaba que 1-3466 es capaz de inhibir significativamente el crecimiento tumoral in vivo de las 5 líneas celulares probadas.

EJEMPLO 7 Clonación, producción y caracterización del anticuerpo 1-3466 lgG1 humanizado Regiones variables químicamente sintetizadas para cadenas ligera y pesada del anticuerpo humanizado I-3466 fueron amplificadas por PCR y clonadas en vectores de expresión de anticuerpo que portaban las regiones constantes de lgG1 de cadena ligera kappa y cadena pesada respectivamente. Los iniciadores de PCR contenían 36 nucleótidos con 15 nucleótidos para templado In-Fusion con el vector traslapando la región de clonación y 21 nucleótidos para templar con las regiones variables. Las secuencias de nucleótidos exactas se muestran a continuación: para clonación de región variable de cadena ligera: IF- I-3466-LCK-F humanizado (SEQ ID No. 21 ) [d'-ACAGATGCCAGATGCGACATTGTGATGACCCAGTCC], IF- I-3466-LCK-R humanizado (SEQ ID No. 22) [d'-TGCAGCCACCGTACGCTTGATCTCCACCTTGGTGCC], para clonación de región variable de cadena pesada: IF- I-3466-HCG1-F humanizado (SEQ ID No. 23) [d'-ACAGGTGTCCACTCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT], IF- I-3466-HCG1-R humanizado (SEQ ID No. 24) [5 '-GCCCTTGGTGGATGCGGAGGAGACTGTCACCAGGGT]. Los vectores fueron linealizados con digestión por Bmtl y Fspl. La reacción de In-Fusion se llevó a cabo de conformidad con el protocolo recomendado por el proveedor. Los clones resultantes fueron confirmados por secuenciación. Células 293 de riñon embrionario humano fueron transfectadas usando ADNs de plásmido de cadena ligera y pesada. El medio que contenía anticuerpos secretados se cosechó y se concentró. El anticuerpo fue purificado por afinidad usando columna de proteína A/G y se concentró y dializó en PBS. La concentración de proteína se determinó por OD280nm y la pureza se analizó por SDS-PAGE reductor y no reductor (figuras 9A y 9B).

EJEMPLO 8 Análisis de BIACore de anticuerpo 1-3466 lgG1 humanizado Equipo y materiales Instrumento BIAcore T100, chips biosensores CM5, regulador de pH HBS-EP, regulador de pH de acetato (pH 5), regulador de pH glicina-HCI (pH 1.5), equipo de acoplamiento de amina eran de BIAcore (Upsala, Suecia). IgG Fc antihumano era de Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, EUA), receptor de factor de crecimiento- 1 similar a la insulina humana soluble (hIGF-IR), dominio extra-celular (ECD) era de R&D Systems (Minneapolis, EUA).

Prueba de Biacore Todos los experimentos se realizaron a 25°C a una velocidad de flujo de 40 µl/min. Para preparar una prueba de BIAcore (véase figura 10), un anticuerpo IgG-Fc anihumano (50 µg/ml en regulador de pH de acetato, pH 5) fue inmovilizado sobre un chip de sensor de carboximetildextrano (CM5) usando procedimientos de acoplamiento de amina como lo describe el fabricante. 11042 y 11111 unidades de resonancia (RU) de anticuerpos anti-IgG Fc fueron ligados respectivamente sobre Flowcells (FC) 1 y 3. Los Mabs purificados para ser probados se diluyeron a una concentración de 5 µg/ml en 0.5% de P20, regulador de pH de HBS-EP y se inyectaron sobre FC3 para alcanzar 500 a 1000 RU. Se uso FC1 como la célula de referencia. Señales específicas corresponden a la diferencia de señales obtenidas sobre FC2 versus FC1. El analito (hIGF-IR soluble, peso molecular aparente 365 kDa) se inyectó durante 90 seg a 5 concentraciones diferentes (100, 50, 25, 12.5 y 6.25 nM) en 0.5% de P20, regulador de pH HBS-EP. Estas concentraciones se prepararon a partir de una solución de abastecimiento en 0.5% de P20, HBS-EP. La fase de disociación del analito se monitoreó durante un periodo de 10 minutos. Regulador de pH de corrimiento también se inyectó bajo las mismas condiciones como una doble referencia. Después de cada ciclo (anticuerpo + inyección de hIGF-IR), ambas Flowcells se regeneraron mediante inyección de 20 a 45 µl de regulador de pH de glicina-HCI (pH 1.5).

Esta regeneración es suficiente para eliminar todos los Mabs y complejos de Mabs/hIGF-IR capturados en el chip sensor.

