TWI689520B - 抗表皮生長因子受體(egfr)抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體、CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體及其抗原結合片段。亦提供編碼抗EGFR抗體或其抗原結合片段之經分離核酸分子、相關表現載體及宿主細胞。提供製備抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體、CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體及其抗原結合片段之方法。亦提供相關醫藥組合物及其用於治療個體之方法。
Description
本申請案主張2014年5月30日申請之美國臨時申請案第62/005,887號之優先權,該案以全文引用的方式併入本文中。
表皮生長因子受體(亦稱為EGFR、ErbB-1及HER1)為受體之ErbB家族的細胞表面受體,四種密切相關受體酪胺酸激酶之亞家族,包括EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)及Her 4(ErbB-4)。EGFR與配體(諸如表皮生長因子(EGF)、轉型生長因子a(TGF α)、HB-EGF、雙調蛋白、β細胞調節素/BTC、後生因子/EPGN或其他配體)之結合誘導受體二聚及EGFR C端域中數個酪胺酸(Y)殘基(Y992、Y1045、Y1068、Y1148及Y1173)之自體磷酸化。此自體磷酸化引發數個信號轉導級聯(包括MAPK、Akt及JNK路徑)之下游活化,從而引起細胞遷移、黏附及細胞增殖。
EGFR或家族成員之突變、擴增或錯調參與所有上皮癌之約30%。舉例而言,引起EGFR過度表現或過度活性之突變與多種癌症有關,包括肺癌、肛癌、頭頸癌及多形性膠質母細胞瘤。EGFR鑑別為致癌基因使得需要開發針對EGFR之抗癌療法。本發明符合此需求及其他需求。
本發明提供一種抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列N/T/Q-YGVH(SEQ ID NO:4)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列Y-N/A/G/D-T/D/N-P/K/E-FTSRF(SEQ ID NO:9)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY(SEQ ID NO:14)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列I-G/R/S-T/L/P-NIH(SEQ ID NO:20)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KY-A/G-SE-S/T-I-S/R(SEQ ID NO:24)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPT-T/L/S/A/Y(SEQ ID NO:30)之CDR-L3。
在一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含選自由SEQ ID NO:1-3組成之群的胺基酸序列的CDR-H1;(2)包含選自由SEQ ID NO:5-8組成之群的胺基酸序列的CDR-H2;及(3)包含選自由SEQ ID NO:10-13組成之群的胺基酸序列的CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含選自由SEQ ID NO:15-19組成之群的胺基酸序列的CDR-L1;(2)包含選自由SEQ ID NO:21-23組成之群的胺基酸序列的CDR-L2;(3)包含選自由SEQ ID NO:25-29組成之群的胺基酸序列的CDR-L3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列TYYDYEFAY(SEQ ID NO:10)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTT(SEQ ID NO:25)之CDR-L3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可
變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YATEFTSRF(SEQ ID NO:7)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YDDKFTSRF(SEQ ID NO:6)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ
ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
本發明亦提供一種CDR-H2去糖基化之抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變域,該重鏈可變域包含所選包含胺基酸序列Y-A/G/D-D/N-K/E-FTSRF(SEQ ID NO:31)的CDR-H2。在一些實施例中,重鏈可變域進一步包含有包含胺基酸序列N/T/Q-YGVH(SEQ ID NO:4)之CDR-H1及包含胺基酸序列T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY(SEQ ID NO:14)之CDR-H3。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體或其抗原結合
片段進一步包含輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列I-G/R/S-T/L/P-NIH(SEQ ID NO:20)之CDR-L1;包含胺基酸序列KY-A/G-SE-S/T-I-S/R(SEQ ID NO:24)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPT-T/L/S/A/Y(SEQ ID NO:30)之CDR-L3。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體包含人類IgG之Fc序列。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗原結合片段選自由以下組成之群:Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、雙功能抗體及線性抗體。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體為多特異性抗體。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段結合於治療劑。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段結合於標記物。在一些實施例中,根據上述任何實施例(或上述任何實施例如所應用),標記物選自由以下組成之群:放射性同位素、螢光染料及酶。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗體為去海藻糖基化抗體。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段結合於細胞毒性劑。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,細胞毒性劑為美登素(maytansine)或其衍生物。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,美登素或其衍生物為DM-1。
本發明提供一種經分離核酸分子,其編碼根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之抗EGFR抗體或其抗原結合片段。亦提供一種表現載體,其編碼根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之核酸分子。亦提供包含根據上述任何實施例(或如上述任
何實施例所應用)之表現載體的細胞。本發明亦提供一種製備抗體之方法,其包含培養根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之細胞及自細胞培養物回收抗體或其抗原結合片段。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,細胞為哺乳動物細胞。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,哺乳動物細胞為CHO細胞。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,細胞為穩定哺乳動物細胞株。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,穩定哺乳動物細胞株中之任一者為CHO細胞株。
本發明提供一種組合物,其包含根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之抗EGFR抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
本發明提供一種偵測患者之樣品中EGFR蛋白之方法,其藉由使根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之抗EGFR抗體或其抗原結合片段與樣品接觸及偵測結合於EGFR蛋白之抗EGFR抗體來進行。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段用於免疫組織化學分析(IHC)或ELISA分析。
亦提供一種治療個體之癌症的方法,其包含投與個體有效量之根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之組合物。亦提供一種組合物,其包含根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之抗EGFR抗體或其抗原結合片段以用於治療癌症。提供根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之抗EGFR抗體或其抗原結合片段之用途,其係用於製造用於治療癌症之藥物。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,癌症選自結腸直腸癌、肺癌及頭頸癌。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施
例所應用)之一些實施例中,進一步投與個體選自由以下組成之群的治療劑:抗贅生劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,癌症為咽喉癌。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,進一步施與個體放射療法。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之一些實施例中,進一步投與個體選自由以下組成之群的治療劑:抗贅生劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體的KRAS為野生型。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體具有KRASG13D突變。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體的BRAF為野生型。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體具有BRAFV600E突變。
在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體抗艾必妥(Erbitux)或其生物類似物。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體在用艾必妥或其生物類似物時有進展。在根據上述任何實施例(或如上述任何實施例所應用)之某些實施例中,投與包含本文所述之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的組合物的個體用艾必妥或其生物類似物難治癒。
圖1展示經執行以比較獲自CDR-L3/CDR-H3庫之抗EGFR Fab變體與EGFR之結合的ELISA的結果。
圖2展示經執行以比較獲自CDR-L3/CDR-H3庫之全長抗EGFR IgG抗體變體與EGFR之結合的ELISA的結果。
圖3展示經執行以比較HLX05抗體(亦即自製艾必妥(ERBITUX)生物類似物)與獲自CDR-H2庫之抗EGFR抗體變體與EGFR之解離速率的解離速率ELISA的結果。
圖4展示經執行以比較HLX05抗體(亦即自製艾必妥生物類似物抗體)、購自Merck KGaA之ERBITUX®、抗EGFR抗體1-26/2-68、1-26/3-67、#8/#33、#34/#33及利妥昔單抗(rituximab)之直接EGFR結合的ELISA的結果。
圖5展示經執行以比較HLX05、ERBITUX®、利妥昔單抗及抗EGFR抗體1-26/2-68、1-26/3-67、#8/#33及#34/#33之EGFR結合的競爭性ELISA的結果。
圖6A及6B展示對HLX05、ERBITUX®及抗EGFR抗體1-26/2-68、1-26/3-67、#8/#33、#34/#33執行的聚糖分析的結果。
圖7展示經執行以比較HLX05、ERBITUX®及抗EGFR抗體1-26/2-68、1-26/3-67、#8/#33、#34/#33之FcγIII結合的ELISA的結果。
圖8A展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體1-26/2-68之ADCC活性的分析的結果。圖8B展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體#8/#33之ADCC活性的分析的結果。圖8C展示經執行以比較抗EGFR抗體1-26/2-68及1-26/3-67之ADCC活性的分析的結果。圖8D展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體1-26/3-67之ADCC活性的分析的結果。圖8E展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體#34/#33之ADCC活性的分析的結果。圖8F展示經執行以比較抗EGFR抗體#8/#33及
#34/#33之ADCC活性的分析的結果。圖8G展示經執行以比較HLX05、1-26/2-68、1-26/3-67、#8/#33及#34/#33之ADCC活性的分析的定量結果。
圖9A展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體1-26/2-68對A431細胞之抗增殖作用的分析的結果。圖9B展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體#8/#33對A431細胞之抗增殖作用的分析的結果。圖9C展示經執行以比較抗EGFR抗體1-26/2-68及1-26/3-67對A431細胞之抗增殖作用的分析的結果。圖9D展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體1-26/3-67對A431細胞之抗增殖作用的分析的結果。圖9E展示經執行以比較HLX05及抗EGFR抗體#34/#33對A431細胞之抗增殖作用的分析的結果。圖9F展示經執行以比較抗EGFR抗體#8/#33及#34/#33對A431細胞之抗增殖作用的分析的結果。圖9G展示經執行以比較HLX05、1-26/2-68、1-26/3-67、#8/#33及#34/#33對A431細胞之抗增殖作用的分析的定量結果。
圖10描繪量測ERBITUX®、#34/#33、1-26/3-67及1-26/2-68抑制腫瘤生長之能力的A431腫瘤異種移植分析的結果。
圖11展示第3天與第35天之#34/#33、1-26/3-67、1-26/2-68及ERBITUX®的血清含量。
圖12描繪量測HLX05、1-26/3-67、ERBITUX®及安慰劑抑制腫瘤生長之能力的FaDu腫瘤異種移植分析的結果。
圖13描繪量測1-26/3-67+放射療法、ERBITUX®+放射療法及安慰劑+放射療法抑制腫瘤生長之能力的FaDu腫瘤異種移植分析的結果。
圖14A展示經執行以評定HLX07-DM1、HLX07及對照抗體抑制DiFi細胞(KRASWT、BRAFWT)之生長之能力的活體外實驗的結果。圖14B展示經執行以評定HLX07-DM1、HLX07及對照抗體抑制HCT-116
細胞(KRASG13D)之生長之能力的活體外實驗的結果。圖14C展示經執行以評定HLX07-DM1、HLX07及對照抗體抑制HT29細胞(BRAFV600E)之生長之能力的活體外實驗的結果。
圖15A展示在PBMC效應細胞存在下1-26/3-67-FF(亦即「無海藻糖」)、1-26/3-67及對照抗體對DiFi細胞(KRASWT)的ADCC活性。圖15B展示在PBMC效應細胞存在下1-26/3-67-FF(亦即「無海藻糖」)、1-26/3-67及對照抗體對HCT-116細胞(KRASG13D)的ADCC活性。圖15C展示在PBMC效應細胞存在下1-26/3-67-FF(亦即「無海藻糖」)、1-26/3-67及對照抗體對HT29細胞(BRAFV600E)的ADCC活性。
圖16A展示經執行以比較食蟹獼猴中34/33及3/67隨時間之血清濃度的ELISA的結果。圖16B展示經執行以比較食蟹獼猴中HLX05(亦即1-3)及ERBITUX®(亦即4-6)隨時間之血清濃度的ELISA的結果。
圖17展示由穩定細胞株產生之1-26/3-67抗體相對於時間的濃度(mg/ml)。
本發明提供新穎抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體。申請者已意外地發現,與ERBITUX®(西妥昔單抗(cetuximab),一種FDA批准用於治療轉移性結腸直腸癌及頭頸癌之抗EGFR抗體)相比,本文所述之抗EGFR抗體展現增強之治療功效。本文所述之抗EGFR抗體亦展現比ERBITUX®長之半衰期。
在一相關態樣中,本發明提供CDR-H2中缺乏N-糖基化基元之新穎抗EGFR抗體。抗體之輕鏈可變區及/或重鏈可變區內的糖基化(諸如ERBITUX® VH區之Asn 99處的N-聚糖)可因干擾抗原結合而降低抗體之治療功效。另外,此類糖基化可引起一批抗體內之異質性,從而可使功能、免疫原性或穩定性改變。CDR-H2中缺乏糖基化基元之抗EGFR抗體的製備批料中存在較少糖型。
亦提供免疫結合物、編碼本文所述之新穎抗EGFR抗體之核酸及組合物(諸如醫藥組合物)。本發明亦提供使用新穎抗EGFR抗體偵測樣品(諸如活體內或離體樣品)中EGFR之方法、包含此類抗體以用於治療癌症之組合物及此類抗體於製造用於治療癌症之藥物中的用途。
如本文所用之「治療(treatment)」或「治療(treating)」為獲得有益或所要結果(包括臨床結果)之途徑。出於本發明之目的,有益或所要臨床結果包括(但不限於)一或多種以下結果:緩解一或多種由疾病引起之症狀,降低疾病之程度,穩定疾病(例如阻止或延遲疾病之惡化),阻止或延遲疾病之擴散(例如癌轉移),阻止或延遲疾病之復發,延遲或減緩疾病之進展,改善疾病病況,提供疾病之緩解(部分或全部),降低一或多種治療疾病所要之其他藥物之劑量,延遲疾病之進展,提高或改良生活品質,提高重量增加及/或延長存活期。「治療」亦涵蓋癌症之病理性結果(諸如腫瘤體積)降低。本文所提供之方法涵蓋此等治療態樣中之任何一或多者。
術語「再發」、「復發」或「已復發」係指癌症或疾病在臨床評定疾病消失後再現。遠端癌轉移或局部再發之診斷可認作是復發。
術語「難治性」或「抗性」係指癌症或疾病對治療無反應。
術語「輔助療法」係指主要療法(通常手術)後給予之治療。癌症或疾病之輔助療法可包括免疫療法、化學療法、放射療法或激素療法。
術語「維持療法」係指經給予以幫助維持先前治療作用之定期再治療。通常給予維持療法來幫助保持癌症消退或延長對特定療法之反應而與疾病進展無關。
術語「侵襲性癌症」係指擴散至其起始之組織層以外至正常周圍組織中之癌症。侵襲性癌症可為或可不為轉移性的。
術語「非侵襲性癌症」係指極早期癌症或未擴散至起始組織以外之癌症。
腫瘤學中之術語「無進展存活期」係指在治療期間及治療後,癌症不增長之時間長度。無進展存活期包括患者經歷完全反應或部分反應之時間量以及患者經歷穩定疾病之時間量。
腫瘤學中之術語「進展性疾病」可指自治療開始起,歸因於質量增加或腫瘤擴散,腫瘤增長超過百分之20。
「病症」為受益於用抗體治療之任何病狀。舉例而言,具有異常EGFR活性或需要預防異常EGFR活性之哺乳動物。其包括慢性及急性病症或疾病,包括使哺乳動物易患所述病症之彼等病理性病狀。本文中欲治療病症之非限制性實例包括癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)。
如本文所用之「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖(無論惡性或良性),及所有癌前及癌性細胞及組織。
術語「抗體」以最廣泛意義使用且尤其覆蓋例如單一單株抗體(包括促效劑、拮抗劑及中和抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多株抗體、單鏈抗抗體及抗體之片段(參見下文),只要其特異性結合天然多肽及/或展現本發明之生物活性或免疫活性即可。根據一個實施例,抗體結合於標靶蛋白之寡聚形式,例如三聚形式。根據另一實施例,抗體特異性結合於蛋白質,其結合可由本發明之單株抗體(例如本發明之沈積抗體等)抑制。片語抗體之「功能片段或類似物」為具有與所參考抗體相同之定性生物活性的化合物。舉例而言,本發明抗體之功能片段或類似物可為可特異性結合於EGFR之物質。在一個實施例中,抗體可預防或基本上降低EGFR誘導細胞增殖之能力。
「經分離抗體」為已鑑別且自自然環境之組分分離及/或回收的
抗體。其自然環境之污染組分為干擾抗體之診斷或治療用途之物質,且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中,抗體將純化(1)至如勞立法(Lowry method)所測定,大於95重量%之抗體,且最佳大於99重量%;(2)至足以藉由利用旋杯式測序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度;或(3)至均質,其利用SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳銀染色獲得。由於抗體之自然環境之至少一種組分將不存在,所以分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體。然而,經分離抗體通常將由至少一個純化步驟來製備。
