JP5198289B2 - 前立腺癌の治療用アジュバントとしてのｉｇｆ−ｉｒアンタゴニスト - Google Patents

Description

［連邦政府資金］
本発明は、国立衛生研究所からの認可番号ＣＡ８５８５９および国防総省からの認可番号Ｗ８１ＸＷＨ−０４−１−０９１２の下で米国政府支援を一部受けてなされた。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。

［関連出願の相互参照］
本出願は、２００６年２月３日に出願された米国出願第６０／７６５，０７２号（全体として参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。

［発明の分野］
本発明は、アンドロゲン枯渇療法およびインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）アンタゴニストにより前立腺癌を治療する方法に関する。前記方法は、アンドロゲン依存性癌のアンドロゲン非依存性癌への移行を阻害するかまたは遅らせ、再発の危険性を著しく減少させ、治療成果を改善する。

前立腺癌は米国人において最も一般的な皮膚以外の癌であり、癌では２番目に死亡率が高い。ほとんどの前立腺癌は、初期はアンドロゲン依存性（ＡＤ）である。前立腺癌細胞は、初期は継続して増殖するためにアンドロゲンを必要とする。手術（睾丸摘出）または薬物療法（ＧｎＲＨ作用薬またはエストロゲン）のいずれかによるアンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）によるテストステロンの除去に対する反応により、感受性前立腺癌細胞のアポトーシスが迅速に誘発される。陽性反応速度は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）における減少および腫瘍体積の固定化または減少に基づいて、約８６％である。細胞死は一般に最初の数日間から１週間以内に起こる。しかしながら、陽性反応の次に成長停止期間があり、この期間内に残存する細胞は死なない傾向にある。ホルモン除去後１８〜３６ヶ月で、症例の９０％で成長が再発する。生き残った癌細胞はアンドロゲン非依存性になるか、または無反応になり、その後にアンドロゲン非依存性（ＡＩ）腫瘍成長が起こる。ＡＤＴは、最初は非常に有効であるので、ＡＤＴの恩典の利点を利用し、その効果を延長または向上させる治療法は大きな利点である。

アンドロゲン非依存性は様々なメカニズムにより生じるようである。アンドロゲン受容体遺伝子における突然変異は診断時ではまれであるが、抗アンドロゲンフルタミドにさらされた後に増加する。しかしながら、これらの突然変異は、大部分の患者において起こらず、ホルモン抵抗性疾患のほとんどの症例を説明することができない。高レベルのｂｃｌ−２が、限局性疾患と比較して進行した疾患において高い頻度で観察される。従って、アポトーシスを誘発する能力は、疾患が進行するにつれ減少する。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の突然変異を有する細胞の増殖、ＴＧＦ−β受容体の喪失、およびペプチド成長因子の発現は、ホルモン抵抗性状態の進行に関与する可能性が高い。しかしながら、これらのプロセスによっては、進行の速度および頻度を説明できない。

インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）は、正常な胎児および出生後の成長および発育に必須であるユビキタス膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは細胞増殖、細胞分化、細胞のサイズにおける変化を刺激し、細胞をアポトーシスから保護することができる。これは細胞形質転換にある程度必須であると考えられてきた（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７：１０５０−９３（２０００）；Ｂａｓｅｒｇａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：５５７４−８１（２０００）に概説）。ＩＧＦ−ＩＲはほとんどの細胞型の細胞表面上に位置し、成長因子ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（以下、まとめてＩＧＦと称する）のシグナル伝達分子としての働きをする。ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦと結合するよりも１０００倍低い親和力ではあるが、インスリンとも結合する。ＩＧＦ−ＩＲは、ジスルフィド結合により共有結合した２つのα鎖および２つのβ鎖を含有する、前駆形成されたヘテロ四量体である。受容体サブユニットは１８０ｋｄの単一ポリペプチド鎖の一部として合成され、続くタンパク質分解により、α（１３０ｋｄ）およびβ（９５ｋｄ）サブユニットにされる。α鎖は全て細胞外にあり、リガンド結合部位を含有する。β鎖は膜貫通ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、ならびに細胞分化および形質転換に必要なＣ末端伸長を有するが、マイトジェンシグナル伝達およびアポトーシスからの保護に関して重要ではない。

ＩＧＦ−ＩＲは、インスリン受容体（ＩＲ）と、特にβ鎖配列において非常に類似している（７０％相同性）。近年の研究は、これらの受容体が、この相同性により、１つのＩＲ二量体および１つのＩＧＦ−ＩＲ二量体を含有するハイブリッドを形成できることを証明した（Ｐａｎｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：１９３５−１９（１９９９））。ハイブリッドの形成は、正常細胞および形質転換細胞の両方において起こり、ハイブリッド含有量は細胞内の２つのホモダイマー受容体（ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲ）の濃度に依存する。３９の乳癌試料を用いた一研究では、ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲはどちらも全ての腫瘍サンプルにおいて過剰発現されたが、ハイブリッド受容体含有量は一貫して両ホモ受容体のレベルを約３倍超過していた（Ｐａｎｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：１９３５−４４（１９９９））。ハイブリッド受容体はＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲ対からなるが、ハイブリッドはＩＧＦ−ＩＲの親和力と同等の親和力でＩＧＦと選択的に結合し、インスリンとは弱くしか結合しない（ＳｉｄｄｌｅおよびＳｏｏｓ，Ｔｈｅ ＩＧＦ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．１９９−２２５．１９９９）。従って、これらのハイブリッドはＩＧＦと結合することができ、正常細胞および形質転換細胞の両方においてシグナルを変換することができる。

ＩＧＦ−Ｉの内分泌発現は主に成長ホルモンにより制御され、肝臓において産生されるが、最新の証拠は、多くの他の組織タイプもＩＧＦ−Ｉを発現できることを示唆している。従って、このリガンドは、内分泌および傍分泌によって調節され、多くの種類の腫瘍細胞の場合においては自己分泌される（Ｙｕ，Ｈ．およびＲｏｈａｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２：１４７２−８９（２０００））。

アンドロゲン受容体（ＡＲ）は３つの機能的および構造的ドメイン：Ｎ末端（調節）ドメイン；標的ＤＮＡ配列（リガンド反応性エレメント）との特異的結合を調節するＤＮＡ結合ドメイン（Ｉｎｔｅｒｐｒｏアクセッション番号ＩＰＲ００１６２８）；及びホルモン結合ドメインからなる。Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）はアンドロゲン受容体に特有であり、最初の約５３０残基に及び、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメインはより小さく（６５残基付近）、タンパク質の中心部分を占め、ホルモンリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は受容体Ｃ末端に位置する。リガンドの非存在下で、ステロイドホルモン受容体は核成分と弱く結合すると考えられ、ホルモン結合は受容体親和性を大きく増大させる。アンドロゲン受容体（ＡＲ）、アンドロゲン、および前立腺癌の相互作用は複雑である。核および細胞質間のＡＲの分布は、アンドロゲンおよびアンドロゲン消失により影響を受ける。例えば、去勢していない雄マウスにおいて増殖させたＬｕＣａＰ３５細胞では核においてのみＡＲ免疫活性が観察されるが、その後去勢された雄マウスにおいて増殖させたＬｕＣａＰ３５では細胞質および核において強力な免疫活性が観察された。

本発明は、アンドロゲン依存性腫瘍、例えば前立腺癌の治療に関する。前立腺腫瘍は典型的にはアンドロゲン、例えばテストステロンにより刺激され、アンドロゲン依存性（ＡＤ）成長を示す。従って、前立腺癌の治療は典型的には、前立腺癌細胞からアンドロゲンを奪う療法を含む。しかしながら、前立腺癌の大部分は最終的にはアンドロゲン非依存性（ＡＩ）へ移行する。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストをアンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）と組み合わせて投与することにより、ＡＤ腫瘍のＡＩ腫瘍への移行が阻害または予防されることが見出された。

従って、本発明は、アンドロゲン枯渇療法とＩＧＲ−ＩＲアンタゴニストの投与によるアンドロゲン依存性癌の治療法を提供する。本発明の１つの実施形態において、アンドロゲン依存性癌は前立腺癌である。

本発明によると、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは細胞外アンタゴニストまたは細胞内アンタゴニストであり得、複数のアンタゴニストを用いることができる。さらに一般的には、本発明は、腫瘍細胞のＡＤからＡＩへの移行を阻害するための、ＩＦＧ−ＩＲシグナル変換の阻害および経路の構成要素の調節に関する。細胞外アンタゴニストとしては、これに限定されないが、ＩＧＦ−ＩＲまたはそのリガンド（ＩＧＦ）と結合するタンパク質または他の生体分子が挙げられる。本発明のある実施形態において、細胞外アンタゴニストはＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦとの結合を阻害する。一つの実施形態において、結合タンパク質は抗体、例えば、ＩＭＣ−Ａ１２などである。別の実施形態において、結合タンパク質はＩＧＦ−ＩＲの可溶性リガンド結合フラグメントである。細胞内ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは生体分子であり得るが、通常、小分子である。本発明の一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、ＡＧｌ０２４、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、およびＢＭＳ−５５４４１７から選択される小分子である。

ＩＧＦ−ＩＲシグナル変換を阻害するための様々なアンタゴニストの有効性は、例えば、ＩＧＦ−ＩＲシグナル変換経路の構成要素の状態を分析することにより観察され得る。一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲの阻害は、Ａｋｔのリン酸化反応の減少として観察される。別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害は、サバイビンまたはチューブリンβ−ペプチド（ＴＵＢＢ）の発現の減少として観察される。

