KR101426134B1

KR101426134B1 - 항 ｉｇｆ-1ｒ 단일클론 항체와 ｉｌ-2를 포함하는 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물

Info

Publication number: KR101426134B1
Application number: KR1020120060639A
Authority: KR
Inventors: 문병곤; 이양순; 김은아; 이정태; 문경덕; 박상경
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2012-06-05
Publication date: 2014-08-06
Also published as: KR20130033273A

Abstract

본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 항 IGF-1R 단일클론 항체와 면역세포의 활성을 증가시키는 IL-2가 결합된 융합 단일클론 항체, 상기 융합 단일클론 항체의 제조방법 및 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융한 단일클론 항체는 IL-2에 의해 암세포 주변의 면역세포가 강하게 활성화 되어 대조 항암항체 또는 보고된 항IGF-1R 항체보다 증가된 항체의존성 세포독성을 나타낼 수 있으므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

항 ＩＧＦ-1Ｒ 단일클론 항체와 ＩＬ-2를 포함하는 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물{A fusion monoclonal antibody comprising IGF-R1 antibody and IL-2, and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 항 IGF-1R 단일클론 항체와 IL-2를 포함하는 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 항 IGF-1R 단일클론 항체와 면역세포의 활성을 증가시키는 IL-2가 결합된 융합 단일클론 항체, 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법 및 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것이다.

인슐린 유사 성장인자(Insulin like growth factor) 1 및 2("IGF-1" 및 "IGF-2")는 혈장내에 존재하는 약 7.5kDa 크기의 폴리펩티드로서, 대부분의 조직에서 검출되고, 매우 다양한 포유동물 세포의 분화 및 증식을 촉진한다고 알려져 있다. 상기 IGF-1 및 IGF-2는 모두 세포표면에 위치한 IGF-1 수용체(IGF-1R, Insulin-like growth factor 1 receptor)에 결합하여 세포의 작용을 조절할 뿐만 아니라 초기 분화에서 중요한 역할을 수행하지만, 정상 성체에서는 특별히 중요한 역할을 수행하지는 않는 것으로 알려져 있다.

IGF-1R은 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성되는데, 알파 서브유닛은 세포막 외부에 존재하여 IGF-1 및 IGF-2와 직접적으로 결합하는 약 130-135kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이고, 베타 서브유닛은 막투과 영역과 티로신 키나제 활성을 가지는 세포질 영역으로 구성되는 약 95kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이다. 기능적으로 볼 때, 상기 IGF-1R은 티로신 키나아제 성장인자 수용체 군에 속하고, 인슐린 수용체와 구조적으로 유사하다고 알려져 있다. 상기 IGF-IR은 처음에는 단일쇄(single chain) 프로수용체(proreceptor) 폴리펩타이드로서 합성된 다음 글라이코실화, 단백질 분해에 의해 가공되며 공유결합되어 2개의 알파 서브유닛과 2개의 베타 서브유닛을 포함하는 성숙한 460kDa 헤테로테트라머(heterotetramer)를 형성한다.

한편, 성체에서 IGF-1, IGF-2, IGF-1R 등이 비정상적으로 활성화되는 경우에는 암의 발생과 관련성이 있는 것으로 보고되었다. 특히, IGF-1R은 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등 다양한 암 환자의 조직에서 과발현 된다고 보고되고 있으며, 최근에 발표된 논문에 의하면 조사 대상 181명의 유방암 환자 중 절반 이상인 109명에서 IGF-1R를 과발현하고 있다고 보고하고 있어, IGF-1R가 훌륭한 유방암 바이오마커(biomarker)로 사용될 수 있을 가능성을 강하게 제시하고 있어, 항암제의 표적(target)으로 최근에 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, WO 2002/53596, WO 2005/016967 및 WO 2006/01347 에는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체 또는 인간의 단클론 항체 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있고, WO 2006/138729에는 환자에게 IGF-1R 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 골암을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, WO 2010/066868에는 사람 IGF-1에 결합하고 IGF-2와 교차반응하여 IGF-1 수용체에 대한 IGF-1 및 IGF-2의 결합을 방해하고 IGF-1 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 인간 항체 및 상기 인간 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 상기 IGF-1R을 표적으로 하는 다양한 항암제는 암세포의 치료효과가 특별히 우수하지 못하기 때문에 아직까지는 상업적으로 이용되지 않고 있는 실정이다.

