CN109923126A - 抗-pd-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗‑PD‑1抗体及其抗原结合片段。本发明还提供编码抗‑PD‑1抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸分子、相关表达载体及宿主细胞。本发明提供制造抗‑PD‑1抗体及其抗原结合片段的方法。本发明亦提供相关医药组合物及其用以治疗个体的方法。

Description

抗-PD-1抗体
交叉引用
本PCT国际申请要求于2016年9月16日提交的美国临时专利申请No.62/395,832的权益和优先权。该PCT国际申请也要求于2017年6月14日提交的美国临时专利申请No.62/519,590的权益和优先权。所述申请的内容在此通过参考文献结合。
技术领域
本发明是关于抗-PD-1抗体及其应用于人类癌症治疗中的使用方法。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)是由活化T及B细胞表达的关键免疫检查点受体并介导免疫抑制。PD-1是受体CD28家族的一员，包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1及BTLA。已识别PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体(程序性死亡配体-1(PD-L1)及程序性死亡配体-2(PD-L2))，其被抗原提呈细胞表达且存在于许多人类癌症中，并且该抗体一经结合至PD-1即下调T细胞活化及细胞因子分泌(Freeman等，2000；Latchman等，2001)。不同于CTLA-4，PD-1主要作用于活化T细胞和肿瘤及/或基质细胞表达的免疫抑制的PD-L1(B7-H1)及PD-L2(B7-DC)配体的结合的周围组织(Flies等人，2011；Topalian等人，2012a)。PD-1/PD-L1相互作用的抑制在临床前模型中表明潜在的抗肿瘤活性(美国专利第8,008,449及7,943,743号)，PD-1/PD-L1相互作用的Ab抑制剂在治疗癌症中的用途已进入临床试验(Brahmer等，2010；Flies等，2011；Topalian等，2012b；Brahmer等，2012)。
基于存在的研发针对PD-1的抗癌治疗剂的需求，本发明的目的在于满足此需求及其他需求。
发明内容
本发明提供抗-PD-1抗体和/或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明的抗-PD-1抗体是嵌合抗-PD-1抗体c1G4和/或人源化抗-PD-1h1G4，其包含轻链(LC)可变域(可变区)序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASQDVTTAVA(SEQ ID NO:9)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDF(SEQ ID NO:14)的CDR-H3。
本发明进一步提供针对人类化h1G4抗-PD-1抗体的亲和力成熟抗体。在某些实施例中，本发明的成熟抗-PD-1抗体(例如，抗-PD-1抗体，33B)包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASTDVTTAVA(SEQ ID NO:15)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASLRHT(SEQ ID NO:16)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYGIPWT(SEQ IDNO:17)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FRFSNYGMS(SEQ ID NO:18)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNAY(SEQ ID NO:19)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列TSYYYGIDF(SEQ ID NO:20)的CDR-H3。
在其他实施例中，本发明的成熟抗-PD-1抗体(例如，抗-PD-1抗体，66E)包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KAKQDVTTAVA(SEQ IDNO:21)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYWIPWT(SEQ ID NO:22)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDL(SEQ ID NO:23)的CDR-H3。
在某些实施例中，本发的成熟抗-PD-1抗体(例如，抗-PD-1抗体，711D)包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASQDVTNAVA(SEQ IDNO:24)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列SSYYYGIDL(SEQ ID NO:25)的CDR-H3。
本文中所述的CDR序列提供于下表1中。
表1
在一些实施例中，抗-PD-1抗体包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含选自SEQ ID No:9、21及24的氨基酸序列的CDR-L1；(2)包含SEQ ID No:10或16的氨基酸序列的CDR-L2；(3)包含选自SEQ ID No:11、17、22的氨基酸序列的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含SEQ ID No:12或18的氨基酸序列的CDR-H1；(2)包含SEQ ID No:13或19的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含选自SEQ ID No:14、20、23及25的氨基酸序列的CDR-H3。
本发明还提供抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变域序列，该重链可变域序列包含(SEQ ID NO:4)中所述的氨基酸序列，及轻链可变域序列，该轻链可变域序列包含SEQ ID NO:2)中所述的氨基酸序列。
本发明还提供人源抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含(SEQ ID NO:8)中所述的氨基酸序列及包含(SEQ ID NO:6)中所述的氨基酸序列的轻链可变域序列。
在根据(或应用于)上文实施例中的任何一实施例中，该抗体包含人类IgG的Fc序列。在根据(或应用于)上文实施例中的任何一实施例中，该抗原结合片段选自以下的组：Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双功能抗体及线性抗体。在根据(或应用于)上文实施例中的任一实施例中，该抗体是多特异性抗体。
在根据(或应用于)上文实施例中的任一实施例中，该抗-PD-1抗体或其抗原结合片段结合至治疗剂。在根据(或应用于)上文实施例中的任一实施例中，该抗-PD-1抗体或其抗原结合片段与标记物结合。在根据(或应用于)上文实施例中的任一实施例中，该标记物选自以下的组：放射性同位素、荧光染料及酶。
本发明提供编码根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的经分离核酸分子。本发明还提供编码根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的核酸分子的表达载体。本发明亦提供包含根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的表达载体的细胞。本发明提供产生抗体的方法，其包括培养根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的细胞及从细胞培养物中回收抗体或其抗原结合片段。在根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，该细胞是哺乳动物细胞。在根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，该哺乳动物细胞为CHO细胞。在根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，该细胞为稳定的哺乳动物细胞系。在根据(或应用于)稳定的哺乳动物细胞系中的任何一者的一些实施例中，该稳定的哺乳动物细胞系为CHO细胞系。
本发明提供包含根据(或应用于)上文实施例中的任何一者的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段及医药上可接受的载体的组合物。
本发明提供检测来自病患的样本中的PD-1蛋白的方法，其通过使根据(或如应用至)上文实施例中的任何一者的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段接触该样本及检测结合至PD-1蛋白的抗-PD-1抗体。在根据(或如应用至)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，该抗-PD-1抗体或其抗原结合片段用于免疫组织化学分析(IHC)或ELISA分析中。
本发明还提供治疗个体的癌症的方法，其包括向该个体给予有效量的根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的组合物。本发明亦提供包含根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物，该组合物用于治疗癌症。本发明提供根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。在根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，该癌症选自：黑色素瘤、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma)(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌及非小细胞肺癌(NSCLC))、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌及唾液腺癌。在根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，向该个体进一步给予选自以下组的治疗剂：抗肿瘤药剂、化学治疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。在根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，向该个体进一步给予放射治疗。在根据(或如应用于)上文实施例中的任何一者的一些实施例中，向该个体进一步给予抗VEGF、VEGFR2或EGFR的治疗抗体。
附图说明
图1A至1B：c1G4对PD-1重组蛋白的结合。图1A显示为比较抗-PD-1抗体c1G4及参考抗-PD-1对PD-1-His的结合进行的ELISA的结果。图1B显示为比较抗-PD-1抗体c1G4及参考抗-PD-1对PD-1-AP的结合进行的第二组ELISA的结果。数据指示c1G4及参考抗-PD-1可结合至PD-1-His及PD-1-AP两者。
图2A至2B：c1G4结合至PD-1配体的阻断及竞争。图2A显示为比较抗-PD-1抗体c1G4及参考抗-PD-1阻断PD-L1及PD-1的结合的能力进行的ELISA的结果。c1G4及参考抗-PD-1两者均被发现阻断PD-L1对PD-1的结合。图2B显示为判定抗-PD-1抗体c1G4与参考抗-PD-1竞争结合至PD-1-His的能力进行的ELISA的结果。数据指示c1G4及参考抗-PD-1两者均可阻断PD-L1对PD-1的结合，及c1G4可与抗-PD-1参考物竞争结合至PD-1-His。
图3A至3B：c1G4对表达PD-1的CHO-S细胞的结合。c1G4抗体对CHO-S细胞(图3A)及经PD-1转染的CHO-S细胞(图3B)的结合通过流式细胞测量术测试。参考抗-PD-1及抗-PD-L1抗体分别用作阳性对照及阴性对照。数据显示c1G4结合至经人类PD-1转染的CHO细胞但不结合至未经转染的CHO细胞。
图4：通过所选c1G4抗体阻断配体结合至PD-1。使用流式细胞测量术测试抗-PD-1c1G4阻断配体PD-L1对表达PD-1的CHO-S细胞的结合的能力。参考抗-PD-1及抗-PD-L1抗体分别用作阳性对照及阴性对照。通过测量染色后的平均荧光强度(MFI)，抗-PD-1单克隆抗体c1G4阻断PD-L1结合至经PD-1转染的CHO-S细胞。上述数据证实抗-PD-1c1G4阻断PD-L1配体结合至细胞表面PD-1。
图5A至5B：混合白细胞反应(MLR)中抗-PD-1c1G4对细胞因子产生的影响。在混合白细胞反应分析中，抗人类PD-1的单克隆抗体c1G4促进IFN-γ分泌及IL-2分泌。参考抗-PD-1及阿瓦斯汀(Avastin)(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。图5A阐述显示浓度依赖性IL-2分泌的条形图；图5B阐述显示浓度依赖性IFN-γ分泌的条形图。
图6：混合白细胞反应(MLR)中抗-PD-1c1G4对T细胞增殖的影响。在混合白细胞反应分析中，抗人类PD-1的单克隆抗体c1G4促进CD4+及CD8+T细胞增殖。参考抗-PD-1及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。图6A阐述显示在抗体的各种浓度下CD4+T细胞增殖的条形图；图6B阐述显示在抗体的各种浓度下CD8+T细胞增殖的条形图。
图7：c1G4抗体的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下植入人类结肠癌细胞系HT29及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝2:1)。自第1天起，每周两次将抗-PD-1抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图7A中。第28天的个别肿瘤体积如图7B所示。所有数据点为平均值±SEM。
图8：针对c1G4及h1G4的序列比对。图8A显示c1G4、人源h1G4、人类生殖细胞系轻链可变区IGKV1-39*01及纳武单抗(Nivolumab)(NIV)的轻链的氨基酸序列比对。(分别为SEQID NO 27至30，以出现的顺序)。图8B显示c1G4、人源化h1G4、人类生殖细胞系重链可变区IGHV3-11*04及纳武单抗(NIV)的重链的氨基酸序列比对(分别为SEQ ID NO 31至34，以出现的顺序)。自c1G4移植以用于人源化改造的CDR(互补决定区)用粗体加下划线文本标示。
图9：人源化抗-PD-1抗体对表达PD-1的CHO-S细胞的结合。人源化h1G4及原始c1G4抗体对细胞表面上的PD-1的结合通过流式细胞测量术测试。参考抗-PD-1及抗-PD-L1抗体分别用作阳性对照及阴性对照。
图10：通过人源化h1G4抗体阻断配体结合至PD-1。使用流式细胞测量术分析测试人源化抗-PD-1h1G4阻断配体PD-L1对表达PD-1的CHO-S细胞的结合的能力。参考抗-PD-1及抗-PD-L1抗体分别用作阳性对照及阴性对照。通过对染色的平均荧光强度(MFI)测量，c1G4及h1G4两者阻断PD-L1对经PD-1转染的CHO-S细胞的结合。
图11A至11D阐述h1G4对人类(图11A)、食蟹猴(图11B)、小鼠(图11C)及大鼠(图11D)PD-1蛋白的物种交叉反应性。所有数据点是三次重复试验的平均值±SD。
图12：人源化抗-PD-1抗体对活化人类T细胞的结合。人源化h1G4对人类T细胞的结合是通过流式细胞测量术测试。参考抗-PD-1抗体及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。
图13：混合白细胞反应(MLR)中h1G4对细胞因子产生的影响。在混合白细胞反应分析中，抗人类PD-1的人源化抗体h1G4促进IFN-分泌及IL-2分泌。参考抗-PD-1抗体及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。图13A阐述显示浓度依赖性IL-2分泌的条形图；图14B阐述显示浓度依赖性IFN-γ分泌的条形图。
图14：混合白细胞反应(MLR)中h1G4对T细胞增殖的影响。在混合白细胞反应分析中，抗人类PD-1的人源化抗体h1G4促进CD4+及CD8+T细胞增殖。参考抗-PD-1抗体及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。图14A阐述显示在抗体的各种浓度下CD4+T细胞增殖的条形图；图14B阐述显示在抗体的各种浓度下CD8+T细胞增殖的条形图。
图15：HT29/PBMC异体移植模型中h1G4抗体的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下植入人类结肠癌细胞系HT29及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图15A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图15B中。所有数据点为平均值±SEM。
图16：NCI-H292/PBMC异体移植模型中h1G4抗体的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下植入人类NSCLC细胞系NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图16A中。第25天的个别肿瘤体积呈现于图16B中。所有数据点为平均值±SEM。
图17：hPD1KI小鼠中h1G4抗体的肿瘤生长抑制活性。人类PD-1敲入(knock-in)(hPD1KI)小鼠(n＝4只/组)经皮下注入MC38-huPD-L1(经人类PD-L1转染的MC38)细胞。当肿瘤体积达到约75mm3时开始抗体处理。每周两次将抗-PD-1抗体注入小鼠的腹腔内。所有数据点为平均值±SD。
图18：人源化NSG小鼠的三阴性乳癌(TNBC)细胞异体移植模型中h1G4的效用研究。人类化NSG小鼠(n＝9只/组)经皮下接种MDA-MB-231细胞。当肿瘤体积达到约60至150mm3时开始抗体处理。给药天数由箭头指示。所有数据点为平均值±SEM。
图19：混合白细胞反应(MLR)中人类抗-PD-1抗体对细胞因子产生的影响。在混合白细胞反应分析中，抗人类PD-1的人类单克隆抗体促进IFN-γ分泌及IL-2分泌。参考抗-PD-1抗体及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。图19A阐述显示浓度依赖性IL-2分泌的条形图；图19B阐述显示浓度依赖性IFN-γ分泌的条形图。
图20：HT29/PBMC异体移植模型中人类抗-PD-1抗体的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下注入人类结肠癌细胞系HT29及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次将抗-PD-1抗体注入小鼠的腹腔内。每周两次测量肿瘤体积。所有数据点为平均值±SEM。
图21：HT29/PBMC异体移植模型中抗-PD-1及抗-VEGF单克隆抗体的组合。小鼠(n＝4只/组)经皮下注入人类结肠癌细胞系HT29及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。将抗-PD-1 mAb、抗-VEGF mAb(HLX04)或抗-PD-1 mAb加抗-VEGF mAb注入小鼠的腹腔内。给药天数由箭头指示。每周两次测量肿瘤体积。所有数据点为平均值±SEM。
图22：NSCLC异种移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-VEGF mAb的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下注入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次将抗-PD-1(h1G4)及抗-VEGF(HLX04)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图22A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图22B中。所有数据点为平均值±SEM。
图23：NSCLC异种移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-VEGFR2 mAb的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下注入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次将抗-PD-1(h1G4)及抗-VEGFR2(HLX06)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图23A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图23B中。所有数据点为平均值±SEM。
图24：NSCLC异种移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-EGFR mAb的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝4只/组)经皮下注入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次将抗-PD-1(HLX10)及抗-EGFR(HLX07)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线系显示于图24A中。在第21天下个别肿瘤体积系呈现于图24B中。所有数据点为平均值±SEM。
图25：HT-29(KRASWT,BRAFV600E)异种移植小鼠模型中抗-PD-1 mAb加抗-EGFR mAb的肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝5只/组)经皮下注入人类结肠癌细胞HT-29及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次将抗-PD-1(HLX10)及抗-EGFR(HLX07)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图25A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图25B中。所有数据点为平均值±SEM。
具体实施方式
本发明提供新型抗-PD-1抗体及/或其抗原结合片段。发明人惊人地发现抗-PD-1抗体(例如，本文描述的嵌合c1G4及人源化h1G4抗体及其等亲和力成熟抗体，例如33B、66E及711D)增强由T细胞分泌IL-2和IFNγ及CD4+和CD8+ T细胞的增殖。相较于(纳武单抗)(其为经FDA批准用以治疗癌症的人源化IgG4抗-PD-1单克隆抗体)，本文描述的抗-PD-1抗体亦显示增强的效用及/或抗肿瘤活性。
本发明亦提供免疫结合物、编码本申请描述的新型抗-PD-1抗体的核酸、及组合物(诸如医药组合物)。本发明亦提供使用新型抗-PD-1抗体以检测样本(诸如活体内或活体外样本)中的PD-1的方法，包含所示抗体以用于治疗癌症的组合物，及所述抗体在治疗癌症的药剂的制备中的用途。
定义
如本文使用，「治疗(treatment或treating)」是用于获得有利或所需结果(包括临床结果)的途径。出于本发明的目的，有利或所需临床结果包括(但不限于)以下中的一或更多者：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；使疾病稳定(例如，预防或延迟疾病的恶化)；预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解(部分或完全)；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。「治疗」亦包括癌症的病理结果(诸如，例如，肿瘤体积)的减小。本文提供的方法预期治疗的为上述情况中的任何一或更多者。
术语「复现」、「复发」或「复发性」是指疾病消失的临床评估后，癌症或疾病的重现。远处转移或局部复现的诊断可视为复发。
术语「难治」或「顽固」是指癌症或疾病对治疗无反应。
术语「辅助治疗」是指在基本治疗(primary therapy)(通常，外科手术)后给定的治疗。用于癌症或疾病的辅助治疗可包括免疫治疗、化学治疗、放射治疗或激素治疗。
术语「维持治疗」是指给定以帮助维持先前治疗效果的预定再治疗。维持治疗通常给定以帮助保持癌症缓解，或不管疾病进展，延长癌症对特定治疗的反应。
术语「浸润性癌症」是指已超过其中开始的组织层扩散进入正常周围组织内的癌症。浸润性癌症可或可不为转移性的。
术语「非浸润性癌症」是指极早期癌症或未扩散超过起源组织的癌症。
肿瘤学中术语「无进展存活期」是指在治疗期间及治疗后癌症不生长的时间长度。无进展存活期包括病患已经历完全反应或部分反应的时间量，及病患已经历稳定疾病的时间量。
肿瘤学中术语「进行性疾病」可是指自治疗开始大于20％的肿瘤生长–由于肿瘤的质量增加或肿瘤扩散。
「失调症」是将获益自该抗体治疗的任何病症。例如，忍受或需要抗异常PD-1活性的预防的哺乳动物。包括慢性及急性失调症或疾病，其中包括那些使哺乳动物易患所述失调症的病理状态。本文待治疗的失调症的非限制性实例包括癌症(诸如头颈癌、咽喉癌、结肠直肠癌、肺癌等)。
如本文所述，「肿瘤」是指所有肿瘤细胞生长及增殖，无论恶性或良性，及所有癌前及癌细胞及组织。
术语「抗体」是以最广泛意义使用及具体而言涵盖的(例如)单一单克隆抗体(包括促效剂、拮抗剂及中和抗体)、具有多抗原决定基特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗-抗体及抗体的片段(参见下文)，只要其等特异性结合天然多肽及/或显示本发明的生物活性或免疫活性。根据一项实施例，该抗体结合至靶蛋白的寡聚形式，例如，三聚形式。根据另一实施例，该抗体特异性结合至蛋白质，该结合可通过本发明的单克隆抗体(例如，本发明保藏的抗体等)抑制。抗体的「功能片段或类似物」是具有与其参考的抗体相同的定性生物活性的化合物。例如，本发明的抗体的功能片段或类似物可为可特异性结合至PD-1者。在一项实施例中，该抗体可防止或大体上减小PD-1诱导细胞增殖的能力。
「分离的抗体」是已经鉴别及分离及/或回收自其自然环境的组分的抗体。其自然环境的污染物组分是指将干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，及可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施例中，如借由洛瑞(Lowry)方法测定，该抗体将经纯化(1)至大于95重量％的抗体及最优选地大于99重量％，(2)借助于转杯式定序仪纯化至足够获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)借由SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯(Coomassie)蓝(或优选地，银染色)纯化至均质化。由于抗体的自然环境的至少一种组分将不存在，因此分离的抗体包括于重组细胞内原位的抗体。通常，然而，分离的抗体将由至少一个纯化步骤制成。
基本4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链及两个相同的重(H)链组成的异四聚醣蛋白(IgM抗体由5个基本异四聚体单元及称为J链的额外多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个基本4链单元及J链的多价聚集体)。在IgG的情况下，该4链单元通常约150,000道尔顿。各L链通过一个共价二硫键连接至H链，而所述两个H链视H链同型物而定通过一或更多个二硫键彼此连接。各H及L链也都具有规律间隔的链内二硫桥。各H链于N端具有可变域(VH)，接着各α及γ链的三个恒定域(CH)及μ及ε同型物的四个CH域。各L链于N端具有可变域(VL)，接着在其另一端具有恒定域(CL)。该VL与VH对齐及该CL与重链的第一恒定域(CH1)对齐。特定氨基酸残基被认为在轻链与重链可变域的间形成界面。VH及VL配对在一起形成单一抗原结合位点。就不同类别抗体的结构及性质而言，参见，例如，Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr及Tristram G.Parslow(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994，第71页及第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定域的氨基酸序列可归属于两种明显不同的类型(称为κ及λ)中的任何一种。视免疫球蛋白的重链的恒定域(CH)的氨基酸序列而定，它们可归属于不同的类别或同型物。存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，它们分别具有名为α、δ、γ、ε及μ的重链。γ及α类别基于CH序列及功能中相对较小的差异可进一步分为子类，例如，人类表现下列子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
术语「可变」是指在抗体间，可变域的某些区段的序列显著不同的事实。V域介导抗原结合及界定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性跨可变域的110个氨基酸范围非均匀分布。相反地，此类V区由相对不变的延伸组成，此类延伸称为具有15至30个氨基酸的框架区(FR)，它们由具有极端可变性的较短区(称为「高度可变区」)分隔，所述高度可变区为各9至12个氨基酸长度。具有天然重链及轻链的可变域各包含四个FR，其主要采取β折叠构型且由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由FR紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接涉及抗体对抗原的结合，但显示各种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的参与。
如本文使用，术语「CDR」或「互补决定区」意图表达的是于重链及轻链多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。此类特定区已由Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequences ofproteins of immunological interest」(1991)；由Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中定义包括在彼此进行比较时，氨基酸残基的重叠或子集。然而，涉及抗体或经移植抗体或其变体的CDR的定义的应用意图限定在如本文定义及使用的术语的范围内。包含上文引用的各参考文献中定义的CDR的氨基酸残基作为比较列于下表2中。
表2
如本文使用的术语「单克隆抗体」是指获得自大体上均质的抗体的群体的抗体，即组成该群体的抗体除了个别抗体可少量存在的可能天然生成的突变外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，是指针对单一抗原位点。此外，相对于包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。除单克隆抗体的特异性外，单克隆抗体的有利的处在于其可经合成而不被其他抗体污染。修饰语「单克隆」不应视为需通过特定方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可由最先由Kohler等人，Nature.256:495(1975)描述的杂交瘤方法制成或可使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制得(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。「单克隆抗体」亦可使用Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)及例如下文实例中描述的技术自噬菌体抗体库分离。
本文的单克隆抗体包括「嵌合」抗体(其中重链及/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而该(等)链的剩余部分与衍生自其他物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源)及此类抗体的片段，只要它们都显示本发明的生物活性(参见美国专利案第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文受关注的嵌合抗体包括「灵长类化」抗体，其包含衍生自非人类灵长类动物(例如，旧世界猴、猿类等)的可变域抗原结合序列及人类恒定区序列。
「完整」抗体是包含抗原结合位点及CL及至少重链恒定域(CH1、CH2及CH3)的抗体。该等恒定域可为天然序列恒定域(例如，人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，该完整抗体具有一或更多种效应子功能。
「抗体片段」包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；双功能抗体；线性抗体(参见美国专利案第5,641,870号，实例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。表述「线性抗体」通常是指Zapata等人，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简而言之，此类抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为「Fab」片段)及残余的「Fc」片段(反映容易结晶的能力的名称)。该Fab片段由整个L链及H链的可变区域(VH)及一个重链的第一恒定域(CH1)组成。各Fab片段关于抗原结合为单价的，即其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个经二硫键连接的Fab片段且仍可交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同在于在CH1域的羧基端具有额外的极少残基，包括来自抗体铰链区的一或更多个半胱氨酸。Fab'-SH系本文针对其中恒定域的该(类)半胱氨酸残基具有游离的硫醇基的Fab'指定的名称。F(ab’)2抗体片段最初产生为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对。已知抗体片段的其他化学偶合物。
Fc片段包含由二硫键结合在一起的两个H链的羧基端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定，该区也有由某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
「变体Fc区」包含借助于如本文定义的至少一种「氨基酸修饰」不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，相较于天然序列Fc区或相较于亲代多肽的Fc区，该变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区中自约一个至约十个氨基酸取代，及优选地自约一个至约五个氨基酸取代。在一项实施例中，本文的变体Fc区将具有与天然序列Fc区的至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性。根据另一实施例，本文的变体Fc区将具有与亲代多肽的Fc区的至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性。
术语「包含Fc区的多肽」系指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫黏附素(参见本文于别处的定义)。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可(例如)在多肽的纯化期间或通过重组改造编码该多肽的核酸来移除。因此，包含具有根据本发明的Fc区的多肽(包括抗体)的组合物可包含所有K447残基已移除的多肽群体、K447残基未移除的多肽群体、或具有K447残基的多肽及无K447残基的多肽的混合物的多肽群体。
抗体「效应子功能」是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)及随抗体同型物变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调；及B细胞活化。「天然序列Fc区」包含与自然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。Fc序列的实例被描述(例如，但不限于)于Kabat等人，Sequences ofImmunological Interest.，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))中。
「Fv」是含有完全抗原识别及结合位点的最小抗体片段。此片段由具有一个重链及一个轻链可变区域以紧密非共价结合的二聚体组成。自所述两个域的折叠产生有助于氨基酸残基的抗原结合并对抗体赋予抗原结合特异性的六个高度可变环(H及L链各产生3个环)。
然而，甚至单一可变域(或半个Fv，其仅包含三个对抗原具特异性的CDR)具有识别并结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。
也缩写成「sFv」或「scFv」的「单链Fv」是包含连接成单一多肽链的VH及VL抗体域的抗体片段。优选地，该sFv多肽进一步在VH与VL域之间包含多肽接头，其能够使sFv形成用于抗原结合的所需结构。为回顾sFv，参见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg及Moore编，Springer-Verlag,New York，第269至315页(1994)；Borrebaeck 1995，同下。
术语「双功能抗体」是指通过以下方式所制成的小抗体片段：用短接头(约5至10个残基)在VH与VL域之间构筑sFv片段(参见前段)使得达成V域的链间而非链内配对，从而产生二价片段(即具有两个抗原结合位点的片段)。双特异性双功能抗体是具有两个「交叉」sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH及VL域存在于不同多肽链上。双功能抗体系更充分描述(例如)于EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
非人类(例如，啮齿类动物)抗体的「人源化」形式为含有衍生自非人类抗体的最小序列的嵌合抗体。就大部分而言，人源化抗体是其中来自受体的高度可变区的残基被来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的具有所需抗体特异性、亲和力及能力的高度可变区的残基置换的人类免疫球蛋白(受体抗体)。在一些实例中，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基是由相应的非人类残基置换。
此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。作出此类修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含大体上所有至少一个及通常两个可变域，其中所有或大体上所有此类高度可变环对应于非人类免疫球蛋白的相同部分及所有或大体上所有该类FR为人类免疫球蛋白系列的相同部分。人源化抗体视需要也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常包含人类免疫球蛋白的至少一部分。为进一步详细说明，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
关于本文定义的多肽及抗体序列的「百分率(％)氨基酸序列一致性」或「同源性」系定义为在比对序列并引入间隔(若有必要)后得到最大百分率序列一致性，及未考虑任何保守取代为序列一致性的一部分时，候选序列中氨基酸残基与参考多肽中的氨基酸残基相同的百分率。出于测定百分率氨基酸序列一致性的目的的比对可以本领域技术人员已知的各种方式取得，例如，使用公开可用的计算机软件(诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件)。本领域技术人员可决定用于比对序列的适当参数，其中包括在比较中的序列的全长上得到最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，然而，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列一致性值。该ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，且源代码已与用户文件一起于U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559提出申请，其中其以U.S.Copyright Registration No.TXU510087注册。该ALIGN-2程序公开获得自Genentech,Inc.,South San Francisco,California。该ALIGN-2程序应经编译以于UNIX操作系统(较佳数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且请勿变更。
术语「Fc受体」或「FcR」用以描述结合至抗体的Fc区的受体。在一项实施例中，本发明的FcR为结合IgG抗体(γ受体)的受体且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子类，其中包括此等受体的等位基因变体及或者拼接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(「活化受体」)及FcγRIIB(「抑制受体」)，它们具有类似氨基酸序列，主要在其细胞质域不同。活化受体FcγRIIA于其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB于其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见回顾M.in Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。该术语包括同种异型，诸如FcγRIIIA同种异型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及/或FcγRIIA-H131。FcR于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中回顾。其他FcR(包括那些在未来待识别者)由本文的术语「FcR」包含。该术语亦包括新生儿受体(FcRn)，其负责将母系IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。
术语「FcRn」是指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn由结构上类似于主要组织兼容性复合体(MHC)及由非共价结合至β2-微球蛋白的α链组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能回顾于Ghetie及Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766中。FcRn在将免疫球蛋白IgG自母亲被动递送至幼崽及血清IgG浓度的调节中发挥作用。FcRn可充当救援受体，在细胞内及跨细胞以完整形式结合及输送胞饮化IgG，及自默认降解途径对其援救等。
人类IgG Fc区的「CH1域」(亦称为「H1」域的「C1」)通常自约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
「铰链区」通常定义为自人类IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其他IgG同型物的铰链区可通过将形成重链间S-S键的第一及最后半胱氨酸残基放置于相同位置中与IgG1序列对齐。
Fc区的「较低铰链区」通常定义为残基立即自C端至铰链区的延伸，即Fc区的残基233至239。在先前的报告中，FcR结合通常归因于IgG Fc区的较低铰链区中的氨基酸残基。
人类IgG Fc区的「CH2域」(亦称为「H2」域的「C2」)通常自约氨基酸231延伸至约氨基酸340。该CH2域的独特之处在于其不与另一域紧密配对。而是，两个N连接的分支糖链间插于完整天然IgG分子的两个CH2域之间。已推断糖可取代域-域配对及帮助稳定CH2域(Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。)
「CH3域」(亦称为「C2」或「H3」域)包含Fc区中残基C端至CH2域的延伸(即，自约氨基酸残基341至自抗体序列的C端(通常于IgG的氨基酸残基446或447处))。
「功能Fc区」具有天然序列Fc区的「效应子功能」。示例性「效应子功能」包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。例如，该类效应子功能通常要求Fc区与结合域(例如，抗体可变域)组合及可使用如本文所示的各种分析评估。
「C1q」为包括用于免疫球蛋白的Fc区的结合位点的多肽。C1q与两个丝氨酸蛋白酶(C1r及C1s)一起形成复合体C1，是补体依赖性细胞毒性(CDC)途径的第一组分。人类C1q可购买自(例如)Quidel,San Diego,CA。
术语「结合域」是指多肽的结合至另一分子的区。在FcR的情况下，该结合域可包含其多肽链(例如，其α链)的一部分，其负责结合Fc区。一个有用的结合域是FcRα链的细胞外域。
含具有「经改变的」FcR结合亲和力或ADCC活性的变体IgG Fc的抗体是相较于亲代多肽或包含天然序列Fc区的多肽具有增强或减弱的FcR结合活性(例如，FcγR或FcRn)及/或ADCC活性的抗体。对FcR「显示增强的结合」的变体Fc以比亲代多肽或天然序列IgG Fc更高的亲和力(例如，较低的视Kd或IC50值)结合至少一个FcR。根据一些实施例，相较于亲代多肽的结合改善约3倍，较佳约5、10、25、50、60、100、150、200、高达500倍或约25％至1000％的结合改善。对FcR「显示减小的结合」的多肽变体以比亲代多肽更低的亲和力(例如，较高的视Kd或较高的IC50值)结合至少一个FcR。相较于亲代多肽的结合减小可为约40％或更大的结合减小。
「抗体依赖性细胞介导的细胞毒性」或「ADCC」是指一种细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀手(NK)细胞、嗜中性白细胞及巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)的经分泌的Ig能够使此类细胞毒性效应子细胞特异性结合至携抗原的靶细胞并接着用细胞毒素杀灭靶细胞。抗体「武装」细胞毒性细胞并且是这种杀灭所绝对需要的。用于介导ADCC的原发性细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血干细胞上的FcR表达总结于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为评估受关注的分子的ADCC活性，可进行活体外ADCC分析，诸如描述于美国专利案第5,500,362或5,821,337号或下文实例中的分析。适用于此等分析的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀手(NK)细胞。或者或另外，受关注的分子的ADCC活性可例如在诸如Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)中揭示的动物模型中进行活体内评估。
当分析中具有变体(variant)Fc区的多肽及具有野生型Fc区的多肽(或亲代多肽)的数量基本上相同时，在人类效应子细胞的存在下比具有野生型IgG Fc的多肽或亲代多肽更有效地「显示增加的ADCC」或介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的包含变体Fc区的多肽系活体外或活体内大体上更有效介导ADCC的多肽。通常，此类变体将使用此项技术中已知的任何活体外ADCC分析(诸如用于(例如)在动物模型中测定ADCC活性的分析或方法等)进行识别。在一项实施例中，优选的变体比野生型Fc(或亲代多肽)在介导ADCC时更有效约5倍至于100倍，例如，自约25至约50倍。
「补体依赖性细胞毒性」或「CDC」是指靶细胞在补体的存在下溶解。经典补体途径的活化是由补体系统(C1q)的第一组分结合至与其同源抗原结合的(适当子类的)抗体开始。为评估补体活化，可进行CDC分析，例如，如描述于Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中的分析。具有经改变的Fc区氨基酸序列及增加或减小的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利案第6,194,551B1号及WO99/51642中。这些专利公开案的内容以引用的方式特定地并入本文内。亦参见Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
如本文揭示的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的「有效量」是足以进行明确规定的目的的量。「有效量」可经验地并由关于规定目的的已知方法进行测定。术语「治疗有效量」是指如本文揭示的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物有效「治疗」哺乳动物(亦称病患)的疾病或失调症的量。在癌症的情况下，如本文揭示的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸或重量；抑制(即，减缓至一定程度及较佳停止)癌细胞浸润至外周器官内；抑制(即，减缓至一定程度及较佳停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；及/或在一定程度上减轻与癌症相关联的症状中的一或更多者。在某种程度上，如本文揭示的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物可预防生长及/或杀灭现存的癌细胞，其可为细胞抑制及/或细胞毒性的。在一项实施例中，该治疗有效量为生长抑制量。在另一实施例中，该治疗有效量为延长病患存活期的量。在另一实施例中，该治疗有效量为改善病患的无进展存活期的量。
本发明的如本文揭示的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的「生长抑制量」是可活体外或活体内抑制细胞(尤其肿瘤，例如，癌细胞)生长的量。用于抑制肿瘤细胞生长的目的的本发明的多肽、抗体、拮抗剂或组合物的「生长抑制量」可经验地及由本文提供的已知方法或实例进行测定。
本发明的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的「细胞毒性量」是可活体外或活体内引起细胞(尤其肿瘤，例如，癌细胞)的破坏的量。用于抑制肿瘤细胞生长的目的的本发明的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的「细胞毒性量」可经验地及由此项技术中已知的方法进行测定。
本发明的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的「生长抑制量」是可活体外或活体内抑制细胞(尤其肿瘤，例如，癌细胞)的生长的量。用于抑制肿瘤细胞生长的目的的本发明的抗-PD-1抗体(或其片段)或组合物的「生长抑制量」可经验地及由本文提供的已知方法或实例进行测定。
如本文使用，「医药上可接受」或「医药上可相容」是指所述材料并非在生物学上或其他方面不适宜，例如，该材料可并入向病患投与的医药组合物内而不引起任何显著的不适宜生物效应或不以有毒的形式与含该材料的组合物的其他组分中的任何一者相互作用。医药上可接受的载体载体或赋形剂已较佳地满足毒理学及制造测试的所需标准及/或包括于由美国食品及药品监督管理局(U.S.Food and Drug administration)制订的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)上。
术语「检测」意欲包括判定物质的存在或缺乏或定量物质(诸如PD-1)的量。因此该术语是指本发明的材料、组合物及方法用于定性及定量测定的用途。通常，用于检测的特定技术就本发明的实务而言是非决定性的。
例如，根据本发明的「检测」可包括：观察PD-1基因产品、mRNA分子或PD-1多肽的存在或缺乏；PD-1多肽的浓度变化或结合至标靶的量的变化；PD-1多肽的生物功能/活性的变化。在一些实施例中，「检测」可包括检测野生型PD-1浓度(例如，mRNA或多肽浓度)。检测可包括定量当相较于对照时，在10％与90％之间的任何值或在30％与60％之间的任何值或大于100％的变化(增加或减小)。检测可包括定量在2倍至10倍(包括性)或更大(例如)100倍之间的任何值的变化。
字词「标记物」当本文使用时是指直接或间接结合至抗体的可检测化合物或组合物。该标记物自身可由自身检测(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或在酶促标记物的情况下，可催化可检测的基质化合物或组合物的化学改变。
本文提及「约」某一值或参数是指个别值的为本领域技术人员容易知道的的常见误差范围。本文提及「约」某一值或参数包括(及描述)针对该值或参数本身的情况。例如，涉及「约X」的描述包括「X」的描述。
应了解本文描述的本发明的形态及实施例包括「包含」形态及实施例、「由形态及实施例组成」及「基本上由形态及实施例组成」。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请案及公开案)以全文引用的方式并入本文中。
抗-PD-1抗体
本发明是基于对结合PD-1受体(PD-1)的新颖抗体的识别。该抗-PD-1抗体可用于各种治疗及诊断方法中。例如，该抗-PD-1抗体可单独使用或与其他药剂组合以治疗特征为异常PD-1表现或异常PD-1活性的疾病(包括，例如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳癌(例如，三阴性乳癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)。本文提供的抗体也可用于检测病患或病患样本中的PD-1蛋白，方式为通过向病患投与抗-PD-1抗体及检测结合至病患(例如，活体内或活体外)的样本中的PD-1蛋白的抗-PD-1抗体或通过使该抗-PD-1抗体与来自病患的样本接触及定性或定量地检测结合至该PD-1蛋白的抗-PD-1抗体。
程序化细胞死亡蛋白1(亦称为PD-1及CD279(分化279的团簇))是在人类中由PDCD1基因编码的蛋白质。PD-1是属于免疫球蛋白超家族且表达于T细胞及增殖B细胞上的细胞表面受体。PD-1结合两种配体(PD-L1及PD-L2)。作为免疫检查点发挥作用的PD-1通过防止T细胞的活化而在下调免疫系统中发挥重要作用，其进一步降低自体免疫及促进自体耐受。PD-1的抑制效应通过促进淋巴结中的抗原特异性T细胞的细胞凋亡(程序化细胞死亡)而同时减少调节T细胞(抑制T细胞)的细胞凋亡的双重机制完成。
抗-PD-1抗体以足够的亲和力及特异性结合至PD-1的抗体。优先地，本文提供的抗-PD-1抗体(或其抗原结合片段)可用作治疗剂以靶向及干扰其中涉及PD-1活性的疾病或病症。抗-PD-1抗体通常将不结合至其他免疫球蛋白超家族。优选地，该抗-PD-1抗体是重组人类化抗-PD-1单克隆抗体。
根据一项实施例，抗-PD-1抗体包含CDR、本文揭示的抗体中的任何一者的可变重链区及/或可变轻链区。
在某些实施例中，本发明的抗-PD-1抗体嵌合抗-PD-1抗体c1G4及/或人源化抗-PD-1h1G4，其包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASQDVTTAVA(SEQ ID NO:9)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDF(SEQID NO:14)的CDR-H3。在一些实施例中，变体在SEQ ID No.9至14的一或更多者中包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个氨基酸取代。
具有c1G4及h1G4的轻链及重链的全长氨基酸及核苷酸序列及所述CDR序列提供于下文序列表中。
本发明还提供抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变域序列，该重链可变域序列包含(SEQ ID NO:4)中所述的氨基酸序列，及轻链可变域序列，该轻链可变域序列包含SEQ ID NO:2)中所述的氨基酸序列。
本发明还提供人源化抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含(SEQ ID NO:8)中所述的氨基酸序列及包含SEQ ID NO:6)中所述的氨基酸序列的轻链可变域序列。
本发明进一步提供针对人源化h1G4抗-PD-1抗体的亲和力成熟抗体。在某些实施例中，本发明的成熟抗-PD-1抗体(例如，抗-PD-1抗体，33B)包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASTDVTTAVA(SEQ ID NO:15)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASLRHT(SEQ ID NO:16)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYGIPWT(SEQ IDNO:17)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FRFSNYGMS(SEQ ID NO:18)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNAY(SEQ ID NO:19)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列TSYYYGIDF(SEQ ID NO:20)的CDR-H3。
在其他实施例中，本发明的成熟抗-PD-1抗体(例如，抗-PD-1抗体，66E)包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KAKQDVTTAVA(SEQ IDNO:21)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYWIPWT(SEQ ID NO:22)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDL(SEQ ID NO:23)的CDR-H3。
在某些实施例中，本发明的成熟抗-PD-1抗体(例如，抗-PD-1抗体，711D)包含轻链(LC)可变域序列，该轻链(LC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASQDVTNAVA(SEQ IDNO:24)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3，及重链(HC)可变域序列，该重链(HC)可变域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列SSYYYGIDL(SEQ ID NO:25)的CDR-H3。
重链及轻链可变域及CDR以所有可能的成对组合进行组合以产生大量抗-PD-1抗体。
在某些实施例中，氨基酸取代为保守氨基酸取代。在某些实施例中，这些氨基酸取代不实质性减小抗体结合抗原的能力。例如，可作出不实质性减小PD-1结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。抗-PD-1抗体变体的结合亲和力可使用下文实例中描述的方法进行评估。
保守取代是以「保守取代」的标题显示于表3中。更实质性的变化以「示例性取代」的标题提供于表3中，并且关于氨基酸侧链类别如下文进一步描述。可将氨基酸取代引入受关注的抗体内及针对所需活性(例如，经保留/改善的PD-1结合、经减小的免疫原性或经改善的ADCC或CDC)筛选产品。
表3：保守取代
原始残基 示例性取代 较佳取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
非保守取代将涉及上述类别中的一者的成员与另一类别的成员交换。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可(例如)使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如那些本文描述的)便利地产生。简而言之，一或更多个CDR残基经突变及变体抗体展示于噬菌体上及针对特定生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。可在HVR中作出改变(例如，取代)以(例如)改善抗体亲和力。可于HVR「热点」(即，由在体细胞成熟过程(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))期间由经历高频率突变的密码子编码的残基)及/或SDR(a-CDR)中作出这些改变，并测试所得变体VH或Vl的结合亲和力。通过自第二库构筑及再选择的亲和力成熟已描述于(例如)Hoogenboom等人的Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,(2001)中。
在亲和力成熟的一些实施例中，通过各种方法中的任何一者(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的突变)将多样性并入针对成熟选择的可变基因内。然后产生第二库。然后筛选该库以识别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR定向方法，其中数个HVR残基(例如，每次4至6个残基)经随机化。涉及抗原结合的HVR残基可(例如)使用丙氨酸扫描突变或建模明确识别。特定的，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些实施例中，抗-PD-1抗体包含轻链可变域(VL)序列，该轻链可变域(VL)序列包含(1)包含选自由SEQ ID No:9、21及24组成的组的氨基酸序列的CDR-L1；(2)包含SEQ IDNo:10或16的氨基酸序列的CDR-L2；(3)包含选自由SEQ ID No:11、17、22组成的组的氨基酸序列的CDR-L3，及重链可变域序列(VH)，该重链可变域序列(VH)包含(1)包含SEQ ID No:12或18的氨基酸序列的CDR-H1；(2)包含SEQ ID No:13或19的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含选自由SEQ ID No:14、20、23及25组成的组的氨基酸序列的CDR-H3。
重链及轻链可变域及CDR以所有可能的成对组合进行组合以产生大量抗-PD-1抗体。
在某些实施例中，抗-PD-1抗体可在重链或轻链可变区中缺乏N-糖基化基序，这可在一批抗体中引起差异，从而导致被改变的功能、免疫原性或稳定性。分析抗体糖基化的方法包括(但不限于)例如，层析术(诸如阳离子交换层析术(CEX)或液相层析术)、质谱法(诸如电喷雾电离质谱法)及毛细管电泳-十二基硫酸钠。此等方法系描述(例如)于Jung等人，(2011)Curr Op Biotechnol.22(6):858-67；Cummings RD,Etzler ME.Antibodies andLectins in Glycan Analysis.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编，Essentials ofGlycobiology.，第2版，Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor LaboratoryPress；2009.，第45章；Mulloy B,Hart GW,Stanley P.Structural Analysis ofGlycans.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编，Essentials of Glycobiology.，第2版，Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009.，第47章；Leymarie等人，(2012)Anal Chem.84(7):3040-3048；Fernandez(2005)EuropeanBiopharmaceutical Review.，第106至110页；及Raju,T.(2013)Methods Mol Biol.988:169-180中。
在某些实施例中，抗-PD-1抗体对PD-1具有比其对该PD-1的同源物更强的结合亲和力。通常，该抗-PD-1抗体「特异性结合」至PD-1(即，具有不大于约1x 10-7M，较佳地不大于约1x 10-8及最佳地不大于约1x10-9M的结合亲和力(Kd)值)但对PD-1家族的成员具有比其对PD-1的结合亲和力弱至少约50倍或至少约500倍或至少约1000倍的结合亲和力。特异性结合至PD-1的抗-PD-1抗体可为如上文定义的抗体的各种类型中的任何一者，但较佳地为人源化或人类抗体。
在一些实施例中，如通过此项技术中已知的方法(诸如ELISA、荧光活化的细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA))测定，抗-PD-1抗体结合至非靶蛋白的程度小于约该抗体对PD-1的结合的10％。特异性结合可(例如)通过相较于对照分子(通常为具有类似结构但不具有结合活性的分子)的结合，测定分子的结合而进行测量。例如，特异性结合可通过与类似于标靶(例如，过量的未经标记的标靶)的对照分子竞争而进行测定。在此情况下，若未经标记的标靶对探针的结合是由过量未经标记的标靶竞争抑制，则指示特异性结合。术语「特异性结合」或「特异性结合至」如本文使用的特定多肽标靶上的特定多肽或抗原决定基或「对(如本文使用的特定多肽标靶上的特定多肽或抗原决定基)具特异性」可(例如)通过分子对该标靶具有至少约10-4M，或者至少约10-5M，或者至少约10-6M，或者至少约10-7M，或者至少约10-8M，或者至少约10-9M，或者至少约10-10M，或者至少约10-11M，或者至少约10-12M或更大的Kd来显示。在一项实施例中，术语「特异性结合」指其中分子结合至特定多肽或特定多肽上的抗原决定基而不实质性结合至任何其他多肽或多肽抗原决定基的结合。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是治疗抗体针对肿瘤细胞的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，通过这些免疫系统的效应子细胞主动溶解靶细胞(例如，癌细胞)，其等膜表面抗原已由特异性抗体(例如，诸如本文描述的抗-PD-1抗体)结合。在一些实施例中，如由(例如)实例中描述的分析证实，该抗-PD-1抗体显示与或纳武单抗类似的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应子功能。
例如，在某些实施例中，本文描述的抗-PD-1抗体的ADCC效应子功能活性是(纳武单抗)的ADCC效应子功能活性的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％或大于100％(例如，约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％或约130％)，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，该抗-PD-1抗体显示与类似的针对PD-1的结合亲和力。在某些实施例中，如实例中描述，对PD-1的结合由ELISA证实。例如，抗-PD-1对PD-1的结合亲和力比(纳武单抗)对PD-1的结合亲和力高约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或大于100％(例如，约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％或大于约125％)。
在某些实施例中，该抗-PD-1抗体以在约0.1pM至200pM(0.2nM)之间的Kd结合人类PD-1，例如，约0.1pM、约0.25pM、约0.5pM、约0.75pM、约1pM、约5pM、约10p M、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约80pM、约90pM、约100pM、约110pM、约120pM、约130pM、约140pM、约150pM、约160pM、约170pM、约180pM、约190pM或大于约190pM，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体对PD-1的结合亲和力比(纳武单抗)对PD-1的结合亲和力高约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或大于约100％(例如，约105％、约110％、约120％或约130％)。在某些实施例中，该抗-PD-1对PD-1的结合亲和力比(纳武单抗)对PD-1的结合亲和力高约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3倍、约3.25倍、约3.5倍、约3.75倍、约4倍、约4.25倍、约4.5倍、约4.75倍或大于约4.75倍，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体具有相较于经延长的活体内半衰期。在某些实施例中，本文描述的抗-PD-1抗体的活体内半衰期系不短于的活体内半衰期。
在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体显示类似于(纳武单抗)或其生物类似物的药物动力学性质。在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体显示(纳武单抗)或其生物类似物的血清浓度-时间曲线的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或大于95％(诸如约96％、约97％、约98％、约99％，或大于约99％)的AUC(曲线下面积)，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，该抗体包含人类IgG(例如，人类IgG1或人类IgG4)的Fc序列。在某些实施例中，该Fc序列已经改变或以其他方式变化使其缺乏抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应子功能，通常为关于其等对Fc受体(FcR)的结合。已知可改变效应子功能的Fc序列变化或突变的许多实例。例如，WO 00/42072及Shields等人，J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述具有改善或减弱的FcR结合的抗体变体。将这些公开案的内容以引用的方式明确地并入本文内。该抗体可呈Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段；双功能抗体及线性抗体的形式。同样地，该抗体可为结合至PD-1，但也结合一或更多个其他标靶及抑制其功能的多特异性抗体。该抗体可结合至治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射性同位素及化学治疗剂)或标记物以通过成像(例如，放射性同位素、荧光染料及酶)检测病患样本中或活体内的PD-1。其他修饰包括毒素对本文提供的抗-PD-1抗体的结合。
本发明还公开了编码抗-PD-1抗体的核酸分子、包含编码本文描述的CDR及/或重链可变域及/或轻链可变域的核酸分子的表达载体及包含该等核酸分子的细胞。此等抗体可用于本文描述的治疗中及用以检测病患样本(例如，经由FACS、免疫组织化学法(IHC)、ELISA分析)或病患中的PD-1蛋白。
单克隆抗体
单克隆抗体可(例如)使用杂交瘤方法(诸如那些由Kohler及Milstein,Nature,256:495(1975)描述者)制成或可由重组DNA方法(美国专利案第4,816,567号)制得或可由在下文实例中本文描述的方法产生。在杂交瘤方法中，仓鼠、小鼠或其他适当的宿主动物通常用免疫剂免疫以引起产生或可产生将特异性结合至该免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，所述淋巴细胞可经活体外免疫。
免疫剂将通常包括多肽或受关注的蛋白质的融合蛋白或包含该蛋白质的组合物。通常，若需要人类起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(「PBL」)，或若需要非人类哺乳动物来源，则使用脾脏细胞或淋巴结细胞。这些淋巴细胞系然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLESAND PRACTICE,New York:Academic Press,1986，第59至103页)。永生化细胞系通常是经转形的哺乳动物细胞，特定言的啮齿类动物、牛及人类起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。该等杂交瘤细胞可在优选含有一或更多种抑制未经融合的永生化细胞的生长或存活的物质的合适培养基中培养。例如，若亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨喋呤及胸苷(「HAT培养基」)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
较佳的永生化细胞系是那些有效融合，通过产生经选择的抗体的细胞支持抗体的稳定高浓度表达及对培养基(诸如HAT培养基)敏感者。更佳的永生化细胞系是鼠科骨髓瘤系，它们可(例如)获得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California and the American Type Culture Collection,Manassas,Virginia。人类骨髓瘤及小鼠-人类杂骨髓瘤细胞系也已针对人类单克隆抗体的产生进行描述(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTIONTECHNIQUES AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,Inc.:New York,1987，第51至63页)。
可然后分析其中培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对多肽的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可由免疫沉淀法或由活体外结合分析(诸如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))判定。此项技术中已知这些技术及分析。单克隆抗体的结合亲和力可(例如)由Munson及Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析测定。
在识别所需杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释方法子选殖及通过标准方法生长(Goding，同上)。适用于此目的的培养基包括(例如)杜贝卡式改良伊格培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium)及RPMI-1640培养基。或者，所述杂交瘤细胞可作为腹水生长于活体哺乳动物中。
由亚克隆分泌的单克隆抗体可由诸如(例如)蛋白A-琼脂糖、氢氧磷灰石层析术、凝胶电泳、透析或亲和力层析术的常用免疫球蛋白纯化程序自培养基或腹水液分离或纯化。
单克隆抗体也可由重组DNA方法制得，诸如那些描述于美国专利案第4,816,567号中者。编码本文提供的单克隆抗体的DNA可使用常用程序(例如，通过使用可特异性结合至编码鼠科抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离及定序。本文提供的杂交瘤细胞充当此DNA的较佳来源。一经分离，可将该DNA放置于表达载体内，然后将该等表达载体转染至不以其他方式产生免疫球蛋白的宿主细胞(诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。该DNA亦可(例如)通过用于人类重链及轻链恒定域的编码序列取代同源性鼠科序列(美国专利案第4,816,567号；Morrison等人，同上)或通过使非免疫球蛋白多肽的编码序列中的所有或部分共价连接至免疫球蛋白编码序列加以修饰。此非免疫球蛋白多肽可替代本文提供的抗体的恒定域，或可替代本文提供的抗体的一个抗原结合位点的可变域以产生嵌合二价抗体。
在某些实施例中，由本发明提供的抗-PD-1抗体由稳定的哺乳动物细胞系表达。在某些实施例中，由本发明提供的抗-PD-1抗体以约2.0克/升、约2.5克/升、约3.0公/升、约3.5克/升、约4.0克/升、约4.5克/升、约5.0克/升、约5.5克/升、约6克/升、约6.5克/升、约7.0克/升或大于约7.0克/升，包括在这些值之间的任何范围的滴定量自稳定的哺乳动物细胞系表达。在某些实施例中，其中表达由本发明提供的抗-PD-1抗体的稳定的哺乳动物细胞系为CHO细胞系。
在某些实施例中，所述抗体为单价抗体。此项技术中已知用于制备单价抗体的方法。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链及经修饰的重链的重组表达。该重链通常于Fc区中的任何一处经截断，以便于防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基经另一氨基酸残基取代或经删除以便于防止交联。
活体外方法也适用于制备单价抗体。可使用(但不限于)此项技术中已知的技术完成抗体消化，以产生其片段(特定言之，Fab片段)。
人类及人源化抗体
该等抗体可为人源化抗体或人类抗体。非人类(例如，鼠科)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如抗体的Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或其他抗原结合子序列)，它们通常含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基经来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的具有所需特异性、亲和力及能力的CDR的残基置换。在一些实例中，人类免疫球蛋白的Fv框架残基经相应的非人类残基置换。人源化抗体也可包含于受体抗体及输入性CDR或框架序列均未见的残基。通常，人源化抗体可包含大体上所有至少一个及通常两个可变域，其中该类CDR区中的所有或大体上所有对应于那些非人类免疫球蛋白的CDR区，及FR区中的所有或大体上所有是那些人类免疫球蛋白共有序列中的FR区。人源化抗体优选将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的一部分。Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
通常，人源化抗体具有来自非人类的来源的一或更多个氨基酸残基引入于其中。这些非人类氨基酸残基通常称为「输入性」残基，它们通常取自「输入性」可变域。根据一项实施例，人源化可基本上遵循Winter及同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过以啮齿类动物CDR或CDR序列替代人类抗体的相应序列进行。因此，这种「人源化」抗体中，是很小部分的完整人类可变域已被来自非人类物种的相应序列替代的抗体(美国专利案第4,816,567号)。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基及可能一些FR残基由来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基替代的人类抗体。
作为人源化的另一种选择，可产生人类抗体。例如，如今可产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人类抗体的完整库。例如，已报道嵌合及生殖系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子删除导致内源性抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球蛋白基因数组转移至这种生殖系突变小鼠内将导致一经抗原激发即产生人类抗体。参见，例如，Jakobovits等人，PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.,7:33(1993)；美国专利案第5,545,806、5,569,825、5,591,669、5,545,807号及WO 97/17852。
或者，人类抗体可通过将人类免疫球蛋白基因座引入其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物(例如，小鼠)内制得。一经激发，就会观察到人类抗体产生，这在所有方面(包括基因重排、重组及抗体库)与人类中所见都极为相似。此方法(例如)公开于美国专利案第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425与5,661,016号及Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)中。
或者，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348:552-553,1990)以来自未免疫化供体的免疫球蛋白可变(V)域基因库活体外产生人类抗体及抗体片段。根据此技术的一项实施例，抗体V域序列是以顺读一致(inframe)方式选殖至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因(例如M13或fd)内，并以功能抗体片段显示在噬菌体颗粒的表面上。噬菌体展示可以各种形式进行，例如，如下文描述于实例部分中或回顾(例如)于Johnson,KevinS.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)中。V-基因区段的多种来源可用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)从衍生自免疫化小鼠的脾脏的V基因的小随机组合库分离各种抗-恶唑酮抗体。来自未免疫化人类供体的V基因库可经构筑及针对各种抗原(包括自身抗原)的抗体可遵循由Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12:725-734(1993)描述的技术而基本上分离。亦参见美国专利案第5,565,332及5,573,905号。
如上文讨论，人类抗体亦可由经活体外活化的B细胞产生(参见美国专利案5,567,610及5,229,275)。
人类抗体亦可使用此项技术中已知的各种技术(包括噬菌体展示库)产生。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人及Boerner等人的技术亦适用于人类单克隆抗体的制备。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)及Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
多特异性抗体
多特异性抗体是对两种或更多种不同的抗原具有结合特异性的单克隆(优选人类或人源化)抗体(例如，对至少两种抗原具有结合特异性的双特异性抗体)。例如，结合特异性中的一种可针对a5～1蛋白，另一种可针对任何其他抗原。根据一项优选的实施例，另一种抗原为细胞表面蛋白或受体或受体子单元。例如，细胞表面蛋白可为自然杀手(NK)细胞受体。因此，根据一项实施例，本发明的双特异性抗体可结合PD-1及(例如)第二细胞表面受体。
此项技术中熟知适用于制造双特异性抗体的方法。例如，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中所述两条重链具有不同的特异性。Milstein及Cuello,Nature,305:537-539(1983)。因为免疫球蛋白重链及轻链的随机分配，此等杂交瘤(细胞杂交瘤)产生具有十种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常由亲和层析步骤完成。类似过程系公开于WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO,10:3655-3659(1991)中。
具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)可融合至免疫球蛋白恒定域序列。该融合优选地与免疫球蛋白重链恒定域(包含铰链、CH2及CH3区中的至少一部分)发生。含有轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)优选存在于这类融合物的至少一者中。将编码免疫球蛋白重链融合物(及视需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入各表达载体内，并共转染至合适的宿主生物体内。对于进一步的产生双特异性抗体的细节，参见，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology,121:210(1986)。
也已公开用于直接从重组细胞培养物制造及分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，双特异性抗体已使用亮氨酸拉链产生。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。来自Fos及Jun蛋白的亮氨酸拉链肽是通过基因融合连接至两个不同抗体的Fab'部分。抗体同源二聚体在铰链区减少以形成单体及然后经再氧化以形成抗体异二聚体。此方法也可用于产生抗体同源二聚体。由Hollinger等人，PNAS USA,90:6444-6448(1993)报道的「双功能抗体」技术已为制造双特异性抗体片段提供替代机制。片段包含由接头连接至VL的VH，该接头太短而无法容许相同链上的两个域之间配对。因此，一个片段的VH及VL域被迫与另一片段的互补VL及VH域配对，借此形成两个抗原结合位点。已有报导通过于单链Fv(sFv)二聚体以制造双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994)。
已有设想具有超过两个价数的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。
异质结合抗体(缀合抗体,heteroconjugate antibody)
异质结合抗体是由两个共价连接的抗体组成。此类抗体已(例如)被建议使免疫系统细胞靶向非所需的细胞(美国专利案第4,676,980号)及用于治疗HIV感染。WO 91/00360、WO 92/200373、EP 03089。这些抗体可使用合成蛋白化学中已知的方法(包括那些涉及交联剂的)活体外制备。例如，免疫毒素可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键进行构筑。适用于此目的的试剂的实例包括亚氨酸硫醇盐及甲基-4-巯基丁基亚氨酸盐(mercaptobutyrimidate)及一些揭示(例如)于美国专利申请第4,676,980号中的实例。
效应子功能改造
可能需要根据效应子功能修饰本文提供的抗体，以便于增强(例如)抗体于治疗癌症中的效用。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区内，借此容许在此区内形成链间二硫键。因此产生的同源二聚性抗体可具有改善的内化能力及/或增强的补体介导的细胞杀灭及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见，Caron等人，J.Exp.Med.,176:1191-1195(1992)及Shapes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚性抗体也可使用如Wolff等人，Cancer Research,53:2560-2565(1993)中报道的异型双官能交联剂制备。或者，抗体可经改造以具有双重Fc区并可借此具有增强的补体溶解及ADCC能力。参见，Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。
可在Fc区序列中作出突变或改变以改善FcR结合(例如，FcγR、FcRn)。根据一项实施例，本发明的抗体具有选自由以下的组的至少一种经改变的效应子功能：ADCC、CDC及相较于天然IgG或亲代抗体经改善的FcRn结合。数种有用的特异性突变的实例报道(例如)于Shields,RL等人，(2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta,L.G.,(2002)BiochemicalSociety Transactions 30(4):487-490及WO 00/42072中。
根据一项实施例，Fc受体突变在选自由以下的组的至少一个位置处的取代：Fc区的238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号根据EU编号系统。在一些实施例中，该Fc受体突变为D265A取代。在一些实施例中，该Fc受体突变为N297A取代。额外合适的突变系见于美国专利案第7,332,581号中。
免疫结合物
本发明还关于包含结合至细胞毒性剂(诸如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性结合物))的抗体的免疫结合物。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思子素A链、蒴莲根毒素A链、α-八迭球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)及单端孢霉烯(tricothecene)。各种放射性核素可用于产生经放射结合的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。适用于产生此等免疫结合物的示例性化学治疗剂包括那些本文于别处描述者。
在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体结合至美登素(maytansine)、美登醇(maytansinoid)或卡奇霉素(calicheamicin)。在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体结合至美登醇DM1。
抗体及细胞毒性剂的结合物使用各种双功能蛋白偶联剂制成，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫醇基)丙酸盐(SPDP)、亚胺基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚酰胺二甲酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双迭氮基化合物(诸如双(对迭氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲苯酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238:1098(1987)中描述制备。经碳-14-标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)用于使放射性核苷酸结合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
在另一实施例中，该抗体可结合至「受体」(诸如链霉亲和素)以用于肿瘤预靶向中，其中将该抗体-受体结合物投与病患，接着使用清洁剂自循环移除未经结合的结合物及然后投与结合至细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)的「配体」(例如，抗生物素蛋白)。
共价修饰
抗-PD-1抗体及其片段的共价修饰包括于本发明的范围内。共价修饰的一种类型包括使多肽的靶向氨基酸残基与可与多肽的经选择的侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应。与双功能剂的衍生系(例如)适用于将该多肽交联至不溶于水的支持基质或表面以用于纯化抗体的方法中，及反之亦然。常用交联剂包括(例如)1,1-双(重氮基乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，具有4-迭氮基水杨酸的酯)、同双功能亚胺酸酯(包括二琥珀酰亚胺基酯，诸如3,3'-二硫双(琥珀酰亚胺基-丙酸酯))、双功能马来酰亚胺(诸如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷)及试剂(诸如甲基-3-[(对迭氮基苯基)-二硫]丙酰异丙亚胺)。
其他修饰包括谷酰胺酰基及天冬酰胺酰基残基分别变为相应的谷氨酰基及天冬氨酰基残基的脱酰胺作用；脯氨酸及赖氨酸的羟化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸及组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco，第79至86页(1983))；N端氨基的乙酰化及任何C端羧基的酰胺化。
多肽的共价修饰的另一类型包括以美国专利申请第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式将该多肽连接至各种非蛋白聚合物中的一者，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧伸烷基。
嵌合分子
本发明的抗-PD-1抗体及/或其片段也可(若有利)以形成包含融合至另一异源性多肽或氨基酸序列(例如，免疫黏附素或肽抗体)的多肽的嵌合分子的方式而被修饰。
在一项实施例中，此嵌合分子包含多肽与蛋白转导域的融合，该蛋白转导域靶向该多肽以递送至各种组织尤其是跨脑血屏障递送，使用(例如)人类免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(Schwarze等人，1999,Science 285:1569-72)。
在另一实施例中，此嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合，该表位提供抗-标签抗体可选择性结合的抗原决定基。该抗原决定基标签通常放置于该多肽的氨基端或羧基端。该多肽的所述抗原决定基标记的形式的存在可使用针对标签多肽的抗体检测。同样地，抗原决定基标签的提供能够使用抗-标签抗体或结合至该抗原决定基标签的另一类型的亲和基质通过亲和纯化易于纯化该多肽。此项技术中已知各种标签多肽及其等个别抗体。实例包括聚-组氨酸(聚-His)或聚-组氨酸-甘氨酸(聚-His-gly)标签；flu HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988)]；c-myc标签及结合至其的8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗体(Evan等人，Molecular and Cellular Biology,5:3610-3616(1985)]；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990)]。其他标签多肽包括标志-肽(Flag-peptide)(Hopp等人，BioTechnology,6:1204-1210(1988)]；KT3抗原决定基肽(Martin等人，Science,255:192-194(1992)]；α-微管蛋白抗原决定基肽(Skinner等人，J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)]；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990))。
在替代实施例中，嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区的融合。就嵌合分子(例如，「免疫黏附素」)的二价形式而言，此融合可至IgG分子的Fc区。本发明的Ig融合包括多肽，该类多肽包含取代Ig分子内的至少一个可变区的人类的约或仅残基94至243、残基33至53或残基33至52。在特别优选的实施例中，该免疫球蛋白融合包括铰链、CH2及CH3或IgG1分子的铰链、CH1、CH2及CH3区。就免疫球蛋白融合的产生而言，亦参见1995年6月27日发证的美国专利申请第5,428,130号。
免疫脂质体
本文揭示的抗体也可调配为免疫脂质体。包含抗体的脂质体由此项技术中已知的方法制备，诸如报道于Epstein等人，PNAS USA,82:3688(1985)；Hwang等人，PNAS USA,77:4030(1980)；及美国专利申请第4,485,045及4,544,545号中的方法。具有增加的循环时间的脂质体系公开于美国专利申请第5,013,556号中。
特别有用的脂质体可通过逆相蒸发方法用包含卵磷脂、胆固醇及PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。将脂质体挤压通过具有指定孔径的过滤器以产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab’片段可经由二硫键交换反应结合至如Martinet等人，J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中报道的脂质体。抗肿瘤药剂、生长抑制剂或化学治疗剂(诸如阿霉素)也视需要包括于该脂质体内。参见，Gabizon等人，J.National CancerInst.,81(19):1484(1989)。
使用抗-PD-1抗体治疗
可将本文提供的抗-PD-1抗体及/或其片段及/或组合物投与至个体(例如，哺乳动物，诸如人类)以治疗涉及异常PD-1活性的疾病及失调症，其包括(例如)癌症(诸如头颈癌、咽喉癌、结肠直肠癌、肺癌等)。在某些实施例中，本发明提供本文公开的抗-PD-1抗体(或其片段)以用于制造治疗癌症的药剂，该癌症为个体中的癌症(诸如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(classicalHodgkin’s lymphoma)(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)。在某些实施例中，本发明提供本文公开的抗-PD-1抗体或其片段)以用于治疗个体中的癌症(诸如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)。
在某些实施例中，本发明提供包含本文公开的抗-PD-1抗体(或其片段)的药物组合物，其用于治疗个体中的癌症(黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)。在某些实施例中，待治疗的个体为哺乳动物(例如，人类、非人类灵长类动物、大鼠、小鼠、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施例中，该个体为人类。在某些实施例中，该个体为临床病患、临床试验志愿者、实验动物等。在某些实施例中，该个体疑似患有或存在风险患有癌症(诸如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)或经诊断患有癌症或患有异常PD-1表现或活性的任何其他疾病。
此项技术中已知许多诊断方法，这些诊断方法用于癌症(诸如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)或显示异常PD-1活性的任何其他疾病，及所述疾病的临床描述。这些方法包括(但不限于)例如，免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交(FISH)。关于用于异常PD-1活性或表现的诊断方法的额外详细说明报道(例如)于Gupta等人，(2009)Mod Pathol.22(1):128-133；Lopez-Rios等人，(2013)J Clin Pathol.66(5):381-385；Ellison等人，(2013)J Clin Pathol 66(2):79-89；及Guha等人，(2013)PLoS ONE 8(6):e67782中。
给药可通过任何合适的途径，包括(例如)静脉内、肌内或皮下给药。在一些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)及/或组合物与第二、第三或第四试剂(包括，例如，抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合给药以治疗涉及异常PD-1活性的疾病或失调症。此类药剂包括(例如)多西他赛(docetaxel)、吉非替尼(gefitinib)、FOLFIRI(伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)及甲酰四氢叶酸(leucovorin))、伊立替康(irinotecan)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗-VEGF抗体)、FOLFOX-4、滴注氟尿嘧啶(infusionalfluorouracil)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)及奥沙利铂(oxaliplatin)、阿法替尼(afatinib)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、鲁索利替尼(tivantinib)、依维莫司(everolimus)、CpG-ODN、雷帕霉素(rapamycin)、来那度胺(lenalidomide)、维罗非尼(vemurafenib)、内皮抑素(endostatin)、拉帕替尼(lapatinib)、PX-866、Imprime PGG及埃罗替尼(irlotinibm)。在一些实施例中，抗-PD-1抗体(或其片段)结合至额外的药剂。
在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)及/或组合物与一或更多种额外的治疗组合使用，诸如放射治疗、外科手术、化学治疗及/或靶向治疗。在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)及/或组合物与放射治疗组合使用。在某些实施例中，本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)及/或组合物与放射治疗的组合用于治疗选自由以下的组的癌症：黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHLPMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌及甲状腺癌。
取决于待治疗的病症及与熟知该领域的医师所熟悉的给药相关的因素，本文提供的抗-PD-1抗体或其片段将以有效治疗该病症同时最小化毒性及副作用的剂量给药。就癌症(诸如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHLPMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌)的治疗而言，典型剂量可为(例如)在0.001至1000μg的范围内；然而，低于或高于此示例性范围的剂量在本发明的范围内。每日剂量可为总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg(例如，约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约50mg/kg或由前述值中的任何两者定义的范围)，较佳自总体重的约0.3μg/kg至约10mg/kg(例如，约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg或由前述值中的任何两者定义的范围)，更佳自总体重的约1μg/kg至1mg/kg(例如，约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg或由前述值中的任何两者定义的范围)，及甚至更佳自每日体重的约0.5至10mg/kg(例如，约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg或由前述值中的任何两者定义的范围，包括前述值之间的任何范围)。如上文指示，治疗或预防效用可由已治疗病患的定期评估进行监测。就经数日或更久的重复给药而言，取决于病症，重复治疗直至发生疾病症状的所需抑制效果。然而，其他剂量方案可为有用的及在本发明的范围内。所需剂量可由组合物的单一剂量给药；组合物的多次剂量给药或组合物的连续输液给药。
包含抗-PD-1抗体或其片段的医药组合物可每日给药一、二、三或四次。所述组合物也可频率较低地每日给药，例如，一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次、每两个月一次、每三个月一次、或每六个月一次。所述组合物还可以缓释调配物(诸如在一定时间周期内使用时逐渐释放该组合物的植入物)给药，及容许该组合物以较低的频率给药，诸如一月一次、每2至6个月一次、每年一次或甚至单一给药。缓释装置(诸如丸剂、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球及类似物)可由注射给药。
抗体(或其片段)可以单一每日剂量给药，或总每日剂量可以每日二、三或四次的分开剂量给药。组合物也可以低于每日的频率给药，例如，一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。该抗体(或其片段)还可以缓释调配物(诸如在一定时间周期内使用时逐渐释放该组合物的植入物)给药，及容许该组合物以较低的频率给药，诸如一月一次、每2至6个月一次、每年一次或甚至单一给药。缓释装置(诸如丸剂、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球及类似物)可由注射给药或以外科手术植入各种位置中。
癌症治疗可由(例如，但不限于)肿瘤消退、肿瘤体重或体积缩小、进展的时间、存活的持续时间、无进展存活期、整体反应速率、反应的持续时间、生活的质量、蛋白质表达及/或活性进行评估。可采用判定治疗效用的方法，其中包括(例如)通过放射成像测量反应。
在一些实施例中，治疗效用作为百分率肿瘤生长抑制(％TGI)进行测量，其使用等式100-(T/C x 100)计算，其中T是经治疗肿瘤的平均相对肿瘤体积，及C是未经治疗肿瘤的平均相对肿瘤体积。在某些实施例中，该％TGI为约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或大于95％。在某些实施例中，抗-PD-1的％TGI与的％TGI相同或大于的％TGI，诸如约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍，包括在这些值之间的任何范围，或比的％TGI大大于约2.7倍。
药物制剂
抗-PD-1抗体(或其片段)可与合适的载体或赋形剂调配使其适用于给药。抗体的合适调配物是通过将具有所需纯度的抗体(或其片段)与视需要的医药上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合成冻干调配物或水溶液形式获得(Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Osol,A.编，(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对受体是无毒的，且包括缓冲剂(诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸及甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、酚醇、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲苯酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯啶酮)；氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或离氨酸)；单糖、二糖及其他糖类(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(诸如EDTA)；糖类(诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)；成盐对离子(诸如钠)；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；及/或非离子型表面活性剂(诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG))。示例性抗体调配物见报道于W098/56418中，以引用的方式将其明确并入本文内。适用于皮下给药的冻干调配物描述于W097/04801中。所述冻干调配物可用合适的稀释剂复水至高蛋白质浓度，经复水的调配物可皮下给药至本文中待治疗的哺乳动物。
本文的调配物亦可含有不止一种如治疗中的特定病症所需的活性化合物，优选具有互补活性而对彼此没有不利影响者。例如，可视需要进一步提供抗肿瘤药剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。这些分子以有效用于预期目的的量适当地存在于组合物中。这些其他药剂的有效量取决于存在于该调配物中的抗体的量、疾病或失调症或治疗的类型及上文讨论的其他因素。这些药剂通常以如本文描述的相同的剂量及给药途径使用或以迄今所用剂量的约自1至99％使用。也可将活性成分包埋于(例如)由凝聚技术或由界面聚合制备的微胶囊(例如，分别为羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物传递系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液内。此等技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编，(1980)中。可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质是以成形对象的形式(例如，薄膜或微胶囊)。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利申请第3,773,919号)、L-谷氨酸及乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解乙烯-乙烯基、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOTTM)(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
脂质体(Lipofectin或liposome)可用以将本发明的多肽及抗体(或其片段)或组合物传递至细胞内。在使用抗体片段的情况下，特异性结合至靶蛋白的结合域的最小抑制片段较佳。例如，基于抗体的可变区序列，肽分子可经设计以保留结合靶蛋白序列的能力。这些肽可化学合成及/或由重组DNA技术产生。参见，例如，Marasco等人，PNAS USA,90:7889-7893(1993)。
亦可将活性成分包埋于(例如)由凝聚技术或由界面聚合制备的微胶囊(例如，分别为羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物传递系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液内。此等技术报道于Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES中，同上。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，该等基质是以成形对象的形式(例如，薄膜或微胶囊)。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利申请第3,773,919号)、L-谷氨酸及乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOT TM)(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸的聚合物可释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白释放更短的时间周期。当囊封抗体在体内保留较长时间时，其可因在37℃下曝露于水分而变性或聚集，导致生物活性的损失及可能的免疫原性的变化。取决于涉及的机制，可针对稳定设计合理策略。例如，若发现聚集机制是通过硫醇基-二硫键互换的分子间S-S键形成，则稳定可由以下实现：修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂及创造特异性聚合物基质组合物。
在某些实施例中，该调配物包含具有以下浓度的本文描述的抗-PD-1抗体：大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约2mg/ml、大于约3mg/ml、大于约4mg/ml、大于约5mg/ml、大于约6mg/ml、大于约7mg/ml、大于约8mg/ml、大于约9mg/ml、大于约10mg/ml、大于约11mg/ml、大于约12mg/ml、大于约13mg/ml、大于约14mg/ml、大于约15mg/ml、大于约16mg/ml、大于约17mg/ml、大于约18mg/ml、大于约19mg/ml、大于约20mg/ml、大于约21mg/ml、大于约22mg/ml、大于约23mg/ml、大于约24mg/ml、大于约25mg/ml、大于约26mg/ml、大于约27mg/ml、大于约28mg/ml、大于约29mg/ml或大于约30mg/ml，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，抗-PD-1抗体(例如，以大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml或大于约25mg.ml，包括在这些值之间的任何范围的浓度)调配于包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(吐温80)或前述的任何组合的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体(例如，以大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml或大于约25mg/ml，包括在这些值的间的任何范围的浓度)调配于包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体调配于包含约50mM至约100mMNaCl的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体(例如，以大于约mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml或大于约25mg/ml，包括在这些值之间的任何范围的浓度)调配于包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体调配于包含约10mM至约50mM琥珀酸盐的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体(例如，以大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml或大于约25mg/ml，包括在这些值之间的任何范围的浓度)调配于包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体调配于具有在约5.1与5.6之间的pH的缓冲剂中。在某些实施例中，该抗-PD-1抗体调配于包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲剂中，其中该调配物pH＝5.5。
在某些实施例中，包含本文描述的PD-1抗体(例如，以大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml或大于约25mg/ml，包括在这些值之间的任何范围的浓度)的调配物(诸如包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲剂的调配物，其中该调配物pH＝5.5)在室温下稳定(诸如在约20至25℃下稳定约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周或5.0周，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，包含本文描述的PD-1抗体(例如，以大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml或大于约25mg/ml，包括在这些值之间的任何范围的浓度)的调配物(诸如包含包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲剂的调配物，其中该调配物pH＝5.5)在加速条件下稳定(诸如在约37℃下储存)稳定约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周、或5.0周，包括在这些值之间的任何范围。
粒径排阻层析术(SEC)是蛋白质稳定性研究中用于检测可能的片段化及聚集(对应于物理及化学不稳定性)的熟知且广泛使用的方法。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml,10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％高分子量物质，在37℃下1周后的高分子量物质(HMWS)增加小于约1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％或0.1％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％高分子量物质，在37℃下2周后的高分子量物质增加小于约2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％或0.1％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-EFGR抗体的调配物显示相对于初始％高分子量物质，在37℃下4周后的高分子量物质增加小于约3.3％、3.2％、3.1％、3.0％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.2％、2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％或0.1％，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％低分子量物质，在37℃下1周后的低分子量物质(LMWS)增加小于约1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％或0.1％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％低分子量物质，在37℃下2周后的低分子量物质增加小于约2.0％、1.8％1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、％、0.4％、0.2％或0.1％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％低分子量物质，在37℃下4周后的低分子量物质增加小于约2.4％、2.2％、2.0％、1.8％1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％或0.1％，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％单体，在37℃下1周后的单体减少不大于约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％或3.5％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物显示相对于初始％单体，在37℃下2周后的单体减少不大于约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％或3.5％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用SEC测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-EFGR抗体的调配物显示相对于初始％单体，在37℃下2周后的单体减少不大于约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％或3.5％，包括在这些值之间的任何范围。
阳离子交换层析术(CEX)用于检测蛋白质降解诸如脱酰胺作用或氧化(Moorhouse等人，(1997)J.Pharm.Biomed.Anal.16,593–603)的熟知且广泛使用的工具。降解产物通常称作酸性或碱性物质。酸性物质是比来自CEX的主峰更早洗脱的变体，而碱性物质是比来自CEX的主峰更晚洗脱的变体。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的酸性峰值部分在37℃下1周后不大于总蛋白质的约7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的酸性峰值部分在37℃下2周后不大于总蛋白质的约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的酸性峰值部分在37℃下2周后不大于总蛋白质的约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％或27％，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的碱性峰值部分在37℃下1周后不大于总蛋白质的约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％或46％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的碱性峰值部分在37℃下2周后系不大于总蛋白质的约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％或46％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的碱性峰值部分在37℃下4周后系不大于总蛋白质的约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％或46％，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的主峰部分在37℃下1周后系不小于总蛋白质的约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％或46％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的碱性峰值部分在37℃下2周后系不小于总蛋白质的约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％或46％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，如使用CEX测量，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文描述的抗-PD-1抗体的调配物的碱性峰值部分在37℃下4周后系不小于总蛋白质的约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％或46％，包括在这些值之间的任何范围。
待用于活体内给药的调配物必须是无菌的。这可以容易地(例如)通过无菌过滤膜过滤完成。
使用抗-PD-1抗体的诊断及成像的方法
经标记的抗-PD-1抗体、其片段及其衍生物及类似物(其特异性结合至PD-1多肽)可出于诊断目的用于检测、诊断或监测与PD-1的表达、异常表达及/或活性相关的疾病及/或失调症。例如，本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)可用于原位、活体内、活体外及活体外诊断分析或成像分析中。用于检测PD-1多肽的表达的方法包括(a)使用一或更多种本发明的抗体分析个体的细胞(例如，组织)或体液中多肽的表达，及(b)比较基因表达程度和标准基因表达程度，通过此经分析的基因表达程度相对于标准表达程度的增加或减小指示异常表现。
本文提供的额外实施例包括诊断动物(例如，哺乳动物，诸如人类)中与PD-1的表达或异常表达相关的疾病或失调症的方法。所述方法包括检测哺乳动物中的PD-1分子。在某些实施例中，诊断包括：(a)向哺乳动物投与有效量的经标记的抗-PD-1抗体(或其片段)，(b)在给药后等待一定时间间隔，以容许经标记的抗-PD-1抗体(或其片段)在个体中的表达PD-1分子的位点处优先浓缩(及容许未经结合的被标记的分子清除至背景水平)；(c)测定背景水平；及(d)检测个体中被标记的分子，使得被标记的分子的高于背景水平的检测指示该个体患有与PD-1的表达或异常表达相关的特定疾病或失调症。背景水平可由各种方法测定，该等方法包括将经检测后的标记分子的量与先前针对特定系统测定的标准值进行比较。
本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)可用以使用熟习此项技术中已知的经典免疫组织化学方法分析生物样本中的蛋白质浓度(例如，参见Jalkanen,等人，J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen,等人，J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。适用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。合适的抗体分析标记物为此项技术中已知，且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)及锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺(luminol)；及荧光标记物，如荧光素及罗丹明(rhodamine)及生物素。
此项技术中已知的技术可应用至本文提供的经标记的抗体(或其片段)。所述技术包括(但不限于)使用双官能偶联剂(参见例如，美国专利申请第5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；及5,808,003号)。
或者或另外，技术人员可测量细胞中编码PD-1多肽的核酸或mRNA的浓度，例如，经由使用对应于编码PD-1的核酸或其补体的基于核酸的探针进行的荧光原位杂交；(FISH；参见1998年10月公开的W098/45479)、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交或聚合酶链反应(PCR)技术，例如实时定量PCR(RT-PCR)。技术人员也可通过测量生物流体(诸如血清)中的脱落抗原(shed antigen)，例如，使用基于抗体的分析(亦参见，例如，1990年6月12日发证的美国专利申请第4,933,294号；1991年4月18日公开的W091/05264；1995年3月28日发证的美国专利申请第5,401,638号；及Sias等人，J.Immunol.Methods 132:73-80(1990))研究PD-1过表达。除上文分析外，有经验的执业医师可获得各种活体内及活体外分析。例如，技术人员可使哺乳动物体内的细胞曝露于视需要经可检测标记物(例如，放射性同位素)标记的抗体，该抗体与该细胞的结合可(例如)通过针对放射性进行外部扫描或借由分析取自先前曝露于抗体的哺乳动物的样本(例如，活组织切片或其他生物样本)以进行评估。
制品及试剂盒
本文提供的另一实施例是含有适用于治疗癌症的材料的制品，该癌症诸如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、甲状腺癌及唾液腺癌。所述制品可包含容器及于该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可形成自各种材料，诸如玻璃或塑料。通常，该容器容纳有效治疗病症的组合物及可具有无菌出入口(例如，该容器可为静脉输液袋或具有可由皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂是本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)。该标签或包装插页指示该组合物适用于治疗特定的病症。该标签或包装插页将进一步包含用于向病患给予该抗体组合物的说明书。亦预期包含本文描述的组合治疗的制品及试剂盒。
包装插页是指通常包括于治疗产品的商业包装中的说明书，其包含有关使用所述治疗产品的适应症、用途、剂量、给药、禁忌症及/或警告的信息。在一项实施例中，该包装插页指示该组合物适用于治疗癌症(诸如头颈癌、肺癌或结肠直肠癌)。
另外，所述制品可进一步包含第二容器，其包含医药上可接受的缓冲剂，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、格氏溶液及葡萄糖溶液。其可进一步包括在商业及使用者立场上所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
还提供适用于各种目的(例如，适用于分离或检测病患中的PD-1)的试剂盒，该等试剂盒视需要与所述制品组合。就PD-1的分离及纯化而言，该试剂盒可含有结合至珠子(例如，SEPHAROSETM珠)的本文提供的抗-PD-1抗体(或其片段)。可提供含有用于检测及定量活体外(例如，在ELISA或蛋白质印迹法中)PD-1的抗体(或其片段)的试剂盒。与所述制品一样，该试剂盒包含容器及于该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。例如，该容器容纳包含至少一种本文提供的抗-PD-1抗体的组合物。可包括含有(例如)稀释剂及缓冲剂、对照抗体的额外容器。该标签或包装插页可提供该组合物的描述及针对预期活体外或诊断用途的说明书。
实施例
实施例1
抗-PD1抗体的研发
抗-PD-1抗体的研究见如下总结。通过筛选经PD-1(经纯化的重组6xHis标记的PD-1_ECD抗原)(如SEQ ID NO:26揭示的「6xHis」)免疫的小鼠的杂交瘤所产生的Fab噬菌体库识别阳性抗-PD-1抗体克隆。进行下文中进一步详细描述的活体外功能分析以表征所述克隆。
简而言之，将杂交瘤克隆的连续稀释液用涂覆PD1-His蛋白的盘(plate)在室温下培养1小时，及在450nm下监测PD1结合活性。所述盘用溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％牛奶在室温下阻断1小时并用PBS-吐温20(PBST)清洗，接着添加杂交瘤稀释液。在培养杂交瘤克隆后，所述盘用PBST清洗，用1:4000抗-小鼠IGG-HRP在室温下培养1小时，用PBST清洗，用四甲基联苯胺(TMB)显影，及最后使用H2SO4以停止该反应，测量在450nm下的吸光度。
流式细胞测量术显示克隆ID编号11、12、14、16、18、20、24、27及28可结合PD-1。用于评估PD-1结合的流式细胞测量术条件包括以下的步骤：1)用PBS(2％FBS)清洗4E+05个表达PD-1的CHO-S细胞两次；2)添加杂交瘤上清液，在4℃下培养30min；3)在500x g下将细胞离心5min；4)用PBS(2％FBS)清洗两次；5)添加经1:150稀释的山羊抗-人类IgG-FITC，在4℃下培养30min；6)用PBS(2％FBS)清洗细胞两次；7)将细胞悬浮于50μl 1x PBS中，通过流式细胞测量术分析。
流式细胞测量术用以评估杂交瘤上清液阻断PD-L1与PD1之间的结合的能力。结果显示经克隆#11阻断的结合相当于对照抗-PD-1抗体(例如，纳武单抗)。进行的流式细胞测量术结合分析包括以下的步骤：1)用PBS(2％FBS)清洗每个样本4E+05个细胞两次；2)混合8μg/mL生物素-PDL1及杂交瘤上清液，体积比率为1:1；3)向细胞添加60μL来自步骤2的混合物及在4℃下培养30min；4)细胞用PBS(2％FBS)清洗两次；5)用抗生物素蛋白-FITC(1:65稀释液)在4℃下将细胞培养30min；及6)细胞用PBS(2％FBS)清洗两次。
于SS320感受态细胞中识别一个阳性PD-1群落(c1G4)。下文提供c1G4克隆的特征及序列。
实施例2
产生人源化抗-PD-1抗体1G4(h1G4)
人源化抗-PD-1抗体1G4(h1G4)使用人类生殖细胞系轻链可变区IGKV1-39*01及人类生殖细胞系重链可变区IGHV3-11*04产生。简而言之，人源化是通过将来自嵌合c1G4的轻链及重链的CDR残基移植至人类免疫球蛋白的类似轻链及重链框架完成。移植CDR的人源化抗体的库可经产生以用于进一步基于活体外噬菌体展示的亲和力成熟以增强对其抗原的亲和力。
针对c1G4及h1G4的序列比对显示于图8A及8B中。图8A显示嵌合c1G4、人源化h1G4、人类生殖细胞系轻链可变区IGKV1-39*01及纳武单抗(NIV)的轻链的氨基酸序列比对。图8B显示嵌合c1G4、人源化h1G4、人类生殖细胞系重链可变区IGHV3-11*04及纳武单抗(NIV)的重链的氨基酸序列比对。自c1G4移植以用于人源化的CDR(互补决定区)用粗体加下划线文本标识。
实施例3
c1G4及h1G4的平衡解离常数(KD)的测定
结合亲和力及动力学通过使用表面等离子共振(SPR)测量。将抗-人类IgG Fc首先固定于传感器芯片上，然后以Rmax～150RU捕获参考抗-PD-1抗体、c1G4及h1G4。实验在25℃下进行，测量用PD-1-His的自58.8nM至7.35nM的连续稀释液穿过用0.1％(w/v)BSA补充的HBS-P+缓冲剂中的经捕获抗体来进行。所有数据用评估软件分析及曲线用1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型拟合。
结合及解离动力学及算得的亲和力(KD)由表面等离子共振(SPR)测量。相比于抗-PD-1参考的对c1G4及h1G4的亲和力的改善显示于下表4中。数据代表一式两份进行的两个独立实验。
表4
实施例4
嵌合c1G4及人源化h1G4抗体的结合特征
c1G4对PD-1重组蛋白的结合
进行ELISA分析以评估嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体对PD-1的结合。嵌合c1G4及参考抗-PD-1的连续稀释液通过用PD-1-His于微量滴定盘的孔中捕获。各孔中经捕获的抗体的量使用抗-人类IgG Fc-HRP-结合的二级抗体定量。向该孔添加HRP-结合的二级抗体，并在培养后，冲走过量的二级抗体。向该孔添加TMB，在培养后，停止该反应，并通过监测在450nm下的吸光度的增加测量HRP活性。用以比较抗-PD-1抗体嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体对PD-1-His的结合而进行的ELISA的结果显示于图1A中。
图1B显示用以比较抗-PD-1抗体嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体对PD-1-AP的结合而进行的第二组ELISA的结果。嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体的连续稀释液用抗-人类IgG Fc抗体于微量滴定盘的孔中捕获。各孔中经捕获的抗体的量使用AP-结合的PD-1定量。在培养后，冲走过量的PD-1-AP。向该孔添加碱性磷酸盐受质，并在培养后，停止该反应并通过监测在405nm下的吸光度的增加测量AP活性。
结果显示嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体可结合至PD-1-His及PD-1-AP。
c1G4对PD-1配体的结合的阻断及竞争
嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体的连续稀释液用PD-L1-AP在室温下培养2小时。将各抗体:抗原混合物添加至微量滴定盘的涂覆PD-1-His的孔。在培养及清洗后，向该孔添加pNPP及培养1小时以检测经结合的PD-L1-AP。通过监测在405nm下的吸光度的增加测量AP活性。图2A显示用以比较抗-PD-1抗体嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体阻断PD-L1及PD-1的结合的能力而进行的ELISA的结果。发现嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体两者均阻断PD-L1对PD-1的结合。
图2B显示用以测定抗-PD-1抗体嵌合c1G4与参考抗-PD-1抗体竞争结合至PD-1-His的能力而进行的ELISA的结果。将嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体的连续稀释液与固定浓度的PD-1-His(0.1μg/ml)在室温下预混合2小时，然后结合至涂覆固定浓度的参考抗-PD-1(4μg/ml)的盘(plate)。使用抗-His-HRP-结合的二级抗体定量各孔中经结合的PD-1-His的量。在培养后，冲走过量二级抗体。向该孔添加TMB，及在培养后，停止该反应，并通过监测在450nm下的吸光度的增加测量HRP活性。将固定浓度的PD-1-His(0.1μg/ml)添加至涂覆固定浓度的NIV(4μg/ml)的盘及在室温下培养1小时，然后向该孔添加嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体的连续稀释液。在培养及清洗后，使用抗-His-HRP-结合的二级抗体定量各孔中经结合的PD-1-His的量。
此数据显示嵌合c1G4及参考抗-PD-1抗体两者均可阻断PD-L1对PD-1的结合，并且嵌合c1G4可与抗-PD-1参考竞争结合至PD-1-His。
c1G4及h1G4对表现PD-1的CHO-S细胞的结合
在细胞表面表达重组人类PD-1的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系并利用其通过流式细胞测量术测定PD-1人类单克隆抗体的特异性。用含有编码PD-1的跨膜形式的全长cDNA的表达质粒转染CHO细胞。通过用连续稀释于FACS缓冲剂(具有1％FBS的PBS)中的抗-PD-1单克隆抗体培养该经转染的细胞评估c1G4及h1G4抗-PD-1单克隆抗体的结合。该细胞系用流动缓冲剂清洗并通过经生物素标记的兔抗-人类IgG FcγAb及链霉亲和素-PE检测其结合。流式细胞分析系使用Cytomics FC 500(Beckman Coulter Inc.)进行。
图3A及3B提供通过流式细胞测量术测定的c1G4抗体对CHO-S细胞(图3A)及经PD-1转染的CHO-S细胞(图3B)的结合。参考抗-PD-1及抗-PD-L1抗体分别用作阳性对照及阴性对照。结果显示该c1G4结合至经PD-1转染的CHO细胞，但不结合至未经人类PD-1转染的CHO细胞。
人源化h1G4及原始c1G4抗体对细胞表面上的PD-1的结合特征显示于图9中。
由经选择的c1G4及h1G4抗体阻断配体结合至PD-1
使用流式细胞测量术分析测试抗-PD-1c1G4及h1G4的阻断配体PD-L1结合至表达PD-1的CHO-S细胞的能力。抗-PD-1及抗-PD-L1抗体分别用作阳性对照及阴性对照。将表达PD-1的CHO-S细胞悬浮于FACS缓冲剂(具有1％FBS的PBS)中。将各种浓度的c1G4及h1G4抗-PD-1抗体、参考抗-PD-1及抗-PD-L1抗体添加至细胞悬浮液并在4℃下培养30分钟。洗除未经结合的抗体并添加经生物素标记的PD-L1-Fc融合蛋白及在4℃下培养30分钟。清洗该细胞，然后用链霉亲和素-PE在4℃下染色30分钟。流式细胞分析物使用Cytomics FC 500(Beckman Coulter Inc.)进行。
如通过染色的平均荧光强度(MFI)测量，抗-PD-1单克隆抗体c1G4阻断PD-L1结合至经PD-1转染的CHO-S细胞。如由染色的平均荧光强度(MFI)测量(图4及10)，此结果证实c1G4及h1G4两者均阻断PD-L1结合至经PD-1转染的CHO-S细胞。
人源化抗-PD-1抗体对活化人类T细胞的结合
人类T细胞使用MagniSortTM人类T细胞富集试剂盒(eBioscience)分离自PBMC。经分离T细胞由5μg/ml植物凝集素(PHA)活化3天以刺激PD-1表达。收集活化T细胞并在具有人类Fc阻断剂(eBioscience)的FACS缓冲剂(具有2％FBS的PBS)中在4℃下培养20分钟。
抗-PD-1单克隆抗体的结合通过用连续稀释于FACS缓冲剂中的抗-PD-1单克隆抗体培养活化T细胞进行评估。该细胞用流动缓冲剂清洗且其结合用经FITC标记的兔抗-人类IgG FcγAb检测。流式细胞分析物使用Cytomics FC 500(Beckman Coulter Inc.)进行。参考抗-PD-1抗体及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。
人源化抗-PD-1抗体h1G4结合至活化人类T细胞的结果显示于图12中。
实施例5
在混合白细胞反应(MLR)中抗-PD-1c1G4及h1G4对细胞因子产生的影响
使用混合白细胞反应以证实阻断PD-1途径对淋巴细胞效应子细胞的影响。测试该分析中的T细胞在存在或缺乏抗-PD-1抗体的情况下的增殖、IFN-γ分泌及IL-2分泌。
使用Lympho-kwik T(One Lamda,Inc.)自PBMC纯化人类T细胞。将经分离T细胞悬浮于PBS中及用1μM的CFSE在室温下标记10分钟。在用完全培养基(具有10％FBS的RPMI-1640)清洗细胞后，将经CFSE标记的T细胞以1E6/细胞的浓度悬浮于完全培养基中。
自PBMC产生同种异体树突细胞。经分离PBMC系用200U/ml重组人类IL-3(eBioscience)培养整夜以容许单核细胞/巨噬细胞群体附着至盘。移除未贴壁细胞且将该盘用完全培养基清洗两次。然后将该盘上的所述细胞在含有200U/ml人类IL-4(eBioscience)及200U/ml人类GM-CSF(eBioscience)的完全培养基中培养6天。单核细胞衍生的树突细胞通过在第6天向该培养物添加TNF-α(100U/ml)成熟及培养整夜。成熟DC系经胰蛋白酶化、获取及以1E5/细胞的浓度悬浮于完全培养基中。
各反应含有200μl总体积的105个经CFSE标记的T细胞及104个同种异体树突细胞。在不同抗体浓度下将抗-PD-1单克隆抗体c1G4或h1G4添加至各培养物。无抗体或抗-VEGF抗体(阿瓦斯汀)用作阴性对照。参考抗-PD-1抗体用作阳性对照。在37℃下将所述细胞培养5天。5天后，自各培养物取出100μl培养基以供细胞因子测量。细胞因子的浓度使用人类IFN-γ或IL-2ELISA MAXTM Deluxe试剂盒(BioLegend)测量。收集所述细胞及通过流式细胞测量术分析T细胞增殖。
图5A阐述由针对人类PD-1的单克隆抗体c1G4促进的浓度依赖性IL-2分泌，及图5B阐述由针对人类PD-1的单克隆抗体c1G4产生的浓度依赖性IFN-γ分泌。
图13A阐述由针对人类PD-1的单克隆抗体h1G4促进的浓度依赖性IL-2分泌，及图13B阐述由针对人类PD-1的单克隆抗体h1G4产生的浓度依赖性IFN-γ分泌。
针对人类PD-1的单克隆抗体c1G4在混合白细胞反应分析中促进CD4+及CD8+T细胞增殖。图6A阐述在各种浓度的c1G4抗体下的CD4+T细胞增殖，及图6B阐述在各种浓度的c1G4抗体下的CD8+T细胞增殖。图14A阐述在各种浓度的h1G4抗体下的CD4+T细胞增殖，及图14B阐述在各种浓度的h1G4抗体下的CD8+T细胞增殖。
总之，上述结果显示抗-PD-1单克隆抗体c1G4及h1G4促进T细胞增殖、IFN-γ分泌及IL-2分泌。相比之下，含有阴性对照抗体的培养物不显示T细胞增殖、IFN-γ或IL-2分泌的增加。
实施例6
c1G4及h1G4抗体的肿瘤生长抑制活性
抗-人类PD-1抗体的活体内活性通过在异种移植小鼠模型中使用免疫功能不全的NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠进行研究。癌细胞及经分离人类PBMC在皮下投与前以指定效应子-比-标靶(E:T)比率立即混合。各小鼠经癌细胞及人类PBMC的混合物双侧接种。将四只小鼠分配至各实验组。在移植癌症/效应子细胞的1天后腹腔内投与测试对象的第一剂量。该小鼠一周两次接受测试对象的剂量，历时3至4周。观察各动物中的肿瘤的形成，一周两次。肿瘤由测径器测量且肿瘤体积(V)使用下式计算：
V(mm3)＝0.5×(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)。
在HT29/PBMC异体移植模型中以c1G4或h1G4抗体进行的肿瘤生长曲线分别显示于图7A及15A中。在第28天以c1G4进行或在第21天以h1G4进行的HT29/PBMC异体移植模型的个别肿瘤体积分别呈现于图7B及15B中。此外，在NCI-H292/PBMC中以h1G4抗体进行的肿瘤生长曲线显示于图16A中。在第25天下以h1G4抗体进行的个别肿瘤体积呈现于图16B中。所有数据点为平均值±SEM。
此外，还研究HT29/PBMC异体移植模型中抗-PD-1及抗-VEGF单克隆抗体的组合治疗。以抗-PD-1及抗-VEGF的组合增强肿瘤抑制的数据呈现于图21中。
实施例7
h1G4的物种交叉反应性
重组人类、大鼠、小鼠及食蟹猴PD-1融合蛋白购买自Sino Biological Inc。通过在4℃下培养整夜将PD-1/Fc(每孔9ng)固定于96孔分析盘上。非特异性结合位点使用于PBS中的5％脱脂牛奶在室温下阻断1小时。在用PBST将盘清洗三次后，指定浓度的h1G4、参考抗-PD-1(阳性对照)及HLX01(阴性对照)用固定化蛋白质在室温下培养1小时。用PBST将所述盘清洗三次，然后用在PBS中稀释至1/10,000中的经过氧化物酶标记的山羊抗-人类IgGF(ab)’2(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在室温下培养1小时。在清洗后，用TMB(eBioscience)使盘显影。使用Vmax酶标仪(Molecular Devices)读取在450nm波长长度下的吸光度。
图11A至11D显示h1G4对人类(图11A)、食蟹猴(图11B)、小鼠(图11C)及大鼠(图11D)PD-1蛋白的物种交叉反应性。
实施例8
h1G4抗体的肿瘤生长抑制活性
h1G4抗体于hPD1KI小鼠中的肿瘤生长抑制活性
抗-人类PD-1抗体的活体内活性是在人类PD-1敲入C57BL/6小鼠(hPD1KI小鼠)中进行研究。对该小鼠皮下接种经人类PD-L1转染的小鼠结肠癌细胞(每只小鼠1E6个细胞)。当肿瘤体积达到约75mm3(第9天)时，开始抗体治疗。在治疗前，将四只动物分配至各实验组。该动物一周两次接受抗-PD-1抗体的剂量，历时3至4周。观察各动物中的肿瘤的形成，一周两次。肿瘤由测径器测量及肿瘤体积(V)使用下式计算：V(mm3)＝0.5×(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)。hPD1KI小鼠中h1G4抗体的肿瘤生长抑制活性显示于图17中。
h1G4于人源化NSG小鼠的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系异体移植模型中的效用研究
对人源化NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ)皮下接种MDA-MB-231(人类三阴性乳腺癌细胞系)。当肿瘤体积达到～60-150mm3时，基于根据表的肿瘤体积将小鼠随机分配至3组(n＝9只/组)内。在研究第0、7、14、21及28天，每7天一次向小鼠腹腔内给药h1G4。在研究第0、5、10、15及20天，每5天一次腹腔内注射派姆单抗(Keytruda)(抗-PD-1)。每3至4天观察各动物中的肿瘤的形成。肿瘤由测径器测量及肿瘤体积(V)使用下式计算：V(mm3)＝0.5×(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)。图18阐述h1G4于人源化NSG小鼠的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系异体移植模型中的效用研究。
实施例9
亲和力成熟抗-PD-1抗体33B、66E及711D的平衡解离常数(KD)的测定
人源化抗-PD-1抗体h1G4用于基于活体外噬菌体展示的亲和力成熟实验中以产生具有经改善的结合性能的克隆。h1G4的CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3(聚集于3个CDR上)及CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3(聚集于6个CDR上)核酸库经由PCR产生，克隆至噬菌体展示载体内及转化为大肠杆菌TG1或SS320细胞以产生噬菌体的库。在针对两个库进行用偶联至涂覆链霉亲和素的磁性M-280(Thermo Fisher Scientific#11205D)的生物素化PD-1-His分选三轮后，经由ELISA筛选出三个Fab克隆(即，33B、66E及711D)。其他动力学特征由表面等离子共振(SPR)(参见与如上文针对图9描述的方法相同的SPR方法)使用33B、66E及711D的全长IgG测量并发现具有等于或优于参考抗-PD-1抗体的结合性能。
表5显示相对于h1G4筛选自基于噬菌体库的亲和力成熟的33B、66E及711D的CDR的氨基酸序列。
表5
表6显示由表面等离子共振(SPR)测量的33B、66E及711D的结合及解离动力学以及计算亲和力(KD)。抗-PD-1抗体的相较于参考抗-PD-1抗体的亲和力改善也显示于表6中。数据代表一式两份进行的两个独立实验。
表6
实施例10
亲和力成熟抗体的功能
在混合白细胞反应(MLR)中人类抗-PD-1抗体(33B、66E、711D)对细胞因子产生的影响
遵循与上文描述相同的方法，此研究显示针对人类PD-1的人类单克隆抗体(诸如66E及711D)在混合白细胞反应分析中促进IFN-γ分泌及IL-2分泌。参考抗-PD-1抗体及阿瓦斯汀(抗-VEGF)分别用作阳性对照及阴性对照。图19A显示由亲和力成熟抗体产生的浓度依赖性IL-2分泌，及图19B显示由亲和力成熟抗体产生的浓度依赖性IFN-γ分泌。
人类抗-PD-1抗体于HT29/PBMC异体移植模型中的肿瘤生长抑制活性
遵循与上文描述相同的方法，对小鼠(n＝4只/组)皮下注入人类结肠癌细胞系HT29及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1抗体注入小鼠的腹腔内。每周两次量测肿瘤体积。人类亲和力成熟抗-PD-1抗体于HT29/PBMC异体移植模型中的肿瘤生长抑制活性显示于图20中。所有数据点为平均值±SEM。
实施例11
PD-1组合治疗
具有抗-PD-1及其他治疗抗体的组合治疗的活体内活性通过在异种移植小鼠模型中使用免疫功能不全的NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠进行研究。在皮下投与前以指定效应子-比-标靶(E:T)比率立即混合癌细胞及经分离人类PBMC。各小鼠经癌细胞及人类PBMC的混合物双侧接种。将四或五只动物分配至各实验组。在移植癌症/效应子细胞的1天后腹腔内投与测试对象的第一剂量。该等动物一周两次接受测试对象的剂量，历时3至4周。观察各动物中的肿瘤的形成，一周两次。肿瘤由测径器测量，肿瘤体积(V)使用下式计算：
V(mm3)＝0.5×(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)
抗-PD-1 mAb加抗-VEGF mAb于NSCLC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长抑制活性
