CN101193916A - 抗整联蛋白免疫缀合物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗整联蛋白特异性抗体与细胞毒性化合物的缀合物、所述缀合物的合成、选择和用于癌症治疗或其它疾病的用途，所述其它疾病由细胞增殖、细胞迁移或炎症介导，其病理学涉及新组织的血管生成或新生血管化。另外，本发明涉及这种疾病的组合治疗，其中所述治疗包括所述缀合物组合一种或多种其它治疗形式的用途，所述治疗形式包括但不限于：化疗、手术或放疗。优选的缀合物包含通过二硫键连接至抗体的类美登醇(maytansinoid)化合物，优选的化疗药物是多柔比星、紫杉烷、喜树碱、鬼臼毒素、核苷类似物或嘧啶类似物。

Description

抗整联蛋白免疫缀合物、方法和用途
发明背景
发明领域
本发明涉及肿瘤特异性抗体与细胞毒性化合物的缀合物。优选的缀合物包含通过二硫键连接至抗整联蛋白抗体的类美登醇(maytansinoid)化合物。
发明背景
已有众多尝试通过将抗肿瘤药物缀合至抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体(Mab)，以便通过对肿瘤的靶向传递提高所述药物的局部浓度，来提升此抗肿瘤药物的效力。相反，抗体实际破坏肿瘤细胞的能力不限于涉及封闭增殖刺激物的抗体，例如通过阻断配体结合受体或阻断向受体的信号转导来封闭生长因子EGF和Her-2(ErbB1和ErbB2)，或激发效应物功能(ADCC或CDC)的抗体。因此，已在寻找组合Mab的特异性和代谢毒物的杀伤能力的产物。以前的实例是缀合多柔比星的Mab BR96(Braslawsky等，Cancer Immunol Immunother33：367-374，1991)和融合至抗生长因子抗体或片段的假单胞菌属外毒素(Kreitment等，Internat.J.Immunopharm.14(3)：465-72，1992)。
这些尝试遇到了无法预见的限制，例如需要相对每个细胞的外部结合位点数量的高胞内毒素浓度。如果癌细胞表面上的肿瘤相关抗原的数量估计为105个分子/细胞，则可有效用于这些缀合物的细胞毒性剂必须对靶癌细胞具有10-10-10-11M的IC50值。(Chari，R.V.J.Adv.Drug Delivery Rev.1998，31，89-104)。其次，所述药物必须在结合至靶时被释放并穿透细胞，或者整个构建物必须被转运到细胞中，毒素在那里被切下或活化。
这些缺点有一些可通过使用缀合至内化抗体的高度有效药物和使用在胞内条件下具有增强的不稳定性的化学键或大或小程度地解决。Chari等(Cancer Res.52：127-131，1992；Liu等，Proc.Natl.Acad.SciUSA 93：8618-8623，1996；美国专利第5,208,020号)开发了其中抗体经二硫键连接至类美登醇的抗体缀合物。
类美登醇是植物源的抗真菌和抗肿瘤剂。S.M.Kupchan等首先报告由卵叶美登木(Maytenus ovatus)和山檨美登木(Maytenusbuchananii)的乙醇萃取物中分离出3种柄型大环内酯，它们连同其在鼠模型中以μg/kg剂量范围抗白血病作用的论述一起是美国专利第3,896,111号的主题。然而，类美登醇具有不可接受的毒性，引起中枢和外周神经病变以及副作用：尤其是恶心、呕吐、腹泻、肝功能检测指标升高以及少见的虚弱和嗜睡。因此，一段时间以来，寻找正确的靶向部分连同合适的化学处理以形成具有可接受的降解半衰期的美登素-抗体缀合物已成为研究焦点。
与游离类美登醇的高细胞毒性相反，抗体缀合物具有的对抗原阴性细胞的毒性比对抗原阳性细胞的毒性低几个数量级。通过二硫键合连接具有以下优势：这些键在靶细胞内容易被胞内谷胱甘肽裂解，释放高毒性游离药物。该方法已应用于抗肿瘤相关抗原的抗体，例如C242-DM1缀合物(Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：8618-8623，1996)和HuN901-DM1(Chari等，2000)。但是，这些缀合物的应用由于各自靶抗原的有限表达而受限。
因此，仍有需要如下改进该方法：使用靶向更高表达的肿瘤相关抗原的抗体，任选所述抗原在恶性肿瘤的增殖和转移期高表达，由此允许天然浓度的毒素靶向最有毒力的细胞。
抗整联蛋白单克隆抗体
相当多的证据表明，进行性肿瘤生长依赖于血管生成，血管生成形成新血管，为肿瘤提供营养和氧，带走废物并用作肿瘤细胞转移至远处位置的导管(Gastl等，Oncol.54：177-184)。近期研究进一步确定了整联蛋白在血管生成过程中的作用。在血管生成当中，许多在活化的内皮细胞表面上表达的整联蛋白调节与各种ECM蛋白的关键性粘附相互作用，以调节不同的生物事件，例如细胞迁移、增殖和分化。具体地说，业已表明密切相关但不同的整联蛋白αVβ3和αVβ5介导血管生成过程中的独立途径。针对αVβ3产生的抗体阻断碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱发的血管生成，而对αVβ5特异性的抗体抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱发的血管生成(Eliceiri等，J.Clin.Invest.103：1227-1230(1999)；Friedlander等，Science 270：1500-1502(1995))。因此，整联蛋白，尤其是含αV亚单位的整联蛋白，是用于涉及血管生成的疾病(例如眼和肿瘤疾病)、组织重塑(例如再狭窄)和某些细胞类型的增殖(尤其是上皮和鳞状细胞癌)的合理治疗靶标。
抗体药物缀合物
业已描述了细胞结合剂与高度细胞毒性的美登素的缀合物(美国专利第5,208,020号和第5,416,064号；R.V.J.Chari等，1992Cancer Res.52：127-131)。业已开发了某些用于与蛋白胺基反应的试剂或反应物，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，用于形成药物-蛋白缀合物。该类试剂一般描述于Carlsson等，Biochem J.173：723，1978和美国专利第4,149,003号。在WO2004/016801中公开了用于美登素与Mab和其它蛋白缀合的硝基-吡啶基连接试剂。
在以上援引的方法中，细胞结合剂用双功能剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)修饰，以导入活性二硫化物部分。与含巯基的细胞毒性剂反应提供了缀合物，其中细胞结合剂如单克隆抗体和药物经二硫键连接。发现C-3羟基位置可被修饰而不损失活性，实际上，发现某些酯具有增强的细胞杀伤活性(关于综述，参见Cassady等，Chem Pharm Bull 52(1)：1-26，2004)。美国专利第5,208,020号和5,416,064号具体教导了活化的N-甲基-N-(3-甲基二硫代丙酰基)-L-丙氨酸的美登醇酯的应用。得自该反应的类美登醇部分在二硫键还原性裂解时被释放，命名为DM1[N2′-脱乙酰-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，CAS注册号139504-50-0]。因此，使用甲基二巯基化形式的DM1制备的所有缀合物都保有未取代的亚甲基碳，其邻接缀合物药物侧的二硫键(图1)。
为了增强此二硫化物连接的体内稳定性，重要之处在于提供先前已提到的空间位阻型二硫键(Thorpe等，Cancer Research 47：5924-31，1987)。该目标可通过使用在邻接二硫键的碳原子上携带一个或两个甲基取代基的交联剂实现，或使用在邻接巯基的α-碳原子上具有至少一个取代基或具有二硫化物取代基的活性药物实现。
尽管现在清楚认识到靶向传递的问题，但发现一种抗体特异性和亲和性、缀合化学性质和毒素的适宜组合是无法预见的。本发明的一个目标是提供新的抗体美登素缀合物，其中所述抗体针对细胞表面抗原，其数量足以传递杀细胞剂量的类美登醇，所述缀合物具有合适的化学和生物稳定性，以在给予受试者时提供治疗有效的释放速率。
发明概述
本发明的一个目标是提供新的抗体美登素缀合物，其中所述抗体针对细胞表面抗原，其数量足以传递杀细胞剂量的类美登醇，其中所述抗体已知在结合靶抗原后被细胞内化。在一个具体实施方案中，所述缀合物包含已通过置换邻接的亚甲基碳而被工程改造的二硫键，以在给予受试者时提供治疗有效的释放速率。在一个具体实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物，其包含：结合人αV整联蛋白亚单位的抗体，该抗体缀合至具有10-9M或以下的IC50的细胞毒性剂，其中所述抗体-药物缀合物对表达αV整联蛋白的癌细胞系发挥细胞毒性或细胞抑制作用。在该实施方案中，本发明的抗体对异二聚化整联蛋白受体如αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6或αVβ8异二聚化整联蛋白或其片段的至少一个αV亚单位是特异性的。优选的缀合物包含通过二硫键连接至所述抗体的类美登醇化合物，所述抗体能够结合玻连蛋白和纤维蛋白原。
在一个方面，本发明的抗体缀合物由下式表示：
[C-L]m-A    I
其中，A是人αV整联蛋白亚单位特异性抗体，其中所述抗体能够由表达所述αV亚单位的细胞内化；C是具有10-9M或以下的IC50的细胞毒素；L是结合所述抗体和细胞毒素的连接基团，其还含胞内环境组分可裂解的键；而m代表连接至所述抗体的细胞毒素分子的平均数，为1-10的整数，具体地说为3-4。所述细胞毒素可选自类美登醇、加里刹霉素(calicheamicin)、埃坡霉素、discodermolide、eleuthrobin、多拉司他汀、隐藻素(cryptophycin)、喜树碱、根霉素(CAS注册号90996546)或紫杉烷衍生物以及在10-9M或以下对肿瘤细胞生长表现出半最大抑制(IC50或GI50)的其它这种化合物。
在本发明第一个目标的一个方面，抗αV整联蛋白抗体-类美登醇缀合物包括含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含与单克隆抗体CNTO 95竞争结合异二聚化人整联蛋白受体的αV亚单位的抗体。在一个实施方案中，所述抗体包含来源于称为CNTO 95的抗体的重链或轻链的至少一部分互补决定区(CDR)或其配体结合部分，并组合可与CDR一起掺入到抗体中的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分。本文描述的抗体CNTO 95是来源于含表达人免疫球蛋白的基因的免疫转基因小鼠的人抗αV抗体。因此，在一个实施方案中，本发明涉及含源自CNTO 95抗体的至少一个CDR区或可变区的抗体。在一个优选实施方案中，所述抗体是CNTO 95。
在本发明的另一方面，抗体-类美登醇缀合物包含美登素酯，其在胞内环境组分将连接细胞毒素C至连接基团L的键裂解时被释放。在一个实施方案中，所述类美登醇于C-3、C-14、C-15或C-20被酰化氨基酸酯化，其中所述酰基携带受保护的巯基，其中邻接受保护巯基的所述酰基的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基为CH3、C2H5、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基、杂环烷基或H；其中所述酰基在羰基官能团和硫原子之间具有至少两个碳原子的直链长度。在一个优选实施方案中，所述类美登醇为3-美登醇酯，所述酰化氨基酸基团在邻接受保护巯基的碳原子上具有0、1或2个甲基。在一个优选实施方案中，酯化美登醇选自N2′-脱乙酰-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，CAS注册号139504-50-0)、N2′-脱乙酰-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N2′-脱乙酰-N2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
本发明的第二个目标是提供抗整联蛋白抗体-类美登醇缀合化合物，用于治疗由异常增殖引起的、以新生血管化为特征的人增殖疾病。在一个特别优选的实施方案中，本发明的化合物用于治疗癌症的方法，所述癌症包括乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌或骨癌。本发明的化合物可单独地或与其它药物组合用于预防或治疗原发癌或预防或治疗转移性疾病。
本发明第二个目标的另一个方法涉及抗整联蛋白抗体类美登醇缀合化合物与化疗剂在癌症治疗方法中的组合用途。优选的缀合物包含通过二硫键连接至抗体的类美登醇化合物，优选的化疗剂为多柔比星、紫杉烷、喜树碱、鬼臼毒素、核苷类似物或嘧啶类似物。
在本发明的第三个目标中，以一种方法制备所述抗体-类美登醇缀合物，由此使所述抗体与双功能化学连接试剂如N-琥珀酰亚胺基-(2-吡啶基硫代)链烷酸酯反应，随后与预活化的类美登醇反应，由此发生二硫化物交换，以在所述抗体和类美登醇之间产生位阻型二硫键。
在本发明的另一方面，所述抗体-类美登醇缀合物使用其中酰基部分携带受保护巯基的美登醇酯制备。在一个实施方案中，所述类美登醇于C-3、C-14、C-15或C-20被酰化氨基酸酯化，其中所述酰基携带受保护的巯基，其中邻接受保护巯基的所述酰基的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基选自：CH3、C2H5、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基、杂环芳基部分、杂环烷基部分或H；其中所述酰基在羰基官能团和硫原子之间具有至少两个碳原子的直链长度。在一个优选实施方案中，所述类美登醇为3-美登醇酯，所述酰化氨基酸基团在邻接受保护巯基的碳原子上具有0、1或2个甲基。在一个优选实施方案中，酯化美登醇选自N2′-脱乙酰-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，CAS注册号139504-50-0)、N2′-脱乙酰-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N2′-脱乙酰-N2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在本发明的另一方面，基本以携带活性酯的类美登醇与未预先化学活化的抗整联蛋白抗体的单步反应，制备抗αV整联蛋白抗体-类美登醇缀合物。类美登醇的活性酯可为N-琥珀酰亚胺酯、N-硫代琥珀酰亚胺酯、N-邻苯二甲酰亚胺酯、N-硫代邻苯二甲酰亚胺酯、2-硝基苯酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3-磺酰-4-硝基苯酯或3-羧基-4-硝基苯酯。
附图简述
图1显示了具有优选种类的巯基化美登素酰胺的化学结构；注解了DM1、DM3和DM4。
图2显示了本发明的优选双功能连接试剂的化学结构及其化学名词首字母缩写。
图3是一幅示意图，显示了制备本发明的抗体-类美登醇缀合物的合成方法。
图4图示了裸小鼠中人黑素瘤随时间推移的体积变化以及给予CNTO 95的作用。小鼠用A375.S2细胞(3×106)皮下接种，3天后开始给予CNTO 95或对照。每周3次用CNTO 95或载体以10mg/kg的剂量腹膜内治疗小鼠。各个数据点是10只患肿瘤动物的平均肿瘤体积(±SEM)。在第26天时，与对照治疗的动物相比，每周给予3次的CNTO 95显著抑制肿瘤生长(P＝0.0005)。
图5图示了裸大鼠中人黑素瘤随时间推移的体积变化以及给予CNTO 95的作用。大鼠用A375.S2细胞(3×106)皮下接种，3天后开始给予CNTO 95或对照。每周1次用CNTO 95或载体以10mg/kg的剂量静脉内治疗大鼠。各个数据点是9只患肿瘤动物的平均肿瘤体积(±SEM)。
图6图示了裸小鼠中A375.S2人黑素瘤细胞随时间推移的生长。肿瘤体积表示为平均值±SEM(n＝9或10)。箭头表示静脉内药物注射。星号表示1只未响应动物由于其肿瘤体积超过1500mm3而被处死。
图7图示了无胸腺裸大鼠中人A375.S2黑素瘤细胞的生长。在第14天时，当平均肿瘤体积达到250mm3时，将所述动物随机分组，给予首剂药物。所有动物都在第35天时被处死。肿瘤体积表示为平均值±SEM(n＝9或10)。箭头表示静脉内药物给予的天数。
图8图示了带肿瘤小鼠的总体重随时间推移的变化，所述小鼠在肿瘤植入后第7天注射，并每7天再注射5次3、6或10mg/kg CNTO364；在第7和14天注射25mg/kg CNTO 364或F105-DM1，以及在第7、14和35天注射15mg/kg CNTO 364。
图9图示了与图8中相同的动物的肿瘤体积随时间推移的变化。
图10图示了如图8所述各组中所有动物的个体肿瘤体积。
图11是裸大鼠随时间推移的平均体重±SEM(n＝6)的图表，所述裸大鼠带有皮下人A549人肺癌肿瘤，并用15mg/kg的CNTO 364治疗或进行对照治疗。箭头表示静脉内药物注射的时间。
图12图示了雌性无胸腺大鼠中人A549人肺癌肿瘤的生长。CNTO 364(15mg/kg)治疗消退了雌性无胸腺大鼠中的既有A549人肺癌肿瘤。
图13是一幅散点图，显示了在用15mg/kg CNTO364或对照物质治疗的雌性无胸腺大鼠中人A549人肺癌肿瘤生长研究结束时的个体肿瘤重量。水平线表示各个研究组的中值。
图14A和B图示了大鼠中的平均肿瘤体积随时间推移的变化，所述大鼠带有HT29人结肠肿瘤细胞，用CNTO 364(CNTO 95-SPP-DM1)、CNTO 365(CNTO 95-SSNPB-DM4)和CNTO 366(CNTO 95-SSNPP-DM4)治疗。A.PBS对照和不相关抗体F105，使用相同方法和试剂将其缀合至巯基化美登素，并在第7和21天以10mg/kg注射。B.如所述的PBS对照和缀合抗体，在第7和21天以20mg/kg注射，只有CNTO 365组在第7天接受单次注射。
图15A和B图示了如图14所述带有HT29肿瘤的大鼠的体重平均变化。
发明详述
1.定义
为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。其它定义在整个详述中陈述。
术语“αV整联蛋白”、“αV亚单位整联蛋白”和“含αV亚单位的整联蛋白”在本文可互换使用，指功能性整联蛋白异二聚体的αV跨膜糖蛋白亚单位，包括αV的所有变体、同种型和种同源物。因此，在某些情况下，本发明的抗体可与非人物种的αV或结构上与人αV相关的其它蛋白(例如人αV同源物)交叉反应。在其它情况下，抗体对人αV可为完全特异性的，不表现出种或其它类型的交叉反应性。
本文使用的“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。因此，所述抗体包括含分子的任何蛋白或肽，该分子包含至少一部分免疫球蛋白分子，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架(FR)区或其任何部分，或至少一部分结合蛋白，它们可掺入到本发明抗体中。抗体可为鼠、人、人源化或嵌合抗体。
“抗原结合片段”或其部分包括单链抗体及其片段。功能性片段包括结合哺乳动物αV亚单位的抗原结合片段。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，在铰链区含二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用的接头太短，以至于不允许在相同链上的两个结构域之间配对，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接，所述接头能使这两个结构域成为单一蛋白链，其中VL和VH区配对，形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。这种单链抗体也计划包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，以和完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。如本领域所知和/或本文描述的，这种片段可通过酶切、合成或重组技术生产。
术语“表位”指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面分子群组成，通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于与前者而非后者的结合在存在变性溶剂时消失。术语“天然构象表位”或“天然蛋白表位”在本文可互换使用，包括由整联蛋白分子的构象折叠产生的蛋白表位，其在整联蛋白分子线性序列的不同部分的氨基酸在三维空间中紧密聚集时产生。这种构象表位分布在细胞质膜的胞外侧上。
本文使用的术语“人抗体”意欲包括具有来源于或紧密匹配于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过随机或定点诱变体外导入的突变或通过体细胞突变体内导入的突变)。因此，本文使用的术语“人抗体”指其中蛋白的基本每个部分(例如CDR、构架区、CL、CH结构域(例如CH1、CH2、CH3)、铰链区、(VL、VH))都大致类似于人种系抗体的抗体。已基于人抗体的氨基酸序列相似性将人抗体分为几组，参见例如http://people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcgO7s/。因此，使用序列相似性检索，可选择具有相似线性序列的抗体作为模板，以产生“人源化抗体”。
“人源化”(也叫做重构或CDR-嫁接)现在是一种已充分确立的技术，用于降低异种源(通常为啮齿动物)的单克隆抗体(mAb)的免疫原性，用于提升效应物功能(ADCC、补体活化、Clq结合)。使用分子生物学技术对工程改造的mAb进行工程改造，但是，单纯将啮齿动物互补决定区(CDR)CDR-嫁接入人构架区中经常导致失去原始mAb的结合亲和性和/或特异性。为了人源化抗体，人源化抗体的设计包括诸如在CDR残基中的保守氨基酸置换的改变，以及将啮齿动物mAb的残基回复置换入人构架区中(回复突变)。可通过结构分析的序列比较或通过分析可变区3D结构的同源模型，辨别或鉴别位置。最近，亲和成熟方法使用噬菌体文库来改变选定位置的氨基酸。同样，已使用许多方法来选择其中嫁接啮齿动物CDR的最合适人构架区。由于抗体结构的已知参数的数据集增加，所以对这些技术进行完善和改进。可使用单个抗体或几种不同人mAb的各个轻链或重链可变区中的构架序列片段的共有或种系序列。另一种人源化的方法是仅将啮齿动物序列的表面残基修饰为人mAb中存在的最常见残基，称为“重塑”或“镶饰”。公开了已知的人Ig序列，例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.ncbi.nih.gov/igblast；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.kabatdatabase.com/top.html；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.appliedbiosystems.com；www.biodesign.com；antibody.bath.ac.uk；http://www.unizh.ch/～antibody/；www.cryst.bbk.ac.uk/～ubcgO7s；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，它们各自都通过引用整体结合到本文中。
“嵌合抗体”是保有一个物种的独特结构域(通常为可变结构域)而余下的结构域来自另一物种的抗体；例如小鼠-人嵌合体。
本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子的制备物。在一个实施方案中，人单克隆抗体通过杂交瘤产生，杂交瘤包含得自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞，具有融合至永生化细胞的含人重链转基因和轻链转基因的基因组。但是，一般来说，克隆抗体编码序列，并插入宿主细胞或生产细胞系中。
本文使用的术语“重组宿主细胞”(或只是“宿主细胞”)意指重组表达载体已导入其中的细胞。应当理解的是，此术语不仅意指特定的目标细胞，而且指此细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后代中产生，所以这种子代实际上与亲代细胞可能不完全相同，但仍包含在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如CHO系或小鼠骨髓瘤SP/0衍生细胞系。
本文使用的术语“重组人抗体”包括所有人或人源化抗体，它们通过重组方法制备、表达、建立或分离，例如(a)分离自动物(例如小鼠)或由该动物制备的杂交瘤的抗体，所述动物对人免疫球蛋白是转基因的或是转染色体的，(b)分离自宿主细胞的抗体，所述宿主细胞被转化以表达所述抗体，例如分离自转染瘤的抗体，(c)分离自重组的组合人抗体文库的抗体，和(d)通过任何其它方法制备、表达、建立或分离的抗体，所述方法包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列。
本文使用的“分离抗体”意指基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合αV的分离抗体基本不含特异性结合非αV抗原的抗体)。但是，特异性结合人αV的表位、同种型或变体的分离抗体可与例如来自其它物种的其它相关抗原(例如αV种同源物)具有交叉反应性。而且，分离抗体可基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
本文使用的“特异性结合”指抗体结合预定抗原。通常，所述抗体以10-7M或以下的解离常数(KD)结合，其结合预定抗原的KD比其结合预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD低至少两分之一。
本文使用的“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如IgM或IgG1)。
缩写
Ab        多克隆或单克隆抗体
αV       整联蛋白亚单位αV
b3        整联蛋白亚单位β3
bFGF      碱性成纤维细胞生长因子
HUVEC     人脐静脉内皮
IFN       干扰素
Ig        免疫球蛋白
IgG       免疫球蛋白G
Mab       单克隆抗体
NPB＝N-琥珀酸亚胺基-5-硝基-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯
SMCC＝4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酸亚胺酯
SMNP＝4-甲基-4-(5-硝基-2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酸亚胺酯
SMPT＝4-琥珀酸亚胺基氧基羰基-(2-吡啶基二硫代)甲苯
SPDB＝4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酸亚胺酯
SPDP＝3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酸亚胺酯
SPP＝4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酸亚胺酯
SP＝N-琥珀酸亚胺基4-(2-吡啶基)
SS＝硫代琥珀酸亚胺基
SSNPP＝N-琥珀酸亚胺基-4-(5-硝基-2-吡啶基二硫代)戊酸磺基琥珀酸亚胺酯
VEGF    血管内皮生长因子
2.组合物
A.本发明的抗体缀合物
本发明的抗体缀合物由下式表示：
[C-L]m-A    I
其中，A是人αV整联蛋白亚单位特异性抗体，其中所述抗体能够由表达所述αV亚单位的细胞内化；C是具有10-9M或以下的IC50的细胞毒素；L是结合所述抗体和细胞毒素的连接基团，其还含胞内环境组分可裂解的键；而m代表连接至所述抗体的细胞毒素分子的平均数，为1-5的整数，优选3-4。所述细胞毒素可选自类美登醇、加里刹霉素、埃坡霉素、discodermolide、eleuthrobin、多拉司他汀、隐藻素、喜树碱、根霉素(CAS注册号90996546)或紫杉烷衍生物以及在10-9M或以下对肿瘤细胞生长表现出半最大抑制(IC50或GI50)的其它这种化合物。
含胞内可裂解键的连接基团包括酸不稳定键，例如顺式-乌头键、酯、酸敏感性腙键、溶酶体可降解的肽连接基团、水解酶可剪切的连接基团、肽酶或蛋白酶特异性连接基团和二硫化物(巯基)连接基团(综述参见Dyba，M.等，2004Curr Pharm Design 10：2311-2334)。相对于在例如循环中占优势的条件，通过能够在胞内条件下更快速和选择性地切割，所述连接基团赋予缀合物整体药动学进一步的特异性和安全性。由于细胞区室中的有利还原能力以及可诱导的氧化还原酶活化，特别优选二硫键(Saito，G.等，Adv.Drug Delivery Rev2003  55：199-215)。在本发明的一个实施方案中，所述键处于抗体分子中(例如在半胱氨酸侧链中)存在的硫原子和毒性化合物中存在的另一个硫原子之间。在另一个实施方案中，所述连接部分由一个或多个原子或化学基团组成。
化学连接生物分子如重组蛋白至化合物时的另一个主要考虑因素是，衍生化的化学物质可以并在大多数情况下将产生可具有迄今未知的生物特性的新分子实体。因此，应当理解的是，生理裂解的产物应设计用于产生具有生物活性的预期衍生物。本发明的类美登醇包括DM1、DM3、DM4和如图1所示和描述的其它物质，它们保有生物活性。
通过将抗αV抗体化学连接至类美登醇分子制备本发明的抗αV整联蛋白抗体-类美登醇缀合物，而不明显降低抗体的生物活性，并提供在生理条件下被释放时保有其细胞毒性能力的类美登醇。合适的类美登醇的实例是美登醇和美登醇类似物的酯，包括但不限于具有修饰芳环的酯和在C-19、C-20或C-14或C-15或C-4，5具有脱氧修饰的酯。优选美登醇C-3酯。特别优选的类美登醇是美登醇的N-甲基-丙氨酸酯(N2′-脱乙酰-美登素)衍生物。特别优选的缀合物包含二硫键，其在被还原裂解时释放携带游离巯基的对应类美登醇。含巯基的优选类型的类美登醇示于图1：N2′-脱乙酰-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，CAS注册号139504-50-0)、N2′-脱乙酰-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N2′-脱乙酰-N2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
可使用目前已知的或以后开发的任何技术形成本发明的抗体分子与毒性化合物的缀合物。例如，可修饰细胞毒性化合物，以产生游离氨基，然后经酸不稳定连接基团或光不稳定连接基团连接至抗体分子。毒性化合物可与肽缩合，随后连接至抗体分子，以产生肽酶不稳定性连接基团。可处理毒性化合物，以产生伯羟基，其可琥珀酸化，并连接至抗体分子，以产生可被胞内酯酶裂解以释放游离药物的缀合物。
为了在抗体A和细胞毒素C之间建立二硫键，优选地，处理毒性化合物，以产生游离或受保护的巯基，然后将含一个或多个二硫基或巯基的毒性化合物经二硫键共价连接至抗体分子。二硫键不需要直接与抗体的游离巯基形成，但可通过衍化抗体内任何反应基团以导入用于二硫基交换的位点来形成，例如通过将双功能连接基团偶联至抗体中的游离胺基。例如，抗体分子可通过已知方法用诸如以下的交联试剂修饰：3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酸亚胺酯(SPDP)、4-琥珀酸亚胺基-氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酸亚胺酯(SDPB)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酸亚胺酯(SPP)、5-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酸亚胺酯、2-亚氨硫代环戊烷(IT)或乙酰琥珀酸酐。
由此以式II表示本发明的抗αV整联蛋白抗体-细胞毒素缀合物，其中美登醇在C-3处酯化；抗体为抗αV整联蛋白亚单位抗体；R1、R2、X1和X2独立为H、Me、C2H5、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基部分或杂环烷基部分；n为1-5；p为1-5；m为1-10。
Figure A20058004781300221
在一个优选实施方案中，连接部分为衍生于SPP的4-硫代戊酸酯或4-硫代戊酸酯。然后使如此衍生的含游离或受保护巯基的抗体分子与含二硫键或巯基的毒性化合物反应，以产生缀合物。所述缀合物可通过HPLC或凝胶过滤纯化。
B.本发明的抗αV亚单位抗体
除了结合αV以外，可根据其保留的本发明抗体的其它功能特性，选择如上所述的人抗体或其抗原结合片段或部分，所述功能特性例如为：
1)结合表达人αV的活细胞；
2)阻止活细胞结合基质蛋白；
3)以10-8M或以下(例如10-9M或10-10M或以下)的KD结合人αV；
4)表现出与αV的钙非依赖性结合；
5)结合αV上的或属于结合αV的抗体的独特互补群的特有表位；
6)在体外或体内抑制血管生成；或
7)缩小肿瘤实体或防止肿瘤体内生长。
在本发明的另一方面，使用本发明的人抗αV抗体CNTO 95的结构特征建立结构相关的人抗αV抗体，其保有至少一种本发明抗体的功能特性，例如结合αV。更具体地讲，CNTO 95的一个或多个CDR区可与已知人构架区和CDR重组组合，以建立额外的、重组工程改造的本发明人抗αV抗体。
在一个优选实施方案中，在本文描述的抗αV抗体缀合物中使用的抗体是来源于免疫转基因小鼠的人抗αV抗体，该小鼠含表达人免疫球蛋白的基因。抗体制备详述于PCT公开号WO 02/12501和美国公开号2003/040044，这两个文献均通过引用结合到本文中。所述抗体包括含分子的任何蛋白或肽，所述分子含来源于称为“CNTO 95”(参见PCT公开号WO 02/12501和美国公开号2003/040044)的抗体的重链或轻链的至少一部分互补决定区(CDR)或其配体结合部分，并组合可掺入到抗体中的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分。
优选地，上述工程改造的抗体的CDR1、2和/或3包含与完整人Mab的氨基酸序列完全一样的氨基酸序列，所述完整人Mab称为CNTO 95、Gen0101、CNTO 95、C371A，通过免疫如本文所公开的转基因小鼠产生。但是，一般技术人员会认识到，有可能与CNTO 95的确切CDR序列有一些偏差，但仍保持所述抗体有效结合αV的能力(例如保守置换)。在一个具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可具有抗原结合区，其含至少一个重链CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，所述CDR具有对应CDR 1、2和/或3的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1、2和/或3)。在另一个具体实施方案中，抗体或抗原结合部分或变体可具有抗原结合区，其含至少一个轻链CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，所述CDR具有CNTO 95轻链对应CDR 1、2和/或3的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：4、5和/或6)。在一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段的3个重链CDR和3个轻链CDR具有mAb CNTO 95的对应CDR的氨基酸序列。因此，在另一个实施方案中，工程改造的抗体可由一个或多个CDR组成，所述CDR与CNTO 95的一个或多个CDR例如90％、95％、98％或99.5％相同。本发明的抗αV亚单位抗体可包括但不限于选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6中至少一个的5个至全部连续氨基酸的至少一部分、序列或组合。抗αV亚单位抗体还任选包含SEQID NO：7、8中至少一个的至少一种70-100％连续氨基酸的多肽。例如，轻链可变区的氨基酸序列可与SEQ ID NO：8的序列对比，或者重链CDR3的氨基酸序列可与SEQ ID NO：7对比。
如本文所公开并要求保护的，SEQ ID NO.1-8显示的序列包含“保守序列修饰”，即不显著影响或改变由核苷酸序列编码或含所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸序列修饰。这种保守序列修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰导入SEQ ID NO：1-8中或导入编码其的核酸中。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸置换。本领域已确定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳基侧链的氨基酸(例如缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)。因此，在人抗αV抗体中的预测非必须氨基酸残基优选被相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。
本发明的至少一种抗体结合对至少一种αV亚单位蛋白、亚单位、片段、部分或其任何组合特异性的至少一个特定表位。所述至少一个表位可包括含有所述蛋白的至少一部分的至少一个抗体结合区，所述表位优选由所述蛋白的至少一个胞外、可溶、亲水、外部或胞质部分组成。所述至少一个特定表位可包含至少1-3个氨基酸的至少一个氨基酸序列到SEQ ID NO：9整个指定部分的连续氨基酸的任何组合。
如先前所陈述的，本发明还涉及含与本文所述氨基酸序列基本相同的序列中的氨基酸的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR。优选地，这种抗体或抗原结合片段和含这种链或CDR的抗体可以高亲和性(例如低于或等于约10-9M的KD)结合人αV亚单位。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括含保守氨基酸置换以及氨基酸缺失和/或插入的序列。
在本发明的抗αV亚单位抗体中对功能必须的氨基酸可通过本领域已知的方法鉴别，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，出处同上，第8、15章；Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后述方法将单个丙氨酸突变导入到分子中的每个残基。然后测试所获突变分子的生物活性，例如但不限于至少一种αV亚单位中和活性。对抗体结合关键的位点还可通过结构分析来鉴别，例如通过结晶、核磁共振或光亲和性标记(Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos等，Science 255：306-312(1992))。
3.缀合物的制备方法
可通过还原性裂解由分离自天然来源的天然C-3酯美登素(Kupchan等，J.Amer.Chem.Soc.97，5294(1975))制备起始化合物美登醇，其用于生产本发明的化合物DM1、DM3和DM4以及相关的活化类美登醇(图1)。处于-40℃四氢呋喃中的试剂三甲氧基氢化铝锂对该步骤特别有用。其它天然类美登醇酯还可有利地通过培养微生物生产，所述微生物属于诺卡氏菌属(美国专利第4,151,042号)或束丝放线菌(Actinosynnema spp.)，它们已被工程改造，以在培养基中生产美登醇、美登素或C-3美登醇酯，例如美登醇丙酸酯，并由培养基中提取化合物，用于进一步的纯化。有许多本领域已知的连接基团用于制备抗体类美登醇缀合物，包括例如二硫基、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定性肽连接基团或可为酸不稳定的或酯酶可酶切的酯。
如美国专利第5,208,020号所教导的；用含甲基二硫代基团或其它受保护硫代基团的羧酸(包括例如N-甲基-N-[3-(甲基二硫代)-1-氧代丙基]-L-丙氨酸)酯化美登醇或类似物产生相应的含二硫基的类美登醇。对于获得含D和L酰基侧链的两种非对映体产物的情况，通过本领域已知的方法容易分离非对映体类美登醇酯，还原不希望的D-丙氨酰类似物异构体产物以回收美登醇，如WO03096782中教导。用二硫苏糖醇还原性裂解二硫基获得相应的含巯基的类美登醇，其容易经二硫键或硫醚键连接至细胞结合剂。巯基-类美登醇可通过使用C18柱的HPLC以采用水-乙腈梯度洗脱的反相模式纯化。
双功能偶联试剂。已知在两种物质(其中至少一种含蛋白或多肽)的缀合物的制备中使用双功能剂，以便将缀合物的组分共价偶联，缀合分子中的氨基一般用于缀合反应。双功能蛋白偶联剂包括(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺并甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酸亚胺酯、亚氨硫代环戊烷(IT)、亚氨酯的双功能衍生物如已二亚氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate)·HCl、活性酯如辛二酸二琥珀酰亚胺酯、醛如戊二醛、双叠氮化物如双(对-叠氮苯甲酰)己二胺、双-重氮基衍生物如双-(对-重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如亚苄基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。SPDP是其中最常用于该用途的试剂，许多其它的N-琥珀酰亚胺基-(2-吡啶基二硫代)-、N-琥珀酰亚胺基-(5-硝基-2-吡啶基二硫代)-或N-琥珀酰亚胺基-(4-吡啶基二硫代)-短链烷酸已被证实有用。图2显示了常用的双功能连接基团的结构及其首字母缩写。
活化抗体与巯基化类美登醇的缀合。CNTO 95-类美登醇缀合物的制备遵循先前描述的方法(Chari等，Cancer Res.52：127-131，1992和美国专利5,208,020)，概述于图3。在该方法中，用双功能连接基团以5-10∶1范围的连接基团对抗体比率修饰抗体，以在抗体氨基酸侧链上导入二硫代吡啶基。通过G25凝胶过滤层析分离活化的抗体与剩余的连接基团。纯化后的连接基团抗体比率低于5-10∶1，通常在3-5∶1的范围内，以252nm和280nm的吸光度检测。以比检测的连接基团摩尔数过量的摩尔数加入活化的巯基-类美登醇。在缀合后，再通过G25大小排阻层析纯化混合物，以产生原液。
在替代方案中，基本上通过带有活性酯的类美登醇与先前未化学活化的抗整联蛋白抗体的单步反应制备抗整联蛋白抗体类美登醇缀合物。类美登醇的活性酯可为N-琥珀酰亚胺酯、N-硫代琥珀酰亚胺酯、N-邻苯二甲酰亚胺酯、N-硫代邻苯二甲酰亚胺酯、2-硝基苯酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯、3-磺酰-4-硝基苯酯或3-羧基-4-硝基苯酯。所述方法描述于出版物WO2002098883，其内容通过引用结合到本文中。
4.使用本发明缀合物的方法
本发明的抗体可给予需要其的受试者，以预防、治疗、管理或改善癌症或其一种或多种症状。本发明的抗体还可与一种或多种其它疗法(优选用于预防、管理或治疗癌症的疗法，包括但不限于下文列出的预防或治疗剂)组合给予需要其的受试者，以预防、治疗、管理或改善癌症或其一种或多种症状。在一个具体实施方案中，本发明提供一种预防、治疗、管理或改善癌症或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要其的受试者一剂预防或治疗有效量的制剂，该制剂包含本发明的抗αV抗体缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗、预防或改善癌症或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要其的受试者一剂预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物连同预防或治疗有效的一种或多种疗法(例如手术、放疗或给予抗αV抗体缀合物以外的治疗剂)。本发明的抗体缀合物可用作一线、二线、三线或四线癌症治疗。本发明提供用于在受试者中治疗或改善癌症的一种或多种症状的方法。此外，本发明提供用于在患者中预防癌症复发的方法，所述患者已通过给予本发明的抗αV抗体缀合物治疗并已没有疾病活动。
可通过本发明包括的方法治疗的癌症包括但不限于新生瘤、肿瘤、转移瘤或特征为不受控的细胞生长的任何疾病或障碍。癌症可为原发性或转移性癌症。癌细胞可表达或可不表达αV亚单位整联蛋白。在一个优选实施方案中，按照本发明方法管理、治疗或改善的癌症为表达整联蛋白αV亚单位的癌症，已转移到患者机体中的另一个部位或器官，或具有转移潜力。可通过本发明包括的方法治疗的癌症的具体实例包括但不限于头、颈、眼、嘴、咽喉、食管、胸、骨、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾脏、肝脏、胰腺和脑的癌症。其它的癌症包括但不限于以下癌症：白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病如成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、粒-单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病和骨髓增生异常综合症，慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；脾大性红细胞增多；淋巴瘤，例如但不限于何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤；骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞性白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；骨癌和结缔组织肉瘤，例如骨肉瘤、骨髓瘤骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、Ewing肉瘤、Paget骨病、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、Kaposi肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、非神经胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳癌，包括腺癌和管内癌以及乳头状乳癌；副肾癌，包括嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌；胰癌；垂体癌；眼癌，不限于眼黑素瘤、脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤和成视网膜细胞瘤；阴道癌；外阴癌；子宫颈癌；子宫癌，不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌；食管和其它头颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌、腺癌、粘液表皮样癌、腺鳞状细胞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如肝细胞癌和肝胚细胞瘤、胆囊癌；胆管癌；肺癌，例如非小细胞癌肺、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)、前列腺癌；阴茎癌(penal cancer)；口腔癌，不限于鳞状细胞癌；基底癌；涎腺癌；肾细胞癌和其它肾癌；和膀胱癌，不限于移行细胞癌(关于这些疾病的综述，参见De Vita，V.T.，Hellman，S.，&Rosenberg，S.A.Cancer：Principles and practice of oncology.Philadelphia：J.B.Lippincott Company；第6版，2001)。还通过本发明的方法和组合物治疗癌前病症。这种癌症可包括但不限于滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、乳房、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，和癌前病变，例如家族性腺瘤息肉病和骨髓发育异常综合症。
在一个优选实施方案中，要按照本发明方法预防、管理、治疗或改善的癌症选自前列腺癌、乳癌、骨癌、黑素瘤、肺癌和卵巢癌。在另一个实施方案中，要按照本发明方法预防、管理、治疗或改善的癌症选自转移性肿瘤，包括但不限于已转移或可转移至骨的癌症(非限制性实例是已转移至骨或具有可转移至骨的潜力的前列腺癌、乳癌和肺癌)、已转移至或可转移至肺的肿瘤、已转移至或可转移至脑的肿瘤以及已转移至或可转移至受试者其它器官或组织的肿瘤。
抗癌治疗
已知可用于或已用于或目前正用于预防、治疗、管理或改善癌症或其一种或多种症状的任何药物或治疗(例如化疗、放疗、激素疗法和/或生物疗法或免疫疗法)可与本文描述的本发明抗αV抗体缀合物组合使用。治疗剂或预防剂包括但不限于肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟物、合成药物、无机分子和有机分子。这些药物(即抗癌药物)类型的实例包括但不限于细胞毒素、血管生成抑制剂和免疫调节剂以及用于提供疼痛缓解或抵消一种或多种治疗剂的有害作用的药物(例如用于降低糖皮质激素的高钙血作用的双磷酸盐)。
生物免疫调剂剂包括：抗T细胞受体抗体，例如抗CD3抗体(例如Nuvion(Protein Design Labs)、OKT3(Johnson & Johnson)或抗CD20抗体Rituxan(IDEC))、抗CD52抗体(例如CAMPATH 1H(Ilex))、抗CDlla抗体(例如Xanelim(Genentech))；抗细胞因子或抗细胞因子受体抗体和拮抗剂，例如抗IL-2受体抗体(Zenapax(Protein DesignLabs))、抗IL-6受体抗体(例如MRA(Chugai))和抗IL-12抗体(CNTO1275(Centocor))、抗TNFα抗体(Remicade(Centocor))或TNF受体拮抗剂(Enbrel(Immunex))、抗IL-6抗体(BE8(Diaclone)和CNTO328(Centocor))，以及免疫特异性结合肿瘤相关抗原的抗体(例如曲妥珠单抗(Genentech))。
血管生成抑制剂(即抗血管生成剂)包括但不限于血管生成抑制素(纤溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；angiozyme。双磷酸盐包括但不限于阿仑磷酸盐、氯甲双磷酸、依替磷酸盐、伊班磷酸盐、帕米磷酸盐、利塞磷酸盐、替鲁磷酸盐和唑来磷酸盐。
可按照本发明方法使用的抗癌药物的具体实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、阿西维辛(Acivicin)、阿地白介素(Aldesleukin)、六甲蜜胺(Altretamine)、奥美定(Aminoglutethimide)、安丫啶(Amsacrine)、阿那曲唑(Anastrozole)、安曲霉素、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、阿扎替派(Azetepa)、含氮霉素、巴马司他(Batimastat)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、硫酸博莱霉素、布喹那钠(Brequinar Sodium)、溴匹立明(Bropirimine)、白消安、卡波铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、盐酸卡柔比星、卡折来新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥、西罗霉素(Cirolemycin)、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂(Dexormaplatin)、地扎胍宁(Dezaguanine)、甲磺酸地扎胍宁(Dezaguanine Mesylate)、地吖醌(Diaziquone)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、枸橼酸屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone Propionate)、偶氮霉素、依达曲沙(Edatrexate)、盐酸依氟鸟氨酸(Eflornithine Hydrochloride)、恩洛铂(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹哌啶(Epipropidine)、盐酸表柔比星、厄布洛唑(Erbulozole)、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑(Etanidazole)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、法扎拉滨、芬维A胺(Fenretinide)、氟脲苷(Floxuridine)、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨(Flurocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福司曲星钠(FostriecinSodium)、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲(Hydroxyurea)、盐酸伊达比星、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫福新(Ilmofosine)、白介素II(包括重组白介素II或rIL2)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-m、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂(Iproplatin)、盐酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride)、盐酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、来曲唑、乙酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑(Liarozole Hydrochloride)、洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌(LosoxantroneHydrochloride)、马索罗酚(Masoprocol)、盐酸氮芥、乙酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔(Menogaril)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、Metoprine、美妥替哌(Meturedepa)、丝裂霉素、米托司培(Mitosper)、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑(Nocodazole)、奥马铂(Ormaplatin)、紫杉醇、培门冬酶(Pegaspargase)、甲基比裂霉素(Porfromycin)、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素(Puromycin)、罗谷亚胺(Rogletimide)、盐酸沙芬戈(SafingolHydrochloride)、司莫司汀(Semustine)、辛曲秦(Simtrazene)、SparfosateSodium、稀疏霉素(Sparsomycin)、螺莫司汀(Spiromustine)、螺铂(Spiroplatin)、链黑霉素(Streptonigrin)、链脲佐菌素(Streptozocin)、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉素(Talisomycin)、替加氟(Tegafur)、盐酸替洛蒽醌(Teloxantrone Hydrochloride)、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆(Teroxirone)、睾内酯(Testolactone)、硫米嘌呤(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤、噻替派(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明(Tirapazamine)、托泊替康、三甲曲沙(Trimetrexate)、葡糖醛酸三甲曲沙(Trimetrexate Glucuronate)、曲普瑞林、乌拉莫司汀(UracilMustard)、乌瑞替派(Uredepa)、伐普肽(Vapreotide)、维替泊芬(Verteporfn)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定(Vinepidine Sulfate)、硫酸长春甘酯(VinglycinateSulfate)、硫酸长春罗新(Vinleurosine Sulfate)、酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)、硫酸长春罗定(Vinrosidine Sulfate)、硫酸长春利定(Vinzolidine Sulfate)、伏氯唑(Vorozole)、折尼铂、净司他丁(Zinostatin)、盐酸佐柔比星。
本发明还包括将本发明的抗体与放疗组合给予，所述放疗包括使用x-射线、γ射线和其它放射源，以破坏癌细胞。在优选实施方案中，放射治疗作为外部成束辐射或远距疗法给予，其中放射由远距离的来源发出。在其它优选实施方案中，放射治疗作为内部治疗或近距治疗给予，其中放射性源放置于接近癌细胞或肿瘤实体的机体内部。
在具体实施方案中，给予乳癌患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予预防或治疗有效量的一种或多种用于乳癌治疗的其它药物，其包括但不限于多柔比星、表柔比星、多柔比星和环磷酰胺的组合(AC)、环磷酰胺、多柔比星和5-氟尿嘧啶的组合(CAP)、环磷酰胺、表柔比星和5-氟尿嘧啶的组合(CEF)或其它药物，例如贺赛汀(Herceptin)、他莫昔芬、紫杉醇或紫杉特尔(taxotere)。
在具体实施方案中，给予前列腺癌患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予预防或治疗有效量的一种或多种用于前列腺癌治疗的其它药物，其包括但不限于：外部成束辐射治疗；组织间植入放射性同位素，即铼、钯或铱；亮丙瑞林(leuprolide)或其它LHRH激动剂；非甾族抗雄激素(氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide))、甾族抗雄激素(乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate))、亮丙瑞林和氟他米特的组合、雌激素如DES、乙炔雌二醇；低剂量强的松或据报道产生症状自觉改善和PSA水平下降的其它化疗方案。
在具体实施方案中，给予卵巢癌患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予预防或治疗有效量的一种或多种用于卵巢癌治疗的其它药物，其包括但不限于：腹膜内放疗，例如32P治疗；全腹照射治疗和全盆照射治疗、顺铂、紫杉醇(Taxol)或紫杉特尔(Taxotere)和顺铂或卡波铂的组合、环磷酰胺和顺铂的组合、环磷酰胺和卡波铂的组合、5-FU和亚叶酸、依托泊苷、多柔比星脂质体、吉西他滨、异环磷酰胺、六甲密胺(HMM)或托泊替康的组合。
在具体实施方案中，给予肿瘤转移至骨的患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予预防或治疗有效量的一种或多种用于骨转移肿瘤治疗的其它药物，其包括但不限于：用于治疗潜伏性恶性肿瘤的药物或疗法，例如用于转移至骨的前列腺癌或乳癌的激素抑制剂、使用金属的骨亲和性放射性同位素(锶-89和锶-153)和双磷酸盐(例如帕米磷酸盐或阿仑磷酸盐)的放疗或化疗。
癌症疗法及其剂量、给予途径和推荐用途是本领域已知的，已描述于例如Physician′s Desk Reference(第57版，2003)的文献，此文献现在可通过互联网由PDR
Figure A20058004781300341
Electronic Library，ThomsonMicromedex，Greenwood Village，Colorado(Edition 2004)订阅获得。
炎性疾病治疗
本发明的抗αV抗体缀合物可给予需要其的受试者，以预防、管理、治疗或改善炎性疾病或其一种或多种症状。本发明的抗体还可与一种或多种其它疗法(优选用于预防、管理、治疗或改善炎性疾病的疗法(包括但不限于列于下文的预防剂或治疗剂))一起联合给予需要其的受试者，以预防、管理、治疗或改善炎性疾病或其一种或多种症状。
通过本发明包括的方法可治疗的炎性疾病包括但不限于：哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性疾病、脓毒性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、骨关节炎、脊柱关节病(例如银屑病关节炎、强直性脊柱炎、Reiter综合症(反应性关节炎)、炎性骨质溶解、Wilson病和由慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。另外，自身免疫病也与炎症病理学相关。
抗炎疗法
本发明提供预防、管理、治疗或改善炎性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要其的受试者本发明的抗αV抗体缀合物以及一种或多种疗法(例如免疫特异性结合αV整联蛋白的抗体或抗体片段之外的预防剂或治疗剂)。已知可用于或已用于或目前正用于预防、管理、治疗或改善炎性疾病或其一种或多种症状的任何药物或治疗都可与本文描述的本发明抗αV抗体缀合物组合使用。这种药物的实例包括但不限于免疫调节剂、抗血管生成剂、抗炎剂和TNFα拮抗剂。
可与本发明的抗αV抗体缀合物组合给予患有炎性疾病的受试者的免疫调节剂的具体实例包括：氨甲蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷酰胺(cytoxan)、赛庚啶(nuran)、环孢霉素A、米诺环素、咪唑硫嘌呤、抗生素(例如FK506(他克莫司))、甲基强的松龙(MP)、皮脂类固醇、类固醇、霉酚酸酯、雷帕霉素(西罗莫司)、来氟米特、抗T细胞受体抗体(例如Orthoclone OKT3(Johnson & Johnson)、Nuvion(Protein Design Labs)或抗CD20抗体(Rituxan(IDEC))、抗CD52抗体(例如CAMPATH 1H(Ilex))、抗IL-2受体抗体(例如Zenapax(ProteinDesign Labs))、抗IL6(CNTO 328，Centocor)或抗IL-6受体抗体(MRA，Chugai)以及抗IL-12抗体(CNTO1275，Centocor)、抗IFN抗体、抗TNF抗体、抗IL-1抗体和IL-1α/β拮抗剂。
可与本发明的抗αV抗体缀合物组合给予患有炎性疾病的受试者的TNFα拮抗剂的实例包括：阻断、降低、抑制或中和TNFα的功能、活性和/或表达的蛋白、多肽、肽、融合蛋白、抗体(及其抗原结合片段)如免疫特异性结合TNFα的抗体、核酸分子(例如反义分子或三股螺旋)、有机分子、无机分子和小分子。TNFα拮抗剂的实例包括：英利昔单抗(REMICADE；Centocor)、D2E7(HUMARA；AbbottLaboratories/Knoll Pharmaceuticals Co.，Mt.Olive，N.J.)、也称为HUMICADE和CDP-870(均来自Celltech/Pharmacia，Slough，U.K.)的CDP571、TNF-R1(Amgen)、依那西普(ENBREL；Immunex)和TNFR受体超家族其它成员的抑制剂。本发明包含的其它TNF拮抗剂包括但不限于已知阻断TNFα生产的IL-10和抗p38MAPK药物。
可与本发明的抗αV抗体缀合物组合给予患有炎性疾病的受试者的抗炎剂的非限制性实例包括：非甾族抗炎药物(NSAID)、甾族抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱药和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于：阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREX)、双氯芬酸(VOLTAREN)、依托度酸(IODINE)、非诺洛芬(NALFON)、消炎痛(INDOCIN)、酮洛来克(TORADOL)、奥沙普秦(DAYPRO)、nabumentone(RELAFEN)、舒林酸(CLINORIL)、托美汀(TOLECTIN)、罗非昔布(VIOXX)、萘普生(ALEVE，NAPROSYN)、酮洛芬(ACTRON)和萘丁美酮(RELAFEN)。这种NSAID起抑制环氧化酶(例如COX-1和/或COX-2)的功能。甾族抗炎药物的实例包括但不限于：糖皮质激素、地塞米松(DECADRON)、可的松、氢化可的松、强的松(DELTASONE)、强的松龙和去炎松。
在具体实施方案中，给予骨关节炎患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于骨关节炎预防、治疗、管理或改善的其它药物或疗法，其包括但不限于：镇痛药，例如醋氨酚、非那西丁；和曲马多，NSAID，例如阿司匹林、双氟尼酸、双氯芬酸、依托度酸、芬那酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、消炎痛、酮洛芬、水杨酸甲酯、nebumetone、萘普生、奥沙普秦、苯基丁氮酮、吡罗昔康、舒林酸和托美汀；环氧化酶(Cox)-2特异性抑制剂(CSI)，例如西乐葆和罗非昔布；关节内或关节周注射的长效制剂，例如糖皮质激素或生物药物，以及关节内注射的透明质酸。本发明的抗αV抗体缀合物还可与预防、治疗、管理和改善骨关节炎的其它非药理方法组合使用，所述方法包括但不限于：照射骨关节炎关节、减少关节负荷、将热或冷应用于受侵袭的关节、辣椒碱软膏、锻炼和其它物理疗法以及关节置换手术。
在具体实施方案中，给予类风湿性关节炎患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于类风湿性关节炎预防、治疗、管理和改善的其它药物或疗法，包括如对骨关节炎所讨论的NSAID、镇痛药和CSI。另外，可在给予本发明的抗αV抗体的同时、之前或之后使用其它疗法，例如每月一次脉冲式给予高剂量糖皮质激素或关节内给予糖皮质激素；病症缓解性抗风湿药(DMARD)，包括氨甲蝶呤、金化合物(例如金诺芬)、D-青霉胺、抗疟药(例如氯喹)和柳氮磺胺吡啶；TNFα中和剂，例如依那西普和英利昔单抗；免疫抑制剂和细胞毒性剂，不限于咪唑硫嘌呤、来氟米特、环孢霉素和环磷酰胺；和外科手术，例如关节成形术、全关节置换、手再造手术、切口或关节内窥镜滑膜切除术以及腕早期腱鞘切除术；外部干涉，例如各种矫正和辅助装置，以及其它物理治疗；和膳食补充，例如增加ω-3脂肪酸(例如二十碳五烯酸)摄入。
在具体实施方案中，给予慢性阻塞性肺病(COPD)患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于COPD预防、治疗、管理和改善的其它药物或疗法，包括但不限于：支气管扩张药，包括但不限于短效和长效β-肾上腺素能激动剂，例如舒喘宁、吡布特罗、特布他林和奥西那林、口服持续释放的舒喘宁和吸入的沙美特罗；抗胆碱能药，例如异丙托溴铵和茶碱及其衍生物；糖皮质激素；氧；肺移植；肺减容术；气管内插管、呼吸机支持；每年接种流感疫苗和肺炎球菌疫苗；锻炼和戒烟。
在具体实施方案中，给予肺纤维化患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于肺纤维化治疗的一种或多种有效量的其它药物，其包括但不限于：氧、皮质类固醇、细胞毒性剂(环磷酰胺或咪唑硫嘌呤)、支气管扩张药、短效和长效β-肾上腺素能激动剂、抗胆碱能药和茶碱及其衍生物以及抗组胺药(苯海拉明和苯吡拉明)。
在具体实施方案中，给予哮喘患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于哮喘治疗的一种或多种有效量的其它药物，其包括但不限于：肾上腺素能刺激剂(实例包括但不限于儿茶酚胺，例如肾上腺素、异丙基肾上腺素和新异丙肾上腺素；间苯二酚，例如奥西那林、特布他林和非诺特罗；和水杨苷，例如舒喘灵；甲基黄嘌呤，包括茶碱及其各种盐；抗胆碱能药，包括硫酸阿托品、硝酸甲基阿托品和异丙托溴铵；糖皮质激素；肥大细胞稳定剂色甘酸钠和奈多罗米钠；白细胞三烯修饰剂物齐留通、扎鲁司特和孟鲁司特；免疫抑制剂，包括氨甲蝶呤；和乙酰半胱氨酸。
在具体实施方案中，给予变应性疾病患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于变应性疾病治疗的一种或多种有效量的其它药物，其包括但不限于：色甘酸、抗组胺剂、拟交感神经药物(既是α肾上腺素能药物，又是β肾上腺素能药物)、茶碱及其衍生物、糖皮质激素和用变应原注射进行免疫脱敏治疗。
自身免疫病治疗
本发明的抗αV抗体缀合物可给予需要其的受试者，以预防、管理、治疗或改善自身免疫病或其一种或多种症状。本发明的抗αV抗体缀合物还可与一种或多种其它疗法(优选用于预防、管理或治疗自身免疫病的疗法，包括但不限于下文列出的预防或治疗剂)组合给予需要其的受试者，以预防、管理、治疗或改善自身免疫病或其一种或多种症状。在一个具体实施方案中，本发明提供一种预防、管理、治疗或改善自身免疫病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要其的受试者一剂预防或治疗有效量的本发明液体制剂。在另一个实施方案中，本发明提供一种预防、管理、治疗或改善自身免疫病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要其的受试者一剂预防或治疗有效量的本发明液体制剂和一剂预防或治疗有效量的一种或多种治疗物(例如预防剂或治疗剂)，所述治疗物不是免疫特异性结合αV整联蛋白的抗体或抗体片段。
本发明提供用于管理、治疗或改善受试者中的自身免疫病或其一种或多种症状的方法，所述受试者是这些自身免疫病的常规疗法难以治愈的，所述方法包括给予所述受试者一剂预防或治疗有效量的本发明抗体。本发明还提供用于管理、治疗或改善受试者中的自身免疫病或其一种或多种症状的方法，所述受试者是这种自身免疫病的现有单一药物疗法难以治愈的，所述方法包括所述受试者一剂预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物和一剂预防或治疗有效量的一种或多种治疗物(例如预防剂或治疗剂)，所述治疗物不是免疫特异性结合αV整联蛋白的抗体或抗体片段。本发明还提供用于管理、治疗或改善自身免疫病或其一种或多种症状的方法，所述方法给予患者本发明的抗αV抗体缀合物联合任何其它治疗，所述患者已被证实是其它治疗难以治愈的，但对这些治疗不再是难以治愈的。本发明还提供用于管理和治疗自身免疫病的替代方法，其中另一种治疗已被证实或可被证实对待治疗受试者太过毒性，即产生不可接受的或无法忍受的副作用。
具体地说，本发明提供管理和治疗自身免疫病的替代方法，其中所述患者是其它疗法难以治愈的。此外，本发明通过给予本发明的抗αV抗体缀合物，提供用于在已治疗且无疾病活动性的患者中预防自身免疫病复发的方法。
在自身免疫病中，免疫系统在没有外来物要对抗的情况下触发免疫应答，机体的正常保护性免疫系统通过错误地攻击自身引起其自身组织的损伤。有许多以不同方式攻击机体的不同自身免疫病。例如，多发性硬化个体的脑受到侵袭，Crohn病个体的肠受到侵袭，类风湿性关节炎个体的各个关节的滑液、骨和软骨受到侵袭。随着自身免疫病的发展，可产生一种或多种类型的机体组织破坏，可伴有所述器官或组织新生血管化的器官异常生长或器官功能改变。自身免疫病可侵袭仅一个器官或组织类型，或者可侵袭多个器官和组织。通常受自身免疫病侵袭的器官和组织包括红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺(例如甲状腺或胰腺)、肌肉、关节和皮肤。可通过本发明方法治疗的自身免疫病的实例包括但不限于斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合症、自身免疫性Addison病、自身免疫性肾上腺病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、Behcet病、大疱性类天疱疮、心肌病、腹腔口炎性皮炎、慢性疲劳免疫功能失调综合症(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、Churg-Strauss综合症、瘢痕类天疱疮、CREST综合症、冷凝集素病、Crohn病、盘状红斑狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、Graves病、格林-巴利综合症、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、Meniere病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合症、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、Reiter综合症、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、Sjogren综合症、僵人综合症、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、脉管炎如疱疹样皮炎脉管炎、白斑病和Wegener肉芽肿病。
自身免疫病治疗及其剂量、给予途径和推荐用途是本领域已知的，已描述于例如Physician′s Desk Refererce(第56版，2002和第57版，2003)的文献。
本发明提供用于预防、管理、治疗或改善受试者中的自身免疫病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要其的受试者本发明的抗αV抗体缀合物和一种或多种治疗物(例如预防剂或治疗剂)，所述治疗物不是免疫特异性结合αV整联蛋白的抗体或抗体片段。已知可用于或已用于或目前正用于预防、管理、治疗或改善自身免疫病或其一种或多种症状的任何药物或治疗都可与本文描述的本发明抗αV抗体缀合物组合使用。这种药物的实例包括但不限于：免疫调节剂、抗炎剂和TNFα拮抗剂。上文公开了可与本发明的抗αV抗体缀合物组合用于预防、管理、治疗或改善自身免疫病的免疫调节剂、抗炎剂和TNFα拮抗剂的具体实例。
在具体实施方案中，给予多发性硬化(MS)患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于预防、治疗、管理和改善MS的其它药物或疗法，其包括但不限于：IFN-β1b(Betaseron)和IFN-α2a(Avonex)、醋酸格拉替雷(Copaxone)、米托蒽醌、氨甲蝶呤、环磷酰胺、静脉内免疫球蛋白、糖皮质激素、甲基强的松龙、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、巴氯芬(口服或经留置导管鞘内注射)、盐酸环苯扎林、氯硝安定、盐酸可乐定、卡马西平、卡巴番定、阿密替林、去氧苯比妥、恩丹西酮、异烟肼、奥昔布宁、托特罗定、丙胺太林、贝胆碱(bethanecol)、盐酸特拉唑嗪、枸橼酸西地那非、金刚胺、匹莫林、高剂量维生素、乳酸清钙、更昔洛韦、抗生素和血浆交换。
在具体实施方案中，给予银屑病患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于预防、治疗、管理和改善银屑病的其它药物或疗法，其包括：局部含胆固醇制剂、焦油(Estar、Psorigel、Fototar软膏)、局部维生素D类似物如钙泊三醇软膏、有或没有补骨脂素的紫外线、氨甲蝶呤、环孢霉素、柳氮磺胺吡啶和合成类维生素A。
在具体实施方案中，给予Crohn病患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于预防、治疗、管理和改善Crohn病的其它药物或疗法，其包括但不限于：止泻药(洛哌丁胺、含阿托品的苯乙哌啶、消胆胺或考来替泼)、抗痉挛药(丙胺太林、双环胺或天仙子胺)、5-氨基水杨酸药物(柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪(Asacol)及其缓释剂型(Pentasa)、皮脂类固醇、用于风湿病的免疫调节药物-咪唑硫嘌呤、巯基嘌呤、环孢霉素和氨甲蝶呤；抗生素；TNF抑制剂，包括依那西普和英利昔单抗；免疫抑制剂，包括他克莫司、霉酚酸酯和沙立度胺；营养疗法、采用要素饮食的肠内疗法(例如给予Vivonex达4周)以及完全肠胃外营养。
在具体实施方案中，给予红斑狼疮患者预防或治疗有效量的本发明抗αV抗体缀合物，联合给予用于预防、治疗、管理和改善红斑狼疮的其它药物或疗法，其包括但不限于：抗疟药(包括但不限于羟化氯喹)、糖皮质激素(例如可使用低剂量、高剂量或高剂量静脉内脉冲疗法)；免疫抑制和免疫调节剂，包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥和氮烷硫嘌呤、氨甲蝶呤和霉酚酸酯；产雄激素的类固醇(包括但不限于炔羟雄烯异唑)和抗凝剂(包括但不限于华法林)。
非恶性或免疫相关性细胞增殖疾病
本发明的缀合物还用于治疗非恶性增殖疾病，尤其是涉及血管生成的疾病。血管生成除了在肿瘤生长和转移、眼病(包括视网膜病)和皮肤病(包括银屑病和Kaposi肉瘤)中的能力以外，还已知是许多病理状况中的影响因素。这种非致肿瘤性血管生成依赖性疾病的代表性实例包括角膜新生血管化、肥厚性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、动静脉畸形(上文论述)、动脉粥样硬化斑和局部缺血性心脏病、延迟的伤口愈合、血友病性关节、不愈合骨折、Osier-Weber综合症、银屑病、寻常性天疱疮、Behcet综合症、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、化脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼(tracoma)、月经过多(上文论述)和血管粘附。
4.药物制剂
本发明提供抗αV-类美登醇缀合物的稳定制剂，其优选为磷酸缓冲盐水溶液或混合的盐溶液，以及提供含防腐剂的防腐溶液和制剂以及适于药用或兽医用的多用途防腐制剂，其在药物可接受制剂中包含至少一种抗αV-类美登醇缀合物。
优选的防腐剂包括选自以下的防腐剂：苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。
可通过本领域众所周知的各种传递方法，包括SC或IM注射、透皮、肺部、透粘膜、植入、渗透泵、药筒、微型泵或技术人员了解的其它方法，将在本文描述的稳定或防腐制剂或溶液中的至少一种抗αV-类美登醇缀合物给予本发明的患者。
4.药物制剂
在给予CNTO 95-类美登醇的优选方法中，由预先安装的配有输液袋的导管静脉内给予药物。CNTO 95-美登素在ImmunoGen，Inc.(Cambridge，MA)的20-ml单次用西林瓶中提供。各个西林瓶均含0.05至约2.0mg/ml浓度的蛋白的缓冲溶液(pH6.5±0.5)，所述缓冲溶液基本由纯化水中的USP级磷酸二氢钾(0.57mg/ml)、磷酸二氢钠一水合物(0.20mg/ml)、磷酸氢二钠(0.555mg/ml)和氯化钠(8.16mg/ml)组成。在将剂量体积灌输入输液袋时，通过使药品通过低蛋白结合的5μ滤器预过滤药品两次，并在制备8小时之内通过在线0.22μm滤器给予患者。在输注后，静脉管路应用液体冲洗，以确保传递完整药物剂量。
基于先前通过静脉内方法给予人类患者Mab-类美登醇缀合物的经验，可每3周一次给予22-295mg/M2范围内的剂量(J Clin Oncol.21：211-222，2003)。
6.制品
本发明包括一种制品，其包含用于治疗上述疾病的含抗αV-类美登醇缀合物的物质、容器和在容器上或随附容器的标签或包装说明书。所述制品优选含至少一个西林瓶，其含有至少一种抗αV类美登醇缀合物和指定缓冲液和/或防腐剂的溶液，任选在水性稀释液中，其中所述包装材料包含指明这种溶液可在一定时间段内保存的标签。本发明可包含一种制品，其包含包装材料、含冻干的至少一种抗αV-类美登醇缀合物的第一个西林瓶和含指定缓冲液或防腐剂的水性稀释液的第二个西林瓶，其中所述包装材料包含标签，指示操作者或患者如何在水性稀释液中重构所述至少一种抗αV-类美登醇缀合物，以形成溶液。
合适的容器包括例如瓶、西林瓶、注射器等。所述容器可由各种物质制成，例如玻璃或塑料。所述容器可具有无菌入口(例如容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针可穿透的塞子的西林瓶)。
组合物中的至少一种活性剂是抗αV抗体-类美登醇缀合物。标签或包装说明书指示所述组合物用于治疗选定病症，例如癌症。本文的包装说明书可指示所述抗体或组合物用于治疗癌症，其对采用本文概述的用于特定疾病和诊断的标准护理的治疗不响应或响应很差。在其它实施方案中，包装说明书可指示抗体-类美登醇缀合物或组合物还可用于治疗转移癌、前列腺癌、乳癌或结直肠癌。
尽管已概括地描述了本发明，但本发明的实施方案将在以下的实施例中进一步公开。
实施例1
单克隆抗体CNTO95的生产和表征
抗αV整联蛋白抗体CNTO95的制备详述于PCT公开号WO02/12501和美国公开号2003/040044，这两个文献均通过引用结合到本文中。具体地说，人Mab CNTO 95通过用由人胎盘纯化的αvβ3整联蛋白免疫(CBA/J×C57/BL6/J，GenPharm International)F2杂合小鼠产生。所述抗体由人可变区和IgG1κ恒定区组成。CNTO95的制备方法和期望特征先前已描述于WO0212501和Trikha等，2004，Int.J.Cancer 110(3)：326-335。
使用表达人免疫球蛋白但不表达小鼠IgM或Igκ的GenPharmInternational转基因小鼠。这些小鼠含人序列转基因，此转基因经历了V(D)J连接、重链种类转换和体细胞突变，以产生人序列免疫球蛋白库(Taylor等，International Immunology 6：579-591(1993))。轻链转基因部分来自酵母人工染色体克隆，其含接近一半的种系人Vκ区。除了几个VH基因以外，重链(HC)转基因还编码人μ和人γ1(Lonberg等，Nature 368：856-859(1994))和/或γ3恒定区。在免疫和融合过程中使用来源于HC012基因型谱系的小鼠，以产生用于制备本发明缀合物的抗αV单克隆抗体。
用OTG(辛基硫代葡糖苷Pierce)的缓冲盐水如所述(WO0212501)提取表达αVβ3整联蛋白的人胎盘(使用绞肉机绞碎)或M21人黑素瘤细胞。这些制备物用等体积的完全弗氏佐剂乳化，并用于在第0和14天免疫15-17周龄手术阉割的雄性小鼠(GenPharm，Foster City，CA)，在第28、48和56天以不完全弗氏佐剂免疫。3天后由使用固相EIA型方法显示抗αVβ3滴度为1∶1280的小鼠收获脾细胞。鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)对存活脾细胞以1∶1比率进行融合。使用EIA微量滴定板测定或EIA捕获测定筛选杂交瘤上清液，选择产生抗体的细胞系扩增，并复测目标特性。
ELISA分析证实，来自两个杂交瘤C371A(也叫做Mab CNTO 95)和C372A的纯化抗体以浓度依赖性方式结合αVβ3。对于C372A和CNTO 95，分别在0.07和0.7μg/mL实现50％结合。在相同测定中，抗αIIβ3抗体c7E3IgG在0.07μg/mL表现出50％最大结合。
为确定CNTO95的专有特异性，使用以下鼠抗体进行竞争结合(或竞争性)测定：m7E3IgG、抗αVβ3(克隆LM609，Chemicon)、抗αVβ5(克隆P1F6，Gibco)、抗β3(Chemicon，AMAC)或抗αV(克隆VNR139，Gibco)抗体。这些结果表明，CNTO 95结合其它测试抗体不共有的表位。
使用125-I CNTO 95比较纯化整联蛋白结合不同细胞系上表达的受体的结合亲和性值。A375S2和M21细胞表达αvβ3和αvβ5这二者，HT-29细胞表达αvβ5。为了对比，使用能够结合整联蛋白的其它Mab。使用多批抗体的多次平行测定计算各种情况下饱和结合曲线的Kd。在αvβ3包被平板上，CNTO 95平均KD为2.1±1.33×10-10M；平均阿昔单抗(abciximab)Kd为2.5±1.46×10-10M。αvβ5上的CNTO 95平均KD为2.5±1.04×10-11M。阿昔单抗显示在αvβ5包被平板上无结合或无剂量响应。
如在图4中所示，用CNTO 95给药在裸小鼠中抑制人黑素瘤生长。在第26天时，相比于对照治疗动物的肿瘤，CNTO 95抑制肿瘤生长达约80％。在该模型中，CNTO 95不与宿主血管生成性血管相互作用，因为其不结合小鼠整联蛋白，提示仅封闭人肿瘤表达的整联蛋白可独立于抗血管生成作用来抑制肿瘤生长。
对于大鼠研究，由Harlan购买6-7周龄的雌性裸大鼠。用A375.S2细胞(3×106)在侧腹区皮下接种20只大鼠(第1天)。在第4天，将大鼠随机分配为2组。一组静脉内注射CNTO 95(10mg/kg的PBS溶液)、而另一组接受同种型匹配的对照IgG(10mg/kg)。此后每周给药1次，直至第46天为止(总共6剂)。一周两次通过卡钳检测肿瘤，通过公式(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。每周还记录体重。
在大鼠中，CNTO 95能够封闭大鼠血管生成性整联蛋白和人肿瘤细胞表达的整联蛋白这二者。与同种型匹配的人IgG对照Mab相比，用10mg/kg的CNTO 95每周治疗一次带肿瘤的裸大鼠降低肿瘤生长(图5)。到第46天时，与对照治疗的裸大鼠相比，用CNTO 95治疗导致最终肿瘤大小显著降低(p＝0.0007)。
总之，CNTO 95是全人Mab，其以通过多功能检测证实的专有特异性、亲和力和活性结合整联蛋白αV家族成员，所述多功能检测表明，CNTO 95在体外和体内中和整联蛋白受体αVβ3和αVβ5的生物作用。CNTO 95在体外抑制肿瘤和内皮细胞这二者的粘附、迁移、增殖和侵入，表明结合和封闭多种αV整联蛋白受体比仅封闭单种整联蛋白更有效。另外，CNTO 95在体内抑制血管生成和肿瘤生长。封闭小鼠模型中的肿瘤细胞整联蛋白或组合封闭大鼠模型中的肿瘤细胞和宿主血管生成性整联蛋白显著降低人黑素瘤的生长，突显了靶向多个细胞靶对抗肿瘤效力的潜在重要性。
体外模型的结果表明，CNTO 95具有有效的抗血管生成特性，抑制内皮细胞粘附、增殖、迁移和毛细血管萌出。另外，CNTO 95在大鼠Matrigel模型中阻断受bFGF和M21黑素瘤细胞这二者刺激的血管生成，在灵长类血管生成模型中阻断bFGF刺激的血管生成。CNTO 95在啮齿动物模型和使用猕猴的新非人灵长类动物模型中显示出有效的抗血管生成作用。
除了封闭血管生成内皮上的整联蛋白以外，抑制肿瘤细胞自身上的整联蛋白功能的能力也降低肿瘤生长。业已表明，许多αV整联蛋白在肿瘤细胞生物学中起关键作用。在其中CNTO 95不与宿主整联蛋白交叉反应的小鼠异种移植模型中，用CNTO 95治疗显著抑制v3/5阳性黑素瘤的生长。
CNTO 95的一种最重要特征是其全人特性。因为其是全人的，所以CNTO 95在患者中不大可能引起免疫反应。而且，因为CNTO 95不仅能够结合αVβ3和αVβ5，而且能够结合其它αV整联蛋白，例如αVβ6和αVβ1，所以其具有抑制多种整联蛋白介导的事件的能力。
实施例2：CNTO 95-美登素缀合物的制备
使用如所述的双功能连接基团制备巯基化美登素的抗体缀合物，用作进一步生物测试的起始物。
缀合用CNTO 95抗体由Centocor供应。CNTO 95以约20mg/ml(共260mg)提供。抗体被透析入缓冲液A(50mM KPi，50mM NaCl，2mM EDTA pH6.5)中，然后在95％缓冲液A、5％ETOH中达到8mg/ml。抗体用6.5倍摩尔过量的SPP修饰，以导入用于药物缀合的连接基团，形成CNTO 95-SS-Py，其中S-Py是2-巯基吡啶。残余的SPP通过G25凝胶过滤层析去除。连接基团对抗体的比率经检测为4.7。使用3.2/ml抗体浓度的97％缓冲液A、3％二甲基乙酰胺溶液，以对连接基团1.7倍摩尔过量的DM1(MW＝737.5g/mol)修饰Ab-SS-Py缀合物。在缀合后，缀合物在G25上使用PBS，pH6.5作为缓冲液再层析。获得的缀合物含3.2mol DM1/mol CNTO-95：[Ab]＝2.59mg/ml，[DM1]＝38.3μg/ml。计算基于滤过物质在252和280nm的吸光度读数，使用消光系数：280nm的Ab＝224,000M-1cm-1，280nm的DM1＝5700M-1cm-1，252nm的Ab＝82，880M-1cm-1，而252nm的DM1＝26，790M-1cm-1。
通过非还原性SDS-PAGE、SEC HPLC和通过利用ELISA对αVβ3和αVβ5蛋白的结合亲和性分析产物。根据PAGE，产物在160kDa附近有一条主带，还观察到较低分子量的微弱条带。根据SEC HPLC分析，洗脱出单体的缀合物级分(18.8′)为96％，作为较高分子量物质(16.2′)洗脱的缀合物约为4％。通过将吸光度对浓度绘图计算结合亲和性，得到CNTO95对αVβ5的表观Kd为3.0e-11M，缀合物对αVβ5的表观Kd为3.5e-11M。两种物质对αVβ3获得的表观Kd均为约3.0e-9。
其它批次的CNTO95-SPP-DM1和缀合至DM4的CNTO 95以及类似缀合的靶向非人抗原F105的不相关抗体使用如图2所示和如图3所概述的双功能连接基团以类似方式制备。这些制备物的特征在下文给出：
CNTO95-SPP-DM1(CNTO 364)的制备。如下用SPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM1：将270.6mg CNTO95缀合至3.7mg DM1，获得的98ml缀合物以2.74mg/mL的PBS溶液pH 6.5储存于2℃-8℃。DM1浓度根据吸光度测定为37.6μg/mL。因此，DM1/mol CNTO95的比率是2.98(1μg DM1等于68.9μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是96.3％单体和0.59％游离药物。
CNTO95-SPP-DM1(CNTO 364)的制备。如下用SPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM1：将104mg CNTO95缀合至1.82mg DM1，获得的26ml缀合物以3.65mg/mL缀合的CNTO95-SPP-DM1抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM1浓度根据吸光度测定为70.07μg/mL。因此，制备物包含3.80molDM1/mol CNTO95的比率(1μg DM1等于57.2μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是93.4％单体和1.61％游离药物。
CNTO95-SPP-DM1(CNTO 364)的制备。如下用SPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM1：将228mg CNTO95缀合至4.13mg DM1，获得的102ml缀合物以2.24mg/mL缀合的CNTO95-SPP-DM1抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM1浓度根据吸光度测定为40.53μg/mL。因此，制备物包含3.93molDM1/mol CNTO95的比率(1μg DM1等于55.3μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是94.7％单体和1.00％游离药物。
CNTO95-SSNPB-DM4(CNTO 365)的制备。如下用SSNPB连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM4：将121mgCNTO95缀合至2.18mg DM4，获得的34ml缀合物以3.25mg/mL的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为64.11μg/mL。因此，DM4/mol抗体的比率是3.57(1μg DM4等于55.6μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是95.4％单体和3.23％游离药物。
CNTO95-SSNPP-DM4(CNTO 366)的制备。如下用SSNPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM4：将101mg CNTO95缀合至1.45mg DM4，获得的30ml缀合物以3.07mg/mL抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为48.39μg/mL。因此，制备物具有2.95mol DM4/mol CNTO95(1μg DM4等于69.5μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是85.9％单体和1.18％游离药物。
CNTO95-SPDB-DM4(CNTO 365)的制备。如下用SPDB连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM4：将228.5mgCNTO95缀合至4.37mg DM4，获得的104.5ml缀合物以2.19mg/mL缀合的CNTO95-SPDB-DM4抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为41.84μg/mL。因此，制备物具有3.92molDM4/mol CNTO95(1μg DM4等于52.3μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是93.6％单体和0.55％游离药物。
CNTO95-SPDB-DM4(CNTO 365)的制备。如下用SPDB连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM4：将309mg CNTO95缀合至5.4mg DM4，获得的130.7ml缀合物以2.36mg/mL缀合的CNTO95-SPDB-DM4抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为41.2μg/mL。因此，制备物具有3.57molDM4/mol CNTO95(1μg DM4等于57.5μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是93.8％单体和0.40％游离药物。
CNTO95-SPP-DM1(CNTO 364)的制备。如下用SPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM1：将270.6mg CNTO95缀合至3.7mg DM1，获得的缀合物以2.74mg/mL的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM1浓度根据吸光度测定为37.6μg/mL。因此，制备物包含2.98DM1/mol CNTO95的比率(1μg DM1等于68.9μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是96.3％单体和0.59％游离药物。
CNTO95-SPP-DM1(CNTO 364)的制备。如下用SPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM1：将245mg F105缀合至4.28mg DM1，获得的91.5ml缀合物以2.68mg/mL缀合的F105-SPP-DM1抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM1浓度根据吸光度测定为46.76μg/mL。因此，制备物包含3.79DM1/mol F105的比率(1μg DM1等于57.3μg缀合的F105抗体)。根据HPLC，制备物是90.3％单体和2.44％游离药物。
CNTO95-SPP-DM4(CNTO 366)的制备。如下用SPP连接基团将单克隆抗体CNTO95缀合至类美登醇DM4：将76.7mg CNTO95缀合至1.10mg DM4，获得的35ml缀合物以2.19mg/mL缀合的CNTO5-SPP-DM4抗体的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为31.5μg/mL。因此，制备物包含2.96mol DM4/molCNTO95的比率(1μg DM4等于69.4μg缀合的CNTO95抗体)。根据HPLC，制备物是97.3％单体和1.14％游离药物。
F105-SSNPB-DM4的制备。如下用SSNPB连接基团将单克隆抗体F105缀合至类美登醇DM4：将106mg F105缀合至1.84mgDM4，获得的25ml缀合物以3.85mg/mL的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为73.45μg/mL。因此，DM4/mol抗体的比率是3.57(1μg DM4等于57.5μg缀合的F105抗体)。根据HPLC，制备物是85.1％单体和1.92％游离药物。
F105-SSNPB-DM4的制备。如下用SSNPB连接基团将单克隆抗体F105缀合至类美登醇DM4：将106mg F105缀合至1.84mgDM4，获得的30ml缀合物以3.46mg/mL的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为57.93μg/mL。因此，DM4/mol抗体的比率是3.32(1μg DM1等于65.4μg缀合的F105抗体)。根据HPLC，制备物是88.8％单体和1.85％游离药物。
F105-SSNPP-DM4的制备。如下用SSNPP连接基团将单克隆抗体F105缀合至类美登醇DM4：将105mg F105缀合至1.76mg DM4，获得的28ml缀合物以3.41mg/mL的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为62.87μg/mL。因此，制备物包含3.45mol DM4/mol F105(1μg DM4等于59.4μg缀合的F105抗体)。根据HPLC，制备物是85.9％单体和3.75％游离药物。
F105-SPDB-DM4的制备。如下用SPDP连接基团将单克隆抗体F105缀合至类美登醇DM4：将230.5mg F105缀合至4.12mg DM4，获得的104.5ml缀合物以2.21mg/mL的PBS溶液pH6.5储存于2℃-8℃。DM4浓度根据吸光度测定为39.41μg/mL。因此，制备物包含3.66mol DM4/mol F105(1μg DM4等于56.0μg缀合的F105抗体)。根据HPLC，制备物是89.2％单体和0.65％游离药物。
总之。合成以下的物质用于进一步的分析(表6)。
表6
  化合物   药物   美登醇活化试剂   Mab活 化试剂   邻接产物中的二 硫基的甲基(Mab 侧：药物侧)
  CNTO364   DM1   N-甲基，N-(1-二硫代甲基-3-羧基-丙基)丙氨酸   SPP或SSNPP   1∶0
  CNTO365   DM4   N-甲基，N-(1-二硫代甲基-2-甲基-4-羧基-正丁基)丙氨酸   SPDB或SSNPB   0∶2
  CNTO366   DM4   N-甲基，N-(1-二硫代甲基-2-甲基-4-羧基-正丁基)丙氨酸   SPP或SSNPP   1∶2
  F105-DM1   DM1   N-甲基，N-(1-二硫代甲基-3-羧基-丙基)丙氨酸   SPP或SSNPP   1∶0
  F105-DM4   DM4   N-甲基，N-(1-二硫代甲基-2-甲基-4-羧基-正丁基)丙氨酸   SPDB或SSNPB   0∶2
  F105-DM4   DM4   N-甲基，N-(1-二硫代甲基-2-甲基-4-羧基-正丁基)丙氨酸   SPP或SSNPP   1∶2
实施例3：结合肿瘤细胞的CNTO 95-美登素缀合物
测试CNTO95-类美登醇缀合物结合活细胞的能力和亲和力。
材料和方法。CNTO 95，Centocor批号95-VF30A03-1，20mg/ml的PBS溶液；CNTO 364(CNTO 95-SPP-DM1)，ImmunoGen批号1806-164，37.6mg/ml DM1，2.74mg/ml缀合抗体，内毒素水平＜0.1EU/mg；CNTO 365(CNTO 95-SPDB-DM4)，ImmunoGen批号2020-78，41.2mg/ml DM4，2.36mg/ml缀合抗体，内毒素水平＜0.1EU/mg；CNTO 366(CNTO95-SPP-DM4)，ImmunoGen批号2020-48，31.5mg/mlDM4，2.19mg/ml缀合抗体，内毒素水平＜0.1EU/mg。
细胞：HT29人结肠癌和A549人肺癌细胞得自ATCC，并保持在补加10％胎牛血清(FBS)的αMEM中。A2780人卵巢癌细胞得自国立癌症研究所。A2780细胞在含10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。收获细胞，清洗，悬浮在无血清DMEM中，在冰上序贯地与连续稀释的CNTO 95、CNTO 364、CNTO 365和CNTO 366以及FITC-标记的抗人抗体(10mg/ml)温育。没有一抗或用同种型匹配的抗体取代一抗用作阴性对照。立即用FACS Scan II流式细胞仪(BectonDickinson，Mountain View，CA)分析细胞。数据用GraphPad Prism软件使用非线性回归分析，以确定50％最大结合时的浓度(表7)。大多数情况下有效结合常数的变化小于2倍。
                 表7
              EC50(mg/ml)
化合物        HT29     A549       A2780
CNTO 95       0.14     0.18       0.17
CNTO 364      0.19     0.27       0.27
CNTO 365      0.21     0.34       0.27
CNTO 366      0.29     0.42       0.30
实施例4：CNTO 95-美登素缀合物对肿瘤细胞的细胞毒性
在体外测试CNTO95-类美登醇缀合物随时间推移杀死肿瘤细胞的能力。
CNTO 364(CNTO 95-SPP-DM1)，ImmunoGen批号1806-164，37.6μg/ml DM1，2.74mg/ml缀合抗体，内毒素水平＜0.1EU/mg。CNTO 365(CNTO 95-SPDB-DM4)，ImmunoGen批号2020-78，41.2μg/ml DM4，2.36mg/ml缀合抗体，内毒素水平＜0.1EU/mg。CNTO 366(CNTO95-SPP-DM4)，ImmunoGen批号2020-48，31.5μg/ml DM4，2.19mg/ml缀合抗体，内毒素水平＜0.1EU/mg。
人HT29人结肠癌和人非小细胞肺癌细胞A549(ATCC)在补加10％FBS的αMEM中于37℃在5％CO2存在下培养。将细胞接种入白色96-孔组织培养板(5000细胞/孔)的培养基中，温育16小时。将连续稀释的免疫缀合物加入各个合适的孔(0-20μg/ml)中。组织培养板于37℃温育96小时。按照生产商的说明进行ATPLIte测定。数据用GraphPad Prism软件使用非线性回归分析(表8)，以确定在通过发光度检测的半最大细胞数时的浓度。
表8
Figure A20058004781300541
实施例5：CNTO 95-DM1治疗带有人黑素瘤衍生肿瘤的大鼠
研究CNTO 364相比于CNTO95对晚期皮下A375.S2人黑素瘤细胞的效力。
CNTO 95-DM1由母液浓度为2.59mg/ml的ImmunoGen，Inc.批号1716-74B制备。5mg/kg CNTO 95-DM1等于74μg/kg DM1。CNTO95得自Centocor批号5380-027，母液浓度＝20mg/ml。人IgG-DM1：ChromPure人IgG来自Jackson ImmunoReseaurch Laboratories。人IgG-DM1由母液浓度为2.8mg/ml的ImmunoGen批号1762-50制备。5mg/kg的该缀合物等于76μg/kg DM1。美登素：ImmunoGen批号1710-121，母液浓度＝16.38μg/ml的PBS溶液，pH6.5。美登素的母液用PBS稀释至15和7.5μg/ml。PBS：ImmunoGen，pH6.5。A375.S2人黑素瘤细胞购自ATCC并传代，以冷冻等份储存于Centocor CellBiology Services。
9周龄无胸腺裸大鼠皮下接种A375.S2人黑素瘤细胞。在第14天时，当平均肿瘤体积达到250-300mm3时，将动物随机分为9只/10只的小组，并开始治疗。静脉内注射CNTO 95-DM1和适宜的对照化合物(在第一周每隔一天注射3次，接着在第11、14、16、21和28天每周注射1次达两周。记录肿瘤大小和体重。图6表明了裸小鼠中人黑素瘤的肿瘤体积随时间推移的变化。肿瘤体积表示为平均值±SEM(n＝9或10)。箭头表示静脉内药物注射。星号表示1只未响应动物由于其肿瘤体积超过1500mm3而被处死。所有动物都在第35天时被处死。肿瘤体积表示为平均值±SEM(n＝9或10)。箭头表示静脉内药物给予。CNTO95-DM1以5mg/kg阻断肿瘤生长，缩小平均肿瘤体积，而10mg/kg的CNTO95在该实验中无作用。
在大鼠中的第二个实验中，平均肿瘤体积在第14天达到250mm3。动物随机分组，第一剂在第14天静脉内给予。随后在同一周的第16和18天给予注射，此后在第23天和第31天每周注射一次。所有动物都在第35天处死。CNTO 95-DM1 5mg/kg在雌性无胸腺大鼠中引起A375.S2人黑素瘤异种移植物完全消退(图7)。包括PBS、游离CNTO 95、不相关抗体-DM1缀合物、游离美登素以及游离CNTO95加游离美登素在内的对照化合物未显示出任何显著作用。
实施例6：CNTO 95-DM1治疗带有人结肠癌衍生肿瘤的大鼠
研究CNTO 364相比于CNTO95对晚期皮下HT29人结肠癌的效力。
CNTO 364，ImmunoGen批号1806-50，蛋白浓度2.53mg/ml，DM1浓度41.8mg/ml，DM1对CNTO 95的比率为3.6mol DM1/molCNTO 95。PBS或抗体F105-DM1用作对照。F105-DM1；ImmunoGen批号1806-44，蛋白浓度2.2mg/ml，DM1浓度为38.3mg/ml，DM1对F105的比率为3.8mol DM1/mol F105。检测所有测试品的内毒素污染，LAL值低于1.0EU/mg。表达avb3、avb5和avb6整联蛋白的HT29人结肠癌细胞系得自Centocor细胞库。该细胞系经测定无支原体和细菌物质。细胞在补加10％FBS、1％丙酮酸盐和1％MEM非必须氨基酸的aMEM中在5％CO2存在下于37℃培养。
在本研究中使用70只得自Harlan Laboratories(Indianapolis，IN)的雌性无胸腺大鼠。在后肋区(背侧，在最后一根肋骨后约0.5英寸，距脊骨0.5英寸)给大鼠皮下注射5×106HT29细胞(0.2ml 25×106细胞/ml)。每天(工作日)监视所有大鼠的可触知肿瘤的外观。根据个体肿瘤体积将动物分为7组，每组都含有9只动物(表9)。所有组的平均起始肿瘤体积都在250-260mm3之间。
表9
  组别   N   CNTO 364(mg/kg)   给药日
  1)PBS   9   0   第7、14、21、28和35天
  2)F105-DM1   9   25   第7和14天
  3)CNTO 364   9   3   第7、14、21、28和35天
  4)CNTO 364   9   6   第7、14、21、28和35天
  5)CNTO 364   9   10   第7、14、21、28和35天
  6)CNTO 364   9   15   第7、14和35天
  7)CNTO 364   9   25   第7和14天
在分组当天(第0天)，对动物称重，静脉内注射25mg/kg的对照抗体F105-DM1或3、6、10、15或25mg/kg的CNTO 364。所有测试品和对照品都以1ml体积/100g体重给予。3、6和10mg/kg的CNTO 364组按照每7天1次×5的程序静脉内给予。15mg/kg的CNTO 364在第7、14和35天给药。25mg/kg的CNTO 364和25mg/kg的F105-DM1在第7天和第14天给药。后2组由于体重明显下降(由第0天下降超过10％)而按照动物实验室IACUC指引实施安乐死(图8)。
每周记录2次肿瘤体积检测结果。用卡钳以厘米(mm)为单位在两个维度(长和宽)检测肿瘤。使用公式V＝(长×宽×宽)/2计算肿瘤体积(mm3)。用GraphPad Prism软件使用非配对t检验进行统计。
CNTO 364以剂量依赖性方式抑制既有结肠肿瘤的生长(图9)。CNTO 364以10mg/kg按照每7天1次×5的给药程序在9只动物中产生3只完全肿瘤消退和2只部分消退(图10)。用CNTO 364以15mg/kg在第7、14和35天治疗在9只带有肿瘤的动物中产生4只完全消退和4只部分消退。PBS对照组在肿瘤细胞植入后第35天被终止(平均肿瘤体积超过5000mm3)。此时，使用双尾不配对t检验，10mg/kg和15mg/kg的CNTO 364治疗组对PBS对照的肿瘤体积差异具有＜0.0001的P值。
25mg/kg的CNTO 364和25mg/kg的F105-DM1这二者的两次连续注射均有毒性，产生不可接受的体重下降(图8)。但是，单次注射25mg/kg的CNTO 364完全消退平均肿瘤体积超过4000mm3的晚期HT29人结肠癌肿瘤(未显示)。
实施例7：CNTO 95-DM1治疗带有人肺癌衍生肿瘤的大鼠
在带有A549人肺癌的雌性无胸腺大鼠中进行本研究，以评价CNTO 95-DM1缀合物的体内效力。CNTO 95在Centocor(Malvern，PA)制备，DM1的缀合由ImmunoGen(Cambridge，MA)进行。CNTO 364为如实施例1所述的CNTO95-SPP-DM1。
人肺癌细胞系A549(ATCC)在含10％FBS的MEMα中培养，细胞在无血清αMEM中制备，用于皮下植入无胸腺大鼠中。在后肋区(背侧，在最后一根肋骨后约0.5英寸，距脊骨0.5英寸)上以5×106细胞(0.2ml的25×106细胞/ml)皮下植入雌性无胸腺大鼠(6周龄，HarlanLaboratory，Indianapolis，IN)后肋区。当平均肿瘤体积达到250mm3时，以相似平均肿瘤体积将动物分为剂量组(表10)，在肿瘤细胞注射后第17和29天静脉内给药。
表10
  组别   药物   第17和29天给药
  1   PBS   N/A
  2   F105-DM1   15mg/kg
  3   CNTO 364   15mg/kg
  4   单独的CNTO 95   15mg/kg
  5   CNTO 95+美登素   15mg/kg+260μg/kg
  6   单独的美登素   260μg/kg
每周记录两次肿瘤体积检测结果。用电子Vernier卡钳以厘米(mm)为单位在两个维度(长和宽)检测肿瘤。使用公式V＝(长×宽×宽)/2计算肿瘤体积(mm3)。肿瘤体积表示为平均值±SEM(n＝6)。这些结果对时间作图，图12，其中箭头指示静脉内药物注射时间。使用体重作为耐受性指标(图11)也表明，在本研究中使用的CNTO 364给药程序被动物良好耐受，在首次给药后仅产生初始体重3％的一过性体重损失。
用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)，使用95％置信区间，进行单向方差分析(ANOVA)和Bonferroni检验。参看图12：组1，PBS；组2，F105-DM1，15mg/kg；组3，CNTO 364，15mg/kg；组4，单独的CNTO 95，15mg/kg；组5，15mg/kg的CNTO 95加260mg/kg的美登素；组6，单独的美登素，260mg/kg。通过用于多重比较的单向方差分析(ANOVA)和Bonferroni检验测定P值。*P＜0.05，CNTO 364对F105-DM1、CNTO 95加美登素或单独的美登素；**P＜0.01，CNTO 364对单独的CNTO 95；***P＜0.001，CNTO 364对PBS。
DM1缀合至大分子CNTO 95可能通过延长DM1的体内半衰期改变DM1的药动学特性。为排除此可能性，将不相关抗体F105-DM1免疫缀合物纳入本研究，以确定CNTO 95-DM1缀合物的活性是否是CNTO 95依赖性的。因为CNTO 95是抗血管生成化合物和抗肿瘤化合物并且DM1是细胞毒性剂，所以抗肿瘤活性有可能缘于游离CNTO95和游离DM1的简单相加效应。因此，纳入游离CNTO 95、游离CNTO 95加游离美登素以及游离美登素给药组作为对照。如图13所示，15mg/kg的CNTO 364按照每12天1次×2的给药程序消除了6个肿瘤A549肺肿瘤异种移植物中的6个。在F105-DM1组观察到1个完全肿瘤消退，在CNTO 95加美登素组中观察到2个完全肿瘤消退。这些结果表明了CNTO 95-DM1免疫缀合物CNTO 364在A549肺肿瘤消退中的优越性。用CNTO364按照此给药方案治疗的动物显示出一过性皮肤毒性和体重下降，没有严重毒性的明显征兆。
实施例8：人结肠癌肿瘤模型中的缀合物结构比较
选择在免疫缺失大鼠中使用皮下植入的HT29人结肠肿瘤衍生细胞的晚期肿瘤模型，检验使用的各种谱系对CNTO 95免疫缀合物制品的耐受性和效力。
CNTO 95-SPP-DM1(CNTO 364)、CNTO 95-SSNPB-DM4(CNTO365)、CNTO 95-SSNPP-DM4(CNTO 366)和它们的Mab F105等价物由ImmunoGen(Cambridge，MA)制备。100只雌性无胸腺大鼠(4-6周龄)得自Harlan Laboratories。
人HT29(ATCC)在补加10％FBS的αMEM中在5％CO2存在下于37℃培养。在无血清αMEM中制备浓度为2.5×107细胞/ml的细胞用于接种。在后肋区(背侧，在最后一根肋骨后约0.5英寸，距脊骨0.5英寸)上以5×106HT29细胞(0.2ml的25×106细胞/ml)皮下接种雌性无胸腺大鼠。所有大鼠都每周监测两次肿瘤外观。根据各组的平均肿瘤体积约为250mm3将动物分为13组，每组6只动物。在分组当天(第7天)，各组接受如表11列出的其初始剂量。基于各个缀合物中DM1或DM4的含量计算免疫缀合物的剂量。L和H分别代表175和350μg/kg DM1或DM4。所有测试品都以1ml体积/100g体重给予。除了仅在第7天接受1剂的第11组以外，所有其它组都在第7天和第21天给药。肿瘤体积的变化用作效力指标(图14A和B)，体重变化(图15A和B)用于监测耐受性。所有检测结果都表示为组平均值±SEM(n＝6)。
表11
  组别  给予的抗体缀合物(mg/kg)   DMx剂量μg/kg
  1.PBS  0   0
  2.F105-SPP-DM1  11.5   DM1：175
  3.F105-SPP-DM1  23   DM1：350
  4.F105-SSNPB-DM4  10   DM4：175
  5.F105-SSNPB-DM4  20   DM4：350
  6.F105-SSNPP-DM4  10.5   DM4：175
  7.F105-SSNPP-DM4  21   DM4：350
  8.CNTO 364  10   DM1：175
  9.CNTO 364  20   DM1：350
  10.CNTO 365  10   DM4：175
  11.CNTO 365  20   DM4：350
  12.CNTO 366  12   DM4：175
  13.CNTO 366  24   DM4：350
如图14B所示，在首次给药后，注射350μg/kg DM4的CNTO 365和F105-SSNPB-DM4的动物损失了初始体重的10％以上。因此，在这两个组中在1次注射后的给药是不连续的。＞10％的体重损失是一过性的，动物在停止治疗的10天内恢复。其余组在第7天和第21天均给药，除了高剂量CNTO 364组以外没有观察到显著体重损失，在高剂量CNTO 364组中动物体重损失超过10％。在使用CNTO 364遵循该给药程序的其它实验中没有观察到明显的重量损失。如图14B所示，单次注射高剂量的CNTO 365在6只动物中的4只中引起既有皮下人HT29结肠癌的完全消退。高剂量的CNTO 364(350μg/kg的DM1)和低剂量的CNTO 365(175μg/kg的DM4)也消退进行性的结肠肿瘤(在各组中分别为6只动物中的2只)或显著抑制HT29结肠肿瘤的生长。但是，低剂量的CNTO 364(175μg/kg的DM1)和两种剂量的CNTO 366对肿瘤大小不具有任何显著作用。这些结果提示，在该肿瘤异种移植模型中按照每14天1次×2的程序给予时，CNTO365具有优于CNTO 364和CNTO 366的效力和功效。
显然，可不同于前述说明书和实施例的具体描述来实施本发明。
按照以上教导有可能对本发明实施众多改变和变更，因此，它们属于所附权利要求书的范围。
                         序列表
<110>Centocor，Inc.