IL-2는 체내에 항원이 침입했을 때 분비되어 T세포를 매개로 한 면역 반응을 촉진시키는 면역 촉진 사이토카인의 하나로, T세포의 증식 및 분화, B세포의 항체생산, NK세포의 활성화를 촉진시켜 외부 침입물질로부터 우리 몸을 방어하는 역할을 한다. 이러한 면역촉진의 기능을 이용하여 Chiron Corporation에서 recombinant IL-2를 개발하여 악성흑색종(malignant melanoma)과 신장세포암(renal cell cancer) 치료제로 판매하고 있으나, 과량(수 백 mg/kg)으로 사용할 경우 혈관 손상, 간독성을 유발하는 치명적인 부작용이 보고되고 있다. 이러한 부작용을 방지하고, 암치료에 보다 효율적인 치료제를 개발하고자 IL-2의 효능을 암발생부위에 집중시키기 위한 방법들이 개발되고 있다.

예를 들어, US 7,462,350에는 항체, 항체의 일부, 알부민 등의 비-IL-2 부분과 혈청내 반감기가 증가하도록 변이된 돌연변이 IL-2 부분이 융합된 융합 단백질이 개시되어 있고, US 7,851,599에는 암마커로 알려진 EDb-피브로넥틴 도메인에 특이적인 항체의 일부가 IL-2와 융합된 융합단백질과 암치료제인 젬시타빈의 조합물을 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 돌연변이 IL-2 부분을 포함하는 융합단백질의 효과는 돌연변이된 IL-2 부분을 포함할 경우에만 나타날 수 있을 뿐, 정상적인 IL-2 부분을 포함할 경우에는 적용될 수 없다는 문제점이 있고, ED-B-피브로넥틴 도메인에 대한 항체를 포함하는 융합단백질은 IL-2의 효능을 암발생부위에 집중시키는 효과를 나타낼 수는 있으나, 항체자체는 별다른 항암효과를 나타내지 못한다는 단점이 있었다.

이에 본 발명자들은 개선된 항암효과를 나타내는 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 항 IGF-1R 단일클론 항체의 카르복실 말단에 IL-2가 융합된 새로운 형태의 융합 단일클론 항체를 제조하였고, 증가된 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 암세포 표면 항원인 IGF-1R와 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2가 연결된 융합 단일클론 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 IL-2가 연결된 융합 단일클론 항체를 제공한다.

본 발명의 용어, "단일클론 항체"란 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하는데, 상기 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명의 목적상 상기 단일클론 항체는 암세포 표면항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명의 암세포 표면항원인 IGF-R1에 결합할 수 있는 항체는 본 발명의 융합 단일클론 항체를 IGF-R1을 발현하는 암세포로 집중시킬 수 있을 뿐만 아니라, IGF-R1과 결합하여 그 자체로도 항암활성을 가질 수 있다. 또한, 암세포에 집중되어 상기 항체에 연결된 IL-2에 의해 면역세포를 자극하여 암세포 의존성 항암활성을 최대화시킬 수 있다. 상기 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 인간화 항체와 같이 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체 등이 될 수 있고, 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 포함하는 재조합 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드, 서열번호 4 또는 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드, 서열번호 5 또는 9의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드 또는 서열번호 6 또는 10의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드와 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체 등이 될 수 있다.

또한, 항체 단편이 사용될 수 있다. 본 발명의 용어, "항체 단편"은 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다.

아울러, 상기 항체단편은 IGF-R1과 결합할 수 있는 scFv(Single-chain variable fragment) 도메인 일 수 있다. 본 발명의 용어 “scFv”는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편을 의미하며, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다.

