ES2931477T3 - Anticuerpo anti-CDH3 que tiene alta capacidad de internalización - Google Patents

Abstract

Es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo anti-cadherina que tenga una alta capacidad de internalización y proporcionar un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-cadherina que elimine eficazmente las células cancerosas que expresan cadherina con el uso de dicho anticuerpo. La presente invención proporciona un anticuerpo anti-cadherina que reconoce un dominio de cadherina 1 (EC1) de cadherina y exhibe una alta capacidad de internalización. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-CDH3 que tiene alta capacidad de intemalización

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-cadherina que reconoce un determinado dominio de cadherina y tiene una alta capacidad de internalización. Además, la presente invención se refiere a un conjugado de anticuerpo anti-cadherina-fármaco. Además, la presente divulgación se refiere a un método para el uso de un conjugado de anticuerpo anti-cadherina-fármaco.

Antecedentes de la técnica

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

El cáncer es una enfermedad grave, que es una de las causas principales de muerte, pero la necesidad de tratamiento del mismo aún no se ha satisfecho. Con el fin de solucionar el problema de las técnicas de quimioterapia convencionales, que dañan de manera desventajosa las células normales, en los últimos años se han realizado estudios activos sobre una técnica de tratamiento del cáncer realizada con el uso de un fármaco de direccionamiento molecular que se ha diseñado para seleccionar como diana una molécula específica expresada específicamente en una célula cancerosa.

Un ejemplo de una molécula que puede ser la diana de un fármaco dirigido de manera molecular en el cáncer es la cadherina. La cadherina es una proteína de membrana que se descubrió como molécula asociada con adhesión celular homofílica, dependiente de calcio (documento no de patente 1). Las proteínas que tienen repeticiones de cadherina (EC) compuestas por aproximadamente 110 residuos de aminoácido, que son altamente homólogas entre sí, se denominan superfamilia de cadherina. La superfamilia de cadherina incluye 120 o más especies de proteína y desempeña un papel clave en el mantenimiento de la estructura en capas multicelular.

Se ha notificado que los niveles de expresión de cadherina están elevados en células cancerosas. Por consiguiente, se ha estudiado el uso de un fármaco que comprende un anticuerpo que reconoce la cadherina y un agente anticanceroso unido al mismo o un anticuerpo que tiene actividad citotóxica dependiente de anticuerpos (ADCC) para el tratamiento de cáncer para células cancerosas que presentan un nivel de expresión de cadherina superior en tejido canceroso en comparación con el de en tejido normal (documento de patente 1 : documento de patente 2 ).

Las proteínas que pertenecen a la superfamilia de cadherina pueden clasificarse aproximadamente tal como sigue según las características estructurales de las mismas: 1) cadherinas clásicas; 2) cadherinas desmosómicas; 3) protocadherinas; y 4) otras. Los miembros principales de la superfamilia de cadherina; es decir, cadherinas clásicas tales como E-cadherina (CDH1), N-cadherina (CDH2) y P-cadherina (CDH3) son altamente homólogas entre sí (figura 1). Específicamente, tales proteínas son proteínas transmembrana que atraviesan una sola vez la membrana que se supone que forman dímeros, y tiene 5 dominios extracelulares de cadherina (EC1 a EC5) y dominios intracelulares. La adhesión celular mediada por adherinas clásicas se caracteriza por adhesión entre células homogéneas, y tal adhesión celular tiene lugar cuando las células reconocen la molécula de cadherina de la misma especie que se expresa específicamente y de manera diferente dependiendo de la especie celular. Específicamente, CDH1 reconoce y se une a CDH1, y CDH3 reconoce y se une a CDH3. Por tanto, las células de la misma especie se adhieren entre sí (figura 2 ).

Se deduce que las cadherinas homólogas/heterólogas las reconoce el dominio de cadherina 1 (EC1) ubicado en el extremo N-terminal del dominio extracelular (documento no de patente 2). Klingel et al. demuestran que, incluso cuando se sustituye una secuencia que comprende las posiciones 1 a 213 de la secuencia de aminoácidos de CDH3 humano (SEQ ID NO: 2) por el correspondiente dominio de CDH1 humano, se uniría a CDH3 en lugar de CDH1 (documento no de patente 3). Por tanto, las cadherinas clásicas, incluyendo CDH1 y CDH3, se considera que se unen entre sí basándose en el mismo mecanismo.

En los últimos años, muchos fármacos de anticuerpo para el tratamiento contra el cáncer se han comercializado realmente como fármacos dirigidos molecularmente, y muchos de tales fármacos se basan en el mecanismo de ADCC. Sin embargo, la eficacia farmacológica de los mismos no siempre es suficiente, y se ha intentado el desarrollo de técnicas que ejerzan efectos antitumorales más potentes.

Un ejemplo de un medio eficaz para potenciar la actividad antitumoral del anticuerpo es un conjugado de un anticuerpo y un fármaco altamente tóxico (toxina). Si se administra una toxina a un paciente por sí misma, de manera desventajosa daña los tejidos normales. Por consiguiente, no puede servir como medio terapéutico eficaz. Al unir una toxina a un anticuerpo que se une a un antígeno específico de célula tumoral, sin embargo, una toxina puede destruir selectivamente células tumorales sin afectar adversamente al tejido normal. Tales fármacos se denominan “conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC)”. Específicamente, una toxina no ejerce su toxicidad mientras está unida a un anticuerpo. Sin embargo, algunos anticuerpos se incorporan dentro de las células cuando los anticuerpos se unen a un antígeno diana, y entonces se degradan en los lisosomas. Por consiguiente, tales anticuerpos que comprenden toxinas unidas a los mismos se incorporan y degradan en células, se liberan las toxinas, se expresa selectivamente la toxicidad en células específicas y se destruyen las células de ese modo.

En ADC, los fármacos unidos a anticuerpos circulan en la sangre, y tales fármacos se acumulan y ejercen eficacia farmacológica en células tumorales diana. No es preferible que un fármaco se libere en cualquier sitio distinto de regiones tumorales (es decir, liberación de anticuerpos) debido a un riesgo de efectos secundarios adversos. Es decir, es preferible que los ADC se diseñen de una manera tal que los fármacos unidos a anticuerpos se incorporen en primer lugar a células y luego se liberen de los anticuerpos. Desde tal punto de vista, Genentech Inc. ha desarrollado fármacos que comprenden trastuzumab y toxina unida al mismo (T-DM1), los fármacos desarrollados se han sometido a pruebas clínicas, y tales fármacos ejercen efectos clínicos notablemente altos. Es decir, no es suficiente si los ADC simplemente se acumulan en células cancerosas diana, y es necesario que los ADC se incorporen eficazmente en las células cancerosas. Tal capacidad (la capacidad de internalización de un anticuerpo) está estrechamente relacionada con la eficacia farmacológica de ADC.

La capacidad de internalización de un anticuerpo se ve afectada tanto por la proteína de superficie de membrana a la que se une un anticuerpo como un anticuerpo propio. Por consiguiente, tal capacidad no puede deducirse inequívocamente basándose en la estructura molecular, las propiedades físicas del anticuerpo u otros factores. El examen de anticuerpos relevantes con una alta capacidad de internalización contra antígenos es por consiguiente un gran objetivo en el desarrollo de ADC. La presente invención pretende superar tal objetivo con respecto al antígeno CDH3. El documento EP 2 426 149 se refiere a un anticuerpo anti-cadherina que tiene alta citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, en particular a un anticuerpo anti-cadherina, que reconoce una cualquiera de la región en el sentido de 5' de EC1, un dominio de cadherina 4 (EC4) y un dominio de cadherina 5 (EC5). Zhang et al. 2008 (AACR Meeting Abstracts, 2008-04-16, p. 1-2) y Zhang et al. 2010 (Clin Cancer Res. 2010; 16(21):5177-88) se refieren a la caracterización de las propiedades biológicas de PF-03732010, un anticuerpo monoclonal humano contra P-cadherina, en ensayos basados en células y modelos tumorales.

Tal como se describió anteriormente, se ha conocido el concepto de tratamiento del cáncer con el uso de ADC. Sin embargo, ninguna de tales técnicas sugiere la eficacia de un complejo inmunitario resultante de la conjugación de un anticuerpo anti-cadherina que tiene una alta capacidad de internalización con un fármaco. Aunque se ha notificado la correlación entre la estructura de los dominios y la función de cadherina, no se ha hecho ningún informe con respecto a la correlación entre la estructura de los dominios y la capacidad de internalización.

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: WO 2002/097395

Documento de patente 2: WO 2007/102525

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Yoshida y Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982

Documento no de patente 2: Nose, A. et al., Cell 61; 147-155,1990

Documento no de patente 3: Klingel, H. et al., Journal of Cell Science 113: 2829-36, 2000

Sumario de la invención

Objetos que van a solucionarse mediante la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-cadherina que tiene una alta capacidad de internalización. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un conjugado de anticuerpo anti-cadherinafármaco que destruye eficazmente células cancerosas que expresan cadherina con el uso de tal anticuerpo.

Medios para solucionar los objetos

Los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de solucionar los objetos anteriores. Sometieron a ensayo la capacidad de internalización del anticuerpo anti-CDH3 humano y descubrieron que cada anticuerpo ejercía una capacidad de internalización diferente. Por tanto, clasificaron los anticuerpos dependiendo de los dominios reconocidos de ese modo y descubrieron que sería altamente probable que anticuerpos con una alta capacidad de intemalización reconocieran el dominio de cadherina 1 (EC1).

Los ejemplos de factores que definen la capacidad de intemalización del anticuerpo incluyen la afinidad de un anticuerpo por un antígeno y un epítopo reconocido por un anticuerpo, aunque los detalles de lo mismo siguen sin conocerse. La presente invención se ha completado realizando exámenes al tiempo que se centraba el foco especialmente en la correlación entre un anticuerpo y un epítopo reconocido de ese modo.

Según la presente invención, se proporciona lo siguiente.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, la presente invención proporciona un agente citotóxico que comprende un anticuerpo monoclonal IgG anti-p-cadherina, que reconoce un dominio de cadherina 1 (EC1) de p-cadherina y presenta una alta capacidad de internalización, en el que la alta capacidad de internalización es una viabilidad sometida a ensayo de células que expresan CDH3 que es del 60% o menos, cuando el anticuerpo se administra con un anticuerpo anti-IgG marcado con saporina, en el que la célula que expresa CDH3 es la línea celular de cáncer de mama HCC1954 (ATCC, CRL-2338), en el que se conjuga una sustancia citotóxica con el anticuerpo, y en el que la sustancia citotóxica es un derivado de maitansinoide seleccionado de DM1, DM3 o DM4 o un derivado de auristatina seleccionado de MMAE o MMAF. Otras realizaciones ventajosas de la presente invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

La presente divulgación proporciona además un método para destruir células que expresan altamente cadherina en un paciente que comprende administrar el anticuerpo o el agente citotóxico de la presente invención a un paciente con una alta expresión de cadherina. Además, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de enfermedad con una alta expresión de cadherina, que comprende administrar el anticuerpo o el agente citotóxico de la presente invención a un paciente con una alta expresión de cadherina.

Además, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo de la presente invención para la producción de un agente citotóxico. Además, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo de la presente invención para la producción de un agente terapéutico para enfermedades con una alta expresión de cadherina.

Efectos de la invención

El anticuerpo anti-cadherina de la presente invención reconoce el dominio de cadherina 1 (EC1) de cadherina y tiene una alta capacidad de internalización. Un anticuerpo capaz de ejercer una alta capacidad de internalización es útil para la preparación de un anticuerpo modificado y diseñado por ingeniería genética. Por ejemplo, un fármaco que ejerce toxicidad en una célula se une al anticuerpo anti-cadherina de la presente invención, y el resultante se administra a un paciente que tiene células cancerosas que expresan cadherina. Por tanto, pueden esperarse efectos antitumorales potentes. Específicamente, el anticuerpo anti-cadherina de la presente invención es útil como agente anticanceroso. Según la presente invención, se proporciona un complejo inmunitario que comprende el anticuerpo y un agente quimioterápico unido al mismo por medio de un ligador. Este complejo inmunitario presenta citotoxicidad más potente sobre líneas de células cancerosas que expresan cadherina, en comparación con un anticuerpo al que no se ha unido un agente quimioterápico. Por consiguiente, pueden esperarse efectos antitumorales potentes para la administración del complejo inmunitario a un paciente que tiene células cancerosas que expresan cadherina. Específicamente, el complejo inmunitario de la presente invención es útil como agente anticanceroso.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra secuencias de proteínas de maduración de CDH1 (E-cadherina), CDH2 (N-cadherina), y CDH3 (P-cadherina) de la que se han eliminado las secuencias de propéptido y señal.

