EA013323B1 - Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения - Google Patents

Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения Download PDF

Info

Publication number
EA013323B1
EA013323B1 EA200701250A EA200701250A EA013323B1 EA 013323 B1 EA013323 B1 EA 013323B1 EA 200701250 A EA200701250 A EA 200701250A EA 200701250 A EA200701250 A EA 200701250A EA 013323 B1 EA013323 B1 EA 013323B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
conjugate
alpha
human
integrin
Prior art date
Application number
EA200701250A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200701250A1 (ru
Inventor
Цимин Чэнь
Мохит Трикха
Роберт Дж. Лутц
Рита М. Стивз
Годфри Эмфлетт
Original Assignee
Сентокор, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сентокор, Инк. filed Critical Сентокор, Инк.
Publication of EA200701250A1 publication Critical patent/EA200701250A1/ru
Publication of EA013323B1 publication Critical patent/EA013323B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Abstract

Изобретение относится к конъюгатам специфических антител против интегрина с цитотоксическими соединениями, к синтезу, отбору и применению таких конъюгатов при лечении злокачественных опухолей или других заболеваний, опосредованных пролиферацией клеток, миграцией клеток или воспалением, в патологии которых участвует ангиогенез или неоваскуляризация новой ткани. Кроме того, изобретение относится к комбинированной терапии таких заболеваний, где лечение включает в себя применение указанных конъюгатов в сочетании с одним или несколькими видами лечения, включающими в качестве неограничивающих примеров химиотерапию, хирургическое или радиационное лечение. Предпочтительные конъюгаты включают в себя соединения майтансиноидов, связанные с антителом дисульфидной связью, и предпочтительные средства химиотерапии представляют собой доксорубицин, таксан, камптотецин, подофиллотоксин, аналог нуклеозида или аналог пиримидина.

Description

Настоящее изобретение относится к конъюгатам опухолеспецифических антител с цитотоксическими соединениями. Предпочтительные конъюгаты содержат соединения майтансиноидов, связанные с антителом против интегрина дисульфидной связью.
Предшествующий уровень техники
Делались многочисленные попытки усилить эффективность антинеопластических лекарственных средств путем конъюгации таких средств с моноклональными антителами (МаЬ) против ассоциированных с опухолями антигенов для увеличения концентрации лекарственного средства за счет направленной доставки в опухоль. Потенциал антител в отношении действенного разрушения опухолевых клеток, напротив, ограничен антителами, направленными на блокирование пролиферативных стимулов, таких как факторы роста БОЕ и Нег-2, за счет блокирования связывания лиганда с данными рецепторами или блокирования передачи сигнала данных рецепторов (ЕгЬВ1 и ЕгЬВ2) или теми антителами, которые имеют эффекторные функции (ЛЭСС или СЭС). Поэтому ведут поиск продукта, сочетающего специфичность МаЬ с потенциалом, к разрушению клеток в виде метаболического яда. Примерами последнего являются конъюгированное с доксорубицином антитело МаЬ ВН96 (ВгаДатеку, е1 а1. Сапсег 1ттипо1 1штипо1йег 33:367-374, 1991) и экзотоксин Ркеиботопак, слитый с антителами или фрагментами против факторов роста (Кгейтеп! е1 а1., 1п1егпа1. 1. 1ттипорйагт. 14 (3):465-472, 1992).
Данные попытки столкнулись с непредвиденными ограничениями, например с необходимостью относительно высокой внутриклеточной концентрации токсина по сравнению с числом внешних участков связывания на клетке. Если число ассоциированных с опухолью антигенов на поверхности клетки оценивают как 105 молекул/клетку, цитотоксические средства, которые могут эффективно использоваться в таких конъюгатах, должны иметь значение 1С50 в отношении опухолевых клеток-мишеней, составляющее 10-10-10-11 (Сйап, К.УД. Абу. Эгид Оейуегу Неу. 1998, 31, 89-104). Во-вторых, лекарственное средство должно высвобождаться после связывания с мишенью и проникать в клетку, или вся конструкция должна транспортироваться в клетку, и токсин должен там отщепляться или активироваться иначе.
Некоторые из данных недостатков могут быть в большей или меньшей степени разрешены применением сильно действующих лекарственных средств, конъюгированных с интернализирующим антителом и применением химической связи, которая усиливает лабильность во внутриклеточных условиях. В С’йап е! а1. (Сапсег Нек. 52:127-131, 1992; Ыи е! а1., Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1 И8Л 93:8618-8623, 1996; патент США № 5208020) разработаны конъюгаты антител, в которых антитело связано с майтансиноидом дисульфидной связью.
Майтансиноиды представляют собой противогрибковые и противоопухолевые средства растительного происхождения. Выделение трех петлевых макролидов из этаноловых экстрактов Мау!епи§ оуа!и§ и Мау1епи8 Ьисйапапи впервые описано 8.М. Кирсйап е! а1. и является субъектом патента США № 3896111 вместе с демонстрацией их противолейкозных эффектов на экспериментальных мышах в интервале доз мкг/кг. Однако майтансиноиды имеют неприемлемую токсичность, вызывая центральную и периферическую невропатии и побочные эффекты, в частности тошноту, рвоту, диарею, усиление тестов функции печени и реже слабость и летаргию. Поэтому исследования были некоторое время сфокусированы на поиске правильной группы-мишени с подходящим химическим методом для получения конъюгата майтансиноида-антитела с приемлемым периодом полураспада.
В отличие от высокой цитотоксичности свободного майтансиноида конъюгат с антителом имеет токсичность, на несколько порядков более низкую в отношении антиген-отрицательных клеток по сравнению с антиген-положительными клетками. Связь дисульфидным мостиком имеет преимущество легкого отщепления данных связей в клетках-мишенях внутриклеточным глутатионом, с высвобождением высокотоксичного свободного лекарства. Данный подход применяли к антителам против ассоциированных с опухолями антигенов, например, при использовании конъюгатов С242-ЭМ1 (Ъш е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1 И8А 93:8618-8623, 1996) и ΗπΝ901-ΌΜ1 (Сйап е! а1., 2000). Однако применение данных конъюгатов ограничено вследствие ограниченной экспрессии соответствующих антигенов-мишеней.
Поэтому все еще остается необходимость улучшить данный подход использованием антител, направленных на экспрессируемые в большом количестве опухолеассоциированные антигены и, необязательно, на антигены, экспрессируемые в большом количестве во время пролиферативной и метастазирующей стадии злокачественной опухоли, что обеспечивает естественное концентрирование токсина в наиболее вирулентных клетках.
Моноклональные антитела против интегринов.
Значимые доказательства показывают, что прогрессирующий рост опухолей зависит от ангиогенеза, образования новых кровеносных сосудов, предоставляющих опухолям питательные вещества и кислород, отводящих отходы и действующих как проводники метастазов опухолевых клеток в отдаленные участки (Оакб е! а1., Опсо1. 54: 177-184). Последние исследования далее определили роль интегринов в процессе ангиогенеза. Во время ангиогенеза некоторое количество интегринов, которые экспрессированы на поверхности активированных эндотелиальных клеток, регулируют критические адгезивные взаимодействия с различными белками ЕСМ, регулируя различные биологические события, например миграцию клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Более конкретно, близкородственные, но различные
- 1 013323 интегрины ανβ3 и ανβ5, как было показано, опосредуют независимые пути процесса ангиогенеза. Антитело, полученное против ανβ3, блокировало индуцированный основным фактором роста фибробластов (ЬРОР) ангиогенез, в то время как антитело, специфичное в отношении ανβ5, ингибировало ангиогенез, индуцированный фактором роста эндотелия сосудов (ΥΕΟΡ) (ЕНсс1Г1. е! а1., 1. С11п. 1пус5(. 103: 1227-1230 (1999); Рпеб1апбег е! а1., 8с1еисе 270: 1500-1502 (1995)). Поэтому интегрины, и особенно интегрины, содержащие альфа^-субъединицу, являются предполагаемыми терапевтическими мишенями для заболеваний, в развитии которых участвует ангиогенез, например заболеваний глаз и неоплазий, перестройки тканей, такой как повторный стеноз, и пролиферации некоторых типов клеток, в частности эпителиальных и плоскоклеточных карцином.
Лекарственные конъюгаты антител.
Описаны конъюгаты связывающих клетки агентов с высокоцитотоксичным майтансином (патент США № 5208020 и 5416064; Κ.ν.1. Скал е! а1., 1992 Сапсег Кек. 52:127-131). Некоторые реагенты или реактанты, такие как сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимидила (ΝΗ8), для взаимодействия с аминогруппами белка были разработаны для применения в образовании конъюгатов белок-лекарство. Реагенты данного типа, в общем, описаны Саг1ккоп е! а1. (Вюсйет 1. 173: 723, 1978) и в патенте США № 4149003. Реагенты с нитропиридильным линкером для конъюгации майтансина с МаЬ и другими белками описаны в АО 2004/016801.
В указанных выше процессах связывающие клетки агенты модифицируют бифункциональным агентом, таким как №сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (8ΡΌΡ), для введения активного дисульфидного радикала. Взаимодействие с содержащим тиол цитотоксическим лекарственным средством представляет конъюгат, в котором связывающее клетку средство, такое как моноклональное антитело, и лекарство связывают дисульфидными связями. Обнаружено, что положение гидроксила С-3 может модифицироваться без потери активности, фактически, некоторые эфиры, как было обнаружено, имели повышенную цитотоксичную активность (См. Саккабу, е! а1. Скет. Ркагт. Ви11. 52(1): 1-26, 2004 для обзора). В патентах США № 5208020 и 5416064 конкретно описано применение активированного эфира майтансола и №метил-№(3-метилдитиопропаноил)-Ь-аланина. Майтансоидный радикал, участвующий в данном взаимодействии, который высвобождается при восстановительном расщеплении дисульфидной связи, обозначен ΌΜ1 ^2'-дезацетил-^'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансин, рег. № СА8 139504-50-0]. Таким образом, все конъюгаты, полученные с использованием метилдитиолированной формы ΌΜ1, сохраняют незамещенный углерод метилена, прилегающего к дисульфидной связи на относящейся к лекарству стороне конъюгата (фиг. 1).
Для усиления стабильности данной дисульфидной связи ίη νίνο важно предоставить стерически напряженные дисульфидные связи, как это отмечалось ранее (Ткогре, е! а1. Сапсег Кекеагск 47:5924-31, 1987). Данная цель может достигаться путем применения перекрестных линкеров, которые несут один или два метильных заместителя на атоме углерода, прилегающем к дисульфидной связи, или применения активированных лекарств, несущих по меньшей мере один заместитель на альфа-углеродном атоме, прилегающем к сульфгидрильному или дисульфидному заместителю.
Хотя проблемы направленной доставки в настоящее время четко раскрыты, поиск подходящей комбинации специфичности и сродства антитела, химии конъюгации и токсина является непредсказуемым. Целью настоящего изобретения является предоставление новых конъюгатов антитела и майтансина, где антитело направлено на антигены клеточной поверхности, число которых достаточно для доставки токсичной дозы майтансиноида, причем данные конъюгаты имеют подходящую химическую и биологическую стабильность для представления терапевтически эффективной скорости высвобождения при введении субъекту.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является представление новых конъюгатов антитела и майтансина, где антитело направлено на антигены клеточной поверхности, число которых достаточно для доставки токсичной дозы майтансиноида, и где известно, что антитело интернализуется клеткой после связывания с антигеном-мишенью. В конкретном варианте осуществления конъюгаты включают в себя дисульфидную связь, которую конструируют посредством замещения прилегающих углеродов метилена с обеспечением терапевтически эффективной скорости высвобождения при введении субъекту. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к конъюгату антитело-лекарство, включающему в себя антитело, которое связывается с альфа^-субъединицей человеческого интегрина, конъюгированное с цитотоксическим агентом с 1С50, составляющим 10-9 М или менее, где конъюгат антитело-лекарство оказывает цитотоксическое или цитостатическое действие на клеточную линию злокачественной опухоли, экспрессирующую альфа^-интегрин. В данном варианте осуществления антитела согласно изобретению специфичны, по меньшей мере, в отношении одной альфа^-субъединицы гетеродимерного интегринового рецептора, такого как гетеродимерный белок-интегрин альфа^-бета-1, альфа^-бета-3, альфа-νбета-5, альфа^-бета-6 или альфа^-бета-8 либо его фрагмент. Предпочтительные конъюгаты содержат майтансиноидные соединения, связанные с антителом дисульфидной связью, и антитело способно связывать витронектин и фибиноген.
- 2 013323
В одном из аспектов конъюгаты антитела согласно изобретению представлены формулой [С-Цт-А I где А представляет собой антитело, специфичное в отношении человеческой интегриновой субъединицы альфа-У; где указанное антитело способно интернализоваться клеткой, экспрессирующей указанную субъединицу альфа-У;
С представляет собой цитотоксин с 1С50, составляющей 10-9 М или менее;
Ь представляет собой связывающую группу, которая связывает антитело и цитотоксин и далее включает в себя связь, расщепляемую компонентами внутриклеточной среды;
т представляет среднее число молекул цитотоксина, связанных с антителом, и представляет собой целое число в интервале 1-10, конкретнее в интервале 3-4.
Цитотоксин может быть выбран из группы, состоящей из майтансиноидов, калихеамицинов, эпотилонов, дискодермолида, элеутробинов, доластатинов, криптофицинов, камптотецинов, ризоксина (рег. № СА8 90996546), или производных таксана и других таких соединений, которые проявляют 50% максимального ингибирования (1С50 или Ш50) в отношении роста опухолевых клеток 10-9 М или менее.
В аспекте первого объекта изобретения конъюгат антитела против альфа-У-интегрина и майтансиноида включает в себя любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает в себя антитело, конкурирующее за связывание с альфа-У-субъединицей гетеродимерного человеческого интегринового рецептора с моноклональным антителом СЫТО 95. В одном из вариантов осуществления антитело включает в себя по меньшей мере часть определяющей комплементарность области (0ΌΒ) тяжелой или легкой цепи или их связывающую лиганд область, происходящую из антитела, обозначенного СЫТО 95, в комбинации с вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи, константной областью тяжелой цепи или легкой цепи, каркасной областью или любой его частью, которая может быть встроенной в антитело с 0ΌΚ Описанное здесь антитело СЫТО 95 представляет собой человеческое антитело против альфа-У, происходящее от иммунизации трансгенной мыши, содержащей гены для экспрессии человеческих иммуноглобулинов. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к антителам, содержащим по меньшей мере одну область СЭВ или вариабельную область, происходящую из антитела СЫТО 95. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой СЫТО 95. В другом аспекте изобретения конъюгат антитело-майтансиноид включает в себя сложный эфир майтансинола, который высвобождается после расщепления связи, соединяющей цитотоксин С с линкером Ь, компонентами внутриклеточной среды. В одном из вариантов осуществления майтансиноид этерифицируется в С-3, С-14, С-15 или С-20 ацилированной аминокислотой, в которой ацильная группа несет защищенную сульфгидрильную группу, где атом углерода ацильной группы, прилегающей к защищенной сульфгидрильной группе, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический, гетероциклоалкильный радикал или Н; и где ацильная группа имеет длину линейной цепи по меньшей мере в два углеродных атома между карбонильной функциональностью и атомом серы. В предпочтительном варианте осуществления майтансиноид представляет собой сложный эфир 3-майтансинола, а ацилированная аминокислотная группа несет 0, 1 или 2 метильные группы на углеродном атоме, прилегающем к защищенному сульфгидрилу. В предпочтительном варианте осуществления этерифицированный майтансинол выбран из
Ы2'-дезацетил-Ы2'-(3-меркапто-1-оксоприл)майтансина (ЭМ1. рег. № СА8 139504-50-0), Ы2-дезацетил-Ы2-(4-меркапто-1-оксопентил)майтансина (ЭМ3) и
Ы2 -дезацетил-Ы2 -(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансина (ЭМ4).
Вторым объектом изобретения является представление соединений-конъюгатов антитела против интегрина и майтансиноида, которые могут использоваться для лечения пролиферативных заболеваний человека, вызванных аномальной пролиферацией и характеризующихся неовасуляризацией. В особенно предпочтительном варианте осуществления соединения согласно изобретению применяют в способе лечения злокачественной опухоли, включая злокачественные опухоли молочной железы, толстого кишечника, прямой кишки, легких, предстательной железы, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, желудка, эндометрия, яичников, шейки матки или кости. Соединения согласно изобретению могут использоваться отдельно или в комбинации с другими средствами в профилактике или лечении первичных злокачественных опухолей или в профилактике или лечении метастазирующих заболеваний.
В другом способе второй объект изобретения относится к комбинированному применению соединений-конъюгатов антитела против интегрина и майтансиноида со средствами химиотерапии при лечении злокачественной опухоли. Предпочтительные конъюгаты содержат соединения майтансиноиды, связанные с антителом дисульфидной связью, и предпочтительные средства для химиотерапии представляют собой доксорубицин, таксан, камптотецин, подофиллотоксин, аналог нуклеозида или аналог пиримидина.
В третьем объекте изобретения конъюгат антитела и майтансиноида получают способом, в котором антитело взаимодействует с биспецифическим химическим линкерным реагентом, таким как Ысукцинимидил-(2-пиридилтио)алканоат, и впоследствии взаимодействует с предактивированным май
- 3 013323 тансиноидом, где обмен дисульфидами приводит к образованию стерически напряженной дисульфидной связи между антителом и майтансиноидом. В другом аспекте изобретения конъюгат антитела и майтансиноида получают с использованием сложного эфира майтансинола, в котором ацильная группа несет защищенную сульфгидрильную группу. В одном из вариантов осуществления майтансиноид этерифицируется в С-3, С-14, С-15 или С-20 ацилированной аминокислотой, в которой ацильная группа несет защищенную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, прилегающий к защищенной сульфгидрильной группе, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители выбраны из СН3, С2Н5, линейного алкила или алкенила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, разветвленного или циклического алкила или алкенила, атомов углерода, разветвленного или циклического алкила или алкенила, имеющего от 3 до 10 атомов углерода, фенила, замещенного фенила, гетероциклического арильного радикала, гетероциклоалкильного радикала или Н; и где ацильная группа имеет длину линейной цепи, равную по меньшей мере двум атомам углерода между карбонильной функциональностью и атомом серы. В предпочтительном варианте осуществления майтансиноид представляет собой сложный эфир 3-майтансинола, а ацилированная аминокислотная группа несет 0, 1 или 2 метильные группы на углеродном атоме, прилегающем к защищенному сульфгидрилу. В предпочтительном варианте осуществления этерифицированный майтансинол выбран из
М2'-дезацетил-Ы2'-(3-меркапто-1-оксоприл)майтансина (ΌΜ1, рег. № СЛ8 139504-50-0), М2-дезацетил-Ы2-(4-меркато-1-оксопентил)майтансина (ΌΜ3) и
Ν2 -дезацетил-Ν2 -(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансина (ΌΜ4).
Еще в одном аспекте изобретения конъюгат антитела против альфа-У-интегрина и майтансиноида получают, по существу, в одну стадию взаимодействия майтансиноида, несущего реакционноспособный сложный эфир, с антителом против интегрина, до этого не активированным химически. Реакционноспособный сложный эфир майтансиноида может представлять собой сложный эфир Ν-сукцинимидила, Νсульфосукцинимидила, Ν-фталимидила, Ν-сульфофталимидила, 2-нитрофенила, 4-нитрофенила, 2,4динитрофенила, 3-сульфонил-4-нитрофенила или 3-карбокси-4-нитрофенила.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана химическая структура тиолированных амидов майтансина с предпочтительными видами молекул; отмечены ΌΜ1, ΌΜ3 и ΌΜ4.
На фиг. 2 показаны химические структуры предпочтительных бифункциональных линкерных реагентов согласно изобретению и их химические акронимы.
Фиг. 3 представляет собой схематичное изображение способа синтеза для получения конъюгатов антитело-майтансиноид согласно изобретению.
Фиг. 4 представляет собой график, на котором показано изменение объема опухоли человеческой меланомы с течением времени в голых мышах и эффект введения СЫТО 95. Мышей инокулировали подкожно клетками Л375.82 (3х106) и дозирование ί'ΝΤΟ 95 или контроля начинали через 3 суток. Мышей обрабатывали ί'ΝΤΟ 95 или носителем три раза в неделю в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно. Каждая точка данных представляет собой средний объем опухоли от 10 несущих опухоль животных (±ст.ош.среднего). ί'ΝΤΟ 95, введенное три раза в неделю, значимо ингибировало рост опухолей по сравнению с обработанными контролем животными, на 26 сутки (Р=0,0005).
Фиг. 5 представляет собой график, на котором показано изменение объема опухоли человеческой меланомы с течением времени в голых крысах и эффекта введения ίΝΤΟ 95. Крыс инокулировали подкожно клетками Л375.82 (3х106) и лечение ίΝΤΟ 95 или контролем начинали через трое суток. Крыс обрабатывали ίΝΤΟ 95 или носителем три раза в неделю в дозе 10 мг/кг внутривенно. Каждая точка данных представляет собой средний объем опухоли от 9 несущих опухоль животных (±ст.ош.среднего).