본 발명의 용어, "면역세포(immunocyte)"란 항체를 만드는 세포를 의미하는데, 통상적으로 B 세포, 자연 살상 세포(Natural killer cell, NK cell) 또는 T 세포 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역세포는 항체의존성 세포독성 메커니즘에 작용하는 자연 살상 세포 또는 T 세포를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어 "인터루킨 2(Interleukin 2, IL-2)"란, Th1 세포에서 발현되고 이의 수용체는 CD25/IL2RA, CD122/IL2RB 및 CD132/IL2RG이며, 면역반응을 촉진시키고, 면역시스템에 관여하는 T 세포, B 세포, 단핵구 세포 등의 다양한 세포를 활성화시킬 수 있으며, 상기 T 세포의 성장인자로 작용할 수 있는 효과를 나타내는 15.5kD 크기의 사이토카인을 의미한다. 본 발명에서, 상기 IL-2는 상기 IGF-1R과 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체(“항-IGF-1R-mAb”)에 결합하여 본 발명의 융합 단일클론 항체를 구성하기 위한 융합파트너로서 사용되며, 이때 사용되는 IL-2는 IL-2의 활성을 나타내는 한 전체, 단편, 뮤테인(mutein) 등 일 수 있으나, 바람직하게는 IL-2 전체가 될 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 IL-2 또는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 IL-2가 될 수 있다.

본 발명의 융합 단일클론 항체에 포함된 항-IGF-1R-mAb와 IL-2는 직접적으로 결합할 수도 있고, 링커를 통하여 결합할 수도 있다. 상기 항-IGF-1R-mAb과 IL-2를 직접적으로 결합하는 방법은 특별이 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 펩티드 결합, 이황화 결합 등을 이용하여 상기 두 개의 단백질을 결합시킬 수 있다.

본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지의 역할을 수행할 수도 있다. 본 발명에서 상기 링커는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 항-IGF-1R-mAb과 IL-2를 연결할 수 있는 폴리펩티드 또는 상기 항-IGF-1R-mAb을 암호화하는 유전자와 IL-2를 암호화하는 유전자를 연결할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화된 폴리펩티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 항-IGF-1R-mAb의 Fc 영역의 C-말단과 IL-2의 N-말단을 연결할 수 있는 펩타이드성 링커가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 GGGGS 모티프가 3번 반복된 형태의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드성 링커가 될 수 있고, 상기 GGGGS 모티프는 1~10번 반복될 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기의 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된 아미노산 서열로 구성됨이 바람직하다.

링커 펩타이드: GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 1)

링커 뉴클레오티드: 5'-GGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGCAGTCCCGGTGGCGGCTCC-3'(서열번호 2)

본 발명의 용어, "융합 단일클론 항체"란 단일클론 항체와 다른 펩타이드의 전체 또는 일부가 연결되어 형성된 형태를 가지고, 자연적으로는 존재하지 않는 인위적으로 생산된 단일클론 항체를 의미한다. 본 발명에서는 “융합 단일클론 항체”라는 용어를 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 IL-2가 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 연결된 형태의 융합 단백질을 지칭할 때 사용되는데, 이때, IL-2가 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 연결되는 부위는 상기 단일클론 항체의 모든 부위가 될 수 있고, 특정부위에 제한되지 않으며, 바람직하게는 Fc 부분, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 등이 될 수 있고, 상기 융합 단일클론 항체는 면역세포를 자극함과 동시에 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 나타낸다.

상기 융합 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 항-IGF-1R-mAb의 전체 또는 일부와 IL-2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 또는 항-IGF-1R-mAb의 전체 또는 일부와 IL-2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체가 될 수 있다.

바람직하게는 상기 융합 단일클론 항체는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 융합 단일클론 항체는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 융합 단일클론 항체는, 항-IGF-1R-mAb 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태(서열번호 13 또는 14)의 융합 단일클론 항체가 될 수 있다.