本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは任意の形態のＡＤＴとともに使用される。本発明の一つの実施形態において、ＡＤＴは睾丸摘出を含む。本発明の別の実施形態において、ＡＤＴは黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体の投与を含む。別の実施形態において、ＡＤＴは抗アンドロゲンの投与を含む。さらに別の実施形態において、副腎アンドロゲン阻害剤が投与される。本発明によると、ＡＤＴの複数の方法を組み合わせることができる。

本発明はさらにＡｋｔによるシグナル伝達の阻害を提供する。従って、本発明は、Ａｋｔを活性化するシグナル変換タンパク質のモジュレータの投与を含む。一つの実施形態において、このようなモジュレータはＥＧＦＲのアンタゴニストである。

本発明に従って、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストがＡＤＴのアジュバントとして投与される。一つの実施形態において、ＡＤＴとＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの投与は、ほぼ同時に開始される。別の実施形態において、ＡＤＴがまず開始され、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストはアンドロゲン非依存性癌がアンドロゲン非依存性になる前に投与される。本発明はさらに、ＡＤＴおよびＩＧＦ−ＩＲアンタゴニスト投与と合わせた抗腫瘍薬の使用を提供する。本発明の一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよびＡＤＴ剤は、前立腺癌の外科治療または放射線治療のネオアジュバントとして合わせて使用される。

本発明はまた、剤形中にＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストとＡＤＴ剤とを含む組成物も提供する。

ＩＧＦ−ＩＲの阻害剤は前立腺癌の治療用治療薬として有用であることが見出されている。特に、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストをアンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）と組み合わせて投与すると、ＡＤＴ単独と比較して改善された治療結果をもたらす。

アンドロゲンはインスリン様成長因子Ｉ受容体発現を上方制御し、前立腺癌をＩＧＦ−Ｉの効果に対する感受性を高めることが観察された。同様に、前立腺癌細胞において観察されるアンドロゲン非依存性への移行は、低いレベルの循環アンドロゲンに対しても細胞が感受性になるようなＡＲレベルの増加や非アンドロゲンステロイドによる活性化を可能にするＡＲ突然変異といった、アンドロゲン受容体シグナル伝達を増大させる細胞の適応の結果として生じ得る。まさに、ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達が実際に腫瘍細胞の核へのＡＲ移行に介在し、ＡＲ依存性遺伝子の上方制御に至ることが示されている。このようなやり方で、循環レベルのアンドロゲンの非存在下でＡＲシグナル伝達を促進することによるホルモン除去療法後に、ＩＧＦ−Ｉによってアンドロゲン依存性前立腺癌のアンドロゲン非依存性への変換が促進され得ることが提案されている。ヒトおよびヒト前立腺異種移植片からの最近のデータもまた、現在のアンドロゲン除去方法は、アンドロゲン受容体の活性化が起こらないレベルまで前立腺アンドロゲンを減少させることができないことを示す。前立腺は実際に、いくつかの前駆体ステロイドおよびおそらくはアセテートからもＤＨＴを合成できる。

従って、ホルモン除去療法を伴うＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の阻害は、前立腺癌のアンドロゲン非依存性疾患への変換を予防するか、または変換までの時間を延長することができ、著しく再発の開始を遅らせることになる。従って、ＩＧＦ−ＩＲのアンタゴニストは、新たに診断され、局所的に進行したかまたは転移性であるホルモン依存性前立腺癌を治療するためのアンドロゲン枯渇法に対して有効なアジュバント療法であり得る。

ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストをアンドロゲン消失とともに使用することも、ＩＧＦが介在するアポトーシスからの回復をブロックする可能性を有する。ＩＧＦ−ＩＲがアポトーシスを無効にできるメカニズムは、ｒａｓ−ｒａｆ−ｍａｐキナーゼ、ｍＴＯＲおよびフォークヘッドシグナル伝達を含むＰＩ３キナーゼ、ならびに１４−３−３の阻害を含む。ＩＧＦ−ＩＲ阻害がアンドロゲン消失の効果を延長できることによる別のメカニズムは、初期アポトーシス後の細胞周期停止において腫瘍を維持することによる。

従来の研究は、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストが、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性前立腺癌の両方の異種移植片を治療するために使用される場合、プラスの効果を有し得ることを示してきた。異種移植片の増殖は、減速するが、停止または逆転しなかった。ＩＧＦ−ＩＲのアンタゴニストは、アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）とともに投与された場合に、前立腺癌の治療に特に有用であることが見出されている。典型的には、前立腺腫瘍はアンドロゲン非依存性に移行し、ＡＤＴに非感受性になる。すでに観察されているように、このようなアンドロゲン非感受性腫瘍は、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストに対して強力な反応を示さない傾向がある。しかしながら、本明細書において示されるように、前立腺腫瘍のＡＤからＡＩへ進行する時間は、ＡＤＴをＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの投与と組み合わせる療法により有意に延長される。この延長された期間中で、腫瘍はサイズが小さくなり、ＰＳＡレベルが減少する。併用療法は、ＡＤＴ単独に関して見られる高い再発リスクを減少させ、転移性癌が発達するリスクを減少させる。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストでの治療も、転移が潜在的に存在するか、または診断されているような進行した前立腺癌の治療に有利である。

前立腺癌細胞を移殖したモデルにおいて、細胞質から核へのＡＲ移行は、アンドロゲン刺激によってだけでなく、それほどではないが、ＩＧＦ−ＩＲ刺激によっても誘発されることが観察される。アンドロゲンの存在下でさえも、アンドロゲンおよびＩＧＦの存在下でのＡＲ移行は、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストにより減少する。

前立腺において、去勢後に、低レベルのアンドロゲンが依然として検出可能である。ＡｋｔシグナルによるＩＧＦ−ＩＲの発現は、去勢に反応してまず減少するが、次に増加することも報告され、さらにＡｋｔの成長因子刺激は低レベルのアンドロゲンに対するＡＲシグナル伝達を向上させることが報告されている。

本明細書において示されるように、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストを用いた治療は去勢マウスにおける腫瘍の再発を著しく遅らせる。さらに、減少した核ＡＲと減少した腫瘍体積の間には良好な相関関係がある。このことは、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害はＡＲによる腫瘍進行を抑制するのに大きな役割を果たすことを示唆する。本明細書において記載される実験において、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達は、ＩＧＦ−ＩＲと結合するＡ１２と表示される抗体を用いて阻害される。Ａ１２および類似の抗体に関する従来の実験は、ＥＲＫおよびＭＡＰＫ、特にＡｋｔを含む様々なシグナル変換分子のリン酸化反応（即ち、活性化）が減少することを示す。ＩＧＦ−ＩＲの阻害効果は、Ｍｌ２前立腺腫瘍株（Ｗｕ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：３０６５−７４）およびＭＣＦ７乳癌細胞（Ｂｕｒｔｒｕｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６３：８９１２−２１）を含む様々な腫瘍細胞型において観察される。従って、当然のことながら、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストに関して本明細書で観察されたのと同一または類似のアジュバント活性が、Ａｋｔ活性化に対して同一または類似の影響を及ぼす薬剤に関しても観察される。

ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストでの治療の結果、核へのＡＲ移行が阻害されることが観察される。阻害は、組織化学的または蛍光顕微鏡により、またＡＲ誘発性遺伝子の発現レベルの減少により観察することができる。去勢に対する耐性に関連する２つの遺伝子と、サバイビンと、チューブリンβ−ペプチドは、Ａｋｔ活性化を介してＩＧＦ−ＩＲにより制御される。遺伝子の発現は、去勢のみのものよりも、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストで治療された去勢マウスにおいて抑制される。ＡＲ移行およびＡｋｔによって活性化される遺伝子発現に対する同様の阻害効果が、Ａｋｔ特異的な阻害物質またはＡｋｔを含む別のシグナル変換経路のアンタゴニストに反応して、有意な程度まで観察される。

様々なＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストを本発明に従って用いることができる。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは細胞外アンタゴニストまたは細胞内アンタゴニストであり得る。細胞外および細胞内ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、生体分子、小分子、あるいは、例えば受容体の細胞外結合領域との相互作用（即ち、細胞外アンタゴニスト）、ＩＧＦ−ＩＲの細胞内チロシンキナーゼドメインのリン酸化反応の阻害、またはＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達経路に含まれる任意の他の細胞成分の活性化との相互作用の阻害によりＩＧＦ−ＩＲの活性化を阻害し、これにより最終的に遺伝子活性化または細胞増殖を阻害する、任意の他の物質であり得る。

本発明の一つの実施形態において、細胞外ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、アンタゴニストと受容体の細胞外結合領域との十分な物理的または化学的相互作用により、受容体の細胞外リガンド結合領域と相互作用し、その結果、ＩＧＦ−ＩＲおよびそのリガンド（ＩＧＦ）の結合がブロックされ、受容体のチロシンキナーゼ活性が阻害される。当業者は、会合または結合を含むこのような化学的相互作用の例が、当分野において公知であり、アンタゴニストと細胞外結合領域間の共有結合、イオン結合、水素結合などを含むことを理解する。本発明の一つの実施形態において、細胞外ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは生体分子である。生体分子としては、これに限定されないが、ＩＧＦ−ＩＲと結合する抗体または抗体フラグメントが挙げられる。別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、ＩＧＦ−ＩＲに対するリガンド結合をブロックする小分子であり得る。別の実施形態において、細胞外アンタゴニストは、ＩＧＦ−ＩＲリガンドを抑制または分解する物質である。一例は、ＩＧＦと結合するＩＧＦ−ＩＲの可溶性細胞外フラグメントである。このような物質の別の例は、例えばＩＧＦ受容体活性化を制限するために、例えば、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、およびＩＧＦＢＰ−３などと結合できるＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）である。本発明の別の実施形態において、小分子阻害剤は、ＩＧＦ−ＩＲのリガンド結合ドメインと結合し、ＩＧＦ−ＩＲリガンドによる結合および受容体活性化を阻害する。