[Figura 2] La figura 2 muestra el mecanismo de adhesión de moléculas que pertenecen a la familia de cadherinas clásicas.

[Figura 3] La figura 3 muestra los resultados de ARNm de CDH3 humano expresado en diversos tipos de tejidos tumorales (A: tejidos normales; B: diversos tipos de tejidos con cáncer; y C: el grado de diferenciación de células cancerosas pancreáticas).

[Figura 4] La figura 4 muestra los resultados de la inmunotinción de CDH3 humano en diversos tipos de tejidos tumorales.

[Figura 5] La figura 5 muestra los resultados de análisis de citometría de flujo basados en la reacción de líneas celulares forzadas a expresar CDH3 humano y un anticuerpo anti-CDH3 humano disponible comercialmente (A: células CHO; B: células CHO forzadas a expresar CDH3 humano; a: anticuerpo anti-CDH3 humano 0,01 mg/ml; b: anticuerpo anti-CDH3 humano 0,1 mg/ml; y c: anticuerpo anti-CDH3 humano 1 mg/ml).

[Figura 6] La figura 6 muestra los resultados de análisis de citometría de flujo típicos basados en la reacción de 3 ejemplos de anticuerpos obtenidos y diversas líneas celulares (A: células CHO forzadas a expresar CDH3 humano; B: células CHO; C: línea celular de cáncer de pulmón NCI-H358; a: anticuerpo anti-CDH3 humano 0,01 mg/ml; b: anticuerpo anti-CDH3 humano 0,1 mg/ml; y c: anticuerpo anti-CDH3 humano 1 mg/ml).

[Figura 7] La figura 7 muestra la capacidad de internalización del anticuerpo de ratón anti-CDH3 humano y la viabilidad de células humanas que expresan CDH3 a las que se les han administrado diversos tipos de anticuerpos y el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con saporina (en relación con la viabilidad celular (100 %) lograda sin la adición de anticuerpos). Se llevaron a cabo ensayos múltiples veces cambiando los tipos de anticuerpos administrados (A y B).

[Figura 8] La figura 8 muestra los dominios extracelulares de CDH3 humano correspondientes a los fragmentos de proteína parciales 1 a 5 de CDH3 humano.

[Figura 9] La figura 9 muestra los resultados de la expresión proteína parcial de CDH3 humano (A: fragmento 1; B: fragmento 2; C: fragmento 3; D: fragmento 4; y E: fragmento 5).

[Figura 10] La figura 10 muestra las reacciones de proteínas parciales de CDH3 humano y diversos anticuerpos analizados mediante inmunotransferencia de tipo Western (A: fragmento 1; B: fragmento 2; C: fragmento 3; D: fragmento 4; y E: fragmento 5).

[Figura 11] La figura 11 muestra los resultados del análisis de epítopos de PPAT-055-13 usando un alineamiento de péptidos. Un valor numérico en el eje X indica el número de un péptido en un alineamiento de péptidos (A: PPAT-055-13; B: en ausencia de anticuerpo primario).

[Figura 12] La figura 12 muestra la estructura de DM1SMe.

[Figura 13] La figura 13 muestra los resultados de la prueba de citotoxicidad del conjugado de anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano-fármaco in vitro (ADC: un clon del anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano al que se le ha unido un fármaco; Desnudo: el anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano).

[Figura 14] La figura 14 muestra los resultados del análisis de tinción inmunohistológica de CDH3 humano expresado en una masa tumoral formada por medio de trasplante de la línea celular HCC1954 en un ratón.

[Figura 15] La figura 15 muestra los resultados de la prueba de citotoxicidad del conjugado de anticuerpo quimérico frente a ^c DH3 humano-fármaco in vivo (un clon del anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano al que se le ha unido un fármaco; Desnudo: el anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano no conjugado; Vehículo: lisado de anticuerpo).

Realizaciones para llevar a cabo la invención

A continuación en el presente documento, la presente invención se describe en mayor detalle.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo anti-cadherina que reconoce el dominio de cadherina 1 (EC1) de cadherina y tiene una alta capacidad de internalización.

En esta descripción, el dominio de cadherina 1 (EC1), el dominio de cadherina 2 (EC2), el dominio de cadherina 3 (EC3), el dominio de cadherina 4 (EC4) y el dominio de cadherina 5 (EC5) de P-cadherina (CDH3), E-cadherina (CDH1) y N-cadherina (CDH2) representan cada uno dominios descritos a continuación. Los correspondientes dominios de otras cadherinas pueden determinarse comparando secuencias de proteína de cadherina conocidas obtenidas de Genbank u otras instituciones. Puede llevarse a cabo la comparación de secuencias usando un programa conocido, tal como ClustalW2 (Thompson, J. D. et al., Nucleic Acids Research 22 (22): 3673-3680, 1994) o ClustalX2 (Thompson, J. D. et al., Nucleic Acids Research 25 (24): 4876-4882, 1997).

P-cadherina (CDH3)

Dominio de cadherina 1 (EC1): posiciones 108 a 236 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 Dominio de cadherina 2 (EC2): posiciones 237 a 348 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 Dominio de cadherina 3 (EC3): posiciones 349 a 461 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 Dominio de cadherina 4 (EC4): posiciones 462 a 550 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 Dominio de cadherina 5 (EC5): posiciones 551 a 654 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 E-cadherina (CDH1)

Dominio de cadherina 1 (EC1): posiciones 155 a 283 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 Dominio de cadherina 2 (EC2): posiciones 284 a 395 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 Dominio de cadherina 3 (EC3): posiciones 396 a 507 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 Dominio de cadherina 4 (EC4): posiciones 508 a 597 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 Dominio de cadherina 5 (EC5): posiciones 598 a 704 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 N-cadherina (CDH2)

Dominio de cadherina 1 (EC1): posiciones 160 a 288 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 Dominio de cadherina 2 (EC2): posiciones 289 a 402 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 Dominio de cadherina 3 (EC3): posiciones 403 a 518 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 Dominio de cadherina 4 (EC4): posiciones 519 a 607 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 Dominio de cadherina 5 (EC5): posiciones 608 a 719 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 La capacidad de internalización del anticuerpo puede someterse a ensayo según una técnica conocida. Por ejemplo, se conocen un método que comprende marcar un anticuerpo (o un anticuerpo secundario) con RI, un colorante fluorescente u otra sustancia y someter a ensayo el nivel de incorporación de marcador (intensidad de fluorescencia y RI) y un método para someter a ensayo la muerte celular usando una toxina tal como saporina (por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con saporina). Desde el punto de vista de la sensibilidad y la conveniencia, un método que implica el uso de un anticuerpo marcado con una toxina saporina es superior a otras técnicas. Los valores numéricos que indican los grados de capacidad de internalización usados en el presente documento se determinan en las condiciones descritas en el ejemplo 6 o 15. Específicamente, la capacidad de internalización se somete a ensayo de la siguiente manera.

(1) Ensayo de la capacidad de internalización

El anticuerpo anti-CDH3 humano (100 ng) y el anticuerpo marcado con saporina (100 ng, Advanced Targeting Systems, Inc.) se añadieron a las células que expresan CDH3 humano, y los resultados se calentaron en un incubador a 37 °C en presencia del 5 % de CO2 durante 3 días. Después de eso, se evaluó la actividad de un anticuerpo para determinar la destrucción celular usando un reactivo de recuento de células viables (Cell Counting Kit-8, ^d O^{j i}N^d O LABORATORIES, Inc.). Se expresó la actividad de destrucción celular en relación con una viabilidad celular del 100 % lograda sin la adición de anticuerpo.

En la presente invención, “alta capacidad de internalización” se refiere a que la viabilidad de células que expresan CDH3 a las que se les han administrado el anticuerpo de interés y el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con saporina (representado en relación con una viabilidad celular del 100 % lograda sin la adición de anticuerpo), es preferiblemente del 70 % o menos, más preferiblemente del 60 % o menos, más preferiblemente del 50 % o menos, más preferiblemente del 45 % o menos, además preferiblemente del 40 % o menos y de manera particularmente preferible del 35 % o menos.

Es preferible que el anticuerpo de la presente divulgación reconozca una cadherina clásica. Los ejemplos de la misma incluyen, pero no se limitan a, E-cadherina, N-cadherina y P-cadherina.

Como antígeno usado para la preparación del anticuerpo de la presente divulgación puede usarse cadherina o un péptido parcial de la misma. Un ejemplo de la misma es, pero no se limita a, una proteína CDH3 soluble.

El anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. El anticuerpo (policlonal o monoclonal) de la presente divulgación puede prepararse mediante cualquier técnica. Las técnicas para preparar tal anticuerpo se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). El término “anticuerpo monoclonal” usado en el presente documento no se limita a un anticuerpo preparado mediante una técnica de hibridoma. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se origina a partir de un único clon (por ejemplo, un clon de un eucariota, procariota o fago), y tal anticuerpo puede prepararse mediante cualquier método. El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos de las mismas incluyen un método de hibridoma, un método de recombinación, un método de presentación en fago y una combinación de cualquiera de los mismos. Todos de los mismos están dentro del alcance de la presente invención.

(a) Preparación de anticuerpo policlonal

Con el fin de preparar un anticuerpo policlonal, se administra cadherina, el producto de expresión del dominio extracelular de cadherina o un péptido parcial de la misma (preferiblemente EC1), como antígeno, a un animal mamífero, tal como una rata, ratón o conejo. La cantidad del antígeno que va a administrarse por animal es de 0,1 a 100 mg cuando no se usa adyuvante, y es de 1 a 100 |ig cuando se usa un adyuvante. Los ejemplos de adyuvante incluyen adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund (FIA) y adyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización se lleva a cabo principalmente por medio de inyección intravenosa, hipodérmica o intraperitoneal. El intervalo entre dos casos de inmunización no está particularmente limitado, y la inmunización se lleva a cabo al intervalo de varios días a varias semanas, y preferiblemente al intervalo de 2 a 5 semanas de 1 a 10 veces, y preferiblemente de 2 a 5 veces. El título de anticuerpo se somete a ensayo por medio de inmunoensayo enzimático (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) u otras técnicas de 6 a 60 días tras el caso de inmunización final, y la muestra de sangre se recoge el día que se somete a ensayo el título de anticuerpo máximo con el fin de obtener antisuero. Si es necesario, puede purificarse un anticuerpo a partir del antisuero mediante una técnica conocida seleccionada adecuadamente de entre, por ejemplo, precipitación con sales con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía de afinidad. Alternativamente, cualquiera de estas técnicas puede realizarse en combinación adecuada.

(b) Preparación de anticuerpo monoclonal

Con el fin de preparar un anticuerpo monoclonal, se administra cadherina, un producto de expresión del dominio extracelular de cadherina, o un péptido parcial de la misma (preferiblemente EC1 ), como antígeno, a un animal mamífero, tal como una rata, ratón o conejo. La cantidad del antígeno que va a administrarse por animal es de 0,1 a 100 mg cuando no se usa adyuvante, y es de 1 a 100 |ig cuando se usa un adyuvante. Los ejemplos de adyuvante incluyen adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund (FIA) y adyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización se lleva a cabo principalmente por medio de inyección intravenosa, hipodérmica o intraperitoneal. El intervalo entre dos casos de inmunización no está particularmente limitado, y la inmunización se lleva a cabo al intervalo de varios días a varias semanas, y preferiblemente al intervalo de 2 a 5 semanas de 1 a 10 veces, y preferiblemente de 2 a 5 veces. Las células productoras de anticuerpos se recogen de 1 a 60 días, y preferiblemente de 1 a 14 días tras el caso de inmunización final. Los ejemplos de las células productoras de anticuerpos incluyen células de bazo, células de ganglios linfáticos y células de sangre periférica, siendo preferibles células de bazo y células de ganglios linfáticos locales.

Con el fin de obtener células de hibridoma de fusión, se someten células productoras de anticuerpos y células de mieloma a fusión celular. Como células de mieloma que van a fusionarse con las células productoras de anticuerpos, pueden usarse líneas celulares establecidas generalmente disponibles de animales tales como ratones. Las líneas celulares tienen preferiblemente propiedades tal como sigue. Es decir, son preferibles las líneas celulares que tienen selectividad para fármacos que no pueden sobrevivir en medio de selección HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) en un estado sin fusión y solo pueden sobrevivir en un estado en el que la célula se fusiona con las células productoras de anticuerpos. Los ejemplos de células de mieloma incluyen células de mieloma de ratón, tales como P3363-Ag.8.U1 (P3U1) y NS-1.