이때, 본 발명에서 제공하는 융합 단일클론 항체의 암세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 해리 상수값(KD 값)은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 100 nM 이하임이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IgG1_IL-2형태로 항IGF-1R_IL-2의 융합 단일클론 항체를 제작하였으며(실시예 1), FACS 방법으로 유방암 세포주인 MCF-7의 표면에 발현하는 IGF-1R에 항IGF-1R 항체(A12)와 이 항체에 IL-2를 결합시킨 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 IL-2를 결합시키지 않은 A12 항체와 유사하게 MCF-7 세포의 IGF-1R과 결합하는 것을 확인하였고, 이 항체들은 같은 부위를 인식하고 있음을 확인하였다(실시예 2-1). 또한, CTLL-2 세포주를 이용한 IL-2 의존성 세포증식을 확인한 결과, 융합항체의 IL-2가 세포증식능이 있어, IL-2의 활성을 가지고 있음을 확인하였다(실시예 2-2).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입되어 상기 융합 단일클론 항체를 발현할 수 있는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 항-IGF-1R-mAb을 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 항-IGF-1R-mAb을 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2의 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 E. coli, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법은(ⅰ) 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;(ⅱ) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;(ⅲ) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,(ⅳ) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 IL-2가 융합된 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 상기 중쇄 또는 경쇄와 함께 항체를 형성할 수 있는 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드의 조합을 각각 포함하는 2개의 발현벡터, 또는 상기 조합의 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 바이시스트로닉 벡터일 수 있다.

아울러, 상기 중쇄 또는 경쇄는 IL-2와 직접적으로 연결되거나 또는 링커 펩타이드를 통하여 연결될 수 있다. 이때, 링커 펩타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, GGGGS의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 일 수 있고, 이는 1~10번 반복 될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성됨이 바람직하며, 상기 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 구성됨이 바람직하다.

상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 다른 실시양태에 의하면, 본 발명의 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법은(ⅰ) 암세포 표면항원 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 수득하는 단계;(ⅱ) 인간의 IL-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;(ⅲ) 상기 수득한 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단과, 상기 수득한 인간의 IL-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단을 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 연결함으로써, 융합 폴리펩티드를 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;(ⅳ) 상기 수득한 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 융합 폴리뉴클레오티드를 각각 클로닝하여 각각의 발현벡터를 수득하는 단계;(ⅴ) 상기 수득한 각각의 발현벡터를 하나의 숙주세포에 동시에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,(ⅵ) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IGF-1R 항원에 결합하는 항체(A12 또는 AMG479)의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와, 인간의 IL-2를 암호화하는 유전자를 각각 수득하고, 상기 수득한 중쇄를 암호화하는 유전자의 3'-말단과 인간 IL-2를 암호화하는 유전자의 5'-말단을 링커 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결하여 융합 폴리뉴클레오티드를 수득하였다. 이어, 상기 경쇄를 암호화하는 유전자 및 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 각각 클로닝하여 각각의 발현벡터를 수득하고, 상기 수득한 각 발현벡터를 하나의 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. 끝으로, 상기 형질전환체를 배양하여 목적하는 융합 단일클론 항체를 생산하고, 이를 배양액으로부터 정제하여 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 제조하였다(실시예 1).

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "암"이란 통상적으로 알려진 원인에 의하여 발병하는 악성종양을 의미하는데, 본 발명에서는 특별히 이에 제한되지 않으나, 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종, 혈액암 등이 될 수 있고, 바람직하게는 세포의 표면에 IGF-1R이 비정상적으로 과발현되는 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 유방암이 될 수 있다.

본 발명의 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

아울러, 본 발명의 암치료용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 적소두 추출물과 분획물들을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 상기 융합 단일클론 항체가 암세포 사멸기능인 항체기능인 항체의존성 세포독성(ADCC)효과가 있음을 확인하였으며, 이를 통해 항암용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 유방암종인 MCF-7 세포를 투여한 암 모델 Xenogrft 항암치료효과를 확인하였으며(도 4), 또한, 상기 융합 단일클론 항체를 구성하는 IL-2와 단일클론 항체를 조합하여 투여한 것보다도 상기 융합 단일클론 항체를 투여하는 경우에 보다 우수한 항암치료효과를 나타냄을 확인하였다(도 5). 상기 결과는 본 발명의 융합 단일클론 항체가 암치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 뒷받침하는 것으로 분석되었다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 암치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 암을 치료하는 방법에서 투여되는 상기 암치료용 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 융한 단일클론 항체는 IL-2에 의해 암세포 주변의 면역세포가 강하게 활성화 되어 대조 항암항체 또는 보고된 항IGF-1R 항체보다 증가된 항체의존성 세포독성을 나타낼 수 있으므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 융합 단일클론 항체의 구조를 보여주는 개략도이다.
도 2는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 통한 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 항암항체(A12), 융합 항암항체(A12_IL-2) 및 대조군 항체(IgG1)의 결합력(좌측) 및 경쟁 결합능 측정결과(우측)를 나타내는 그래프이다.
도 3은 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)에 따른 CTLL-2 세포의 증식촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5는 IL-2, 항IGF-1R 항체(AMG479), IL-2와 항IGF-1R 항체(AMG479)의 조합 또는 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항 IGF -1R 항체와 인간 IL -2가 결합된 융합 단일클론 항체의 제조