Фиг. 6 представляет собой график, на котором показан рост клеток человеческой меланомы Л375.82 с течением времени в голых мышах. Объемы опухоли выражены в виде среднего значения ±ст.ош.среднего (п=9 или 10). Стрелки указывают на внутривенные инъекции лекарственного средства. Звездочка указывает на то, что одно из неотвечающих животных умерщвляли, когда объем ее опухоли превысил 1500 мм3.
Фиг. 7 представляет собой график, на котором показан рост клеток человеческой меланомы Л375.82 с течением времени в голых крысах. На 14 сутки, когда средний объем опухоли достигал 250 мм3, животных случайным образом группировали и вводили первую дозу. Всех животных умерщвляли на 35 сутки. Объем опухоли выражали в виде среднего значения ±ст.ош.среднего (п=9 или 10). Стрелки указывают на сутки внутривенных инъекций лекарственного средства.
Фиг. 8 представляет собой график, на котором показано изменение общей массы тела с течением времени в несущих опухоль мышах, инъецированных на 7 сутки после имплантации опухоли, и опять каждые 7 сутокх5 3, 6 или 10 мг/кг ίΝΤΟ 364; на 7 и 14 сутки 25 мг/кг ίΝΤΟ364 или Ε105-ΌΜ1 и на 7, 14 и 35 сутки 15 мг/кг ίΝΤΟ364.
Фиг. 9 представляет собой график, на котором показано изменение объема опухоли с течением времени у тех же животных, которые описаны на фиг. 8.
Фиг. 10 представляет собой график, на котором показаны объемы индивидуальных опухолей для
- 4 013323 всех животных в группах, описанных на фиг. 8.
Фиг. 11 представляет собой график средней массы тела ±ст.ош.среднего (п=6) от времени для голых крыс, которые имели подкожную опухоль в результате введения клеток А549 человеческой карциномы легких и которых лечили СЫТО 364 в дозе 15 мг/кг или контролем. Стрелки указывают на время внутривенных инъекций лекарственного средства.
Фиг. 12 представляет собой график, на котором показан рост опухолей человеческих карцином легких А549 у самок бестимусных мышей. Лечение СЫТО 364 (15 мг/кг) снижало развитые опухоли, полученной в результате введения клеток А549 человеческой карциномы легких у самок бестимусных мышей.
Фиг. 13 представляет собой график рассеяния, на котором показаны отдельные массы опухолей в момент окончания исследования роста опухолей человеческих карцином легких А549 у самок бестимусных крыс, которых лечили 15 мг/кг СЫТО364 или контрольными веществами. Горизонтальные линии указывают на медиану каждой группы исследования.
Фиг. 14А и В представляют собой графики, на которых показано изменение среднего объема опухоли с течением времени у крыс, которые имели опухоли, вызванные НТ29 толстого кишечника человека и которых лечили СЫТО 364 (СЫТО 95-8ΡΡ-ΌΜ1), СЫТО 365 (СЫТО 95-88ΗΡΒ-ΌΜ4) и СЫТО 366 (СЫТО 95-88ЫРР-ПМ4).
A. Контроль ΡΒ8 и не относящееся к делу антитело Р1 05, конъюгированное с тиолированными майтансинами с использованием того же способа и реагентов и инъецированное на 7 и 21 сутки в дозе 10 мг/кг.
B. Контроль ΡΒ8 и описанные конъюгированные антитела, инъецированные в дозе 20 мг/кг на 7 и 21 сутки, кроме группы СЫТО365, которая получала одну инъекцию на 7 сутки.
Фиг. 15А и В представляют собой графики, на которых показано среднее изменение массы тела у крыс, несущих опухоли НТ29, как показано на фиг. 14.
Подробное описание изобретения
1. Определения.
Для более легкого понимания настоящего изобретения некоторые термины вначале определены. Дополнительные определения приведены по ходу подробного описания. Термины «альфа-У-интегрин», «интегрин с субъединицей альфа-У» и «интегрин, содержащий субъединицу альфа-У», используются здесь взаимозаменяемо и означают трансмембранные гликопротеиновые субъединицы альфа-У функционального интегринового гетеродимера и включают в себя все варианты, изоформы и гомологи видов альфа-У. В соответствии с этим, антитела согласно изобретению могут в некоторых случаях перекрестно взаимодействовать с альфа-У из видов, отличных от человека, и с другими белками, которые структурно родственны человеческому альфа-У (например, человеческие гомологи альфа-У). В других случаях антитела могут быть полностью специфичны в отношении человеческого альфа-У и не проявляют видовой или иной перекрестной реактивности.
Используемый здесь термин «антитело» включает в себя целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент его одной цепи. Таким образом, антитело включает в себя любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает в себя по меньшей мере часть иммуноглобулиновой молекулы, например, в качестве неограничивающих примеров по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (СИР.) или тяжелую, или легкую цепь, или связывающую лиганд часть, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, константную область легкой или тяжелой цепи, каркасную область (ГК), или любую часть антитела, или по меньшей мере одну часть связывающего белка, которая может быть встроена в антитело по настоящему изобретению. Антитело может быть мышиным, человеческим, гуманизированным или химерным.
«Антигенсвязывающий фрагмент» или его часть включает в себя одноцепочечные антитела и их фрагменты. Функциональные фрагменты включают в себя антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с альфа-У-субъединицей млекопитающих. Примеры связывающих фрагментов, входящих в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают в себя (ί) ГаЬ-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН; (ίί) Г(аЬ')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий в себя два ГаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в области шарнира; (ίίί) Γά-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН; (ίν) Γν-фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН одного плеча антитела, (ν) фрагмент ЙАЬ. в котором домены УН и УЪ экспрессированы на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, слишком короткого для обеспечения образования пары двух доменов на одной цепи, принуждающего таким образом домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи с созданием двух антигенсвязывающих участков; и (νί) выделенную определяющую комплементарность область (СЭК). Более того, хотя два домена Γν-фрагмента УЪ и УН кодируются отдельными генами, они могут объединяться с использованием рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который дает им возможность существовать в виде одного белка, в котором области УЪ и УН образуют моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Γν (κοΓν)). Такие одноцепочные антитела, так же как подразумевается, входят в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Данные фрагменты антитела получают с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области, и
- 5 013323 фрагменты подвергают скринингу на предмет применения тем же образом, как интактные антитела. Такие фрагменты могут продуцироваться ферментативным расщеплением, синтетическими или рекомбинатными способами, известными в данной области и/или описанными здесь.
Термин «эпитоп» означает белковую детерминанту, способную к специфичному связыванию антитела. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые группы сахаров и обычно имеют специфичные трехмерные характеристики, а также специфичные характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не с последним, теряется в присутствии денатурирующих растворителей. Термин «нативный конформационный эпитоп» или «нативный белковый эпитоп» используются здесь взаимозаменяемо и включают в себя белковые эпитопы, образующиеся в результате конформационного фолдинга интегриновой молекулы, которые возникают, когда аминокислоты из различных частей линейной последовательности интегриновой молекулы собираются вместе очень близко в 3-мерном пространстве. Такие конформационные эпитопы распределяются на внеклеточной стороне плазматической мембраны. Используемый здесь термин «человеческое антитело», как подразумевается, включает в себя антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из иммуноглобулиновых последовательностей человеческой зародышевой линии или близко соответствующие таким последовательностям. Человеческое антитело согласно изобретению может включать в себя аминокислотные последовательности, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями человеческой зародышевой линии (например, содержат мутации, введенные путем случайного или сайтспецифического мутагенеза ίη νίίτο, или соматические мутации ίη νίνο). Таким образом, используемый здесь термин «человеческое антитело» относится к антителу, в котором, по существу, каждая часть белка (например, СЭК, каркас, домены СЬ, СН (например, СН1, СН2, СНЗ), шарнир, (УЬ, УН)), по существу, сходна с антителом человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела классифицированы на группы на основе сходства их аминокислотной последовательности, см., например, 1Шр://рсор1с.сгу51.ЬЬк.ас.ик/~иЬсд()75/. Таким образом, с использованием поиска сходства последовательности антитело со сходной линейной последовательностью может быть выбрано в качестве образца для создания «гуманизированных антител».
«Гуманизация» (также называемая переформирование или пересадка СОК) в настоящее время является хорошо отработанным способом снижения иммуногенности моноклональных антител (шЛЬ) из ксеногенных источников (обычно грызунов) и для улучшения эффекторных функций (ЛИСС, активация комплемента, связывание СЧс.|). Сконструированное тАЬ получают с использованием способов молекулярной биологии, однако простая пересадка СЭК определяющих комплементарность областей (СЭК.) грызунов в каркасные области человека часто приводит к потере сродства связывания и/или специфичности исходных тАЬ. Для гуманизации антитела конструирование гуманизированного антитела включает в себя вариации, такие как замена консервативных аминокислот в остатках СЭК, и обратная замена остатков из тАЬ грызунов в человеческих каркасных областях (обратные мутации). Положения для замены могут быть выявлены или идентифицированы путем сравнения последовательностей для структурного анализа или путем анализа моделей гомологии ЗЭ-структуры вариабельных областей. В процессе созревания сродства в недавнее время использовали фаговые библиотеки для варьирования аминокислот в выбранных положениях. Сходным образом, многие подходы применяли для выбора наиболее подходящих каркасных областей, в которые нужно пересаживать СЭК. грызунов. Поскольку число данных известных параметров структур антител возрастает, улучшается продуманность и изощренность данных способов. Может использоваться консенсус последовательностей зародышевой линии из одного антитела и фрагментов каркасных последовательностей в каждой вариабельной области легкой или тяжелой цепи из различных человеческих тАЬ. Другим подходом к гуманизации является модификация только поверхностных остатков последовательности грызунов наиболее обычными остатками, находящимися в человеческих тАЬ, и это называется «перестройка последовательности» или «облицовка». Описаны известные последовательности человеческих 1д, например \у\у\у.псЫ.п1т.ш11.80у/сп1гс//с.|исгу.Гсщ:
\у\у\у.псЫ.ш11.доу/щЫа51: \у\у\у.а1сс.огд/р11адс/11бЬ.1ит1: \у\у\у.каЬа1ба1аЬа5с.сот/1ор.111т1:
\у\у\у.апиЬобугс5оигсс.сот/оп1тссотр.111тк \у\у\у.арр11сбЬю5уЧст5.сот:
\у\у\у.Ьюбс5щп.сот: апДЬобу.ЬаШ.ас.ик;
1Шр://\у\у\у.ишх11.с11/~апиЬобу/: \у\у\у.сгу51.ЬЬк.ас.ик/~иЬсдО75;
ΚаЬаί с1 а1., 8сс.|испсс5 оГ РгсИсиъ оГ 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. И.8. Эср1. Нса1111 (1983), причем каждый приведенный источник полностью включен сюда в качестве ссылки.
«Химерные антитела» представляют собой те антитела, которые сохраняют отдельные домены, обычно вариабельный домен, от одного вида и остальное от другого вида, например химеры мышь
- 6 013323 человек.
Используемые здесь термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся к препарату молекул антител одной молекулярной композиции. В одном из вариантов осуществления человеческие моноклональные антитела получают посредством гибридомы, которая включает в себя В-клетку, полученную из трансгенного животного, не являющегося человеком, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий человеческий трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитую с иммортализованной клетки. Однако в общем кодирующие антитело последовательности клонируют и встраивают в клетку хозяина или продуцирующую клеточную линию.
Используемый здесь термин «рекомбинантная клетка хозяина» (или просто «клетка хозяина»), как подразумевается, относится к клетке, в которую введен рекомбинантный экспрессирующий вектор.
Следует понимать, что такие термины, как подразумевается, относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут произойти в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий внешней среды, такое потомство фактически может быть не идентично родительской клетке, но, тем не менее, включается в объем используемого здесь термина «клетка хозяина». Рекомбинантные клетки хозяина включают, например, линии СНО или происходящую от мышиной миеломы 8Р/О клеточную линию.
Используемый здесь термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все человеческие или гуманизированные антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, например (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам человеческого иммуноглобулина, или из происходящей из данного животного гибридомы, (Ь) антитела, выделенные из клетки хозяина, трансформированной для экспрессии данного антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные другими средствами, которые включают в себя встраивание последовательностей человеческих иммуноглобулиновых генов в другие последовательности ДНК.
Используемый здесь термин «выделенное антитело», как подразумевается, относится к антителу, которое, по существу, свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с альфа-У, по существу, свободно от антител, которое специфично связывается с антигенами, отличными от альфа-У). Выделенное антитело, специфично связывающееся с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого альфа-У, может, однако, иметь перекрестную реактивность в отношении других родственных антигенов, например из других видов (например, гомологи вводов альфа-У). Более того, выделенное антитело может быть, по существу, свободным от других клеточных материалов и/или химических веществ. Используемый здесь термин «специфичное связывание» относится к антителу, связывающемуся с предварительно определяемым антигеном. Обычно антитело связывается с константой диссоциации (Кс), составляющей 10-7 М или менее, и связывается с предварительно определенным антигеном с Кс, которая по меньшей мере в два раза ниже, чем его Кс, для связывания неспецифичного антигена (например, БСА, казеин), отличного от предварительно определенного антигена или близкородственного антигена.
Используемый здесь «изотип» относится к классу антитела (например, 1дМ или 1дО1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.
Сокращения.
АЬ - антитела, поликлональные или моноклональные, аУ - интегриновая субъединица альфа-У,
Ь3 - интегриновая субъединица бета-3,
ЬРОР - основной фактор роста фибробластов,
НиУЕС - эндотелиальные клетки пупочной вены человека,
ΙΕΝ - интерферон,
1д - иммуноглобулин,
1дС - иммуноглобулин О,
МаЬ - моноклональное антитело,
ΝΡΒ - №сукцинимидил-5-нитро-(2-пиридилдитио)бутират,
8МСС - сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, 8ΜΝΡ - №сукцинимидил-4-метил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентанат, 8МРТ - 4- сукцинимидилоксикарбонил-(2-пиридилдитио)толуол, 8ΡΌΒ - №сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутират, 8ΡΌΡ - №сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пропионат, 8РР - №сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентанат,
8Р - №сукцинимидил-4-(2-пиридил),
- сульфосукцинимидил,
88NΡΡ - сульфосукцинимидил-№сукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пеитанат,
УЕОЕ - фактор роста эндотелия сосудов.
- 7 013323
2. Композиции.
А. Конъюгаты антител согласно изобретению.
Конъюгаты антител согласно изобретению представлены формулой [С-Цп>-А I где А представляет собой антитело, специфичное в отношении человеческой субъединицы альфа-Уинтегрина, в которой указанное антитело способно интернализоваться клеткой, экспрессирующей указанную альфа-У-субъединицу;
С представляет собой цитотоксин с 1С50, равной 10-9 М или менее;
Ь представляет собой линкерную группу, которая связывает антитело и цитотоксин и далее включает в себя связь, расщепляемую компонентами внутриклеточной среды;
т представляет собой среднее число цитотоксиновых молекул, связанных с антителом, и является целым числом в интервале 1-5, предпочтительно 3-4.
Цитотоксин может быть выбран из группы, состоящей из майтансиноидов, калихеамицинов, эпотилонов, дискодермолида, элеутробинов, доластатинов, криптофицинов, камптотецинов, ризоксина (рег. № СА8 90996546) или производных таксана и других таких соединений, которые проявляют 50% максимального ингибирования (1С50 или С150) в отношении роста опухолевых клеток 10-9 М или менее.
Линкеры, содержащие расщепляемые внутри клеток связи, включают в себя кислотно-лабильные связи, такие как связи цис-аконитила, сложные эфиры, чувствительные к кислоте гидразоновые связи, деградируемые в лизосомах пептидные линкеры, расщепляемые гидролазами линкеры, специфичные в плане расщепления протеазой или пептидазой линкеры, и дисульфидные (сульфгидрильные) линкеры (см. ОуЬа. М., с1 а1. 2004, Сигг. Рйагт. Эемдп. 10:2311-2334 для обзора). Поскольку линкер может быстро или селективно расщепляться во внутриклеточных условиях по сравнению с условиями, преобладающими, например, в циркуляторном русле, он обеспечивает дальнейшую специфичность и безопасность в плане общей фармакодинамики конъюгата. Дисульфидные связи особенно предпочтительны по причине благоприятного восстановительного потенциала в клеточных компартментах, а также по причине индуцируемой активации ферментов восстановления (8айо, 6. с1 а1. Αάν. Эгид. Оейуегу Рет. 2003 55:199-215). В одном из вариантов осуществления связь находится между атомом серы, присутствующем в молекуле антитела, например в боковой цепи остатка цистеина, и другим атомом серы, присутствующей в токсичном соединении. В другом варианте осуществления связывающий радикал состоит из одного или нескольких атомов или химических групп.
Другое основное соображение при химическом связывании биологической молекулы, такой как рекомбинантный белок, с химическим соединением заключается в том, что дериватизационная химия может и в большинстве случаев будет давать новую молекулярную сущность, которая поэтому может иметь неизвестные биологические свойства. Так, следует понимать, что продукты физиологического расщепления должны конструироваться так, что они дадут производные с предназначенной биологической активностью. Майтансиноиды согласно изобретению, включая ΌΜ1, ΌΜ3, ΌΜ4 и другие, как показано и описано на фиг. 1, сохраняют биологическую активность.
Конъюгаты антитела против альфа-У-интегрина и майтансиноида согласно изобретению получают путем химического связывания антитела против альфа-У с молекулой майтансиноида, без значимого снижения биологической активности антитела, и с предоставлением майтансиноида, который при высвобождении в физиологических условиях сохраняет свой цитотоксический потенциал. Примеры подходящих майтансиноидов представляют собой сложные эфиры майтансинола и аналоги майтансинола, включая в качестве неограничивающих примеров те, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, и те, которые имеют модификации в положениях С-19, С-20, или С-14, или С-15, или С-4,5-дезокси. Предпочтительными являются сложные эфиры майтансинола С-3. Особенно предпочтительными майтансиноидами являются производные Ν-метилаланиновых сложных эфиров майтансинола (Ν2 дезацетилмайтансин). Особенно предпочтительные конъюгаты включают в себя дисульфидную связь, которая при расщеплении путем восстановления высвобождает соответствующий майтансиноид, несущий свободный тиол. Содержащие тиол майтансиноиды предпочтительного типа показаны на фиг. 1 ^'-дезацетил-^'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансин (ΌΜ1, рег. № СА8 139504-50-0), ^-дезацетил-^-(4-меркапто-1-оксопентил)майтансин (ΌΜ3) и ^-дезацетил-^-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансин (ΌΜ4).
Конъюгаты молекул антитела согласно изобретению и токсического соединения могут быть образованы с использованием любых способов, известных в настоящее время или разработанных ранее. Например, цитотоксическое соединение может быть модифицировано с получением свободной аминогруппы и затем присоединено к молекуле антитела кислотолабильным линкером или фотолабильным линкером. Токсическое соединение может конденсироваться с пептидом и впоследствии связываться с молекулой антитела для продукции лабильного в плане воздействия пептидаз линкера.
Токсическое соединение может обрабатываться для получения первичной гидроксильной группы, которая может сукцинилироваться и связываться с молекулой антитела для продукции конъюгата, который может расщепляться внутриклеточными эстеразами, с высвобождением свободного лекарственного средства.
- 8 013323
Для создания дисульфидной связи между антителом А и цитотоксином С предпочтительно токсическое соединение обрабатывают с созданием свободной или защищенной тиольной группы, и затем одно или несколько содержащих дисульфид или тиол токсических соединений ковалентно связывают с молекулой антитела дисульфидной(ыми) связью(ями). Дисульфидная связь должна образовываться непосредственно со свободным тиолом антитела, но может образовываться дериватизацией любой реакционноспособной группы в антителе для введения участка дисульфидного обмена, например, связыванием бифункционального линкера со свободными аминогруппами антитела. Например, молекулы антитела могут модифицироваться реагентами перекрестного связывания, такими как Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ), 4-сукцинимидилоксикарбонил-а-метил-а-(2-пиридилтио)толуол (8ΜΡΤ), Ы-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират (8ΌΡΒ), Ы-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентанат (8ΡΡ), Х-сукцинимидил-5-(2-пиридилдитио)пентанат, 2-иминотиолан (ΙΤ) или ацетилянтарный ангидрид, известными способами.
Таким образом, конъюгаты антитела против альфа-У-интегрина с цитотоксином согласно изобретению представлены формулой II, в которой майтансинол этерифицируют в положении С-3, и антитело представляет собой антитело против интегриновой субъединицы альфа-У; Κμ В2, X! и Х2 независимо представляют собой Н, Ме, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 углеродных атомов, разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 углеродных атомов, фенильную, замещенную фенильную, или гетероциклическую арильную группу, или гетероциклоалкильную группу; η представляет собой 1-5; р представляет собой 1-5; т представляет собой 1-10.