Resultados La unión de 1-3466 humanizado de Mab al analito hIGF-IR-ECD se caracterizó por las constantes de velocidad de asociación y disociación ka y kd, respectivamente. La constante de disociación de equilibrio (KD) se calculó por la relación entre constantes de velocidad de disociación y asociación. Los resultados se dan en el siguiente cuadro 4. El sensograma correspondiente a las diferentes concentraciones de analito está representado en la figura 1 1.

CUADRO 4

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo aislado, o un fragmento inmunogénico funcional del mismo, que tiene una afinidad de unión para el receptor de factor de crecimiento similar a insulina-l humana (IGF-IR), caracterizado porque al unirse el IGF-IR, inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF1 a dicho IGF-IR con una CI50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.03 nM y también inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF2 a dicho IGF-IR con una CI50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.1 nM.

2.- Un anticuerpo aislado, o un fragmento inmunogénico funcional del mismo, que tiene una actividad inhibidora de tirosina cinasa del receptor de factor de crecimiento similar a insulina-l humana (IGF-IR), caracterizado porque al unirse el IGF-IR, inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF1 a dicho IGF-IR con una CI50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.03 nM y también inhibe la unión de la pareja de unión nativa IGF2 a dicho IGF-IR con una CI50 menor que 0.3 nM, preferencialmente menor que 0.1 nM.

3.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque es también capaz de inhibir 100 % de la fosforilación inducida por IGF1 y/o IGF2 de la cadena beta de IGF-IR.

4.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque no presenta ninguna actividad intrínseca agonística.

5.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque es capaz de inducir, usando el mismo método de análisis de FACS: i) por lo menos 30 % de la internalización de IGF-IR sobre células HT29, y/o ii) por lo menos 85 % de la internalización de IGF-IR sobre células MCF-7.

6.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque es capaz de inducir, usando el mismo método de análisis de FACS: i) por lo menos 50 % de la degradación de IGF-IR sobre células HT29, y/o ii) por lo menos 65 % de la degradación de IGF-IR sobre células MCF-7.

7.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque es capaz de inhibir la proliferación in vitro inducida tanto por IGF1 como por IGF2 de células MCF-7 con CI50 por lo menos igual a 1 nM y preferencialmente por lo menos igual a OJ y 0.5 nM respectivamente para IGF1 y IGF2.

8.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad CDR escogida de las CDRs de secuencia SEQ ID No. 1 , 3 ó 5, o por lo menos una CDR cuya secuencia tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 1 , 3 ó 5, o porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR escogida de las CDRs de la secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6, o por lo menos una CDR cuya secuencia tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6.

9.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos dos de las tres CDRs o las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o por lo menos dos de tres CDRs o tres CDRs de las secuencias respectivamente teniendo por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con las secuencias SEQ ID Nos. 2, 4 y 6.

10.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos dos de las tres CDRs o las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5, o por lo menos dos de tres CDRs o tres CDRs de las secuencias respectivamente teniendo por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5.

11.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque comprende una cadena pesada que comprende las tres CDRs de las secuencias SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o tres CDRs de las secuencias respectivamente teniendo por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6 y porque además comprende unaa cadena ligera que comprende las tres CDRs de la secuencia SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5, o tres CDRs de las secuencias respectivamente teniendo por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con las secuencias SEQ ID Nos. 1 , 3 y 5.

12.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado además porque no se une de manera significativa al receptor de insulina humana (IR).

13.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho fragmento funcional es escogido de las fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc y los diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media habría sido incrementada tal como fragmentos pegilados.

14.- Un hibridoma de murino capaz de secretar un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15.- El hibridoma de murino de conformidad con la reivindicación 14, depositado en el CNCM, Instituí Pasteur, Paris, el 23 de junio de 2005 bajo el número I-3466.

16.- Un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque dicho anticuerpo es secretado por el hibridoma de conformidad con la reivindicación 15.

17.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ó 16, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de la secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 7, o una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 7, y/o porque comprende una cadena pesada de la secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 8, o una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 8.

18.- El anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico y además comprende las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón.

19.- El anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha especie heteróloga es el hombre.

20.- El anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado además porque las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano son respectivamente la región kappa y gamma-1 , gamma-2 o gamma-4.

21.- El anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado además porque comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 17, o una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 17, y/o porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 18, o una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 18.

22.- El anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende a cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 17 y porque comprende una cadena pesada de la secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 18.

23.- Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se escoge de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 16 a 22; b) un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico tal como se define en a); c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran astringencia con por lo menos una de las CDRs de la secuencia SEQ ID No. 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14, o con una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14; d) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran astringencia con por lo menos la cadena ligera de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 15 y/o la cadena pesada de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 16, o con una secuencia que tiene por lo menos 80 %, preferiblemente 85 %, 90 %, 95 % y 98 %, de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 15 y/o 16; y e) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran astringencia con por lo menos la cadena ligera de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 19 y/o la cadena pesada de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 20, o con una secuencia que tiene por lo menos 80 %, preferiblemente 85 %, 90 %, 95 % y 98 %, de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 19 y/o 20.