CHO-S 포유동물 세포주에서 항IGF-1R 항체와 IL-2를 결합시킨 융합 단일클론 항체를 생산하기 위한 목적으로 항IGF-1R 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자는 Imclone사(A12)(서열번호 5 및 6) 또는 Amgen사(AMG479)(서열번호 9 및 10) 항IGF-1R항체의 유전자를 사용하였고, 인간 IL-2 유전자는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 공개된 유전자 서열(서열번호 12)을 사용하였다.

융합항체를 암호화하는 핵산의 발현은 원핵세포 또는 진핵세포에서 통상의 방법으로 수행할 수 있는데 진핵세포 숙주-벡터 시스템은 많은 상이한 종에 대한 광범위한 벡터를 포함한다. DNA를 증폭시키기 위한 대표적인 벡터는 pcDNA3.1 벡터이고 이를 다시 유전자 재조합을 통해 CHO-S 포유동물세포주에서 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 항체 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 확보하였다.

먼저, 링커로서 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 1)를 암호화하는 유전자(서열번호 2)를 사용하여 항IGF-1R 항체의 중쇄영역을 암호화하는 유전자의 3'-말단과 인간 IL-2를 암호화하는 유전자의 5'-말단을 연결하여, 항IGF-1R 항체의 중쇄영역을 암호화하는 부위와 IL-2를 암호화하는 부위가 링커 유전자를 통하여 연결된 융합 펩타이드(서열번호 13 또는 14)를 암호화하는 유전자를 수득하고 이를 발현벡터에 클로닝하였다.

또한, 항IGF-1R 항체의 경쇄영역을 암호화하는 유전자를 또 다른 발현벡터 pcDNA3.1에 클로닝하였다. 그런 다음, 상기 클로닝하여 얻어진 각 발현벡터를 CHO-S 포유동물세포주에 함께 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 500㎖ 배양용 삼각 플라스크에서 병 1개 당 200㎖의 부피로 세포배양기(SanYo, Japan)에서 4일동안 배양하여 융합 단일클론 항체를 생산하였다. 이때, 사용된 배지는 IgG 함량이 매우 낮은(ultra low IgG) 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 배지(Invitrogen Co., U.S.A.)와 CHO-S세포 전용 배지의 혼합액(혼합비 1:1)을 사용하였다.

배양이 종료된 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 이를 0.22㎛ 진공 필터 장치(Millipore, U.S.A.)로 여과하여, 목적하는 융합 단일클론 항체를 포함하는 배양액을 수득하였다.

상기 수득한 배양액을 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼(Hitrap MabSelect Sure, 5㎖, GE healthcare, U.S.A.)에 적용하여. 상기 배양액으로부터 융합 단일클론 항체를 정제하였다.

구체적으로, 상기 수득한 배양액을 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼에 로딩하고, 상기 컬럼을 50mM Tris-Cl(pH7.5), 150mM NaCl로 20배 컬럼부피만큼 1차 세척한 다음, 10배 컬럼 부피의 50mM Na-citrate(pH5.0)로 2차 세척하였다. 이어, 용출액(50mM Na-citrate 150mM NaCl, pH 3.4)을 가하여 항체분획을 용출시키고, 용출된 항체분획에 1M Tris-HCl(pH 9.0) 완충액을 가하여 중화시켰다.