СЛОЖНЫЙ ЭФИР МАЙТАНСИНОЛА
С ш
II
В предпочтительном варианте линкерный радикал представляет собой 4-тиопентанат, происходящий из 8ΡΡ, или 4-тиопентанат. Молекула антитела, содержащая свободные или защищенные тиольные группы, происходящие таким образом, затем взаимодействует с содержащим дисульфид или тиол токсическими соединениями для продукции конъюгатов. Конъюгаты могут быть очищены путем ВЭЖХ или гель-фильтрацией.
В. Антитела против альфа-У согласно изобретению.
В дополнение к связыванию альфа-У человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты или их части, описанные выше, могут быть выбраны на основании сохранения других функциональных свойств антител согласно изобретению, например:
1) связывание живых клеток, экспрессирующих человеческую альфа-У;
2) предотвращение связывания живых клеток с матриксными белками;
3) связывание с человеческим альфа-У с Кс 10-8 М или менее (например, 10-9 М или 10-10 М или ме- нее);
4) проявление независимого от кальция связывания с альфа-У;
5) связывание с уникальным эпитопом на альфа-У или отношение к уникальной группе комплементарности антител, связывающихся с альфа-У;
6) ингибирование ангиогенеза ίη νίίτο или ίη νίνο или
7) снижение опухолевой массы или предотвращение роста опухоли ίη νίνο.
Еще в одном аспекте изобретения структурные свойства человеческих антител против альфа-У согласно изобретению СЫТО 95 используют для создания структурно родственных человеческих антител против альфа-У, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител согласно изобретению, такое как связывание с альфа-У. Более конкретно, одна или несколько областей СБЯ СЫТО 95 могут комбинироваться рекомбинантно с известными областями каркаса человека и СБЯ для создания дополнительных, сконструированных рекомбинантно человеческих антител против альфа-У согласно изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления антитело для применения в конъюгатах антител против альфа-У, описанных здесь, представляет собой человеческое антитело против альфа-У, происходящее от иммунизации трансгенной мыши, содержащей гены для экспрессии человеческих иммуноглобулинов. Получение антитела описано подробно в публикации РСТ № \¥О 02/12501 и в публикации заявки на выдачу патента США № 2003/040044, причем оба данных источника включены сюда в качестве ссыл
- 9 013323 ки. Антитело включает в себя любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает в себя по меньшей мере часть определяющей комплементарность области (СЭК) тяжелой или легкой цепи, или ее лиганд-связывающую часть, происходящую из антитела, обозначенного «СЫТО 95» (см. публикацию РСТ \УО 02/12501 и публикацию заявки на выдачу патента США № 2003/040044), в комбинации с вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи, константной областью тяжелой или легкой цепи, каркасной областью, или любой частью указанного антитела, которая может встраиваться в антитело.
Предпочтительно СЭК1, 2 и/или 3 описанных выше сконструированных антител включают в себя точную(ые) аминокислотную(ые) последовательность(и), соответствующую(ие) полностью человеческому МаЬ, обозначенному СЫТО 95, Сеи0101, СЫТО 95, С371А, полученные путем иммунизации трансгенной мыши, как описано здесь. Однако обычный специалист в данной области поймет, что может быть возможным некоторое отклонение от точной последовательности СЭК СЫТО 95, при сохранении, тем не менее, способности антитела эффективно связывать альфа-У (например, консервативные замены). В конкретном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут иметь антигенсвязывающую область, которая включает в себя по меньшей мере часть по меньшей мере одной СЭК тяжелой цепи (т.е. СЭК1, СЭК2 и/или СИКЗ), имеющей аминокислотную последовательность соответствующих СЭК1, 2 и/или 3 (например, 8ЕО Ш ЫО: 1, 2 и/или 3). В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающая часть или вариант может иметь антигенсвязывающую область, которая включает в себя по меньшей мере часть по меньшей мере одной СЭК легкой цепи (т.е. СЭК1, СЭК2 и/или СЭК3), имеющей аминокислотную последовательность соответствующих СЭК1, 2 и/или 3 (например, 8ЕО Ш ЫО: 4, 5 и/или 6) легкой цепи СЫТО 95. В предпочтительном варианте осуществления три СЭК тяжелой цепи и три СЭК легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента имеют аминокислотную последовательность соответствующего СЭК тАЬ СЫТО 95. В соответствии с этим в другом варианте осуществления сконструированное антитело может быть составлено из одного или нескольких СЭК, которые, например, на 90, 95, 98 или 99,5% идентичны в отношении одного или нескольких СЭК СЫТО 95. Антитела против альфа-У-субъединицы по настоящему изобретению могут включать в себя в качестве неограничивающих примеров по меньшей мере одну часть, последовательность или комбинацию, выбранную из 5 до всех из следующих друг за другом аминокислот по меньшей мере одной из 8ЕО Ш ЫО: 1-6. Антитело против альфа-У-субъединицы по настоящему изобретению может далее включать в себя полипептид по меньшей мере из одной из 70-100% следующих друг за другом аминокислот по меньшей мере одной из 8ЕО Ш ЫО: 7, 8. Например, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может сравниваться с последовательностью 8ЕО Ш ЫО: 8, или аминокислотная последовательность тяжелой цепи СЭК3 может сравниваться с 8ЕО Ш ЫО: 7.
Как описано и заявлено здесь, последовательности, приведенные в 8ЕО Ш ЫО: 1-8, включают в себя «консервативные модификации последовательности», т.е. модификации аминокислотной последовательности, которые значимо не влияют или не изменяют характеристик антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательности включают в себя аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут вводиться в 8ЕО Ш ЫО: 1-8 или в кодирующие их нуклеиновые кислоты стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-специфический мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают те, в которых аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Данные семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный несущественный аминокислотный остаток в антителе против человеческого альфа-У предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей.
По меньшей мере одно антитело согласно изобретению связывается по меньшей мере с одним конкретным эпитопом, специфичным в отношении по меньшей мере одного белка альфа-У-субъединицы, его субъединицы, фрагмента, части или любой комбинации. По меньшей мере один эпитоп может включать в себя по меньшей мере одну связывающую антитело область, которая включает в себя по меньшей мере одну часть указанного белка, причем данный эпитоп предпочтительно составлен по меньшей мере одной внеклеточной, растворимой, гидрофильной, внешней или цитоплазматической частью указанного белка. По меньшей мере один определенный эпитоп может включать в себя любую комбинацию по меньшей мере одной аминокислотной последовательности по меньшей мере из 1-3 аминокислот до целой определенной части следующих друг за другом аминокислот 8ЕО Ш ЫО: 9.
Как констатировалось ранее, изобретение также относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам, иммуноглобулиновым цепям и СЭК, включающим в себя аминокислоты в последовательности,
- 10 013323 которая по существу соответствует описанной здесь аминокислотной последовательности. Предпочтительно, такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты и антитела, включающие в себя такие цепи или СЭЯ, могут связываться с человеческой альфа-У-субъединицей с высоким сродством (например, Кс меньше или равна примерно 10-9 М). Аминокислотные последовательности, которые являются, по существу, идентичными описанным здесь последовательностям, включают в себя последовательности, включающие в себя консервативные аминокислотные замены, а также делеции и/или вставки аминокислот.
Аминокислоты в антителе против альфа-У-субъединицы по настоящему изобретению, которые существенны для функционирования, могут идентифицироваться способами, известными в данной области, такими как сайт-специфический мутагенез или мутагенез аланинового сканирования (например, АикиЬе1, кирга, Сйар1егк 8, 15; Сипшпдйаш аиб Ае11к, 8с1еисе 244:1081-1085 (1989)). Последняя процедура вводит единичные аланиновые мутации в каждый остаток молекулы. Полученные в результате мутантные молекулы затем тестируют на биологическую активность, например, в качестве неограничивающего примера по меньшей мере на одну активность по нейтрализации альфа-У-субъединицы. Участки, критичные для связывания антитела, также могут идентифицироваться путем структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс и фотоаффинное мечение (8шйй, е1 а1., 1. Мо1. Βίο1. 224:899-904 (1992) и бе Уок, е1 а1., 8с1еисе 255:306-312 (1992)).
3. Способы получения конъюгатов.
Исходное соединение майтансинол, используемый при продукции соединений ΌΜ1, ΌΜ3 и ΌΜ4, и родственные активированные майтансиноида (фиг. 1) согласно изобретению могут быть получены из природного С-3 сложного эфира майтансина, выделенного из природных источников (Кирсйап е1 а1., 1. Атег. Сйет. 8ос. 97, 5294 (1975)) путем восстановительного расщепления. Реагент гидрид литиятриметоксиалюминия в тетрагидрофуране при -40°С особенно подходит для данной стадии. Другие природные сложные эфиры майтансиноидов могут также быть предпочтительно получены путем культивирования микроорганизма, который принадлежит к роду Иосагб1а (патент США № 4151042) или Асбиокуппета крр., которые сконструированы для продукции майтансинола, майтанацина или С-3 сложных эфиров майтансинола, таких как пропионат майтансинола, в культуральном бульоне, и экстракции соединений из культурального бульона для дальнейшей очистки. Имеется много связывающих групп, известных в данной области, для получения конъюгатов антитела и майтансиноида, включая, например, дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, пептидные линкеры, лабильные при воздействии пептидаз или сложные эфиры, которые могут быть кислотолабильными или расщепляемыми эстеразой.
Как описано в патенте США № 5208020, этерификация майтансинола или аналога карбоновыми кислотами, содержащими метилдитиогруппу или другую защищенную тиогруппу, включая, например, Νметил-Ы-[3-(метилдитио)-1-оксопропил]-Ь-аланин, приводит к продукции соответствующих, содержащих дисульфид майтансиноидов. В случае, когда получаются два диастереоизомерных продукта, содержащих Ό- и Ь-ацильные боковые цепи, диастереоизомерные сложные эфиры майтансиноидов легко разделяются способами, известными в данной области, и содержание менее желательного продукта Όаланилового аналога-изомера снижают для получения майтансинола по АО 03096782. Восстановительное расщепление дисульфидной группы дитиотреитом дает соответствующий, содержащий тиол майтансиноид, который легко связывается через дисульфидные или тиоэфирные связи со связывающими клетки агентами. Тиол-майтансиноиды могут быть очищены путем ВЭЖХ с использованием колонки С18 в обращенно-фазовом режиме с элюцией градиентом вода-ацетонитрил.
Бифункциональные реагенты для связывания.
Известно, что при получении конъюгатов двух веществ, из которых по меньшей мере одно включает в себя белок или полипептид, применяют бифункциональные агенты для ковалентного присоединения конъюгата, причем аминогруппы в конъюгированных молекулах обычно используются для реакции конъюгации. Бифункциональные средства для присоединения включают в себя №сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ), сукцинимидил-4-(№малеидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (ΙΤ), бифункциональные производные имидоэфиров, такие как диметиладипимидат-НС1, активные сложные эфиры, такие как дисукцинимидилсуберат, альдегиды, такие как глутаральдегид, бисазидосоединения, такие как бис(п-аксидобензоил)гександиамин, производные бис-диазония, такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин, диизоцианаты, такие как толуол-2,6-диизоцианат, и активные бис-соединения фтора, такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. 8ΡΌΡ находится среди наиболее часто применяемых реагентов для данной цели, и было доказано, что могут использоваться многие другие кислоты, включающие в себя радикалы №сукцинимидил-(2-пиридилтио)-, №сукцинимидил-(5-нитро-2пиридилтио)- или №сукцинимидил-(4-пиридилдитио)-короткоцепочечный алкан. На фиг. 2 показаны структуры обычно используемых бифункциональных линкеров и их акронимов.
Конъюгация активированного антитела с тиолированным майтансиноидом.
Получение конъюгатов ί,’ΝΤΟ 95-майтансиноид проводили, следуя способу, описанному ранее (Сйап е1 а1., Сапсег Век. 52: 127-131, 1992, и патент США 5208020), и как показано на фиг. 3. В данной процедуре антитело модифицировали бифункциональным линкером в отношении линкера к антителу в интервале от 5 до 10 к 1 для введения дитиопиридильных групп на боковые группы аминокислот антите
- 11 013323 ла. Активированное антитело отделяют от остатков линкера хроматографией путем гель-фильтрации на 025. Отношение линкер-антитело после очистки составляет менее 5-10:1 и обычно находится в интервале от 3:1 до 5:1, и его измеряют поглощением при 252 и 280 нм. Активированный тиол-майтансиноид добавляют в молярном избытке по отношению к измеренному линкеру. После конъюгации смесь опять очищают хроматографией путем гель-фильтрации на 025 с получением объединенного продукта.
В качестве альтернативы конъюгат антитела против интегрина и майтансиноида получают, по существу, в одну стадию взаимодействия майтансиноида, несущего реакционноспособный сложный эфир с антителом против интегрина, ранее не активированным химически. Реакционноспособный сложный эфир майтансиноида может быть сложным эфиром Ν-сукцинимидила, Ν-сульфосукцинимидила, Νфталимидила, Ν-сульфофталимидила, 2-нитрофенила, 4-нитрофенила, 2,4-динитрофенила, 3-сульфонил4-нитрофенила или 3-карбокси-4-нитрофенила. Способ описан в публикации XVО 2002098883, содержание которой включено сюда в качестве ссылки.
4. Способы применения конъюгатов согласно изобретению.
Антитела согласно изобретению могут вводиться нуждающемуся в этом субъекту для предотвращения, лечения, управления или ослабления злокачественной опухоли или одного или нескольких ее симптомов. Антитела согласно изобретению могут также вводиться в комбинации с одной или несколькими другими способами лечения, предпочтительно способами лечения, которые могут использоваться для предотвращения, управления или лечения злокачественной опухоли (включая в качестве неограничивающих примеров профилактические или терапевтические средства, перечисленные здесь ниже), нуждающемуся в этом субъекту для предотвращения, лечения, управления или ослабления злокачественной опухоли или одного или нескольких ее симптомов. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу предотвращения, лечения, управления или ослабления злокачественной опухоли или одного или нескольких ее симптомов, причем указанный способ включает в себя нуждающемуся в этом субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества препарата, содержащего конъюгаты против альфа-У-антитела согласно изобретению. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу предотвращения, лечения или ослабления злокачественной опухоли или одного, или нескольких ее симптомов, причем указанный способ включает в себя введение нуждающемуся в этом субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества конъюгатов антитела против альфа-У согласно изобретению в сочетании с профилактически или терапевтически эффективным одним или несколькими способами лечения (например, хирургическое, радиационное лечение, или введение терапевтических средств, отличных от конъюгатов против альфа-У-антитела). Конъюгаты антитела согласно изобретению могут использоваться в качестве первой, второй, третьей или четвертой очереди лечения злокачественной опухоли. Изобретение относится к способам лечения или ослабления у субъекта одного или нескольких симптомов злокачественной опухоли. Далее изобретение относится к способам предотвращения рецидива злокачественной опухоли у пациентов, которых лечили и которые не имели активности заболевания, после введения конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению.
Злокачественные опухоли, которые можно лечить способами согласно изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров неоплазии, опухоли, метастазы или любое заболевание или нарушение, характеризующееся неконтролируемым ростом клеток. Злокачественная опухоль может представлять собой первичную или метастазирующую злокачественную опухоль. Злокачественные клетки могут экспрессировать интегрины с альфа-У-субъединицей или могут не экспрессировать данные белки. В предпочтительном варианте осуществления злокачественная опухоль, которую контролируют, лечат или ослабляют ее воздействие согласно способам согласно изобретению, представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую альфа-У-субъединицу интегрина, и она метастазирует в другой участок или орган в организме пациента или имеет потенциал для метастазирования. Конкретные примеры злокачественных опухолей, которые можно лечить способами согласно изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров злокачественные опухоли головы, шеи, рта, горла, пищевода, грудной клетки, кости, легких, толстого кишечника, прямой кишки, желудка, предстательной железы, молочной железы, яичников, почки, печени, поджелудочной железы и головного мозга. Дополнительные злокачественные опухоли включают в себя в качестве неограничивающих примеров следующее: лейкозы, неограничивающими примерами которых являются острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острые миелоцитарные лейкозы, такие как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз, эритролейкоз и миелодиспластический синдром, хронические лейкозы, неограничивающими примерами которых являются хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосато-клеточный лейкоз; истинная полицитемия; лимфомы, неограничивающими примерами которых являются болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома; миеломы, такие как множественная миелома, несекреторная миелома, остеосклеротическая миелома, лейкоз плазматических клеток, солитарная плазмацитома и экстрамедуллярная плазмацитома; макроглобулинемия Вальденстрема; злокачественную опухоль костей и саркомы соединительной ткани, такие как саркома кости, миеломная болезнь кости, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга, болезнь костей Педжета, злокачественная гигантоклеточная опухоль, фибросаркома кости, хордома, периостеальная
- 12 013323 саркома, мягкоклеточные саркомы, ангиосаркома (гемангиосаркома), фибросаркома, саркома Капоши, леймиосаркома, липосаркома, лимфангиосаркома, неврилеммома, рабдомиосаркома, синовиальная саркома; опухоли головного мозга, неограничивающими примерами которых являются глиома, астроцитома, неглиальная опухоль, акустическая невринома, краниофарингиома, медуллобластома, менингиома, пинеоцитома, пинеобластома, первичная опухоль головного мозга; рак молочной железы, включающий в себя аденокарциному и интрадуктальную карциному, и папиллярный рак молочной железы; рак надпочечников, включающий в себя феохромоцитому и адренокортикальную карциному; рак щитовидной железы; рак поджелудочной железы; злокачественные опухоли гипофиза; злокачественные опухоли глаза, неограничивающими примерами которых являются окулярная меланома, хороидная меланома, меланома цилиарного тела и ретинобластома; вагинальные злокачественные опухоли; рак вульвы; злокачественные опухоли шейки матки; злокачественные опухоли матки, неограничивающими примерами которых являются карцинома, эндометрия и саркома матки; злокачественные опухоли яичника; злокачественные опухоли пищевода и другие злокачественные опухоли головы и шеи, неограничивающими примерами которых являются плоскоклеточный рак, аденокарцинома, мукоэпидермоидная карцинома, аденоплоскоклеточная карцинома, саркома, меланома, плазмацитома, бородавчатая карцинома и зерноклеточная (мелкоклеточная) карцинома; злокачественные опухоли желудка; злокачественные опухоли толстого кишечника; злокачественные опухоли прямой кишки; злокачественные опухоли печени, такие как гепатоцеллюлярная карцинома и гепатобластома, злокачественные опухоли желчного пузыря; холангиокарциномы; злокачественные опухоли легких, такие как немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома (эпидермоидная карцинома), аденокарцинома, крупноклеточная карцинома и мелкоклеточный рак легких; злокачественные опухоли яичек, хориокарцинома (опухоль желточного мешка), злокачественные опухоли предстательной железы; злокачественной опухоли ротовой полости, не ограниченные плоскоклеточной карциномой; базальные злокачественные опухоли; злокачественные опухоли слюнной железы; почечно-клеточный рак и другие злокачественные опухоли почки; и злокачественные опухоли мочевого пузыря, не ограниченные переходно-клеточной карциномой (для обзора по таким заболеваниям см. Эе Уйа, У.Т., Не11тап, 8. & КокепЬетд, 8.Ά. Сапсег: Рппар1ек апб ртасйсе οί опсо1оду. РЫ1абе1рЫа: 1. В. Ырр1псой Сотрапу; 6111 Ебйюп, 2001). Способами и композициями согласно изобретению также можно лечить предзлокачественные состояния. Такие злокачественные опухоли могут включать в себя в качестве неограничивающих примеров фолликулярные лимфомы, карциномы с мутациями р53, гормонозависимые опухоли молочной железы, предстательной железы и яичника, и предраковые повреждения, такие как семейный аденоматозный полипоз и миелодиспластические синдромы.
В предпочтительном варианте осуществления злокачественная опухоль, которую предотвращают, контролируют, лечат или ослабляют ее воздействие способом согласно изобретению, выбрана из рака предстательной железы, рака молочной железы, злокачественной опухоли кости, меланомы, рака легких и рака яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, которую предотвращают, контролируют, лечат или ослабляют ее воздействие способом согласно изобретению, выбрана из метастазирующих опухолей, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров опухоли, которые имеют или не имеют метастазов в кости (неограничивающие примеры представляют собой злокачественные опухоли предстательной железы, молочной железы и легких, которые метастазируют или имеют потенциал для метастазирования в кость), опухоли, которые метастазируют или могут метастазировать в легкие, опухоли, которые метастазируют или могут метастазировать в головной мозг, и опухоли, которые метастазируют или могут метастазировать в другие органы или ткани субъекта.
Способы лечения злокачественных опухолей.