Posteriormente, las células de mieloma y las células productoras de anticuerpos se someten a fusión celular. La fusión celular se lleva a cabo en un medio para el cultivo de células animales, tal como medio RPMI-1640 o DMEM libre de suero, mezclando las células productoras de anticuerpos (de 1 x 106 a 1 x 107 células /ml) y las células de mieloma (de 2 x 105 a 2 x 106 células /ml) (la razón de las células productoras de anticuerpos con respecto a las células de mieloma es preferiblemente de 5:1) en presencia de un promotor de la fusión celular. Un ejemplo de un promotor de la fusión celular que puede usarse es polietilenglicol que tiene el peso molecular promedio de 1000 a 6000 Da. Alternativamente, puede usarse un aparato de fusión celular disponible comercialmente que utiliza estimulación eléctrica (por ejemplo, electroporación) para permitir que las células productoras de anticuerpos se fusionen con las células de mieloma.

Se seleccionan hibridomas de interés de las células que se han sometido a fusión celular. Para este fin, se diluye adecuadamente una suspensión celular con medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal, el resultante se aplica a una placa de microtitulación a la densidad celular de aproximadamente 3 x 105 células/pocillo, se añade un medio de selección a cada pocillo, y entonces se realiza el cultivo mientras se intercambia adecuadamente el medio de selección. Como resultado, las células hechas crecer aproximadamente 14 días tras el inicio del cultivo en el medio de selección pueden obtenerse como hibridomas.

Posteriormente, el sobrenadante de cultivo de los hibridomas hechos crecer se examina para detectar el anticuerpo diana. La selección de hibridomas puede llevarse a cabo según una técnica convencional, sin limitación particular. Por ejemplo, parte del sobrenadante de cultivo contenido en los pocillos que contienen las células hechas crecer como hibridomas se muestrea, y pueden llevarse a cabo inmunoensayos enzimáticos, radioinmunoensayos, o similares para examinar hibridomas que producen anticuerpos que se unen al dominio de cadherina 1 (EC1). Se someten las células de fusión a clonación por medio de dilución limitante u otros medios, y pueden establecerse al final células de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales.

Pueden recogerse anticuerpos monoclonales a partir de los hibridomas establecidos mediante, por ejemplo, una técnica de cultivo celular convencional o recogida de fluido ascítico. Según una técnica de cultivo celular, se cultivan hibridomas en un medio para cultivo de células animales tal como medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10 %, medio MEM o medio libre de suero en condiciones de cultivo generales (por ejemplo, a 37 °C en presencia del 5 % de CO2) durante de 7 a 14 días, y se obtienen anticuerpos a partir del sobrenadante de cultivo.

Cuando van a recogerse anticuerpos monoclonales por medio de recogida de fluido ascítico, se administran por vía intraperitoneal aproximadamente 1 * 107 células de hibridoma a animales de la misma especie que el animal mamífero del que se obtienen células de mieloma, con el fin de permitir que crezcan grandes cantidades de células de hibridoma. El fluido ascítico se muestrea de 1 a 2 semanas después de eso. Si el método para recoger anticuerpos descrito anteriormente requiere purificación de anticuerpos, puede llevarse a cabo mediante una técnica conocida seleccionada adecuadamente de entre, por ejemplo, precipitación con sales con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía de afinidad. Alternativamente, cualquiera de estas técnicas puede realizarse en combinación adecuada.

El anticuerpo de la presente divulgación no está particularmente limitado. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo de ratón, anticuerpo humano, anticuerpo de rata, anticuerpo de conejo, anticuerpo de oveja, anticuerpo de camello, anticuerpo de ave o un anticuerpo recombinante de gen modificado artificialmente previsto para disminuir la heteroantigenidad contra el ser humano, tal como anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado. Puede producirse un anticuerpo recombinante de gen mediante una técnica conocida. Un anticuerpo quimérico se compone de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un animal mamífero no humano, tal como un anticuerpo de ratón, y las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano. Tal anticuerpo puede obtenerse uniendo ADN que codifica una región variable del anticuerpo de ratón a ADN que codifica una región constante del anticuerpo humano, insertando el resultante en un vector de expresión e introduciendo el vector de expresión en una célula huésped. Un anticuerpo humanizado se prepara trasplantando una región determinante de complementariedad (CDR) de un animal mamífero no humano, tal como un anticuerpo de ratón, en la región determinante de complementariedad de un anticuerpo humano, y se ha conocido para ello una técnica de recombinación génica general. Específicamente, se sintetiza una secuencia de ADN que está diseñada para unir una CDR de un anticuerpo de ratón a una región de entramado (FR) de un anticuerpo humano por medio de PCR a partir de varios oligonucleótidos preparados para que tengan regiones solapantes en los extremos terminales. El ADN obtenido se une a un ADN que codifica para una región constante de un anticuerpo humano, el resultante se inserta en un vector de expresión y el vector de expresión se introduce entonces en una célula huésped. Por tanto, se prepara un anticuerpo humanizado (por ejemplo, documentos EP 239400 y WO 96/02576).

CH de un anticuerpo humanizado quimérico puede ser una inmunoglobulina humana de cualquier tipo (a continuación en el presente documento, denominada “hIg”), CH de la clase hIgG es preferible, y puede usarse cualquiera de las subclases hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4 de la clase hIgG. CL de un anticuerpo humanizado quimérico puede ser cualquier hIg, y puede usarse la de la clase k o X.

El anticuerpo humanizado con CDR trasplantadas se prepara trasplantando las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH y VL de un anticuerpo de animal no humano en posiciones adecuadas de la VH y la VL de un anticuerpo humano.

El anticuerpo humanizado con CDR trasplantadas puede prepararse construyendo ADNc que codifica una región V que resulta del trasplante de las secuencias de aminoácidos de las CDR de Vh y VL de un anticuerpo de animal no humano que reacciona específicamente con cadherina en las FR de VH y VL de cualquier anticuerpo humano, insertando los resultantes en un vector de expresión de célula animal que tiene ADN que codifica CH y CL del anticuerpo humano para construir un vector que expresa el anticuerpo humanizado con CDR trasplantadas, e introduciendo y expresando el resultante en una célula animal.

Muchas células huésped productoras de anticuerpos que se usan para la expresión de proteínas se originan a partir de animales mamíferos. La célula huésped específica que es la más óptima para el producto de expresión génica de interés puede determinarse preferentemente. Los ejemplos de células huésped generales incluyen, pero no se limitan a, la línea celular que se origina a partir de la célula CHO (célula de ovario de hámster chino), la CV1 (célula de riñón de mono), COS (un derivado de CV1 que alberga el antígeno T de SV40), SP2/0 (célula de mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (célula de mieloma de ratón), 293 (célula de riñón humano) y 293T (un derivado de 293 que alberga el antígeno T de SV40). Pueden obtenerse células huésped de instituciones comerciales, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o una organización que ha publicado un documento relevante.

Una célula huésped preferible es o bien la línea celular deficiente en DGFR que se origina a partir de la célula CHO, o bien SP2/0 (véase Urland, G. et al., Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions, Somat. Cell. Mol. Genet. Vol. 12, 1986, págs. 5555-566; y Schulman, M. et al., A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies, Nature, vol. 276, 1978, págs. 269-270). La célula huésped más preferible es la célula CHO deficiente en DGFR.

Puede transfectarse un plásmido en una célula huésped mediante cualquier técnica. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, transfección (incluyendo el método de fosfato de calcio, el método de DEAE, lipofección y electroporación), un método que comprende introducción de ADN con el uso de una envuelta tal como el virus Sendai, microinyección e infección usando un vector de virus tal como un vector de retrovirus o adenovirus (véase Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 9: Introduction of ADN into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.). La introducción de un plásmido en una célula huésped por medio de electroporación es lo más preferible.

Un ejemplo de otra técnica para preparar un anticuerpo quimérico o humanizado es un método en el que las interacciones entre CDR y residuos de entramado se modelan con el fin de identificar residuos de entramado importantes para la unión a antígeno, y se comparan secuencias para identificar residuos de entramado poco comunes ubicados en posiciones específicas (por ejemplo, Queen et al., patentes estadounidenses n.^{o s} 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.180.370). Los anticuerpos pueden humanizarse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos de tales técnicas incluyen injerto de CDR (patente europea n.° 239.400; publicación internacional PCT Wo 91/09967; y patentes estadounidense n.^{o s} 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), remodelación de superficie o rechapado (patentes europeas n.^{o s} 592.106 y 519.596; Padlan, Mol. Immunol., vol. 28, págs. 489 a 498, 1991; Studnicka et al., Prot. Eng., vol. 7, págs. 805 a 814, 1994; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 91, págs. 969 a 973, 1994) e intercambio de cadenas (patente estadounidense n.° 5.565.332). Se describe un método para preparar un anticuerpo quimérico en Molecular Biotechnology 26, 39, 2004 y Journal of Immunological Methods 125, 191, 1989.

Es preferible que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo quimérico o humanizado sea completamente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región VH o VL que se origina a partir de ADNc expresado por el hibridoma depositado. Un anticuerpo que tiene una secuencia que presenta el 90 % o más de identidad como resultado de ingeniería genética también es preferible. En el transcurso de la humanización o quimerización, el ajuste de la sustitución de residuos se ha realizado hasta ahora dirigido a la mejora de la unión a antígeno puesto que tal anticuerpo con una secuencia parcialmente modificada se considera que se deriva fundamentalmente del hibridoma original.

Se han conocido técnicas para preparar un anticuerpo humanizado o quimérico por medio de ingeniería genética. Específicamente, las secuencias de VH y VL del anticuerpo monoclonal original se modifican por ingeniería genética y luego se quimerizan o humanizan según una técnica convencional.

También se conoce un método para obtener un anticuerpo humano. Por ejemplo, se someten linfocitos humanos a sensibilización con antígenos de interés o con células que expresan antígenos de interés in vitro, los linfocitos sensibilizados se fusionan con células de mieloma humanas tales como células U266, y entonces puede obtenerse un anticuerpo humano de interés que tiene actividad de unión a un antígeno (véase la publicación de patente japonesa (Kokoku) n.° H01-59878 B (1989)). Alternativamente, un animal transgénico que tiene todo el repertorio de genes de anticuerpos humanos puede inmunizarse con un antígeno de interés para obtener un anticuerpo humano de interés (véanse los documentos WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). Además, se ha conocido una técnica para obtener un anticuerpo humano por medio de cribado usando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, se expresa una región variable de anticuerpo humano sobre la superficie de un fago mediante el método de presentación en fago como anticuerpo de cadena sencilla (scFv), y puede seleccionarse un fago que se une a antígeno. El gen del fago seleccionado puede analizarse para determinar la secuencia de ADN que codifica para una región variable del anticuerpo humano que se une al antígeno. Tras la dilucidación de la secuencia de ADN de scFv que se une a antígeno, puede prepararse un vector de expresión adecuado basándose en tal secuencia y entonces puede obtenerse un anticuerpo humano. Tales técnicas se han conocido bien en la técnica. Véanse los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388.

Tal anticuerpo puede ser monovalente, divalente o polivalente, siempre que reconozca un dominio de cadherina 1 (EC1) de cadherina y mantenga una alta capacidad de internalización. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo de bajo peso molecular tal como un fragmento de anticuerpo, o un anticuerpo modificado. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')² , scFv, dsFv y un péptido que comprende CDR. Alternativamente, se fusiona una región Fc con un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de bajo peso molecular, tal como Fab, Fab', F(ab')² , Fv, scFv (Fv de cadena sencilla) o diacuerpo, para proporcionarle actividad de ADCC. Con el fin de lograr tal anticuerpo, puede construirse un gen que codifica para tal anticuerpo, el resultante puede introducirse en un vector de expresión, y el resultante puede incorporarse en el vector de expresión y puede expresarse en una célula huésped adecuada.

Entre los fragmentos obtenidos procesando IgG con una proteasa, papaína (cortada en el aminoácido 224 de la cadena H), Fab es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y que tiene actividad de unión a antígeno, que se compone de aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H unida a la cadena L completa a través de un enlace disulfuro.

Puede obtenerse Fab de la presente invención procesando un anticuerpo que reacciona específicamente con cadherina, con una proteasa, papaína. Alternativamente, puede insertarse ADN que codifica para Fab del anticuerpo en un vector de expresión procariota o eucariota, y el vector puede introducirse y expresarse en un procariota o eucariota. Por tanto, puede prepararse Fab.

Entre los fragmentos obtenidos procesando IgG con una proteasa, pepsina (cortada en el aminoácido 234 de la cadena H), F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100000 y que tiene actividad de unión a antígeno, que es algo más grande que el producto obtenido uniendo dos Fab por medio de un enlace disulfuro de la región de bisagra.