상기 용출된 항체분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 활성분획을 수집한 다음, 원심분리형 농축기(Amicon Ultra, 30,000 MWCO, Millipore, U.S.A.)에 적용하여 인산완충액으로 완충액을 교환하면서 농축시켰다. 그런 다음, 농축된 항체분획을 0.22㎛ 공극 직경의 시린지 필터로 멸균 여과하고, 흡광도(A280)를 측정하여 항체 농도를 결정하였다. 도 1은 본 발명의 융합 단일클론 항체의 구조를 보여주는 개략도이다. 도 1에서 보듯이, IgG 형태의 항체 말단에 IL-2가 결합한 형태의 새로운 융합 단일클론 항체를 생산할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: FACS 기기를 이용한 MCF -7 세포에 발현된 IGF -1R에 대한 융합항체의 결합능 측정

MCF-7 유방암 세포주에서 발현되는 IGF-1R에 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 융합 단일클론 항체가 결합하는지의 여부를 확인하였다.

먼저, 1 x 10⁵ MCF-7 세포에 1㎍/㎖의 대조군 IgG, 항IGF-1R 항체(A12), 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 각각 처리하여 1시간동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후 FITC로 표식이 된 2차항체(항 인간 IgG-FITC, Sigma)를 가하여 추가로 반응시키고, FACS 기기로 IGF-1R에 대한 각 항체의 결합능을 측정하였다(도 2의 좌측 그래프). 도 2의 좌측 그래프는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 이용한 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 대조군 항체(IgG1), 항암항체(A12) 및 융합 항암항체(A12_IL-2)의 결합력 측정결과를 나타내는 그래프이다. 도 2의 좌측 그래프에서 보듯이, 대조군 항체에 비하여, 항암항체(A12)와 융합 항암항체(A12_IL-2)는 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대하여 높은 결합력을 나타내었으므로, 상기 항암항체(A12) 및 융합 항암항체(A12_IL-2)는 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 특이적으로 결합하는 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

다음으로, 1 x 10⁵ MCF-7 세포에 6.4pM, 32pM, 0.16nM, 0.8nM, 4nM, 20nM 또는 100nM의 rhIGF1-sR를 먼저 처리한 다음, 상기 rhIGF1-sR가 처리된 각각의 MCF-7 세포에 1㎍/㎖의 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 각각 처리하여 1시간동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후 FITC로 표식이 된 2차항체를 가하여 추가로 반응시키고, FACS 기기로 IGF-1R에 대한 각 항체의 결합능을 측정하였다(도 2의 우측 그래프). 도 2의 우측 그래프는 FACS 기기를 통한 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 항암항체(A12) 및 융합 항암항체(A12_IL-2)의 경쟁 결합능 측정결과를 나타내는 그래프이다. 도 2의 우측 그래프에서 보듯이, 항IGF-1R 항체(A12)와 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 유사한 수준으로 rhIGF1-sR과의 경쟁을 통해 MCF-7 세포 표면의 IGF-1R에 결합할 수 있음을 확인하였다.

이와 같은 결과는, 본 발명의 융합 항체가 항암항체와 동일하게 암세포에 발현하는 IGF-1R에 결합되어 ADCC를 야기할 수 있음을 의미하는 것으로 분석되었다.

실시예 3: In vitro IL -2 의존성 세포독성 T 세포주의 증식 확인

IL-2R가 과발현되는 세포독성 T 세포주인 CTLL-2(ATCC, TIB-214) 세포를 96웰 플레이트에 5 x 10⁴ 세포수가 되도록 분주하고, 원하는 농도로 희석한 IL-2, 항암항체인 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 단독으로 또는 IL-2와 병용하여 처리한 다음, 37℃ 배양기에서 72시간 배양하였다. 이어, WST-8(Dojindo laboratories)를 각 웰당 10㎕씩 넣어주고 1시간동안 반응시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다(도 3). 도 3은 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)에 따른 CTLL-2 세포의 증식촉진 효과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 IL-2와 유사한 정도로 세포의 증식을 촉진하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과는, 본 발명의 융합항체가 IGF-R1을 발현하는 세포로 항암항체를 집중시킬 뿐만 아니라, IL-2에 의해 세포독성을 나타내는 T 세포의 증식을 증가시켜 항체의존성 세포독성으로 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 뒷받침하며, 생체내에서 항암항체 단독 또는 IL-2와의 병용투여보다 본 발명의 융합항체가 보다 더 높은 항체의존성 세포독성을 나타낼 가능성이 있음을 시사하는 것으로 분석되었다.