Любое средство или вид лечения (например, виды химиотерапии, радиационной терапии, гормональной терапии и/или биологической терапии, или иммунотерапии), которые известны, применялись или в настоящее время применяются для профилактики, лечения, управления или ослабления воздействия злокачественной опухоли, или одного, или нескольких ее симптомов, могут использоваться в комбинации с конъюгатом с антителом против альфа-У согласно изобретению в соответствии с описанным здесь изобретением. Терапевтические или профилактические средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров пептиды, полипептиды, белки, белки слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, малые молекулы, средства-миметики, синтетические лекарственные средства, неорганические молекулы и органические молекулы. Неограничивающие примеры классов таких средств (т.е. противораковых средств) цитотоксины, ингибиторы ангиогенеза и средства, используемые для предоставления облегчения боли или для отмены повреждающих эффектов одного или нескольких терапевтических средств (например, применение бифосфоната для снижения гиперкальцемических эффектов глюкокортикоидов).
Биологические иммуномодулирующие средства включают в себя антитела против Т-клеточного рецептора, такие как антитела против СЭЗ (например, Ыцуюп (Рто1еш Эекщп ЬаЬк), ОКТ3 (1ойпкоп & 1ойпкоп), или антитела против СЭ20 Кйихап (ЮЕС)), антитела против СЭ52 (например, САМРАТН 1Н (11ех)), антитела против СЭ11а (например, Хапейт (Сепеп1есй)); антитела и антагонисты против цитокина или против рецептора цитокина, такие как антитела против рецептора 1Б-2 (Сепарах (Рто1ет Эекщп ЬаЬк)), антитела против рецептора 1Ь-6 (например, МКА (Сйида1)) и антитела против 1Б-12 (СЫТО 1275 (СеШосот)), антитела против ТЫЕ-альфа (Кеткабе (СеШосот)) или антагонист рецептора ΊΝΕ (ЕпЬге1
- 13 013323 (1ттипех)), антитела против 1Ь-б (ВЕ8 (Э1ас1опе) и ΟΝΤΘ328 (Сеи1осог)),и антитела, которые иммуноспецифично связываются с опухолеассоциированными антигенами (например, трастузимаб (СеиеШесН).
Ингибиторы ангиогенеза (т.е. антиангиогенные агенты) включают в качестве неограничиващих примеров ангиостатин (фрагмент плазминогена); антиангиогенный антитромбина III; ангиозим. Бифосфонаты включают в себя в качестве неограничивающих примеров алендронат; клодронат; этидронат; ибадронат; памидронат; ризедронат; тилудронат и золедронат.
Неограничивающие конкретные примеры противораковых средств; которые могут быть использованы в соответствии со способами согласно изобретению; включают в себя 5-фторурацил; ацивицин; альдеслейкин; альтретамин; аминоглутетимид; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназу; азацитидин; ацетепу; азотомицин; батимистат; бикалутамид; блеомицина сульфат; бреквинар натрия; бропиримин; бусульфан; карбоплатин; кармустин; гидрохлорид карубицина; карцелезин; цедефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; криснатола мезилат; циклофосфамид; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; даунорубицина гидрохлорид; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; дезагуанина мезилат; диазихон; доцетаксел; доксорубицин; доксорубицина гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифена цитрат; дромостанолона пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфлорнитина гидрохлорид; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицина гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицина гидрохлорид; эстрамустин; экстрамустина натрия фосфат; этанидазол; этопозид; этопозида фосфат; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабина фосфат; фторурацил; флуроцитабин; фосквидон; фостриецин натрия; гемцитабин; гемцитабина гидрохлорид; гидроксимочевину; идарубицина гидрохлорид; ифосфамид; ильмофосин; интерлейки II (включая рекомбинантный интерлейкин II; или г1Ь2); интерферон альфа-2а; интерферон альфа-2Ь; интерферона альфа-т; интерферон альфа-и3; интерферон бетаИа; интерферон гамма-й; ипроплатин; иринотекана гидрохлорид; ланреотида ацетат; летрозол; лейпролида ацетат; лиарозола гидрохлорид; лометрексол натрия; ломустин; лозоксантрона гидрохлорид; мазопрокол; мехлорэтамина гидрохлорид; мегестрола ацетат; меленгестрола ацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрия; метоприн; метуредэпу; митомицин; митоспер; митотан; митоксантрона гидрохлорид; микофеноловую кислоту; нокодазол; ормаплатин; паклитаксел; пегаспаргазу; порфромицин; преднимустин; прокарбазина гидрохлорид; пуромицин; роглетимид; сафингола гидрохлорид; семустин; симтразен; спарфосат натрия; спарсомицин; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенер; тализомицин; тегафур; телоксантрона гидрохлорид; темопорфин; тенипосид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепу; тиазофурин; тирапазамин; топотекан; триметрексат; триметрексата глюкуронат; трипторелин; урацил-мустард; уредепу; вапреотид; вертепорфин; винбластина сульфат; винкристина сульфат; виндезин; виндезина сульфат; винепиридина сульфат; винглицината сульфат; винлейрозина сульфат; винорельбина тартрат; винросидина сульфат; винзолидина сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; зорубицина гидрохлорид.
Изобретение также относится к введению антитела согласно изобретению в комбинации с радиационной терапией, включающей в себя применение рентгеновских лучей, гамма-лучей и других источников радиации для разрушения раковых клеток. В предпочтительных вариантах осуществления радиационное лечение осуществляют путем облучения внешним пучком или телетерапии, в которой радиация направляется из удаленного источника. В других предпочтительных вариантах осуществления радиационное лечение осуществляют путем внутренней терапии или брахитерапии, в которой радиоактивный источник помещают внутри организма вблизи злокачественных клеток или опухолевой массы.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с раком молочной железы вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата против антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с введением профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких средств, которые могут использоваться для лечения рака молочной железы, включая в качестве неограничивающих примеров доксорубицин, эпирубицин, комбинацию доксорубицина и циклофосфамида (АС), комбинацию циклофосфамида, доксорубицина и 5-фторурацила (САР), комбинацию циклофосфамида, эпирубицина и 5-фторурацила (СЕЕ), или другие средства, например, герцептин, тамоксифен, паклитаксел или таксотер.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с раком предстательной железы вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата против антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с введением профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких средств, которые могут использоваться для лечения рака предстательной железы, включая в качестве неограничивающих примеров радиационную терапию внешним пучком; интерстициальную имплантацию радиоизотопов, т. е. рения, палладия или иридия; лейпролид или другие антагонисты ЬНКН, нестероидные антиандрогены (флутамид, нилутамид, бикалутамид), стероидные антиандрогены (ципротерона ацетат), комбинацию лейпролида и флутамида, экстрогены, такие как ЭЕ8, этинилэкстрадиол; преднизон в низкой дозе, или другие режимы химиотерапии, о которых сообщали, что они приводили к субъективному улучшению симптомов и снижению уровня Р8А.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с раком яичника вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с введением профилактически или терапевтически эффективного количества одного или
- 14 013323 нескольких средств, которые могут использоваться для лечения рака яичника, включая в качестве неограничивающих примеров: внутрибрюшинную радиационную терапию, такую как терапию 32Р; общую абдоминальную или тазовую радиационную терапию, цисплатин, комбинацию паклитаксела (таксол) или доцетаксела (таксотер) и цисплатина или карбоплатина, комбинацию циклофосфамида и цисплатина, комбинацию циклофосфамида и карбоплатина, комбинацию 5-Еи и лейковорина, этопозид, липосомальный доксорубицин, гемцитабин, ифосфамид, гексаметилмеламин (НММ) или топотекан.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с метастазами опухоли в кости вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с введением профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких средств, которые могут использоваться для лечения метастазов опухоли в кости, включая в качестве неограничивающих примеров: средства или виды лечения, применяемые при лечении основной злокачественной опухоли, такие как ингибиторы гормонов для рака предстательной железы или молочной железы, метастазирующего в кости, радиотерапию или химиотерапию с проникающими в кости радиоизотопами металлов (стронций-89 и самарий-153) и бифосфонатами (например, палмидронат или алендронат). Виды лечения злокачественной опухоли и их дозировки, пути введения и рекомендованные способы применения известны в данной области и описаны в такой литературе, как РйумаапЕ Искк ЯсГсгспсс (57(Н сб., 2003), доступной в настоящее время через Интернет путем подписки на ΡΌΒ(Β) Е1сс1гоп1с ЫЬгагу, Тйошкоп Мюгошсбсх, Сгсстсооб УШадс, Со1огабо (Εάίΐίοη 2004).
Лечение воспалительных нарушений.
Конъюгаты антитела против альфа-У согласно изобретению могут вводиться нуждающемуся в этом субъекту для предотвращения лечения или ослабления воспалительного нарушения, или одного, или нескольких его симптомов. Антитела согласно изобретению могут также вводиться в комбинации с одним или несколькими другими видами лечения, предпочтительно с теми, которые могут использоваться для предотвращения, управления, лечения или ослабления воспалительного нарушения (включая в качестве неограничивающих примеров профилактические или терапевтические средства, перечисленные здесь и ниже), нуждающемуся в этом субъекту для предотвращения, управления, лечения или ослабления воспалительного нарушения или одного, или нескольких его симптомов.
Воспалительные нарушения, которые можно лечить способами согласно изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров астму, энцефалит, воспалительное заболевание кишечника, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), аллергические нарушения, септический шок, легочный фиброз, недифференцированную спондилоартропатию, недифференцированную артропатию, артрит, остеоартрит, спондилоартропатии (например, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера (реактивный артрит), воспалительный остеолиз, болезнь Вильсона и хроническое воспаление вследствие вирусных и бактериальных инфекций. Кроме того, аутоиммунные нарушения ассоциированы с воспалительной патологией.
Виды противовоспалительного лечения.
Настоящее изобретение относится к способам профилактики, управления, лечения или ослабления воспалительного заболевания или одного, или нескольких его симптомов, причем указанные, способы включают в себя введение нуждающемуся в этом субъекту конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению и одной или нескольких способов лечения (например, профилактических или терапевтических средств, отличных от антител или фрагментов антител, которые иммуноспецифично связываются с интегринами альфа-У. Любое средство или вид лечения, которые известны, применялись или в настоящее время применяются для профилактики, лечения, управления или ослабления воспалительного нарушения или одного или нескольких его симптомов, могут использоваться в комбинации с конъюгатом антитела против альфа-У согласно изобретению в соответствии с описанным здесь изобретением. Неограничивающие примеры таких средств включают в себя иммуномодулирующие средства, антиангиогенные средства, противовоспалительные средства и антагонисты ΤΝΕ-альфа.
Конкретные примеры иммуномодулирующих средств, которые могут быть введены в комбинации с конъюгатом антитела против альфа-У согласно изобретению субъекту с воспалительным нарушением, включают в себя метотрексат, лефлуномид, циклофосфамид, цитоксан, нуран, циклоспорин А, миноциклин, азатиоприн, антибиотики (например, ЕК506 (такролимус)), метилпреднизолон (МР), кортикостероиды, стероиды, микофенолат мофетил, рапамицин (сиролимус), лефлунамид, антитела против Т-клеточного рецептора (например, Ог11юс1опс ОКТ3 (бойшоп & бойпкоп), Шсюп (Рго1сш Эсмдп ЬаЬк), или антитела против СИ20 (Кйихап (ГОЕС)), антитела против СИ52 (например, САМРАТН 1Н (11сх)), антитела против рецептора 1Ь-2 (например, 2спарах (Рго1сш Эсмдп ЬаЬк)), антитела против 1Ь6 (СОТО 328, СсШосог) или антитела против рецептора 1Ь-6 (МКА, Сйида1) и антитела против 1Б-12 (С№ТО1275, СспФсог), антитела против ΙΕΝ, антитела против ΤΝΕ, антитела против 1Ь-1, антагонисты 1Ь-1 альфа/бета.
Примеры антагонистов ΤΝΕ-альфа, которые могут вводиться в комбинации с конъюгатами против антитела альфа-У согласно изобретению субъекту с воспалительным нарушением, включают в себя белки, полипептиды, пептиды, белки слияния, антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), такие как антитела, которые иммуноспецифически связываются с ΤΝΕ-альфа, молекулы нуклеиновой кислоты (на
- 15 013323 пример, антисмысловые молекулы или тройные спирали), органические молекулы, неорганические молекулы и малые молекулы, которые блокируют, снижают, ингибируют или нейтрализуют функцию, активность и/или экспрессию ТЫР-альфа. Примеры антагонистов ТЫР-альфа включают в себя инфликсимаб (КЕМ1САЭЕ; Сеп1осот), Э2Е7 (НИМАКА; АЬЬой БайогаЮпсх/КпоИ РйагтасеиОсаЬ Со., Μΐ. Ойуе, ЫЭ.), СЭР57Е который так же известен, как НЬМ1САЭЕ и СЭР-870 (оба - от СеШесй/Рйаттааа, 81оидй, Великобритания), ТЫР-К1 (Атдеп), этанерцепт (ЕЫВКЕЬ; 1ттипех), и ингибиторы других представителей надсемейства рецепторов ТЫРК. Другие антагонисты ТЫР, относящиеся к изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров 1Ь-10, которые, как известно, блокируют продукцию ТЫРальфа, и средства против р38 МАРК.
Неограничивающие примеры противовоспалительных средств, которые могут вводиться в комбинации с конъюгатом антитела против альфа-У согласно изобретению субъекту с воспалительным нарушением, включают в себя нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (Ы8АШ), стероидные противовоспалительные средства, бета-агонисты, антихолинергические средства и метилксантины. Неограничивающие примеры Ы8А1Э включают в себя аспирин, ибупрофен, целекоксиб (СЕЬЕВКЕХ), диклофенак (УОЬТАКЕЫ), этодолак НОЭШЕ), фенопрофен (ЫАЬРОЫ), индометацин (1ЫЭОС1Ы), кеторолак (ТОКАВОЕ), оксапрозин (□АУРЕО), набументон (КЕЬАРЕЫ), сулиндак (СЬ1ЫОК1Ь), толментин (ТОЬЕСТ1Ы), рофекоксиб (У1ОХХ), напроксен (АЬЕУЕ, ЫАРКО8УЫ), кетопрофен (АСТКОЫ) и набуметон (КЕЬАРЕЫ). Такие Ы8А1Э функционируют путем ингибирования фермента циклоксигеназы (например, СОХ-1 и/или СОХ-2). Неограничивающие примеры стероидных противовоспалительных средств включают в себя глюкокортикоиды, дексаметазон ^ЕСАОКОЫ), кортизон, гидрокортизон, преднизон ^ЕЬТА8ОЫЕ), преднизолон и триамцинолон.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с остеоартритом вводят в профилактически или терапевтически эффективном количестве конъюгат антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с другими средствами или видами лечения, которые могут использоваться для предотвращения, лечения, управления или ослабления остеоартрита, включая в качестве неограничивающих примеров: анальгетики, такие как ацетаминофен, фенацетин; и трамадол, Ы8АШ, такие как аспирин, дифлунизал, диклофенак, этодолак, фенаматы, фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, метилсалицилат, небуметон, напроксин, оксапразин, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак и толметин; специфичные в отношении циклооксигеназы (Сох)-2 ингибиторы (С81), такие как целекоксиб и рофекоксиб; внутри-околосуставную препаратов-депо, например, глюкокортикоидов или биофармацевтических средств, и внутрисуставную инъекцию гиалуроновой кислоты. Конъюгаты антитела против альфа-У согласно изобретению могут также использоваться в комбинации с другими нефармакологическими мерами при предотвращении, лечении, управлении и ослаблении остеоартрита, включая в качестве неограничивающих примеров промывание остеоартритного сустава, снижение загрузки сустава; применение тепла или холода на пораженный сустав; мазь капсаицина; упражнения и другие виды физического лечения, и хирургическая замена сустава.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с ревматоидным артритом вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с другими средствами или видами лечения, которые могут использоваться для предотвращения, лечения, управления или ослабления ревматоидного артрита, включая в качестве неограничивающих примеров: Ы8АШ, анальгетики и С81, которые обсуждались, для остеоартрита. Кроме того, другие виды лечения могут использоваться одновременно, перед или после введения антитела против альфа-У согласно изобретению, например, ежемесячные введения глюкокортикоидов в высокой дозе или внутрисуставное введение глюкокортикоидов; модулирующие заболевание противоревматические лекарственные средства ^МАКЭ), включая метотрексат, соединения золота (например, ауранофин), Эпеницилламин, антималярийные препараты (например, хлорохин) и сульфалазин; нейтрализующие ТЫРальфа средства, такие как этанецепт и инфликсимаб; иммуносупрессорные и цитотоксические средства, неограничивающими примерами которых являются азатиоприн, лефлуномид, циклоспорин и циклофосфамид; и хирургические вмешательства, такие как артропластика, полное удаление сустава, реконструктивная хирургия руки, открытая или атрокопическая синовиоэктомия и ранняя теносиновиоэктомия кисти; внешние вмешательства, такие как различные биопротезы и вспомогательные устройства, и другие физические виды лечения; и диетические добавки, такие как повышенный прием омега-3-жирных кислот (таких как эйкозапентановая кислота).
В конкретных вариантах осуществления пациентам с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с другими средствами или видами лечения, которые могут использоваться для предотвращения, лечения, управления или ослабления ХОБЛ, включая в качестве неограничивающих примеров: бронходилататоры, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров бета-адренергические агонисты короткого и длительного действия, такие как альбутерол, пирбутерол, тербуталин и метапротеренол, пероральный альбутерол с замедленным высвобождением и ингалируемый сальметерол; антихолинергические препараты, такие как ипратропиум-бромид и теофиллин и его производные; глюкокортикоиды; кислород; пересадку легких; хирургическую операцию по
- 16 013323 снижению объема легких; эндотрахеальную интубацию, поддержку вентиляции; ежегодное вакцинирование от гриппа и пневмококка; физические упражнения; и отмену курения.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с фиброзом легких вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с другими средствами или видами лечения, которые могут использоваться для предотвращения, лечения, управления или ослабления фиброза легких, включая в качестве неограничивающих примеров: кислород; кортикостероиды; цитотоксические лекарственные средства (циклофосфамид или азатиоприн); бронходилататоры, такие как бета-адренергические агонисты короткого и длительного типа действия, антихолинэргетики и теофиллин и его производные); и антигистаминные препараты (дифенгидрамин и доксиламин).
В конкретных вариантах осуществления пациентам с астмой вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с другими средствами или видами лечения, которые могут использоваться для лечения астмы, включая в качестве неограничивающих примеров: катехоламины, например, норадреналин, изопротеренол и изоэтарин; резорцинолы, например, метапротеренол, тербуталин и фенотерол; и салигенины, например, сальбутамол; метилксантины, включая теофиллин и его различные соли; антихолинергетики, включая атропина сульфат, акопина метилнитрат и ипратропиум-бромид; глюкокортикоиды; стабилизирующие тучные средства кромолин натрия и недокромил натрия; модуляторы лейкотриена зилейтон, зафирлукаст и монтелукаст; иммуносупрессорные средства, включая метотрексат; и ацетилцистеин.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с аллергией вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с другими средствами или видами лечения, которые могут использоваться для лечения аллергии, включая в качестве неограничивающих примеров: кромолин; антигистамины; средствасимпатомиметики (альфа-адренергические и бета-адренергические лекарственные средства); теофиллин и его производные; глюкокортикоиды; и средства лечения, десенситизирующие иммунную систему инъекциями аллергена.
Лечение аутоиммунного нарушения.
Конъюгат антитела против альфа-У согласно изобретению может вводиться нуждающемуся в этом субъекту для предотвращения, управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения или его одного, или нескольких симптомов. Конъюгат антитела против альфа-У согласно изобретению также может вводиться в комбинации с одним или несколькими другими видами лечения, предпочтительно, видами лечения, которые могут использоваться для профилактики, управления или лечения аутоиммунного нарушения (включая в качестве неограничивающих примеров терапевтические средства, перечисленные здесь ниже), нуждающемуся в этом субъекту для профилактики, управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения или одного, или нескольких его симптомов. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу профилактики, управления, лечения или ослабления аутоиммунного заболевания или одного, или нескольких его симптомов, причем указанный способ включает в себя введение нуждающемуся в этом субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества жидкого препарата согласно изобретению.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу предотвращения, управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения или одного, или нескольких его симптомов, причем указанный способ относится к введению нуждающемуся в этом субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества жидкого препарата согласно изобретению и дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких видов лечения (например, профилактических или терапевтических средств), отличных от антител или фрагментов антител, которые иммуноспецифично связываются с альфа-У-интегринами.
Изобретение относится к способам управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения или одного, или нескольких его симптомов у субъекта, рефрактерного к обычным видам лечения такого аутоиммунного заболевания, причем указанные способы включают в себя введение указанному субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества антител согласно изобретению. Изобретение также относится к способам управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения или одного, или нескольких его симптомов у субъекта, устойчивого к существующим видам лечения такого аутоиммунного заболевания одним средством, причем указанные способы включают в себя введение указанному субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению и дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких видов лечения (например, профилактических или терапевтических средств), отличных от антител или фрагментов антитела, которые иммуноспецифически связываются с альфа-У-интегрином.