24.- Un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23.

25.- Una célula hospedero que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 24.

26.- Un animal transgénico con la excepción del hombre que comprende por lo menos una célula transformada por un vector de conformidad con la reivindicación 25.

27.- Un procedimiento para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 16 a 22, que comprende las siguientes etapas: a) cultivar en un medio y condiciones de cultivo apropiadas una célula de conformidad con la reivindicación 25; y b) recuperar dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, así producidos empezando a partir del medio de cultivo o las células cultivadas.

28.- Un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de ser obtenido por un procedimiento de conformidad con la reivindicación 27.

29.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13 y 16 a 22 y 28, caracterizado además porque es, además, capaz de unirse específicamente a un receptor humano de la familia de tirosina cinasa y/o capaz de inhibir la actividad de tirosina cinasa de dichos receptores.

30.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque consiste en un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la unión de EGF sobre el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) y/o inhibir la actividad de tirosina cinasa de dicho EGFR.

31.- El anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el segundo motivo de anti-EGFR es emitido desde el anticuerpo monoclonal de murino 225, su derivado quimérico C225 o cualquier anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225.

32.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque consiste en un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la actividad modulada por el receptor de HER2/neu y/o inhibir la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor de HER2/neu.

33.- El anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el segundo motivo anti-HER2/neu es emitido desde el anticuerpo monoclonal de murino 4D5 o 2C4 o el anticuerpo humanizado Trastuzumab o Pertizumab.

34.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque consiste en un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) sobre el receptor de cMET y/o inhibir la actividad de tirosina cinasa del receptor de cMET.

35.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque consiste en un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo capaz de inhibir específicamente la unión de la proteína estimulante de macrófagos (MSP) sobre el receptor de RON y/o inhibir la actividad de tirosina cinasa del receptor de RON.

36.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 35, caracterizado además porque es capaz de interactuar con cualquier tipo de receptor que esté implicado en el desarrollo de tumores tales como, por ejemplo, VEGFR, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) o CXCR4 o 2 (receptor de quimiocina de tipo 4 ó 2).

37.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, caracterizado además porque el segundo motivo se selecciona de los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', Fab'PEG, scFv, scFv-Fc y los diacuerpos, o cualquier forma cuya vida media habría sido incrementada.

38.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 37 como un medicamento.

39.- Una composición que comprende por medio de principio activo un compuesto que consiste de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38.

40.- La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque comprende por lo menos un segundo compuesto se escoge de los compuestos capaces de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET y/o RON.

41.- La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque el segundo compuesto se escoge de los anticuerpos anti-EGFR, -IGF-IR, -HER2/neu, -cMET y/o - RON aislados, o sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir la actividad inductora de diseminación proliferativa y/o anti-apoptótica y/o angiogénica y/o metastásica mediada por dicho receptor(es).

42.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 39 a 41 , caracterizada además porque comprende, como producto de combinación para un uso simultáneo, separado o secuencial, por lo menos un inhibidor de la actividad de tirosina cinasa del IR, IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET y/o RON.

43.- La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el inhibidor de la actividad de tirosina cinasa se selecciona del grupo que consiste de agentes naturales derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo- o pirrolopiridopirimidinas o bien quinazilinas.

44.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 39 a 43, caracterizada además porque comprende, además, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial, un agente citotóxico/citostático.

45.- La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque dicho agente citotóxico/citostático se escoge de las agentes que interactúan con ADN, los antimetabolitos, los inhibidores de topoisomerasa I o II, o agentes inhibidor y estabilizador de huso o bien cualquier agente capaz de ser usado en quimioterapia.

46.- La composición de conformidad con la reivindicación 44 ó 45, caracterizada además porque dicho agente citotóxico/citostático es acoplado químicamente a por lo menos uno de los elementos de la composición para uso simultáneo.

47.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 44 a 46, caracterizada además porque dicho agente citotóxico/citostático se escoge de los agentes inhibidor y estabilizador de huso, preferiblemente vinorelbina, vinflunina o vincristina.

48.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 47, caracterizada además porque uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, es conjugado con una toxina celular y/o un radioelemento.

49.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48 como un medicamento.

50.- El uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38 y/o de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 49 para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de una enfermedad conectada con una sobreexpresión y/o una activación anormal del IGF-IR, y/o conectada con una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción de IGF1 o IGF2 con IGF-IR.

51.- El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la administración de dicho medicamento no induce o sólo induce ligeramente efectos secundarios conectados con la inhibición del receptor de insulina IR.

52.- El uso como se reclama en la reivindicación 50 ó 51 para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la transformación de células normales en células con carácter tumoral y/o el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales, preferiblemente células dependientes de IGF, por lo menos células dependientes de IGF2.