Puede obtenerse F(ab')2 de la presente invención procesando un anticuerpo que reacciona específicamente con cadherina, con una proteasa, pepsina. Alternativamente, puede prepararse uniendo dos Fab' descritos a continuación por medio de tioéter o disulfuro.

Fab' es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y que tiene actividad de unión a antígeno que resulta de la escisión de un enlace disulfuro de F(ab')2 de la región de bisagra mencionada anteriormente.

Puede obtenerse Fab' de la presente invención procesando F(ab')2 que reacciona específicamente con cadherina, con un agente reductor, ditiotreitol. Alternativamente, puede insertarse ADN que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresión procariota o eucariota, y el vector puede introducirse en un procariota o eucariota para expresar Fab' en el mismo. Por tanto, puede prepararse Fab'.

“scFv” indica un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH compuesto por una única VH unida a una única VL por medio de un ligador peptídico adecuado (en el presente documento denominado “P”). VH y VL incluidas en el scFv de la presente invención pueden derivarse del anticuerpo de la presente invención que reacciona específicamente con cadherina, tal como un anticuerpo humanizado o anticuerpo humano.

El scFv de la presente invención puede preparares obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con cadherina, construyendo ADN que codifica scFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o eucariota e introduciendo el vector es un procariota o eucariota para expresar scFv en el mismo.

“dsFv” se obtiene uniendo los polipéptidos cuando un único residuo de aminoácido en VH y VL se sustituye por un residuo de cisteína entre sí por medio de un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína. Los residuos de aminoácido que van a sustituirse por residuos de cisteína pueden seleccionarse según el método de Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697, 1994) basándose en la predicción de la conformación del anticuerpo. VH y VL incluidos en el dsFv de la presente invención pueden derivarse del anticuerpo de la presente invención que reacciona específicamente con cadherina tal como un anticuerpo humanizado o humano.

El fragmento dsFv de la presente invención puede prepararse obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con cadherina, construyendo ADN que codifica dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o eucariota e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar dsFv en el mismo.

Un péptido que comprende CDR se compone de al menos uno de la CDR de cadena H o L. Puede unirse una pluralidad de CDR directamente entre sí o por medio de un ligador peptídico adecuado.

El péptido que comprende CDR de la presente invención puede prepararse obteniendo ADNc que codifica VH y VL del anticuerpo que reacciona específicamente con cadherina, construyendo ADN que codifica CDR, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o eucariota e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar tal péptido en el mismo.

El péptido que comprende CDR también puede producirse por medio de síntesis química, tal como el método de Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) o el método de tBoc (t-butiloxicarbonilo).

Como anticuerpo modificado, puede usarse también un anticuerpo conjugado con una molécula variada, tal como polietilenglicol (PEG). Un anticuerpo conjugado con fármaco es particularmente útil. Tal anticuerpo modificado puede obtenerse sometiendo un anticuerpo a modificación química. Se conoce en la técnica un método de modificación de anticuerpos.

El anticuerpo de la presente invención ejerce una alta capacidad de internalización. Por tanto, puede conjugarse una toxina con el mismo, y el resultante puede usarse en forma de un agente citotóxico. El agente citotóxico de la presente invención puede ponerse en contacto con, por ejemplo, células cancerosas que expresan cadherina, de modo que el agente puede dañar las células cancerosas.

Según una realización preferible de la presente invención, el anticuerpo es un denominado ADC que comprende un anticuerpo y una sustancia citotóxica tal como un fármaco conjugado con el mismo.

Los ejemplos de fármacos que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, duocarmicina, un análogo de duocarmicina, un derivado de duocarmicina, CC-1065, un análogo de duocarmicina compuesto principalmente por CBI, un análogo de duocarmicina compuesto principalmente por MCBI, un análogo de duocarmicina compuesto principalmente por CCBI, doxorubicina, un conjugado de doxorubicina, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatina, dolestatina-10 , combretastatina, caliqueamicina, maitansina, un análogo de maitansina, DM1, DM2, DM3, DM4, DMI, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF), éster AE del ácido 5-benzoilvalérico (AEVB), tubulisina, disorazol, epotilona, paclitaxel, docetaxel, SN-38, topotecán, rizoxina, equinomicina, colcicina, vinblastina, vindesina, estramustina, cemadotina, eleuterobina, metotrexato, metopterina, o 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, leurosideína, actinomicina, daunorubicina, un conjugado de daunorubicina, mitomicina C, mitomicina A, carminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina, un derivado de podofilotoxina, etopósido, fosfato de etopósido, vincristina, taxol, taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, N8-acetilespermidina y camptotecina.

El ADC usado en la presente invención puede prepararse uniendo el fármaco mencionado anteriormente a un anticuerpo según una técnica convencional. Un anticuerpo y un fármaco pueden unirse directamente entre sí por medio de sus propios grupos ligadores o indirectamente por medio de un ligador a otra sustancia.

Un fármaco puede unirse directamente a un anticuerpo por medio de un enlace disulfuro entre SH o por medio de grupos maleimida. Por ejemplo, el enlace disulfuro intramolecular en la región Fc de un anticuerpo y el enlace disulfuro de un fármaco pueden reducirse, y el fármaco puede unirse al anticuerpo por medio de un enlace disulfuro. Alternativamente, pueden unirse entre sí por medio de maleimidas. Además, puede introducirse cisteína en un anticuerpo por medio de ingeniería genética.

Puede unirse un anticuerpo a un fármaco indirectamente por medio de otra sustancia (ligador). Un ligador comprende preferiblemente uno o más grupos funcionales que reaccionan con cualquiera o ambos del anticuerpo y el fármaco. Los ejemplos de grupos funcionales incluyen grupos amino, carboxilo, mercapto, maleimida y piridinilo.

Los ejemplos de ligadores incluyen, pero no se limitan a, sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), N-succinimidil-4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), éster N-succinimidílico del ácido ^k -maleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico del ácido y-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido e-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(P-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), 6-maleimidocaproílo (MC), maleimidopropanoílo (MP), p-aminobenciloxicarbonilo (PAB), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) y N-succinimidil-(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB). También puede usarse un ligador peptídico tal como valinacitrulina (Val-Cit) o alanina-fenilalanina (ala-phe), y puede usarse cualquiera de los ligadores mencionados anteriormente en combinación adecuada.

Puede unirse un fármaco a un anticuerpo según el método descrito en, por ejemplo, Cancer Research, 68 (22) 9280, 2008, Nature Biotechnology, 26 (8) 925, 2008, Bio Conjugate Chemistry, 19, 1673, 2008, Cancer Research, 68 (15), 6300, 2008, o la publicación de patente japonesa (Kohyo) n.° 2008-516896 A.

Otra realización del conjugado de anticuerpo fármaco de la presente invención es una denominada “ inmunotoxina” compuesta por un anticuerpo y una toxina unida a la misma químicamente o por medio de ingeniería genética.

Los ejemplos de toxinas que pueden usarse en la presente invención incluyen cadena A de toxina diftérica, endotoxina de Pseudomonas, cadena de ricina, cadena de ricina A desglicosilada, gelonina y saporina.

Otra realización del anticuerpo de la presente invención es un denominado “anticuerpo marcado con RI” compuesto por el anticuerpo de la presente invención y una sustancia radiactiva marcada con el mismo.

Cuando se usa una sustancia radiactiva en forma de un agente terapéutico contra el cáncer, es preferible un metal radiactivo citotóxico. Cuando se usa en forma de un agente de diagnóstico del cáncer, es preferible un metal no radiactivo no citotóxico. También pueden usarse yodo 123 (123I) o yodo 131 (131I).

Los ejemplos de metales radiactivos citotóxicos incluyen itrio 90 (90Y), renio 186 (186Re), renio 188 (188Re), cobre 67 (67 ^{c u} ), hierro 59 (59Fe), estroncio 89 (89Sr), oro 198 (198Au), mercurio 203 (203Hg), plomo 212 (212Pb), disprosio 165 (165Dy), rutenio 103 (103Ru), bismuto 212 (212Bi), bismuto 213 (213Bi), holmio 166 (166Ho), samario 153 (153Sm) y lutecio 177 (177Lu).

Entre estos metales radiactivos, 90Y, 153Sm y 177Lu son particularmente preferibles desde el punto de vista de, por ejemplo, semivida, energía radiactiva, facilidad de marcaje, eficacia de marcaje o estabilidad de un complejo.

Los ejemplos de metales radiactivos no citotóxicos preferibles como agentes de diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, tecnecio 99m (99mTc), indio 111 (111In), indio 113m (113mIn), galio 67 (67Ga), galio 68 (68Ga), talio 201 (201Tl), cromo 51 (51Cr), cobalto 57 (57Co), cobalto 58 (58Co), cobalto 60 (60Co), estroncio 85 (85Sr), mercurio 197 (197Hg) y cobre 64 (64Cu).

Con el fin de unir tal elemento de metal radiactivo al anticuerpo de la presente invención, es preferible que se permita que un reactivo quelante de metal reaccione con el anticuerpo y que se permita que el elemento de metal radiactivo reaccione con el mismo para formar un complejo. En el anticuerpo modificado así obtenido, se une un elemento de metal radiactivo al anticuerpo de la presente invención por medio de un reactivo quelante de metal.

Los ejemplos de reactivos quelantes de metales usados para la formación de un complejo de este tipo incluyen: (1) derivados de quinolina, tales como 8-hidroxiquinolina, 8-acetoxiquinolina, 8-hidroxiquinaldina, sulfato de oxiquinolina, O-acetiloxina, O-benzoiloxina, O-p-nitrobenzoiloxina, y compuestos de quinolona que tienen un esqueleto de quinolina (por ejemplo, norfloxacino, ofloxacino, enoxacino, ciprofloxacino, lomefloxacino, tosfloxacino, fleroxacino y esparfloxacino); (2) compuestos, tales como ácido cloranílico, aluminón, tiourea, piogalol, cupferrón, bismutiol (II), ácido galoilgálico, tiolida, 2-mercaptobenzotiazol y cloruro de tetrafenilarsonio; (3) ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminepentaacético (DTPA), y compuestos que tienen un esqueleto similar (dihidroxietilglicina, ácido diaminopropanoltetraacético, ácido etilendiaminadiacético, clorhidrato de ácido etilendiaminadipropiónico, ácido hidroxietiletilendiaminatriacético, etilendiaminatetrakis(ácido metilensulfónico), ácido glicol éter diaminatetraacético, ácido hexametilendiaminatetraacético, ácido hidroxietiliminodiacético, ácido iminodiacético, ácido diaminopropanotetraacético, ácido nitrilotriacético, ácido nitrilotripropiónico, sal de trisodio de nitrilotris(ácido metilensulfónico), ácido trietilentetraminahexaacético, metil-DTPA, ciclohexil-DTPA, aminobencil-EDTA, isotiocianobencil-EDTA, isotiocianobencil-DTPA, metilisotiocianobencil-DTPA, ciclohexilisotiocianobencil-DTPA, maleimidopropilamidobencil-EDTA, maleimidopentilamidobencil-EDTA, maleimidodecilamidobencil-EDTA, maleimidopentilamidobencil-DTPA, maleimidodecilamidobencil-EDTA y maleimidodecilamidobencil-DTPA); y (4) 1 ácido,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Cyclen), 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (Cyclam), isotiocianobencil-DOTA e isotiocianobencil-NOTA.

Entre estos reactivos quelantes de metales, son preferibles isotiocianobencil-DOTA, metilisotiocianobencil-DTPA y ciclohexilisotiocianobencil-DTPA desde el punto de vista de, por ejemplo, la facilidad de introducción de un quelato de metal en un anticuerpo, la eficacia de marcaje o la estabilidad de un complejo.

Un experto en la técnica sería capaz de unir un elemento de metal radiactivo al anticuerpo de la presente invención según una técnica convencional. Por ejemplo, se permite que un reactivo quelante de metal reaccione con el anticuerpo de la presente invención para preparar de ese modo un precursor de marcador de antemano, y entones se permite que el precursor reaccione con un elemento de metal radiactivo.

El agente citotóxico de la presente invención puede contener adecuadamente un portador, un excipiente, un diluyente farmacéuticamente aceptable, o similar, según la necesidad, además del anticuerpo de la presente invención (al que puede unirse una sustancia citotóxica, incluyendo un fármaco, una toxina o una sustancia radioactiva, según la necesidad). El agente citotóxico de la presente invención puede prepararse en forma de una preparación de inyección, por ejemplo. La dosis del agente citotóxico de la presente invención varía dependiendo de los síntomas, la gravedad, la edad y el peso corporal de un paciente, la vía de administración u otros factores. El peso del anticuerpo como principio activo es generalmente de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 mg/kg (peso corporal).