실시예 4: 항암모델동물에서 융합 단일클론 항체의 항암효과 확인

실시예 4-1: A12_ IL -2의 항암효과 확인

누드마우스의 배면 피하에 베타-에스트라디올 서방형 팰렛을 이식하고, 3일이 경과한 후 MCF-7세포를 매트리젤(matrigel)과 1:1(v/v)로 혼합하고, 상기 혼합세포를 1 x 10⁷ 세포/200㎕/마우스의 농도로 상기 누드마우스의 등부위에 피하이식 하였다. 이식한 종양의 크기가 200㎣이 되는 시점(종양이식 후 7-8일)부터 주 2회 대조군(Vehicle), 항암항체인 항IGF-1R 항체(A12)(100㎍), IL-2(10㎍) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)(110㎍)를 각각 복강에 투여하고, 주 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 4). 도 4는 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

도 4에서 보듯이, 융합 단일클론 항체(A12_IL-2) 투여군에서는 1회 항체 투여 후부터 종양의 증식정도가 현저하게 억제됨을 알 수 있었고, 실험 종료시점에는 대조군(vehicle) 대비 80% 이상의 종양증식 억제효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 이 군들에서는 종양부위에 괴사가 일어나 점점 종양의 크기가 줄어들었으며, 2마리의 마우스에서는 종양이 완전히 사라졌다. 반면, 항IGF-1R 항체(A12) 투여군에서는 실험 21일째까지는 유의하게 종양 억제능을 보였으나 그 이후 급속도로 점차 종양의 크기가 증가됨을 확인할 수 있었고, 실험 종료일에는 대조군에 비하여 20% 정도의 종양증식 억제효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 한편, IL-2 단독 투여군은 대조군과 비교하여 유의한 종양 억제능을 보이지 못하였다.

따라서, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 IL-2를 단독으로 투여할 경우보다도 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 투여할 경우에 우수한 암치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 4-2: AMG479 _ IL -2의 항암효과 확인

누드마우스의 배면 피하에 베타-에스트라디올 서방형 팰렛을 이식하고, 3일이 경과한 후 MCF-7세포를 매트리젤과 1:1(v/v)로 혼합하고, 상기 혼합세포를 1 x 10⁷ 세포/200㎕/마우스의 농도로 상기 누드마우스의 등부위에 피하이식 하였다. 이식한 종양의 크기가 200㎣이 되는 시점(종양이식 후 7-8일)부터 주 2회 대조군(Vehicle), IL-2(10㎍), 항IGF-1R 항체(AMG479_IL-2)(100㎍), IL-2(10㎍)와 항IGF-1R 항체(AMG479_IL-2)(100㎍)의 조합 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)(110㎍)를 각각 복강에 투여하고, 주 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 5). 도 5는 IL-2, 항IGF-1R 항체(AMG479), IL-2와 항IGF-1R 항체(AMG479)의 조합 또는 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

도 5에서 보듯이, 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2) 투여군에서는 1회 항체 투여 후부터 종양의 증식정도가 현저하게 억제됨을 알 수 있었고, 실험 종료시점에는 대조군(vehicle) 대비 현저한 종양증식 억제효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 이 군들에서는 종양부위에 괴사가 일어나 점점 종양의 크기가 줄어들었다. 반면, 대조군(vehicle)에 비해 상대적으로 종양증식 억제효과를 보인 항IGF-1R 항체(AMG479), 또는 항IGF-1R 항체(AMG479)(100ug)와 IL-2(10ug)의 병용 투여군의 경우에는 초기에는 우수한 종양증식 억제효과를 나타내었지만 시간이 경과함에 따라 종양의 크가가 점차 증가함을 확인할 수 있었다. 한편, IL-2 단독 투여군은 대조군과 비교하여 유의한 종양 억제능력을 보이지 않았다.