Изобретение также относится к способам управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения или одного, или нескольких его симптомов путем введения конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в комбинации с любым другим лечением пациентам, у которых подтверждена рефрактерность к другим видам лечения, но их при этом не лечат ими. Изобретение также относится к
- 17 013323 альтернативным способам управления или лечения аутоиммунного нарушения, в которых другой вид лечения, как доказано или может быть доказано, является слишком токсичным, т.е. приводит к неприемлемым или непереносимым побочным эффектам для подвергающегося лечению субъекта.
В частности, изобретение относится к альтернативным способам управления или лечения аутоиммунного нарушения, в которых пациент устойчив к другим видам лечения. Далее изобретение относится к способам предотвращения аутоиммунного нарушения у пациентов, которых лечили введением конъюгата антитела против альфа-У и которые не имели при этом активности данного заболевания.
При аутоиммунных нарушениях иммунная система переключает иммунный ответ при том, что нет чужеродных соединений, с которыми надо бороться, и обычно защищающая иммунная система вызывает повреждение своих собственных тканей, по ошибке атакуя их. Имеется много различных аутоиммунных заболеваний, которые повреждают организм различными путями. Например, головной мозг повреждается у субъектов рассеянным склерозом, кишечник у субъектов повреждается болезнью Крона, а синовий, кость и хрящ различных суставов у субъектов повреждается ревматоидным артритом. Аутоиммунные заболевания прогрессируют, может произойти разрушение одного или нескольких типов тканей организма, ненормальный рост органа, который может сопровождаться неоваскуляризацией указанного органа или ткани, или изменение функции органа. Аутоиммунное нарушение может затрагивать только один орган или тип ткани, или поражает множественные органы и ткани. Органы и ткани, обычно подверженные аутоиммунным нарушениям, включают в себя красные кровяные клетки, кровеносные сосуды, соединительные ткани, эндокринные железы (например, щитовидную или поджелудочную железу), мышцы, суставы и кожу. Примеры аутоиммунных нарушений, которые можно лечить способами согласно изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров очаговую алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунную тромбоцитопению, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, синдром мальадсорбции - дерматит, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (СГГО8), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, гранулематозный аллергический ангиит, рубцовый пемфигоид, синдром СКЕ8Т, болезнь холодового агглютинина, болезнь Крона, дискоидную волчанку, врожденную смешанную криоглобулинемию, фибромиалгиюфибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, миелополирадикулоневрит, тироидит Хасимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ΙΓΡ), невропатию 1дА, ювенильный артрит, плоский лишай, волчаночный эритрематоз, болезнь Меньера, смешанную болезнь соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет I типа или иммунологически опосредованный сахарный диабет, миастению гравис, обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярный синдром, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена-Ларсена, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулиты, такие как дерматит-герпесовидный васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.
Виды лечения аутоиммунных заболеваний и их дозировки, пути введения и рекомендации по применению известны в данной области и описаны в такой литературе, как Ρΐινδίοίαη'δ Эс^к КеГегепсе (56(Н ей., 2002 апй 57Ш ей., 2003).
Настоящее изобретение относится к способам предотвращения, управления, лечения или ослабления либо только аутоиммунного нарушения как такового, либо нескольких его симптомов, причем указанные способы включают в себя введение нуждающемуся в этом пациенту конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению и одного или нескольких видов лечения (например, профилактических или терапевтических средств), отличных от антител и фрагментов антител, которые иммуноспецифически связываются с альфа-У-интегринами. Любое средство или вид лечения, который, как известно, может использоваться или использовался для предотвращения, управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения либо как такового, либо нескольких его симптомов, может использоваться в комбинации с описанным здесь конъюгатом антитела против альфа-У согласно изобретению. Неограничивающие примеры таких средств включают в себя иммуномодулирующие средства, противовоспалительные средства и антагонисты ТЫГ-альфа. Конкретные примеры иммуномодулирующих средств, противовоспалительных средств и антагонистов ТЫГ-альфа, которые могут использоваться в сочетании с конъюгатом антитела против альфа-У согласно изобретению для профилактики, управления, лечения или ослабления аутоиммунного нарушения, описаны здесь выше. В конкретных вариантах осуществления пациентам с рассеянным склерозом (ТС) вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в сочетании с другими средствами или видами терапии, которые могут использоваться при предотвращении, лечении, управлении и ослаблении ΡΟ включая в качестве неограничивающих примеров 1ГЫ-бета-1Ь (Ве!а§егоп) и 1ГЫ-альфа-2а (Ауопех); глатирамер-ацетат (Сорахопе); митоксантрон; метотрексат; циклофосфамид; внутривенный иммуноглобулин; глюкокортикоиды; метилпреднизолон; 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин); баклофен (перораль- 18 013323 но или интратекально через стационарный катетер); циклоэнзаприна гидрохлорид; клоназепам; клонидина гидрохлорид; карбамазепин; габапентин; амитриптилин; примидон; ондансетрон; изониазид; оксибутинин; толтеродин; пропантелин; бетанекол; теразолина гидрохлорид; силденафила цитрат; амантадин; пемолин; витамины в высоких дозах; оротат кальция; ганцикловир; антибиотик; и замену плазмы. В конкретных вариантах осуществления пациентам с псориазом вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в сочетании с другими средствами или видами терапии, которые могут использоваться при предотвращении, лечении, управлении и ослаблении псориаза, включая местные, содержащие стероиды препараты; тар (Еб1аг, Р8опде1, крем Ро1о1аг); аналоги витамина Ό для местного введения, такие как мазь кальпотриена; ультрафиолетовое облучение с псораленом или без него; метотрексат; циклоспорин; сульфасалазин; и синтетические ретиноиды.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с болезнью Крона вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в сочетании с другими средствами или видами терапии, которые могут использоваться при предотвращении, лечении, управлении и ослаблении болезни Крона, включая в качестве неограничивающих примеров средства против диареи (лоперамид, дифеноксилат с атопином, холестирамин или колестипол); спазмолитики (пропантелин, дицикломин или гиосциамин); средства на основе 5-аминосалициловой кислоты (сульфалазин, мезаламин (Л§асо1) и его форма с замедленным высвобождением (Реп1а§а); кортикостероиды; иммуномодуляторные лекарственные средства, которые могут использоваться в ревматических заболеваниях - азатиоприн, меркаптопурин, циклоспорин и метотрексат; антибиотики; ингибиторы ΤΝΕ, включая энтерасепт и инфликсимаб; иммуносупрессорные средства, включая такролимус, микофенолат мофетил и талидомид; нутриционные виды лечения; энтеральные виды лечения с элементными диетами (например, прием У1уопех в течение 4 недель); и общее парентеральное питание.
В конкретных вариантах осуществления пациентам с системной красной волчанкой вводят профилактически или терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против альфа-У согласно изобретению в сочетании с другими средствами или видами терапии, которые могут использоваться при предотвращении, лечении, управлении и ослаблении системной красной волчанки, включая в качестве неограничивающих примеров: противомалярийные средства (включая в качестве неограничивающих примеров гидроксихлорохин); глюкокортикоиды (например, может использоваться внутривенная импульсная терапия с низкой дозировкой или высокой дозировкой); иммуносупрессорные и иммуномодулирующие средства, включая циклофосфамид, хлорамбуцил и азатиоприн, метотрексат и микофенолат мофетил; андрогенные стероиды (включая в качестве неограничивающих примеров даназол); и антикоагулянты (включая в качестве неограничивающих примеров варфарин).
Незлокачественные или связанные с иммунитетом пролиферативные заболевания.
Конъюгаты согласно изобретению также могут использоваться для лечения незлокачественных пролиферативных заболеваний и особенно тех, в которых используется ангиогенез. Ангиогенез известен как фактор, играющий роль в некоторых патологических состояниях, включая в дополнение к тому, что он обеспечивает способность опухолей расти и метастазировать, в нарушениях глаза, включая ретинопатии, и в нарушениях кожи, включая псориаз и саркому Капоши. Репрезентативные примеры таких не относящихся к опухолям зависимых от ангиогенеза заболеваний включают в себя неоваскуляризацию роговицы, гипертрофические шрамы и келоиды, пролиферативную диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, артериовенозные мальформации (обсуждаемые выше), атеросклеротические бляшки и ишемическую болезнь сердца, замедленное заживление ран, гемофильные суставы, несрастание переломов, синдром Рандю-Ослера-Вебера, псориаз, обыкновенную пузырчатку, синдром Бехчета, острый респираторный дистресс-синдром (ΑΚΌ8), пиогенную гранулому, склеродермию, трахому, меноррагию (обсуждалось выше) и адгезию сосудов.
5. Фармацевтические композиции.
Изобретение относится к стабильным препаратам конъюгатов антител против альфа-У и майтансиноидов, которые предпочтительно представляют собой водный фосфатно-солевой буферный или смешанный раствор, а также консервированные растворы и препараты, содержащие консервант, а также консервированные препараты многократного применения, подходящие для фармацевтического или ветеринарного применения, включающие в себя по меньшей мере один конъюгат антитела против альфа-У и майтансиноида в фармацевтически приемлемом препарате. Предпочтительные консерванты включают в себя те консерванты, которые выбраны из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и т.п.), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, дегидроацетата натрия и тимерозала или их смесей.
По меньшей мере один конъюгат антитела против альфа-У и майтансиноида в описанных здесь стабильных или консервированных препаратах или растворах может вводиться пациенту в соответствии с настоящим изобретением различными способами доставки, включающими в себя п./к. или в./м. инъекцию; чрескожный путь, легочный путь, введение через слизистые оболочки, имплантацию, осмотический насос, картридж, микронасос или другие средства, понятные и хорошо известные специалисту в данной области.
- 19 013323
6. Фармацевтические препараты.
В предпочтительном способе введения ί'ΝΤΟ 95-майтансиноида лекарственное вещество вводится внутривенно по предварительно установленному катетеру, укомплектованному сумкой для инфузий. ί’ΝΤΟ 95-мертансин поставляется в 20 мл одноразовых сосудах от 1ттипо6еп, 1пс. (СатЬпбде, Массачусетс). Каждый сосуд содержит белок в концентрации от 0,05 примерно до 2,0 мг/мл в буферном растворе (рН 6,5±0,5), состоящем из одноосновного фосфата калия (0,57 мг/мл), одноосновного фосфатамоногидрата натрия (0,20 мг/мл), двухосновного фосфата натрия (0,555 мг/мл) и хлорида натрия (8,16 мг/мл) в очищенной воде И8Р. Лекарственный продукт предварительно фильтруют дважды после вливания дозируемого объема в сумку для инфузий пропусканием его через связывающий небольшие количества белка фильтр 5-μ и выводят пациентам через встроенный 0,22 мкм фильтр в течение 8 ч. После инфузии линию внутривенного введения следует ополоснуть жидкостью для обеспечения доставки полной дозы лекарственного средства.
Основанные на предшествующем опыте введения внутривенным методом конъюгатов МаЬмайтансиноида людям дозы в интервале от 22 до 295 мг/м2 можно вводить каждые три недели (1. С11п. Опсо1. 21:211-222, 2003).
7. Готовые изделия.
Изобретение относится к готовому изделию, содержащему материалы, которые могут использоваться для лечения нарушений, описанных выше, включающему в себя конъюгат антител против альфаV и майтансиноида, контейнер и этикетку или вкладку в упаковку на контейнере, или в сочетании с ним. Готовое изделие предпочтительно содержит по меньшей мере один сосуд, включающий в себя раствор по меньшей мере одного конъюгата антитела против альфа-ν и майтансиноида с предписанными буферами и/или консервантами, необязательно в водном разбавителе, где указанный упаковочный материал содержит этикетку, которая указывает на то, что такой раствор может храниться в течение некоторого периода времени. Изобретение может относиться к готовому изделию, включающему в себя упаковочный материал, первый сосуд, содержащий лиофилизованный по меньшей мере один конъюгат антитела против альфа-ν и майтансиноида, и второй сосуд, содержащий водный растворитель с предписанным буфером или консервантом, где указанный упаковочный материал содержит этикетку, в которой имеется инструкция для практикующего специалиста или пациента, как восстанавливать по меньшей мере один конъюгат антитела против альфа-ν и майтансиноида в водном разбавителе, с получением раствора.
Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылки, сосуды, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть образованы из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может иметь стерильный порт для доступа (например, контейнер может представлять собой сумку для внутривенного раствора или сосуд, имеющий пробку, которую можно проткнуть иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно средство в композиции представляет собой конъюгат антитела против альфа-ν и майтансиноида. Этикетка или вкладка в упаковку показывает, что композиция применяется для лечения выбранного состояния, такого как злокачественная опухоль. Вкладка в упаковку может показывать, что антитело или композиция применяется для лечения злокачественной опухоли, которая не отвечает или слабо отвечает на стандартное лечение, как показано здесь для конкретных заболеваний и диагнозов. В других вариантах осуществления вкладка в упаковку может указывать на то, что конъюгат антитела и майтансиноида или его композиция может использоваться для лечения метастазирующего рака, рака предстательной железы, рака молочной железы или колоректального рака.
Хотя изобретение описано в общих терминах, варианты осуществления изобретения будут далее описаны в следующих примерах.
Пример 1. Получение и описание моноклонального антитела ΟΝΤΟ 95.
Получение антитела СКТО 95 к альфа-У-интегрину подробно описано в публикации РСТ № АО 02/12501 и в публикации США № 2003/040044, которые включены здесь в качестве ссылки. В частности, человеческое моноклональное антитело САТО 95 получали путем иммунизации (СВА/1хС57/ВЬ6/1, СепРйагт 1п!етпа!юпа1) Е2 гибридных мышей ανβ3 интегрином, выделенным из плаценты человека. Антитело состоит из вариабельной человеческой области и константной области 1дС1 каппа. Способ получения желаемых характеристик СОТО 95 был описан ранее в АО0212501 и Тпкка е! а1. 2004, Ιη!. I. Сапсег 110 (3): 326-335.
Использовали трансгенных мышей (СепРкатт 1п!етпа1юпа1), экспрессирующих человеческие иммуноглобулины, но не мышиные 1дМ или 1д1к. Эти мыши содержали человеческие трансгенные последовательности, определяющие слияние ν(Ο)Ι сегментов, переключение классов тяжелых цепей и соматические мутации для образования спектра иммуноглобулинов с человеческими последовательностями (Тау1ог е! а1., 1п!етпа!юпа1 1ттипо1о§у 6:579-591 (1993)). Трансген легкой цепи происходит частично из клона дрожжевой искусственной хромосомы, включающей в себя примерно половину зародышевой линии человеческой Ук области. Дополнительно к нескольким ΥΗ генам, трансген тяжелой цепи (НС) кодирует как человеческую μ, так и человеческую γ1 (ЬопЬетд е! а1., №1иге 368:856-859 (1994)), и/или γ3 константную область. Мышей, происходящих из линии с генотипом НС012, использовали в процессах иммунизации и слияния для создания анти-альфа-ν моноклонального антитела, применяемого для полу
- 20 013323 чения конъюгата согласно изобретению.
Человеческую плаценту (измельченную с помощью гомогенизатора) или клетки человеческой меланомы М21, экспрессирующие αγβ3, интегрин, подвергали экстракции с использованием ОТО (октилтиогликозид, Г|егсе) в солевом буфере, как описано ранее (\УО 0212501). Эти препараты эмульгировали в равном объеме полного адъюванта Фрейнда и использовали для иммунизации хирургически кастрированных самцов мыши в возрасте от 15 до 17 недель (беиЛИат, РоЧет Сйу, СА) в дни 0 и 14, а также эмульгировали в неполном адъюванте Фрейнда и проводили иммунизацию в дни 28, 48 и 56. Через трое суток выделяли мышиные спленоциты, которые демонстрировали титр 1: 1280 против αγβ3, с использованием твердофазного формата ИФА. Слияние проводили при соотношении 1:1 клеток миеломы мыши (8Ρ2/0) к жизнеспособным клеткам селезенки. Супернатанты гибридомы изучали с помощью микропланшетного ИФА или твердофазного ИФА, отбирали линии, продуцирующие антитела, и проверяли их на наличие желаемых характеристик.
Анализ ЕЬ18А подтвердил, что антитела, выделенные из двух гибридом, С371 А (также называемой МаЬ СЫТО 95) и С372А, связывают αγβ3 концентрационно-зависимым образом. Пятидесятипроцентного связывания достигали при 0,07 и 0,7 мкг/мл для С372А и СЫТО 95 соответственно. В этом же исследовании анти-альфа-11-бета3 антитело, с7Е3 1дО, показало пятидесятипроцентное максимальное связывание при 0,07 мкг/мл.
Чтобы подтвердить уникальную специфичность конкурентного связывания (или комплементации) СЫТО 95, были проведены анализы с использованием следующих мышиных антител: т7Е3 1дО, антиальфа-У-бета-3 (клон ЬМ609, Οκιηίοοη). анти-альфа-У-бета-5 (клон Ρ1Ε6, О1Ьсо), анти-бета-3 (Οκιηίοοη. АМАС) или анти-альфа-У (клон УЫК139, Οί^ο). Результаты этих анализов показали, что СЫТО 95 связывает эпитоп, с которым другие изученные антитела не взаимодействуют.
Степени сродства связывания с очищенными интегринами сравнивали со связыванием с рецепторами, экспрессируемыми различными клеточными линиями, с использованием 125-Ι СЫТО 95. Клетки А37582 и М21 экспрессируют как αγβ3, так и αγβ5, клетки НТ-29 экспрессируют αγβ5. Для сравнения использовали другие моноклональные антитела, способные связывать интегрины. Величину Кб вычисляли по кривой насыщения связывания, в каждом случае используя множественные повторения различных серий антител. На плашках, покрытых α^3, значение Кс СЫТО 95 было 2,1±1,33х 10-10 М; а значение Кс абциксимаба было 2,5±1, 46х10-10 М. Значение Кс СЫТО 95 на а^5 было 2,5±1,04х10-11 М. Абциксимаб не показал связывания и зависимости от дозировки на плашках, покрытых а^5.
Как показано на фиг. 4, введение СЫТО 95 подавляет рост опухоли человеческой меланомы у голых мышей. На 26 день СЫТО 95 подавляет опухолевый рост примерно на 80% по сравнению с опухолями у контрольных мышей. В этой модели СЫТО 95 не взаимодействовало с ангиогенными сосудами хозяина, так как не связывало мышиные интегрины, что позволяет предположить, что блокирование человеческих интегринов, экспрессируемых опухолью, самостоятельно может подавлять опухолевый рост у мышей, независимо от антиангиогенных эффектов.
Для исследований на крысах были закуплены у НатРш самки голых крыс в возрасте 6-7 недель. Двадцати крысам подкожно вводили клетки А375.82 (3х 106) в боковую область (день 1). На день 4 крыс случайным образом разделяли на 2 группы. Одной группе вводили внутривенно СЫТО 95 (10 мг/кг в ΡΒ8), тогда как другой группе вводили изотипически сходный контрольный 1дО (10 мг/кг). Затем указанные дозы продолжали вводить еженедельно до дня 46 (всего 6 доз). Опухоли измеряли штангенциркулем дважды в неделю и объемы опухолей вычисляли по формуле (длина х ширину2)/2. Вес тела также определяли еженедельно. У крыс СЫТО 95 способен блокировать как крысиные ангиогенные интегрины, так и человеческие интегрины, экспрессируемые клетками опухоли. Лечение в течение недели голых крыс, имеющих опухоль, с помощью СЫТО 95 в дозе 10 мг/кг уменьшало рост опухоли, в сравнении с крысами, которым вводили контрольные моноклональные антитела изотипически сходного человеческого ΙβΟ (фиг. 5). На 46 сутки лечение СЫТО 95 привело к значительному уменьшению конечного размера опухоли по сравнению с контрольными голыми крысами (р=0,0007). В целом, СЫТО 95 является полностью человеческим моноклональным антителом, которое связывает членов семейства альфа-У-интегринов с уникальной специфичностью, авидностью и активностью, как продемонстрировано множеством функциональных анализов, показывающих, что оно нейтрализует биологические эффекты интегриновых рецепторов альфа-У-бета-3 и альфа-У-бета-5 ίη νίίτο и ίη νίνο. СЫТО 95 подавляет адгезию, миграцию, пролиферацию и инвазию как опухолевых, так и эндотелиальных клеток ίη νίίτο и демонстрирует, что связывание и блокирование множественных альфа-У-интегриновых рецепторов более эффективно, чем блокирование только одного интегрина. Кроме того, СЫТО 95 подавляет ангиогенез и рост опухоли ίη νίνο. Рост опухолей человеческой меланомы был значительно уменьшен при блокировании интегринов опухолевых клеток в мышиной модели или путем сочетанного блокирования интегринов опухолевых клеток и ангиогенных интегринов хозяина в крысиной модели, показывая потенциальную важность использования множественных клеточных мишеней для повышения противоопухолевой эффективности.