理論に拘束されることを望まないが、細胞外ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、ＩＧＦ−ＩＲ活性化後のＩＧＦ−ＩＲの細胞外領域における構造変化から始まる全てのシグナル変換カスケードを阻害すると考えられる。この阻害は、表面ＩＧＦ−ＩＲならびに細胞内に取り込まれたＩＧＦ−ＩＲを含む。例えば、活性化受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、シグナル伝達活性を維持しつつ、クラスリン被覆ピットを通ってエンドソーム中へ内在化され得ると考えられる。内在化後、このような受容体は、細胞表面へ戻されるか、あるいはエンドソームまたはリソソームに分解するかのいずれかである。

ＩＧＦ−ＩＲ介在シグナル変換を阻害する別の方法は、ＩＧＦ−ＩＲ発現を下方制御することによる。本発明の一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは受容体と結合し、受容体内在化および分解を促進する。別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは受容体の発現を減少させる。

生体分子は、本発明の文脈においては、すべてのアミノ酸、ヌクレオチド、脂質および一般に６５０Ｄより大きな分子量を有する単糖類のポリマーを含む。従って、生体分子は、例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにオリゴ糖および多糖類を含む。生体分子はさらに、前記の分子のいずれかの誘導体も含む。例えば、生体分子の誘導体は、脂質およびグリコシル化誘導体またはオリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質を含む。生体分子の誘導体はさらに、オリゴ糖および多糖類、例えば、リポ多糖類の脂質誘導体を含む。最も典型的には、生体分子は抗体またはその機能的誘導体である。

小分子は、有機化合物、例えば、複素環、ペプチド、糖、ステロイドなど、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、ならびに無機化合物を含む。小分子中の原子は共有結合およびイオン結合により結合し、前者は小分子有機化合物、例えば、小分子チロシンキナーゼ阻害剤に典型的であり、後者は小分子無機化合物に典型的である。小分子有機化合物における原子の配列は、鎖、例えば、炭素−炭素鎖または炭素−複素原子鎖を表わしてもよいか、または炭素原子を含有する環、例えばベンゼンまたは多環系、あるいは炭素および複素原子の組み合わせ、即ち、複素環、例えば、ピリミジンまたはキナゾリンを表わしてもよい。小分子は任意の分子量を有し得るが、これらは一般に、その分子量が６５０Ｄより大きくないことを除き、それ以外の点では生体分子と見なされる分子を含む。小分子は、本来見出される化合物、例えば、ホルモン、神経伝達物質、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質、およびその誘導体ならびに伝統的な有機合成、生合成、またはその組み合わせのいずれかにより合成される化合物の両方を含む。例えば、Ｇａｎｅｓａｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ７（１）：４７−５５（Ｊａｎ．２００２）；Ｌｏｕ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，６（２４）：１２８８−１２９４（Ｄｅｃ．２００１）参照。化合物は、有効性、安定性、医薬適合性などを向上させるために修飾され得る。

細胞内ＩＧＦＩＲアンタゴニストは生体分子、例えば、突然変異受容体サブユニット、細胞内結合タンパク質（例えば、細胞内で発現された抗体のフラグメント）などであり得る。好ましい実施形態において、細胞内アンタゴニストは小分子である。小分子阻害剤は、これに限定されないが、ＡＴＰ結合ドメイン、基質結合領域、またはＩＧＦ−ＩＲのキナーゼドメインを修飾またはブロックする小分子を含む。小分子阻害剤はまた、これに限定されないが、ｒａｓ−マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、およびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ経路を含むＩＧＦ−ＩＲシグナル変換経路の他の成分の阻害剤である物質を含む。

アンタゴニストを同定するために、生化学、酵素、または細胞ベースのハイスループットなアッセイを用いて、小分子ライブラリーを阻害活性についてスクリーニングすることができる。試験化合物の、ＩＧＦ−ＩＲとＩＧＦ−ＩＲリガンドもしくは基質ＩＲＳ−１との結合を阻害する能力またはＩＧＦ−ＩＲ二量体からの機能的受容体形成を阻害する能力を検出するためにアッセイを策定することができる。細胞内ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、キナーゼドメインを有する細胞内領域と結合するか、または細胞内領域の活性化を阻害するか、ＩＧＦ−ＩＲのシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内タンパク質と結合するか、または任意の細胞内タンパク質の活性化を阻害することにより、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を阻害することができる。ＩＧＦ−ＩＲの小分子アンタゴニストは、例えば、インスリン様成長因子Ｉ受容体選択的キナーゼ阻害剤ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：２３１−９）およびＮＶＰ−ＡＤＷ７４２（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：２２１−３０）、ＩＧＦ−ＩＲおよびＨＥＲ２を選択的に阻害するＩＮＳＭ−１８（Ｉｎｓｍｅｄ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、および基質結合をブロックすることによりリン酸化反応を阻害し、ＩＲリン酸化よりもＩＦＧ−ＩＲリン酸化反応の阻害について著しく低いＩＣ_５０を有するチロシンキナーゼ阻害剤トリホスチン（ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎｓ）ＡＧ１０２４およびＡＧ１０３４（Ｐａｒｒｉｚａｓ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：１４２７−３３）を含む。その他、シクロリグナン誘導体ピクロポドフィリン（ＰＰＰ）は、ＩＲ活性を妨害することなくＩＧＦ−ＩＲリン酸化反応を阻害するＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストである（Ｇｉｒｎｉｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２３６−４２）。他の小分子ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、ベンゾイミダゾール誘導体ＢＭＳ−５３６９２４（Ｗｉｔｔｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：５６３９−４３）およびＢＭＳ−５５４４１７（Ｈａｌｕｓｋａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３６２−７１）を含み、これはＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲをほぼ等しく阻害する。ＩＧＦ−ＩＲに加えて受容体を阻害する化合物について、直接結合アッセイによってインビトロで測定されたＩＣ_５０値は、エクスビボまたはインビボ（即ち、インタクトな細胞または生物）で測定されたＩＣ_５０値を反映しないかもしれないことに注目すべきである。例えば、ＩＲの阻害を回避しようとする場合、インビトロでＩＲを阻害する化合物を、ＩＧＦ−ＩＲを有効に阻害する濃度でインビボにおいて用いても、受容体の活性に著しく影響を及ぼさないかもしれない。

アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は標的ｍＲＮＡの分解をもたらし、その結果としてタンパク質の翻訳を防止する。従って、受容体チロシンキナーゼおよびＩＧＦシグナル伝達に重要な他のタンパク質の発現を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を抑制する能力は、２５年以上も前に見出されている（ＺａｍｅｃｎｉｋおよびＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７５：２８０−８４）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡと塩基対を形成し、スプライシング、ポリアデニル化、エクスポート、安定性、およびタンパク質翻訳を含むＲＮＡプロセッシングおよびメッセージ翻訳のいくつかの段階を潜在的に妨害し得る（ＳａｚａｎｉおよびＫｏｌｅ，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：４８１−８６）。しかしながら、２つの最も強力で広く用いられるアンチセンス法は、ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡの分解、および異常なスプライス部位を標的とすることによるスプライシングの変更である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を認識し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’〜３’末端間の中程でＲＮＡを切断する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩＧＦ−ＩＲの阻害は、Ｗｒａｉｇｈｔ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５２１−６において例示されている。

ＲＮＡ介在性のメカニズムは元来、ｍＲＮＡ安定性、メッセージ翻訳、およびクロマチン構成を調節できる（ＭｅｌｌｏおよびＣｏｎｔｅ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１：３３８−４２）。さらに、外部から導入された長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、様々な下等生物における遺伝子サイレンシングのための有効なツールである。しかしながら、哺乳動物において、長いｄｓＲＮＡは、ウイルス感染およびインターフェロン産生の効果に関連する毒性の高い反応を惹起する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２５：５０９−１３）。これを回避するために、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−９８）は、５’リン酸および２塩基３’オーバーハングを各鎖上に備え、細胞中へ導入されると、標的とされるｍＲＮＡを選択的に分解する１９ｍｅｒの二本鎖からなるｓｉＲＮＡの使用を開始した。