La composición farmacéutica de la presente invención es particularmente útil como agente terapéutico para enfermedades con alta expresión de cadherina (preferiblemente CDH3). Las enfermedades con alta expresión de cadherina (preferiblemente CDH3) no están particularmente limitadas, siendo preferibles cáncer. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de células de transición, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer del tracto biliar, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de cabeza y cuello, cáncer esofágico, cáncer de células escamosas cutáneas, melanoma, cáncer gástrico, cáncer de próstata, osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos.

A continuación en el presente documento, la presente invención se describe en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos, aunque la presente invención no se limita a los mismos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión de ARNm de CDH3 humano en tejido normal y tejido canceroso

Se prepararon muestras de ARN total según una técnica convencional con el uso de Isogen (Nippon Gene) a partir de las muestras recogidas de tejidos humanos normales y diversos tipos de tejidos cancerosos por medio de microdisección por captura con láser. Se sometieron las muestras de ARN (10 ng cada una) a análisis de la expresión génica usando el instrumento GeneChipU-133B (Affymetrix, Inc.) según el Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix, Inc.). Se designó que el nivel de expresión promedio de todos los genes era 100, y se examinaron los genes que presentaban los niveles de expresión potenciados en células cancerosas. Como resultado, se encontró que la expresión de CDH3 humano estaba limitada en tejidos humanos normales, pero los niveles de expresión del mismo estaban potenciados en células de cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer pancreático (figura 3^a y 3B). Además, se examinó la expresión de ARNm de CDH3 en tejido de cáncer pancreático con diferentes grados de diferenciación. Como resultado, se encontró que los niveles de expresión del mismo eran altos en algunos tejidos, independientemente de los grados de diferenciación (figura 3C).

Ejemplo 2: Expresión de proteína CDH3 humana en tejido canceroso analizada por medio de tinción inmunohistoquímica

Con el fin de inspeccionar la expresión de proteína CDH3 en muestras clínicas de cáncer, se llevó a cabo inmunotinción con el uso de alineamientos que contenían muestras de tejido canceroso.

Se usaron los alineamientos que contenían muestras de tejido de cáncer pancreático (cáncer glandular), cáncer de pulmón (cáncer glandular), cáncer de pulmón (cáncer de células escamosas) y cáncer de colon (cáncer glandular) obtenidos de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd.).

Se sometieron los portaobjetos de alineamientos de tejido a desparafinización y luego activación con Tris 10 mM y EDTA 1 mM (pH 9,0) a 95 °C durante 40 minutos. Tras inactivarse las peroxidasas endógenas con el uso de un reactivo de bloqueo incluido en el kit Envision+ (Dako), se permitió que las muestras reaccionaran con anticuerpo anti-CDH3 610227 5 |ig/ml (BD Biosciences) o con anticuerpo anti-HBs Hyb-3423 5 |ig/ml (un control negativo) a 4 °C durante la noche. Tras eliminarse por lavado la disolución de anticuerpo, se permitió que las muestras reaccionaran con un reactivo de anticuerpo secundario frente a polímero incluido en el kit Envision+ a temperatura ambiente durante 30 minutos. Entonces se sometieron las muestras a desarrollo del color usando un reactivo colorante incluido en el kit Envision+, y se realizó tinción nuclear con el uso de disolución de hematoxilna/eosina.

La figura 4 muestra los resultados. Mientras que las células cancerosas se tiñeron con el anticuerpo anti-CDH3 humano, las células normales no se tiñeron con el mismo.

Ejemplo 3: Establecimiento de una línea celular CHO que expresa CDH3 humano

Con el fin de obtener una línea celular para el examen de anticuerpos anti-CDH3, se estableció una línea celular CHO que expresa CDH3 de longitud completa.

(1) Producción de vector de expresión del gen de CDH3

Con el fin de insertar ADN de CDH3 de longitud completa tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 en un vector de expresión de mamífero pEF4/myc-HisB (Invitrogen), se trató el ADN de CDH3 humano de longitud completa con dos enzimas de restricción KpnI (Takara Bio Inc.) y XbaI (Takara Bio Inc.) a 37 °C durante 1 hora. Después de eso, se insertó el fragmento así obtenido en pEF4/myc-HisB, que se había tratado con las mismas enzimas de restricción KpnI y Xbal, con el uso de ADN ligasa de T4 (Promega) según una técnica convencional. Por tanto, se obtuvo un vector de expresión (pEF4-CDH3-myc-His).

(2) Adquisición de una línea celular que expresa CDH3 estable

Según el protocolo de un reactivo de transfección FuGENE® 6 (Roche Diagnostics K.K.), se inocularon 8 * 105 células CHO en una placa de 10 cm de diámetro el día antes de la transfección, y se cultivaron las células durante la noche. Después de eso, se mezclaron 8 |ig de un vector de expresión (pEF4-CDH3-myc-His) y 16 |il de un reactivo FuGENE 6 con 400 |il de medio RPMI 1640 libre de suero (Sigma-Aldrich), y se permitió que la mezcla reposara a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió el resultante a la disolución de cultivo celular para la transfección. Dos días tras la transfección, se realizó la clonación a través de dilución limitante con el uso de un reactivo de selección (Zeocin®).

Se seleccionaron clones de células CHO que expresan CDH3 de longitud completa a través de inmunotransferencia de tipo Western con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-c-Myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Como resultado, se obtuvo una línea celular CHO (EXZ1501) forzada a expresar CDH3, que presenta un alto nivel de expresión y una alta capacidad de crecimiento. La línea celular obtenida, su cepa parental (es decir, CHO) y un anticuerpo anti-CDH3 comercialmente disponible (R&D Systems, Inc.) se sometieron a la reacción y se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la figura 5.

Ejemplo 4: Producción de antígeno de dominio extracelular de CDH3 humano

Se produjo la proteína de dominio extracelular de CDH3 humano (sCDH3) que crece de la región transmembrana C-terminal y una región posterior a la misma para que sirviera como inmunógeno para la producción de un anticuerpo anti-CDH3 humano.

(1) Producción de vector de expresión de antígeno de sCDH3

Se realizó PCR con el uso de un ADNc de longitud completa de CDH3 humano como molde y un cebador directo (SEQ ID NO: 7: CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT) y un cebador inverso (SEQ ID NO: 8: CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC), que se habían diseñado para amplificar un fragmento correspondiente al dominio extracelular de CDH3 humano (1-654 en SEQ ID NO: 2, a continuación en el presente documento denominado ADNc de sCDH3). Se llevó a cabo la reacción con el uso de KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) repitiendo un ciclo de 94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 90 segundos 30 veces.

Después de eso, se escindió un fragmento de gel que contenía una banda de un tamaño objetivo (aproximadamente 2,0 kpb) por medio de electroforesis en gel de agarosa, y se obtuvo el ADNc de sCDH3 objetivo usando un kit de extracción de gel QIA® quick (QIAGEN K.K.).

Con el fin de insertar ADNc de sCDH3 es un vector de expresión pEF4/myc-HisB, se trató ADNc de sCDH3 con dos enzimas de restricción KpnI y XbaI. Entonces se insertó el fragmento así obtenido en pEF4/myc-HisB, que se había tratado con las mismas enzimas de restricción KpnI y XbaI, con el uso de ADN ligasa de T4 según una técnica convencional, y se obtuvo un vector de expresión pEF4-sCDH3-myc-His.

(2) Expresión de proteína CDH3 soluble

Según el protocolo de un reactivo de transfección FuGENE 6, se inocularon 8 * 105 células CHO en una placa de 10 cm el día antes de la transfección, y se cultivaron las células durante la noche. Después de eso, se mezclaron 8 |ig de un vector de expresión pEF4-sCDH3-myc-His y 16 |il de un reactivo FuGENE 6 con 400 |il de medio RPMI 1640 libre de suero, y se permitió que la mezcla reposara a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió la mezcla resultante a la disolución de cultivo celular para la transfección. Dos días tras la transfección, se llevó a cabo la clonación a través de dilución limitante con el uso de un reactivo de selección (Zeocin®).

Se seleccionaron células CHO que expresan CDH3 soluble por medio de inmunotransferencia de tipo Western con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-c-Myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Se seleccionaron líneas celulares que presentan altos niveles de secreción en el sobrenadante de cultivo y alta proliferación para obtener líneas celulares CHO que expresan CDH3 soluble (EXZ1702). Se cultivaron las líneas celulares EXZ1702 seleccionadas durante 72 horas en tres botellas giratorias (cada área de cultivo: 1500 cm2) con medio libre de suero CHO-S-SFM-II (333 ml/botella) (Invitrogen), y se recuperaron los sobrenadantes de cultivo. Se sometieron los sobrenadantes de cultivo así obtenidos a cromatografía de afinidad por medio de la columna HisTrap® HP (GE Healthcare Biosciences Inc.) y cromatografía de filtración en gel por medio de una columna Superdex® 200 pg (GE Healthcare Biosciences Inc.). Por tanto, se obtuvo proteína de dominio extracelular de CDH3 soluble.

Ejemplo 5: Producción de anticuerpo monoclonal anti-CDH3 humano

(1) Producción de anticuerpo monoclonal usando proteína CDH3 soluble como inmunógeno

Se mezcló una disolución de 50 |ig de proteínas CDH3 solubles en solución salina fisiológica con una cantidad igual de Titer-MAX Oro® (TiterMax, Inc.), y se inyectó la mezcla por vía intraperitoneal e hipodérmica en ratones MRL/lpr (Japan SLC Inc.) para la inmunización inicial. Se realizaron procedimientos de inmunización posteriores inyectando una mezcla preparada de manera similar de proteína CDH3 soluble (25 |ig) y Titer-MAX Oro® por vía intraperitoneal e hipodérmica en los ratones. Tres días tras la inmunización final, se prepararon células de bazo a partir de los ratones en condiciones asépticas, y se fusionaron las células con células de mieloma de ratón SP2/O-Ag14 o P3-X63-Ag8.653 según una técnica convencional mediante el método de polietilenglicol).

(2) Selección de hibridoma que produce anticuerpos anti-CDH3 humano

Se realizó la selección de anticuerpos anti-CDH3 humano por medio de análisis de citometría de flujo con el uso de EXZ1501.

Específicamente, se retiró EXZ1501 de una placa de cultivo por medio de tratamiento de la misma con EDTA-PBS 2 mM y luego se suspendió en una disolución de FACS hasta una densidad celular de 1 * 106 células/ml. Se inoculó la suspensión celular en una placa de 96 pocillos hasta una densidad de 50 |il/pocillo, se añadió al mismo un sobrenadante de cultivo de hibridoma y se permitió que la reacción avanzara a 4 °C durante 60 minutos. Tras lavarse la placa dos veces con la disolución de FACS (200 |il/pocillo), se añadió a la misma F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón marcado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen), y se permitió que la reacción avanzara a 4 °C durante 30 minutos. Después de eso, se lavó la placa dos veces con la disolución de FACS, se realizó análisis de citometría de flujo y se seleccionaron los hibridomas que se observó que reaccionaban con EXZ1501.

La figura 6 muestra los resultados de reacciones típicas entre los anticuerpos obtenidos a partir de tales hibridomas y EXZ1501, su cepa celular parental (la célula CHO) o la línea celular de adenocarcinoma bronquiolo-alveolar humano (NCI-H358) en la que se observó un alto nivel de expresión de CDH3. Se encontró que todos los hibridomas seleccionados reaccionaban con EXZ1501 y NCI-H358; sin embargo, estas células no reaccionaban con la célula CHO.

Ejemplo 6: Evaluación de la capacidad de internalización del anticuerpo de ratón anti-CDH3 humano usando anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con saporina (MabZAP)

Se sometió a ensayo la capacidad de intemalización con el uso del anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con una toxina (saporina) que inhibe la síntesis de proteínas. La destrucción de células por la saporina implica siempre intemalización celular. Por tanto, el grado en el que las células humanas que expresan CDH3 se destruyen por el anticuerpo anti-CDH3 humano puede someterse a ensayo usando MabZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.) como anticuerpo secundario, y puede evaluarse la capacidad de internalización del anticuerpo anti-CDH3 humano.