따라서, 항IGF-1R 항체(AMG479), IL-2 또는 항IGF-1R 항체(AMG479)와 IL-2를 병용투여할 경우보다도 본 발명의 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2)를 투여할 경우에 더욱 우수한 암치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> A fusion monoclonal antibody comprising IGF-R1 antibody and IL-2, and pharmaceutical composition comprising the same <130> PA120455/KR <150> KR 10-2011-0097132 <151> 2011-09-26 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding linker peptide <400> 2 ggtggaggtg gcagcggtgg tggcggcagt cccggtggcg gctcc 45 <210> 3 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A12 heavy chain peptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser 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tgatgatctc ccggaccccc gaggtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc 840 cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900 aagaccaagc cccgggagga gcagtacaac tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 960 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 1020 ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc aaggccaagg gccagccccg ggagccccag 1080 gtgtacaccc tgcccccctc ccgggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1140 ctggtgaagg gcttctaccc ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc 1200 gagaacaact acaagaccac cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260 tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg 1320 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag 1380 tga 1383 <210> 6 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding A12 light chain peptide <400> 6 tcctccgagc tgacccagga ccccgccgtg tccgtggccc tgggccagac cgtgcggatc 60 acctgccagg gcgactccct gcggtcctac tacgccacct ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccca tcctggtgat ctacggcgag aacaagcggc cctccggcat ccccgaccgg 180 ttctccggct cctcctccgg caacaccgcc tccctgacca ttaccggcgc ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg caagagccgg gacggctccg gccagcacct ggtgttcggc 300 ggcggcacca agctgaccgt gctgggccag cccaaggccg ccccctccgt gaccctgttc 360 cctccctcct ccgaggagct gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatctccgac 420 ttctaccccg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgact cctcccccgt gaaggccggc 480 gtggagacca ccaccccctc caagcagtcc aacaacaagt acgccgcctc ctcctacctg 540 tccctgaccc ccgagcagtg gaagtcccac cggtcctact cctgccaggt gacccacgag 600 ggctccaccg tggagaagac cgtggccccc gccgagtgca gctgagcggc cgct 654 <210> 7 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMG479 heavy chain peptide <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val 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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 465 470 475 480 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 485 490 495 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 500 505 510 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 515 520 525 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 530 535 540 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 545 550 555 560 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 565 570 575 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 580 585 590 Ile Ser Thr Leu Thr Ala 595

Claims

암세포 표면 항원인 IGF-1R(Insulin like growth factor-1 receptor)에 대하여 특이적으로 결합하는, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 펩타이드 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 펩타이드로 이루어진 항체 및 IL-2(Interleukin-2)가 연결된 융합 단일클론 항체.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체는 IgG 형태인 것인 융합 단일클론 항체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 IL-2는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 영역의 C-말단에 연결된 것인 융합 단일클론 항체.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체와 IL-2는 링커로 연결된 것인 융합 단일클론 항체.
제5항에 있어서,
상기 링커는 펩타이드 링커인 것인 융합 단일클론 항체.
제6항에 있어서,
상기 펩타이드 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 단일클론 항체.
제1항에 있어서,
암세포 표면 항원에 대한 해리 상수(KD value)가 100nM 이하인 친화력을 가지는 것인 융합 단일클론 항체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 IL-2는 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 단일클론 항체.
제1항에 있어서,
서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 것인 융합 단일클론 항체.
제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제8항 및 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제12항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 유전자와 IL-2를 암호화하는 유전자가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 항체를 암호화하는 유전자와 IL-2를 암호화하는 유전자가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드 것인 폴리뉴클레오티드.
제12항에 있어서,
상기 항체를 암호화하는 유전자는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제12항에 있어서,
상기 IL-2를 암호화하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제12항의 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제16항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
제17항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 융합 단일클론 항체의 제조방법.
(ⅰ) 제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제8항 및 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;
(ⅲ) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
(ⅳ) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제8항 및 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법.
제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제8항 및 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물.
제20항에 있어서,
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 암치료용 조성물.
제20항에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종 또는 혈액암으로 구성되는 군에서 선택된 것인 암치료용 조성물.