在此研究中，对小鼠(n＝4只/组)皮下注入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1(h1G4)及抗-VEGF(HLX04)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图22A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图22B中。所有数据点为平均值±SEM。此数据显示，与抗-VEGF mAb(HLX04)组合的抗-PD-1 mAb(h1G4)比单独使用任何一种药剂更有效抑制NCI-H292异种移植的肿瘤生长。
在其他研究中，对小鼠(n＝4/组)皮下注入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1(h1G4)及抗-VEGFR2(HLX06)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图23A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图23B中。所有数据点为平均值±SEM。此数据显示与抗-VEGFR2 mAb(HLX06)组合的抗-PD-1 mAb(h1G4)比单独使用任何一种药剂更有效抑制NCI-H292异种移植的肿瘤生长。
抗-PD-1 mAb加抗-EGFR mAb于NSCLC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长抑制活性
遵循与上文描述相同的方法，对小鼠(n＝4/组)皮下注入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜经分离人类PBMC的混合物(癌细胞：PBMC＝3:1)。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1(HLX10)及抗-EGFR(HLX07)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图24A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图24B中。所有数据点为平均值±SEM。此数据显示与抗-EGFR mAb(HLX07)组合的抗-PD-1 mAb(HLX10(h1G4))比单独使用任何一种药剂更有效抑制NCI-H292异种移植的肿瘤生长。
另外，对小鼠(n＝5/组)皮下注入人类结肠癌细胞HT-29及新鲜经分离人类PBMC(癌细胞：PBMC＝3:1)的混合物。自第1天起，每周两次，将抗-PD-1(HLX10)及抗-EGFR(HLX07)抗体注入小鼠的腹腔内。肿瘤生长曲线显示于图25A中。第21天的个别肿瘤体积呈现于图25B中。所有数据点为平均值±SEM。
此数据显示与抗-EGFR mAb(HLX07)组合的抗-PD-1 mAb(HLX10(h1G4))比单独使用HLX10更有效抑制BRAF突变体HT-29异种移植的肿瘤生长。HLX10加HLX07治疗比单独HLX07治疗针对肿瘤生长产生稍微更大的抑制。HLX10加HLX07治疗及单独HLX07治疗的平均肿瘤生长抑制速率分别为47％及28％。
前述实施例仅提供出于说明目的，并且无意以任何方式限制本发明的范围。本领域工作人员自前述描述将知晓除本文显示及说明以外的本发明的各种修改等均落于随附申请专利范围的范围内。
实施方式的列表
由本发明提供的实施方式包括(但不限于)：
1.一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，该轻链可变域(VL)序列包含(1)包含氨基酸序列KASQDVTTAVA(SEQ ID NO:9)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3，及重链可变域(VH)序列，该重链可变域(VH)序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDF(SEQ ID NO:14)的CDR-H3。
2.一种成熟抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，该轻链可变域(VL)序列包含(1)包含氨基酸序列KASTDVTTAVA(SEQ ID NO:15)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASLRHT(SEQ ID NO:16)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYGIPWT(SEQ IDNO:17)的CDR-L3，及重链可变域(VH)序列，该重链可变域(VH)序列包含(1)包含氨基酸序列FRFSNYGMS(SEQ ID NO:18)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNAY(SEQ ID NO:19)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列TSYYYGIDF(SEQ ID NO:20)的CDR-H3。
3.一种成熟抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，该轻链可变域(VL)序列包含(1)包含氨基酸序列KAKQDVTTAVA(SEQ ID NO:21)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYWIPWT(SEQ IDNO:22)的CDR-L3，及重链可变(VH)域序列，该重链可变(VH)域序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDL(SEQ ID NO:23)的CDR-H3。
4.一种成熟抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，该轻链可变域(VL)序列包含(1)包含氨基酸序列KASQDVTNAVA(SEQ ID NO:24)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；及(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ IDNO:11)的CDR-L3，及重链可变域(VH)序列，该重链可变域(VH)序列包含(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；及(3)包含氨基酸序列SSYYYGIDL(SEQ ID NO:25)的CDR-H3。根据实施方式1-9中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体含有人类IgG的Fc序列。
5.如实施方式1至4中任一项的抗-PD-1抗体的抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双功能抗体及线性抗体。
6.如实施方式1至5中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体为多特异性抗体。
7.如实施方式1至6中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其结合至治疗剂。
8.如实施方式1至7中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其结合至标记物。
9.如实施方式8的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该标记物选自由以下组成的组：放射性同位素、荧光染料及酶。
10.一种分离的核酸分子，其编码如实施方式1至4中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。
11.一种表达载体，其编码如实施方式10的核酸分子。
12.一种细胞，其包含如实施方式11的表达载体。
13.一种产生抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养如实施方式12的细胞及自细胞培养物回收抗体。
14.一种组合物，其包含如实施方式1至9中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段及医药上可接受的载体。
15.一种检测来自病患的样本中的PD-1蛋白的方法，其通过使如实施方式1至9中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段接触该样本及检测结合至该PD-1蛋白的该抗-PD-1抗体。
16.如实施方式15的方法，其中该抗-PD-1抗体或其抗原结合片段用于免疫组织化学分析(IHC)或ELISA分析中。
17.一种治疗个体的癌症的方法，其包括向该个体投与有效量的如实施方式14的组合物。
18.如实施方式17的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、乳癌、子宫颈癌、甲状腺癌及唾液腺癌。
19.如实施方式18的方法，其中向该个体进一步投与选自由以下组成的组的治疗剂：抗肿瘤药剂、化学治疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。
20.如实施方式19的方法，其中向该个体进一步投与放射治疗。
21.如实施方式18的方法，其中向该个体进一步投与抗VEGF、VEGFR2或EGFR的治疗抗体。
序列表
SEQ ID NO:1(c1G4_LC核苷酸序列)
CAGCTCGAGGATATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGACTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAACAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTACACTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:2(c1G4_LC氨基酸序列，下划线：经Kabat定义的CDR，参见图8A)
QLEDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYTIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:3(c1G4_HC核苷酸序列)
GAAGTGATGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTAGTAACATCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTTCCTGCAAATGAGCGGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCCTGTATTACTGTGTATCGTATTACTATGGAATAGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:4(c1G4_HC氨基酸序列，下划线：经Kabat定义的CDR，参见图8B)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPEKSLEWVATISGGGSNIYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLFLQMSGLRSEDTALYYCVSYYYGIDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:5(h1G4_LC核苷酸序列)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGACTACTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTACACTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:6(h1G4_LC氨基酸序列，下划线：经Kabat定义的CDR，参见图8A)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:7(h1G4_HC核苷酸序列)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCAACCATTAGTGGTGGTGGTAGTAACATCTACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTATCGTATTACTATGGAATAGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:8(h1G4_HC氨基酸序列，下划线：经Kabat定义的CDR，参见图8B)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWIRQAPGKGLEWVSTISGGGSNIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSYYYGIDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:9(c1G4及h1G4CDR-L1):KASQDVTTAVA
SEQ ID NO:10(c1G4及h1G4CDR-L2):WASTRHT
SEQ ID NO:11(c1G4及h1G4CDR-L3):QQHYTIPWT
SEQ ID NO:12(c1G4及h1G4CDR-H1):FTFSNYGMS
SEQ ID NO:13(c1G4及h1G4CDR-H2):TISGGGSNIY
SEQ ID NO:14(c1G4及h1G4CDR-H3):VSYYYGIDF
SEQ ID NO:15(33B CDR-L1):KASTDVTTAVA
SEQ ID NO:16(33B CDR-L2):WASLRHT:
SEQ ID NO:17(33B CDR-L3):QQHYGIPWT
SEQ ID NO:18(33B CDR-H1):FRFSNYGMS
SEQ ID NO:19(33B CDR-H2):TISGGGSNAY
SEQ ID NO:20(33B CDR-H3):TSYYYGIDF
SEQ ID NO:21(66E CDR-L1):KAKQDVTTAVA
SEQ ID NO:22(66E CDR-L3):QQHYWIPWT
SEQ ID NO:23(66E CDR-H3):VSYYYGIDL
SEQ ID NO:24(711D CDR-L1):KASQDVTNAVA
SEQ ID NO:25(711D CDR-H3):SSYYYGIDL

Claims (21)

1.一种抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，所述轻链可变域(VL)序列包含：
(1)包含氨基酸序列KASQDVTTAVA(SEQ ID NO:9)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；
(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3；
及重链可变域(VH)序列，所述重链可变域(VH)序列包含：
(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；
(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDF(SEQ ID NO:14)的CDR-H3。
2.根据权利要求1所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为亲和力成熟抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，该轻链可变域(VL)序列包含：
(1)包含氨基酸序列KASTDVTTAVA(SEQ ID NO:15)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列WASLRHT(SEQ ID NO:16)的CDR-L2；
(3)包含氨基酸序列QQHYGIPWT(SEQ ID NO:17)的CDR-L3；
及重链可变域(VH)序列，该重链可变域(VH)序列包含：
(1)包含氨基酸序列FRFSNYGMS(SEQ ID NO:18)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列TISGGGSNAY(SEQ ID NO:19)的CDR-H2；
(3)包含氨基酸序列TSYYYGIDF(SEQ ID NO:20)的CDR-H3。
3.根据权利要求1所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为亲和力成熟抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，所述轻链可变域(VL)序列包含：
(1)包含氨基酸序列KAKQDVTTAVA(SEQ ID NO:21)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；
(3)包含氨基酸序列QQHYWIPWT(SEQ ID NO:22)的CDR-L3；
及重链可变(VH)域序列，该重链可变(VH)域序列包含：
(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；
(3)包含氨基酸序列VSYYYGIDL(SEQ ID NO:23)的CDR-H3。
4.根据权利要求1所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为亲和力成熟抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域(VL)序列，所述轻链可变域(VL)序列包含：
(1)包含氨基酸序列KASQDVTNAVA(SEQ ID NO:24)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:10)的CDR-L2；
(3)包含氨基酸序列QQHYTIPWT(SEQ ID NO:11)的CDR-L3；
及重链可变域(VH)序列，该重链可变域(VH)序列包含：
(1)包含氨基酸序列FTFSNYGMS(SEQ ID NO:12)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列TISGGGSNIY(SEQ ID NO:13)的CDR-H2；
(3)包含氨基酸序列SSYYYGIDL(SEQ ID NO:25)的CDR-H3；
根据实施方式1-9中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体含有人类IgG的Fc序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双功能抗体及线性抗体。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为多特异性抗体。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗-PD-1抗体或其抗原结合片段结合至治疗剂。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于抗-PD-1抗体或其抗原结合片段结合至标记物。
9.根据权利要求8所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述标记物选自：放射性同位素、荧光染料及酶。
10.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。
11.一种表达载体，其编码如权利要求10所述的核酸分子。
12.一种细胞，其包含如权利要求11所述的表达载体。
13.一种产生抗-PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求12所述的细胞及自所述细胞的培养物回收抗体。
14.一种组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段及医药上可接受的载体。
15.一种检测来自病患的样本中的PD-1蛋白的方法，其特征在于，使权利要求1至9中任一项的抗-PD-1抗体或其抗原结合片段接触所述样本并检测结合至该PD-1蛋白的该抗-PD-1抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述抗-PD-1抗体或其抗原结合片段用于免疫组织化学分析(IHC)或ELISA分析中。
17.一种如权利要求14所述的组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于制备治疗个体的癌症的药剂。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述癌症选自：黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、经典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、非霍奇金氏淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、乳癌、子宫颈癌、甲状腺癌及唾液腺癌。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于向所述个体进一步给予选自以下的治疗剂：抗肿瘤药剂、化学治疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，向所述个体进一步进行与放射治疗。
21.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，向所述个体进一步给予抗VEGF、VEGFR2或EGFR的治疗抗体。
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