哺乳動物における干渉ｄｓＲＮＡの作用は、通常、２つの酵素段階を含む。第一に、ダイサー（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ型酵素）は、ｄｓＲＮＡを２１〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡセグメントに開裂させる。次に、ＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）はＲＮＡ二本鎖を解き、１つの鎖を同族ｍＲＮＡにおける相補領域と対合させ、ｓｉＲＮＡ鎖の５’末端の１０ヌクレオチド上流の部位での開裂を開始する（Ｈａｎｎｏｎ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ．４１８：２４４−５１）。１９〜２２ｍｅｒの範囲の短い、化学的に合成されたｓｉＲＮＡはダイサー段階を必要とせず、ＲＩＳＣ機構に直接入ることができる。ＲＮＡ二本鎖のいずれかの鎖は潜在的にＲＩＳＣ複合体上にロードすることができるが、オリゴヌクレオチドの組成は、鎖の選択に影響を及ぼし得ることに注意すべきである。従って、特定のｍＲＮＡ標的の選択的分解を達成するためには、二本鎖は、その５’末端で比較的弱い塩基対合を有することにより、アンチセンス鎖成分のローディングに有利であろう（Ｋｈｖｏｒｏｖａ，２００３，Ｃｅｌｌ １１５：２０９−１６）。外因性ｓｉＲＮＡは、合成オリゴヌクレオチドとして提供でき、あるいはプラスミドまたはウイルスベクターから発現させることができる（ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：２１７−２４）。後者の場合、前駆体分子は通常、４〜８ヌクレオチドのループおよび１９〜３０ヌクレオチドの幹部を含有する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として発現され、これらは次にダイサーにより開裂されて、機能的ｓｉＲＮＡを形成する。

本発明に従って使用される抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、以下の性質の１つ以上を示す。

１）抗体はＩＧＦ−ＩＲの外部ドメインと結合し、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＲに対する結合を阻害する。阻害は、例えば、精製または膜結合受容体を用いた直接結合アッセイにより決定できる。この実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、ＩＧＦ−ＩＲと、ＩＧＦ−ＩＲ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）の天然のリガンドと少なくとも同程度の強さで結合する。

２）抗体はＩＧＦ−ＩＲを中和する。リガンド、例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの、ＩＧＦ−ＩＲの外部細胞外ドメインに対する結合は、βサブユニットの自己リン酸化反応およびＭＡＰＫ、Ａｋｔ、およびＩＲＳ−１を含むＩＦＧ−ＩＲ基質のリン酸化反応を刺激する。

ＩＧＦ−ＩＲの中和は、通常、シグナル変換と関連する１つ以上の活動の阻害、縮小、不活性化および／または途絶を含む。中和は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで、例えば、組織、培養された細胞、または精製された細胞成分を用いて決定され得る。中和は、ＩＧＦ−ＩＲ／ＩＲヘテロ二量体ならびにＩＧＦ−ＩＲホモ二量体の阻害を含む。従って、中和ＩＧＦ−ＩＲは、成長（増殖および分化）、血管形成（血管補充、侵入、および転移）、および細胞運動および転移（細胞接着および侵襲性）の阻害、縮小、不活性化および／または途絶を含む様々な効果を有する。

ＩＧＦ−ＩＲ中和の一つの指標は、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を用いて、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化反応レベル、および／または天然または合成基質のリン酸化反応を測定することにより決定され得る。従って、リン酸化反応アッセイは、本発明の文脈において中和抗体の決定に有用である。リン酸化反応は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットでホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出できる。チロシンキナーゼ活性についてのいくつかのアッセイは、Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．２８３：１４３３−４４およびＢａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１４３−５０において記載されている。本発明の抗体は、リガンドに対して反応する細胞において、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％のＩＧＦ−ＩＲのチロシンリン酸化反応の減少を引き起こす。

ＩＧＦ−ＩＲ中和の別の指標は、ＩＧＦ−ＩＲの下流基質のリン酸化反応の阻害である。従って、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、またはＩＲＳ−１のリン酸化反応のレベルを測定できる。基質リン酸化反応の減少は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％である。

加えて、タンパク質発現の検出法は、ＩＧＦ−ＩＲ中和を決定するために用いることができ、測定されるタンパク質はＩＧＦ−ＩＲチロシンキナーゼ活性により調節される。癌進行および薬剤耐性に関連するこのようなタンパク質の一例はサバイビンであり、これはアポトーシス阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーである。サバイビン調節は複雑で、複数の経路が仲介するが、Ａｋｔが介在し、ＩＧＦ−Ｉにより増加する調節が示されている。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：２４７４−８２参照。遺伝子発現を分析する方法としては、タンパク質発現の検出のための免疫組織学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合性放射性リガンド結合アッセイ、固体マトリックスブロッティング技術、例えば、ノザンおよびサザンブロット、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡが挙げられる。例えば、Ｇｒａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ，７８：１２８４−９２；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８５：５６７−７１；Ｓａｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４８：１０４７−５３；Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，Ｇｌｉａ １５：２８９−９６；Ｒａｄｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｌｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１９−３１；Ｐｅｔｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：３９３４−３９；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７：４４１９−２６；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３１４０−４８参照。

エクスビボアッセイもＩＧＦ−ＩＲ中和を決定するために利用できる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の存在下および非存在下で受容体リガンドによって刺激された細胞系を用いたマイトジェンアッセイにより観察され得る。ＭＣＦ７乳癌株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、ＩＧＦ−ＩＲを発現し、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩにより刺激される細胞系である。別の方法は、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍細胞またはＩＧＦ−ＩＲを発現するようにトランスフェクトされた細胞の成長阻害に関しての試験を含む。阻害は、腫瘍モデル、例えば、マウス中に注入されたヒト腫瘍細胞を用いて観察することもできる。

本発明の抗体はＩＧＦ−ＩＲ中和の任意の特定のメカニズムに限定されない。本発明の抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＩＧＦ−ＩＲ細胞表面受容体に外面的に結合でき、リガンド（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）の結合および受容体に関連するチロシンキナーゼが仲介するその後のシグナル変換をブロックでき、シグナル変換カスケードにおけるＩＧＦ−ＩＲおよび他の下流タンパク質のリン酸化反応を防止できる。

３）抗体はＩＧＦ−ＩＲを下方制御する。細胞表面に存在するＩＧＦ−ＩＲの量は、受容体タンパク質産生、内在化、および分解に依存する。細胞表面に存在するＩＧＦ−ＩＲの量は、受容体または受容体と結合する分子の内在化を検出することにより間接的に測定できる。例えば、受容体内在化は、ＩＧＦ−ＩＲを発現する細胞を標識抗体と接触させることにより測定できる。膜に結合した抗体は剥離され、集めてカウントされる。内在化抗体は、細胞を溶解させ、溶解物中の標識を検出することにより決定される。

別の方法は、例えば、ＩＧＦ−ＩＲの表面発現のために染色された細胞の蛍光励起細胞分取分析により、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体または他の物質での処理後に細胞上に存在する受容体の量を直接測定することである。染色された細胞は、３７℃でインキュベートされ、蛍光強度を長時間にわたって測定する。対照として、染色された集団の一部は４℃（受容体内在化が停止される条件下）でインキュベートされ得る。

ＩＧＦ−ＩＲに特異的であり、試験される抗体の結合をブロックしないかまたは競合しない異なる抗体を用いて、細胞表面ＩＧＦ−ＩＲを検出し、測定できる。（Ｂｕｒｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：８９１２−２１）ＩＧＦ−ＩＲ発現細胞の、本発明の抗体での処理の結果、細胞表面ＩＧＦ−ＩＲが減少する。好ましい実施形態において、減少は、本発明の抗体での処理に反応して、少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、なおいっそう好ましくは少なくとも約９０％である。著しい減少は、早ければ４時間で観察できる。

下方調節の別の指標は、細胞中に存在する全受容体タンパク質の減少であり、内部受容体の分解を反映する。従って、細胞（特に癌細胞）の本発明の抗体での処理の結果、全細胞ＩＧＦ−ＩＲが減少する。好ましい実施形態において、減少は、少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、なおいっそう好ましくは少なくとも約９０％である。

ヒト被験者の治療に関して、抗体は好ましくはヒト抗体であるが、ヒト化またはキメラ抗体であってもよい。ＩＧＦ−ＩＲと結合する一つの好ましいヒト抗体は、Ａ１２である（ＷＯ２００５０１６９７０参照）。別の好ましいヒト抗体は２Ｆ８である（ＷＯ２００５０１６９７０参照）。有用な抗体はさらに、ＩＧＦ−ＩＲに対する結合についてＩＭＣ−Ａ１２またはＩＭＣ−２Ｆ８と競合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体、ならびに他のエピトープと結合する抗体（即ち、他のエピトープと結合し、すでに記載された特性、例えば、リガンドブロッキング、受容体内在化などを示すが、ＩＭＣ−Ａ１２またはＩＭＣ−２Ｆ８と競合しない抗体）を含む。本発明の有用な中和抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の他の非制限的例は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，（ＷＯ２００３／１０００００８；ＵＳ２００４／００１８１９１）およびＳｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ，（ＷＯ２００３／１０６６２１；ＵＳ２００３／０２３５５８２）により記載されている。本明細書において記載されるいくつかの抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表１に記載する。

本発明に従って使用できる抗体は、天然の免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、ならびに免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む。免疫グロブリンの抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）_２を含む。結合特異性を保持するが、例えば、二重特異性、多価（２より多い結合部位）、小型（例えば、結合ドメイン単独）を含む望ましい他の特性を有する他の抗体フォーマットが開発されている。

一本鎖抗体は、元の完全な抗体のいくつかまたは全ての定常ドメインを欠失した２つの可変ドメインを含む。従って、これらは完全な抗体の使用と関連した問題のいくつかを克服できる。例えば、一本鎖抗体は、重鎖定常領域および他の生体分子間の、特定の望ましくない相互作用がない傾向がある。さらに、一本鎖抗体は完全な抗体よりも相当小さく、完全な抗体よりも高い浸透性を有すことができ、一本鎖抗体が局在化し、標的抗原結合部位とより有効に結合することが可能になる。さらに、一本鎖抗体の相対的に小さなサイズのために、完全な抗体よりも受容者において望ましくない免疫応答を誘発しにくくなる。