Como células humanas que expresan CDH3, se usaron las células de cáncer de mama humano HCC1954 (5000 células/pocillo), se añadieron a las mismas 100 ng de los anticuerpos de ratón anti-CDH3 humano y 100 ng de MabZAP, y se calentó el resultante en un incubador a 37 °C en presencia del 5 % de CO2 durante 3 días. Después de eso, se evaluó la actividad de un anticuerpo para la destrucción celular usando un reactivo de recuento de células viables (Cell Counting Kit-8, DOJINDO ^lA^b O^rATORIES, Inc.). Se expresó la actividad de destrucción celular en relación con una viabilidad celular del 100 % lograda sin la adición de anticuerpo. La tabla 1, figura 7A y figura 7B muestran los resultados de ensayos llevados a cabo múltiples veces usando diferentes anticuerpos.

[Tabla 1]

N.° de anticuerpo Subtipo Viabilidad celular (%, Viabilidad celular

prueba A) (%, prueba B)

PPAT-055-01 IgG1 92 85

PPAT-055-02 IgG2a 31 42

PPAT-055-03 IgG1 34 50

PPAT-055-05 IgG1 69

PPAT-055-07 IgG2a 45

PPAT-055-08 IgG2a 43 40

PPAT-055-09 IgG1 26 57

PPAT-055-10 IgG1 61

PPAT-055-11 IgG1 59

PPAT-055-12 IgG2a 47 58

PPAT-055-13 IgG1 99 95

PPAT-055-14 IgG1 87

PPAT-055-15 IgG1 23

PPAT-055-16 IgG1 88 89

PPAT-055-17 IgG1 93 87

PPAT-055-18 IgG1 65

PPAT-055-19 IgG2b 85 79

PPAT-055-20 IgG2a 78

PPAT-055-21 IgG2a 57

PPAT-055-24 IgG2a 44

PPAT-055-25 IgG1 54

Negativo Ab1 IgG2a 97

Negativo Ab2 IgG1 90 98

Negativo Ab1 y negativo Ab2 indican anticuerpos que reconocen antígenos que no se expresan en líneas celulares humanas y no relacionados con CDH3.

El hibridoma PPAT-055-03 que produce el anticuerpo PPAT-055-03 se depositó en el National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba, 292-0818, Japón) con el número de registro: NITE P-988 el 15 de octubre de 2010 y se transfirió, con el número de registro: NITE BP-988, al depósito internacional según el Tratado de Budapest el 7 de septiembre de 2011.

Los hibridomas PPAT-055-09 y PPAT-055-24 que producen los anticuerpos PPAT-055-09 y PPAT-055-24 se depositaron en el National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba, 292-0818, Japón) con los números de registro: NITE BP-989 y NITE BP-991, respectivamente, el 15 de octubre de 2010 y se transfirieron, con los números de registro: NITE BP-989 y NITE BP-991, respectivamente, al depósito internacional según el Tratado de Budapest el 7 de septiembre de 2011.

El hibridoma PPAT-055-15 que produce el anticuerpo PPAT-055-15 se depositó internacionalmente en el National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba, 292-0818, Japón) con el número de registro: NITE BP-1145 según el Tratado de Budapest.

Ejemplo 7: Clasificación de anticuerpo monoclonal anti-CDH3 basándose en el epítopo

Se llevó a cabo la clasificación basada en epítopos del anticuerpo anti-CDH3 humano obtenido basándose en la reacción del mismo con un fragmento que expresa una secuencia parcial de CDH3 humano analizada mediante inmunotransferencia de tipo Western. Con el fin de que las secuencias se solapen suficientemente entre sí entre los fragmentos, se diseñaron los fragmentos 1 a 5 que expresan una secuencia parcial de CDH3 humano (figura 8). (1) Producción de vector de expresión para un fragmento que expresa una secuencia parcial de CDH3 humano Se realizó PCR con el uso del ADNc de CDH3 humano de longitud completa del ejemplo 3 como molde y los conjuntos de cebadores descritos a continuación. Se llevó a cabo la reacción con el uso de a Dn polimerasa iProof high-fidelity (Bio-Rad Laboratories, Inc.) repitiendo un ciclo de 98 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 30 segundos 35 veces. Se escindió un fragmento de gel que contenía una banda con un tamaño similar al tamaño objetivo por medio de electroforesis en gel de agarosa, y se obtuvo una secuencia parcial de ADNc de CDH3 humano de interés usando un kit de extracción de gel QIA® quick.

Con el fin de insertar la secuencia parcial de CDH3 humano es un vector de expresión de E. coli (pCold® TF, Takara Bio Inc.), se trató la secuencia parcial con dos enzimas de restricción KpllI y Xbal. Entonces se insertó el fragmento así obtenido en pCold TF, que se había tratado con las mismas enzimas de restricción KpnI y XbaI, con el uso de ADN ligasa de T4 según una técnica convencional, y se obtuvieron vectores de expresión para los fragmentos. Se llevó a cabo PCR usando los conjuntos de cebadores descritos a continuación de modo que se obtuvo cada fragmento. Fragmento 1 (posiciones 108 a 236 de SEQ ID NO: 2)

Cebador directo: TATGGAGCTCGGTACCGATTGGGTGGTTGCTCCAATATCTG (SEQ ID NO: 9)

Cebador inverso: AGATTACCTATCTAGACTACTGCATCACAGAAGTACCTGGTAGG (SEQ ID NO: 10) Fragmento 2 (posiciones 132 a 348 de SEQ ID NO: 2)

Cebador directo: TATGGAGCTCGGTACCAAGTCTAATAAAGATAGAGACACCAAG (SEQ ID NO: 11) Cebador inverso: AGATTACCTATCTAGACTACCTCTGCACCTCATGGCCCACTGCATTCTCA (SEQ ID NO: 12) Fragmento 3 (posiciones 237 a 461 de SEQ ID NO: 2)

Cebador directo: TATGGAGCTCGGTACCGTGACAGCCACGGATGAGGATGATG (SEQ ID NO: 13)

Cebador inverso: AGATTACCTATCTAGACTAGACACACACAGGCTCCCCAGTG (SEQ ID NO: 14) Fragmento 4 (posiciones 349 a 550 de SEQ ID NO: 2)

Cebador directo: TATGGAGCTCGGTACCCTGACGGTCACTGATCTGGACG (SEQ ID NO: 15)

Cebador inverso: AGATTACCTATCTAGACTAGGGCTCAGGGACTGGGCCATGGTCATTG (SEQ ID NO: 16) Fragmento 5 (posiciones 462 a 654 de SEQ ID NO: 2)

Cebador directo: TATGGAGCTCGGTACCTACACTGCAGAAGACCCTGACAAGG (SEQ ID NO: 17)

Cebador inverso: AGATTACCTATCTAGACTAACCTCCCTTCCAGGGTCCAGGGCAGGTTTCG (SEQ ID NO: 18) (2) Expresión de la secuencia parcial de CDH3 humano

Con el uso del vector de expresión para el fragmento CDH3 de (1), se transformaron células de E. coli Rossetta® 2 (Merck) según una técnica convencional, y se cultivaron las células transformadas en un medio LB. Cuando la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,4, se enfrió con hielo el producto de cultivo durante 30 minutos, se ajustó la concentración de isopropil-p-tiogalactopiranósido (IPTG) a 0,5 mM y se realizó el cultivo a 20 °C durante 18 horas, seguido por la recuperación del producto de cultivo.

Se inspeccionó la expresión de la secuencia parcial de CDH3 humano mediante electroforesis de la disolución de cultivo de E. coli, seguido por análisis de inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen) para detectar la presencia de una banda en una posición deducida.

Específicamente, se añadió un tampón de electroforesis en una cantidad igual a un décimo de la cantidad de la disolución de cultivo de E. coli, se cargó la mezcla y se sometió a electroforesis sobre gel en gradiente del 5 % al 20 % (Bio-Rad Laboratories, Inc.) en condiciones reductoras, y se transfirió el resultante a Immobilon® P (Millipore Corporation). Se lavó la membrana de transferencia suavemente con TBS-T (Tween® 20 al 0,05 %, TBS) y luego se sometió a agitación en TBS que contenía BSA al 40 % durante 1 hora. Después de eso, se añadieron a lo mismo anticuerpos anti-CDH3 diluidos con TBS-T que contenía Block Ace® al 10 % (Snow Brand Milk Products, Co. Ltd.), y se sometió la membrana a agitación durante 1 hora. Se lavó la membrana con TBS-T, se sometió a agitación con el anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP (GE Healthcare Biosciences Inc.) diluido con TBS-T que contenía Block Ace al 10 % durante 1 hora, y luego se lavó con TBS-T. Se detectó el desarrollo de color usando ECL®-Plus (GE Healthcare Biosciences Inc.) y una película de rayos X (RX-u, Fuji Film Corporation) según las instrucciones facilitadas por los fabricantes. La figura 9 muestra los resultados de detección.

(3) Clasificación de anticuerpo basándose en el epítopo usando el producto de expresión de la secuencia de CDH3 parcial

Se cargaron lisados de E. coli en los que se habían expresado las secuencias de CDH3 parciales mencionadas anteriormente y se sometieron a electroforesis sobre gel en gradiente del 5 % al 20 % (Bio-Rad Laboratories, Inc.) en condiciones reductoras, y se transfirieron los resultantes a Immobilon P (Millipore Corporation) usando un aparato de inmunotransferencia (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Se lavó la membrana de transferencia suavemente con TBS-T (Tween® 20 al 0,05 %, TBS) y luego se sometió a agitación en TBS que contenía BSA al 40 % durante 1 hora. Después de eso, se cortó la membrana en tiras de igual anchura, se añadieron a lo mismo anticuerpos anti-CDH3 diluidos con TBS-T que contenía Block Ace al 10 % y se sometió la membrana a agitación durante 1 hora. Se lavó la membrana con TBS-T, se sometió a agitación con el anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP (GE Healthcare Biosciences Inc.) diluido con TBS-T que contenía Block Ace al 10 % durante 1 hora, y luego se lavó con TBS-T. Se detectó el desarrollo de color usando ECL®-Plus (GE Healthcare Biosciences Inc.) y una película de rayos X (RX-u, Fuji Film Corporation) según las instrucciones facilitadas por los fabricantes. La figura 10 muestra los resultados de detección. Basándose en la reactividad con el producto de expresión de secuencias parciales de CDH3, se determinaron los dominios reconocidos por los anticuerpos.

(4) Determinación del epítopo del anticuerpo monoclonal anti-CDH3 usando un alineamiento de péptidos

Cuando se determina un epítopo usando el producto de expresión de las secuencias de CDH3 parciales descritas en (3) anteriormente, se aplicó el anticuerpo PPAT-055-13 que se consideró que correspondía al límite de epítopo a un alineamiento de péptidos (Replitope; fabricado por JPT Peptide Technologies) y se sometió a determinación de epítopos en mayor detalle. Específicamente, con respecto a una región correspondiente a la región extracelular de CDH3 (que corresponde a las posiciones 108-563 de SEQ ID NO: 2), se diseñó un péptido de 13 residuos y se sintetizó, mientras que cada residuo inicial estada desplazado por cada dos residuos de aminoácido desde el extremo N-terminal (es decir, las posiciones 108-120, 110-122, ... y 551-563). Los péptidos así sintetizados se inmovilizaron sobre un portaobjetos de vidrio, y luego se bloquearon mediante SuperBlock (Thermo Fisher Scientific Inc.). Se hizo reaccionar el producto así preparado con un anticuerpo que es una diana de búsqueda de epítopos como anticuerpo primario. Se lavó el producto de reacción tres veces con TBS-T, y entonces se llevó a cabo la detección usando un anticuerpo de anti-ratón (Thermo Fisher Scientific Inc.) que se había marcado fluorescentemente con Dylight 649. Se usó un anticuerpo que no se había permitido que reaccionara con el anticuerpo que es una diana de búsqueda de epítopos como control negativo en los ensayos. Los resultados de los ensayos se muestran en la figura 11. Se observaron señales fuertes en regiones correspondientes a las posiciones 446-472 y 490-504 de la secuencia de aminoácidos de CDH3 mostrada en SEQ ID NO: 2, y se supuso que estos eran epítopos del presente anticuerpo.

La correlación referente a las regiones en la secuencia de CDH3 reconocidas por los anticuerpos deducidas basándose en el experimento anterior se muestra en la tabla 2 junto con los resultados de la prueba de internalización mostrada en la tabla 1.