基本4鏈抗體單元為異四聚醣蛋白,其由兩條相同之輕(L)鏈及兩條相同之重(H)鏈構成(IgM抗體由基本異四聚體單元以及另一稱作J鏈之多肽的5鏈組成,因此含有10個抗原結合位點,而分泌之IgA抗體可聚合形成多價群集,其包含2-5個基本4鏈單元以及J鏈)。在IgG之情況下,4鏈單元一般為約150,000道爾頓(dalton)。各L鏈經由一個共價二硫鍵連接於H鏈,而兩條H鏈視H鏈同型而定經由一或多個二硫鍵彼此連接。各H及L鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋。各H鏈在N端具有可變域(VH),其後為三個恆定域(CH)(對於α及γ鏈中之每一者)及四個CH域(對於μ及ε同型)。各L鏈在N端具有可變域(VL),其後為位於其另一端之恆定域(CL)。VL與VH對準且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。咸信,特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH與VL配對一起形成單一抗原結合位點。關於不同類別抗體之結構及特性,參見例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr及Tristram G.Parslow(編),Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994,第71頁及第6章。
任何脊椎動物物種之L鏈可基於其恆定域之胺基酸序列指定為稱為κ及λ之兩個明顯不同類型之一。視重鏈之恆定域(CH)之胺基酸序
列而定,免疫球蛋白可歸於不同類別或同型。存在五種免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,其分別具有稱為α、δ、γ、ε及μ之重鏈。基於CH序列及功能之相對較小的差異,將γ及α類別進一步分成亞類,例如人類表現以下亞類:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
術語「可變」係指抗體中可變域之某些區段的序列廣泛不同。V域介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而,可變性並非均勻分佈在可變域之110個胺基酸範圍內。實情為,V區由相對不變之15-30個胺基酸的延伸片段(稱作構架區「FR」)組成,該等延伸片段經具有極大可變性之長度各為9-12個胺基酸的較短區(稱作「高變區」)分隔。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含主要採用β-摺疊構型且藉由三個高變區連接之四個FR,該三個高變區形成連接β-摺疊結構且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分的環。各鏈中之高變區由FR緊密結合在一起,且與另一鏈之高變區一起促使形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。雖然恆定域不直接參與抗體與抗原之結合,但其展現各種效應功能,諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
如本文所用,術語「CDR」或「互補決定區」欲意謂重鏈與輕鏈多肽之可變區內存在的非鄰接抗原組合位點。此等特定區域由如下文獻描述:Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977);Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequences of proteins of immunological interest」(1991);Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987);及MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),其中在彼此比較時該等定義包括胺基酸殘基之重疊或亞群。
儘管如此,使用任一定義來提及抗體或接枝抗體或其變體之CDR意欲屬於如本文所定義及使用之術語的範疇。包涵以上所引用參考文獻中之每一者所定義的CDR的胺基酸殘基如下闡述於表1中作為對比物。
1遵循前述Kabat等人之命名法的殘基編號
2遵循前述Chothia等人之命名法的殘基編號
3遵循前述MacCallum等人之命名法的殘基編號
如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上均質之抗體(亦即構成該群體之個別抗體除了少量存在的可能天然存在之突變外為相同的)獲得的抗體。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外,與包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑對比,各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性外,單株抗體之優勢在於其可在未受其他抗體污染之情況下合成。修飾語「單株」不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言,適用於本發明之單株抗體可由最先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述之融合瘤方法來製備,或可使用重組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中製備(參見例如美國專利第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991),Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)及如下實例中所述之技術自噬菌體抗體庫中分離。
本文之單株抗體包括「嵌合」抗體,其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體中之相應序列相
同或同源,而鏈其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體中之相應序列以及該等抗體之片段相同或同源,只要其顯示本發明之生物活性即可(參見美國專利第4,816,567號;及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文之相關嵌合抗體包括包含源自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體。
「完整」抗體為包含抗原結合位點以及CL及至少重鏈恆定域CH1、CH2及CH3者。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變體。完整抗體較佳具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分,較佳完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段;雙功能抗體;線性抗體(參見美國專利第5,641,870號,實例2;Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995]);單鏈抗體分子;及由抗體片段形成之多特異性抗體。
表述「線性抗體」通常指Zapata等人,Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中所述之抗體。簡言之,此等抗體包含串聯Fd區段對(VH-CH1-VH-CH1),其與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對。線性抗體可為雙特異性或單特異性的。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱作「Fab」片段之相同抗原結合片段,及殘餘「Fc」片段,該名稱反映易於結晶之能力。Fab片段由完整L鏈以及H鏈可變區(VH)及一條重鏈之第一恆定域(CH1)組成。各Fab片段對於抗原結合而言為單價的,亦即其具有單一抗原結合位點。用胃蛋白酶處理抗體產生單一大F(ab')2片段,其大致對應於具有二價抗原結合活性之兩個二硫鍵連接之Fab片段且仍能夠交叉連接抗
原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於CH1域之羧基末端具有少數其他殘基,包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH在本文中指代恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'。最初F(ab')2抗體片段經製備為其間具有鉸鏈區半胱胺酸之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
Fc片段包含兩個H鏈之羧基端部分,其由二硫鍵結合在一起。抗體之效應功能由Fc區中之序列決定,該區亦為由存在於某些類型細胞上之Fc受體(FcR)識別之部分。
「變異Fc區」包含因如本文所定義之至少一個「胺基酸修飾」而不同於天然序列Fc區的胺基酸序列。較佳地,變異Fc區與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比,具有至少一個胺基酸取代,例如天然序列Fc區或親本多肽之Fc區中約1至約10個胺基酸取代且較佳約1至約5個胺基酸取代。在一個實施例中,本文中之變異Fc區與天然序列Fc區具有至少約80%同源性、至少約85%同源性、至少約90%同源性、至少約95%同源性或至少約99%同源性。根據另一實施例,本文中之變異Fc區與親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性、至少約85%同源性、至少約90%同源性、至少約95%同源性或至少約99%同源性。
術語「包含Fc區之多肽」係指包含Fc區之多肽,諸如抗體或免疫黏附素(參見本文別處之定義)。可(例如)在純化多肽期間或藉由重組工程設計編碼多肽之核酸來移除Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)。因此,包含具有本發明之Fc區的多肽(包括抗體)的組合物可包含移除K447殘基之多肽群體、未移除K447殘基之多肽群體或具有含K447殘基及不含K447殘基之多肽的混合物的多肽群體。
抗體「效應功能」係指由抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)引起之彼等生物活性,且其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性;Fc受體結
合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;下調細胞表面受體;及B細胞活化。「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致之胺基酸序列。Fc序列之實例描述於例如(但不限於)Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))中。
「Fv」為含有完整抗原識別位點及結合位點之最小抗體片段。此片段由一個重鏈可變區與一個輕鏈可變區緊密非共價結合之二聚體組成。此兩個域摺疊產生六個高變環(H鏈及L鏈各3個環),其提供用於抗原結合之胺基酸殘基,且賦予抗體抗原結合特異性。然而,甚至單個可變域(或包含僅三個對抗原具有特異性之CDR之Fv的一半)亦具有識別及結合抗原之能力,但親和力比整個結合位點低。
「單鏈Fv」(亦簡寫為「sFv」或「scFv」)為包含VH及VL抗體域連接於單一多肽鏈中之抗體片段。sFv多肽較佳在VH與VL域之間進一步包含使sFv能夠形成抗原結合所需結構之多肽連接子。對於sFv之評述,請參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore編,Springer-Verlag,New York,第269-315頁(1994);前述Borrebaeck 1995。
術語「雙功能抗體」係指藉由在VH與VL域之間用短連接子(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見先前段落)以使V域之鏈間配對而非鏈內配對,從而得到二價片段(亦即具有兩個抗原結合位點之片段)所製備之小抗體片段。雙特異性雙功能抗體為兩個「交叉」sFv片段之異二聚體,其中兩個抗體之VH域及VL域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更詳細描述於例如EP 404,097、WO 93/11161及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
非人類(例如嚙齒動物)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類
抗體之最少序列的嵌合抗體。在最大程度上,人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體),其中接受者高變區之殘基經具有所需抗體特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之高變區的殘基(供體抗體)置換。在一些情況下,人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外,人類化抗體可包含接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體效能。一般而言,人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部,其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環,且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分,通常人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。對於其他細節,參見Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
關於本文中鑑別之多肽及抗體序列的「胺基酸序列一致性百分比(%)」或「同源性」定義為在序列對準後,在考慮任何保守取代作為序列一致性之一部分的情況下,候選序列中與所比較多肽中胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式,例如使用公開可得之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體),達成對準以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可決定量測對準之適當參數,包括達成相對於所比較序列之全長的最大對準所需之任何算法。然而,出於本文之目的,使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.設計且原始程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔,其中其以美國版權登記號
TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California公開獲得。ALIGN-2程式應編譯用於UNIX操作系統,較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
術語「Fc受體」或「FcR」用以描述結合至抗體Fc區的受體。在一個實施例中,本發明之FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體(包括此等受體之對偶基因變體及交替剪接形式)的FcR。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」),其具有類似胺基酸序列,主要在其細胞質域不同。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參見Daëron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中之評述)。該術語包括異型,諸如FcγRIIIA異型:FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及/或FcγRIIA-H131。FcR評述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994);及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR,包括將來鑑別之FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn,其負責輸送母體IgG至胎兒(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
術語「FcRn」指新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn結構上類似於主要組織相容複合體(MHC)且由非共價結合於β2-微球蛋白之α鏈組成。新生兒Fc受體FcRn之多種功能評述於Ghetie及Ward(2000)Annu.Rev.Immunol. 18,739-766中。FcRn在自母體向幼體被動傳遞免疫球蛋白IgG及血清IgG含量調節中起作用。FcRn可充當救助受體,其在細胞內與跨越細胞結合且輸送完整形式之經胞飲IgG,且將其自預設降解
路徑挽救。
人類IgG Fc區之「CH1域」(亦稱為「H1」域之「C1」)通常自約胺基酸118延伸至約胺基酸215(EU編號系統)。
「鉸鏈區」通常定義為自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其他IgG同型之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一個及最後的半胱胺酸殘基置於相同位置而與IgG1序列對準。
Fc區之「下鉸鏈區」通常定義為緊鄰鉸鏈區C端之殘基的延伸序列(亦即Fc區之殘基233至239)。在先前報導中,FcR結合通常歸因於IgG Fc區之下鉸鏈區中的胺基酸殘基。
人類IgG Fc區之「CH2域」(亦稱為「H2」域之「C2」)通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。CH2域獨特之處在於其不與另一域緊密配對。而是兩條N連接之分支碳水化合物鏈插入完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。據推測,碳水化合物可替代域-域配對且幫助穩定CH2域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
「CH3域」(亦稱為「C2」或「H3」域)包含Fc區中CH2域C端殘基的延伸片段(亦即抗體序列之約胺基酸殘基341至C端,通常位於IgG之胺基酸殘基446或447)。
「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合;補體依賴性細胞毒性;Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;下調細胞表面受體(例如B細胞受體;BCR)等。此類效應功能通常需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用例如本文中揭示之各種分析評定。
「C1q」為包括免疫球蛋白Fc區之結合位點的多肽。C1q與兩個絲胺酸蛋白酶C1r及C1s一起形成複合物C1,補體依賴性細胞毒性(CDC)路徑之第一組分。人類C1q可購自例如Quidel,San Diego,CA。
術語「結合域」係指多肽中結合於另一分子之區域。在FcR之情形下,結合域可包含其多肽鏈(例如其α鏈)中負責結合Fc區之一部分。一種適用結合域為FcRα鏈之細胞外域。
具有FcR結合親和力或ADCC活性「改變」之變異IgG Fc的抗體為與親本多肽或包含天然序列Fc區之多肽相比FcR結合活性(例如FcγR或FcRn)及/或ADCC活性增強或降低的抗體。「展現與FcR之結合增加」的變異Fc以高於親本多肽或天然序列IgG Fc之親和力(例如表觀Kd或IC50值較低)結合至少一個FcR。根據一些實施例,與親本多肽相比,結合改良為約3倍,較佳約5、10、25、50、60、100、150、200至500倍,或結合改良約25%至1000%。「展現與FcR之結合降低」的多肽變體以低於親本多肽之親和力(例如較高表觀Kd或較高IC50值)結合至少一個FcR。與親本多肽相比結合減少可為約40%或更多結合減少。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式,其中結合於存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)的所分泌Ig使此等細胞毒效應細胞能夠特異性結合於帶有抗原之標靶細胞且隨後以細胞毒素殺滅標靶細胞。抗體「裝備」細胞毒性細胞且完全為此殺滅所需。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII,而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)之第464頁上表3中。為評定相關分子之ADCC活性,可執行活體外ADCC分析,諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或以下實例中所述之活體外ADCC分析。用於該等分析之適用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外,可例如在Clynes等人,PNAS USA 95:652-656(1998)中所揭示之動物模型中活體內評定相關
分子之ADCC活性。
包含「展現增加之ADCC」或在人類效應細胞存在下比具有野生型IgG Fc之多肽或親本多肽有效地介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)的變異Fc區的多肽為在分析中具有變異Fc區之多肽與具有野生型Fc區之多肽(或親本多肽)之量基本上相同時活體外或活體內實質上更有效調節ADCC的多肽。一般而言,此類變體使用此項技術中已知之任何活體外ADCC分析鑑別,諸如用於測定ADCC活性之分析或方法,例如在動物模型等中。在一個實施例中,較佳變體比野生型Fc(或親本多肽)約5倍至約100倍(例如約25至約50倍)有效地調節ADCC。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下溶解標靶細胞。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組分(C1q)結合於與其同源抗原結合之(適當亞類之)抗體而起始。為評定補體活化,可進行CDC分析,例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。在美國專利第6,194,551B1號及WO99/51642中描述Fc區胺基酸序列改變且C1q結合能力增大或減小之多肽變體。此等專利公開案之內容以引用的方式明確併入本文中。亦參見Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