複数の一本鎖抗体は、各単鎖が第一ペプチドリンカーにより共有結合する１つのＶ_Ｈおよび１つのＶ_Ｌドメインを有するが、少なくとも１以上のペプチドリンカーにより共有結合でき、単一特異的または多特異的であり得る多価一本鎖抗体を形成する。多価一本鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントを含み、少なくとも１つの他の鎖とペプチドリンカーにより結合する。ペプチドリンカーは、少なくとも１５のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基の最大数は約１００である。

２つの一本鎖抗体を組み合わせて、二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（二価二量体とも知られる）を形成できる。二重抗体は２つの鎖および２つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であり得る。二重抗体の各鎖は、Ｖ_Ｌドメインと結合したＶ_Ｈドメインを含む。ドメインは同じ鎖上のドメイン間の対合を防止するのに十分な短いリンカーで結合され、従って異なる鎖上の相補性ドメイン間の対合が行われ、２つの抗原結合部位が再形成される。同様に、３つの一本鎖抗体を組み合わせて、三重抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）（三価三量体とも知られる）を形成することができる。三重抗体は、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのカルボキシル末端と直接（即ち、リンカー配列なしで）融合したＶ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのアミノ酸末端を有するように構築される。三重抗体は、単一特異性、二重特異性または三重特異性であり得る。各抗原結合部位に関して二価である二重特異性抗体も開発されている。例えば、Ｚｈｕ（ＷＯ０１／９０１９２）は、他の方法では天然に存在する抗体のエフェクター機能の構造を有し、エフェクター機能を保持する、４つの結合部位を備える抗体を記載している。Ｚｈｕ（ＷＯ２００６／０２０２５８）は、２つの二重抗体およびＩｇ定常領域を組み入れた二重特異性抗体を開示している。

従って、本発明の抗体およびそのフラグメントは、これに限定されないが、天然に存在する抗体、二価フラグメント、例えば、（Ｆａｂ’）_２、一価フラグメント、例えば、Ｆａｂ、一本鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、二重抗体、三重抗体など、抗原と特異的に結合するものを含む。

ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、本明細書においては、ＩＭＣ−Ａ１２（ＩＧＦの細胞外ドメインと結合し、ＩＧＦの結合をブロックするヒトモノクローナル抗体）により例示される。ＩＭＣ−Ａ１２の特性および類似のヒト抗体は国際公開ＷＯ２００５／０１６９７０において提供される。

本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストのアンドロゲン依存性前立腺癌細胞に対する効果は、以下の１以上を含む。１）ＩＧＦは、アンドロゲンの非存在下でのＡＲ活性化または移行を仲介できる。本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストはＩＧＦが仲介する移行をブロックする。２）ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは細胞死の促進または腫瘍細胞増殖の阻害を仲介する。３）ＡＲ誘導性アンドロゲン受容体遺伝子発現の活性化が減少する。ＡＲ誘導性発現を示す遺伝子は、例えば、ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２（膜貫通セリンプロテアーゼ）を含む。

本発明に従って、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、前立腺癌を有する患者に、アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ；ホルモン療法とも呼ばれる）とあわせて投与される。ＡＤＴの目標は、体内の男性ホルモン（アンドロゲン、例えば、テストステロン）のレベルを下げることである。睾丸において主に産生されるアンドロゲンは、前立腺癌細胞が成長するのを実際に刺激できる。アンドロゲンレベルを下げることは、通常、前立腺癌を縮小させるか、またはよりゆっくりと成長するようにできる。

ＡＤＴはいくつかの状況（手術または放射線照射が不可能な患者、あるいは癌がすでに前立腺を超えて広がっているので、これらの治療により回復できない患者についての第一選択（初期）治療法として；癌が依然としてあるか、または再発した場合に、初期治療、例えば、手術または放射線療法の後；放射線療法に加えて、癌再発の危険性が高い人のある群における初期治療として（アジュバント療法）；および手術または放射線前に、癌を縮小させ、他の治療法をより有効にする試み（ネオアジュバント療法））において使用される。本発明に従って、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストをＡＤＴと組み合わせて、ＡＤＴが用いられる任意の状況において投与する。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストはＡＤＴの効果を向上および／または延長するアジュバントである。

ＡＤＴに使用されるいくつかの方法がある。睾丸摘出は、アンドロゲン、主にテストステロンの９０％より多くが産生される睾丸の除去を含む。この原発巣を切除すると、ほとんどの前立腺癌は縮小する。恒久的で、一般に、体内のホルモンのレベルの変化に関連する様々な望ましくない副作用をもたらすが、睾丸摘出はおそらくは、アンドロゲン産生を減少させ、容易に外来処置として行うことができる最も安価で、簡単な方法である。

黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体（ＬＨＲＨ作用物質とも呼ばれる）は、睾丸により産生されるアンドロゲン、主にテストステロンを減少させることにより、テストステロンレベルを睾丸摘出と同程度に有効に低下させる。ＬＨＲＨ類似体を注射するか、または小さなインプラントとして皮膚下に設置し、毎月あるいは３、４、６、または１２ヶ月ごとに投与する。ＬＨＲＨ類似体の例としては、ロイプロリド、ゴセレリン、およびトリプトレリンが挙げられる。ＬＨＲＨ類似体の可能な副作用は、睾丸摘出の副作用と類似し、主にホルモンレベルの変化による。

抗アンドロゲンは身体が任意のアンドロゲンを使用する能力をブロックする。睾丸摘出後またはＬＨＲＨ類似体での治療中でさえも、少量のアンドロゲンが依然として副腎により産生される。この種類の薬剤としては、フルタミド、ビカルタミド、およびニルタミドが挙げられる。これらの薬剤は通常、錠剤として毎日摂取される。

抗アンドロゲン治療はしばしば睾丸摘出またはＬＨＲＨ類似体と組み合わせられる。この組み合わせは、複合アンドロゲン遮断（ＣＡＢ）と呼ばれる。さらに、抗アンドロゲンは睾丸摘出またはＬＨＲＨ類似体を用いた治療がもはやそれ自体では作用しなくなった場合に加えることができる。いくつかの最新の研究は、抗アンドロゲン単独の有効性をＬＨＲＨ作用物質の有効性と比較している。生存率における違いはほとんど見いだされなかったが、いくつかは、抗アンドロゲンの効果が若干低いことを見出した。

睾丸摘出またはＬＨＲＨ作用物質によりすでに治療された患者における抗アンドロゲンの副作用は、通常深刻ではない。下痢が主な副作用であるが、嘔気、肝臓障害、および疲労感も起こり得る。ＬＨＲＨ作用物質との主な違いは、抗アンドロゲンが性機能への副作用が少なく、単独で使用されるならば、性欲および性的能力の維持を可能にすることである。

副腎により産生される低レベルのアンドロゲンは、持続した刺激を提供するために十分であり得るので、副腎アンドロゲン阻害剤を投与することができる。アンドロゲン除去後、前立腺癌細胞の一部はアンドロゲンに対して過敏になり、副腎からは末梢テストステロンの５〜１０％が供給される。副腎アンドロゲン産生を阻害するために最も一般的に使用される２つの薬剤は、アミノグルテチミドおよびケトコナゾールである。

アンドロゲン抑制剤の他の例としては、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、酢酸メゲステロール、酢酸シプロテロン、およびプレドニゾンが挙げられる。エストロゲンは、以前は進行した前立腺癌の男性における睾丸摘出に対する主な代替案であったが、血液凝固および胸部肥大を含む副作用が起こり得るために、エストロゲンは主にＬＨＲＨ類似体および抗アンドロゲンへ代替されてきている。

本発明に従って、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストを用いた一連の治療を、ＡＤＴの開始前、開始時、または開始後から施す。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの一連の投与は、ＡＤＴと同時にするべきであるが、完全に一致する必要はない。例えば、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストをアンドロゲン消失に起因する寛解期の任意の時点で投与できる。本発明の一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、原発性または転移性腫瘍の治療のために、アンドロゲン消失の２４ヶ月以内に投与される。別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストはアンドロゲン消失の１８ヶ月以内に投与される。本発明の一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストはＡＤＴ治療に際して観察される細胞死期間中または前記期間の終わり付近で投与され、ＡＩ細胞のその後の増生をさらに予防するかまたは遅らせる。本発明の一つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの投与は、アンドロゲン消失の２週間以内に開始される。別の実施形態において、投与はアンドロゲン消失の１週間以内に開始される。

本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、腫瘍成長に関与する他の受容体を中和するアンタゴニストとともに投与できる。特に、Ａｋｔを含むシグナル変換経路に関与する受容体を対象とする。例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）によるシグナル変換は、Ａｋｔ活性化が関与すると考えられる。従って、本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストはＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の細胞内または細胞外アンタゴニストと組み合わせることができる。

ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のアンタゴニストは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の細胞外ドメインと結合し、１以上のリガンドの結合をブロックし、および／またはリガンド誘発性の活性化を中和する抗原結合タンパク質を含む。アンタゴニストはまた、ＥＧＦＲのリガンドと結合し、ＥＧＦＲとリガンドとの結合を阻害する抗体または他の結合タンパク質も含む。ＥＧＦＲのリガンドとしては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびベータセルリンが挙げられる。ＥＧＦおよびＴＧＦ−αはＥＧＦＲを介する刺激をもたらす主な内在性リガンドであると考えられるが、血管形成の促進により有効であることが示されている。ＥＧＦＲアンタゴニストはまた、他のＥＧＦＲ受容体サブユニットとのＥＧＦＲ二量化（即ち、ＥＧＦＲホモ二量体）または他の成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ２）とのヘテロ二量化を阻害する物質も含む。ＥＧＦＲアンタゴニストはさらに、生体分子および小分子、例えば、ＥＧＦＲを介するシグナル変換を阻害するためにＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤を含む。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ；Ｃ２２５）は、ＥＧＦＲと結合し、リガンド結合をブロックするＥＧＦＲアンタゴニスト抗体の一例である。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）は、Ｍ２２５のマウス可変ドメイン（例えば、ＷＯ９６／４０２１０参照）およびヒト定常ドメインを有するキメラＩｇＧｌ抗体である。１１Ｆ８と命名されるヒト抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｚｈｕにより開示されている（ＷＯ２００５／０９０４０７）。他の抗ＥＧＦＲ抗体としては、ＥＭＤ７２０００（マツズマブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）（パニツムマブ；ＡＢＸ−ＥＧＦ）、ＴｈｅｒａＣＩＭ（ニモツズマブ）、およびＨｕ−Ｍａｘ−ＥＧＦＲ（ザルツズマブ）が挙げられる。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの一例は、ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ＺＤ１９３９）であり、これはＥＧＦＲを阻害するためにＡＴＰ類似物質として機能するキノザリン誘導体である。米国特許第５，６１６，５８２号（Ｚｅｎｅｃａ Ｌｉｍｉｔｅｄ）参照。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの別の例は、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（ＯＳＩ−７７４）であり、これは４−（置換フェニルアミノ）キノザリン誘導体［６，７−ビス（２−メトキシ−エトキシ）−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニル−フェニル）アミン塩酸塩］ＥＧＦＲ阻害剤である。ＷＯ９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）；Ｍｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７：４８３８−４８（１９９７）；Ｐｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２９１：７３９−４８（１９９９）参照。ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）は、ＥＧＦＲおよびその下流ＰＩ３／Ａｋｔのリン酸化反応およびＭＡＰ（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼシグナル変換経路を阻害することにより機能でき、その結果、ｐ２７が介在する細胞周期の停止がもたらされる。Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＣＯの第３７回年次総会（カリフォルニア州サンフランシスコ、２００１年５月１２〜１５日）で提示されたアブストラクト２８１参照。

アンタゴニストは別々に投与することができるが、ある例においては、２つのアンタゴニストの機能を１つの分子、例えば、二重特異性抗体または二重阻害剤中に組み合わせることが望ましい。二重特異性抗体は、ＩＧＦ−ＩＲ特異性と異なるＲＴＫまたは他の細胞表面分子の特異性とを組み合わせるように設計される。ＩＧＦ−ＩＲ特異性のＥＧＦＲ特異性またはＨＥＲ２特異性との組み合わせは、特に重要である。ＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲと結合する二重特異性抗体の一例は、Ｚｈｕにより記載されている（ＷＯ２００６／０２０２５８）。同様に、ＩＧＦ−ＩＲおよび第二の細胞成分を阻害する小分子は入手可能であるか、またはスクリーニングできる。例えば、前述のように、ＩＮＳＭ−１８（Ｉｎｓｍｅｄ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ）はＩＧＦ−ＩＲおよびＨＥＲ２／ｎｅｕを阻害する。

本発明の別の態様は、本発明のアンタゴニストまたはその医薬的に許容される塩、水和物またはプロドラッグを、医薬的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物に関する。このような組成物は、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストとＡＤＴ剤の独立した組成物または両方を含有する１つの組成物であり得る。

本発明の組成物は、固体または液体形態、溶液または懸濁液であってよい。投与経路としては、例えば、経口、非経口（静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内）、局所、経皮および吸入によるものが挙げられる。

経口投与に関して、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストは、例えば不活性希釈剤または融合可能な担体とともに投与できるか、または固体投与形態中に組み入れることができる。経口液体および固体投与形態の例としては、例えば、溶液、懸濁液、シロップ、エマルジョン、錠剤、ロゼンジ、カプセル（ソフトゼラチンカプセルを含む）などが挙げられる。経口投与形態は、持続放出型製品として、例えば、崩壊を遅らせるか、または活性化合物の拡散を制御するためのコーティングを用いて処方することができる。必要ならば、組成物は可溶化剤も含むことができる。

注射可能な投与形態の例としては、無菌注射液、例えば、溶液、エマルジョンおよび懸濁液が挙げられる。注射可能な投与形態はさらに固体、例えば、無菌粉末であって、注射前に液体中に復元、溶解または懸濁されるものが挙げられる。無菌注射溶液は、ＥＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよび／またはＡＤＴ剤を、必要とされる量において、適切な溶媒中、前記の様々な他の成分とともに配合し、必要ならば、続いて濾過滅菌することにより調製される。担体は典型的には、例えば、無菌水、生理食塩水、注射可能な有機エステル、ピーナッツ油、植物性油などを含む。緩衝剤、保存料などを投与可能な形態中に含めることができる。無菌製剤は、加熱、照射、精密濾過、および／または様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの添加により調製できる。

局所投与に関して、本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよびＡＤＴ剤は、別々にまたは一緒に、例えば、ゲル、クリーム、または軟膏、またはペイントの形態において投与できる。このような用途に典型的な担体としては、疎水性または親水性基剤、油性またはアルコール性液体、および乾燥粉末が挙げられる。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよびＡＤＴ剤はまた、貼付剤において用いられるゲルまたはマトリックス基質中に配合することができ、任意に、経皮バリアを介した化合物の制御放出をもたらす。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよびＡＤＴ剤はまた、直腸投与のための公知の方法により処方できる。

吸入による投与に関して、本発明のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよびＡＤＴ剤は、ネブライザー、エアゾル、または乾燥粉末吸入器に用いられる好適な担体中に溶解してもよいし、前記担体中に懸濁してもよいし、あるいは前記担体上に吸着させてもよい。

好適な投与量は、医師または免許のある医療従事者が、例えば、治療される病気の性質、投与経路、治療期間、および患者の状態などの因子に応じて決定できる。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストおよびＡＤＴ剤は、所望の治療効果を得るために必要に応じて頻繁に投与できる。投与頻度が、例えば、使用される投与形態の性質に依存する。当業者は、投与量および治療頻度は、個々の患者の耐性および使用されるブロッキングまたは阻害剤の薬理学的および薬物速度論的特性に依存することを理解する。理想的には、使用される薬剤は可飽和の薬物動態が達成されることが望ましい。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の負荷用量は、例えば、約１０から約１０００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは約２００から約４００ｍｇ／ｍ^２に及び得る。これに続いて、例えば、１日あたりまたは１週あたり約２００から約４００ｍｇ／ｍ^２の範囲で、数回追加投与する。ＩＧＦ−ＩＲ抗体の投与量の一例は、４００ｍｇ／ｍ^２（負荷）および２５０ｍｇ／ｍ^２（毎週注入）である。（ヒトおよび他の哺乳動物についてのｍｇ／ｋｇおよびｍｇ／ｍ^２間の換算については、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ、Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９６６，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．５０：２１９−４４参照。）患者を副作用についてモニターし、このような副作用が重くなると、治療を停止する。ＡＤＴ剤の有効な投与量は、当分野において周知である。

当業者には、有効な用量を決定するために、どのようにして治療の進行をモニターするかも周知である。前立腺癌に関して、このような方法の一つは、ＰＳＡレベルをモニターすることである。別の方法は、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）をモニターすることである。前立腺癌をモニターする他の方法は、超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）などを含む。組織サンプルはＡＲの発現および細胞分布、ならびにサバイビンおよび／またはＴＵＢＢの発現についても調べることができる。

本発明のある実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの投与をＡＤＴと組み合わせた治療を、１以上の抗腫瘍薬とともに用いることができる。例えば、前述のように、ＡＤＴはしばしば前立腺腫瘍の放射線治療のネオアジュバントとして用いられる。抗腫瘍因子が放射線である場合、放射線源は、治療される患者に対して外部（外照射療法−ＥＢＲＴ）または内部（小線源療法−ＢＴ）のいずれかであり得る。

抗腫瘍薬はアルキル化剤または代謝アンタゴニストであり得る。アルキル化剤の例としては、これに限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが挙げられる。代謝アンタゴニストの例としては、これに限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびパクリタキセル、ゲムシタビンが挙げられる。

有用な抗腫瘍薬は、分裂抑制剤、例えば、タキサン、ドセタキセルおよびパクリタキセルも含む。トポイソメラーゼ阻害剤は、本発明の抗体との組み合わせにおいて使用できる別の種類の抗腫瘍薬である。これらとしては、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩの阻害剤が挙げられる。トポイソメラーゼＩ阻害剤としては、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカンが挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）が挙げられる。他の物質は現在、トポイソメラーゼ阻害活性および抗腫瘍薬としての有効性に関して評価中である。好ましい実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤はイリノテカン（ＣＰＴ−１１）である。

本出願全体にわたって、様々な刊行物、引用文書、テキスト、技術マニュアル、特許、および特許出願が言及されている。これらの刊行物、特許、特許出願および他の文書の教示および開示はその全体において、本発明が関連する従来の技術をより十分に説明するために参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書において開示される本発明の原理内での変更は、当業者が加えることができると理解され、予想されるべきであり、このような修正は本発明の範囲内に含まれることが意図される。