Результаты моделей ίη νίίτο тοбек демонстрируют, что СЫТО 95 имеет потенциальные антиангиогенные способности, подавляя адгезию, пролиферацию, миграцию и капиллярное проникновение эндо- 21 013323 телиальных клеток. Кроме того, ί'ΝΤΟ 95 блокирует ангиогенез, стимулированный как ЬЕОЕ, так и М21 клетками меланомы в крысиной модели Ма1пдс1. и ЬЕОЕ клетками в модели ангиогенеза у приматов.
ί,'ΝΤΟ 95 показало нулевые антиангиогенные эффекты как в модели грызунов, так и в новой модели нечеловекоподобных приматов (узконосые обезьяны).
В дополнение к блокированию интегринов на ангиогенном эндотелии, способность подавлять интегриновую функцию на самих опухолевых клетках уменьшает рост опухолей. Многие альфа-Уинтегрины предположительно играют критическую роль в биологии опухолевых клеток. В модели 5 мышиных ксенотрансплантатов, где отсутствует перекрестное реагирование ί'ΝΤΟ 95 с интегринами хозяина, лечение ί'ΝΤΟ 95 значительно подавляло рост у3/5-позитивных опухолей меланомы.
Одним из наиболее важных свойств ί'ΝΤΟ 95 является его полностью человеческая природа. В связи с этим, маловероятно, что ί'ΝΤΟ 95 может вызвать иммунные ответы у пациентов. Более того, так как ί'ΝΤΟ 95 способно связываться не только с альфа-У-бета-3 и альфа-У-бета-5, но также с другими альфаУ-интегринами, такими как альфа-У-бета-6 и альфа-У-бета-1, оно, вероятно, способно подавлять различные проявления, опосредованные интегринами.
Пример 2. Получение конъюгатов ί'ΝΤΟ 95-майтансин.
Антительные конъюгаты тиолированных майтансинов получали для дальнейшего биологического тестирования, начиная с использования бифункциональных линкеров, как описано.
Антитела ί'ΝΤΟ 95 для конъюгации поставляла фирма СсгИоеог. ί'ΝΤΟ 95 были поставлены в общем количестве примерно 20 мг/мл (260 мг). Антитело диализировали в буфере А (50 мМ ΚΡί, 50 мМ ΝαίΊ, 2 мМ ΕΌΤΆ рН 6,5), затем переносили в 8 мг/мл в 95% буфер А, 5% ЕТОН. Антитело модифицировали с помощью 6,5-кратного молярного избытка 8ΡΡ для побуждения линкера к конъюгации с лекарственным средством, с образованием ίΝΤΟ 95-88-Ру, где 8-Ру является 2-меркаптопиридином. Остаточный 8РР удаляли с помощью 025 гель-фильтрационной хроматографии. Соотношение линкера к антителу определили как 4,7. Конъюгат ЛЬ-88-Ру модифицировали с помощью 1,7-кратного молярного избытка ΌΜ1 (Μν=737,5 г/М) к линкеру, используя концентрацию антитела 3,2/мл в 97% буфере А, 3% диметилацетамида. После конъюгации конъюгат повторно хроматографировали на 025 с использованием РВ8, рН 6,5 в качестве буфера. Полученный в результате конъюгат содержал 3,2 М ΌΜ1 на 1 М ίΝΤΟ-95: [АЬ]=2,59 мг/мл, [ΌΜ1]=38,3 мкг/мл. Расчеты были основаны на определении поглощения фильтрованного материала при 252 и 280 нм с использованием коэффициентов экстинкции: АЬ=224,000 М-1см-1 при 280 нм, ΌΜ1=5700 М-1см-1 при 280 нм, АЬ=82,880 М-1см-1 при 252 нм и ΌΜ1=26,790 М-1см-1 при 252 нм.
Продукт анализировали с помощью δΌδ-РАОЕ в невосстанавливающих условиях, δΕί НРЬС, и путем определения сродства связывания с альфа-У-бета-3 и альфа-У-бета-5 белком с помощью ΕίΙδΛ. С помощью РАСЕ молекулярную массу продукта определяли в пределах примерно 160 кД, также визуализировали продукт с несколько меньшей молекулярной массой. При использовании анализа δΕί НРЬС, фракция конъюгата, элюирующая мономер (18,8'), составила 96%, и примерно 4% элюированного конъюгата представляли собой вещества с более высокой молекулярной массой (16,2'). Сродство связывания вычисляли путем построения графика абсорбции-концентрации при заданной Кб=3,0 е-11 М для ίΝΤΟ 95 и Кб=3,5 е-11 М для конъюгата на альфа-У-бета-5. Для обоих веществ была задана Кб, равная приблизительно 3,0 е-9 на альфа-У-бета-5.
Другие группы ίΝΤΟ 95^РР-ЭМ1 и ίΝΤΟ 95, конъюгированных с ΌΜ4, и посторонних антител, которые метят нечеловеческий антиген, Е105, и конъюгируют сходным образом, получали аналогичным способом с использованием бифункциональных линкеров, как показано на фиг. 2 и 3. Характеристики этих способов получения приведены ниже.
Получение ίΝΤΟ 95^РР-ЭМ1 (ίΝΤΟ 364). Моноклональное антитело ίΝΤΟ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ1 с помощью δΡΡ линкера следующим образом: 270,6 мг ίΝΤΟ 95 конъюгировали с 3,7 мг ΌΜ1, полученные в результате 98 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,74 мг/мл ΡВδ при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ1, равную 37,6 мкг/мл. Таким образом, соотношение ΌΜ1 на моль ίΝΤΟ 95 составило 2,98 (1 мкг ΌΜ1 эквивалентен 68,9 мкг конъюгированного антитела ίΝΤΟ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 96,3% мономера и 0,59% свободного лекарственного средства.
Получение ίΝΤΟ 95^РР-ЭМ1 (ίΝΤΟ 364). Моноклональное антитело ίΝΤΟ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ1 с помощью δΡΡ линкера следующим образом: 104 мг ίΝΤΟ 95 конъюгировали с 1,82 мг ΌΜ1, полученные в результате 26 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 3,65 мг/мл конъюгированного антитела ίΝΤΟ 95^РР-ЭМ1 в ΡВδ при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ1, равную 70,07 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,80 моль ΌΜ1 на моль ίΝΤΟ 95 (1 мкг ΌΜ1 эквивалентен 57,2 мкг конъюгированного антитела ίΝΤΟ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 93,4% мономера и 1,61% свободного лекарственного средства.
Получение ίΝΤΟ 95^РР-ЭМ1 (ίΝΤΟ 364). Моноклональное антитело ίΝΤΟ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ1 с помощью δΡΡ линкера следующим образом: 228 мг ίΝΤΟ 95 конъюгировали с 4,13 мг ΌΜ1, полученные в результате 102 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,24 мг/мл конъюгированного антитела ίΝΤΟ 95^РР-ЭМ1 в ΡВδ при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ1,
- 22 013323 равную 40,53 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,93 моль ΌΜ1 на моль Τ’ΝΤΘ 95 (1 мкг ΌΜ1 эквивалентен 55,3 мкг конъюгированного антитела Τ'ΝΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 94,7% мономера и 1,00% свободного лекарственного средства.
Получение Τ’ΝΤΘ 95-88№В-ЭМ4 (Τ’ΝΤΘ 365). Моноклональное антитело Τ’ΝΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 88№В линкера следующим образом: 121 мг Τ'ΝΤΘ 95 конъюгировали с 2,18 мг ΌΜ4, полученные в результате 34 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 3,25 мг/мл РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 64,11 мкг/мл. Таким образом, соотношение ΌΜ4 на моль антитела составляло 3,57 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 55,6 мкг конъюгированного антитела Τ’ΝΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 95,4% мономера и 3,23% свободного лекарственного средства.
Получение Τ’ΝΤΘ 95-88№Р-ЭМ4 (СОТО 366). Моноклональное антитело Τ’ΝΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 88NΡΡ линкера следующим образом: 101 мг Τ'ΝΤΘ 95 конъюгировали с 1,45 мг ΌΜ4, полученные в результате 30 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 3,07 мг/мл антитела в РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 48,39 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 2,95 моль ΌΜ4 на моль СNΤО 95 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 69,5 мкг конъюгированного антитела Τ'ΝΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 85,9% мономера и 1,18% свободного лекарственного средства.
Получение СNΤΘ 95-8РЭВ-ЭМ4 (СОТО 365). Моноклональное антитело Τ’ΝΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 8РЭВ линкера следующим образом: 228,5 мг СNΤΘ 95 конъюгировали с 4,37 мг ΌΜ4, полученные в результате 104,5 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,19 мг/мл конъюгированного антитела Τ’ΝΤΘ 95-8РЭВ-ЭМ4 в РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 41,84 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,92 моль ΌΜ4 на моль СNΤΘ 95 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 52,3 мкг конъюгированного антитела СNΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 93,6% мономера и 0,55% свободного лекарственного средства.
Получение СNΤΘ 95-8РЭВ-ЭМ4 (Τ’ΝΤΘ 365). Моноклональное антитело СNΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 8РЭВ линкера следующим образом: 309 мг СNΤΘ 95 конъюгировали с 5,4 мг ΌΜ4, полученные в результате 130,7 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,36 мг/мл конъюгированного антитела СNΤΘ 95-8РЭВ-ЭМ4 в РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 41,2 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,57 моль ΌΜ4 на моль СNΤΘ 95 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 57,5 мкг конъюгированного антитела СNΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 93,8% мономера и 0,40% свободного лекарственного средства.
Получение СNΤΘ 95-8РР-ЭМ1 (Τ’ΝΤΘ 364). Моноклональное антитело СNΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ1 с помощью 8РР линкера следующим образом: 270,6 мг СNΤΘ 95 конъюгировали с 3,7 мг ΌΜ1, полученный в результате конъюгат хранили при 2-8°С в 2,74 мг/мл РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ1, равную 37,6 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 2,98 моль ΌΜ1 на моль СNΤΘ 95 (1 мкг ΌΜ1 эквивалентен 68,9 мкг конъюгированного антитела СNΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 96,3% мономера и 0,59% свободного лекарственного средства.
Получение СNΤΘ 95-8РР-ЭМ1 (Τ’ΝΤΘ 364). Моноклональное антитело СNΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ1 с помощью 8РР линкера следующим образом: 245 мг Т105 конъюгировали с 4,28 мг ΌΜ1, полученные в результате 91,5 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,68 мг/мл конъюгированного антитела Т105-8РР-ЭМ1 в РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ1, равную 46,76 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,79 моль ΌΜ1 на моль Т105 (1 мкг ΌΜ1 эквивалентен 57,3 мкг конъюгированного антитела Т105). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 90,3% мономера и 2,44% свободного лекарственного средства.
Получение СNΤΘ 95-8РР-ЭМ4 (Τ’ΝΤΘ 366). Моноклональное антитело СNΤΘ 95 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 8РР линкера следующим образом: 76,7 мг СNΤΘ 95 конъюгировали с 1,10 мг ΌΜ4, полученные в результате 35 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,19 мг/мл конъюгированного антитела СNΤΘ 95-8РР-ЭМ4 в РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 31,5 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 2,96 моль ΌΜ4 на моль СNΤΘ 95 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 69,4 мкг конъюгированного антитела СNΤΘ 95). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 97,3% мономера и 1,14% свободного лекарственного средства.
Получение Е105-88^В-ЭМ4. Моноклональное антитело Т105 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 88№В линкера следующим образом: 106 мг Т105 конъюгировали с 1,84 ΌΜ4, полученные в результате 25 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 3,85 мг/мл РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 73,45 мкг/мл. Таким образом, соотношение ΌΜ4 на моль антитела составляло 3,57 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 57,5 мкг конъюгированного антитела Т105). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 85,1% мономера и 1,92% свободного лекарственного средства.
Получение Е105-88^В-ЭМ4. Моноклональное антитело Т105 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 88№В линкера следующим образом: 106 мг Т105 конъюгировали с 1,84 мг ΌΜ4, полученные в результате 30 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 3,46 мг/мл РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 57,93 мкг/мл. Таким образом, соотношение ΌΜ4 на моль анти- 23 013323 тела составляло 3,32 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен б5,4 мкг конъюгированного антитела Е105). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 88,8% мономера и 1,85% свободного лекарственного средства.
Получение Ε105-88ΝΡΡ-ΌΜ4. Моноклональное антитело Е105 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 88ΝΡΡ линкера следующим образом: 105 мг Е105 конъюгировали с 1,76 мг ΌΜ4, полученные в результате 28 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 3,41 мг/мл РВ8 при рН б,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 62,87 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,45 моль ΌΜ4 на моль Е105 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 59,4 мкг конъюгированного антитела Е105). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 85,9 % мономера и 3,75% свободного лекарственного средства.
Получение Е105-8Ρ^В-^Μ4. Моноклональное антитело Е105 конъюгировали с майтансиноидом ΌΜ4 с помощью 8РЭР линкера следующим образом: 230,5 мг Е105 конъюгировали с 4,12 мг ΌΜ4, полученные в результате 104,5 мл конъюгата хранили при 2-8°С в 2,21 мг/мл РВ8 при рН 6,5. Путем поглощения определяли концентрацию ΌΜ4, равную 39,41 мкг/мл. Таким образом, препарат содержал соотношение 3,66 моль ΌΜ4 на моль Е105 (1 мкг ΌΜ4 эквивалентен 56,0 мкг конъюгированного антитела Е105). С помощью НРЬС в составе препарата определяли 89,2% мономера и 0,65% свободного лекарственного средства.
В целом, следующие вещества были синтезированы для дальнейших анализов (табл. 1).
Таблица 1
Соединение Лекарственное средство Реагент, активирующий майтансинол Реагент, активирующий моноклональное антитело Метиловые группы, соседствующие с дисульфидом в продукте (сторона моноклонального антитела: сторона лекарственного средства
СИТО364 ϋΜΙ Ν-метил, Ν-(1— дитиометил-3карбоксипропил}аланин ЗРР или Ξ3ΝΡΡ 1:0
СИТО365 ЦМ4 Ν-метил,Ν-(ΙΛΗ ти оме тип -2метил-4карбокси-’Пбутил)аланин ЗРОВ или 58ΝΡΒ 0:2
СЫТОЗбб ЦМ4 Ν-метил,Ν-(1дитиометил-2метил-4карбокси-пбутил)аланин ЗРР или 33ΝΡΡ 1:2
Г105-РМ1 ϋΜΙ Ν-метил,Ν- (1дитиометил-3карбоксипропил) аланин ЗРР или 33ΝΡΡ 1:0
Г105-ОМ4 ЦМ4 Ν-метил,Ν-(1— дитиометил-2метил-4карбокси'Лбутил)аланин 5 РОВ или 33ΝΡΒ 0:2
Г105-ОМ4 ϋΜ4 Ν-метил,Ν-(1дитиометил-2метил-4карбокси-пбутил)аланин | ЗРР или 33ΝΡΡ 1:2
- 24 013323
Пример 3. Связывание конъюгата СЫТО 95-майтансин с опухолевыми клетками.
Изучали способность и сродство конъюгата СЫТО 95-майтансиноид к связыванию с живыми клетками.
Материалы и методы. СЫТО 95, СеШосог лот № 95-УЕ30А03-1, 20 мг/мл в РВ8; СЫТО 364 (СЫТО 95-8РР-ИМ1), 1ттипоСеи лот № 1806-164, 37,6 мг/мл ИМ1, 2,74 мг/мл конъюгированного антитела, уровень эндотоксинов < 0,1 ЕИ/мг; СЫТО 365 (СЫТО 95-8РИВ-ОМ4), 1ттипоСеи лот № 2020-78, 41,2 мг/мл ΌΜ4, 2,36 мг/мл конъюгированного антитела, уровень эндотоксинов < 0,1 ЕИ/мг; СЫТО 366 (СЫТО 95-8РР-ИМ4), 1ттипоСеи лот № 2020-48, 31,5 мг/мл ΌΜ4, 2,19 мг/мл конъюгированного антитела, уровень эндотоксинов < 0,1 ЕИ/мг.
Клетки: клетки человеческой карциномы толстого кишечника НТ29 и клетки человеческой карциномы легкого А549 получали от АТСС и культивировали в альфаМЕМ с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ЕВ8). Клетки человеческой карциномы яичника А2780 получали от ЫаЕоиа1 Сапсег 1п5Ши1е. Клетки А2780 культивировали в среде КРМ1 1640, содержащей 10% ЕВ8. Клетки собирали, промывали, суспендировали в свободной от сыворотки ИМЕМ и последовательно инкубировали в течение 60 мин на льду с сериями разведений СЫТО 95, СЫТО 364, СЫТО 365, СЫТО 366 и Е1ТС-мечеными анти-человеческими антителами (10 мг/мл). Отсутствие первичных антител или замена первичных антител антителами подходящего изотипа служили отрицательным контролем. Клетки немедленно анализировали с помощью проточного цитометра ЕАС8 8сап II (Вес1оп Оюкпъоп. Моийшп У1еет, СА). Данные анализировали с помощью программного пакета СгарйРаб Рпкт койетаге с использованием нелинейной регрессии для определения концентрации 50% максимального связывания (табл. 2). В большинстве случаев константа эффективного связывания изменялась менее чем 2-кратно.
ЕС50 (мг/мл) Таблица 2
Соединение НТ2Э А54 9 А2780
СЫТО 95 0,14 0,18 0,17
СЫТО 364 0,19 0,27 0,27
СЫТО 365 0,21 0, 34 0,27
СЫТО 366 0,29 0,42 0, 30
Пример 4. Цитотоксичность конъюгата СЫТО 95-майтансин для опухолевых клеток.
Изучали т У11го способность конъюгатов СЫТО 95-майтансиноид убивать опухолевые клетки.
СЫТО 364 (СЫТО 95-8РР-ИМ1), IттииоСеи лот № 1806-164, 37,6 мкг/мл. ИМ1, 2,74 мг/мл конъюгированного антитела, уровень эндотоксинов < 0,1 ЕИ/мг. СЫТО 365 (СЫТО 95-8РИВ-ОМ4), IттииоСеи лот № 2020-78, 41,2 мкг/мл ИМ4, 2,36 мг/мл конъюгированного антитела, уровень эндотоксинов < 0,1 ЕИ/мг. СЫТО 366 (СЫТО 95-8РР-ИМ4), 1ттипоСеп лот № 2020-48, 31,5 мкг/мл ИМ4, 2,19 мг/мл конъюгированного антитела, уровень эндотоксинов < 0,1 ЕИ/мг.
Клетки НТ29 человеческой карциномы толстого кишечника и клетки А549 человеческой карциномы легкого (АТСС) культивировали в альфаМЕМ с добавлением 10% ЕВ8 при 37°С в присутствии 5% СО2. Клетки высаживали в белые 96-луночные плашки для культуры ткани (5000 клеток/лунка) в культуральную среду и инкубировали в течение 16 ч. Серии разведений иммуноконъюгатов добавляли в каждую соответствующую лунку (0-20 мкг/мл). Плашки с культурой ткани инкубировали при 37°С в течение 96 ч. Анализ АТРЬЙе проводили в соответствии с инструкцией производителя. Данные анализировали с помощью программного пакета СгарйРай Рпкт койетаге с использованием нелинейной регрессии (табл. 3) для определения концентрации для половины максимального количества клеток, определявшегося по светимости.
Таблица 3
ЕС50 (мкг/мл)
Иммуноконъюгат НТ29 А549
СЫТО 364 1,0 1,2
СЫТО 365 0,24 0,3
СЫТО 366 1,0 1,5
Пример 5. Лечение с помощью СЫТО 95-ИМ1 крыс с опухолями, происходящими от человеческой меланомы.
Исследовали эффективность СЫТО 364, в сравнении с СЫТО 95, против клеток развернутой п/к меланомы человека А375.82. СЫТО 95-ИМ1 был изготовлен IттииоСеи 1пс., лот № 1716-74В, концентрация маточного раствора: 2,59 мг/мл. 5 мг/кг СЫТО 95-ИМ1 эквивалентны 74 мкг/кг ИМ1. СЫТО 95 получали от СсШосог лот № 5380-027, концентрация маточного раствора=20 мг/мл. Человеческий 1дСИМ1: человеческий 1дС СйготРиге получали от 1асккоп 1ттипоКе8еагсН ЬаЬогаЮйек. Человеческий 1дСИМ1 был изготовлен ^титоСе^ лот № 1762-50, концентрация маточного раствора 2,8 мг/мл. 5 мг/кг этого конъюгата эквивалентны 76 мкг/кг ИМ1. Майтансин: IттииоСеи, лот № 1710-121, концентрация
- 25 013323 маточного раствора=16,38 мкг/мл в РВ8, рН 6,5. Маточный раствор майтансина разводили РВ8 до 15 и 7,5 мкг/мл. РВ8: 1ттипо6еп, рН 6,5. Клетки А375.82 меланомы человека закупали у АТСС, транспортировали и хранили в виде замороженных аликвот в СеШосог Се11 В1о1оду 8еМсе5.