[Tabla 2]

N.° de anticuerpo Subtipo Viabilidad celular Viabilidad celular Dominio de

(%, prueba A) (%, prueba B) reconocimiento PPAT-055-01 IgG1 92 85 EC3

PPAT-055-02 IgG2a 31 42 EC1

PPAT-055-03 IgG1 34 50 EC1

PPAT-055-05 IgG1 69 EC1

PPAT-055-07 IgG2a 45 EC1

PPAT-055-08 IgG2a 43 40 EC1

PPAT-055-09 IgG1 26 57 EC1

PPAT-055-10 IgG1 61 EC1

PPAT-055-11 IgG1 59 EC1

PPAT-055-12 IgG2a 47 58 EC1

PPAT-055-13 IgG1 99 95 EC3

PPAT-055-14 IgG1 87 EC4

PPAT-055-15 IgG1 23 EC1

PPAT-055-16 IgG1 88 89 EC5

PPAT-055-17 IgG1 93 87 EC5

PPAT-055-18 IgG1 65 EC4

PPAT-055-19 IgG2b 85 79 EC4

PPAT-055-20 IgG2a 78 EC2 PPAT-055-21 IgG2a 57 EC1

PPAT-055-24 IgG2a 44 EC1

PPAT-055-25_________ |gG1_______________________________ 54_______________ EC1________ * Se dedujo que PPAT-055-13 reconocía el límite entre EC3 y EC4.

La relación entre los dominios de reconocimiento en la tabla y la posición de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 2 son las siguientes.

EC1: posiciones 108 a 236

EC2: posiciones 237 a 348

EC3: posiciones 349 a 461

EC4: posiciones 462 a 550

EC5: posiciones 551 a 654

Basándose en los resultados de determinación de los dominios que van a reconocer los anticuerpos, se examinó la relación entre el dominio de reconocimiento y la capacidad de internalización. Como resultado, se encontró que los anticuerpos que tenían una alta capacidad de internalización se concentraban en el dominio EC1 de CDH3 humano. Ejemplo 8: Purificación de ARN a partir de hibridomas

Se aislaron ARN citoplasmáticos a partir del hibridoma PPAT-055-09 (número de registro NITE BP-989) y el hibridoma PPAT-055-24 (número de registro NITE BP-991) según el método descrito por Gough (Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, págs. 93-95, 1988), aunque se usó un tampón Tn E diferente (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NP-40 al 1 %, NaCl 150 mM, e Dt A 1 mM, pH 8,0) en lugar de un tampón de lisis descrito en el mismo. Específicamente, se suspendieron 5*10® células de hibridoma en 0,2 ml de tampón TNE para lisar la membrana citoplasmática, y entonces se eliminaron los núcleos celulares por medio de centrifugación. Se añadió un tampón de extracción (0,2 ml, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,35 M, SDS al 1 % (p/v), EDTA 10 mM, pH 8,0, urea 7 M) a aproximadamente 0,2 ml del sobrenadante citoplasmático resultante. Se sometió la mezcla a extracción con fenol y cloroformo, y se añadió un portador de glucógeno (n.° de cat. 901393, Roche Diagnostics K.K.) a la disolución de ARN resultante, seguido por precipitación con etanol. Posteriormente, se lisó el precipitado de ARN con la adición de 10 a 50 |il de agua destilada estéril a una concentración de ARN citoplasmática de 0,5 a 2 |ig/|il.

Ejemplo 9: Producción de una biblioteca de ADNc a partir de ARN preparado a partir de hibridoma

Con el fin de sintetizar un ADNc de cadena sencilla, se prepararon 20 |il de una mezcla de reacción que contenía de 0,5 a 3 |ig del ARN citoplasmático preparado anteriormente, Tris-HCl 50 mM (pH 8,3, temperatura ambiente), KCl 75 mM, MgCl23 mM, ^d T^t 10 mM, 100 ng de un cebador al azar, dNTP 0,5 mM y 200 unidades de Superscript II (transcriptasa inversa, Invitrogen), y se incubó la mezcla a 42 °C durante 50 minutos. Se empleó directamente la biblioteca de ADNc así sintetizada como molde de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Ejemplo 10: Amplificación del gen que codifica para la región variable de anticuerpo anti-CDH3 humano mediante PCR Todos los cebadores empleados en los experimentos los sintetizó Hokkaido System Science Co., Ltd.

A. Cebadores para su uso en amplificación por PCR del gen que codifica para región variable de cadena ligera de ratón

Se emplearon los siguientes dos conjuntos de cebadores: (1) un cebador de ADN que tiene, en el extremo 5', una homología con la parte FR1 y cebadores del conjunto 4 que tenían, en el extremo 3', una homología con una gen de cadena J en la cadena L de ratón, y (2) cebadores del conjunto 7 que tienen, en el extremo 5', una homología con la parte de señal de cadena L y un cebador antisentido que tiene, en el extremo 3', una homología con la parte KC (cebador antisentido KVL). Se realizó reacción en cadena de la polimerasa con el uso de los dos conjuntos de cebadores, mediante lo cual se aisló ADN de región variable de cadena L de inmunoglobulina de ratón a partir del ADNc. Las secuencias de cebadores eran tal como sigue.

(1) Cebadores sentido del conjunto 4 para la clonación de la región variable de cadena L de ratón

Según “Phage Display-A Laboratory Manual-, Barbas Burton Scott Silverman”, PROTOCOLO 9.5, Hokkaido System Science Co., Ltd. sintetizó 17 tipos de cebadores sentido y 3 tipos de cebadores inversos.

VK sentido (parte FR1)

Se empleó una mezcla de los siguientes 17 cebadores como cebador VK sentido (parte FR1). En secuencias de nucleótidos, W indica A o T, R indica A o G, M indica A o C, K indica T o G, Y indica T o C, S indica G o C, H indica A, C o T, B indica G, C o T, V indica A, G o C, D indica A, G o T, y N indica A, G, C o T.

SEQ ID NO: 19: 5'-GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3' (degeneración: 2)

SEQ ID NO: 20: 5'-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3' (degeneración: 4)

SEQ ID NO: 21: 5'-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3' (degeneración: 8)

SEQ ID NO: 22: 5'-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3' (degeneración: 8)

SEQ ID NO: 23: 5'-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3' (degeneración: 8)

SEQ ID NO: 24: 5'-GAYATTMAGATRAMCCAGTC-3' (degeneración: 16)

SEQ ID NO: 25: 5'-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3' (degeneración: 12)

SEQ ID NO: 26: 5'-GAYATYCAGATGACACAGAC-3' (degeneración: 4)

SEQ ID NO: 27: 5'-GAYATTGTTCTCAWCCAGTC-3' (degeneración: 4)

SEQ ID NO: 28: 5'-GAYATTGWGCTSACCCAATC-3' (degeneración: 8)

SEQ ID NO: 29: 5'-GAYATTSTRATGACCCARTC-3' (degeneración: 16)

SEQ ID NO: 30: 5'-GAYRTTKTGATGACCCARAC-3' (degeneración: 16)

SEQ ID NO: 31: 5'-GAYATTGTGATGACBCAGKC-3' (degeneración: 12)

SEQ ID NO: 32: 5'-GAYATTGTGATAACYCAGGA-3' (degeneración: 4)

SEQ ID NO: 33: 5'-GAYATTGTGATGACCCAGWT-3' (degeneración: 4)

SEQ ID NO: 34: 5'-GAYATTGTGATGACACAACC-3' (degeneración: 2)

SEQ ID NO: 35: 5'-GAYATTTTGCTGACTCAGTC-3' (degeneración: 2)

J antisentido (cebadores del conjunto 4)

Cebador J1/J2 antisentido (1)

SEQ ID NO: 36: 5'-GGSACCAARCTGGAAATMAAA-3' (degeneración: 8)

Cebador J4 antisentido (2)

SEQ ID NO: 37: 5'-GGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3'

Cebador J5 antisentido (3)

SEQ ID NO: 38: 5'-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3'

Mezcla de cebadores J1/J2, J4, J5 antisentido (4)

(2) Cebadores del conjunto 7 para la clonación de la región variable de cadena L de ratón

VK sentido (parte de péptido señal)

Se obtuvieron los cebadores mediante modificación de la secuencia de nucleótidos de un conjunto de cebadores de Ig de ratón (Novagen; Merck, n.° de cat. 69831-3) y se eliminaron por tanto de los mismos los sitios de enzimas de restricción.

Cebador sentido del conjunto A

SEQ ID NO: 39: 5'-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3'

Cebador sentido del conjunto B

SEQ ID NO: 40: 5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'

Cebador sentido del conjunto C

SEQ ID NO: 41: 5'-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3'

Cebador sentido del conjunto D (una mezcla de los siguientes 2 cebadores)

SEQ ID NO: 42: 5'-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3'

SEQ ID NO: 43: 5'-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3'

Cebador sentido del conjunto E (una mezcla de los siguientes 3 cebadores)

SEQ ID NO: 44: 5'-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3'

SEQ ID NO: 45: 5'-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3'

SEQ ID NO: 46: 5'-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3'

Cebador sentido del conjunto F (una mezcla de los siguientes 4 cebadores)

SEQ ID NO: 47: 5'-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3'

SEQ ID NO: 48: 5'-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3'

SEQ ID NO: 49: 5'-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3'

SEQ ID NO: 50: 5'-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3'

Cebador sentido del conjunto G (una mezcla de los siguientes 4 cebadores)

SEQ ID NO: 51: 5'-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3'

SEQ ID NO: 52: 5'-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3'

SEQ ID NO: 53: 5'-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3'

SEQ ID NO: 54: 5'-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3'

Cebador antisentido K VL

SEQ ID NO: 55: 5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'

B. Cebadores para su uso en la amplificación por PCR del gen que codifica para la región V de cadena H de ratón Se emplearon los siguientes dos conjuntos de cebadores: cebadores del conjunto 4 que tenían, en el extremo 5', una homología con la parte de señal de cadena H de ratón y un cebador que tenía, en el extremo 3', una homología con la parte de KC; y 1 conjunto de cebadores que tenían cada uno, en el extremo 5', una homología con la parte FR1 y un cebador de 2 tipos que tenía, en el extremo 3', una homología con la región constante de cadena H de ratón (IGHC). Se realizó reacción en cadena de la polimerasa con el uso de los dos conjuntos de cebadores, mediante lo cual se aisló ADN de la región variable de cadena H de inmunoglobulina de ratón a partir del ADNc. Las secuencias de cebador eran tal como sigue.

(3) Cebadores para clonar la región variable de cadena H de ratón

VH sentido (parte de señal: cebadores del conjunto 4)

Estos cebadores se sintetizaron según Current Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), unidad 2.12 Clonación, expresión y modificación de regiones de anticuerpo V (tabla 2.12.2).

SEQ ID NO: 56: 5'-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3' (degeneración: 32)

SEQ ID NO: 57: 5'-ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (degeneración: 8)

SEQ ID NO: 58: 5'-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3'

SEQ ID NO: 59: 5'-ATGGRCAGRCTTACWTYY-3' (degeneración: 32)

(4) Cebadores para la clonación de la región variable de cadena H de ratón

VH sentido (parte de FR1)

Se diseñaron estos cebadores mediante modificación de la secuencia de nucleótidos de cebadores sentido divulgados en un documento (Tan et al, “Superhumanized” Antibodies: Reduction of Immunoogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169, 2002, págs. 1119-1125).

SEQ ID NO: 60: 5'-SAGGTSMARCTKSAGSAGTCWGG-3' (degeneración: 256)

VH antisentido (cebador antisentido común a 3 y 4)

Se diseñó el cebador a través de degeneración de la secuencia de nucleótidos, de modo que el cebador se aparearía con todas las isoformas de IgG de ratón.

SEQ ID NO: 61: 5'-CASCCCCATCDGTCTATCC-3' (degeneración: 6)

Ejemplo 11: Producción de vector de expresión transitorio para inmunoglobulina anti-CDH3 humano quimera Producción de plásmido de expresión:

A través de PCR usando el instrumento DNA Engine (ciclador térmico Peltier, Bio-Rad Laboratories, Inc.), se amplificó cada región variable de la cadena L y la cadena H de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CDH3 con el uso de los cebadores descritos en el ejemplo 10. Se incorporó cada uno de los fragmentos de ADN así amplificados en un vector de subclonación pGEM (Promega). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN con el uso de cebadores universales T7 y SP6 del vector.

Se realizaron búsquedas de las secuencias de nucleótidos de regiones variables de cadena L y cadena H del anticuerpo anti-CDH3 humano quimera así obtenido en la página IMGT/V-QUEST Search (http://www.imgt. org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg), mediante lo cual se confirmó la finalización de la clonación de los genes de anticuerpo.