次の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を何ら制限するものと解釈すべきではない。従来の方法、例えば、ベクターおよびプラスミドの構築、ならびに抗体および抗体フラグメントの発現において用いられる方法の詳細な説明は、多くの刊行物（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｅｎｎａ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ、Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを含む）から得ることができる。本明細書において記載される全ての文献はその全体として組み込まれる。

＜ＩＧＦ−ＩＲの拮抗作用はＡＤＴ後の腫瘍再生を阻害する＞

ヒトモノクローナルＩＧＦ−ＩＲ抗体（ＩＭＣ−Ａ１２）と去勢を用いて、去勢後の前立腺癌の再発に関するＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害の有効性を試験するために、前臨床モデルを開発した。研究のために、ＬｕＣａＰ３５（アンドロゲン反応性ヒト前立腺癌細胞系）の異種移植片を雄ＳＣＩＤマウスの側腹部中に皮下移植した。ＬｕＣａＰ３５はアンドロゲン非依存性状態に移行することができ、このプロセスに関連する分子変化を評価するために使用できる。最初に、ＰＳＡレベルが降下し、腫瘍体積が減少するが、６０〜１２０日後、腫瘍の再発が観察される。ＬｕＣａＰ３５は転移可能性を有し、その結果、混合骨病変が生じる。無傷雄マウスにおいて成長したＬｕＣａＰ３５はアンドロゲン感受性であり、アンドロゲン消失に対して患者において通常見られる様式で反応する。

ＬｕＣａＰ３５細胞を雄ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍が約４００ｍｍ^３の体積に達すると、マウスを去勢し、２０匹の動物３群にそれぞれ分けた。グループ１対照は去勢のみを受け、グループ２は去勢およびＩＭＣ−Ａ１２を１週間に３回、去勢後７日に始めて１４日間腹腔内投与され、グループ３は去勢後１４日に始めて１４日間ＩＭＣ−Ａ１２を投与された。ＩＭＣ−Ａ１２の１４日後、さらなる治療は行わなかった。去勢後１週間または２週間のいずれかで始める２週間のＡ１２投与のタイミングは、去勢により誘発されるアポトーシスのピークは去勢の４日以内に起こることを示す、ＬｕＣａＰ３５細胞系に関する公開されたデータに基づいた（Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ９９：３９２−４０１）。ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害は細胞周期停止を引き起こし、細胞のアポトーシスを防止するので、Ａ１２の投与は、去勢後のアポトーシスが「完全」になった時に開始することに決定した（Ｃｏｒｅｙら，２００３；Ｔｅｎｎａｎｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，５６：１１５−２２）。

血液サンプルを眼窩洞から毎週採取した。血清を分離し、ＩＭｘ Ｔｏｔａｌ ＰＳＡ Ａｓｓａｙ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を用いてＰＳＡレベルを決定した。腫瘍を毎週２回測定し、腫瘍体積を式：体積＝ＬＸＷ２／２により推定した。腫瘍が１０００ｍｍ^３に達したとき、あるいは動物の体重減少が初期体重の２０％を超えたとき、マウスを屠殺した。インビボ腫瘍細胞増殖速度を決定するために動物を屠殺する１時間前に、マウスにＢｒｄＵを腹腔内注射した。

去勢により、腫瘍成長は当初は全てのマウスにおいて停止した（図１）。ＩＭＣ−Ａ１２で処置されたマウスにおいて、腫瘍体積は実験の間減少し、腫瘍特異的な死は無かった。未処理同齢集団において、平均腫瘍体積の増加は５週までに明らかであり、腫瘍特異的な死（犠牲）は４週で始まり、実験の間中、継続した。大きな腫瘍は平均される腫瘍集合から死亡により排除されるので、ＩＭＣ−Ａ１２を投与されなかったマウスについての平均腫瘍体積のプロットは、人為的に減少することに注意のこと。

ＰＳＡレベルをＬｕＣａＰ３５異種移植片マウスにおいてモニターした。全てのマウスは当初はホルモン除去に反応し、ＰＳＡレベルにおいて同様の降下が去勢後の最初の週において観察された（図２）。去勢単独により処置されたマウスにおいて、初期降下後、ＰＳＡレベルは次に実験の間、ほぼ第２週から始まって増加した。対照的に、ＩＭＣ−Ａ１２で処置された去勢マウスにおけるＰＳＡレベルは上昇せず、ベースライン付近に留まった。

この実験は、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達および去勢後のＩＧＦ−ＩＲ抗体、ＩＭＣ−Ａ１２による発現阻害の結果、去勢単独よりも腫瘍体積が有意に大きく減少し（ｐ＜０．００ｌ）、腫瘍体積およびＰＳＡにおける増加により決定されるＡＩ腫瘍の再発までの時間を有意に延長すること（ｐ＜０．００１）を示す。

去勢単独により処置された対照動物において、腫瘍成長は約４週間停止したが、その後増加した。去勢単独により処置された動物のうち、半分より多くは去勢後９週間までに腫瘍成長のために死亡し、ほとんどの動物を１６週の最後までに死亡した。対照的に、ＩＭＣ−Ａ１２を投与された動物は全て１６週後も生存していた。

提示されたインビボ結果は、ＩＧＦ−ＩＲシグナル変換の阻害の有効性を示す。特に、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストを１４日にわたって投与し、その後停止した。Ａ１２を同様の様式で投与した別の実験において、いくつかの腫瘍再発がＡ１２の投与後の実験の後半で観察された。４０匹のグループ２および３の動物のうち２匹が、実験の最後までに腫瘍体積のために死亡した。ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの維持量は腫瘍再発までの時間を無制限に延長する。

Ａ１２処置された腫瘍における腫瘍体積の減少とＡＲ移行の間に関係があるかどうかを調査するために、図５において示すように、３群のそれぞれからの腫瘍に対してＡＲ免疫組織化学的検査を行った。核ＡＲ染色スコアを各腫瘍からの１００個の核に対して割り当てた。核を２人で無分別に採点し、２つの得点の平均を前記組織の得点としてカウントした。腫瘍体積と核ＡＲ強度の間には顕著な正の相関関係がある（ｒ＝０．６６、ｐ≦０．０１）。

＜ＩＧＦ−ＩＲの拮抗作用はＡＲ移行を阻害する＞

ＩＧＦ−ＩＲの刺激および拮抗作用のアンドロゲン受容体局在化に対する影響を評価した。ＬｕＣａＰ３５細胞を、ＩＧＦ−１刺激の有無に関わらず、ＩＭＣ−Ａ１２の存在下または非存在下で培養した（図３）。細胞質および核抽出物を処理細胞から調製し、ＰＡＧＥにより評価した。ＥＲＫのレベルを用いてレーンのローディングを同等化した。ＩＧＦ−１で刺激された細胞において、ＩＭＣ−Ａ１２は核において観察されるアンドロゲン受容体の割合を減少させた。

アンドロゲン受容体移行も免疫組織化学的検査により評価した。（図４）。ＬｕＣａＰ３５（ＡＤ）異種移植片腫瘍を去勢していない雄において成長させ、ＬｕＣａＰ３５Ｖ（ＡＩ）異種移植片腫瘍を去勢されたマウスにおいて成長させた。試験マウスをＩＭＣ−Ａ１２で処置した。腫瘍の連続切片を調製し、ＡＲ特異性抗体で染色した。去勢していない対照マウスにおいて、アンドロゲン依存性ＬｕＣａＰ３５組織におけるＡＲは主に核中に局在していた。ＩＭＣ−Ａ１２で処置された試験動物からの組織において、ＡＲ染色は細胞質において観察された。去勢された対照マウスにおいて、アンドロゲン非依存性ＬｕＣａＰ３５ｖ細胞におけるＡＲは、核および細胞質間に分布していた。ＩＭＣ−Ａ１２で処置された試験動物からの組織において、ＡＲ染色は主に細胞質中にあった。

同様の実験において、ＡＲの局在化を組織培養において蛍光顕微鏡により調査した。１０^−８Ｍ ＤＨＴでの処理の結果、細胞質から核へのＡＲの顕著な再分布がもたらされた。ＩＧＦ−１単独での処置の結果、ＡＲから核への部分的再分布が起こり、ＩＭＣ−Ａ１２は前記効果を完全に逆転させた。

＜ＩＧＦ−ＩＲの拮抗作用はＡＲ依存性遺伝子発現を阻害する＞

アポトーシスの阻害物質であるサバイビンは、いくつかのヒト前立腺癌細胞系において強力に発現される。インタクトなアンドロゲン受容体を備える細胞系において、ＤＨＴでのアンドロゲン刺激はサバイビン発現を増加させる。ＩＧＦ誘発性ＡＫＴシグナル伝達はＡＲ陰性細胞系においてさえもサバイビン発現を増加させるので、サバイビン発現はＡＫＴにより媒介されることも観察される。サバイビンの異なる発現を検出するための遺伝子チップ実験は、サバイビン発現がＩＭＣ−Ａ１２での処置により減少することを示す。

カスタムｃＤＮＡマクロアレイをすでに記載されたように［参考文献］、前立腺発現データベース（ＰＥＤＢ）由来のクローン、一般に市販されているヒト前立腺発現配列タグ（ＥＳＴ）データの配列レポジトリーを用いて構築した。（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：２１８−２０）。Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光色素で標識する方法、マイクロアレイスライドへのハイブリダイゼーション、およびアレイプロセッシングは記載されているとおりであった（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：５１１６−２１）。

３つの腫瘍を各実験群においてプールした。ｃＤＮＡマイクロアレイ上で使用する標準試料ＲＮＡを提供するために、等量の全ＲＮＡを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ｓＭＤ）で補足された無色素ＲＰＭＩ−１６４０培地中、対数期で増殖するＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ３、およびＣＷＲ２２ｒＶ１細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離しプールした。プールされた腫瘍および細胞系からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを単離した。Ａｍｂｉｏｎ ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いてｍＲＮＡを１ラウンド増幅させ、およびサンプル品質および量をアガロースゲル電気泳動およびＡ２６０での吸光度により評価した。ハイブリダイゼーションプローブを標識し、アレイ実験の品質管理をすでに記載されているようにして行った（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２００１）。治療群に関連する遺伝子発現における差は、ＳＡＭ法（Ｃｈｕ，Ｇ．，Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，Ｂ．，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．＆Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．，２００２，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（ｓａｍ） ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて偽発見率（ＦＤＲ）≦１０％を有意と見なして決定した（３７）。サンプル間の類似性を、Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０ソフトウェア（ｄｅ Ｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：１４５３−４）を用いて遺伝子およびサンプルの監視されていない階層クラスター化により評価し、ＴｒｅｅＶｉｅｗ（Ｐａｇｅ，Ｒ．Ｄ．，１９９６，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１２：３５７−８）により視察した。

サバイビンおよびＴＵＢＢも、プライマーおよびすでに記載されている方法（Ｗｕ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２：６１５３−６０）を用いてＰＣＲによりアッセイした。標的ｃＤＮＡの標準的ＰＣＲフラグメントを精製した。標準の１０ｎｇ／μｌから１０^−３ｐｇ／μｌへの標準の一連の希釈をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用して、標準曲線を作製した。プールされた腫瘍の各群からの１μｇの全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、１μｌのｃＤＮＡの第一鎖、特異性プライマーセットからなる２０μｌの反応混合物中で行い、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｐｌｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒを用い、製造業者のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）に従って行った。ＲＴ−ＰＣＲ生成物をＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒソフトウェアｖ３．５に関する融解曲線分析に付した。単位複製配列サイズをアガロース電気泳動により確認した。各サンプルを２回アッセイした。

ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストと組み合わせた去勢は、腫瘍の再発までのＡＲ遺伝子発現における減少と関連する。表２に記載される時間枠で各群において採取された腫瘍からのＲＮＡサンプルをｃＤＮＡマイクロアレイ上で分析した。ＳＡＭにおいて２つのサンプルｔ試験により試験される場合、グループ１（去勢単独）についての時間の間で有意な変更が検出された遺伝子はなかった（ｑ値≧１００％）。加えて、特に監視していないが、公知のアンドロゲン調節遺伝子の階層クラスタリングは２つの時間枠で差がなかった。この群における動物の多くはＰＳＡ再発を有し、グループ２および３と比べて４０日までに核ＡＲスコアが増大するので、これは意外ではない。対照的に、Ａ１２処置腫瘍の２つの期間の間に有意な遺伝子発現の変化があった。早期と比較して腫瘍が再発し始めた後期において、試験するために十分なデータを有するアレイ上の３１７０の独立した遺伝子のうち、２１が上方制御され（多くのアンドロゲン制御を含む）、４１が下方制御された（ｑ値≦１０％）（図６）。さらに、監視されていない公知のアンドロゲン調節遺伝子の階層クラスタリングにより、明らかにＡ１２処置された２つの期間は２つの独立したクラスターに分類された。これらのデータは、核ＡＲ発現がＡＲ転写活性およびＡＲ活性化による前立腺癌進行と関連することを示す。

サバイビンおよびβチューブリンの発現はＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストにより有意に減少する。マイクロアレイ研究は、サバイビン発現がＡ１２抗体で処置された腫瘍において減少したと断定した。図７Ａにおいて示すように、腫瘍から抽出されたＲＮＡに関するＱｔ−ＲＴ ＰＣＲは、サバイビンコピー数および腫瘍体積間の顕著な正の相関関係を示す（ｒ＝０．６６、ｐ≦０．０ｌ）。最近、ＩＧＦ−ＩＲ誘発性腫瘍形成に関係する第二の遺伝子としてβ−チューブリン、ＴＵＢＢが見出されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｒ．，２００３，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．３５：７７１−７；Ｇｅｌｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３２：６９３−７００）。ＴＵＢＢはマイクロアレイにおいて減少することが示され、図７Ｂにおいて示されるように、腫瘍試料において腫瘍体積と正に相関することが示され（ｒ＝０．５９、ｐ≦０．０１）、グループ１と比較して、グループ２および３において有意に減少することが示された。グループ１においてマイクロアレイ上で長時間にわたり異ならないが、グループ２および３動物において２つの早期において減少する第三遺伝子はＰＳＡであった。ＰＳＡ発現における変化は、血清ＰＳＡレベルにおける類似のパターンにより確認された。

＜増殖およびアポトーシス＞
アポトーシスは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介性ニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイおよびプロピジウム（ＰＩ）染色によりすでに記載されているようにＡｐｏｐ−Ｄｉｒｅｃｔキット（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて（Ｗｕ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１：３０６５−７４）決定された。簡潔には、１×１０^６個の単細胞懸濁液からの細胞を１０％中性緩衝液ホルマリン（ＮＢＦ）、続いて７０％エタノールアルコールにより−２０℃で３０分間固定した。数回洗浄後、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化し、ＦＩＴＣ共役ｄＵＴＰおよび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（ＴｄＴ）とともに３７℃で１時間インキュベートし、続いてＰＩ／ＲＮａｓｅ緩衝液（１００μｇ／ｍｌのＰＩ、５０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ）とともに室温で６０分間インキュベートした。サンプルを、ＢＤ ＦＡＣｓｃａｎを用いてフローサイトメトリーにより分析した。データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰＲＯソフトウェアで分析した。アポトーシスも、Ａｐｏｐ−Ｔａｇキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ，ＭＡ）を製造業者の推奨に従って用いてホルマリン固定組織に関するＴＵＮＥＬアッセイにより決定した。アポトーシス細胞は組織スライドあたり３００個の細胞によって決定した。

表３に示すように、増殖はグループ１腫瘍においてグループ２および３と比較して有意に大きかった（ｐ≦０．０１）。対照的に、ＴＵＮＥＬ染色により決定されるアポトーシスはグループ２および３と比較してグループ１においてより高かった（表３）。

ＳＣＩＤマウスにおけるＬｕＣａｐ３５皮下異種移植片を観察した研究を示す。全てのマウスは、平均腫瘍サイズが４００ｍｍ^３に達すると去勢した。対照群のマウスは去勢だけを施した。２つの他の群において、去勢後１週間または２週間で始めて、１週につき３回ＩＭＣ−Ａ１２を投与した。 去勢後１週間（早期）または２週間（後期）から始めて、ＩＭＣ−Ａ１２で処置された去勢対照マウスおよび去勢マウスにおけるＰＳＡのレベルを示す。 ＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦでの刺激および／またはＩＧＦ−ＩＲのＩＭＣ−Ａ１２との拮抗作用に反応したアンドロゲン受容体（ＡＲ）の分布を示す。細胞質および核ＡＲのレベルをウェスタンブロットにより評価した。 去勢していないマウスにおけるＬｕＣａＰ３５細胞のアンドロゲン依存性異種移植片腫瘍（左列）および去勢マウスにおけるＬｕＣａＰ３５Ｖ細胞のアンドロゲン非依存性異種移植片腫瘍（右列）におけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）の分布に対するＩＧＦ−ＩＲアンタゴニスト（ＩＭＣ−Ａ１２）の影響を示す。 ＡＲスコアと腫瘍体積間の相関関係を示す。Ｒ＝０．６６、ｐ＜０．０１。去勢のみの値は白丸であり、去勢＋Ａ１２早期および後期の値は黒丸である。値は、腫瘍ごとに採点された１００の核についての平均値である。 皮下Ａ１２処理された腫瘍に関して２つの期間での遺伝子発現の変化を示す。腫瘍が早期と比較して再発し始めた後期において、試験するために十分なデータを有するアレイ上の３１７０の独自の遺伝子のうち、２１が上方制御され（多くのアンドロゲン制御された「^＊」で表されるものを含む）４１が下方制御され、ｑ値は≦１０％であった。 図７Ａは、サバイビンコピー数スコアと腫瘍体積間の相関関係を示す（ｒ＝０．６６、ｐ≦０．０ｌ）。図７Ｂは、チューブリンβペプチド３コピー数スコアと腫瘍体積間の相関関係を示す（ｒ＝０．５９、ｐ≦０．０ｌ）。去勢のみの値は白丸であり、去勢＋Ａ１２早期および後期値は黒丸である。各値は３回のＰＣＲ実施の平均値である。

Claims (6)

1. アンドロゲン枯渇療法を受けている患者においてアンドロゲン依存性前立腺癌を治療するための、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を含有する、医薬組成物であって、前記抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体が、
   ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ _Ｈ ）；および
   ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓを含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ _Ｌ ）
   を含むものである、医薬組成物。
2. 配列番号２に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８に記載のものであり、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲｓが、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０に記載のものである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
5. アンドロゲン枯渇療法が睾丸摘出である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
6. 請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物、および
   ロイプロリド、ゴセレリンまたはトリプトレリンを含有する医薬組成物
   を含む、アンドロゲン依存性癌治療用キット。

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