Девятинедельным бестимусным голым крысам подкожно вводили клетки А375.82 меланомы человека. На 14 день, когда средний объем опухоли достигал 250-300 мм3, животных разделяли на группы по 9/10 и начинали лечение. ΟΝΤΘ 95-ΌΜ1 и подходящие контрольные соединения вводили внутривенно (три инъекции через день в первую неделю, одна инъекция в неделю следующие две недели в дни 11, 14, 16, 21 и 28). Отмечали размеры опухоли и вес тела. На фиг. 6 отображены во времени изменения объемов опухоли человеческой меланомы у голых мышей. Объемы опухоли приведены как среднее значение ±станд. откл. (п=9 или 10). Стрелками показано внутривенное введение лекарственного средства. Звездочка показывает, что одно животное, не отвечавшее на лечение, было усыплено, когда объем опухоли у него превысил 1500 мм3. Всех животных усыпили на 35 день. Объемы опухоли приведены как среднее значение ±станд. откл. (п=9 или 10). Стрелками показано внутривенное введение лекарственного средства. ΟΝΤΘ 95-ΌΜ1 в дозе 5 мг/кг прекращал рост опухоли и уменьшал средний объем опухоли, тогда как ΟΝΤΘ 95 в дозе 10 мг/кг не вызывал эффекта в этом эксперименте.
Во втором эксперименте на крысах средний объем опухоли достигал 250 мм3 на 14 день. Животных разделили на группы и первое внутривенное введение лекарственного средства провели на 14 день. Последующие инъекции проводили на 16 и 18 день той же недели, а затем один раз в неделю на 23 и 31 день. Всех животных усыпили на 35 день. СКГО 95-ΌΜ1 в дозе 5 мг/кг вызывал полную регрессию ксенотрансплантата человеческой меланомы А375.82 у самок бестимусных крыс (фиг. 7). Контрольные соединения, включающие в себя РВ8, свободный ί','ΝΤΟ 95, неспецифичный конъюгат антитело-^Μ1, свободный майтансин и свободный ί','ΝΤΟ 95 плюс свободный майтансин, не показали каких-либо значительных эффектов.
Пример 6. Лечение с помощью СКГО 95-ΌΜ1 крыс с опухолями, происходящими от человеческой карциномы толстого кишечника.
Исследовали эффективность СNΤΟ 364, в сравнении с СОТО 95, против развернутой п/к НТ29 карциномы толстого кишечника человека.
СЭТО 364, 1ттипо6еп лот № 1806-50, концентрация белка 2,53 мг/мл, концентрация ΌΜ1 41,8 мг/мл, отношение ΌΜ1 к СОТО 95 3,6 моль ΌΜ1 на моль СОТО 95. РВ8 или антитело Ρ105-ΌΜ1 использовали в качестве контроля Ρ105-ΌΜ1; 1ттипо6еп лот № 1806-44, концентрация белка 2,2 мг/мл, концентрация ΌΜ1 38,3 мг/мл, отношение ΌΜ1 к Р105 3,8 моль ΌΜ1 на моль Р105. Все реагенты проверяли на наличие эндотоксинов, значения ЬАЬ были ниже 1,0 ЕИ/мг. Клеточная линия карциномы толстого кишечника человека НТ29, экспрессирующая интегрины аУЬ3, аУЬ5 и аУЬ6, была получена из банка клеток СеПосог. В этой клеточной линии определили отсутствие микоплазм и бактериальных агентов. Клетки культивировали в аМЕМ с добавлением 10% ЕВ8, 1% пирувата и 1% ΜΕΜ заменимой аминокислоты, в присутствии 5% СО2, при 37°С.
В этой работе использовали семьдесят самок бестимусных крыс от Наг1ап ЬаЬога1опе5 (1пй1апаро118, ΙΝ). Крысам подкожно вводили 5х106 НТ29 клеток (0,2 мл, 25х106 клеток/мл) в заднюю боковую область (со стороны спины, примерно 0,5 дюйма ниже последнего ребра и 0,5 дюйма от позвоночника). Всех крыс наблюдали ежедневно (в рабочие дни) на предмет появления пальпируемой опухоли. Животных стратифицировали по индивидуальному объему опухоли в семь групп, каждая группа включала в себя 9 животных (табл. 4). Начальный объем опухоли для всех групп составлял в среднем 250-260 мм3.
Таблица 4
Группа Ы СЫТО 364 (мг/кг) Дни введения
1) РВЗ 9 0 7, 14, 21, 28 и 35
2) ϊ-105-ϋΜΙ 9 25 7 и 14
3) СИТО 364 9 3 7, 14, 21, 28 и 35
4} СЫТО 364 9 6 7, 14, 21, 28 и 35
5) СЫТО 364 9 10 7, 14, 21, 28 и 35
6) СЫТО 364 9 15 7, 14 и 35
7} СЫТО 364 9 25 7 и 14
В день разделения на группы (день 0) животных взвешивали и вводили им внутривенно контрольное антитело Ε105-ΌΜ1 в дозе 25 мг/кг или СОТО 364 в дозах 3, 6, 10, 15 или 25 мг/кг. Все тестируемые и контрольные вещества вводили в объеме 1 мл/100 г веса тела. СКГО 364 в группах, получавших дозу 3, 6 и 10 мг/кг, вводили внутривенно по схеме с.|7йх5. СКГО 364 в группе, получавшей дозу 15 мг/кг, вводили на 7, 14 и 35 дни. СNΤΟ 364 в группе, получавшей дозу 25 мг/кг, и Ε105-ΌΜ1 в группе, получавшей дозу 25 мг/кг, вводили на 7 и 14 дни. Две последние группы были усыплены вследствие значительной потери веса (более 10% на день 0) в соответствии с требованиями правил 1АСИС (фиг. 8).
Величины объемов опухолей измеряли дважды в неделю. Опухоли измеряли штангенциркулем в двух направлениях (длина и ширина) в миллиметрах (мм). Объем опухоли (мм3) вычисляли с использованием формулы У=(длинахширинахтолщина)/2. Статистическую обработку проводили с помощью программного пакета СгарИРай РгЬт юГйгаге с использованием непарного ΐ-теста.
СКГО 364 ингибировало рост прижившихся опухолей толстого кишечника доза-зависимым обра
- 26 013323 зом (фиг. 9). СЫТО 364 в дозе 10 мг/кг по схеме дозирования с.|7б/5 вызывало полную регрессию опухоли в трех случаях и частичную регрессию в двух случаях из 9 животных (фиг. 10). Лечение с использованием СЫТО 364 в дозе 15 мг/кг на 7, 14 и 35 дни вызывало полную регрессию опухоли в четырех случаях и частичную регрессию в четырех случаях у 9 животных с опухолью. Контрольная группа, получавшая РВ8, была усыплена на 35 день после имплантации опухолевых клеток (средний объем опухоли превышал 5000 мм3). В это время различие в объемах опухолей между группами, которым вводили СЫТО 364 в дозе 10 мг/кг и 15 мг/кг, по сравнению с контрольной группой, которой вводили РВ8, вычисленное с использованием двойного непарного ί-теста, имело значение Р < 0,0001.
Две подряд инъекции как СЫТО 364 в дозе 25 мг/кг, так и Ρ105-ΌΜ1 в дозе 25 мг/кг, были токсичны и вызывали неприемлемое снижение веса тела (фиг. 8). Однако единичная инъекция СЫТО 364 в дозе 25 мг/кг вызывала полную регрессию развернутой опухоли человеческой карциномы толстого кишечника НТ29 со средним значением объема опухоли более 4000 мм3 (данные не приводятся).
Пример 7. Лечение с помощью СЫТО 95-ΌΜ1 крыс с опухолями, происходящими от человеческой карциномы легкого.
Это исследование проводили для оценки эффективности ш νί\Ό конъюгата СЫТО 95-ΌΜ1 у самок бестимусных крыс с человеческой карциномой легкого А549. СЫТО 95 получали от СепЮсог (Макет, РА), а конъюгирование ΌΜ1 проводили в 1ттипоСеп (СатЬйбде, МА). СЫТО 364 являлся (СЫТО 958РР-ЭМ1) и соответствовал описанному в примере 1.
Клеточную линию человеческой карциномы легкого А549 (АТСС) культивировали в альфаМЕМ, содержащей 10% ЕВ 8, а клетки для подкожной имплантации бестимусным крысам получали в свободной от сыворотки альфаМЕМ. В заднюю боковую область (со стороны спины, примерно 0,5 дюйма ниже последнего ребра и 0,5 дюйма от позвоночника) тела самок бестимусных крыс (возраст 6 недель, получены от Наг1ап ЬаЬогаФгу, 1пб1апароШ, 1Ы) подкожно имплантировали 5/106 клеток (0,2 мл, 25/106 клеток/мл). Когда средний объем опухоли достиг 250 мм3, животных стратифицировали на группы, в зависимости от дозировки, со сходным средним объемом опухоли (табл. 5) и вводили дозы внутривенно на 17 и 29 дни после инъекции опухолевых клеток.
Таблица 5
Группа Лекарственное средство Доза на 17 и 29 дни
1 РВЗ
2 Е105-ЦМ1 15 мг/кг
3 СИТО 364 15 мг/кг
4 СИТО 95 15 мг/кг
5 СЫТО95 + майтансин 15 мг/кг + 260 мкг/кг
6 Майтансин 260 мкг/кг
Величины объемов опухолей измеряли дважды в неделю. Опухоли измеряли электронным штангенциркулем Уегшег в двух направлениях (длина и ширина) в миллиметрах (мм). Объем опухоли (мм3) вычисляли с использованием формулы У=(длина/ширина/толщина)/2. Объемы опухолей представлены как среднее значение±станд.откл. (п=6). Результаты отображены графически в зависимости от времени, фиг. 12, стрелками показано время внутривенного введения лекарственного средства. При использовании веса тела как индикатора переносимости (фиг. 11) видно, что схема дозирования СЫТО 364, примененная в этом исследовании, хорошо переносилась животными, вызывая временную потерю лишь 3% веса тела по сравнению с начальным весом тела после первой инъекции.
Применяли односторонний дисперсионный анализ (АЫОУА) с тестом Бонферрони с использованием программного пакета СгарЬРаб Ргып 4 койуаге (СгарЬРаб 8ойуаге, 1пс., 8ап П1едо, СА) при 95% доверительном интервале. Ссылка на фиг. 12: группа 1, РВ8; группа 2, Ρ105-ΌΜ1 в дозе 15 мг/кг; группа 3, СЫТО 364 в дозе 15 мг/кг; группа 4, СЫТО 95 в дозе 15 мг/кг; группа 5, СЫТО 95 в дозе 15 мг/кг плюс майтансин в дозе 260 мг/кг; группа 6, майтансин в дозе 260 мг/кг. Значение Р определяли с помощью одностороннего дисперсионного анализа (АЫОУА) с тестом Бонферрони для множественных сравнений. *Р<0,05, СЫТО 364 против Ρ105-ΌΜ1, СЫТО 95 плюс майтансин или только майтансин; **Р<0,01, СЫТО 364 против СЫТО 95; ***Р<0,001, СЫТО 364 против РВ8.
Конъюгирование ΌΜ1 с СЫТО 95 с образованием большой молекулы должно изменить фармакокинетические свойства ΌΜ1 в виде продления времени полужизни ΌΜ1 ш νί\Ό. Для исключения этой возможности иммуноконъюгат неспецифичного антитела Е105 с ΌΜ1 включили в это исследование для определения, была ли активность конъюгата СЫТО 95-ΌΜ1 зависящей от СЫТО 95. Так как СЫТО 95 является антиангиогенным и антиопухолевым соединением, а ΌΜ1 является цитотоксичным агентом, возможно, что антиопухолевая активность была связана с простым сложением эффектов свободного СЫТО 95 и свободного ΌΜ1. В связи с этим группы, получавшие свободный СЫТО 95, свободный СЫТО 95 плюс свободный майтансин и свободный майтансин, были включены в исследование. Как показано на фиг. 13, СЫТО 364 в дозе 15 мг/кг, применявшийся по схеме ц/12б/2, уничтожал шесть из шести ксенотрансплантатов опухоли легкого А549. Наблюдалась одна полная регрессия опухоли в группе Е105
- 27 013323
ΌΜ1 и две в группе ί,'ΝΤΟ 95 плюс майтансин. Эти результаты демонстрируют превосходство иммуноконъюгата ί,’ΝΤΟ 95-ЭМ1, ί,’ΝΤΟ 364, в регрессии опухоли легкого А549. Животные, получавшие лечение ί'ΝΤΟ364 в этом режиме дозирования, показали временную токсичность для кожи и снижение веса тела без явных признаков тяжелых токсических эффектов.
Пример 8. Сравнение структур конъюгатов на моделях карциномы толстого кишечника человека.
Для проверки переносимости и свойств различных соединений, используемых при получении иммуноконъюгатов Ο'ΝΤΟ 95, была выбрана модель развернутой опухоли, полученная путем подкожной имплантации клеток, происходящих из человеческой опухоли толстого кишечника НТ29, крысам с иммунной недостаточностью. СКГО 95-8РР-ЭМ1 (СКГО 364), СКТО 95-§8МРВ-ЭМ4 (СКТО 365), СКГО 95-88ΝΡΡ-ΌΜ4 (ΡΝΤΟ 366) и эквивалентные им моноклональные антитела Р 105 получали от 1ттипоОеп (СатЬпбде, МА). Сто самых бестимусных крыс (в возрасте 4-6 недель) получали от Наг1ап ЬаЬога!опек. Человеческие НТ29 (АТСС) культивировали в альфаМЕМ с добавлением 10% РВ8 при 37°С в присутствии 5% СΟ2. Клетки для инокуляции получали в концентрации двадцать пять миллионов клеток на мл свободной от сыворотки альфаМЕМ. Самок бестимусных крыс инокулировали путем подкожного введения 5х106 клеток НТ29 (0,2 мл, 25х106 клеток/мл) в заднюю боковую область (со стороны спины, примерно 0,5 дюйма ниже последнего ребра и 0,5 дюйма от позвоночника). Всех крыс наблюдали дважды в неделю на предмет появления пальпируемой опухоли. Животных стратифицировали на 13 групп, 6 животных в группе, на основе среднего значения объема опухоли для каждой группы приблизительно 250 мм3. В день разделения на группы (день 7) каждой группе вводили первую дозу, как показано в табл. 6. Дозы иммуноконъюгатов вычисляли на основе содержания ΌΜ1 или ΌΜ4 в каждом конъюгате. Ь и Н представляют 175 и 350 мкг/кг ΌΜ1 или ΌΜ4, соответственно. Все тестируемые вещества вводили в объеме 1 мл/100 г веса тела. Кроме группы 11, которой вводили только одну дозу на 7 день, всем другим группам вводили дозы на 7 и 21 дни. Изменения в объемах опухолей использовали в качестве индикатора эффективности (фиг. 14А и В), а изменения в весе тела (фиг. 15А и В) использовали для изучения переносимости. Все измерения представлены как среднее значение в группе станд.±откл.
Таблица 6
№ группы Вводившийся конъюгат антител (мг/кг) Доза ЭЫх (мкг/кг)
1. РВЗ 0 0
2. Е105-ЗРР-ЦМ1 11, 5 ϋΜΙ: 175
3. Γ105-3ΡΡ-ϋΜ1 23 ϋΜΙ: 350
4. Γ105-33ΝΡΒ-ΟΜ4 10 ϋΜ4: 175
5. Γ105-53ΝΡΒ-ΟΜ4 20 ОМ4: 350
6. ГЮ5-ЗЗЫРР-ОМ4 10,5 ϋΜ4: 175
7. Ρ105-33ΝΡΡ-ϋΜ4 21 ΟΜ4: 350
8. СЫТО 364 10 ϋΜΙ: 175
9. СШО 364 20 ЦМ1; 350
10 СЫТО 365 10 ϋΜ4: 175
11 СЫТО 365 20 βΜ4: 350
12 сыто 366 12 ΟΜ4: 175
13 СЫТО 366 24 ΡΜ4: 350
Животные, которым вводили СNΤΟ 365 и Р105-88№В-ОМ4 в дозе 350 мкг/кг ΌΜ4, теряли более чем 10% от исходного веса тела после введения первой дозы, как показано на фиг. 14В. В связи с этим в этих двух группах введение лекарственного средства не продолжали после одной инъекции. Потеря > 10% веса тела была преходящей, и животные восстанавливали вес в течение 10 дней после прекращения лечения. Остальным группам вводили дозы как на 7, так и на 21 день, при этом не наблюдали значительного снижения веса тела, за исключением группы, которой вводили высокие дозы СNΤΟ 364, в которой животные теряли более 10% веса тела. Значительное снижение веса тела не наблюдали в других экспериментах с использованием СNΤΟ 364 в этом режиме дозирования. Как показано на фиг. 14В, единичная инъекция Ρ'ΝΤΟ 365 в высокой дозе вызывала полную регрессию имевшейся подкожной человеческой карциномы толстого кишечника НТ29 у 4 из 6 животных. Ρ'ΝΤΟ 364 в высокой дозе (350 мкг/кг ΌΜ1) и Ρ'ΝΤΟ 365 в низкой дозе (175 мкг/кг ΌΜ4) также вызывали регрессию имевшейся опухоли толстого кишечника (2 из 6 животных в каждой группе, соответственно) или значительно подавляли рост опухоли толстого кишечника НТ29. Однако низкая доза Ρ’ΝΤΟ 364 (175 мкг/кг ΌΜ1) и СNΤΟ 366 в обеих дозах не оказывали какого-либо значительного эффекта на размер опухоли. Эти результаты позволяют предположить, что Ρ'ΝΤΟ 365 более активен и эффективен, чем Ρ'ΝΤΟ 364 и Ρ'ΝΤΟ 366, при введении внутривенно по схеме с.|14бх2 в этой модели ксенотрансплантированной опухоли.
Должно быть очевидным, что практическое осуществление согласно изобретению не ограничивается тем, которое было частично представлено в приведенном выше описании и примерах.
Множество модификаций и вариантов по настоящему изобретению возможно в свете указанных выше способов и, в связи с этим, входят в состав прилагаемой формулы изобретения.

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат лекарственного средства с антителом, представленный формулой ~ СЛОЖНЫЙ ЭФИР МАЙТАНСИНОЛА
    II где антитело представляет собой антитело, специфичное в отношении человеческой альфа-Усубъединицы интегрина, причем указанное антитело способно интернализоваться клеткой, экспрессирующей указанную альфа-У-субъединицу;
    майтансиноид этерифицирован в С-3;
    В1 и В2 представляют собой Ме;
    Х1 и Х2 независимо представляют собой Н, Ме, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 углеродных атомов, разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 углеродных атомов, фенильную, замещенную фенильную или гетероциклическую арильную группу или гетероциклоалкильную группу;
    п представляет собой 2;
    р представляет собой 1-5;
    т представляет собой 1-10.
  2. 2. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.1, в котором антитело конкурирует за связывание человеческого альфа-У-интегрина с моноклональным антителом СЫТО 95 или его фрагментом.
  3. 3. Конъюгат антитела по п.1, в котором молекула антитела представляет собой моноклональное антитело СЫТО 95 или рекомбинантное антитело, имеющее по меньшей мере одну из определяющих комплементарность областей (СИВ) СЫТО 95, показанных в 8Е0 ΙΌ ЫО: 1-6, или, как показано, консервативные замены по меньшей мере одной СИВ.
  4. 4. Конъюгат антитела по п.2, в котором моноклональное антитело конкурирует с МАЬ СЫТО 95 за связывание с живыми клетками, экспрессирующими человеческий интегрин альфа-У-бета-3.
  5. 5. Конъюгат антитела по п.1, в котором молекула антитела специфична в отношении эпитопа в аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ ЫО: 9.
  6. 6. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.1, в котором антитело является человеческим, гуманизированным или химерным антителом.
  7. 7. Способ продуцирования конъюгата по п.1, включающий в себя стадии (а) введения одной или нескольких свободных или защищенных тиольных групп в молекулу антитела, специфичную в отношении интегринов с человеческой субъединицей альфа-У; (Ь) взаимодействия молекулы антитела стадии (а) с соединением, которое токсично в отношении клеток при ЕС50, составляющем 10-9 М или менее, причем указанное соединение имеет одну или несколько дисульфидных или тиольных групп; и (с) получения указанного конъюгата.
  8. 8. Способ по п.7, в котором токсичное соединение представляет собой майтансиноид.
  9. 9. Способ по п.7 или 8, в котором для введения свободных или защищенных тиольных групп в молекулу антитела применяют Ы-гидроксисукцинимидовый сложный эфир (2-пиридил)-3-дитиопропановой кислоты (8РИР), Ы-гидроксисукцинимидовый сложный эфир (2-пиридил)-4-дитиопентановой кислоты (8РР) или Ы-гидроксисукцинимидовый сложный эфир (2-пиридил)-4-дитиобутановой кислоты.