如本文所揭示之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物的「有效量」為足以執行特別陳述之目的的量。「有效量」可憑經驗及藉由與所述目的相關之已知方法確定。
術語「治療有效量」指如本文所揭示之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物有效「治療」哺乳動物(亦稱為患者)之疾病或病症的量。在癌症之情形下,如本文所揭示之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物之治療有效量可減少癌細胞數目;減少腫瘤尺寸或重量;抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳終止)癌細胞浸潤至周邊器官中;抑制(亦即在
一定程度上減緩或終止)腫瘤轉移;在一定程度上抑制腫瘤生長;及/或在一定程度上減少一或多種與癌症相關之症狀。在如本文所揭示之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物可阻止現有癌細胞生長及/或殺滅現有癌細胞之情況下,其可為細胞生長抑制及/或細胞毒性劑。在一個實施例中,治療有效量為生長抑制量。在另一實施例中,治療有效量為延長患者存活期之量。在另一實施例中,治療有效量為改良患者之無進展存活期的量。
如本發明所揭示之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物的「生長抑制量」為能夠在活體外或活體內抑制細胞、尤其腫瘤(例如癌細胞)生長之量。可憑經驗及藉由已知方法或藉由本文中所提供之實例來測定用於抑制贅生性細胞生長之本發明之多肽、抗體、拮抗劑或組合物的「生長抑制量」。
本發明之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物之「細胞毒性量」為能夠在活體外或活體內使細胞、尤其腫瘤(例如癌細胞)破壞的量。用於抑制贅生性細胞生長的本發明之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物之「細胞毒性量」可憑經驗及藉由此項技術中已知之方法確定。
本發明之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物之「生長抑制量」為能夠在活體外或活體內抑制細胞、尤其腫瘤(例如癌細胞)生長的量。用於抑制贅生性細胞生長之本發明之抗EGFR抗體(或其片段)或組合物的「生長抑制量」可憑經驗及藉由已知方法或藉由本文所提供之實例確定。
如本文所使用,「醫藥學上可接受」或「藥理學上相容」意謂不為生物學上或其他方面不適宜之物質,亦即,該物質可併入投與患者之醫藥組合物中而不會引起任何顯著不當生物學作用或以有害方式與含有其之組合物的任何其他組分相互作用。醫藥學上可接受之載劑或賦形劑較佳滿足毒理學及製造測試之所要求標準及/或包括於美國食
品藥物管理局(U.S.Food and Drug administration)制定之非活性成分導引(Inactive Ingredient Guide)中。
術語「偵測」意欲包括確定物質是否存在或對物質(諸如EGFR)之量進行定量。因此,該術語指本發明之物質、組合物及方法用於定性及定量測定之用途。一般而言,用於偵測之特定技術對於實踐本發明並不關鍵。
舉例而言,本發明之「偵測」可包括:觀察EGFR基因產物、mRNA分子或EGFR多肽是否存在;EGFR多肽之含量或結合於標靶之量的變化;生物功能/EGFR多肽之活性變化。在一些實施例中,「偵測」可包括偵測野生型EGFR含量(例如mRNA或多肽含量)。偵測可包括將在與對照相比時在10%與90%之間的任何值之變化(增加或減少)或在30%與60%之間或超過100%的任何值之變化(增加或減少)定量。偵測可包括將在2倍至10倍(包含2倍及10倍)之間或更高(例如100倍)的任何值之變化定量。
當在本文中使用時,詞語「標記物」係指直接或間接結合於抗體之可偵測化合物或組合物。標記物可自身可偵測(例如放射性同位素標記物或螢光標記物),或在酶標記物之情況下,可催化受質化合物或組合物的化學改變,此改變為可偵測的。
在本文中,提及「約」一個值或參數係指此技術領域之熟習此項技術者容易知曉的相應值之通常誤差範圍。本文中,提及「約」一個值或參數包括(及描述)針對該值或參數本身之態樣。舉例而言,提及「約X」之描述包括「X」之描述。
應瞭解,本文中所描述的本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由態樣及實施例組成」及「基本上由態樣及實施例組成」。
本文中引用之包括專利申請案及公開案的所有參考文獻均以全
文引用的方式併入。
本發明基於結合表皮生長因子受體(EGFR)之新穎抗體之鑑別。抗EGFR抗體可用於多種治療及診斷方法中。舉例而言,抗EGFR抗體可單獨或與其他藥劑組合用於治療特徵為異常EGFR表現或異常EGFR活性的疾病,包括例如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等。本文所提供之抗體亦可用於偵測患者或患者樣品中之EGFR蛋白,其藉由投與患者抗EGFR抗體及偵測結合於患者樣品(例如活體內或離體)之EGFR蛋白的抗EGFR抗體,或藉由使抗EGFR抗體與患者之樣品接觸及定性或定量偵測結合於EGFR蛋白之抗EGFR抗體。
表皮生長因子受體或「EGFR」(亦稱為例如ERBB、ERBB1、HER1、PIG61、mENA、細胞生長抑制蛋白40、細胞增殖誘導蛋白61及EC 2.7.10.1)為受體之ErbB家族之成員,四種密切相關受體酪胺酸激酶之亞家族。EGFR藉由結合其特異性配體(諸如表皮生長因子(EGF)、TGF α、結合肝素之EGF樣生長因子、雙調蛋白、β細胞調節素(BTC)、後生因子(EPGN)及其他)而活化,接著EGFR進行二聚及酪胺酸自體磷酸化。自體磷酸化引起例如磷脂醯基3-激酶(PI3K)、磷脂酶(PL)C-g1、Akt、Ras、Raf及有絲分裂原活化之蛋白激酶(MAPK)的下游活化及與細胞增殖、運動性、黏附及遷移有關的其他信號轉導級聯。異常EGFR表現或EGFR活性與多種癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)有關。
抗EGFR抗體為以足夠親和力及特異性結合於EGFR之抗體。較佳地本文所提供之抗EGFR抗體(或其抗原結合片段)可在靶向及干擾涉及EGFR活性之疾病或病狀中用作治療劑。抗EGFR抗體通常不結合於其他ERBb家族,諸如Her2/Neu/ErbB2、Her3/ERBb3或Her4/ERBb4。較佳地,抗EGFR抗體為重組人類化抗EGFR單株抗體。根據一個實施
例,抗EGFR抗體包含本文所揭示抗體中之任一者的CDR、可變重鏈區及/或可變輕鏈區。
在某些實施例中,抗EGFR抗體(或其抗原結合片段)為抗EGFR抗體之變體,該抗EGFR抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及包含胺基酸序列TYYDYEFAY(SEQ ID NO:10)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTT(SEQ ID NO:25)之CDR-L3,其中該變體在SEQ ID NO:5、10、15、21及/或25中之一或多者中包含至少一個胺基酸取代。在一些實施例中,變體在SEQ ID NO:5、10、15、21及/或25中之一或多者中包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10個胺基酸取代。在某些實施例中,胺基酸取代為保守胺基酸取代。在某些實施例中,胺基酸取代不會實質上降低抗體結合抗原之能力。舉例而言,可進行不會實質上降低EGFR結合親和力之保守改變(例如,如本文所提供之保守取代)。抗EGFR抗體變體之結合親和力可使用以下實例中所述之方法評定。
保守取代在表2中以標題「保守取代」展示。更多實質性變化以標題「例示性取代」提供於表2中,且參考胺基酸側鏈類別在下文進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩選產物之所要活性,例如保留/改良之EGFR結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。
非保守取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。一種例示性取代變體為親和力成熟抗體,其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)方便地產生。簡言之,使一或多個CDR殘基突變且在噬菌體上呈現變異抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)篩選。可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)))及/或SDR(a-CDR)中用待測試結合親和力之所得變異VH或VL進行此類改變。藉由建構及自第二庫再選擇達成之親和力成熟例如描述於Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。
在親和力成熟之一些實施例中,藉由多種方法之任一者(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生第二庫。接著篩選庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法,其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之
HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。特定言之,通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體(或其抗原結合片段)包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列N/T/Q-YGVH(SEQ ID NO:4)之CDR-H1;包含胺基酸序列Y-N/A/G/D-T/D/N-P/K/E-FTSRF(SEQ ID NO:9)之CDR-H2;及包含胺基酸序列T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY(SEQ ID NO:14)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列I-G/R/S-T/L/P-NIH(SEQ ID NO:20)之CDR-L1;包含胺基酸序列KY-A/G-SE-S/T-I-S/R(SEQ ID NO:24)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPT-T/L/S/A/Y(SEQ ID NO:30)之CDR-L3。在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含選自由SEQ ID NO:1-3組成之胺基酸序列的CDR-H1;包含選自由SEQ ID NO:5-8組成之胺基酸序列的CDR-H2;及包含選自由SEQ ID NO:10-13組成之胺基酸序列的CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含選自由SEQ ID NO:15-19組成之胺基酸序列的CDR-L1;包含選自由SEQ ID NO:21-23組成之胺基酸序列的CDR-L2;及包含選自由SEQ ID NO:25-29組成之胺基酸序列的CDR-L3。本文所述之CDR之序列提供於下表3中。
在某些實施例中,抗EGFR抗體(或其抗原結合片段)包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及包含胺基酸序列TYYDYEFAY(SEQ ID NO:10)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTT(SEQ ID NO:25)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-
H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;包含胺基酸序列YATEFTSRF(SEQ ID NO:7)之CDR-H2;及包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;包含胺基酸序列YDDKFTSRF(SEQ ID NO:6)之CDR-H2;及包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYGSESIS
(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
在某些實施例中,抗EGFR抗體包含輕鏈可變域(VL),其包含SEQ ID NO:32-35中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中,抗EGFR抗體包含重鏈可變域(VH),其包含SEQ ID NO:36-39中所闡述之胺基酸序列。下文提供SEQ ID NO:32-39之胺基酸序列。
SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:33
SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:35
SEQ ID NO:36
SEQ ID NO:37
SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:39
在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:32中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域及包含SEQ ID NO:38中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域。在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:32中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域及包含SEQ ID NO:37中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域。在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:33中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域及包含SEQ ID NO:36中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域。在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域及包含SEQ ID NO:36中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域。在某些實施例中,抗EGFR抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域及包含SEQ ID NO:39中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域。
在所有可能之逐對組合中,重鏈及輕鏈可變域組合產生多種抗EGFR抗體。
在某些實施例中,抗EGFR抗體在CDR-H2中缺乏N-糖基化基元(「CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體」)。治療性抗體之重鏈或輕鏈可
變區中的糖基化(諸如ERBITUX®之VH區之Asn 99處的N-聚糖)可在一批抗體內引起差異,從而可使功能、免疫原性或穩定性改變。
在某些實施例中,CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體包含重鏈可變域,其包含有包含胺基酸序列Y-A/G/D-D/N-K/E-FTSRF(SEQ ID NO:31)之CDR-H2。在某些實施例中,CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體或其抗原結合片段進一步包含重鏈,其包含有包含胺基酸序列N/T/Q-YGVH(SEQ ID NO:4)之CDR-H1及包含胺基酸序列T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY(SEQ ID NO:14)之CDR-H3。在某些實施例中,CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體或其抗原結合片段進一步包含輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列I-G/R/S-T/L/P-NIH(SEQ ID NO:20)之CDR-L1;包含胺基酸序列KY-A/G-SE-S/T-I-S/R(SEQ ID NO:24)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPT-T/L/S/A/Y(SEQ ID NO:30)之CDR-L3。上述CDR之序列提供於下表4中。
分析抗體糖基化之方法包括(但不限於)例如層析(諸如陽離子交換層析(CEX)或液相層析)、質譜(諸如電噴霧電離質譜)及毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉。此類方法描述於例如以下文獻中:Jung等人,(2011)Curr Op Biotechnol.22(6):858-67;Cummings RD,Etzler ME.Antibodies and Lectins in Glycan Analysis.在Varki A,Cummings RD,Esko JD等人編輯.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press;2009.第45章中;Mulloy B,Hart GW,Stanley P.Structural Analysis of Glycans.在Varki
A,Cummings RD,Esko JD等人編輯.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press;2009.第47章中;Leymarie等人,(2012)Anal Chem.84(7):3040-3048;Fernandez(2005)European Biopharmaceutical Review.第106-110頁;及Raju,T.(2013)Methods Mol Biol.988:169-180。
在某些實施例中,相較於抗EGFR抗體對EGFR之同源物(諸如Her2/ERBb2、Her3/ERBb3或Her4/ERBb4),其對EGFR具有較強結合親和力。通常,抗EGFR抗體「特異性結合」於EGFR(亦即,結合親和力(Kd)值不超過約1×10-7M,較佳不超過約1×10-8且最佳不超過約1×10-9M),但對ERBb家族之成員的結合親和力比其對EGFR弱至少約50倍、或至少約500倍、或至少約1000倍。特異性結合於EGFR之抗EGFR抗體可為如上文所定義之抗體之各種類型中之任一者,但較佳為人類化或人類抗體。
在一些實施例中,如藉由此項技術中已知之方法(諸如ELISA、螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA))所測定,抗EGFR抗體結合於非標靶蛋白(諸如Her2/ERBb2、Her3/ERBb3或Her4/ERBb4)之程度少於抗體與EGFR之結合的約10%。特異性結合可例如藉由相較於對照分子(其一般為不具有結合活性之類似結構分子)之結合測定一種分子之結合來量測。舉例而言,特異性結合可藉由與類似於標靶之對照分子(例如過量未標記標靶)競爭來測定。在此情況下,若標記之標靶與探針之結合由過量未標記標靶競爭抑制,則表明特異性結合。本文所用之術語「特異性結合」或「特異性結合於」或「特異於」特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基可由例如對該標靶之Kd為至少約10-4M、或者至少約10-5M、或者至少約10-6M、或者至少約10-7M、或者至少約10-8M、或者至少約10-9M、或者至少約10-10M、或者至少約10-11M、或者至少約10-12M或更大的分子展
現。在一個實施例中,術語「特異性結合」係指如下結合:其中分子結合於特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而不會實質上結合於任何其他多肽或多肽抗原決定基。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為治療性抗體對腫瘤細胞之作用機制。ADCC為細胞介導之免疫防禦,由此免疫系統之效應細胞有效溶解標靶細胞(例如癌細胞),該標靶細胞之膜表面抗原已與特異性抗體(例如本文所述之抗EGFR抗體)結合。在一些實施例中,如藉由例如實例中所述之分析所展現,抗EGFR抗體展現與ERBITUX®類似的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。舉例而言,在某些實施例中,本文所述之抗EGFR抗體之ADCC效應功能活性為ERBITUX®之ADCC效應功能活性的至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%或大於100%(例如約105%、約106%、約107%、約108%、約109%、約110%、約111%、約112%、約113%、約114%、約115%、約116%、約117%、約118%、約119%、約120%、約121%、約122%、約123%、約124%、約125%或約130%),包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,抗EGFR抗體對FcγRIIIa展現類似於ERBITUX®之結合親和力。在某些實施例中,如實例中所述,與FcγRIIIa之結合由ELISA展現。舉例而言,抗EGFR對FcγRIIIa之結合親和力比ERBITUX®(西妥昔單抗)對FcγRIIIa之結合親和力高約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%或大於100%(例如約105%、約106%、約107%、約108%、約109%、約110%、約111%、約112%、約113%、約114%、約115%、約116%、約117%、約118%、約119%、約120%、約121%、約
122%、約123%、約124%、約125%或大於約125%)。
在某些實施例中,抗EGFR抗體以約0.1pM至200pM(0.2nM)之間的Kd(例如約0.1pM、約0.25pM、約0.5pM、約0.75pM、約1pM、約5pM、約10pM、約20pM、約30pM、約40pM、約50pM、約60pM、約70pM、約80pM、約90pM、約100pM、約110pM、約120pM、約130pM、約140pM、約150pM、約160pM、約170pM、約180pM、約190pM或大於約190pM,包括此等值之間的任何範圍)結合人類EGFR。在某些實施例中,抗EGFR抗體與EGFR之結合親和力比ERBITUX®(西妥昔單抗)與EGFR之結合親和力高約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%或大於約100%(例如約105%、約110%、約120%或約130%)。在某些實施例中,抗EGFR與EGFR之結合親和力比ERBITUX®(西妥昔單抗)與EGFR之結合親和力高約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.25倍、約2.5倍、約2.75倍、約3倍、約3.25倍、約3.5倍、約3.75倍、約4倍、約4.25倍、約4.5倍、約4.75倍或大於約4.75倍,包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體的活體內半衰期比ERBITUX®延長。在某些實施例中,本文所述之抗EGFR抗體的活體內半衰期不短於ERBITUX®之活體內半衰期。
在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體展現類似於ERBITUX®(西妥昔單抗)或其生物類似物之藥物動力學特性。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體展現之AUC(曲線下面積)為ERBITUX®(西妥昔單抗)或其生物類似物之血清濃度-時間曲線之約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、
約90%、約95%或大於95%(諸如約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%),包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,抗體包含人類IgG(例如人類IgG1或人類IgG4)之Fc序列。在某些實施例中,Fc序列已改變或以其他方式變化以使得其缺乏抗體依賴性細胞毒性(ADCC)效應功能,該效應功能通常與其與Fc受體(FcR)之結合有關。存在可改變效應功能的Fc序列之變化或突變的多個實例。舉例而言,WO 00/42072及Shields等人,J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述與FcR之結合改良或降低之抗體變體。此等出版物之內容以引用之方式特別併入本文中。抗體可為Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段;雙功能抗體及線性抗體形式。此外,抗體可為結合於EGFR但亦結合一或多種其他標靶且抑制其功能的多特異性抗體。抗體可結合於治療劑(例如細胞毒性劑、放射性同位素及化學治療劑)或標記物以偵測患者樣品中之EGFR或藉由成像(例如放射性同位素、螢光染料及酶)活體內偵測EGFR。其他修飾包括毒素結合於本文所提供之抗EGFR抗體。
亦涵蓋編碼抗EGFR抗體之核酸分子、包含編碼本文所述之CDR及/或重鏈可變域及/或輕鏈可變域之核酸分子的表現載體及包含該等核酸分子之細胞。此等抗體可用於本文所述之療法中且用於偵測患者樣品中之EGFR蛋白(例如經由FACS、免疫組織化學(IHC)、ELISA分析)或患者體內之EGFR蛋白。
單株抗體可例如使用融合瘤法(諸如Kohler及Milstein,Nature,256:495(1975)所述之融合瘤法)製備,或可藉由重組DNA法(美國專利第4,816,567號)製得,或可藉由本文以下實例中所述之方法製備。在融合瘤方法中,通常用免疫劑使小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物免疫以得到產生或能夠產生與免疫劑特異性結合之抗體的淋巴細胞。或
者,淋巴細胞可在活體外免疫。
免疫劑通常包括多肽或相關蛋白質之融合蛋白或包含該蛋白質之組合物。一般而言,若需要人類來源之細胞,則使用周邊血液淋巴細胞(「PBL」);或若需要非人類哺乳動物來源,則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。接著,使用諸如聚乙二醇之適合融合劑使淋巴細胞與永生化細胞株融合以形成融合瘤細胞。Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(New York:Academic Press,1986),第59-103頁。永生化細胞株通常為經轉型之哺乳動物細胞,尤其為嚙齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。可將融合瘤細胞於適合培養基中培養,該培養基較佳含有一或多種抑制未融合永生化細胞之生長或存活的物質。舉例而言,若親本細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT),則用於融合瘤之培養基中通常包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基),該等物質會阻止HGPRT缺陷細胞生長。
較佳永生化細胞株為有效融合、藉由所選抗體產生細胞來支持抗體之穩定高水平表現及對諸如HAT培養基之培養基敏感的細胞株。更佳之永生化細胞株為鼠類骨髓瘤株,其可獲自例如沙克研究院細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California)及美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)。亦已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株。Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS(Marcel Dekker,Inc.:New York,1987)第51-63頁。
接著可分析培養融合瘤細胞之培養基中針對該多肽之單株抗體的存在。可藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))測定由融合瘤細胞產生之單株抗
體的結合特異性。此類技術及分析為此項技術中所已知。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson及Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)之史卡查分析(Scatchard analysis)測定。
所要融合瘤細胞鑑別後,可藉由限制稀釋程序對純系進行次選殖且藉由前述Goding之標準方法生長。出於此目的之適合培養基包括例如杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)及RPMI-1640培養基。或者,融合瘤細胞可以腹水形式活體內生長於哺乳動物中。
次純系所分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)自培養基或腹水液分離或純化。
單株抗體亦可藉由重組DNA法製得,諸如美國專利第4,816,567號中描述之方法。編碼本文所提供之單株抗體的DNA可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及測序。本文所提供之融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。分離後,可將DNA置於表現載體中,接著轉染於宿主細胞(諸如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中(否則該等宿主細胞不會產生免疫球蛋白),獲得重組宿主細胞中單株抗體之合成。DNA亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列替代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號;Morrison等人,前述),或藉由將非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價接合來修飾。此類非免疫球蛋白多肽可取代本文所提供之抗體之恆定域,或可取代本文所提供之抗體的一個抗原組合位點的可變域以產生嵌合二價抗體。
在某些實施例中,本發明提供之抗EGFR抗體由穩定哺乳動物細胞株表現。在某些實施例中,本發明提供之抗EGFR抗體由穩定哺乳
動物細胞株以約2.0公克/公升、約2.5公克/公升、約3.0公克/公升、約3.5公克/公升、約4.0公克/公升、約4.5公克/公升、約5.0公克/公升、約5.5公克/公升、約6公克/公升、約6.5公克/公升、約7.0公克/公升或大於約7.0公克/公升(包括此等值之間的任何範圍)的力價表現。在某些實施例中,表現本發明提供之抗EGFR抗體的穩定哺乳動物細胞株為CHO細胞株。
在某些實施例中,抗體為單價抗體。用於製備單價抗體之方法為此項技術中已知。舉例而言,一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈及經修飾之重鏈的重組表現。一般在Fc區之任一點截斷重鏈以阻止重鏈交聯。或者,以另一胺基酸殘基取代相關半胱胺酸殘基或使其缺失以阻止交聯。
活體外方法亦適用於製備單價抗體。可使用(但不限於)此項技術中已知之技術實現抗體之消化以產生其片段、尤其Fab片段。
抗體可為人類化抗體或人類抗體。非人類(例如鼠類)抗體之人類化形式為通常含有源自非人類免疫球蛋白之最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體),其中接受者CDR之殘基由具有所要特異性、親和力及能力的非人類物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR(供體抗體)的殘基置換。在一些情況下,人類免疫球蛋白之Fv構架殘基係經相應非人類殘基置換。人類化抗體亦可包含在接受者抗體中及在所引入之CDR或構架序列中均不存在之殘基。一般而言,人類化抗體可包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部,其中全部或實質上全部CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等FR區。人類化抗體較佳亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少
一部分,通常人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
一般而言,人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基,其通常自「輸入」可變域獲得。根據一個實施例,人類化可基本上遵循Winter及同事之方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)),藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此,此類「人類化」抗體為如下抗體(美國專利第4,816,567號),其中實質上小於完整人類可變域經來自非人類物種之相應序列取代。實際上,人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能之一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。
作為人類化之替代,可產生人類抗體。舉例而言,目前可產生在無內源免疫球蛋白產生存在下在免疫後能夠產生人類抗體完整譜系之轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言,已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH)基因的純合子缺失引起對內源抗體產生之完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變小鼠中將在抗原攻擊之後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人,PNAS USA,90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993);Bruggemann等人,Year in Immunol.,7:33(1993);美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591,669號;第5,545,807號;及WO 97/17852。或者,可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠)中來製備人類抗體。在攻擊之後,觀察人類抗體產生,其在所有方面與在人類中所
見極其類似,包括基因重排、組合及抗體譜系。此方法例如描述於如下文獻中:美國專利第5,545,807號;第5,545,806號;第5,569,825號;第5,625,126號;第5,633,425號;及第5,661,016號,及Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992);Lonberg等人,Nature,368:856-859(1994);Morrison,Nature,368:812-813(1994);Fishwild等人,Nature Biotechnology,14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996);Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
或者,可使用噬菌體呈現技術(McCafferty等人,Nature 348:552-553[1990])自未免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此技術之一個實施例,將構架中之抗體V域序列選殖於絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要鞘蛋白基因中,且以功能性抗體片段呈現於噬菌體粒子之表面上。噬菌體呈現可以多種形式執行,例如如下文在實例部分中所述或如例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)中所評述。若干V基因區段來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)自源自免疫小鼠之脾的V基因的隨機組合小庫分離出多種抗噁唑酮抗體。可構築未免疫人類供體之V基因的譜系,且可基本上遵循由Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)所述之技術分離多種抗原(包括自體抗原)之抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。
如上所討論,人類抗體亦可由活體外活化之B細胞產生(參見美國專利5,567,610及5,229,275)。
人類抗體亦可使用此項技術中已知之各種技術製備,包括噬菌體呈現庫。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);
Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77頁(1985)及Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
多特異性抗體為對兩種或兩種以上不同抗原具有結合特異性的單株、較佳人類或人類化抗體(例如雙特異性抗體對至少兩種抗原具有結合特異性)。舉例而言,結合特異性中之一者可針對a5~1蛋白,另一者可針對任何其他抗原。根據一個較佳實施例,另一抗原為細胞表面蛋白或受體或受體亞單位。舉例而言,細胞表面蛋白可為自然殺手(NK)細胞受體。因此,根據一個實施例,本發明之雙特異性抗體可結合EGFR與例如第二細胞表面受體。
製備雙特異性抗體之適合方法為此項技術中所熟知。舉例而言,雙特異性抗體之重組製備基於共表現兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對,其中兩條重鏈具有不同特異性。Milstein及Cuello,Nature,305:537-539(1983)。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈隨機分配,故此等融合瘤(四重融合瘤,quadromas)產生十個不同抗體分子之潛在混合物,其中僅一個抗體分子具有正確之雙特異性結構。正確分子之純化通常藉由親和層析步驟實現。類似程序揭示於WO 93/08829中及Traunecker等人,EMBO,10:3655-3659(1991)中。
具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)之抗體可變域可與免疫球蛋白恆定域序列融合。該融合較佳與免疫球蛋白重鏈恆定域,包含鉸鏈區、CH2區及CH3區之至少一部分。較佳使含有輕鏈結合必需位點之第一重鏈恆定區(CH 1)存在於至少一個融合中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(必要時)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入各別表現載體中,且共轉染於適合宿主有機體中。對於產生雙特異性抗體之其他細
節,參見例如Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
亦已描述直接由重組細胞培養物製備及分離雙特異性抗體片段之各種技術。舉例而言,使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接至兩種不同抗體之Fab'部分。在鉸鏈區還原抗體均二聚體以形成單體,接著使其再氧化以形成抗體異二聚體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。Hollinger等人,PNAS USA,90:6444-6448(1993)描述之「雙功能抗體」技術提供製備雙特異性抗體片段之替代性機制。該等片段包含VH,其經由過短而使得同一鏈上之兩個域之間無法配對的連接子連接至VL。因此,使得一個片段之VH及VL域與另一片段之互補VL及VH域配對,從而形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製備雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)。
亦涵蓋具有兩價以上的抗體。舉例而言,可製備三特異性抗體。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
異結合抗體由兩種共價接合之抗體構成。已提出此類抗體可例如使免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染。WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089。預期抗體可在活體外使用合成蛋白質化學中之已知方法(包括涉及交聯劑之方法)製備。舉例而言,可使用二硫基交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。適用於此目的之試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯及例如美國專利第4,676,980號中所揭示之試劑。
可能需要關於效應功能修飾本文所提供之抗體,以便增強例如
抗體治療癌症之有效性。舉例而言,可將半胱胺酸殘基引入Fc區,從而使得在此區域中形成鏈間二硫鍵。由此產生之均二聚抗體可具有改良之內化能力及/或增加之補體介導之細胞殺滅及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人,J.Exp.Med.,176:1191-1195(1992)及Shapes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。具有增強之抗腫瘤活性之均二聚抗體亦可使用異雙功能性交聯劑製備,如Wolff等人,Cancer Research,53:2560-2565(1993)中所描述。或者,抗體可經工程改造以具有雙Fc區且可從而具有增強之補體溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design3:219-230(1989)。
可進行Fc區序列之突變或改變以改良FcR結合(例如FcγR、FcRn)。根據一個實施例,與天然IgG或親本抗體相比,本發明之抗體具有選自由ADCC、CDC及改良之FcRn結合組成之群的至少一個改變之效應功能。數個適用特定突變之實例描述於Shields,RL等人,(2001)JBC 276(6)6591-6604;Presta,L.G.,(2002)Biochemical Society Transactions 30(4):487-490;及WO 00/42072中。
根據一個實施例,Fc受體突變為取代至少一個選自由以下組成之群的位置:Fc區之238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439,其中Fc區中之殘基根據EU編號系統編號。在一些實施例中,Fc受體突變為D265A取代。在一些實施例中,Fc受體突變為N297 A取代。其他適合突變闡述於美國專利第7,332,581號中。
在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體去海藻糖基化(亦即
「去海藻糖基化抗EGFR抗體」或「非海藻糖基化抗EGFR抗體」)。「去海藻糖基化抗體」或「非海藻糖基化抗體」係指如下IgG1或IgG3同型之抗體,其在具有減少之海藻糖殘基含量之Asn297處之Fc區中具有改變的糖基化模式。當核心海藻糖基化二觸角複合寡醣糖基化以多達2個Gal殘基封端時,在Asn297處發生人類IgG1或IgG3之糖基化。視末端Gal殘基之量而定,將此等結構命名為GO、G1(a1,6或a1,3)或G2聚糖殘基(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗體Fc部分之CHO型糖基化由例如Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述。於未經糖基修飾之CHO宿主細胞中重組表現的抗體通常在Asn297處以至少85%之量海藻糖基化。在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體具有減少之海藻糖殘基含量。在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體之糖基化模式中無海藻糖。通常已知抗體中之典型糖基化殘基位置為根據EU編號系統297位置處之天冬醯胺(「Asn297」)。
因此,在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體包含Fc序列,其經改變或以其他方式變化以使得其海藻糖殘基含量減少或其糖基化模式中無海藻糖。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體包含Fc序列,其在根據EU編號系統之位置297處具有改變。
在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體藉由能夠產生低海藻糖基化或去海藻糖基化聚糖之宿主細胞製備。已形成可產生去海藻糖基化抗體之穩定哺乳動物宿主細胞株且其描述於如下文獻中,例如Yamane-Ohnuki等人,(2004)Biotechnol Bioeng.87,614-622;Mori等人,(2004)Biotechnol Bioeng.88,901-908;Kanda等人,(2006)Biotechnol Bioeng.94,680-688;Kanda(2007)J Biotechnol.130,300-310;Imai-Nishiya(2007)BMC Biotechnol 7,84;Yamane-
Ohnuki及Satoh(2009)mAbs 1,230-236。在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體表現於經糖修飾宿主細胞中,該經糖修飾宿主細胞經工程改造以表現b(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性。在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體表現於經糖修飾宿主細胞中,該經糖修飾宿主細胞中之1,6-海藻糖基轉移酶活性已降低或去除。關於製備經糖修飾宿主細胞之細節,參見例如US 6,946,292。可例如藉由醱酵條件(例如,醱酵時間)或藉由至少兩種具有不同海藻糖基化量之抗體的組合來預先確定抗體海藻糖基化之量。此類去海藻糖基化抗體及相應糖基工程改造方法描述於如下文獻中:WO 2005/044859,WO 2004/065540,WO 2007/031875,Umana等人,Nature Biotechnol.17(1999)176-180,WO 99/154342,WO 2005/018572,WO 2006/116260,WO 2006/114700,WO 2005/011735,WO 2005/027966,WO 97/028267,US 2006/0134709,US 2005/0054048,US 2005/0152894,WO 2003/035835,WO 2000/061739。此等經糖基工程改造之抗體具有增加之ADCC。產生本發明之去海藻糖基化抗體的其他糖基工程改造方法例如描述於如下文獻中:Niwa,R.等人,J.Immunol.Methods 306(2005)151-160;Shinkawa,T.,等人,J.Biol.Chem,278(2003)3466-3473;WO 03/055993或US 2005/0249722。
在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體使用活體外技術製備。在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體為化學合成的。(參見例如Yamamoto等人,(2008)JACS 130,501-510,其描述單核細胞趨化蛋白3(MCP-3)之非海藻糖基化形式)。在某些實施例中,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體藉由使用海藻糖苷移除IgG上之海藻糖殘基來製備。(參見例如Yazawa等人,(1986)_Biochem Biophys Res Commun.136,563-569)。
在某些實施例中,如藉由例如實例中所述之分析所展現,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體具有改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。舉例而言,在某些實施例中,本文所述之抗EGFR抗體的ADCC效應功能活性為ERBITUX®之ADCC效應功能活性之至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少約220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,本文所述之抗EGFR抗體的ADCC效應功能活性超過ERBITUX®之ADCC效應功能活性之約300%,包括ERBITUX®之ADCC效應功能活性之至少約350%,至少約360%,至少約370%,至少約380%,至少約390%,至少約400%,至少約410%,至少約420%,至少約430%,至少約440%,至少約450%,至少約460%,至少約470%,至少約480%,至少約490%,至少約500%,至少約510%,至少約520%,至少約530%,至少約540%,至少約550%,至少約560%,至少約570%,至少約580%,至少約590%或至少約6000%,包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,在具有野生型KRAS之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,在具有KRAS突變之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,KRAS突變為KRAS基因之密碼子12突變。在某些實施例中,KRAS突變為KRAS基因之外顯子2的密碼子13突變。在某些實施例中,在具有KRASG13D突變之個體中,相
較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,KRAS突變為KRAS基因之密碼子61突變。在某些實施例中,KRAS突變為KRAS基因之密碼子117突變。在某些實施例中,KRAS突變為KRAS基因之密碼子146突變。
在某些實施例中,在具有野生型BRAF之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,在具有BRAF突變之個體體內,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,BRAF突變為BRAF基因之密碼子600突變。在某些實施例中,在具有BRAFV600E突變之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,BRAF突變為BRAF基因之密碼子G466突變。在某些實施例中,BRAF突變為BRAF基因之密碼子G469突變。在某些實施例中,BRAF突變為BRAF基因之密碼子L597突變。
在某些實施例中,在具有野生型PTEN之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,在具有PTEN突變之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,PTEN突變為PTEN基因之外顯子3突變。在某些實施例中,PTEN突變為PTEN基因之外顯子4突變。在某些實施例中,PTEN突變為PTEN基因之外顯子5突變。在某些實施例中,PTEN突變為PTEN基因之外顯子6突變。在某些實施例中,
PTEN突變為PTEN基因之外顯子7突變。在某些實施例中,PTEN突變為PTEN基因之外顯子8突變。在某些實施例中,PTEN突變為PTEN基因之密碼子233突變。
在某些實施例中,在具有野生型NRAS之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,在具有NRAS突變之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,NRAS突變為NRAS基因之密碼子12突變。在某些實施例中,NRAS突變為NRAS基因之密碼子13突變。在某些實施例中,NRAS突變為NRAS基因之密碼子61突變。
在某些實施例中,在具有野生型PIK3CA之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,在具有PIK3CA突變之個體中,相較於ERBITUX®,本文所提供之去海藻糖基化抗EGFR抗體展現改良之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。在某些實施例中,PIK3CA突變為PIK3CA基因之外顯子20突變。
在某些實施例中,投與本文所述之去海藻糖基化抗EGFR抗體的個體抗艾必妥或其生物類似物。在某些實施例中,投與本文所述之去海藻糖基化抗EGFR抗體的個體在用艾必妥或其生物類似物時有進展。在某些實施例中,投與本文所述之去海藻糖基化抗EGFR抗體的個體用艾必妥或其生物類似物難治癒。
本發明亦關於免疫結合物,其包含結合於細胞毒性劑(諸如化學治療劑)、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其
片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)之抗體。
可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。多種放射性核素可用於產生放射性結合抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。適用於產生此類免疫結合物之例示性化學治療劑包括本文別處描述之化學治療劑。
在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體(諸如CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體、去海藻糖基化抗EGFR抗體或亦去海藻糖基化之CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體)結合於美登素、類美登素(maytansinoid)或卡奇黴素(calicheamicin)。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體(諸如CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體及/或去海藻糖基化抗EGFR抗體)結合於類美登素DM1。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑來製備,該等蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙-(對重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸伸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言,篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,
Science,238:1098(1987)中所述製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。
在另一實施例中,可使抗體與「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合以用於預靶向腫瘤,其中將抗體-受體結合物投與患者,隨後使用清除劑自循環中移除未結合之結合物,接著投用與細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)結合之「配體」(例如抗生物素蛋白)。
抗EGFR抗體及其片段之共價修飾包括在本發明之範疇內。共價修飾之一種類型包括使多肽之標靶胺基酸殘基與有機衍生劑反應,該有機衍生劑能夠與多肽之所選側鏈或N或C端殘基反應。以雙功能劑衍生適用於(例如)使多肽交聯於用於純化抗體之方法之非水溶性支撐基質或表面,且反之亦然。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮基乙醯基)-2-苯基乙烷;戊二醛;N-羥基丁二醯亞胺酯,例如與4-疊氮基水楊酸形成之酯;同雙官能醯亞胺酯,包括二丁二醯亞胺酯,諸如3,3'-二硫基雙(丁二醯亞胺基-丙酸酯);雙官能順丁烯二醯亞胺,諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷;及諸如甲基-3-[(對疊氮基苯基)-二硫基]丙醯亞胺酯之試劑。
其他修飾包括分別將麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基去醯胺化為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基,脯胺酸及離胺酸之羥基化,絲胺醯基或羥丁胺醯基殘基之羥基的磷酸化,離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化[T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,第79-86頁(1983)],N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。
多肽之共價修飾的另一類型包含將多肽以美國專利第4,640,835號;第4,496,689號;第4,301,144號;第4,670,417號;第4,791,192號
或第4,179,337號中所闡述之方式連接於多種非蛋白聚合物中之一者,例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。
本發明之抗EGFR抗體(或其片段)亦可在有利時以某種方式修飾以形成包含與另一異源多肽或胺基酸序列(例如免疫黏附素或肽體)融合之多肽的嵌合分子。
在一個實施例中,此類嵌合分子包含多肽與蛋白轉導域之融合物,該蛋白轉導域靶向多肽以傳遞至各種組織,且更尤其使用例如人類免疫缺陷病毒TAT蛋白之蛋白轉導域跨越腦血液障壁傳遞(Schwarze等人,1999,Science 285:1569-72)。
在另一實施例中,此類嵌合分子包含多肽與提供抗標籤抗體可選擇性結合之抗原決定基之標籤多肽的融合物。通常將抗原決定基標籤置於多肽之胺基端或羧基端。可使用針對標籤多肽之抗體偵測多肽之此類抗原決定基標記形式之存在。又,抗原決定基標籤之提供使得多肽能夠易於藉由親和純化使用抗標籤抗體或另一類型之與抗原決定基標籤結合的親和力基質純化。各種標籤多肽及其各自抗體在此項技術中係熟知的。實例包括聚組胺酸(poly-His)或聚-組胺酸-甘胺酸(poly-His-gly)標籤;flu HA標記多肽及其抗體12CA5[Field等人,Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988)];c-myc標籤及其8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體(Evan等人,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3616(1985));及單純性疱疹病毒醣蛋白D(gD)標籤及其抗體(Paborsky等人,Protein Engineering,3(6):547-553(1990))。其他標籤多肽包括Flag-肽(Hopp等人,BioTechnology,6:1204-1210(1988));KT3抗原決定基肽(Martin等人,Science,255:192-194(1992));α-微管蛋白抗原決定基肽[Skinner等人,J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)];及T7基因10蛋白肽標籤(Lutz-Freyermuth等人,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990))。
在一替代性實施例中,嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區域之融合物。對於嵌合分子(例如「免疫黏附素」)之二價形式,此類融合物可融合於IgG分子之Fc區。本發明之Ig融合物包括如下多肽,其包含人類之大致或僅殘基94-243、殘基33-53或殘基33-52替代Ig分子內之至少一個可變區。在一尤佳實施例中,免疫球蛋白融合物包括IgG1分子之鉸鏈區、CH2及CH3區或鉸鏈區、CH1、CH2及CH3區。對於製備免疫球蛋白融合物,亦參見1995年6月27日頒佈之美國專利第5,428,130號。
本文所揭示之抗體亦可調配成免疫脂質體。含有抗體之脂質體藉由此項技術中已知之方法製備,諸如Epstein等人,PNAS USA,82:3688(1985);Hwang等人,PNAS USA,77:4030(1980);及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中所述之方法。具有延長之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。
尤其適用之脂質體可藉由用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物以逆相蒸發法來產生。脂質體經具有指定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。本發明抗體之Fab'片段可經由二硫基交換反應結合於如Martin等人,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中所述之脂質體。抗贅生劑、生長抑制劑或化學治療劑(諸如小紅莓(doxorubicin))視情況亦包含在脂質體內。參見Gabizon等人,J.National Cancer Inst.,81(19):1484(1989)。
本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物可投與個體(例如哺乳動物,諸如人類)以治療涉及異常EGFR活性之疾病及病症,包括例如癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)。在某些實
施例中,本發明提供本文所述之抗EGFR抗體(或其片段),其用於製造用於治療個體之癌症(諸如頭頸癌、肺癌或結腸直腸癌)之藥物。在某些實施例中,本發明提供本文所述之抗EGFR抗體(或其片段),其用於治療個體之癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)。在某些實施例中,本發明提供包含本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)的醫藥組合物,其用於治療個體之癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)。在某些實施例中,欲治療個體為哺乳動物(例如人類、非人類靈長類動物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、羊、山羊、狗、貓等)。在某些實施例中,個體為人類。在某些實施例中,個體為臨床患者、臨床試驗志願者、實驗動物等。在某些實施例中,個體懷疑患有或具有患癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)之風險或經診斷患有癌症或具有異常EGFR表現或活性之任何其他疾病。在一些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體的KRAS為野生型。在某些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體具有KRASG13D突變。在一些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體的BRAF為野生型。在某些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體具有BRAFV600E突變。在某些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體抗艾必妥或其生物類似物。在某些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體在用艾必妥或其生物類似物時有進展。在某些實施例中,投與本文所述之抗EGFR抗體的個體用艾必妥或其生物類似物難治癒。
在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與具有野生型KRAS之個體。在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與具有KRASG13D突變之癌症患者。在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與具有野生型BRAF之癌症患者。在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與具
有BRAFV600E突變之個體。在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與抗艾必妥或其生物類似物之個體。在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與在用艾必妥或其生物類似物時有進展之個體。在某些實施例中,將本文所述之結合DM1之抗EGFR抗體投與用艾必妥或其生物類似物難治癒之個體。
癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等)或展現異常EGFR活性之任何其他疾病的多種診斷方法及此等疾病之臨床定界為此項技術中已知。此類方法包括(但不限於)例如免疫組織化學、PCR、螢光原位雜交(FISH)。關於異常EGFR活性或表現之診斷方法的其他細節描述於如下文獻中:Gupta等人,(2009)Mod Pathol.22(1):128-133;Lopez-Rios等人,(2013)J Clin Pathol.66(5):381-385;Ellison等人,(2013)J Clin Pathol 66(2):79-89;及Guha等人,(2013)PLoS ONE 8(6):e67782。
投與可藉由任何適合路徑,包括例如靜脈內、肌肉內或皮下。在一些實施例中,將本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與第二、第三或第四藥劑(包括例如抗贅生劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑)組合投與以治療涉及異常EGFR活性之疾病或病症。此類藥劑包括例如多西他賽(docetaxel)、吉非替尼(gefitinib)、FOLFIRI(伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶及甲醯四氫葉酸(leucovorin))、伊立替康、順鉑、卡鉑、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、貝伐單抗(bevacizumab)(抗VEGF抗體)、FOLFOX-4(輸注用氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸及奧沙利鉑(oxaliplatin))、阿法替尼(afatinib)、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、提瓦替尼(tivantinib)、依維莫司(everolimus)、CpG-ODN、雷帕黴素(rapamycin)、來那度胺(lenalidomide)、維羅非尼(vemurafenib)、內皮生長抑素(endostatin)、拉帕替尼(lapatinib)、PX-
866、Imprime PGG及埃洛替尼(irlotinibm)。在一些實施例中,抗EGFR抗體(或其片段)結合於另一藥劑。
在某些實施例中,將本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與一或多種其他療法(諸如放射療法、手術、化學療法及/或靶向療法)組合投與。在某些實施例中,將本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與放射療法組合投與。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與放射療法之組合用於治療頭頸癌。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與放射療法之組合用於治療咽喉癌。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與放射療法之組合用於治療結腸直腸癌。在某些實施例中,本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)及/或組合物與放射療法之組合用於治療肺癌。
視欲治療之適應症及本領域之熟練醫師所熟悉的給藥相關因素而定,本文所提供之抗體以有效用於治療該適應症同時使毒性及副作用達最小的劑量投與。為治療癌症(諸如頭頸癌、咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌等))典型劑量可為例如在0.001至1000μg範圍內;然而,低於或高於此例示性範圍之劑量屬於本發明之範疇。日劑量可為約0.1微克/公斤至約100毫克/公斤總體重(例如約5μg/kg、約10μg/kg、約100μg/kg、約500μg/kg、約1mg/kg、約50mg/kg或任何兩個前述值所界定之範圍),較佳約0.3微克/公斤至約10毫克/公斤總體重(例如約0.5μg/kg、約1μg/kg、約50μg/kg、約150μg/kg、約300μg/kg、約750μg/kg、約1.5mg/kg、約5mg/kg或任何兩個前述值所界定之範圍),更佳約1微克/公斤至1毫克/公斤總體重(例如約3μg/kg、約15μg/kg、約75μg/kg、約300μg/kg、約900μg/kg或任何兩個前述值所界定之範圍),且甚至更佳每天約0.5至10毫克/公斤總體重(例如約2mg/kg、約4mg/kg、約7mg/kg、約9mg/kg或任何兩個前述值所界定
之範圍,包括前述值之間的任何範圍)。如上所述,治療性或預防性功效可藉由定期評定所治療患者監測。對於在數天或更長時間內重複投藥而言,視病狀而定,重複治療直至出現對疾病症狀之所需抑制為止。然而,其他劑量方案可適用且屬於本發明之範疇。所要劑量可藉由單次大劑量投與組合物、藉由多次大劑量投與組合物或藉由連續輸注投與組合物來傳遞。
包含抗EGFR抗體之醫藥組合物可每天投與一次、兩次、三次或四次。組合物亦可以低於每天之頻率投與,例如一週六次、一週五次、一週四次、一週三次、一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、一個月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次。組合物亦可以持續釋放調配物投與,諸如以植入物投與,該植入物逐漸釋放組合物以在一段時間內使用,且使組合物可不太頻繁地投與,諸如一個月一次、每2-6個月一次、每年一次或甚至單次投與。持續釋放裝置(諸如丸粒、奈米粒子、微米粒子、奈米球、微球體及其類似物)可藉由注射投與。
抗體(或其抗原結合片段)可以單次日劑量投與,或總日劑量可以每天兩次、三次或四次之分次劑量投與。組合物亦可以低於每天之頻率投與,例如一週六次、一週五次、一週四次、一週三次、一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、一個月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次。組合物亦可以持續釋放調配物投與,諸如以植入物投與,該植入物逐漸釋放組合物以在一段時間內使用,且使組合物可不太頻繁地投與,諸如一個月一次、每2-6個月一次、每年一次或甚至單次投與。持續釋放裝置(諸如丸粒、奈米粒子、微米粒子、奈米球、微球體及其類似物)可藉由注射或以手術方式植入各種位置來投與。
癌症療法可藉由如下參數評估,例如(但不限於):腫瘤消退、腫
瘤重量或尺寸縮小、進展之時間、存活時間、無進展存活期、總反應率、反應持續時間、生活品質、蛋白質表現及/或活性。可使用確定療法功效之方法,包括例如經由放射成像量測反應。
在一些實施例中,治療功效以腫瘤生長抑制百分比(TGI%)形式量測,其使用方程式100-(T/C×100)計算,其中T為經治療腫瘤之平均相對腫瘤體積,且C為未治療腫瘤之平均相對腫瘤體積。在某些實施例中,TGI%為約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%或大於95%。在某些實施例中,抗EGFR之TGI%與ERBITUX®之TGI%相同或大於ERBITUX®之TGI%,諸如比ERBITUX®之TGI%大約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.1倍、約2.2倍、約2.3倍、約2.4倍、約2.5倍、約2.6倍、約2.7倍,包括此等值之間的任何範圍,或大於約2.7倍。
抗EGFR抗體(或其片段)可用適合載劑或賦形劑調配以使得其適用於投與。抗體之適合調配物藉由將具有所要純度之抗體(或其片段)與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))混合以凍乾調配物或水溶液形式獲得。在所採用之劑量及濃度下,可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對接受者無毒,且其包括緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨;氯化六羥季銨;氯化苯甲烴銨;苄索氯銨;酚;丁醇或苯甲醇;對羥苯甲酸烷酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇及間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清
白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如,Zn-蛋白質複合物);及/或非離子界面活性劑,諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。例示性抗體調配物描述於WO98/56418中,該專利以引用的方式明確併入本文中。適用於皮下投與之凍乾調配物描述於WO97/04801中。此類凍乾調配物可用適合稀釋劑復原至高蛋白質濃度,且經復原調配物可皮下投與本文中欲處理之哺乳動物。
本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性化合物,較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性化合物。舉例而言,可能需要另外提供抗贅生劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑。此類分子適合以可有效地達成預期目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視調配物中存在的抗體的量、疾病或病症或治療類型及上述其他因素而定。其通常以與本文中描述相同之劑量及投藥途徑或以迄今所用劑量之約1至99%來使用。亦可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成包埋於所製備之微膠囊中,例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊分別包埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或於巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物之半滲透基質,該等基質呈成形物品形式,例如膜或微膠囊。持續釋放之實例包括聚酯、水凝膠(例如,聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與乙
基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
脂質體(Lipofectin/liposome)可用於將本發明之多肽及抗體(或其片段)或組合物傳遞至細胞中。若使用抗體片段,則特異性結合於標靶蛋白質之結合域的最小抑制性片段較佳。舉例而言,基於抗體之可變區序列,可設計保留結合標靶蛋白質序列之能力的肽分子。此類肽可以化學方法合成及/或藉由重組DNA技術產生。參見例如Marasco等人,PNAS USA,90:7889-7893(1993)。
亦可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成包埋於所製備之微膠囊中,例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊分別包埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或於巨乳液中。此類技術揭示於前述Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體(或其片段)之固體疏水性聚合物的半滲透基質,該等基質呈成形物品形式,例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如,聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙瑞林乙酸鹽構成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物(諸如,乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸)使分子能夠經100天釋放,但某些水凝膠經較短時期釋放蛋白質。當囊封抗體長時間保留於體內時,由於在37℃下暴露於水分,其可變性或凝集,從而導致生物活性損失及可能之免疫原性變
化。視所涉及之機制而定,可設計合理策略以達成穩定。舉例而言,若發現凝集機制為經由硫基-二硫基交換形成分子間S-S鍵,則可藉由修飾硫氫基殘基、由酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來實現穩定。
在某些實施例中,調配物包含濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約2mg/ml、大於約3mg/ml、大於約4mg/ml、大於約5mg/ml、大於約6mg/ml、大於約7mg/ml、大於約8mg/ml、大於約9mg/ml、大於約10mg/ml、大於約11mg/ml、大於約12mg/ml、大於約13mg/ml、大於約14mg/ml、大於約15mg/ml、大於約16mg/ml、大於約17mg/ml、大於約18mg/ml、大於約19mg/ml、大於約20mg/ml、大於約21mg/ml、大於約22mg/ml、大於約23mg/ml、大於約24mg/ml、大於約25mg/ml、大於約26mg/ml、大於約27mg/ml、大於約28mg/ml、大於約29mg/ml或大於約30mg/ml(包括此等值之間的任何範圍)的本文所述之抗EGFR抗體。
在某些實施例中,抗EGFR抗體調配(例如濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約5mg/ml、大於約10mg/ml、大於約15mg/ml、大於約20mg/ml或大於約25mg/ml,包括此等值之間的任何範圍)於包含檸檬酸鹽、NaCl、乙酸鹽、丁二酸鹽、甘胺酸、聚山梨醇酯80(Tween 80)或前述之任何組合的緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配(例如濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約5mg/ml、大於約10mg/ml、大於約15mg/ml、大於約20mg/ml或大於約25mg/ml,包括此等值之間的任何範圍)於包含約100mM至約150mM甘胺酸之緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配於包含約50mM至約100mM NaCl之緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配(例如濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約5mg/ml、大於約10mg/ml、大於約15mg/ml、大於約
20mg/ml或大於約25mg/ml,包括此等值之間的任何範圍)於包含約10mM至約50mM乙酸鹽之緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配於包含約10mM至約50mM丁二酸鹽之緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配(例如濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約5mg/ml、大於約10mg/ml、大於約15mg/ml、大於約20mg/ml或大於約25mg/ml,包括此等值之間的任何範圍)於包含約0.005%至約0.02%聚山梨醇酯80之緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配於pH值在約5.1與5.6之間的緩衝液中。在某些實施例中,抗EGFR抗體調配於包含10mM檸檬酸鹽、100mM NaCl、100mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝液中,其中該調配物處於pH=5.5下。
在某些實施例中,包含本文所述之EFGR抗體(例如濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約5mg/ml、大於約10mg/ml、大於約15mg/ml、大於約20mg/ml或大於約25mg.ml,包括此等值之間的任何範圍)的調配物(諸如包含有包含10mM檸檬酸鹽、100mM NaCl、100mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝液的調配物,其中該調配物處於pH=5.5下)在室溫下穩定(諸如在約20-25℃下)約0.5週、1.0週、1.5週、2.0週、2.5週、3.5週、4.0週、4.5週或5.0週,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,包含本文所述之EFGR抗體(例如濃度為大於約0.5mg/ml、大於約1mg/ml、大於約5mg/ml、大於約10mg/ml、大於約15mg/ml、大於約20mg/ml或大於約25mg.ml,包括此等值之間的任何範圍)的調配物(諸如包含有包含10mM檸檬酸鹽、100mM NaCl、100mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝液的調配物,其中該調配物處於pH=5.5下)在加速條件(諸如在約37℃下儲存)下穩定約0.5週、1.0週、1.5週、2.0週、2.5週、3.5週、4.0週、4.5週或5.0週,包括此等值之間的任何範圍。
尺寸排阻層析(SEC)為蛋白質穩定性研究中用於偵測對應於物理及化學不穩定性之潛在分裂及凝集的熟知及廣泛使用之方法。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始高分子量物質(HMWS)%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下1週後展示高分子量物質增加少於約1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始高分子量物質%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下2週後展示高分子量物質增加少於約2.0%、1.8%1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始高分子量物質%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下4週後展示高分子量物質增加少於約3.3%、3.2%、3.1%、3.0%、2.9%、2.8%、2.7%、2.6%、2.5%、2.4%、2.2%、2.0%、1.8%1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%,包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始低分子量物質(LMWS)%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下1週後展示低分子量物質增加少於約1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始低分子量物質%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下2週後展示低分子量物質增加少於約2.0%、1.8%
1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始低分子量物質%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下4週後展示低分子量物質增加少於約2.4%、2.2%、2.0%、1.8%1.6%、1.4%、1.2%、1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%,包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始單體%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下1週後展示單體減少不超過約0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%或3.5%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始單體%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下2週後展示單體減少不超過約0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%或3.5%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用SEC所量測,相對於初始單體%,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在於37℃下4週後展示單體減少不超過約0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%
或3.5%,包括此等值之間的任何範圍。
陽離子交換層析(CEX)為偵測蛋白質降解事件(諸如去醯胺化或氧化)之熟知且廣泛使用之手段(Moorhouse等人,(1997)J.Pharm.Biomed.Anal.16,593-603)。相較於具有較高表觀pI之物質,降解產物通常稱為酸性或鹼性物質。酸性物質為相較於主峰較早地自CEX溶離的變體,而鹼性物質為相較於主峰較晚地自CEX溶離的變體。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下1週後的酸性峰分率不超過總蛋白質之約7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下2週後的酸性峰分率不超過總蛋白質之約8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%或18%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下4週後的酸性峰分率不超過總蛋白質之約8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%或27%,包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下1週後的鹼性峰分率不超過總蛋白質之約39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下2週後的鹼性峰分率不超過總蛋白質之約39%、40%、41%、42%、
43%、44%、45%或46%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下4週後的鹼性峰分率不超過總蛋白質之約39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%,包括此等值之間的任何範圍。
在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下1週後的主峰分率不低於總蛋白質之約32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下2週後的主峰分率不低於總蛋白質之約32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%,包括此等值之間的任何範圍。在某些實施例中,如使用CEX所量測,包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml本文所述之抗EFGR抗體的調配物在37℃下4週後的主峰分率不低於總蛋白質之約32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%或46%,包括此等值之間的任何範圍。
欲用於活體內投藥之調配物必須無菌。其藉由例如經由無菌過濾膜過濾來容易地實現。
特異性結合於EGFR多肽之經標記抗EGFR抗體、其片段及其衍生物及類似物可用於診斷目的以偵測、診斷或監測與EGFR之表現、異常表現及/或活性有關的疾病及/或病症。舉例而言,本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)可當場、活體內、離體及活體外用於診斷分析
或成像分析。偵測EGFR多肽之表現的方法包含(a)使用本發明之一或多種抗體分析個體之細胞(例如組織)或體液中多肽之表現,及(b)比較該基因表現量與標準基因表現量,從而所分析之基因表現量相較於標準表現量增加或減少表明異常表現。
本文所提供之其他實施例包括診斷動物(例如哺乳動物,諸如人類)之與EGFR表現或異常表現有關的疾病或病症的方法。方法包含偵測哺乳動物中之EGFR分子。在某些實施例中,診斷包含:(a)投與哺乳動物有效量之經標記抗EGFR抗體(或其片段),(b)投藥後等待一段時間間隔以使經標記抗EGFR抗體(或其片段)可優先集中在個體中表現EGFR分子之位點處(且使未結合之經標記分子自背景值清除);(c)測定背景值;及(d)偵測個體中之經標記分子以使得偵測高於背景值之經標記分子表明個體患有與EGFR之表現或異常表現有關之特定疾病或病症。可藉由各種方法測定背景值,包括將所偵測之經標記分子之量與先前對於特定系統所測定之標準值進行比較。
本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)可用於使用熟習此項技術者已知之經典免疫組織化學方法(例如參見Jalkanen等人,J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))分析生物樣品中之蛋白質含量。可用於偵測蛋白基因表現之其他基於抗體之方法包括免疫分析,諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。適合抗體分析標記為此項技術中已知且包括酶標記,諸如葡萄糖氧化酶;放射性同位素,諸如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115mIn、113mIn、112In、111In)及鎝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru;魯米諾(luminol);及螢光標記,諸如螢光素及若丹明(rhodamine),及生物
素。
此項技術中已知之技術可應用於本文所提供之經標記抗體(或其片段)。此類技術包括(但不限於)使用雙官能結合劑(參見例如美國專利第5,756,065號;第5,714,631號;第5,696,239號;第5,652,361號;第5,505,931號;第5,489,425號;第5,435,990號;第5,428,139號;第5,342,604號;第5,274,119號;第4,994,560號;及第5,808,003號)。替代或另外地,可量測細胞中編碼EGFR多肽之核酸或mRNA之含量,例如經由使用基於對應於編碼EGFR之核酸或其互補序列之探針的核酸進行螢光原位雜交;(FISH;參見1998年10月公開之WO98/454 79)、南方墨點法、北方墨點法或聚合酶鏈反應(PCR)技術,諸如即時定量PCR(RT-PCR)。亦可例如使用基於抗體之分析(亦參見例如1990年6月12日頒佈之美國專利第4,933,294號;1991年4月18日公開之WO91/05264;1995年3月28日頒佈之美國專利5,401,638;及Sias等人,J.Immunol.Methods 132:73-80(1990))藉由量測生物流體(諸如血清)中之脫落抗原來研究EGFR過度表現。除上述分析以外,熟習此項技術者可使用各種活體內及離體分析。舉例而言,可使哺乳動物體內之細胞暴露於視情況經可偵測標記物(例如放射性同位素)標記之抗體,且可例如藉由外部掃描放射能或藉由分析獲自預先暴露於抗體之哺乳動物的樣品(例如生檢或其他生物樣品)評估抗體與其之結合。
本文所提供之另一實施例為含有適用於治療癌症(諸如頭頸癌、肺癌或結腸直腸癌(例如腫瘤)或)之物質的製品。該製品可包含容器及該容器上或該容器隨附之標籤或包裝插頁。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑料之各種材料形成。一般而言,該容器容納對治療病狀有效之組合物且可具有無菌入口(例如該容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。
組合物中之至少一種活性劑為本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)。標籤或包裝插頁指明該組合物係用於治療特定病狀。標籤或包裝插頁進一步包含用於向患者投與抗體組合物之說明書。亦涵蓋包含本文所述之組合療法的製品及套組。
包裝插頁係指通常包括在治療產品之商業包裝內的說明書,其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或關於此類治療產品使用之警告的資訊。在一個實施例中,包裝插頁表明組合物用於治療癌症(諸如頭頸癌、肺癌或結腸直腸癌)。
此外,製品可進一步包含第二容器,該容器包含醫藥學上可接受之緩衝劑,諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝之生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質,包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
亦提供適用於各種目的之套組,例如用於分離或偵測患者中之EGFR,視情況與製品組合。為分離且純化EGFR,套組可含有偶合於珠粒(例如瓊脂糖珠粒)之本文所提供之抗EGFR抗體(或其片段)。可提供含有抗體(或其片段)之套組以用於例如在ELISA或西方墨點法中活體外偵測及定量EGFR。如製品一般,套組包含容器及容器上或容器隨附之標籤或包裝插頁。舉例而言,容器容納包含本文所提供之至少一種抗EGFR抗體的組合物。可包括含有例如稀釋劑及緩衝劑、對照抗體之其他容器。標籤或包裝插頁可提供組合物之描述以及用於所欲活體外或診斷用途的說明。
使用生殖系重鏈可變區VH3.48及生殖系輕鏈可變區VK3.11產生
人類化抗EGFR抗體348311。348311隨後活體外用於基於噬菌體呈現之親和力成熟實驗以產生具有改良之結合效能的純系。首先,經由PCR產生CDR-L3/CDR-H3核酸庫,選殖於噬菌體呈現載體中,且轉型至大腸桿菌中以產生噬菌體庫。兩輪淘選後,經由ELISA篩選284個Fab純系,且發現七個純系(亦即1-15、1-16、1-26、1-86、2-48、1-13及3-66)具有等效於或優於348311之結合效能(圖1)。使用包含以下輕鏈/重鏈組合之全長IgG純系執行進一步ELISA:348311/348311(LC/HC)、1-15/348311(LC/HC)、1-26/348311(LC/HC)、1-86/348311(LC/HC)、2-48/348311(LC/HC)、348311/1-26(LC/HC)、1-15/1-26(LC/HC)、1-26/1-26(LC/HC)、1-86/1-26(LC/HC)及2-48/1-26(LC/HC)。亦測試HLX05(亦即自製ERBITUX®生物類似物抗體)。相較於包含348311之重鏈的純系,包含1-26之重鏈的純系展現較佳EGFR結合效能。(參見圖2。)
選擇1-26重鏈且用作產生CDR-H2庫之基礎以缺失糖基化位點。經由PCR產生CDR-H2核酸庫,選殖於噬菌體呈現載體中,且轉型至大腸桿菌中以產生噬菌體庫。兩輪淘選後,經由ELISA篩選兩個純系(亦即2-68及3-67)且發現具有改良之結合特性。在塗佈有自製EGFR抗原及包含以下輕鏈/重鏈組合之抗EGFR抗體純系的孔中執行解離速率ELISA:1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、1-26/1-26(LC/HC)及348311/1-26(LC/HC)。在解離速率ELISA中,發現相較於HLX05,包含1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)及348311/1-26(LC/HC)之純系具有較高EGFR結合親和力(圖3)。
純系3-67用作產生CDR-L1/CDR-L2/CDR-H1庫之基礎。經由PCR產生CDR-L1/CDR-L2/CDR-H1核酸庫,選殖於噬菌體呈現載體中,且轉型至大腸桿菌中以產生噬菌體庫。2輪淘選後,經由ELISA篩選純系#8、#31、#33及#34且展示出以類似於ERBITUX®之親和力結合
EGFR。
將純系1-26、2-68、3-67、#8、#31、#33及#34之重鏈及輕鏈改組,產生其他抗EGFR抗體變體,其亦在ELISA中測試。選擇以下前導抗體用於在直接結合ELISA中進一步分析:1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、#8/#33(LC/HC)及#34/#33(LC/HC)。簡言之,在微量滴定盤之孔中用山羊抗fd抗體捕捉各純系、HLX05、ERBITUX®(購自Merck KGaA)及利妥昔單抗(亦即抗CD20抗體)之連續稀釋液。使用抗人類κ-HRP結合之二次抗體定量各孔中之所捕捉抗體之量。將HRP結合之二次抗體添加至孔中,且在培育後,洗掉過量二次抗體。將TMB添加至孔中,且在培育後,停止反應且藉由監測450nm下之吸光度增加量測HRP活性。藉由向孔添加EGFR-AP融合蛋白量測EGFR結合。培育及洗滌後,將pNPP添加至孔中且培育30分鐘。藉由監測405nm下之吸光度增加量測AP活性。繪製抗體濃度隨AP活性變化之曲線(圖4)。如圖4中所示,純系1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)展示出具有類似於HLX05及ERBITUX®(購自Merck KGaA)之EGFR結合親和力。
在與經生物素標記之HLX05競爭EGFR結合之ELISA中測試純系1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC);#8/#33(LC/HC)、#34/#33(LC/HC)、HLX05、ERBITUX®(購自Merck KGaA)及利妥昔單抗。簡言之,將各抗體之樣品與經生物素標記之HLX05預混合。隨後將鹼性磷酸酶結合之EGFR添加至預混合溶液中且在室溫下預培育1小時。隨後將預培育混合物添加至塗佈有抗生物素蛋白之微量滴定盤孔中。培育一小時後,用PBST洗滌所有孔,且向各孔添加pNPP。在37℃下二次培育後,停止反應。藉由監測405nm下之吸光度增加量測鹼性磷酸酶活性。相較於HLX05或ERBITUX®(購自Merck KGaA),所測試之所有純系展示較高競爭能力(圖5)。此類結果亦證實所測試之所有純
系與ERBITUX®結合EGFR之相同抗原決定基。
純系1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC);#8/#33(LC/HC)及#34/#33(LC/HC)各包含經工程改造以移除糖基化位點之CDR-H2。經由HPLC分析完整IgG純系1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC);#8/#33(LC/HC)及#34/#33(LC/HC)、ERBITUX®(購自Merck KGaA)及HLX05之糖基化概況。G0F及G1F佔所測試純系中之聚糖的多數類型,而在ERBITUX®(購自Merck KGaA)及HLX05上偵測到G0(圖6)。對1-26/3-67(LC/HC)、ERBITUX®(購自Merck KGaA)及HLX05之Fab片段及Fc片段執行另一聚糖分析。在1-26/3-67之Fc上偵測到G0F及G1F,但1-26/3-67之Fab上未偵測到聚糖。相比之下,ERBITUX®(購自Merck KGaA)與HLX05之Fc片段上偵測到痕量G2F以及G0F及G1F。在ERBITUX®(購自Merck KGaA)之Fab片段上偵測到G2F+2*Gal及G2F+Gal+SA(NeuAc),且在HLX05之Fab片段上偵測到G2F+2*SA及G2F+Gal+SA(NeuAc)(圖6)。
對自製HLX05、348311/2-68(LC/HC)、1-26/2-68(LC/HC)、348311/3-67(LC/HC)及1-26/3-67(LC/HC)執行SPR。結果展示於下表5中。
量測到純系1-26/2-68之Kd為6.49×10-11,亦即對EGFR之親和力為HLX05之2倍。量測到1-26/3-67之Kd為1.09×10-10,亦即對EGFR之親和力為HLX05之1.2倍。
包含1-26輕鏈及2-68或3-67重鏈之IgG純系展現對EGFR之親和力
比HLX05高2至3倍。(參見下表6。)
經由親和力成熟產生之抗EGFR抗體純系之FcγRIIIA結合經由ELISA分析。簡言之,用FcγRIIIA塗佈微量滴定孔且用BSA阻斷。添加1μg/ml濃度之以下抗體:自製HLX05、1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、#8/#33(LC/HC)、#34/#33(LC/HC)及ERBITUX®(購自Merck KGaA)。培育1小時後,將抗人類κ輕鏈-HRP結合之抗體添加至各孔中。將TMB受質添加至孔中且培育7分鐘。反應停止後,藉由監測450nm下之吸光度增加量測HRP活性。如圖7中所示,1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、#8/#33(LC/HC)、#34/#33(LC/HC)各以類似於ERBITUX®(購自Merck KGaA)及HLX05之親和力結合FcγRIIIa。
將經由親和力成熟產生之抗體純系的ADCC活性與自製HLX05比較。如Suzuki等人,(2007)「A Nonfucosylated Anti-HER2 Antibody Augments Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in Breast Cancer Patients.」Clin Cancer Res 13,1875-1882中所述執行分析。所有測試純系經展示展現類似於自製HLX05之ADCC活性。發現#34/#33(LC/HC)具有略微改良之ADCC活性(圖8A至G)。
在MTT分析中比較1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、#8/#33(LC/HC)、#34/#33(LC/HC)及HLX05對人類A431表皮樣癌瘤細胞之抗增殖作用。MTT色度分析為增殖及細胞毒性研究中測定活細胞數之確立方法。此分析係基於黃色四唑鎓鹽MTT藉由粒線體酶裂解形成可溶性藍色甲產物,且所產生甲之量與MTT暴露期間存在的非死活細胞數成正比(參見Mosmann(1983)J Immunol Methods 1983,65:55-63)。將增加濃度之1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、#8/#33(LC/HC)、#34/#33(LC/HC)或HLX05添加至細胞中。培育後,將MTT試劑添加至細胞中。藉由量測570nm下之吸光度測定所得MTT產物。細胞活力使用下式測定:活力%=(樣品之光學密度/對照之光學密度)×100
以對任何測試細胞株之增殖展示50%抑制的濃度計算IC50值。如圖9中所示,1-26/2-68(LC/HC)、1-26/3-67(LC/HC)、#8/#33(LC/HC)及#34/#33(LC/HC)展示出與HLX05相比具有改良之抗增殖作用。
使用具有人類A431表皮樣癌瘤腫瘤異種移植物之小鼠分析本文所述之抗EGFR抗體之治療功效。簡言之,將人類A431上皮癌瘤細胞(接種物=2×106個細胞)植入雄性BALB/c裸鼠中。將小鼠隨機分成5組。用下表7中所述之給藥方案中之一者處理各組:
開始處理後35天,用ERBITUX®處理之小鼠中的腫瘤比接受安慰
劑之小鼠中之腫瘤小約26%。用1-26/2-68處理之小鼠中的腫瘤比接受安慰劑之小鼠中的腫瘤小約31%(p<0.05)。用#8/#33或#34/#33處理之小鼠中的腫瘤比接受安慰劑之小鼠中的腫瘤小約50%(p<0.01)且比接受ERBITUX®之小鼠中之腫瘤小約50%(p<0.05)。參見圖10及下表8。
1TV:腫瘤體積(mm3)
2RTV:相對於初始情形之腫瘤體積
3TV/CV%:處理組體積/對照組體積
4TGI%:腫瘤生長抑制率=1-(T35-T0)/(C35-C0)%
5p值:<0.05=*<0.01=**<0.001=***
在第3天及第35天自各小鼠獲得血清樣品以測定在此兩個時間點#34/#33、1-26/3-67、1-26/2-68或ERBITUX®之血清濃度。簡言之,用8倍稀釋之EGFR-AP塗佈微量滴定盤之孔。將血清樣品稀釋5000倍且添加至孔中。使用山羊抗人類IgG-Fc-HRP結合之二次抗體定量各孔中之所捕捉抗體之量。重複兩次執行此實驗且結果展示於圖11中。在第3天與第35天,#34/#33、1-26/3-67、1-26/2-68之血清含量高於ERBITUX®之血清含量。
使用具有人類FaDu下嚥鱗狀細胞癌腫瘤異種移植物之小鼠分析本文所述之抗EGFR抗體之治療功效。簡言之,將人類FaDu下嚥鱗狀細胞癌細胞(接種物=2×106個細胞)皮下植入雌性BALB/c裸鼠中。將小鼠隨機分成4組,各組含有7隻小鼠。用下表9中所述之給藥方案中之一者處理各組:
開始處理後17天,用ERBITUX®處理之小鼠中的腫瘤比接受安慰劑之小鼠中之腫瘤小約38%。用HLX05處理之小鼠中的腫瘤比接受安慰劑之小鼠中的腫瘤小約29%(p<0.05)。用1-26/3-67處理之小鼠中的腫瘤比接受安慰劑之小鼠中的腫瘤小約51%(p<0.01)。參見圖12及下表10。
在另一組實驗中,給與NOD-SCID小鼠抗體處理以及放射療法(XRT)。簡言之,將人類FaDu下嚥鱗狀細胞癌細胞(接種物=1×106個細胞)皮下植入雌性NOD-SCID小鼠中。將小鼠隨機分成3組。用下表11
中所述之給藥方案中之一者處理各組:
處理5天後,給與艾必妥與XRT組合療法之小鼠中之腫瘤比僅給與XRT之小鼠中的腫瘤小91%。給與HLX07與XRT組合療法之小鼠中的腫瘤比僅給與XRT之小鼠中的腫瘤小105%。參見圖13及下表12。(RT=放射療法)
DM1(N2'-去乙醯基-N2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)美登素)為已展示誘導有絲分裂阻滯之微管組分的有效抑制劑(參見例如Chan(2008)Acc Chem Res 41,98-107;Oroudjev等人,(2010)Mol Cancer Ther 9,2700-2713;及Remillard等人,(1975)Science 189,1002-1005)。製備HLX07-DM1結合物且如下所述評定其作為抗癌劑之功效。
使用PD10去鹽管柱將HLX07調配於PBS(pH6.5)中。使用相同緩衝液將HLX07之最終濃度調節至7.5mg/mL。在各別管中,將DM1及
SMCC製成10mM DMF溶液。將等體積之DM1及SMCC溶液混合且使其在室溫下完全反應30分鐘。隨後以4.5比1莫耳比將DM1-SMCC添加至HLX07溶液中。在室溫下培育混合溶液2小時。使用PD10管柱移除過量小反應物。使用A280測定抗體-藥物結合物之濃度,且由A252適當校正。使用A280/A252比測定藥物與抗體比。
在一系列活體外實驗中使用DiFi(KRASWT及BRAFWT)、HCT-116(KRASG13D)及HT-29(BRAFV600E)細胞株量測HLX07-DM1介導EGFR陽性人類結腸癌細胞之抑制的能力。在所有研究中,在37℃下將各細胞株之細胞與增加濃度之HLX07-DM、HLX07或對照抗體(抗-CD20)(連續3倍)一起培育3天。使用MTT分析量測生長抑制。具有活性代謝之活細胞將MTT(亦即溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓,一種黃色染料)轉化為在565nm下具有吸光度之紫色甲產物。如圖14A中所示,在EGFR野生型DiFi人類直腸癌瘤細胞中,HLX07-DM1及HLX07之生長抑制作用類似。然而,僅HLX07-DM1對KRAS突變之HCT-116(圖14B)及BRAF突變之HT-29細胞(圖14C)展示抗增殖作用。
為評定無海藻糖之HLX07(亦即HLX07-FF)的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性活性,使用健康人類供體之PBMC作為效應細胞且使用DiFi(具有野生型KRAS之人類直腸癌瘤細胞株)作為標靶細胞來執行ADCC分析。使用Histopaque®-1077(Sigma-Aldrich)自健康供體之全血新鮮製備人類PBMC,且以5×106個細胞/毫升之密度懸浮於RPMI培養基(含有L-麩醯胺酸、25mM HEPES、青黴素、鏈黴素及10% FBS之RPMI-1640)中。將DiFi標靶細胞懸浮於RPMI培養基中且以1×104個細胞/孔塗佈於96孔U形底微量滴定盤中。將HLX07-FF、HLX07及對照抗體(抗CD20)之連續稀釋液以1.5pg/ml至3.3ng/mL之各種濃度添加於個別孔中。隨後,將PBMC添加至孔中以獲得25:1之效應細胞:標
靶細胞比,且在37℃下培育培養盤5小時。隨後將培養盤離心且分析上清液之乳酸脫氫酶活性。使用CytoscanTM-LDH細胞毒性分析套組(G-Bioscience)記錄上清液在490nm下之吸光度以確定乳酸脫氫酶之釋放。以對測試細胞株之ADCC展示50%誘導的濃度計算EC50值。如圖15A中所示,HLX07-FF在1.69ng/ml下展示50%誘導,該濃度比展示50%誘導所要之HLX07之濃度(亦即4.388ng/ml)低60%。
KRAS突變為轉移性結腸癌中抗艾必妥之預測生物標記。參見「Class Labeling Changes to anti-EGFR monoclonal antibodies,cetuximab(Erbitux)and panitumumab(Vecitibix):KRAS Mutations.」美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)2010-01-11。為比較HLX07-FF及HLX07在KRAS突變細胞中之ADDC活性,使用HCT-116(亦即具有KRASG13D突變之人類結腸癌瘤細胞株)作為標靶細胞重複上述分析。該分析使用30:1效應細胞:標靶細胞比執行。在3倍連續稀釋後,將HLX07-FF、HLX07及對照抗體(抗CD20)之連續稀釋液以0.1μg/ml至5.1pg/ml之各種濃度添加於個別孔中。如圖15B中所示,在HCT-116細胞中,HLX07-FF展現ADCC活性比非海藻糖基化HLX07高4.8倍。
BRAF突變為轉移性結腸癌中抗艾必妥之預測生物標記。參見Di Nicolitano等人,(2008)J.Clin Oncol.26,5705-5712。為比較HLX07-FF及HLX07在BRAF突變細胞中之ADDC活性,使用HT29(具有BRAFV600E突變之人類結腸直腸腺癌細胞株)作為標靶細胞重複上述分析。該分析使用30:1效應細胞:標靶細胞比執行。在3倍連續稀釋後,將HLX07-FF、HLX07及對照抗體(抗CD20)之連續稀釋液以0.1μg/ml至5.1pg/ml之各種濃度添加於個別孔中。如圖15C中所示,在HT29細胞中,HLX07-FF展現ADCC活性比海藻糖基化HLX07高4.7倍。
向兩隻食蟹獼猴(一隻雄性,且一隻雌性)經由靜脈內注射24mg/kg抗體(亦即33/34-#1、33/34-#2、3/67-#3及3/67-#4)。在輸注後各時間點藉由ELISA法量測抗EGFR抗體之血清濃度。在第二組食蟹獼猴中用該等抗體重複此實驗。如圖16A中之血清濃度-時間曲線所示,在食蟹獼猴之血清中,可偵測到抗體3/67比抗體34/33長約100。圖16B展示在食蟹獼猴中HLX05(1-3)及ERBITUX®(亦即4-6)之血清濃度-時間曲線。
藉由插入所建立之DASGIP生物反應器平台篩選HLX07 1-26/3-67最高次純系。使用分批補料饋入方案添加丁酸酯且使用較低溫度培育條件,pH值控制在7,次純系1-26/3-67-45-9至第17天達到4.9g/L。參見圖17。
進行穩定性研究,其中使含有5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml及25mg/ml之HLX07抗體調配物經受加速儲存條件(亦即37℃)長達4週。在第0週、第1週、第2週及第4週時間點自各調配物獲得樣品且經由尺寸排阻層析(SEC)及陽離子交換層析(CEX)分析。SEC廣泛用於偵測抗體凝集物(亦即高分子量物質或HMWS)、單體及片段(亦即低分子量物質或LMWS)。陽離子交換層析(CEX)為偵測蛋白質降解事件(諸如去醯胺化或氧化)之熟知且廣泛使用之手段(Moorhouse等人,(1997)J.Pharm.Biomed.Anal.16,593-603)。相較於主要物質,降解產物通常稱為酸性或鹼性物質。酸性物質為具有較低表觀pI之變體,且鹼性物質為具有較高表觀pI之變體。酸性物質為相較於主峰較早地自CEX溶離的變體,而鹼性物質為相較於主峰較晚地自CEX溶離的變體。獲自儲存在加速條件下之調配物之樣品的SEC及CEX分析之結果提供於下表13中:
前述實例僅為說明目的而提供,且並不欲以任何方式限制本發明之範疇。除本文中所示及所述之外的本發明之各種修改為熟習此項技術者自以上描述顯而易見且其屬於隨附申請專利範圍之範疇。
本發明提供之實施例包括(但不限於):
1.一種抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列N/T/Q-YGVH(SEQ ID NO:4)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列Y-N/A/G/D-T/D/N-P/K/E-FTSRF(SEQ ID NO:9)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY(SEQ ID NO:14)之CDR-H3;及輕
鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列I-G/R/S-T/L/P-NIH(SEQ ID NO:20)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KY-A/G-SE-S/T-I-S/R(SEQ ID NO:24)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPT-T/L/S/A/Y(SEQ ID NO:30)之CDR-L3。
2.如實施例1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含選自由SEQ ID NO:1-3組成之群的胺基酸序列的CDR-H1;(2)包含選自由SEQ ID NO:5-8組成之群的胺基酸序列的CDR-H2;及(3)包含選自由SEQ ID NO:10-13組成之群的胺基酸序列的CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含選自由SEQ ID NO:15-19組成之群的胺基酸序列的CDR-L1;(2)包含選自由SEQ ID NO:21-23組成之群的胺基酸序列的CDR-L2;(3)包含選自由SEQ ID NO:25-29組成之群的胺基酸序列的CDR-L3。
3.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列TYYDYEFAY(SEQ ID NO:10)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTT(SEQ ID NO:25)之CDR-L3。
4.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含
(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
5.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
6.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YATEFTSRF(SEQ ID NO:7)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
7.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YDDKFTSRF(SEQ ID NO:6)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列
NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
8.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
9.如實施例2之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
10.一種CDR-H2去糖基化之抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變域,該重鏈可變域包含所選包含胺基酸序列Y-A/G/D-D/N-K/E-FTSRF(SEQ ID NO:31)的CDR-H2。
11.如實施例10之CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該重鏈可變域進一步包含有包含胺基酸序列N/T/Q-YGVH(SEQ ID NO:4)之CDR-H1及包含胺基酸序列T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY(SEQ ID NO:14)之CDR-H3。
12.如實施例10或實施例11之CDR-H2去糖基化之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段進一步包含輕鏈可
變域序列,該輕鏈可變域序列包含有包含胺基酸序列I-G/R/S-T/L/P-NIH(SEQ ID NO:20)之CDR-L1;包含胺基酸序列KY-A/G-SE-S/T-I-S/R(SEQ ID NO:24)之CDR-L2;及包含胺基酸序列NWPT-T/L/S/A/Y(SEQ ID NO:30)之CDR-L3。
13.如實施例1至12中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含人類IgG之Fc序列。
14.如實施例1至13中任一項之抗EGFR抗體之抗原結合片段,其中該抗原結合片段選自由以下組成之群:Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、雙功能抗體及線性抗體。
15.如實施例1至13中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為多特異性抗體。
16.如實施例1至15中任一項之抗體,其中該抗體為去海藻糖基化抗體。
17.如實施例1至16中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其結合於治療劑。
18.如實施例1至16中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其結合於標記物。
19.如實施例18之抗體,其中該標記物選自由以下組成之群:放射性同位素、螢光染料及酶。
20.一種經分離核酸分子,其編碼如實施例1至16中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段。
21.一種表現載體,其編碼如實施例20之核酸分子。
22.一種細胞,其包含如實施例21之表現載體。
23.一種製備抗體之方法,其包含培養如實施例22之細胞及自細胞培養物回收該抗體。
24.一種組合物,其包含如實施例1至17中任一項之抗EGFR抗
體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
25.一種偵測患者之樣品中EGFR蛋白之方法,其藉由使如實施例1至16及18至19中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段與該樣品接觸及偵測結合於該EGFR蛋白之抗EGFR抗體來進行。
26.如實施例25之方法,其中該抗EGFR抗體或其抗原結合片段用於免疫組織化學分析(IHC)或ELISA分析中。
27.一種治療個體之癌症的方法,其包含投與該個體有效量之如實施例26之組合物。
28.如實施例27之方法,其中該癌症選自咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌及頭頸癌。
29.如實施例27之方法,其中進一步投與該個體選自由以下組成之群的治療劑:抗贅生劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。
30.如實施例27之方法,其中進一步施與該個體放射療法。
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<223> 合成構築體
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa=Thr或Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<220>
<223> 合成構築體
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<223> 合成構築體
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<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa=Gly、Arg或Ser
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<221> VARIANT
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<220>
<223> 合成構築體
<210> 22
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<220>
<223> 合成構築體
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<211> 8
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<220>
<223> 合成構築體
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<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
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<220>
<223> 合成構築體
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<223> 合成構築體
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<220>
<223> 合成構築體
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<220>
<223> 合成構築體
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<221> VARIANT
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<223> Xaa=Thr、Leu、Ser、Ala或Tyr
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<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa=Ala、Gly或Asp
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<222> 3
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<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa=Lys或Glu
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
Claims (32)
- 一種抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體或其抗原結合片段,其包含(a)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(b)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(c)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YATEFTSRF(SEQ ID NO:7)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(d)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YDDKFTSRF(SEQ ID NO:6)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(e)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(f)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(g)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列 NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;(h)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGPNIH(SEQ ID NO:18)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASETIR(SEQ ID NO:23)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3;或(i)重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列 YNTPFTSRF(SEQ ID NO:5)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YATEFTSRF(SEQ ID NO:7)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列 NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YDDKFTSRF(SEQ ID NO:6)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGTNIH(SEQ ID NO:15)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO:21)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重 鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IRTNIH(SEQ ID NO:16)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列TYGVH(SEQ ID NO:3)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列IGPNIH(SEQ ID NO:18)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYASETIR(SEQ ID NO:23)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變域序列,該重鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:1)之CDR-H1;(2)包含胺基酸序列YGNEFTSRF(SEQ ID NO:8)之CDR-H2;及(3)包含胺基酸序列DYYDYEFAY(SEQ ID NO:11)之CDR-H3;及輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含胺基酸序列ISTNIH(SEQ ID NO:19)之CDR-L1;(2)包含胺基酸序列KYGSESIS(SEQ ID NO:22)之CDR-L2;及(3)包含胺基酸序列NWPTS(SEQ ID NO:27)之CDR-L3。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其包含包括胺基酸序列SEQ ID NO:32之輕鏈可變域及包括胺基酸序列SEQ ID NO:37之重鏈可變域。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其包含包括胺基酸序列SEQ ID NO:32之輕鏈可變域及包括胺基酸序列SEQ ID NO:38之重鏈可變域。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其包含包括胺基酸序列SEQ ID NO:33之輕鏈可變域及包括胺基酸序列SEQ ID NO:36之重鏈可變域。
- 如請求項1之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其包含包括胺基酸序列SEQ ID NO:34之輕鏈可變域及包括胺基酸序列SEQ ID NO:36之重鏈可變域。
- 如請求項1至14中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含人類IgG之Fc序列。
- 如請求項1至14中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段選自由以下組成之群:Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、雙功能抗體及線性抗體。
- 如請求項1至14中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為多特異性抗體。
- 如請求項1至14中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為去海藻糖基化抗體。
- 如請求項1至14中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其結合於治療劑。
- 如請求項1至14中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其結合於標記物。
- 如請求項20之抗EGFR抗體或其抗原結合片段,其中該標記物選 自由以下組成之群:放射性同位素、螢光染料及酶。
- 一種經分離核酸分子,其編碼如請求項1至18中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段。
- 一種表現載體,其編碼如請求項22之核酸分子。
- 一種細胞,其包含如請求項23之表現載體。
- 一種製備抗體之方法,其包含培養如請求項24之細胞及自細胞培養物回收該抗體。
- 一種組合物,其包含如請求項1至19中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種偵測患者之樣品中EGFR蛋白之方法,其藉由使如請求項1至18、20及21中任一項之抗EGFR抗體或其抗原結合片段與該樣品接觸及偵測結合於該EGFR蛋白之該抗EGFR抗體來進行。
- 如請求項27之方法,其中該抗EGFR抗體或其抗原結合片段用於免疫組織化學分析(IHC)或ELISA分析中。
- 一種如請求項26之組合物之用途,其用於製備治療個體之癌症的藥物。
- 如請求項29之用途,其中該癌症選自咽喉癌、結腸直腸癌、肺癌及頭頸癌。
- 如請求項29之用途,其中該藥物係調配為與選自由以下組成之群的額外治療劑投與:抗贅生劑、化學治療劑、生長抑制劑及細胞毒性劑。
- 如請求項29之用途,其中該藥物係調配為與放射療法併用。
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