Posteriormente, se diseñó un gen que codificaba para la región C ^k humana para que se uniera a un vector de expresión de cadena L quimérico, y se diseñó un gen que codificaba para la región Cgl humana para que se uniera a un vector de expresión de cadena H quimérica para construir genes que codifican para las regiones V de la cadena L y la cadena H del anticuerpo anti-CDH3 clonado. Los genes de anticuerpo quimérico de cadena L y cadena H así diseñados los sintetizó en longitud completa GenScript Inc. En ese momento, se optimizó la frecuencia de uso de codones para que lograr una expresión génica eficaz en células productoras CHO (según un método divulgado en Kim et al., Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells, Gene, 199, 1997, págs. 293-301). En el caso de la cadena L, específicamente, una secuencia de ADN esencial para la traducción eficaz (Kozak, M., J., At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells, J. Mol. Biol. 196, págs. 947-950, 1987), un péptido señal de IGKV de ratón (una región variable de cadena ^k ), la región V de la cadena L del anticuerpo anti-CDH3 y la región KC humana (es decir, una región constante de cadena ^k ) se yuxtapusieron en este orden, y se añadieron sitios de enzimas de restricción en ambos extremos (NheI en el lado 5' y EcoRI en el lado 3'). Se preparó la cadena H quimera de la misma manera. Se escindió cada uno de los genes sintetizados artificialmente con NheI y EcoRI, y se incorporó el fragmento escindido en un vector de expresión pCAGGS entre el sitio NheI y el sitio EcoRI, para producir de ese modo un vector de expresión de cadena L de anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano pCAGGSIGK y un vector de expresión de cadena H pCAGGS-IGH.

Ejemplo 12: Producción de vector de expresión estable para anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano

Con el fin de realizar la expresión a alto nivel de un gen de anticuerpo modificado por ingeniería genética en células CHO, se produjo un vector de expresión en el que se insertó un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) unido a una secuencia de promotor de CMV y que tenía una señal de poli A.

Con el fin de producir una línea celular que produce/expresa de manera estable anticuerpos quiméricos, se produjo un vector de expresión pCAGGS en el que se insertó un gen de dhfr. Específicamente, se insertó un gen de dhfr que tenía un promotor de CMV y una señal de poli A en pCAGGS-IGH y pCAGGS-IGK, que son vectores de expresión transitorios. Se amplificaron un promotor de CMV, un gen de dhfr de ratón que tenía la secuencia Kozak y señal de poli A de SV40 por medio de PCR. Se unieron entre sí estos genes en forma de mezcla por medio de PCR, y se añadió un sitio HindIII en ambos extremos del producto unido, para obtener de ese modo un fragmento génico de HindIII-promotor de CMV-Kozak-dhfr-poli A-HindIII. Se insertó este fragmento en el sitio HindIII de pCAGGSIGH o pCAGGS-IGK, para obtener de ese modo pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A y pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-A. Estos vectores de expresión permiten la expresión de anticuerpo quimérico con un promotor de CAG, y la expresión de un gen de dhfr con un promotor de CMV, mediante lo cual puede producirse eficazmente un anticuerpo quimérico a través de amplificación génica.

Ejemplo 13: Establecimiento de una línea celular CHO que produce anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano

Se transformaron simultáneamente células CHO dhfr(-) (G. Urlaub et al., Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, págs. 4216-4220, 1980) con el uso de dos plásmidos (plásmidos lineales obtenidos escindiendo plásmidos circulares con PvuI en un gen resistente a ampicilina); es decir, un vector pCAGGSIGK-CMV-dhfr-A para la expresión de cadena L anti-CDH3 quimera y un vector pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A para la expresión de cadena H anti-CDH3 quimera. Se realizó la electroporación por medio de Amaxa (Lonza). Se añadió un ADN (0,002 mg/muestra; en el caso de plásmido de cadena L o plásmido de cadena H) a 0,1 ml de tampón de CHO de electroporación Amaxa que contenía 3 * 10e3 células, y se aplicó un pulso.

Se añadieron las células que se habían sometido a electroporación a un medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) libre de HT (H: hipoxantina; T: timidina) que contenía FBS dializado al 10 %. Tres días tras la transfección, se intercambió el medio por un medio IMDM libre de FBS dializado al 10 %, L-glutamina 2 mM y HT, y se seleccionaron células transformadas neo+ con el uso de G4181 mg/ml, para obtener de ese modo clones de una línea celular positiva que produce anticuerpo quimérico. Posteriormente, se realizó amplificación génica con el uso de los clones seleccionados con el uso de G418. Se realizó una amplificación de dos rondas en metotrexato 0,25 mM (MTX) y 1 mM (MTX), y se establecieron líneas celulares que pueden producir un anticuerpo anti-CDH3 humano quimera (de aproximadamente 50 a 100 mg/l).

Ejemplo 14: Cuantificación de anticuerpo quimérico por medio de inmunoensayo enzimático (ELISA)

Se analizó el sobrenadante de cultivo de las células CHO transfectadas por medio de ELISA para confirmar la producción del anticuerpo quimérico. Con el fin de detectar un anticuerpo quimérico, se recubrió una placa con anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H+L) (preabsorbido con IgG de ratón, conejo, bovina y de ratón) (AQI, cat. A-110UD; COSMO BIO Co., Ltd ). Tras bloquear, se sometió el sobrenadante de cultivo obtenido de las células CHO que producen anticuerpo quimérico anti-CDH3 a dilución en serie, y se añadió a los pocillos. Tras someterse la placa a incubación y lavado, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H+L) (preabsorbido con IgG de ratón, conejo, bovina y de ratón)-HRP (AQI, cat. A-110 PD; COSMO BIO Co., Ltd.). Tras la incubación y el lavado, se añadió un tampón de sustrato. Se llevó a cabo adicionalmente incubación, se terminó la reacción y entonces se sometió a ensayo la absorbancia a 450 nm. Se usó IgG humana purificada como patrón.

Ejemplo 15: Evaluación de la capacidad de internalización de anticuerpo quimérico

Se sometió a ensayo la capacidad de internalización del anticuerpo quimérico preparado de la misma manera que en el ejemplo 6, excepto porque se usó HumZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.) como anticuerpo marcado con saporina con el fin de tratar con un anticuerpo quimérico. Como resultado, se encontró que el anticuerpo quimérico mantenía la capacidad de internalización observada en el anticuerpo parental. La tabla 3 muestra los resultados de la prueba de internalización del anticuerpo quimérico en combinación con los resultados del anticuerpo parental mostrados en la tabla 1.

[Tabla 3]

N.° de Subtipo Viabilidad Viabilidad Dominio de N.° de Viabilidad anticuerpo celular de celular de reconocimiento anticuerpo celular de parental anticuerpo anticuerpo quimérico anticuerpo parental (%, parental (%, quimérico prueba A) prueba B) (%) PPAT-055-15 IgG1 23 EC1

PPAT-055-08 IgG2a 43 40 EC1

PPAT-055-02 IgG2a 31 42 EC1

PPAT-055-24 IgG2a 44 EC1 PPAT-055-24C 41 PPAT-055-07 IgG2a 45 EC1

PPAT-055-03 IgG1 34 50 EC1

PPAT-055-25 IgG1 54 EC1

PPAT-055-09 IgG1 26 57 EC1 PPAT-055-09C 44 PPAT-055-21 IgG2a 57 EC1

PPAT-055-12 IgG2a 47 58 EC1

PPAT-055-11 IgG1 59 EC1

PPAT-055-10 IgG1 61 EC1

PPAT-055-18 IgG1 65 EC4

PPAT-055-05 IgG1 69 EC1

PPAT-055-20 IgG2a 78 EC2

PPAT-055-19 IgG2b 85 79 EC4

PPAT-055-01 IgG1 92 85 EC3

PPAT-055-14 IgG1 87 EC4

PPAT-055-17 IgG1 93 87 EC5 PPAT-055-17C 91 PPAT-055-16 IgG1 88 89 EC5

PPAT-055-13 IgG1 99 95 EC3

Negativo Ab1 IgG2a 97

Negativo Ab2 IgG1 90 98

* Se dedujo que PPAT-055-13 reconocía el límite entre EC3 y EC4.

Las líneas celulares PPAT-055-9C y PPAT-055-24C que producen los anticuerpos quiméricos PPAT-055-9C y PPAT-055-24C se depositaron internacionalmente en el National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganismo Depositary (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba, 292-0818, Japón) con los números de registro: NITE BP-1147 y NI^t E BP-1148, respectivamente, el 27 de septiembre de 2011 según el Tratado de Budapest.

Ejemplo 16: Síntesis de fármacos

Se preparó DM1SMe de la manera descrita en las patentes estadounidense números 5.208.020 y 6.333.410B1 (figura 12 ).

Ejemplo 17: Preparación de anticuerpo conjugado con fármaco

(1) Tratamiento de reducción del fármaco que va a conjugarse

Se mezclaron una disolución de 0,78 mg de DM1SMe disuelto en 300 |il de etanol, 180 |il de tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) y 20 |il de disolución TCEP (Bond Breaker, Thermo Fisher Scientific Inc.), y se sometió la mezcla resultante a la reacción bajo la atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos con agitación para reducir los fármacos.

Se purificaron los fármacos reducidos por medio de HPLC, se retiró el disolvente de los mismos mediante destilación y se disolvió el resultante en dimetilacetamida hasta una concentración de fármaco de 10 mg/ml.

(2) Preparación de anticuerpo conjugado con maleimida

Se añadió un exceso molar de 30 veces de sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific Inc.) a anticuerpo quimérico anti-CDH3 humano 1 mg/ml, y se permitió que la reacción avanzara a 30 °C durante 1 hora.

Con el fin de eliminar los agentes de reticulación en exceso, se sometió el producto de reacción a desalación con el uso de las columnas de desalación Zeba Spin (Thermo Fisher Scientific Inc.) equilibradas con fosfato de potasio 50 mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM (pH 6,5).

(3) Modificación de anticuerpo con fármaco

Se sometieron el anticuerpo quimérico anti-CDH3 conjugado con maleimida (1 mg/ml) y un fármaco reducido en una cantidad igual a 1,7 veces mayor que la del número de grupos maleimida conjugados a la reacción en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 50 mM y E^{d t}A 2 mM (pH 6,5) a temperatura ambiente durante la noche. Se llevó a cabo filtración en gel por medio de HPLC con el fin de retirar los fármacos en exceso.

Ejemplo 18: Cuantificación de la conjugación de anticuerpo-fármaco

Se determinó el número de fármacos conjugados con un anticuerpo sometiendo a ensayo la absorbancia a 252 nm y 280 nm con el uso de las constantes de absorción: gAb²⁸⁰ = 223000 M^{' 1} cmr¹ , sAb²⁵² = 82510 M^{' 1} cmr¹ , eDM1²⁸⁰ = 5180 M^{- 1} cm^{- 1} y eDM1²⁵² = 26 160 M^-1 cm^{- 1} , descritos en un documento no de patente (Widdison, W. C., Wilhelm, S. D., Cavanagh, E. E., et al., 2006, Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer, J. Med. Chem., 49, 4392-4408). Como resultado, se dedujo que se introdujeron aproximadamente 3 o 4 fármacos por molécula de anticuerpo. Los resultados de los ensayos se muestran en la tabla 4.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Agente citotóxico que comprende un anticuerpo monoclonal IgG anti-p-cadherina, que reconoce un dominio de cadherina 1 (EC1) de p-cadherina y presenta una alta capacidad de intemalización, en el que la alta capacidad de internalización es una viabilidad sometida a ensayo de células que expresan CDH3 que es del 60% o menos, cuando el anticuerpo se administra con un anticuerpo anti-IgG marcado con saporina, en el que la célula que expresa CDH3 es la línea celular de cáncer de mama HCC1954 (ATCC, CRL-2338), en el que se conjuga una sustancia citotóxica con el anticuerpo, y en el que la sustancia citotóxica es un derivado de maitansinoide seleccionado de DM1, DM3 o DM4 o un derivado de auristatina seleccionado de MMAE o MMAF.

2. Agente citotóxico según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

3. Agente citotóxico según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano.

4. Agente citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo se conjuga con una sustancia citotóxica por medio de un ligador.

5. Agente citotóxico según la reivindicación 4, en el que el ligador se selecciona del grupo que consiste en:

sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), W-succinimidil-4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), éster N-succinimidílico del ácido rc-maleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico del ácido y-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido gmaleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(amaleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(P-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), W-succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), 6-maleimidocaproílo (MC), maleimidopropanoílo (MP), p-aminobenciloxicarbonilo (PAB), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB), valina-citrulina (val-cit) y alanina-fenilalanina (ala-phe).

6. Composición farmacéutica que comprende, como principio activo, el agente citotóxico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Agente terapéutico para su uso en la terapia de una enfermedad con un CDH3 humano altamente expresado, que comprende, como principio activo, el agente citotóxico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la enfermedad con un CDH3 humano altamente expresado se selecciona de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon o cáncer pancreático.

8. Agente terapéutico para su uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad es cáncer de mama.