     Trikha，Mohit
     Qiming，Chen
<120>抗整联蛋白免疫缀合物、方法和用途
<130>CEN 50？？
<140>TBD
<141>2004-11-04
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Arg Tyr Thr Met His
1               5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
1               5
<210>7
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ash Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ash Ser Glu Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Val Ash Ile Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>8
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
                85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
<210>9
<211>1048
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
Met Ala Phe Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu
1               5                   10                  15
Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn
            20                  25                  30
Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr
        35                  40                  45
Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met
    50                  55                  60
Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile
65                  70                  75                  80
Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg
                85                  90                  95
Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys
            100                 105                 110
Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val
        115                 120                 125
Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp
    130                 135                 140
Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu
145                 150                 155                 160
Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp
                165                 170                 175
Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp
            180                 185                 190
Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr
        195                 200                 205
Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys
    210                 215                 220
Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr
225                 230                 235                 240
Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val
                245                 250                 255
Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly
            260                 265                 270
Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly
        275                 280                 285
Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala
    290                 295                 300
Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr
305                 310                 315                 320
Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp
                325                 330                 335
Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala
            340                 345                 350
Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala
        355                 360                 365
Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly
    370                 375                 380
Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys
385                 390                 395                 400
Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val
                405                 410                 415
Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro
            420                 425                 430
Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly
        435                 440                 445
Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu
    450                 455                 460
Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr
465                 470                 475                 480
Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr
                485                 490                 495
Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp
            500                 505                 510
Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu
        515                 520                 525
Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu
    530                 535                 540
Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly
545                 550                 555                 560
Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser
                565                 570                 575
Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg
            580                 585                 590
Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu
        595                 600                 605
Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu
    610                 615                 620
Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val
625                 630                 635                 640
Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr
                645                 650                 655
Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu
            660                 665                 670
Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg
        675                 680                 685
Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn
    690                 695                 700
Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly
705                 710                 715                 720
Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu
                725                 730                 735
Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu
            740                 745                 750
Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val
        755                 760                 765
Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe
    770                 775                 780
Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu
785                 790                 795                 800
Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly
                805                 8l0                 815
Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys
            820                 825                 830
Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly
        835                 840                 845
Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys
    850                 855                 860
Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln
865                 870                 875                 880
Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu
                885                 890                 895
Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys Ile
            900                 905                 910
Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr
        915                 920                 925
Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln
    930                 935                 940
Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu
945                 950                 955                 960
Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu
                965                 970                 975
Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val
            980                 985                 990
Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu
        995                 1000                1005
Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg
    1010                1015                1020
Val Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro
    1025                1030                1035
His Glu Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr
    1040                1045

Claims (36)

1.一种抗体-药物缀合物，所述缀合物包含：结合异二聚化人整联蛋白受体的α-V亚单位的抗体，所述抗体缀合至具有10-9M或以下的IC50的细胞毒性剂，其中所述抗体-药物缀合物对表达αV整联蛋白的癌细胞系发挥细胞毒性或细胞抑制作用。
2.一种下式的抗体缀合物：
[C-L]m-A    I
其中，A是人αV整联蛋白亚单位特异性抗体，其中所述抗体能够由表达所述αV亚单位的细胞内化；C是具有10-9M或以下的IC50的细胞毒性剂；L是结合所述抗体和细胞毒素的连接基团，其还含胞内环境组分可裂解的键；而m代表连接至所述抗体的细胞毒素分子的平均数，为1-10的整数。
3.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗体与单克隆抗体CNTO 95或其片段竞争结合人αV整联蛋白。
4.权利要求1的抗体缀合物，其中所述抗体分子是单克隆抗体CNTO 95或重组抗体，所述重组抗体具有如SEQ ID NO：1-6所示的至少一个CNTO 95互补决定区(CDR)，或具有至少一个所示CDR的保守置换。
5.权利要求3的抗体缀合物，其中所述单克隆抗体与MAb CNTO95竞争结合表达人αVβ3整联蛋白的活细胞。
6.权利要求1的抗体缀合物，其中所述抗体分子对氨基酸序列SEQ ID NO：9中的表位是特异性的。
7.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
8.权利要求2的抗体缀合物，其中所述可裂解的化学键选自二硫键、硫醚、酯、肽键或酰胺。
9.权利要求2的抗体缀合物，其中所述可裂解的化学键是二硫键。
10.权利要求1或2的抗体缀合物，其中所述细胞毒性剂选自类美登醇、加里刹霉素、埃坡霉素、discodermolide、eleuthrobin、多拉司他汀、隐藻素、喜树碱、根霉素(CAS注册号90996546)或紫杉烷衍生物以及在10-9M或以下对肿瘤细胞生长表现出半最大抑制(IC50或GI50)的其它这种化合物。
11.权利要求10的抗体缀合物，其中所述细胞毒性剂是类美登醇。
12.权利要求11的抗体缀合物，其中所述类美登醇于C-3、C-14、C-15或C-20被酰化氨基酸酯化，其中所述酰基携带受保护的巯基，其中邻接受保护巯基的所述酰基的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基选自CH3、C2H5、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基、杂环芳基部分、杂环烷基部分或H；其中所述酰基在羰基官能团和硫原子之间具有至少两个碳原子的直链长度。
13.权利要求11的抗体缀合物，其中所述类美登醇为N2′-脱乙酰基-美登素的巯基化衍生物。
14.权利要求13的抗体缀合物，其中所述N2′-脱乙酰基-美登素的衍生物通过下式的部分连接至抗体分子：-S-CH2CH2-CO-、-S-CH2CH2CH2CH2-CO-、-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-或-S-C(CH3)2CH2CH2-CO-基团。
15.权利要求2的缀合物，其中连接至所述抗体分子的细胞毒性残基的平均数为3-4。
16.一种下式的抗体缀合物及其药物可接受的盐和酯：
Figure A2005800478130004C1
其中所述抗体为人αV整联蛋白亚单位特异性抗体，其中所述抗体能够被表达所述αV亚单位的细胞内化；其中美登醇在C-3处酯化；R1、R2、X1和X2独立为H、Me、C2H5、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基部分或杂环烷基部分；n为1-5；p为1-5；m为1-10。
17.权利要求16的抗体缀合物，其中n＝2，R和R2都是甲基，Z是H，p为3。
18.权利要求1的缀合物的生产方法，所述方法包括以下步骤：(a)将一个或多个游离或受保护的巯基导入到对人αV亚单位整联蛋白特异性的抗体分子中；(b)使步骤(a)的抗体分子与具有10-9M或以下的EC50的细胞毒性化合物反应，所述化合物具有一个或多个二硫基团或巯基；和(c)回收获得的缀合物。
19.权利要求18的方法，其中所述毒性化合物为类美登醇。
20.权利要求18或19的方法，其中(2-吡啶基)-3-二硫代丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯(SPDP)、(2-吡啶基)-4-二硫代戊酸N-羟基琥珀酸亚胺酯(SPP)或(2-吡啶基)-4-二硫代丁酸-羟基琥珀酸亚胺酯(SPDB)用于将游离或受保护的巯基导入到所述抗体分子中。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-17中任一项的缀合物和药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
22.一种使用权利要求1-17中任一项的缀合物制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于治疗癌症。
23.一种在需要其的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的权利要求1-17中任一项的缀合物，其中所述癌症为乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠腺癌、肾细胞癌或胃腺癌。
24.权利要求23的治疗癌症的方法，其中所述癌症为头颈鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌或子宫颈鳞状细胞癌。
25.一种使用权利要求1-17中任一项的缀合物治疗或预防癌症转移扩散的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求1-17中任一项的缀合物。
26.一种在需要其的哺乳动物中抑制癌症细胞生长的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物权利要求1-17中任一项的单克隆抗体缀合物，所述缀合物在所述哺乳动物中以有效抑制所述癌症细胞生长的量防止CNTO 95结合表达人αVβ3整联蛋白的活细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述抗体缀合物静脉内给予。
28.权利要求27的方法，其中所述抗体缀合物以0.05mg/kg体重至12.0mg/kg体重的量给予。
29.权利要求26的方法，其中所述哺乳动物为人患者。
30.一种在需要其的哺乳动物中抑制血管生成的方法，所述方法包括给予患血管生成依赖性疾病的哺乳动物权利要求1-17中任一项的单克隆抗体缀合物，所述缀合物以有效抑制所述血管生成的量防止CNTO 95结合表达人αVβ3整联蛋白的活细胞，其中所述血管生成依赖性疾病为选自以下的疾病：癌症转移、血管瘤、血管纤维瘤、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、由血管生成诱发的角膜病、退化黄斑病变、黄斑变性、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维增生、颗粒性结膜炎、银屑病、毛细管扩张、化脓性肉芽瘤、脂溢性皮炎、痤疮和关节炎。
31.一种用于在需要其的哺乳动物中改善炎性疾病的方法，所述方法包括给予需要其的哺乳动物权利要求1-17中任一项的单克隆抗体缀合物，所述缀合物以有效改善所述炎性疾病的一种或多种症状的量防止CNTO 95结合表达人αVβ3整联蛋白的活细胞，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、黄斑变性、银屑病、糖尿病性视网膜病。
32.权利要求30的方法，其中所述单克隆抗体治疗选自以下的血管生成性皮肤病：银屑病、静脉溃疡、痤疮、红斑痤疮、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管生成。
33.权利要求30的方法，其中所述单克隆抗体治疗涉及角膜或视网膜新血管生成的疾病。
34.权利要求21-33中任一项的方法，其中所述抗体与第二种治疗性或预防性药物或药征(modality)组合给予。
35.一种制品，所述制品包含权利要求1-17中任一项的缀合组合物和容器，还包含包装说明书或标签，所述包装说明书或标签指示所述组合物可用于治疗以表达αV亚单位整联蛋白的细胞为特征的疾病。
36.权利要求35的制品，其中所述包装说明书指示所述组合物可用于治疗癌症。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216779A (zh) * 2008-10-13 2011-10-12 泽普塔根股份公司 免疫缀合物的制备方法及其应用
CN108463253A (zh) * 2016-02-10 2018-08-28 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂*缀合物
CN108586487A (zh) * 2012-09-26 2018-09-28 伊缪诺金公司 用于美登醇酰化的改进的方法
CN110869051A (zh) * 2017-05-30 2020-03-06 小利兰·斯坦福大学托管委员会 对神经炎症性疾病的治疗
CN113842468A (zh) * 2014-09-02 2021-12-28 伊缪诺金公司 用于配制抗体药物缀合物组合物的方法
WO2024001669A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 昱言科技(北京)有限公司 靶向itga2的抗体和包含此抗体的抗体药物缀合物

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2325344B1 (es) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.
PT1819359E (pt) * 2004-12-09 2015-05-28 Janssen Biotech Inc Imunoconjugados anti-integrina, métodos para a sua produção e sua utilização
AU2006274698B2 (en) 2005-08-02 2011-06-09 Xbiotech, Inc. Diagnosis, treatment, and prevention of vascular disorders using IL-1a autoantibodies
MY159375A (en) * 2006-03-21 2016-12-30 Genentech Inc Combinatorial therapy
CA2658612C (en) 2006-08-03 2015-11-17 Astrazeneca Ab Antibodies directed to .alpha.v.beta.6 and uses thereof
WO2008042611A2 (en) * 2006-09-29 2008-04-10 Centocor, Inc. Method of using il6 antagonists with mitoxantrone for prostate cancer
US20090175784A1 (en) * 2007-05-11 2009-07-09 Joshua Goldstein Anti-Alpha V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
WO2008141276A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 Centocor, Inc. Anti-alpha-v immunoliposome composition, methods and uses
US7973138B2 (en) 2007-09-26 2011-07-05 Genentech, Inc. Antibodies
KR20210100223A (ko) 2008-04-30 2021-08-13 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
KR20150127300A (ko) 2008-05-30 2015-11-16 엑스바이오테크, 인크. 인터류킨-1 알파 항체 및 그의 사용 방법
BRPI0916365A2 (pt) * 2008-07-21 2018-05-02 Brigham & Womens Hospital Inc métodos e composições relacionados aos oligossacarídeos de glicosina beta-1,6 sintéticos
CN102209557A (zh) 2008-09-12 2011-10-05 埃克斯生物科技公司 靶向病原性单核细胞
EP2411411B1 (en) 2009-03-25 2016-08-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Novel anti-alpha5beta1 antibodies and uses thereof
LT2437790T (lt) 2009-06-03 2019-06-10 Immunogen, Inc. Konjugavimo būdai
FR2947269B1 (fr) * 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
CA2676946A1 (en) * 2009-08-28 2011-02-28 Lucie Peduto Adam12 inhibitors and their use against inflammation-induced fibrosis
JP2013506709A (ja) 2009-10-06 2013-02-28 イミュノジェン・インコーポレーテッド 有効なコンジュゲートおよび親水性リンカー
MX341687B (es) 2010-02-10 2016-08-30 Immunogen Inc "anticuerpos cd20 y su utilización".
WO2011162933A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-29 Immunogen, Inc. Anti-integrin immunoconjugate dosing regimens
CN107596365A (zh) 2010-06-18 2018-01-19 埃克斯生物科技公司 关节炎治疗
KR20160062200A (ko) * 2010-08-23 2016-06-01 엑스바이오테크, 인크. 종양성 질병들에 대한 치료
WO2012057328A1 (ja) * 2010-10-29 2012-05-03 株式会社ペルセウスプロテオミクス 高い内在化能力を有する抗ｃｄｈ３抗体
KR20220009505A (ko) 2011-03-29 2022-01-24 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
US9724409B2 (en) 2011-04-01 2017-08-08 Xbiotech, Inc. Treatment of inflammatory skin disease
EP2699268A2 (de) 2011-04-21 2014-02-26 Seattle Genetics, Inc. Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
RU2013154048A (ru) * 2011-05-09 2015-06-20 Юниверсити Оф Вирджиния Пэтент Фаундейшн Композиции и способы лечения рака
RU2622021C2 (ru) 2011-09-23 2017-06-08 ИксБиотеч, Инк. Лечение кахексии
KR20150009952A (ko) * 2012-01-27 2015-01-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 알파-v-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체
SG11201404354UA (en) * 2012-02-17 2014-10-30 Seattle Genetics Inc ANTIBODIES TO INTEGRIN αVβ6 AND USE OF SAME TO TREAT CANCER
US9545441B2 (en) 2012-09-18 2017-01-17 Xbiotech, Inc. Treatment of diabetes
SG11201502429YA (en) 2012-10-04 2015-04-29 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
US9180203B2 (en) * 2012-10-23 2015-11-10 The Johns Hopkins University Self-assembling drug amphiphiles and methods for synthesis and use
CA2898239A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Syddansk Universitet Mfap4 binding antibodies blocking the interaction between mfap4 and integrin receptors
EP2777714A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
EP3021942A4 (en) * 2013-07-19 2017-04-19 The Regents of The University of California Milk fat globule epidermal growth factor 8 regulates fatty acid uptake
EP3038624A1 (en) 2013-08-26 2016-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
NZ720736A (en) 2013-12-23 2020-08-28 Bayer Pharma AG Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindel protein (ksp)
KR20170088905A (ko) 2014-11-19 2017-08-02 이뮤노젠 아이엔씨 세포 결합 작용제-세포독성 작용제 접합체를 제조하기 위한 공정
WO2016090157A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Celgene Corporation Biomolecule conjugates
WO2016102679A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Nbe-Therapeutics Ag Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
CN108025084A (zh) 2015-06-22 2018-05-11 拜耳医药股份有限公司 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（adc）和抗体前药缀合物（apdc）
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
SG11201806478PA (en) 2016-02-05 2018-08-30 Immunogen Inc Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
WO2017162663A1 (de) 2016-03-24 2017-09-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
WO2018114798A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
KR102583006B1 (ko) 2016-12-21 2023-09-27 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc)
CN110072556B (zh) 2016-12-21 2023-05-02 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
KR20190117579A (ko) 2017-02-16 2019-10-16 엑스바이오테크, 인크. 화농성 한선염의 치료
US10639382B2 (en) 2017-04-13 2020-05-05 National Guard Health Affairs Method for treating leukemia
EP3634485A4 (en) * 2017-06-07 2021-07-21 Silverback Therapeutics, Inc. CONJUGATES OF ANTIBODIES CONTAINING IMMUNOMODULATOR COMPOUNDS AND THEIR USES
US20200046737A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Notable Labs, Inc. Methods for treating cancer, and compositions therefor
AU2020309570A1 (en) 2019-07-10 2022-02-03 Cybrexa 2, Inc. Peptide conjugates of cytotoxins as therapeutics
JP2022541747A (ja) 2019-07-10 2022-09-27 サイブレクサ ３，インコーポレイテッド 治療薬としての微小管標的化剤のペプチドコンジュゲート
CN115350187B (zh) * 2022-08-30 2023-08-29 中山大学 异丙托溴铵在抑制肺癌骨转移中的应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
PT627940E (pt) * 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
JP3161490B2 (ja) 1993-07-30 2001-04-25 松下電器産業株式会社 金型装置
US6160099A (en) 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
GB9909392D0 (en) * 1999-04-24 1999-06-23 Imp Cancer Res Tech Treatment, imaging and diagnosis of disease
EP1191944A2 (en) 1999-06-25 2002-04-03 Genentech, Inc. METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
AR030612A1 (es) * 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
EP1389090A2 (en) * 2001-04-26 2004-02-18 Board of Regents, The University of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
US20030103985A1 (en) * 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US20050152913A1 (en) 2002-05-13 2005-07-14 Eldridge Ann M. Process for preapring maytansinol
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
BRPI0410260A (pt) * 2003-05-14 2006-05-16 Immunogen Inc composição conjugada para medicamento
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
CN1956722A (zh) 2003-05-20 2007-05-02 伊缪诺金公司 含有新的美登素类的改进的细胞毒剂
PT1819359E (pt) * 2004-12-09 2015-05-28 Janssen Biotech Inc Imunoconjugados anti-integrina, métodos para a sua produção e sua utilização

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216779A (zh) * 2008-10-13 2011-10-12 泽普塔根股份公司 免疫缀合物的制备方法及其应用
CN102216779B (zh) * 2008-10-13 2013-11-27 泽普塔根股份公司 免疫缀合物的制备方法及其应用
CN108586487A (zh) * 2012-09-26 2018-09-28 伊缪诺金公司 用于美登醇酰化的改进的方法
US10944190B2 (en) 2012-09-26 2021-03-09 Immunogen, Inc. Methods for the acylation of maytansinol
CN108586487B (zh) * 2012-09-26 2021-11-05 伊缪诺金公司 用于美登醇酰化的改进的方法
CN113842468A (zh) * 2014-09-02 2021-12-28 伊缪诺金公司 用于配制抗体药物缀合物组合物的方法
CN108463253A (zh) * 2016-02-10 2018-08-28 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂*缀合物
CN108463253B (zh) * 2016-02-10 2022-03-04 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓缀合物
CN110869051A (zh) * 2017-05-30 2020-03-06 小利兰·斯坦福大学托管委员会 对神经炎症性疾病的治疗
WO2024001669A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 昱言科技(北京)有限公司 靶向itga2的抗体和包含此抗体的抗体药物缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
US20060127407A1 (en) 2006-06-15
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