53.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52 para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de cáncer.

54.- El uso como se reclama en la reivindicación 53, en donde el cáncer es un cáncer escogido de cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer endometrial, mieloma múltiple, cáncer de ovario o cáncer de colon.

55.- El uso como se reclama en la reivindicación 54, en donde el cáncer es cáncer de colon.

56.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52 para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de psoriasis o aterosclerosis.

57.- Un método de diagnóstico in vitro de condición patológica que tiene expresión aberrante de IGF-IR en relación con la normal que comprende poner en contacto una muestra biológica que se sospecha que contiene IGF-IR, con el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38, bajo condiciones que favorecen la formación de un complejo IGF-IR/anticuerpo, y detectar el complejo como indicando la presencia del IGF-IR en la muestra.

58.- El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque dicho anticuerpo es detectablemente marcado.

59.- El método de conformidad con la reivindicación 57 ó 58, caracterizado además porque la expresión aberrante de IGF-IR es una sobreexpresión de IGF-IR.

60.- El método de conformidad con la reivindicación 57 ó 58, caracterizado además porque la expresión aberrante de IGF-IR es una subexpresión de IGF-IR.

61.- Un método de diagnóstico para predecir un potencial oncogénico de una muestra de células de próstatas, que comprende: (a) proveer una muestra de pulmón humano o tejido de mama; y (b) determinar, en la muestra, la presencia de IGF-IR, el paso comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 ó 28 a 38 bajo condiciones que favorecen la formación de un complejo de IGF-IR/anticuerpo, en donde la presencia de dicho complejo indica el potencial oncogénico de las células en el tejido.

62.- El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque la presencia del complejo indica que el paciente está en riego de desarrollo o el inicio de un trastorno patológico que tiene sobreexpresión del IGF-IR.

63.- Un método para seguir el progreso de un régimen terapéutico diseñado para aliviar un trastorno patológico que tiene una expresión anormal de expresión de IGF-IR, que comprende: (a) probar una muestra de un sujeto para determinar el nivel de IGF-IR en un primer punto de tiempo; (b) probar la muestra en un segundo punto de tiempo; y (c) comparar el nivel en el segundo punto de tiempo al nivel determinado en (a) como una determinación del efecto del régimen terapéutico en donde una disminución en el nivel de IGF-IR en la muestra es determinante de la regresión del trastorno patológico en el paciente o un incremento en el nivel de IGF-IR es determinante de la progresión del trastorno patológico en el paciente.

64.- Un equipo o conjunto para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedad inducida por una sobreexpresión o una subexpresión del IGF-IR o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del IGF-IR en una muestra biológica, preferiblemente una sobreexpresión del receptor, caracterizado porque el equipo o conjunto comprende los siguientes elementos: a) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38; b) opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorable para la reacción inmunológica; c) opcionalmente, los reactivos que permiten la demostración de complejos de IGF-IR/anticuerpo producidos por la reacción inmunológica.

65.- El uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38, para la preparación de un medicamento destinado para la dirección específica de un compuesto biológicamente activo a células que expresan o sobre-expresan el IGF-IR.

66.- Un método para modular la actividad de IGF-IR en células de mamífero que responden a IGF-IR que comprende: poner en contacto las células con un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38 bajo condiciones suficientes para modular la actividad de dicho IGF-IR en relación con células que no responden a IGF-IR.

67.- Un método para disminuir la actividad de IGF-IR en células de mamífero que responden a IGF-IR en relación con células normales que comprende: poner en contacto las células con un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38.

68.- Un método para identificar un modulador de IGF-IR que comprende: a) poner en contacto IGF-IR con el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 y 28 a 38; b) poner en contacto el complejo de (a) con una genoteca de compuestos; c) identificar un compuesto que perturba el complejo de (a); y d) determinar si el compuesto presenta actividad agonista o antagonista en el IGF-IR, en donde esta actividad indica identificación de un modulador de IGF-IR.

69.- Un método para detectar una pareja de unión para el anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 ó 28 a 38 en una muestra, el método comprende: a) incubar el anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 13, 16 a 22 ó 28 a 38 con una muestra biológica obtenida de un paciente que se presenta con un trastorno proliferativo de células que tiene nivel anormal de expresión y/o activación de IGF-IR humano bajo condiciones suficientes para permitir unión específica del anticuerpo a su pareja de unión y b) detectar unión específica, en donde la unión específica indica la presencia de una pareja de unión en la muestra.

70.- Un método para purificar un IGF-IR de una muestra, el método comprende: a) incubar el anticuerpo de la reivindicación 1 a 13, 16 a 22 ó 28 a 38 con una muestra bajo condiciones para permitir unión específica del anticuerpo y el receptor, y b) separar el anticuerpo de la muestra y obtener el receptor purificado.