  10. 10. Применение конъюгата по любому из пп.1-6 для получения фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли.
  11. 11. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата по любому из пп.1-6, в котором злокачественная опухоль представляет собой аденокарциному молочной железы, аденокарциному легких, аденокарциному поджелудочной железы, аденокарциному толстого кишечника, почечноклеточную аденокарциному или аденокарциному желудка.
  12. 12. Способ лечения злокачественной опухоли по п.11, в котором злокачественная опухоль представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, плоскоклеточную карциному пищевода, плоскоклеточную карциному легких, плоскоклеточную карциному кожи или плоскоклеточную карциному шейки матки.
  13. 13. Применение конъюгата по любому из пп.1-6 для лечения или предотвращения метастатического распространения злокачественной опухоли, включающее в себя введение пациенту терапевтически эф
    - 29 013323 фективного количества конъюгата по любому из пп.1-6.
  14. 14. Способ ингибирования роста злокачественных клеток у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий в себя введение млекопитающему конъюгата моноклонального антитела по любому из пп.1-6, который предотвращает связывание ί,'ΝΤΟ 95 с живыми клетками, экспрессирующими человеческий интегрин альфа-У-бета-3, в количестве, эффективном для ингибирования роста указанных злокачественных клеток у указанного млекопитающего.
  15. 15. Способ по п.14, согласно которому конъюгат антитела вводят внутривенно.
  16. 16. Способ по п.15, согласно которому конъюгат антитела вводят в количестве от 0,05 до 12,0 мг/кг массы тела.
  17. 17. Способ по п.14, согласно которому млекопитающее представляет собой пациента-человека.
  18. 18. Способ ингибирования ангиогенеза у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий в себя введение млекопитающему с зависимым от ангиогенеза заболеванием конъюгата моноклонального антитела по любому из пп.1-6, который предотвращает связывание СNΤΟ 95 с живыми клетками, экспрессирующими человеческий интегрин альфа-У-бета-3, в количестве, эффективном для ингибирования указанного ангиогенеза, где зависимое от ангиогенеза заболевание представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из метастазирования злокачественной опухоли, ангиомы, ангиофибромы, диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, неоваскулярной глаукомы, болезни роговицы, индуцированной ангиогенезом, инволюции желтого пятна, дегенерации желтого пятна, птеригия, дегенерации сетчатки, ретроленальных фиброплазий, гранулярного конъюнктивита, псориаза, телеангиоэктазии, пиогенной гранулемы, себорейного дерматита, акне и артрита.
  19. 19. Способ ослабления воспалительного заболевания у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий в себя введение нуждающемуся в этом млекопитающему конъюгата моноклонального антитела по любому из пп.1-6, который предотвращает связывание ί,'ΝΤΟ 95 с живыми клетками, экспрессирующими человеческий интегрин альфа-У-бета-3, в количестве, эффективном для ослабления одного или нескольких симптомов указанного воспалительного заболевания, выбранного из группы, состоящей из ревматоидного артрита, дегенерации желтого пятна, псориаза, диабетической ретинопатии.
  20. 20. Способ по п.18, согласно которому указанным моноклональным антителом лечат ангиогенное заболевание кожи, выбранное из группы, состоящей из псориаза, венозных язв, акне, розовых угрей, бородавок, экземы, гемангиом и лимфангиогенеза.
  21. 21. Способ по п.18, согласно которому указанным моноклональным антителом лечат нарушение, связанное с неоваскуляризацией роговицы или сетчатки.
  22. 22. Способ по любому из пп.11, 12, 14-21, согласно которому антитело вводят в сочетании со вторым терапевтическим или профилактическим средством или способом.
  23. 23. Конъюгат лекарственного средства с антителом, представленный формулой где антитело представляет собой антитело, специфичное в отношении человеческой альфа-Усубъединицы интегрина, причем указанное антитело способно интернализоваться клеткой, экспрессирующей указанную альфа-У-субъединицу;
    майтансиноид этерифицирован в С-3;
    Кт представляет собой Н;
    В2 представляет собой Ме;
    Х1 и Х2 независимо представляют собой Н, Ме, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 углеродных атомов, разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 углеродных атомов, фенильную, замещенную фенильную или гетероциклическую арильную группу или гетероциклоалкильную группу;
    п представляет собой 2;
    р представляет собой 1-5;
    т представляет собой 1-10.
  24. 24. Фармацевтическая композиция, включающая в себя конъюгат по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
  25. 25. Фармацевтическая композиция, включающая в себя конъюгат по п.23 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
    - 30 013323
  26. 26. Набор, включающий в себя композицию конъюгата по п.1 и контейнер и дополнительно включающий вкладку в упаковку или этикетку, указывающую на то, что композиция может использоваться для лечения заболевания, характеризующегося клетками, экспрессирующими субъединицу альфа-Уинтегрина.
  27. 27. Набор, включающий в себя композицию конъюгата по п.23 и контейнер и дополнительно включающий вкладку в упаковку или этикетку, указывающую на то, что композиция может использоваться для лечения заболевания, характеризующегося клетками, экспрессирующими субъединицу альфа-У интегрина.
  28. 28. Набор по п.26, в котором во вкладке в упаковку указано, что композиция может использоваться для лечения злокачественной опухоли.
  29. 29. Набор по п.27, в котором во вкладке в упаковку указано, что композиция может использоваться для лечения злокачественной опухоли.
  30. 30. Конъюгат лекарственного средства с антителом, включающий в себя антитело, которое связывается с альфа-У-субъединицей гетеродимерного человеческого интегринового рецептора, конъюгированного с цитотоксичным средством с 1С50, составляющей 10-9 М или менее, где конъюгат антитела и лекарственного средства оказывает цитотоксическое или цитостатическое действие на линию клеток злокачественной опухоли, экспрессирующих альфа-У-интегрин, представленный формулой ” СЛОЖНЫЙ ЭФИР МАЙТАНСИНОЛА
    Н»С·^ ______АНТИТЕЛО
    II где антитело представляет собой антитело, специфичное в отношении человеческой альфа-Усубъединицы интегрина, причем указанное антитело способно интернализоваться клеткой, экспрессирующей указанную альфа-У-субъединицу;
    майтансиноид этерифицирован в С-3;
    Κμ Κ2, X! и Х2 независимо представляют собой Н, Μе, ί2Η5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 углеродных атомов, разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 углеродных атомов, фенильную, замещенную фенильную или гетероциклическую арильную группу или гетероцик лоалкильную группу;
    п представляет собой 1-5;
    р представляет собой 1-5;
    т представляет собой 1-10; и когда п равно 1, 2 или 3, то Κι и К2 не являются одновременно Н.
  31. 31. Конъюгат антитела по п.30, в котором п=2, Κι и К2 оба представляют собой метил и р=2.
  32. 32. Конъюгат антитела, представленный формулой где антитело представляет собой антитело, специфичное в отношении человеческой альфа-Усубъединицы интегрина, причем указанное антитело способно интернализоваться клеткой, экспрессирующей указанную альфа-У-субъединицу;
    майтансиноид этерифицирован в С-3;
    Κ1 и Κ2 представляют собой Н;
    р равен 2;
    Х1 представляет собой Μе;
    Х2 представляет собой Н;
    - 31 013323 п равно 2;
    т имеет значение 1-10.
  33. 33. Конъюгат антитела по п.30, в котором п=2, Κι и К2 оба представляют собой метил, р=2 и оба Х1 и Х2 представляют собой Н.
  34. 34. Фармацевтическая композиция, включающая в себя конъюгат по любому из пп.30-33 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
  35. 35. Набор, включающий в себя композицию конъюгата по любому из пп.30-33 и контейнер и дополнительно включающий вкладку в упаковку или этикетку, указывающую на то, что композиция может использоваться для лечения заболевания, характеризующегося клетками, экспрессирующими субъединицу альфа-У-интегрина.
EA200701250A 2004-12-09 2005-11-30 Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения EA013323B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63444504P 2004-12-09 2004-12-09
PCT/US2005/043250 WO2006062779A2 (en) 2004-12-09 2005-11-30 Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200701250A1 EA200701250A1 (ru) 2008-06-30
EA013323B1 true EA013323B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=36578407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701250A EA013323B1 (ru) 2004-12-09 2005-11-30 Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения

Country Status (25)

Country Link
US (2) US8603483B2 (ru)
EP (1) EP1819359B1 (ru)
JP (1) JP5421532B2 (ru)
KR (1) KR101281501B1 (ru)
CN (1) CN101193916B (ru)
AR (1) AR052041A1 (ru)
AU (1) AU2005314392B2 (ru)
BR (1) BRPI0515745A (ru)
CA (1) CA2591148A1 (ru)
DK (1) DK1819359T3 (ru)
EA (1) EA013323B1 (ru)
ES (1) ES2539126T3 (ru)
HK (1) HK1107001A1 (ru)
HU (1) HUE025449T2 (ru)
IL (1) IL183695A0 (ru)
MX (1) MX2007007011A (ru)
NO (1) NO20073493L (ru)
NZ (1) NZ555601A (ru)
PL (1) PL1819359T3 (ru)
PT (1) PT1819359E (ru)
SG (1) SG158119A1 (ru)
TW (1) TWI400087B (ru)
UA (1) UA94388C2 (ru)
WO (1) WO2006062779A2 (ru)
ZA (1) ZA200705556B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2503687C2 (ru) * 2008-04-30 2014-01-10 Иммьюноджен, Инк. Сшивающие реагенты и их применение
RU2623441C2 (ru) * 2012-01-27 2017-06-26 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты антагонистов интегрина для нацеленной доставки к клеткам, экспрессирующим альфа-v-бета-3

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2325344B1 (es) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.
BRPI0515745A (pt) * 2004-12-09 2008-08-05 Centocor Inc imunoconjugados de antiintegrina, métodos e usos
DE602006014691D1 (de) 2005-08-02 2010-07-15 Xbiotech Inc DIAGNOSE, BEHANDLUNG UND PRÄVENTION VON GEFÄSSERKRANKUNGEN MITTELS IL-1alpha-AUTOANTIKÖRPERN
ES2544957T3 (es) 2006-03-21 2015-09-07 Genentech, Inc. Terapia combinada que implica antagonistas alfa5beta1
ES2746925T3 (es) * 2006-08-03 2020-03-09 Medimmune Ltd Anticuerpos dirigidos hacia alfaVbeta6 y uso de los mismos
US20080081041A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Jeffrey Nemeth Method of Using IL6 Antagonists with Mitoxantrone for Prostate Cancer
US20090175784A1 (en) * 2007-05-11 2009-07-09 Joshua Goldstein Anti-Alpha V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
US20090196913A1 (en) * 2007-05-11 2009-08-06 Ken Shi Kun Huang Anti-Alpha-V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
WO2009042746A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Genentech, Inc. Novel antibodies
ES2576681T3 (es) 2008-05-30 2016-07-08 Xbiotech, Inc Anticuerpos IL-1 alfa
RU2532911C2 (ru) * 2008-07-21 2014-11-20 Дзе Брихэм Энд Уимен'З Хоспитал, Инк. Способы и композиции, относящиеся к синтетическим бета-1,6-глюкозаминолигосахаридам
EP2326347A4 (en) 2008-09-12 2013-03-06 Xbiotech Inc TARGETING PATHOGENIC MONOCYTES
CN102216779B (zh) * 2008-10-13 2013-11-27 泽普塔根股份公司 免疫缀合物的制备方法及其应用
AR075925A1 (es) 2009-03-25 2011-05-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-alfa5beta1 (alfa5beta1: glicoproteina integrina) y sus usos
RU2765240C2 (ru) 2009-06-03 2022-01-27 Иммьюноджен, Инк. Способы конъюгации
FR2947269B1 (fr) * 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
CA2676946A1 (en) * 2009-08-28 2011-02-28 Lucie Peduto Adam12 inhibitors and their use against inflammation-induced fibrosis
JP2013506709A (ja) 2009-10-06 2013-02-28 イミュノジェン・インコーポレーテッド 有効なコンジュゲートおよび親水性リンカー
EP2533810B1 (en) 2010-02-10 2016-10-12 ImmunoGen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
WO2011162933A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-29 Immunogen, Inc. Anti-integrin immunoconjugate dosing regimens
KR102167261B1 (ko) 2010-06-18 2020-10-20 엑스바이오테크, 인크. 관절염 치료
AU2011293554B9 (en) 2010-08-23 2015-03-19 Xbiotech Inc. Treatment for neoplastic diseases
PT2634194T (pt) * 2010-10-29 2018-10-19 Perseus Proteomics Inc Anticorpos anti-cdh3 possuidores de elevada capacidade de internalização
TR201902180T4 (tr) 2011-03-29 2019-03-21 Immunogen Inc Tek adimli bi̇r i̇şlem i̇le maytansi̇noi̇d anti̇kor konjugatlarinin hazirlanmasi
SG193997A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Immunogen Inc Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
US9724409B2 (en) 2011-04-01 2017-08-08 Xbiotech, Inc. Treatment of inflammatory skin disease
WO2012143497A2 (de) 2011-04-21 2012-10-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
BR112013028890A2 (pt) * 2011-05-09 2017-01-31 Univ Virginia Patent Foundation composições e métodos para o tratamento de câncer
JP6204915B2 (ja) 2011-09-23 2017-09-27 エックスバイオテク, インコーポレイテッドXbiotech, Inc. 悪液質治療
CA2862319C (en) * 2012-02-17 2021-11-30 Seattle Genetics, Inc. Antibodies to integrin .alpha.v.beta.6 and use of same to treat cancer
US9545441B2 (en) 2012-09-18 2017-01-17 Xbiotech, Inc. Treatment of diabetes
NZ739573A (en) 2012-09-26 2019-11-29 Immunogen Inc Improved methods for the acylation of maytansinol
RU2661083C2 (ru) 2012-10-04 2018-07-11 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент
EP2911701A4 (en) * 2012-10-23 2016-06-08 Univ Johns Hopkins Novel self-assembling drug amphiphiles and methods for synthesis and application
EP2948472B1 (en) 2013-01-23 2019-05-22 Syddansk Universitet Mfap4 binding antibodies blocking the interaction between mfap4 and integrin receptors
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
EP3021942A4 (en) * 2013-07-19 2017-04-19 The Regents of The University of California Milk fat globule epidermal growth factor 8 regulates fatty acid uptake
WO2015031396A1 (en) 2013-08-26 2015-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
RU2698697C2 (ru) 2013-12-23 2019-08-29 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты связующего (ADC) с ингибиторами KSP
KR20240011258A (ko) * 2014-09-02 2024-01-25 이뮤노젠 아이엔씨 항체 약물 컨쥬게이트 조성물의 제형화 방법
CN107592813A (zh) 2014-11-19 2018-01-16 伊缪诺金公司 用于制备细胞结合剂‑细胞毒性剂缀合物的方法
NZ767670A (en) 2014-12-04 2024-01-26 Celgene Corp Biomolecule conjugates
CN107750169B (zh) 2014-12-23 2022-02-08 恩比伊治疗股份公司 包含蒽环类衍生物的结合蛋白药物缀合物
SG11201710639YA (en) 2015-06-22 2018-01-30 Bayer Pharma AG Antibody drug conjugates (adcs) and antibody prodrug conjugates (apdcs) with enzymatically cleavable groups
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
CA3013125A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Immunogen, Inc. Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
GB201602356D0 (en) * 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
SG11201808167VA (en) 2016-03-24 2018-10-30 Bayer Pharma AG Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
US11433140B2 (en) 2016-12-21 2022-09-06 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (ADCs) having KSP inhibitors
IL291308B1 (en) 2016-12-21 2024-03-01 Bayer Pharma AG Drug-antibody conjugates with enzymatically cleavable groups
WO2018114798A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CN110382001A (zh) 2017-02-16 2019-10-25 埃克斯生物科技公司 化脓性汗腺炎的治疗
US10639382B2 (en) 2017-04-13 2020-05-05 National Guard Health Affairs Method for treating leukemia
CA3063439A1 (en) * 2017-05-30 2018-12-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of neuroinflammatory disease
JP2020523319A (ja) * 2017-06-07 2020-08-06 シルバーバック セラピューティックス インコーポレイテッド 免疫調節化合物の抗体コンジュゲートおよびその使用
US20200046737A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Notable Labs, Inc. Methods for treating cancer, and compositions therefor
PE20220485A1 (es) 2019-07-10 2022-04-04 Cybrexa 3 Inc Conjugados peptidicos de agentes dirigidos a microtubulos como terapeuticos
TW202116778A (zh) 2019-07-10 2021-05-01 美商斯布雷克薩二號公司 作為治療劑之細胞毒素之肽結合物
WO2024001669A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 昱言科技(北京)有限公司 靶向itga2的抗体和包含此抗体的抗体药物缀合物
CN115350187B (zh) * 2022-08-30 2023-08-29 中山大学 异丙托溴铵在抑制肺癌骨转移中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012501A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20030103985A1 (en) * 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
JP3161490B2 (ja) 1993-07-30 2001-04-25 松下電器産業株式会社 金型装置
US6160099A (en) 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
GB9909392D0 (en) * 1999-04-24 1999-06-23 Imp Cancer Res Tech Treatment, imaging and diagnosis of disease
JP4780633B2 (ja) 1999-06-25 2011-09-28 イムノゲン インコーポレーティッド 抗−ＥｒｂＢ抗体−メイタンシノイド複合体を用いた治療方法
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
US20020197261A1 (en) 2001-04-26 2002-12-26 Chun Li Therapeutic agent/ligand conjugate compositions, their methods of synthesis and use
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
WO2003096782A2 (en) 2002-05-13 2003-11-27 Smithkline Beecham Corporation Process for preparing maytansinol
AU2003259163B2 (en) 2002-08-16 2008-07-03 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
CN1816356A (zh) * 2003-05-14 2006-08-09 免疫原公司 药物缀合物组合物
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
SI3524611T1 (sl) 2003-05-20 2021-05-31 Immunogen, Inc. Izboljšana citotoksična sredstva, ki vsebujejo nove majtanzinoide
BRPI0515745A (pt) * 2004-12-09 2008-08-05 Centocor Inc imunoconjugados de antiintegrina, métodos e usos

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012501A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20030103985A1 (en) * 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2503687C2 (ru) * 2008-04-30 2014-01-10 Иммьюноджен, Инк. Сшивающие реагенты и их применение
RU2623441C2 (ru) * 2012-01-27 2017-06-26 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты антагонистов интегрина для нацеленной доставки к клеткам, экспрессирующим альфа-v-бета-3

Also Published As

Publication number Publication date
CN101193916A (zh) 2008-06-04
AU2005314392B2 (en) 2011-04-14
PL1819359T3 (pl) 2015-08-31
CN101193916B (zh) 2012-09-05
TWI400087B (zh) 2013-07-01
WO2006062779A3 (en) 2008-01-17
IL183695A0 (en) 2007-09-20
UA94388C2 (ru) 2011-05-10
BRPI0515745A (pt) 2008-08-05
DK1819359T3 (en) 2015-04-20
PT1819359E (pt) 2015-05-28
NO20073493L (no) 2007-09-06
AR052041A1 (es) 2007-02-28
EP1819359A4 (en) 2010-04-28
MX2007007011A (es) 2007-09-21
HK1107001A1 (en) 2008-03-28
EP1819359B1 (en) 2015-03-18
US20060127407A1 (en) 2006-06-15
AU2005314392A1 (en) 2006-06-15
EA200701250A1 (ru) 2008-06-30
KR20070089220A (ko) 2007-08-30
TW200635606A (en) 2006-10-16
SG158119A1 (en) 2010-01-29
HUE025449T2 (en) 2016-04-28
US8603483B2 (en) 2013-12-10
ZA200705556B (en) 2008-12-31
EP1819359A2 (en) 2007-08-22
ES2539126T3 (es) 2015-06-26
WO2006062779A2 (en) 2006-06-15
NZ555601A (en) 2009-07-31
CA2591148A1 (en) 2006-06-15
US20140093523A1 (en) 2014-04-03
KR101281501B1 (ko) 2013-07-15
JP5421532B2 (ja) 2014-02-19
JP2008523062A (ja) 2008-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013323B1 (ru) Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения
US11814435B2 (en) Therapeutic antibodies and their uses
US11279764B2 (en) Antibodies specific for epidermal growth factor receptor variant III and their uses
US11091544B2 (en) Antibodies specific for Trop-2 and their uses
CN109923128A (zh) 用于用抗cd20/抗cd3双特异性抗体进行治疗的给药
CN108064244A (zh) 抗体药物缀合物
CN104119439A (zh) 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
CN105745224B (zh) 用于治疗癌症的针对ly75的偶联抗体
CN109496149A (zh) 抗体及其药物缀合物的制剂
CN116419747A (zh) 靶向cd46的免疫偶联物及其使用方法
US11219689B2 (en) Boron enriched linker (“BEL”) compositions for boron neutron capture therapy and methods thereof
TW202348252A (zh) 用治療性結合分子治療癌症的組合療法
JPWO2022032020A5 (ru)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU