MX2011005382A - Anticuerpos anti-her4 especificos de isoforma. - Google Patents

Anticuerpos anti-her4 especificos de isoforma.

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Abstract

Se describen composiciones y métodos útiles para detectar y tratar cánceres que expresan la isoforma HER4 JM-a.

Description

ANTICUERPOS ANTI-HER4 ESPECÍFICOS DE ISOFOR A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 USC 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. Número de Serie 61/117,903, presentada en noviembre 25, 2008, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a anticuerpos útiles para detectar y tratar cáncer y a métodos para utilizar esos anticuerpos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores ErbB/HER forman una subfamilia de receptor de tirosina quinasas que incluyen EGFR (también conocidos como ErbBl o HERI), HER2 (c-Neu, ErbB2) , HER3 (ErbB3), y HER4 (ErbB4) . Los receptores ErbB se activan selectivamente por una cantidad de factores de crecimiento tipo EGF que llevan a respuestas celulares, tales como proliferación celular, diferenciación, migración o supervivencia. Los receptores ErbB consisten de un dominio extracelular glicosilado, un dominio de una sola transmembrana, y un dominio intracelular incluyendo una enzima tirosina quinasa. El enlace de ligando al receptor de dominio extracelular dispara o activa dimerización de receptor, subsecuente activación del dominio quinasa, autofosforilación de receptor y múltiples cascadas de señalización corriente abajo (1) .
EGFR y HER2 son oncógenos bien establecidos y objetivos de drogas de cáncer. Están implicados en la patogénesis de diversas malignidades epiteliales y neurales y su hiperactividad está asociada con deficientes resultados para el paciente (2-4) . Los agentes terapéuticos dirigidos incluyendo tanto anticuerpos monoclonales como inhibidores de quinasa de pequeño peso molecular que bloquean las funciones de estos receptores, han mostrado efecto terapéutico en supervivencia de pacientes en pruebas clínicas. Cetuximab (ERBITUX™, Imclone, Inc.) es un anticuerpo monoclonal quimérico que bloquea enlace de ligando a EGFR, llevando a una disminución en dimerización de receptor, autofosforilación y activación de rutas de señalización (5) . Cetuximab actualmente está aprobado, para uso clínico en cáncer colorectal quimiorefractario de etapa tardía y local o regionalmente avanzado carcinoma de células escamosas de la cabeza y cuello. Trastuzumab (HERCEPTIN™, Genentech, Inc.) es un anticuerpo monoclonal humanizado contra el dominio extracelular de HER2 actualmente empleado para el tratamiento de cánceres de mama que sobre-expresan ErbB2 tanto en ámbito de adyuvante como para enfermedad avanzada (6-9).
Los antagonistas de receptor HER4 se ha mostrado que son útiles para controlar excesiva migración y/o proliferación o células de músculo liso y en particular para el tratamiento de estenosis. Ver Patente de los E.U.A. Número 7,332,579.
La significancia de HER4 en cáncer se comprende deficientemente. Algunas observaciones indican que el receptor HER4 es regulado por disminución en diversos cánceres, o que su expresión se asocia con marcadores de pronóstico favorable, tal como expresión de receptor de estrógeno (10, 11) . Por otra parte, HER4 se ha reportado que tiene altos niveles de expresión en varios cánceres tales como de tiroides (12), de ovarios (13), y de mama (14), así como meduloblastoma (15), y ependimoma (16) . Además, la significancia de niveles de expresión de HER4 para el resultado clínico genera conflicto (17) . Una de las explicaciones plausibles para estos datos contradictorios es que cuatro formas estructural y funcionalmente diferentes se generan de un solo gen HER4 por corte y empalme alterno (18, 19) . Estas isoformas tienen diferentes perfiles de distribución de tejido y difieren en su capacidad para promover tumorigénesis en líneas celulares de cáncer de mama (26) .
De acuerdo con esto, es deseable proporcionar un agente terapéutico que se dirija a isoformas específicas del receptor HER4 para tratar más precisamente desórdenes tratados con HER4.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-HER4 aislado que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el anticuerpo compite por enlace a la isoforma JM-a con el anticuerpo anti-HER4 mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene número de acceso PTA-9655. En otra modalidad, el anticuerpo liga al mismo epítopo que el epítopo al cual el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene número de acceso PTA-9655 se liga. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano o humanizado.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-HER4 aislado que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a, comprende un fragmento del anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene número de acceso PTA-9655 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el fragmento comprende la región variable del anticuerpo monoclonal mAb 1479. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo .está madurado por afinidad. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 aislado comprende el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene número de acceso PTA-9655 o su forma humanizada .
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-HER4 aislado se liga a un agente citotoxico.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-HER4 aislado que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a tiene menos toxicidad que un anticuerpo anti-HER4 que no es específico para la isoforma HER4 JM-a.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para inhibir la proliferación de una célula de cáncer que expresa la isoforma HER4 JM-a, que comprende poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 reduce la excreción de ectodominio HER4. En algunas modalidades, la célula de cáncer es un cáncer de mama, cáncer de ovarios o célula de meduloblastoma .
Otro aspecto de la invención proporciona un método para tratar cáncer en un paciente cuyo cáncer expresa la isoforma HER4 JM-a, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 reduce excreción de ectodominio HER4. En algunas modalidades, el cáncer a tratar es cáncer de mama, cáncer de ovarios o meduloblastoma.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para tratar cáncer en un paciente al seleccionar un paciente cuyas células cancerosas expresan la isoforma HER4 JM-a y administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 reduce la excreción del ectodominio HER4. En algunas modalidades, el cáncer a tratar es cáncer de mama, cáncer de ovarios o meduloblastoma .
Otro aspecto de la invención proporciona un método para tratar cáncer en un paciente al seleccionar a un paciente cuyas células cancerosas comprenden niveles incrementados de ectodominio excretado Her4 en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido y administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 reduce la excreción de ectodominio HER . En algunas modalidades, el cáncer a tratar es cáncer de mama, cáncer de ovarios o meduloblastoma.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para reducir el riesgo de cardiotoxicidad asociado con terapia de cáncer en un paciente con cáncer que comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el cáncer del paciente sobreexpresa la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, el cáncer de paciente comprende niveles incrementados de ectodominio excretado Her4 en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido. En algunas modalidades, el cáncer de paciente es cáncer de mama, cáncer de ovarios o meduloblastoma .
Otro aspecto de la invención proporciona un método para detectar la presencia de ectodominio excretado HER4 en una muestra de células que comprende poner en contacto las células con un anticuerpo que liga específicamente a la isoforma JM-a HER4.
Todavía otro aspecto de la invención proporciona un método para diagnosticar un tumor en un paciente que comprende detectar la presencia de ectodominio excretado HER4 en el tumor. En una modalidad, el método para detectar comprende poner en contacto un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma JM-a de HER4 con una muestra obtenida del tumor. En una modalidad, el método comprende comparar el nivel de ectodominio excretado HER4 en el tumor al nivel de ectodominio excretado HER4 en una muestra de control no cancerosa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama que muestra el dominio de yuxtamembrana alterno HER4 isoformas JM-a (SEQ ID NO:l) y JM-b (SEQ ID NO: 2) .
La Figura 2 es una tabla que describe características de ciertos anticuerpos monoclonales HER4.
La Figura 3 es un análisis de transferencia Western que ilustra la especificidad de enlace de mAb 1479 y un anticuerpo de control, sc-283, para células COS-7 que expresan isoformas HER4 JM-a CYT-2 o JM-b CYT-1.
La Figura 4 es un análisis de transferencia Western que ilustra la especificidad de enlace de anticuerpos mAb 1479 y de control anti-EGFR (sc-03), anti-HER2 (sc-284) , anti-HER3 (sc-285) para células NIH 3T3-7d y NR6 que expresan en forma estable diferentes receptores ErbB.
La Figura 5 es una gráfica que muestra la especificidad de enlace de mAb 1479 para transíectantes NIH 3T3-7d y NR6 que expresan HER4 JM-a CYT-2 , HER4 JM-b CYT-1, EGFR, HER2 , o HER3 como se analiza por ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) (columnas grises) . El enlace de mAb 1479 se compara con el enlace de anti-EGFR (sc-03), anti-HER2 (sc-284), anti-HER3 (sc-285) y anti-HER4 (sc-283) (el enlace de todos los anticuerpos de control en columnas blancas) en diluciones 1:1000 (izquierda) o 1:100 (derecha).
La Figura 6 es un análisis de transferencia Western que muestra enlace de mAb 1479 al ectodominio excretado HER4 en lisado de tejido de riñon humano y a ectodominio recombinante HER4.
La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de enlace in vitro que se lleva a cabo con ectodominió recombinante HER4 y mAb 1479.
La Figura 8 es una curva de afinidad no lineal de un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) que mide el enlace de mAb 1479 a ectodominió HER4 recombinante.
La Figura 9 es un análisis de transferencia Western de 17 muestras apareadas de mama normal (N) /tejido de tumor de mama (T) utilizando mAb 1479 para detectar excreción de ectodominió. La cuantificación densitométrica de los niveles de expresión del ectodominió HER4 de 100 kDa (gris) y HER4 de longitud íntegra de 150 kDa (blanco) se ilustran bajo cada pista Western.
La Figura 10 es una gráfica que muestra la expresión promedio de ectodominió HER4 y receptor de longitud íntegra en los 17 pares de tejido normal y de tumor de mama apareados cuantificados por densitometría . *, la fracción de HER4 total presente como ectodominió fue mayor dentro de los tejidos de tumor, cuando se compara con los controles de tejido normal acoplados (cajas grises: P<0.05; prueba de rango con signo Wilcoxon) .
La Figura 11A es un análisis de transferencia Western que muestra el efecto de mAb 1479 en fosforilación HER4 tirosina de células de cáncer de mama MCF-7 estimuladas con NRG-1. La membrana se volvió a transferir con anti-HER4 (Abcam) y anti-actina como controles. La Figura 11B es un análisis de transferencia Western que muestra el efecto de mAb 1479 en excreción de ectodominio HER4 de 100 kDa en el medio de cultivo de transfectantes COS-7 que expresan HER4 JM-a CYT-2. Total de lisados celulares del mismo experimento se analizó por transferencia western con anti-HER4 (Abcam) y anti-actina.
La Figura 12 es un análisis de transferencia Western que muestra el efecto de mAb 1479 en ubiquitinación de isoformas JM-a segmentables de HER4.
La Figura 13 es un análisis de transferencia Western que muestra el efecto de mAb 1479 en niveles de expresión HER4.
La Figura 14 es una gráfica que muestra el efecto de mAb 1479 en proliferación de las líneas celulares de cáncer de mama humano T-47D y MCF-7 en comparación con el anticuerpo de control 2C4.
La Figura 15 es una gráfica que muestra el efecto de mAb 1479 en crecimiento independiente del anclaje de líneas celulares de cáncer de mama humano T-47D y MCF-7 en comparación con el anticuerpo de control 3g6 como se indica por un ensayo de formación de colonias en agar suave.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DEFINICIONES A menos de que se defina de otra forma, los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la cual pertenece esta invención y son consistentes con: Singleton et al 1994 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed. , J. Wiley & Sons, New York, NY; y Janeway et al 2001 Immunobiology: the immune system in health and disease 5th Ed., Garland Publishing, New York.
El término ™HER4 polipéptido" o "receptor HER4", como se emplean aquí, a menos de que se indique de otra forma de manera específica o contextual, se refiere a cualquier polipéptido nativo o variante que se produce de un gen HER4 descrito por ejemplo en la Solicitud de Patente Europea Número (EP) 599,274; Plowman at al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993). En una modalidad, el gen HER4 es un gen HER4 humano. Los términos "HER4" y "ErbB4" se emplean en forma intercambiable en la técnica. El término abarca formas de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternas) , variantes alélicas de origen natural y puede incluir modificaciones post-traducción de origen natural tales como glicosilación y modificaciones GPI .
El término "tipo silvestre" en general se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína HER4 de origen natural.
Un "polipéptido de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido correspondiente derivado de la naturaleza. Éstos polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido de secuencia nativa" específicamente abarca formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternas), variantes alélicas de origen natural del polipéptido y puede incluir modificaciones post-traducción de origen natural tales como glicosilación, etc.
La expresión "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a un polipéptido de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en cierta medida del polipéptido de secuencia nativa predominante. Las variantes de secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos .
"Identidad de secuencia" se define como el por ciento de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia. Métodos y programas de computadoras para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Un programa de computadora semejante es "Align 2" cuyo autor es Genentech, Inc., presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A., Washington, DC 20559, en diciembre 10, 1991, y cuyo código se encuentra en WO 2007/001851.
El "dominio extracelular" o "ECD = Extracellular Domain" se refiere a una forma del polipéptido que esencialmente está libre de los dominios de transmembrana y citoplásmico . Se entenderá que cualesquiera dominios transmembrana identificados para · los polipéptidos de la presente invención se identifican de acuerdo con criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico . Las fronteras exactas de un dominio de transmembrana pueden variar pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se identifica inicialmente aquí.
El término "anticuerpo" aquí se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecífieos, (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos ) y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Miller et al 2003 Jour. of Immunology 170:4854-4861). Anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos o derivados de otras especies . Un anticuerpo es uña prote na que es capaz de reconocer y ligar a un antígeno específico (Janeway et al 2001 Immunobiology: the inmune system in health and disease, 5th Ed. , Garland Publishing, New York). Un antígeno objetivo generalmente tiene numerosos sitios de enlace, también denominados epítopos, reconocidos por CDRs en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que específicamente liga a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. De esta manera, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud íntegra o completa o una porción inmunológica activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir una molécula que contiene un sitio de enlace de antígeno que liga en forma inmunoespecífica un antígeno de un objetivo de interés o parte del mismo, estos objetivos incluyen, pero no están limitados a células de cáncer o células que producen anticuerpos autoinmunes asociados con enfermedad autoinmune. La inmunoglobulina aquí descrita puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD y IgA) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG , IgAl y IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden ser derivadas de cualquier especie tal como humana, murina o de conejo. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver Basic & Clinical Immunology, 8th edition, Stites and Terr (eds.), Mcgraw-Hill, Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994 Capítulo 6.
"Anticuerpos nativos" usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 Daltons, compuestas por dos cadenas idénticas ligeras (L) (de las cuales hay dos tipos denominados kappa y lambda) , y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera regularmente tiene puentes disulfuro intracadena espaciadas regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Residuos aminoácidos particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
Un "anticuerpo precursor" puede comprender una secuencia nativa o tipo silvestre. Un anticuerpo precursor puede ser dirigido contra un antígeno objetivo de interés, por ejemplo un polipéptido biológicamente importante.
Anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptido (tales como antígeno de glicolípido asociado con tumor; ver Patente de los E.U.A. Número 5091178) , también se contemplan.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de, un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En ciertas modalidades, el anticuerpo estará purificado (1) a más de 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método Lowry (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad aparente por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o tinción de plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria sin embargo, anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud íntegra, en general el enlace de antígeno o su región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab' )2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; minicuerpos (Patente de los E.U.A. Número 5641870, Ejemplo 2; Zapata et al 1995 Protein Eng. 8(10) : 1057-1062); Olafsen et al 2004 Protein Eng. Design & Sel. 17 (4) .315-323) , fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) , región de determinación de complementariedad (CDR = Complementary Determining Región) , y fragmentos de enlace de epítopo de cualquiera de los anteriores que ligan en forma inmunoespecífica a antígenos de células de cáncer, antígenos virales o antígenos microbianos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores y diferencias de glicosilación. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un sitio antigénico sencillo. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que pueden ser sintetizados sin contaminación por otros anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención, pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al 1975 Nature 256:495, o pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (ver por ejemplo: la Patente de los E.U.A. Número 4816567; la Patente de los E.U.A. Número 5807715). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ligan específicamente a la proteína empleada para inmunización. En forma alterna, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Después de inmunización, los linfocitos se aislan y después se fusionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding 1986 Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 Academic Press). Los anticuerpos también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas por Clackson et al 1991 Nature 352:624-628; Marks et al 1991 J. Mol. Biol. 222:581-597.
El ADN que codifica el anticuerpo puede ser modificado para producir "polipéptidos de anticuerpo de fusión o quiméricos", por ejemplo al sustituir secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera humanos (CH y CL) para las secuencias murinas homologas (Patente de los E.U.A. Número 4816567; y Morrison et al 1984 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851), o por fusión de la secuencia de codificación de inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . En las secuencias polipéptido sin inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio que combina antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.
Los anticuerpos aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los E.U.A. Número 4816567; y Morrison et al 1984 Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851-6855) . Anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo Mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humanas.
Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayoría, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región hipervariable al recipiente se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo. En algunos casos, residuos de región marco (FR = Framework Región) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. El fragmento Fe comprende las porciones carboxi terminales de ambas cadenas H sostenidas en conjunto por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fe, esta región también es la parte reconocida por receptores Fe (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células (Jones et al 1986 Nature 321:522-525; Riechmann et al 1988 Nature 332:323-329; Presta 1992 Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596; Verhoeyen et al 1988 Science 239:1534-1536; Sims et al 1993 J. Immunol. 151:2296; Chothia et al 1987 J. Mol. Biol. 196:901). Otros métodos utilizan una región marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas (Cárter et al 1992 Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al 1993 J. Immunol. 151:2623).
Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se describe aquí. Animales transgénicos (por ejemplo ratones) están disponibles que son capaces ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que deleción homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno . Transferencia de la matriz de genes (gene array) de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos ante prueba con antígeno (Jakobovits et al 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovits et al 1993 Nature, 362:255-258; Bruggemann et al 1993 Year in Inmuno. 7:33; Patente de los E.U.A. Número 5545806; Patente de los E.U.A. Número 5569825; Patente de los E.U.A. Número 5591669; Patente de los E.U.A. Número 5545807; y WO 1997/17852.
Un anticuerpo de "ingeniería de cisteína" es cuando uno o más aminoácidos de cualquier forma de tipo silvestre, anticuerpo monoclonal precursor murino, anticuerpo humano o humanizado, se remplazan con aminoácidos cisteína. El aminoácido cisteína de ingeniería es un ácido de cisteína libre y no es parte de una unidad disulfuro intracadena o intercadena. El ADN que codifica uno o más residuos aminoácido del anticuerpo de interés se modifica o "somete a ingeniería" de manera tal que uno o más codones por aminoácidos cisteína se introducen y de esta manera está disponible cisteína libre en el anticuerpo expresado para mayor modificación tal como una conjugación a una droga citotóxica.
Un "antígeno" es un predeterminado polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto de origen natural o sintético al cual puede ligar selectivamente un anticuerpo. La membrana celular de una célula puede presentar un "antígeno expuesto en superficie celular" .
Un anticuerpo "liga" un objetivo molecular o un antígeno de interés, en donde el enlace a ese antígeno es con suficiente afinidad y especificidad tal que se forma un complejo antígeno-anticuerpo que es útil para hacer blanco a los epítopos del antígeno. Los epítopos del antígeno pueden ser expuestos en la superficie de células o pueden estar presentes en una proteína aislada.
La expresión "enlace específico" o "enlazaespecífreamente a" o "es específico para" un objetivo molecular particular o un antígeno de interés o un epítopo en un objetivo molecular particular o un antígeno de interés, significa enlace que es diferente en forma medible de una interacción no específica. Enlace específico puede medirse por ejemplo al determinar enlace de una molécula en comparación con enlace de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura · similar que no tiene la actividad de enlace. Por ejemplo, enlace específico puede ser determinado por competencia con una molécula de control que es similar al objetivo, por ejemplo un exceso de un objetivo no etiquetado. En este caso, enlace específico se indica si el enlace del objetivo etiquetado a una sonda se inhibe en forma competitiva por exceso de objetivo no etiquetado. En una modalidad, estos términos se refieren a enlace en donde una molécula liga a un polipeptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin ligar sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo del polipéptido. En forma alterna, estos términos pueden describirse por una molécula que tiene una Kd para el' objetivo de al menos aproximadamente 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, o mayor.
"Afinidad de enlace" en general se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de enlace sencillo de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo un antígeno) . A menos que se indique de otra forma, como se emplea aquí, "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de enlace (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su socio Y en general puede representarse por la constante de disociación (Kd) . Afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo ¦ aquellos aquí descritos. Anticuerpos de baja afinidad en general ligan antigeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que anticuerpos de alta afinidad en general ligan antígeno más rápido y tienden a permanecer ligados más tiempo. Una variedad de métodos para medir afinidad de enlace se conocen en la técnica, cualquiera de los cuales puede utilizarse para propósitos de la presente invención.
Un "complejo de antígeno-anticuerpo" o un "complejo anticuerpo-conjugado de droga-antigeno", se forma como resultado de enlace especifico. Por ejemplo, cuando el anticuerpo es aquel que liga HER4 específicamente o una isoforma de HER4 específicamente, usualmente de preferencia ligará uno o más epítopos encontrados en el HER4, o su isoforma, y puede ser un anticuerpo que no tiene afinidad de enlace significante (por ejemplo, afinidad de enlace no específica o reactividad cruzada) , con otros antígenos o proteínas u otras isoformas de HER4. En estas modalidades, la extensión de afinidad de enlace no específica o enlace reactivo cruzado a no-HER4 u otras isoformas de HER4, será menor que 10%, 5%, 2%, o 1% como se determina por análisis de clasificación de células fluorescentes activadas (FACS = Fluorescence Activated Cell Sorting) o radioinmunoprecipitación (RIA) .
Un "anticuerpo intacto" aquí es aquel que comprende los dominios VL y VH, así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o su variante de secuencia de aminoácidos. El anticuerpo intacto puede tener uno o más "funciones efectoras" que se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región constante Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen enlace Clq; citotoxicidad dependiente de complemento; enlace de receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC= Antibody Dependent Cell Mediated Cytotoxicity) ; fagocitosis; y regulación por disminución de receptores de superficie celular tales como receptor de célula B y BCR.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos, y se utilizan en enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se les denomina las regiones marco (FRs) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas cada uno comprenden cuatro FRs, adoptando sustancialmente una configuración de hoja ß, conectados por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se sostienen unidas en proximidad inmediata por las FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antigeno de anticuerpos (ver abat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Los dominios constantes no se involucran directamente en enlace de un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .
El término "región hipervariable" , "HVR" , o "HV" , como se emplea aquí, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o. forman bucles estructuralmente definidos. En general, anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2 , L3 ) . Una cantidad de delineaciones de región hipervariable están en uso y abarcadas aqu . Las Regiones para Determinación de Complementariedad Kabat (CDRs) se basan en variabilidad de secuencia y son las más comúnmente empleadas (Kabat et al 1991) . Chothia se refiere por el contrario a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia and Lesk 1987 J. Mol. Biol. 196:901-917). Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristal complejo disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se notan a continuación. A menos de que se denote de otra forma, se empleará la numeración Kabat de acuerdo con la Base de Datos Kabat de secuencias de proteínas alineadas (Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250; Johnson and Wu 2000 Nuc . Acids Res. 28 (1) : 214-218) . La región hipervariable o ubicaciones de "Regiones de Determinación de Complementariedad" en general son como sigue: aminoácidos 24-34 (VL CDR-L1), aminoácidos 49-56 (VL CDR-L2 ) , aminoácidos 89-97 (VL CDR-L3), aminoácidos 26-35A (VH CDR-Hl) , aminoácidos 49-65 (VH CDR-H2), y aminoácidos.93-102 (VH CDR-H3 ) . Regiones hipervariables también pueden comprender "regiones hipervariables extendidas", aminoácidos 24-36 para VL CDR-L1 y aminoácidos 46-56 para VL CDR-L2. Los residuos de dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al 1991, supra para cada una de estas definiciones. Una "región hipervariable alterada" para los presentes propósitos es una región hipervariable que comprende uno o más (por ejemplo, una a aproximadamente 16) sustituciones de aminoácidos ahí. Una "región hipervariable no modificada" para los presentes propósitos es una región hipervariable que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo no humano del cual se derivó, es decir uno que carece de una o más sustituciones de aminoácidos .
Las expresiones "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat", "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat", y sus variaciones, se refieren al sistema de numeración empleado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al 1991 supra) . Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal actual puede contener menos o adicionales aminoácidos que corresponden a un acortamiento de, o inserción en un FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo .52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo FR de cadena pesada 82. La numeración Kabat de residuos puede ser determinada para un anticuerpo dado por alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar" .
Residuos "marco" o "FR" son aquellos los residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define aquí. Un "marco de consenso humano" es un marco que representa el residuo aminoácido de ocurrencia más común en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . En una modalidad, para VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al 1991.. En una modalidad, para VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al. Un "marco consenso de subgrupo III VH" comprende la secuencia consenso que se obtiene de las secuencias de aminoácido en el subgrupo de cadena variable III de Kabat et al 1991. Un "marco consenso de subgrupo I VL" comprende la secuencia consenso que se obtiene de las secuencias de aminoácido en el subgrupo kappa ligero variable I de Kabat et al 1991.
Un anticuerpo "madurado de afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo, que resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo por antígeno, en comparación con un anticuerpo que no posee esa o esas alteraciones. Anticuerpos madurados de afinidad tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Anticuerpos .madurados de afinidad son producidos por maduración de afinidad por transposición de dominio VH y VL (Marks et al 1992 Bio/Technology 10 : 779-783 ) , o mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos marco (Barbas et al 1994 Proc Nat . Acad. Sci.( USA 91 : 3809 -3813 ; Schier et al 1995 Gene 169 : 147 -155 ; Yelton et al 1995 J. Immunol . 155 : 1994-2004 ; Jackson et al 1995 J. Immunol. 154 ( 7 ) : 3310-9 ; y Hawkins et al 1992 J. Mol. Biol . 226 : 88.9 -896 ) .
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace de antígeno y reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en una asociación no covalente cerrada. Es' en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En forma colectiva, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un sólo dominio variable (p la mitad de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y ligar antígeno, aunque a una menor afinidad que todo el sitio de enlace.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHl) de la cadena pesada. Fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi del dominio CHl de cadena pesada incluyendo una o más ciste nas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en donde el o los residuos cisteína de los dominios constante contienen al menos un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos también se conocen.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa ( ) y lambda (?) , con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes .
Fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipéptido. El polipéptido Fv además comprende un enlazador polipéptido entre los dominios VH y VL que permite a scFv formar la estructura deseada para enlace de antígeno (Plückthun 1994 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315) .
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, estos fragmentos comprenden un VH conectado con un VL en la misma cadena polipéptido (VH - VL) . Al utilizar un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno (EP 404,097; WO 1993/11161; Hollinger et al 1993 Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90: 6444-6448) .
La expresión "conjugado de anticuerpo-droga" o "inmunoconjugados" comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, o sus fragmentos) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) .
Un "aminoácido de cisterna libre" se refiere a un residuo aminoácido de cisterna que se ha sometido a ingeniería en un anticuerpo precursor, tiene un grupo funcional tiol (-SH) , y no está apareado como, o de otra forma parte de, un puente disulfuro intramolecular o intermolecular .
La expresión "valor de reactividad tiol" es una caracterización cuantitativa de la reactividad de aminoácido cisteína libres. El valor de reactividad tiol es el porcentaje de aminoácido cisteína libre en un anticuerpo de ingeniería de cisteína .que reacciona con un reactivo, reactivo a tiol, y convierte a un valor máximo de 1. Por ejemplo, un aminoácido de cisteína libre en°un anticuerpo de ingeniería de cisteína que reacciona con rendimiento del 100% con un reactivo reactivo a tiol, tal como un reactivo biotina-maleimida, formará un anticuerpo etiquetado con biotina que tiene un valor de reactividad tiol de 1.0. Otro aminoácido cisteína de ingeniería en el mismo o diferente anticuerpo precursor que reacciona con 80% de rendimiento con un reactivo reactivo a tiol tendrá un valor de reactividad tiol de 0.8. Otro aminoácido de cisteína de ingeniería en el mismo o diferente anticuerpo precursor que falla totalmente en reaccionar con un reactivo reactivo a tiol tiene un valor de reactividad tiol de 0. La determinación del valor de reactividad tiol de una cisteína particular puede conducirse por ensayo ELISA, espectroscopia de masas, cromatografía de líquido, autoradiografía u otras pruebas analíticas cuantitativas. Reactivos reactivos a tiol que permiten la captura del anticuerpo de ingeniería de cisteína y comparación y cuantificación de la reactividad de cisteína incluyen biotina-PEO-maleimida ( ( + ) -biotinil-3-maleimidopropionamidil-3 , 6-dioxaoctain-diamina, Oda et al 2001 Nature Biotechnology 19:379-382, Pierce Biotechnology, Inc.) Biotina-BMCC, PEO-Yodoacetil Biotina, Yodoacetil-LC-Biotina, y Biotina-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.), y ?a-(3- maleimidilpropionil)biocitina (???, Molecular Probes, Eugene, OR) . Otras fuentes comerciales para biotinilación, reactivos enlazadores bifuncionales y multifuncionales incluyen Molecular Probes, Eugene, OR, y Sigma, St. Louis, MO.
Un anticuerpo o un conjugado anticuerpo-droga se "internaliza" cuando, después de formar un complejo con un antigeno de superficie celular, el complejo antígeno-anticuerpo o el complejo conjugado antígeno-anticuerpo-droga presente en la membrana de superficie celular se retira de la superficie de la célula e incorpora en la propia célula mediante una reacción bioquímica. Varias rutas de tráfico post endocíticas posibles posteriormente pueden acoplar al complejo. (Ver revisiones Schroeder et al 2001 "Recent advances in membrane microdomains : rafts, caveolae, and intracellular cholesterol trafficking . " Exp Biol . Med (Maywood) Nov;226 (10) : 873-90) , Spooner et al 2006 "Retrograde transport pathways utilized by viruses and protein toxins" Virol J. 2006; 3: 26) . Anticuerpos preparados contra proteína desnaturalizada serán útiles en transferencias Western, pero no se esperará que liguen epítopos de superficie celular ni formen complejos de anticuerpo-antígeno y de esta manera no serán internalizados.
Las expresiones "receptor Fe" o "FcR" significan un receptor que liga a la región constante Fe de un anticuerpo. Aún más, un FcR es aquel que liga un anticuerpo igG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y Fcy RUI, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme en forma alterna de estos receptores. Receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en inmuno receptor tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmuno receptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Ver revisión Daeron 1997 Annu. Rev. Immunol. 15:203-234). FcRs se revisan en Ravetch y Kinet 1991 Annu. Rev. Immunol. 9:457-92; Capel et al 1994 Immunomethods 4:25-34; y de Haas et al 1995 J. Lab. Clin. ed. 126:330-41. Otros FcRs, incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, se abarcan aquí por el término "FcR" . El término también incluye el receptor neonatal FcRn que es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al 1976 J. Immunol. 117:587 y Kim et al 1994 J. Immunol. 24:249).
"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en la presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se ligan a su antígeno cognado (Gazzano-Santoro et al 1996 J. Immunol . Methods 202:163).
"Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (por ejemplo, células Destructoras Naturales o linfocitos citolíticos espontáneos (NK= Natural Killer) neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo ligado en una célula objetivo y subsecuentemente provocan lisis de la célula objetivo. Estas células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FCYRIII solamente mientras que los monocitos expresan FcyRl, FcyRII y FCYRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet 1991 Annu. Rev. Immunol. 9:457-92. Para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC in vitro tal como el descrito en las Patentes de los E.U.A. Números 5500362 y 5821337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells) y células Destructoras Naturales (NK = Natural Killer) . En forma alterna o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como aquél descrito en Clynes et al 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:652-656.
"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más receptores de región constante (FcRs) y realizan funciones efectoras. Las células expresan al menos FCYRIII y realizan función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células destructoras naturales ( K) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo de sangre o PBMCs.
"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en donde el objeto es evitar o frenar (reducir) el desorden o condición patológico objetivo. Aquellos que requieren tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el desorden así como aquellos tendientes a tener el desorden o aquellos en quien se va a evitar el desorden. Un sujeto o mamífero es exitosamente "tratado" por cáncer si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo o conjugado anticuerpo-droga del mismo, de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células de cáncer o ausencia de células de cáncer; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (es decir, frenar en cierta medida o detener) infiltración de células de cáncer en órganos periféricos incluyendo la diseminación de cáncer en tejido suave y huesos; inhibición de metástasis de tumor; inhibición de crecimiento de tumor; y/o alivio en cierta medida, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducida morbilidad y mortalidad y mejora en aspectos de calidad de vida. En la extensión el anticuerpo o conjugado anticuerpo-droga del mismo, pueden evitar crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, pueden ser citostáticos y/o citotóxicos. Los parámetros para estimar tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad se miden fácilmente por procedimientos rutinarios familiares para un médico. Para terapia de cáncer, la eficacia puede medirse por ejemplo estimando el tiempo a avance para enfermedad (TTP = Time To Disease Progression) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR = Response Rate) . La metástasis puede determinarse por pruebas por etapas y por exploración de huesos y pruebas para nivel de calcio y otras enzimas para determinar diseminación al hueso. Exploraciones CT también pueden emplearse para buscar diseminación a la pelvis y nodos linfáticos en el área. Rayos X del pecho y medición de niveles de enzimas en el hígado por métodos conocidos, se emplean para buscar metástasis a los pulmones e hígado, respectivamente. Otros métodos rutinarios para supervisar la enfermedad incluyen ultrasonografía transrectal (TRUS = Transrectal Ultrasonography) y biopsia de aguja transrectal (TR B = Transrectal Needle Biopsy) .
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas y se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea malignas o benignas, y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de colon, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial) , cáncer pulmonar, incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas ("NSCLC = Non Small Cell Lung Cáncer"), adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer rectal, cáncer colorectal y carcinoma uterino o endometrial, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer bulbar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, cáncer de cabeza y cuello y melanoma .
Un cáncer que "sobreexpresa" un polipéptido es aquel que tiene niveles significativamente superiores del polipéptido en su superficie celular, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobreexpresión puede ser provocada por transcripción o traducción incrementada que a su vez puede haber sido provocada por anormalidades o cambios a nivel genético (por ejemplo mutaciones o alteraciones de ADN) , variantes de corte y empalme de AR m, o alteraciones en la actividad de factores de transcripción genéticos particulares, promotores o mejoradores. Sobreexpresión puede ser determinada en un ensayo de diagnóstico o pronóstico al evaluar niveles incrementados de la proteína receptora presente en la superficie de una célula (por ejemplo mediante un ensayo de inmunohistoquímica; IHC) . En forma alterna o adicional, se pueden medir niveles de ácido nucleico que codifica receptor en la célula, por ejemplo mediante hibridizacion fluorescente in situ (FISH; ver WO 1998/45479), transferencia southern, o técnicas de reacción de cadena polimerasa (PCR) , PCR de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) .
Las expresiones "desorden proliferativo celular" y "desorden proliferativo" se refieren a desórdenes que están asociados con cierto grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el desorden proliferativo celular es cáncer.
La expresión "cantidad terapéutica efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco o droga efectivo para tratar una enfermedad o desorden en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéutica efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño de tumor; inhibir (es decir frenar en cierta medida o detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir metástasis de tumor; inhibir en cierta proporción el crecimiento de tumor; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la extensión que la droga o fármaco puede evitar crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostática y/o citotóxica. El término "citostática" se refiere al efecto de limitar las funciones de células tales como limitar el crecimiento celular o proliferación de las células. Por ejemplo, en terapia de cáncer, la eficacia puede medirse al estimar el tiempo a avance de la enfermedad (TTP) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR) .
El término "etiqueta" significa cualquier porción que puede ser conectada covalentemente a un anticuerpo y que funciona para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con una segunda etiqueta para modificar la señal detectable que se proporciona por la primer o segunda etiqueta, por ejemplo transferencia de energía por resonancia-fluorescencia (FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer) ; (iii) estabilizar interacciones o incrementar afinidad de enlace con antígeno o ligando; (iv) afectar la movilidad, por ejemplo movilidad electroforética, o permeabilidad celular, por carga, hidrofobicidad, forma u otros parámetros físicos o (v) suministrar una porción de captura, para modular afinidad de ligando, enlace de anticuerpo/antígeno o complejado iónico.
La frase "sal farmacéutica aceptable" como se emplea aquí, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticas aceptables de ADC . Sales ejemplares incluyen pero no están limitadas a sales sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido y isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido o tartrato. Una sal farmacéutica aceptable puede involucrar la inclusión de otra molécula tal como un ión acetato, un ión succinato u otro contra-ión. El contra-ión puede ser una porción orgánica o inorgánica que estabiliza la carga en el compuesto. Además, una sal farmacéutica aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Instancias en donde múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéutica aceptable pueden tener múltiples contra-iones. Por lo tanto, una sal farmacéutica aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contra-iones .
"Solvato farmacéutico aceptable" se refiere a una asociación de una o más moléculas de solvente y ADC . Ejemplos de solventes que forman solvatos farmacéuticos aceptables incluyen pero no están limitados a agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, etil acetato, ácido acético y etanolamina.
"Portadores" como se emplean aguí, incluyen portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticos aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológico aceptable es una solución amortiguada de pH acuoso. Ejemplos de portadores fisiológicos aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contra-iones formadores de sales tales como sodio; y surfactantes no iónicos tales como T EEN®, polietilen glicol (PEG) , y PLURONICS®.
COMPOSICIONES Y MÉTODOS Isoformas HER4 Cuatro isoformas diferentes de manera estructural y funcional se generan a partir de un solo gen HER4 por corte y empalme alterno (18, 19) . Dos de las isoformas difieren en el dominio citoplásmico intracelular (isoformas CYT-1 y CYT-2). CYT-1 tiene un inserto de 16 aminoácidos dentro del dominio citoplásmico mientras que CYT-2 no tiene inserto (18) . La isoforma CYT-1 puede mediar el acoplamiento a fosfoinositida 3-quinasa (PI3-K) , pero no la isoforma CYT-2 (20, 21) .
Las otras dos isoformas (JM-a y JM-b) difieren por una inserción de cualquiera de 23 o 13 aminoácidos alternos en la región de yuxtamembrana extracelular (Figura 1) . JM-a es la isoforma con 23 aminoácidos dentro de la región de yuxtamembrana (NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA SEQ ID NO:l) mientras que JM-lb es la isoforma con 13 aminoácidos en la región (IGSSIEDCIGLMD SEQ ID NO : 2 ) (17, 23) .
La isoforma extracelular JM-a puede romperse por enzima que convierte-factor-a de necrosis de tumor (TACE) (22) mientras que la isoforma JM-b es resistente a proteinasa (23) . Rompimiento por TACE activa un segundo rompimiento de HER4 que involucra actividad ?-secretasa (24). Como resultado, el dominio intracelular (ICD) se libera de la membrana celular y transloca al núcleo en donde puede funcionar para regular la transcripción de genes (25-28) .
Consistente con la hipótesis que las isoformas HER4 difieren en su papel en tumorigénesis, la isoforma HER4 JM-a CYT-2 rompible pero no su contraparte JM-b CYT-2 no rompible, demuestra actividad independiente de ligando y promueve crecimiento de células de cáncer (26) . Además, localización de un epítopo HER4 intracelular en los núcleos se asocia con supervivencia más corta cuando se compara con localización de HER4 en la superficie celular (29) sugiriendo que el rompimiento HER4 pueda regular avance del tumor. Estas mismas isoformas rompibles previamente se han mostrado que son sobreexpresadas en una serie de clínica de muestras de paciente con cáncer de mama (18, 26) .
Además, las isoformas JM-a y JM-b exhiben diferentes patrones de distribución de tejido al igual con la isoforma JM-a que está ausente de tejido cardíaco (23).
Anticuerpos Específicos de Isoforma Un aspecto de la invención proporciona un anticuerpo que liga específicamente a la isoforma JM-a de HER4. En una modalidad, el anticuerpo liga específicamente tanto al receptor HER4 de longitud íntegra intacto que comprende la región de yuxtamembrana JM-a así como el ectodominio HER4 soluble. En otra modalidad, el anticuerpo liga específicamente a una secuencia de aminoácidos que comprende NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA SEQ ID N0:1. En otra modalidad, el anticuerpo liga específicamente a la secuencia de aminoácidos NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA (SEQ ID N0:1) .
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-HER4 aislado que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con la ATCC que tiene número de acceso PTA-9655. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo madurado de afinidad o humanizado derivado del anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con la ATCC que tiene número de acceso PTA-9655.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-HER4 que comprende un fragmento del anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con la ATCC que tiene número de acceso PTA-9655. El anticuerpo es específico para la isoforma JM-a de HER4. En una modalidad, el fragmento liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a . En una modalidad, el fragmento de mAb 1479 comprende al menos una porción de la región hipervariable . En una modalidad, el fragmento de mAb 1479 comprende la región hipervariable de cadena pesada. En una modalidad, el fragmento de mAb 1479 comprende la región hipervariable de cadena ligera. En otra modalidad, el fragmento comprende las regiones hipervariables de cadena ligera y pesada de mAb 1479. En una modalidad, el fragmento comprende la región hipervariable VHl, VH2 , o VH3. En una modalidad, el fragmento comprende al menos dos de las regiones hipervariables VHl, VH2, y VH3. En una modalidad, el fragmento comprende todas las tres regiones hipervariables VHl, VH2, y VH3. En una modalidad, el fragmento comprende la región hipervariable VLl, VL2, o VL3. En una modalidad, el fragmento comprende al menos dos de las regiones hipervariables VLl, VL2 , y VL3. En una modalidad, el fragmento comprende todas las tres regiones hipervariables VLl, VL2, y VL3. En una modalidad, el fragmento comprende al menos una, dos o tres de las regiones hipervariables VHl, VH2, o VH3 y al menos uha, dos o tres de las regiones hipervariables VLl, VL2 , y VL3. En una modalidad, el fragmento comprende todas las tres regiones hipervariables VHl, VH2 , o VH3 y todas las tres regiones hipervariables VLl, VL2, y VL3.
En una modalidad, el fragmento de mAb 1479 comprende al menos una porción de la región variable. En una modalidad, el fragmento de mAb 1479 comprende la región variable de cadena pesada. En una modalidad, el fragmento de mAb 1479 comprende la región variable de cadena ligera. En otra modalidad, el fragmento comprende la región variable ligera y pesada de mAb 1479.
En algunas modalidades, el fragmento comprende mutaciones que no disminuyen significativamente la especificidad de enlace del anticuerpo para la isoforma JM-a.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo que compite para enlace con la isoforma JM-a con el anticuerpo anti-HER4 mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con la ATCC que tiene número de acceso PTA-9655.
Todavía otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo que liga al mismo epítopo que el epítopo al cual el liga el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositado con ATCC con Número de acceso PTA-9655.
En una modalidad, el epítopo ligado por el anticuerpo monoclonal mAb 1479 comprende el ectodominio HER4. En otra modalidad, el epítopo ligado por el anticuerpo monoclonal mAb 1479 comprende al menos una porción de la secuencia de aminoácidos NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA (SEQ ID NO:l). En otra modalidad, el epítopo ligado por el anticuerpo monoclonal mAb 1479 comprende la secuencia de aminoácidos NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA (SEQ ID NO:l) .
En algunas modalidades, los anticuerpos específicos de isoforma JM-a son anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados .
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-HER4 que es específico para la isoforma JM-a reduce la fosforilación de tirosina HER4. La supresión de fosforilación de tirosina-receptor se ha mostrado está asociada con actividad antitumor de anticuerpos terapéuticos que hacen blanco en dominios extracelulares de otros receptores ErbB (39, 48, 49). El efecto de un anticuerpo anti-HER4 en fosforilación HER4 puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica, un ejemplo de lo cual se describe aquí en los Ejemplos 1 y 5. Brevemente, células que expresan HER4 se tratan con anticuerpo anti-HER4 después estimulado con NRG-1. Las células se lisan e inmunoprecipitan con un anticuerpo anti-HER4 general, tal como HFR-1 (R&D, Minneapolis, MN) , separado en geles SDS-PAGE, y analizado por transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina, tal como 4G10 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) . Las transferencias pueden ser exploradas y analizadas por densitometría de exploración para proporcionar un análisis cuantitativo. En algunas modalidades se incluye un control. En una modalidad, un control comprende una muestra de células que expresan HER4 estimuladas con NRG-1 en la ausencia de tratamiento con el anticuerpo anti-HER4. Las células se analizan por transferencia Western con las células tratadas. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 reduce la fosforilación de tirosina HER4 en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-HER4 que es específico para la isoforma JM-a reduce rompimiento HER4. El rompimiento de HER4 resulta en la liberación de un fragmento de ectodominio 100 kDa. Este evento también se refiere como excreción de ectodominio. El efecto de un anticuerpo anti-HER4 en rompimiento HER4 puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica, un ejemplo de lo cual se describe aquí en los Ejemplos 1 y 5. Brevemente, la reducción en el rompimiento HER4 puede detectarse al determinar la presencia del ectodominio en medio de cultivo celular de células que expresan HER4 tratadas con un anticuerpo anti-HER4. El rompimiento puede mejorarse al incluir forbol 13-miristato 12-acetato (PMA) en el ensayo. En algunas modalidades, se incluye un control. En una modalidad, un control se incluye en donde la presencia del ectodominio en el medio de cultivo celular de células que expresan HER4 no tratadas con un anticuerpo anti-HER4 se determina. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER4 reduce el rompimiento HER4 en al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
En algunas modalidades, el anticuerpo Anti-HER4 que es específico para la isoforma JM-a se internaliza. La internalización del anticuerpo puede emplearse para suministrar toxinas conjugadas con anticuerpo a células cancerosas que expresan la isoforma HER4 JM-a.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-HER4 que es específico para la isoforma JM-a promueve internalización HER4. La internalización de tirosina receptor quinasas se ha asociado con regulación por disminución de los receptores. En una- modalidad, el anticuerpo anti-HER4 disminuye la cantidad de HER4 en la superficie celular en al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. El efecto de un anticuerpo anti-HER4 en internalización HER4 puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica, un ejemplo de lo cual se describe aquí en los Ejemplos 1 y 6.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma JM-a de HER4 tiene menos cardiotoxicidad que un anticuerpo anti-HER4 que no es específico para la isoforma HER4 JM-a. La cardiotoxicidad es un efecto secundario asociado con muchos agentes terapéuticos inhibidores de receptor tirosina quinasa (62, 63). Anticuerpos que son específicos para la isoforma JM-a de HER4 se pronostica que producen menos efectos cardiotóxicos en pacientes que los anticuerpos anti-HER4s que reconocen la isoforma JM-b debido a que la isoforma JM-a no está presente en tejido cardiaco (23) . La cardiotoxicidad en un paciente se evidencia por una cantidad de síntomas incluyendo falla cardiaca, Disfunción Ventricular Izquierda (LVD = Left Ventricular Dysfunction) , isquemia de miocardio, hipertensión, tromboembolia venosa, bradicardia y prolongación de intervalo QT (medida del tiempo entre el inicio del la onda Q y el fin de la onda T en el ciclo eléctrico cardiaco) .
La cardiotoxicidad de un compuesto puede medirse, por ejemplo, al utilizar modelos de diagnóstico in vitro o in vivo.
La determinación in vitro de cardiotoxicidad puede realizarse al exponer células cardiacas a un compuesto de prueba y observar cuales quiera cambios en la apariencia de la célula o la proporción apoptósica celular. Cambios relevantes en apariencia de la célula incluyen hinchado y degeneración mitocondrial . La apoptosis celular puede supervisarse por ejemplo, por marcado de extremo libre de deoxiuridina 5-trifosfato mediado por deoxinucleotidil transferasa terminal. Adicionalmente, la secreción incrementada de enzimas o productos químicos apoptósicos relacionados por las células . es indicativa de cardiotoxicidad. Estos productos químicos o enzimas incluyen troponina, péptidos natriuréticos tales como propéptido N-terminal de tipo B (pro-BNP) , citocromo-C y caspasa-9. Células cardiacas que pueden emplearse como el modelo de célula cultivada incluyen miocitos ventriculares primarios o adultos cultivados o neonatales (cardiomiocitos) que se obtienen de un modelo animal conveniente, tal como de ratón o rata. (62-64) .
La determinación in vivo de cardiotoxicidad puede realizarse por ejemplo, al inyectar un compuesto de prueba en un modelo de animal conveniente, tal como un ratón o rata, y observar el efecto del compuesto de prueba en la estructura del tejido cardiaco del modelo, apariencia y función cardiaca mitocondrial , y/o en proporciones de apoptosis de tejido cardiaco de modelo (62). Modelos cardiacos aislados, o preparaciones de Langendorf, son también útiles para determinar la cardiotoxicidad de compuestos (63).
La cardiotoxicidad también puede medirse por observaciones clínicas. Por ejemplo, falla cardiaca y LVD se miden por diagnóstico clínico que combina la historia del paciente y examen físico con pruebas de diagnóstico tales como electrocardiograma (EKG) , radiografía de pecho, y exploración de adquisición de múltiples compuertas (MUGUA = multigated acquisition sean) , isquemia al Miocardio se determina por examen físico, detectar necrosis de miocardio, detectar cambios en EGK, y detectar elevaciones incrementadas en enzimas cardiacas . La hipertensión se determina al medir la presión sanguínea de un paciente. Aquellos pacientes con una presión sanguínea mayor o igual a 140/90 mm de Hg en general se considera que tienen hipertensión. Tromboembolia venosa se detecta por ultrasonografía de compresión, angiografía tomografía, angiografía pulmonar de resonancia magnética o técnicas de medicina nuclear. Bradicardia en general se define como un ritmo cardiaco menor a 60 latidos por minuto y se detecta al determinar el ritmo cardiaco combinado con EKG o análisis de monitor Holter. La prolongación del intervalo QT 4s una anormalidad de la actividad eléctrica del corazón y puede determinarse por análisis EKG. En general, un intervalo QT menor a o igual a 440 milisegundos se considera normal, mientras que un intervalo QT es mayor a 450 milisegundos en hombres y 470 milisegundos en mujeres en general se consideran prolongado (64) .
Fragmentos de Anticuerpo La presente invención abarca fragmentos de anticuerpo . Fragmentos de anticuerpo pueden generarse por medios tradicionales, tal como digestión enzimática o por técnicas recombinantes . En ciertas circunstancias hay ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpo, en vez de anticuerpos enteros. El tamaño menor de los fragmentos permite una rápida liberación, y puede llevar a acceso mejorado a tumores sólidos. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, ver Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical y Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)) . Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células hospederas recombinantes . Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv todos pueden ser expresados en y secretados de E. coli, de esta manera permitiendo la producción fácil de grandes cantidades de sus fragmentos. Fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpo discutidas anteriormente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) . De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células hospederas recombinantes. Fragmento Fab y F(ab')2 con incrementada vida media in vivo que comprende residuos de epítopo de enlace receptor de rescate, se describen en la Patente de los E.U.A. Número 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes al practicante con destreza. En ciertas modalidades, un anticuerpo es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Ver WO 93/16185; Patentes de los E.U.A. Números 5,571,894; y 5,587,458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están carentes de regiones constantes; de esta manera, pueden ser adecuadas para reducido enlace no específico durante uso in vivo. Proteínas de fusión scFv pueden construirse para dar por resultado fusión de una proteína efectora ya sea en el extremo amino o carboxi de una scFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe por la Patente de los E.U.A. Número 5,641,870, por ejemplo. Estos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos .
Anticuerpos Humanizados La invención abarca anticuerpos humanizados. Diversos métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos aminoácidos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos, a menudo se refieren como residuos "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), al sustituir secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A. Número 4,816,567) en donde substancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie, no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizarse en producir los anticuerpos humanizados, puede ser importante para reducir antigenicidad. De acuerdo con el método de "mejor ajuste" así denominado, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas . La secuencia humana que es más cercana a la del roedor entonces se acepta como el marco humano para el anticuerpo humanizado. Ver, por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro método utilrza un marco particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes. Ver, por ejemplo, Cárter et al. (1992) Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Además en general es conveniente que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr esta meta, de acuerdo con un método, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tri-dimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tri-dimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y exhiben probables estructuras de conformación tri-dimensional de secuencias de inmunoglobulina candidata selectas. La inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar a su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias recipiente y de importación, de manera tal que la característica de anticuerpo deseada, tal como incrementada afinidad para el o los antígenos objetivo se logre. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados directa y más substancialmente en influenciar el enlace de antígeno.
Anticuerpos Humanos Anticuerpos humanos de la invención pueden construirse al combinar una o varias secuencias de dominio variable de clon Fv, seleccionadas de bibliotecas de expresión fago derivadas de humanos con una o varias secuencias de dominio constante humano conocidas como se describió anteriormente. En forma alterna, anticuerpos humanos monoclonales de la invención pueden elaborarse por el método de hibridoma . Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos humanos monoclonales se han descrito por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., antiboby monoclonal Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).
Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, ante inmunización, de producir un repertorio íntegro de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que' la deleción homozigota del gen de la región de unión de cadena pesada anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos ante prueba con antígeno. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90 : 2551 ( 1993 ) ; Jakobovits et al., Nature, 362 : 255 ( 1993 ) ; Bruggermann et al., Year in Immunol. , 7 : 33 ( 1993 ) .
La transposición de genes también puede emplearse para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo, roedores, en donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este método, que también se denomina "impresión de epítopo", ya sea la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por técnicas de expresión en fago como se describe aquí, se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humano, creando una población de quimeras Fab o scFv de cadena humana/cadena no-humana. La selección con antígeno resulta en aislamiento de un Fab o scFv quimérico de cadena humana/cadena no-humana, en donde la cadena humana restaura el sitio de enlace de antígeno destruido al retirar la cadena no humana correspondiente en el clon de expresión en fago primario, es decir el epítopo regula (imprime) la selección del socio de cadena humana. Cuando el proceso se repite para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver PCT WO 93/06213 publicada en abril 1, 1993) . A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no-humanos por injertos CDR, ésta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano.
Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace para al menos dos antígenos diferentes. En ciertas modalidades, anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanos o humanizados. En ciertas modalidades, una de las especificidades de enlace es para la isoforma HER4 JM-a y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, anticuerpos biespecíficos pueden ligar a dos epítopos diferentes de la isoforma HER4 JM-a. Anticuerpos biespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos a células que expresan la isoforma HER4 JM-a. Estos anticuerpos poseen el brazo de enlace de isoforma HER4 JM-a y un brazo que liga un agente citotóxico, tal como, por ejemplo, saporina, anti-interferona- , vinca alcaloide, cadena ricina A, metotrexato o hapteno isótopo radioactivo. Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2).
Métodos para producir anticuerpos biespecíficos , se conocen en la técnica. Tradicionalmente , la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática, y son bajos los rendimientos de producto. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829 publicada en mayo 13, 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. En ciertas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para enlace de cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo hospedero conveniente. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas polipéptido empleadas en la construcción, proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales resulta con altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significancia particular.
En una modalidad de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma más fácil de separación.
Este enfoque se describe por WO 94/04690. Para mayores detalles para generar anticuerpos biespecíficos ver por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .
De acuerdo con otro enfoque, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodímeros que se recuperan de cultivo de célula recombinante . La interfase comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo, se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las. cadenas laterales grandes, se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de aminoácido con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros .
'Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados " . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Estos anticuerpos por ejemplo, se han propuesto para hacer blanco en células del sistema inmune a células indeseadas (patente de los E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección VIH (HIV) (WO 91/00360, WO' 92/00373, y EP 03089). Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualquier método de entrelazamiento conveniente. Agentes de entrelazamiento convenientes son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente de los E.U.A. No. 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento .
Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando * enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se rompen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complejante ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab '- NB se vuelve a convertir al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Reciente avance ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli, que puede ser acoplado químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby. et al., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado de E. coli, y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de ligar a células que sobre-expresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos o blancos de tumor de mama humano.
Varias técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante se han descrito también. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab1 de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo.
La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en una misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados para aparear con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) , también se reportaron. Ver Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (1994).
Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan.
Por ejemplo, anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Anticuerpos Mul ivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual liga los anticuerpos . Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a la clase Ig ) con tres o más sitios de enlace de antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. En ciertas modalidades, el dominio de dimerización comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlaces de antígeno amino-terminales a la región Fe. En ciertas modalidades, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho sitios de enlace de antígeno. En una modalidad semejante, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste de) cuatro sitios de enlace de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipéptido (por ejemplo, dos cadenas polipéptido) , en donde la o las cadenas polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender VDl-(Xl)n -VD2- (X2)n -Fe, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender: cadena de región VH-CH1-enlazador flexible-VH-CHl-Fc; o cadena de región VH-CHl-VH-CHl-Fc. El anticuerpo multivalente aquí además puede comprender al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable-cadena ligera. El anticuerpo multivalente aquí, por ejemplo puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí, comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente, además comprenden un dominio CL.
Anticuerpos de un Solo-Dominio En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de un solo dominio. Un anticuerpo de un solo dominio es una cadena polipétido sencilla que comprende todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ejemplo patente de los E.U.A. No. 6,248,516 Bl) . En una modalidad, un anticuerpo de un solo dominio consiste de todo o una porción del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo.
Variantes de Anticuerpo En algunas modalidades, se contemplan una o varias modificaciones de secuencia de aminoácido de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia aminoácido del anticuerpo pueden prepararse al introducir cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifican el anticuerpo, o por síntesis de péptido. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o substituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción, y substitución puede elaborarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos de-anticuerpo objeto al tiempo que se elaborara esa secuencia.
Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para mutagénesis, se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazan por un amino acido neutro o de carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones entonces se refinan al introducir adicionales u otras variantes en o para los sitios de substitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia aminoácido está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no 'requiere ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, mutagénesis aleatoria o de exploración ala se realiza en la región o codón objetivo y las inmunoglobulinas expresadas se criban por la actividad deseada .
Inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones terminales amino- y/o carboxilo en el intervalo de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácido sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal . Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo N- o C- del anticuerpo a una enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.
En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención se altera para incrementar o disminuir la extensión a la cual se glicosila el anticuerpo. La glicosilación de polipéptidos típicamente ya está N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la conexión de una porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-x-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para conexión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquieras de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la conexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también pueden emplearse.
La adición o deleción de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos tal que una o más de las secuencias tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicosilación N-enlazados) es creada o eliminada. La alteración también puede elaborarse por la adición, deleción o substitución de uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación 0-enlazados) .
Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato conectado puede ser alterado. Anticuerpos nativos producidos por células de mamífero, típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que en general se conecta por un enlace N- a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, mannosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa, y ácido siálico, así como fucosa conectada a GlcNAc en el "tronco" de una estructura oligosacárido biantenaria. En algunas modalidades, modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención pueden realizarse para crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.
Por ejemplo, variantes de anticuerpo se proporcionan que tienen una estructura carbohidrato que carece de fucosa conectada (directa o indirectamente) a una región Fe. Estas variantes pueden tener una función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de patente de los E.U.A. Nos. US 2003/0157108 (Presta, L. ) ; US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas a variantes de anticuerpo "defucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; O 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO. 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004).
Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lecl3 CHO deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al. Aren. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de Patente de los E.U.A. No. US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas de células inoperativas , tales como el gen alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO inoperativas (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng., 94 ( 4 ) : 680-688 (2006); y WO2003 /085107 ) .
Variantes de anticuerpos además se proporcionan con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en donde un oligosacárido biantenario conectado a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc . Estas variantes de anticuerpo pueden tener reducida fucosilación y/o mejorada función ADCC. Ejemplos de estas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de los E.U.A. No. 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). Variantes de anticuerpo con al menos un residuo galactosa en el oligosacárido conectado a la región Fe, también se proporcionan. Estas variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Estas variantes, de anticuerpo se describen por ejemplo, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
En ciertas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región . Fe con una o más sustituciones de aminoácido que además mejoran ADCC, por ejemplo sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración Eu de residuos) . Estas sustituciones pueden ocurrir en combinación con cualquiera de las variaciones anteriormente descritas.
En ciertas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que las hacen un candidato conveniente para muchas aplicaciones en donde la vida media del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o nocivas. En ciertas modalidades, las actividades Fe del anticuerpo se miden para asegurar que solo se mantengan las propiedades deseadas. Ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo pueden realizarse para confirmar la reducción/agotamiento de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, ensayos de enlace receptor Fe (FcR) pueden conducirse para asegurar que el anticuerpo carece de enlace FcyR (por lo tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero retiene una actividad de enlace FcRn . Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fe. RUI solamente, mientras que los monocitos expresan Fc.RI, Fc.RII y Fe. RUI. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés, se describen en la patente de los E.U.A. No. 5,500,362 (ver, por ejemplo Hellstrom, I., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (see Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). En forma alterna, métodos de ensayos no radioactivos pueden emplearse (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactiva ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI) . Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PB C) y células Destructoras Naturales (N ) . En forma alterna o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimare in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como el que se describe por Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ensayos de enlace Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de ligar Clq y por lo tanto carece de la actividad CDC. Para estimar activación de complemento, un ensayo CDC puede realizarse (ver, por ejemplo, Gazzano- Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y .J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Enlace FcRn y determinación de vida media/liberación in vivo también pueden realizarse utilizando método conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12) .1759-1769 (2006)).
Otras variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos se proporcionan. Sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero alteraciones FR también se contemplan. Sustituciones conservadoras se ilustran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" se proporcionan en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a las clases de aminoácidos. Sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos cribados, por ejemplo, por una actividad deseada, tal como mejorado enlace de antígeno, disminuida inmunogenicidad, mejorada ADCC o CDC, etc .
TABLA 1 Residuo Sustituciones Sustituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) Val; Leu; He Val Arg (R) Lys ; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Gln Lys; Arg Asp (D) Glu ; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys ; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Leu Ala; Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; He Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; He Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Tyr He; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; 'Ser Ser Trp (W) Tyr ; Phe Tyr Tyr (Y) Tr ; Phe ; Thr ; Phe Ser Val (V) lie; Leu; Met; Leu Phe; Ala; Norleucina Modificaciones en las propiedades biológicas de un anticuerpo puede lograrse al seleccionar sustituciones que afectan (a) la estructura principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed. , pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975) ) : (1) no-polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares sin carga: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) acídicos: Asp (D) , Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) En forma alterna, residuos de origen natural pueden dividirse en grupos con base en propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Sustituciones ¦ no conservadoras involucrarán intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos sustituidos también pueden ser introducidos en los sitios de sustitución conservadores o, en los sitios restantes (no-conservados) .
Un tipo de variantes de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para adicional desarrollo tendrán propiedades biológicas modificadas (por ejemplo, mejoradas) respecto al anticuerpo precursor del cual se generan. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado de afinidad, que puede generarse convenientemente utilizando técnicas de maduración por afinidad basadas en expresión de fago.
Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Los anticuerpos asi generados exhiben de partículas de fago filamentoso como fusiones a cuando menos parte de una proteína de revestimiento fago (por ejemplo, el producto de gen III de M13) empacado dentro de cada partícula. Las variantes de expresión en fago después se criban por su actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlace) . Para identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, mutagénesis de exploración (por ejemplo, barrido o rastreo de alanina) pueden ser realizados para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a enlace de antígeno. En forma alterna o adicional, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo de anticuerpo-antígeno, para, identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Estos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo aquellas aquí elaboradas. Una vez que estas variantes se generan, el panel de variantes se somete a criba utilizando técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo aquellas aquí descritas, y variantes con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para mayor desarrollo.
Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo, se preparan por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácido de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida por sitio) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete de una variante previamente preparada o una versión no variante del anticuerpo.
Puede ser conveniente introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fe de anticuerpos de la invención, de esta manera generando una variante de región Fe. La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región humana IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 Fe) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido incluyendo la de una cisteína bisagra.
De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que en algunas modalidades, un anticuerpo de la invención puede comprender una o más alteraciones en comparación con el anticuerpo contraparte de tipo silvestre, por ejemplo en la región Fe. Estos anticuerpos sin embargo retendrán sustancialmente las mismas características requeridas para la utilidad terapéutica en comparación con su contraparte de tipo silvestre. Por ejemplo, se considera que ciertas alteraciones pueden realizarse en la región Fe que resultarán en enlace Clq alterado (es decir, ya sea mejorado o disminuido) y/o Citotoxicidad Dependiente de Complemento Clq (CDC) , por ejemplo como se describe por W099/51642. Ver también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente de los E.U.A. No. 5,648,260; patente de los E.U.A. No. 5,624,821; y W094/29351 referente a otros ejemplos de variantes de región Fe. WOOO/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcRs . El contenido de estas publicaciones de patente se incorpora específicamente aquí por referencia. Ver, también, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticuerpos con vidas medias incrementadas y mejorado enlace a receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable por la transferencia de IgGs maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones que mejoran el enlace de región Fe a FcRn. Variantes polipéptido con secuencias de aminoácido de región Fe alteradas y capacidad de enlace Clq incrementada o disminuida se describe por la patente de los E.U.A. No. 6,194,551B1, W099/51642. Los contenidos de estas, publicaciones de patente se incorporan específicamente aquí por referencia. Ver, también, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) .
En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en la interfase de polipéptidos Fe que comprenden la región Fe, en donde las modificaciones facilitan y/o promueven heterodimerización. Estas modificaciones comprenden introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fe y una cavidad en un segundo polipéptido Fe, en donde la protuberancia se ubica en la cavidad para promover complejado del primer y segundo polipéptidos Fe. Métodos para generar anticuerpos con estas modificaciones se conocen en la técnica, por ejemplo como se describe por la patente de los E.U.A. No. 5,731,168.
Todavía en otro aspecto, puede ser conveniente el crear anticuerpos de ingeniería de cisteína, por ejemplo, "tioMAbs", en donde uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos ocurren en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir estos residuos con cisteína, grupos tiol reactivos de esta manera se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y pueden emplearse para conjugar el anticuerpo con otras porciones, tales como porciones de droga o fármaco o porciones enlazador-fármaco como se describe más aquí. En ciertas modalidades, cualquiera uno o más de los siguientes residuos puede estar sustituido con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada.
Derivados de Anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención además pueden modificarse para contener porciones no proteináceas adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. De. preferencia, las porciones adecuadas para derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no están limitados a polietilen glicol (PEG) , copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano , copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona) polietilen glicol, homopolímeros de propropilen glicol, copolímeros de propilen óxido/etilen óxido, polioles polioxietilados (e.g., glicerol) , polivinil alcohol y sus mezclas. Polietilen glicol propionaldehído puede tener ventajas para fabricar debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o sin ramificar. El número de polímeros conectados al anticuerpo puede variar, y si se conecta más de un polímero, pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros empleados para la derivatización puede determinarse con base en consideraciones, incluyendo pero no limitadas a las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.
En otra modalidad, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y porción no proteinácea que pueden calentares selectivamente por exposición a radiación. En una modalidad, la porción no proteinácea es nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no está limitada a longitudes de onda que no dañan a células ordinarias, pero que calientan la porción no proteinácea a una temperatura en la cual se exterminan células próximas a la porción anticuerpo-no proteinácea.
Ciertos Métodos para Producción de Anticuerpos Ciertos Métodos Basados en Hibridoma' Anticuerpos monoclonales de la invención pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), y descrito adicionalmente por ejemplo en Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y. , 1981), y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4) :265-268 (2006) respecto a hibridomas humano-humano. Métodos adicionales incluyen aquellos descritos por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 7,189,826 respecto a producción de anticuerpos IgM naturales humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma. La tecnología de hibridoma humana (tecnología Trioma) se describe por Vollmers and, Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3 ) : 927-937 (2005) y Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Para diversas otras técnicas de hibridoma, ver por ejemplo US 2006/258841; US 2006/183887 (anticuerpos humanos completos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; y las Patentes de los E.U.A. Números 7,078,492 y 7,153,507. Un protocolo ejemplar para producir anticuerpos monoclonales utilizando el método de hibridoma, se describe a continuación. En una modalidad, un ratón u otro animal hospedero apropiado tal como un hámster, se inmuniza para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ligarán específicamente a la proteína empleada para inmunización. Anticuerpos se desarrollan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) de un polipéptido que comprende la isoforma HER4 JM-a, o su fragmento, y un adyuvante tal como un monofosforil lípido A (MPL) /trehalosa dicrinomicolato (TDM). (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) . Un polipéptido que comprende la isoforma HER4 JM-a o su fragmento, puede prepararse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como métodos recombinantes , algunos de los cuales se describen adicionalmente aquí . Suero de animales inmunizados se ensaya para anticuerpos de isoforma anti-HER4 JM-a, y se administran opcionalmente inmunizaciones de refuerzo. Linfocitos de animales que producen anticuerpos de isoforma anti-HER4 JM-a se aislan. En forma alterna, linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
Los linfocitos después se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente, tal como polietilen glicol para formar una célula de hibridoma. Ver, por ejemplo Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986). Células de mieloma pueden emplearse que fusionan eficientemente, soportan producción a alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Células de mieloma ejemplares incluyen pero no están limitadas a líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.., New York, 1987) ) .
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente, por ejemplo un medio que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras sin fusión. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , estas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. De preferencia, métodos de cultivo celular de hibridoma libre de suero se emplean para reducir el uso del suero derivado de animal tal como suero bovino fetal como se describe por ejemplo en Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006) .
Oligopéptidos como herramientas para mejorar la productividad de cultivos celulares de hibridoma se describen por Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005) . Específicamente, medios de cultivo estándar se enriquecen con ciertos aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina) , o con fracciones de hidrolizado de proteína y apoptosis puede suprimirse significativamente por oligopéptidos sintéticos, constituidos de tres a seis residuos aminoácido. Los péptidos están presentes a concentraciones milimolares o superiores.
Medio de cultivo en donde las células de hibridoma crecen puede ensayarse para producción de anticuerpos monoclonales que ligan a la isoforma HER4 JM-a. La especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma, puede determinarse por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede determinarse por ejemplo por análisis Scatchard. Ver, por ejemplo, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980) .
Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitante y desarrollados por métodos estándar. Ver por ejemplo, Goding, supra. Medios de cultivo convenientes para este propósito incluyen por ejemplo medio D-MEM o RPMI-1640. Además, células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores de ascitis en un animal. Anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como por ejemplo proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Un procedimiento para aislar proteínas de células de hibridoma se describe por la publicación de patente de los E.U.A. US 2005/176122 y en la Patente de los E.U.A. Número 6,919,436. El método incluye utilizar sales mínimas, tales como sales liotrópicas, en el proceso de enlace y de preferencia también utilizar pequeñas cantidades de solventes orgánicos en el proceso de elusión.
Ciertos Métodos de Criba de Biblioteca Anticuerpos de la invención pueden elaborarse utilizando bibliotecas combinatorias para cribar anticuerpos con la o las actividades deseadas. Por ejemplo, se conoce una variedad de métodos en la técnica para generar bibliotecas de expresión en fago y cribar estas bibliotecas por anticuerpos que poseen las características de enlace deseadas. Estos métodos se describen en general en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) . Por ejemplo, un método para generar anticuerpos de interés es a través del uso de una biblioteca de anticuerpo fago como se describe por Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-93.
En principio, clones de anticuerpos sintéticos se eligen al cribar bibliotecas fago que contienen fagos que exhiben diversos fragmentos de región variable de anticuerpo (Fv) fusionados a proteína de revestimiento fago. Estas bibliotecas fago son seleccionadas por ciclos de adsorción-desorción mediante cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Clones que expresan fragmentos Fv capaces de ligar al antígeno deseado, se adsorben al antígeno y de esta manera separan de los clones sin enlace en la biblioteca. Los clones de enlace después se eluyen del antígeno, y pueden ser adicionalmente enriquecidos por ciclos adicionales de adsorción/elusión de antígeno. Cualquiera de los anticuerpos de la invención puede obtenerse al diseñar un procedimiento de criba de antígeno conveniente para seleccionar el clon fago de interés seguido por construcción de un clon de anticuerpo de longitud íntegra utilizando secuencias Fv del clon fago de interés y secuencias de región constante convenientes (Fe) descritas por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fift Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols .
En ciertas modalidades, el dominio de enlace de antigeno de un anticuerpo se forma de dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, cada una de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) , que ambas presentan tres bucles hipervariables (HVRs) de regiones de determinación de complementareidad (CDRs) . Dominios variables pueden exhibir funcionalidad en fago, ya sea como fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) , en donde VH y VL se ligan covalentemente a través de un péptido flexible, corto o como fragmentos Fab, en donde se fusionan cada uno a un dominio constante e interactúan en forma no covalente como se describe por Winter et al., Ann. Rev. Immunol . , 12: 433-455 (1994). Como se emplea aquí, clones fago que codifican scFv y clones fago que codifican Fab se refieren colectivamente como "clones fago Fv" o "clones Fv" .
Repertorio de genes VH y VL puede clonarse por separado mediante reacción de cadena polimerasa (PCR) y recombinados aleatoriamente en bibliotecas fago, que pueden entonces buscarse por clones de enlace de antígeno como se describe por Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin el requerimiento de construir hibridomas. En forma alterna, el repertorio sin tratamiento previo puede clonarse para proporcionar una fuente de anticuerpos humanos a un amplio intervalo de antígenos no propios y también propios, sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas sin tratamiento previo también pueden hacerse sintéticamente al clonar los segmentos de gen V sub-rearreglados de células madre, y utilizando cebadores PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones altamente variables CDR3 y lograr rearreglo in vitro como se describe por Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
En ciertas modalidades, fago filamentoso se utiliza para exhibir fragmentos de anticuerpo por fusión a la proteína de revestimiento menor pIII. Los fragmentos de anticuerpo pueden exhibirse como fragmentos Fv de cadena sencilla, en donde dominios VH y VL se conectan en la misma cadena polipéptido por un espaciador polipéptido flexible, por ejemplo como se describe por Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en donde una cadena se fusiona a pIII y la otra se secreta en el periplasma- de célula hospedera bacteriana en donde el ensamblado de la estructura de proteína de revestimiento Fab que se exhibe en la superficie fago al desplazar algo de las proteínas de revestimiento de tipo silvestre, por ejemplo como se describe por Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991) .
En general, ácidos nucleicos que codifican fragmentos de gen de anticuerpo se obtienen de células inmunes cosechadas o recolectadas de humanos o animales. Si una biblioteca sesga a favor de unos clones de isoforma anti-HER4 JM-a se desea, el sujeto se inmuniza con la isoforma HER4 JM-a para generar una respuesta a anticuerpo, y células de bazo y/o células B en circulación otros linfocitos de sangre periférica (PBLs) se recuperan para construcción de biblioteca. En una modalidad preferida, una biblioteca de fragmento de gen de anticuerpo humano sesgada a favor de clones de isoforma anti-HER4 JM-a se obtiene al generar una respuesta de anticuerpo de isoforma anti-HER4 JM-a en ratones transgénicos que transportan una matriz génica de inmunoglobulina humana funcional (y que carece de un sistema de producción de anticuerpo endógeno funcional) , tal que la inmunización de isoforma HER4 JM-a da lugar a células B que producen anticuerpos humanos contra la isoforma HER4 JM-a. La generación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se describe a continuación.
Enriquecimiento adicional para poblaciones de células reactivas a isoforma a anti-HER4 JM-a puede obtenerse al utilizar un procedimiento de criba conveniente para aislar células B que expresan el anticuerpo ligado a membrana específico de isoforma HER4 JM-a, por ejemplo por separación de células utilizando cromatografía de afinidad o adsorción de células a isoforma HER4 JM-a etiquetada con fluorócromo seguido por clasificación de células activada por flujo (FACS) .
En forma alterna, el uso de células de bazo y/o células B u otras PBLs de un donador no inmunizado proporciona una mejor representación del repertorio de anticuerpos posible y también permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos utilizando cualquier especie animal (humano o no humano) en donde la isoforma HER4 JM-a no es antigénica. Para bibliotecas que incorporan construcción de gen de anticuerpo in vitro, células madre se recolectan del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifican segmentos de gen de anticuerpo sub-rearreglados . Las células inmunes de interés pueden obtenerse de una variedad de especies animales, tales como humano, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y aves, etc.
Segmentos de gen variable de anticuerpo que codifica ácido nucleico (incluyendo segmentos VH y VL) se recuperan de las células de interés y amplifican. En el caso de rearreglo de bibliotecas de gen VH y VL, el ADN deseado puede obtenerse al aislar ADN genómico aislado o ARNm de linfocitos seguido por reacción de cadena polimerasa (PCR) con cebadores que aparean los extremos 5 ' y 3 ' de los genes VH y VL rearreglados como se describe por Orlandi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86 : 3833 -3837 ( 1989 ) , de esta manera haciendo diversos repertorios de gen V para expresión.
Los genes V pueden amplificarse a partir de ADNc y ADN genómico, con cebadores posteriores en el extremo 5' del exón que codifica el dominio V maduro y cebadores directos con base dentro del segmento J como se describe por Orlandi et al. (1989) y en Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar de ADNc, cebadores posteriores también pueden basarse en el exón líder como se describe por Jones et al., Biotechnol . , 9: 88-89 (1991), y cebadores directos dentro de la región constante como se describe por Sastry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989) . Para llevar al máximo la complementariedad, puede incorporarse degeneración en los cebadores como se describe por Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989) . En ciertas modalidades, la diversidad de biblioteca se lleva al máximo al utilizar cebadores PCR dirigidos a cada familia de gen V a fin de amplificar todos los arreglos VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de célula inmune, por ejemplo como se describe por el método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o como se describe por el método de Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para clonar ADN amplificado en vectores de expresión, pueden introducirse sitios de restricción raros dentro del cebador PCR como una etiqueta en un extremo como se describe por Orlandi et al. (1989), o por adicional amplificación PCR con un cebador etiquetado como se describe por Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).
Repertorios de genes V rearreglados sintéticamente pueden derivarse in vitro de segmentos de gen V. La mayoría de los segmentos de gen VH humanos se han clonado y secuenciado (reportado en Tomlinson et al., J. Mol. Biol . , 227: 776-798 (1992)), y cartografiado (reportado en Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluyendo todas las conformaciones mayores del bucle Hl y H2) pueden emplearse para generar diversos repertorios de gen VH con cebadores PCR que codifican bucles H3 de diversas secuencias y longitudes como se describe por Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Repertorios VH también pueden elaborarse con toda la diversidad de secuencia enfocada en un bucle H3 largo de una sola longitud como se describe por Barbas et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Segmentos V«r y VÁ humanos se han clonado y secuenciado (reportado en Williams and Winter, Eur. J. Immunol . , 23: 1456-1461 (1993)) y pueden utilizarse para producir repertorios de cadena ligera sintéticos. Repertorios de gen V sintéticos, con base en un intervalo de' pliegue VH y VL, y longitudes L3 y H3 , codificarán anticuerpos de diversidad estructural considerable. Después de amplificación de gen ADNs que codifican gen V, pueden re-arreglarse segmentos de gen V de línea germinal in vitro, de acuerdo con los métodos de Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) .
Repertorios de fragmentos de anticuerpo pueden construirse al combinar repertorios de genes VH y VL junto en varias formas . Cada repertorio puede crearse en diferentes vectores, y los vectores recombinados in vitro, por ejemplo, como se describe por Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo por infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993) . El enfoque recombinación in vivo explota la naturaleza de dos cadenas de fragmentos Fab para superar el límite en tamaño de biblioteca impuesto por eficiencia de transformación de E. coli. Repertorios VH y VL sin tratamiento previo se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector fago. Las dos bibliotecas después se combinan por infección fago de bacterias que contienen fagémido de manera tal que cada célula contiene una combinación diferente y el tamaño de biblioteca se limita solo por el número de células presentes (aproximadamente 1012 clones) . Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo, de manera tal que los genes VH y VL se recombinan en un solo replicón y se empacan en forma conjunta en viriones fago. Éstas enormes bibliotecas proporcionan grandes cantidades de anticuerpos diversos de buena afinidad (Kd-1 de aproximadamente 10-8 M) .
En forma alterna, los repertorios pueden clonarse secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo como se describe por Barbas et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblarse en conjunto por PCR y después clonarse, por ejemplo como se describe por Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). El ensamblado PCR también puede emplearse para unir VH y VL ADNs con ADN que codifican un espaciador péptido flexible para formar repertorio Fv de cadena sencilla (scFv) . Todavía en otra técnica, "en ensamblado PCR celular" se utiliza para combinar genes VH y VL con linfocitos por PCR y después clonar repertorios de genes ligados como se describe por Embleton et al., Nucí. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992) .
Los anticuerpos producidos por bibliotecas sin tratamiento previo (ya sea naturales o sintéticas) pueden ser de moderada afinidad (Kd-1 de aproximadamente 106 a 107 -l) , pero maduración de afinidad también puede imitarse in vitro al construir y volver a seleccionar de bibliotecas secundarias como se describe por Winter et al. (1994), supra. Por ejemplo, la mutación puede introducirse al azar in vitro al utilizar polimerasa tendiente a error (reportado en Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el método de Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, puede realizarse maduración por afinidad al mutar aleatoriamente una o más CDRs , por ejemplo utilizando PCR con cebadores que transportan secuencia aleatoria que se extiende por la CDR de interés, en clones Fv individuales selectos y cribar por los clones de más alta afinidad. WO 9607754 (publicada el 14 de marzo 1996 ) describe un método para inducir mutagénesis en una región de determinación de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otro enfoque efectivo es recombinar los dominios VH o VL seleccionados por expresión en fago con repertorios de variantes de dominio V de origen natural, que se obtienen de donadores no inmunizados y criba para superior afinidad en varias rondas de reconstitución de cadena como se describe por Marks et al., Biotechnol., 10 : 779 -783 ( 1992 ) . Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades de aproximadamente 10-9 M o menos.
La criba de las bibliotecas puede lograrse por diversas técnicas conocidas en la especialidad. Por ejemplo, la isoforma HER4 J -a puede utilizarse para revestir los pozos de placas de adsorción, expresadas en células hospederas fijas con placas de adsorción o utilizadas en clasificación celular, o conjugar a biotina para capturar con perlas revestidas con estraptavidina, o utilizadas en cualquier otro método para selección por ciclos de adsorción-desorción de bibliotecas de expresión de fago.
Las muestras de bibliotecas fago se ponen en contacto con la isoforma HER4 JM-a inmobilizada bajo condiciones adecuadas para ligar al menos una porción de las partículas fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluyendo pH, concentración iónica, temperatura y semejantes, se eligen para imitar condiciones fisiológicas. Los fagos ligados a la fase sólida se lavan y después se eluyen por ácido, por ejemplo como se describe por Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o por álcali, por ejemplo como se describe por Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o por competencia de antígeno, por ejemplo en un procedimiento similar al método de competencia de antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos pueden enriquecerse 20-1 , 000-veces en una sola ronda de selección. Aún más, los fagos enriquecidos pueden crecer en cultivo bacteriano y someterse a adicionales rondas de selección.
La eficiencia de selección depende de muchos factores, incluyendo la cinética de disociación durante lavado, y si múltiples fragmentos de anticuerpo en un solo fago pueden acoplar simultáneamente con antígeno. Anticuerpos con rápidas cinéticas de disociación (y débiles afinidades de enlace) pueden retenerse por uso de lavados cortos, expresión en fago multivalente y alta densidad de revestimiento de antígeno en fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes , sino que favorece el volver a ligar el fago que se ha disociado. La selección de anticuerpos con lentas cinéticas de disociación (y buenas afinidades de enlace) pueden promoverse por uso de prolongados lavados y expresión en fago monovalente como se describe por Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en WO 92/09690, y una baja densidad de revestimiento de antígeno como se describe por Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
Es posible seleccionar entre anticuerpos fago de diferentes afinidades, incluso con afinidades que difieren ligeramente, para la isoforma HER4 JM-a. Sin embargo, mutación al azar de un anticuerpo selecto (por ejemplo como se realiza en algunas técnicas de maduración de afinidad) , es probable que de lugar a muchos mutantes, la mayoría que ligan a antígeno, y unos cuantos · con superior afinidad. Con isoforma HER4 JM-a limitante, puede ser descartado por competencia raro fago de afinidad elevada. Para retener todos mutantes de superior afinidad, pueden incubarse fagos con isoforma HER4 JM-a biotinilada en exceso, pero con la isoforma HER4 JM-a biotinilada a una concentración de menor molaridad que la constante de afinidad molar objetivo para isoforma HER4 JM-a. Los fagos de enlace de alta afinidad pueden entonces capturarse por perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina. Esta "captura de equilibrio" permite que los anticuerpos se seleccionen de acuerdo con sus afinidades de enlace, con sensibilidad que permite aislamiento de clones mutantes con tan poco como afinidad dos veces superior de un gran exceso de fagos con menor afinidad. Condiciones empleadas para lavar fagos ligados a una fase sólida también pueden manipularse para discriminar en base a la cinética de disociación.
Clones de isoforma anti-HER4 JM-a pueden seleccionarse con base en actividad. En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpo de isoforma anti-HER4 JM-a que ligan a células vivas que expresan naturalmente la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, la invención proporciona anticuerpo de isoforma anti-HER4 JM-a que bloquean el enlace entre la isoforma HER4 JM-a y un ligando HER4, tal como neuregulina, pero no bloquean el enlace entre una neuregulina y una segunda proteína. Clones Fv que corresponden a estos anticuerpos de isoforma anti-HER4 JM-a pueden seleccionarse por (1) aislar clones de isoforma anti-HER4 JM-a de una biblioteca fago como se describe anteriormente, y amplificar opcionalmente la población aislada de clones fago al desarrollar la población en un hospedero bacteriano conveniente; (2) seleccionar la isoforma HER4 JM-a y una segunda proteína contra las cuales se desea respectivamente actividad bloqueadora y no-bloqueadora; (3) adsorbiendo los clones fago de isoforma anti-HER4 JM-a a isoforma HER4 JM-a inmovilizada; (4) utilizando un exceso de la segunda proteína para eluir cualesquiera clones deseados ¦que reconocen determinantes de enlace de isoforma HER4 J -a superponen o son compartidos con los determinantes de enlace de la segunda proteína; y (5) eluir los clones que permanecen adsorbidos después de la etapa (4) . Opcionalmente, clones con las propiedades deseadas bloqueadoras/no-bloqueradoras pueden ser tradicionalmente enriquecidos al repetir los procedimientos de selección descritos aquí, una o más veces.
ADN que codifica anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o clones Fv de expresión en fago de la invención se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar cebadores oligonucleótidos diseñados para amplificar específicamente las regiones de codificación de cadena pesada y ligera de interés a partir de plantilla de ADN fago o hibridoma. Una vez aislado el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfieren en células hospederas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células hospederas recombinantes . Artículos de revisión en expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican anticuerpo incluye Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992) .
ADN que codifican los clones Fv de la invención puede combinarse con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de cadena pesada y/o cadena ligera (por ejemplo las secuencias de ADN apropiadas pueden obtenerse de Kabat et al., supra) para formar clones que codifican cadenas ligeras y/o pesadas de longitud completa o parcial. Se apreciará que regiones constantes de cualquier isotipo pueden emplearse para este propósito, incluyendo regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE y que dichas regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal . Un clon Fv derivado de ADN de dominio variable de una especie animal (tal como humano) y después fusionado a ADN de región constante de otra especie animal para formar una o varias secuencias de codificación para "híbrido", cadena pesada y/o cadena ligera de longitud íntegra, se incluye en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido" como se emplea aquí. En ciertas modalidades, un clon Fv derivado de ADN variable humano se fusiona a un ADN de región constante humana para formar una o varias secuencias de codificación para cadenas ligeras y/o pesadas humanas de longitud completa o parcial.
ADN que codifican anticuerpo de isoforma anti-HER4 JM-a derivado de hibridoma de la invención también puede ser modificado, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y ligera humana, en lugar de secuencias murinas homologas derivadas del con de hibridoma por ejemplo en el método de Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)) . ADN que codifica un anticuerpo derivado de hibridoma- o clon Fv o fragmento puede además modificarse por unión covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia de codificación para polipéptido sin inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tiene la especificidad de enlace del clon Fv o anticuerpos derivados de clon de hibridoma de la invención.
Vectores, Células Hospederas y Métodos Recombinantes También pueden producirse anticuerpos utilizando métodos recombinantes . Para la producción recombinante de un anticuerpo de isoforma anti-HER4 JM-a, ácido nucleico que codifican el anticuerpo se aisla e inserta en un vector replicable para adicional clonación (amplificación del ADN) o para expresión. ADN que codifica el anticuerpo puede aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes de vector en general incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento me orador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción.
Componente de secuencia de señal Un anticuerpo de la invención puede producirse en forma recombinante no solo directamente, sino también como una polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que de preferencia es una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de rompimiento específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada de preferencia es aquella es. reconocida y procesada (es decir, rota por una señal peptidasa) por la célula hospedera. Para células hospederas procarióticas que no reconocen y procesan una secuencia de señal de anticuerpo nativa, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes de enterotoxina termoestable II. Para secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede ser substituida por ejemplo, por el líder invertasa de levadura, o líder de factor- a (incluyendo líderes de factor-a Saccharomyces y Kluyveromyces ) , o líder de fosfatasa ácida, el líder C. albicans glucoamilasa, o la señal descrita en WO 90/13646. En expresión de células de mamífero, secuencias de señal de mamífero así como líderes secretorios virales, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex, están disponibles .
Originen de replicacion Tanto vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células hospederas selectas . En general, en vectores de clonación esta secuencia es aquella que permite al vector replicar independientemente del ADN cromosomal hospedero, e incluye orígenes de replicacion o secuencias de replicacion autónoma. Estas secuencias son bien conocidas por una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el origen del componente de replicacion no se requiere para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 puede típicamente emplearse solo debido a que contiene el promotor temprano) .
Selección de componente gen Vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren' resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para frenar el crecimiento de una célula hospedera. Estas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo, producen una proteína que confiere resistencia a droga y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos o drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina .
Otro ejemplo de marcadores seleccionables convenientes para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber ácido nucleico que codifica anticuerpo, tales como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina quinasa, metalotioneína-I y -II, de preferencia genes de metalotioneína de primate, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.
Por ejemplo, células transformadas con el gen DHFR se identifican al cultivar los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Bajo estas condiciones, el gen DHFR se amplifica junto con cualquier otro ácido nucleico co- transformado. Una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR endógena (por ejemplo, ATCC CRL-9096) puede emplearse.
En forma alterna, células transformadas con el gen GS se identifican al cultivar los transformantes en un medio de cultivo que contiene L-metionina sulfoximina (Msx) , un inhibidor de GS. Bajo estas condiciones, el gen GS se amplifica junto con cualquier otro ácido nucleico co-transformado . El sistema de amplificación/selección GS puede ser empleado en combinación con el sistema de amplificación/selección de DHFR descrito anteriormente.
En forma alterna, células hospederas (particularmente hospederos de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, gen DHFR de tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3 ' -fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina, o G418. Ver patente de los E.U.A. No. 4,965,199.
Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad por desarrollar o crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula hospedera de levadura, proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofano. Similarmente, cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2.
Además, vectores derivados del plásmido circular pKDl de 1.6 xm pueden emplearse para la transformación de levaduras de Kluyveromyces . En forma alterna, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina de ternero recombinante se reportó para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990) . Vectores de expresión de múltiples-copias estables para secreción de albúmina de suero humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991) .
Componente promotor Vectores de expresión y clonación en general contienen un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y es enlazado operativamente con ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Promotores adecuados para utilizar con hospederos procarióticos incluyen el promotor phoA, ß-lactamasa y sistemas promotores de lactosa, promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) , y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente con el ADN que codifica un anticuerpo .
Secuencias promotoras se conocen para eucariotas .
Virtualmente, todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes, es la región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleotido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresión eucarióticos.
Ejemplos de secuencias promotoras convenientes para utilizar con hospederos de levadura, incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas , tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfo-fructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quínasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles, tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2, isocitócromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables por utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en expresión de levadura además se describen en EP 73,657. Mejoradores de levadura también se emplean ventajosamente con promotores de levadura.
Transcripción de anticuerpo de vectores en células hospederas de mamífero puede ser controlada, por ejemplo por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B, Virus de Simio 40 (SV40) , o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospederas .
Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen viral SV40 de replicación. El promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresión de ADN en hospederos de mamífero utilizando el virus de papiloma bovino como un vector, se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,601,978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) en expresión de ADNc de ß-interferona humana en células de ratón bajo el control de un promotor de timidita quinasa a partir de virus herpes simplex. En forma alterna, la repetición terminal larga del irus Rous Sarcoma puede emplearse como el promotor.
Mejorador de componente elemento Transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de esta invención por superiores eucariotas, a menudo se incrementa al insertar una secuencia mejoradora en el vector. Muchas secuencias mejoradoras ahora se conocen de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, -fetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo se utilizará un mejorador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270), el mejorador promotor temprano de citomegalovirus , el mejorador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y mejoradores de adenovirus . Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en elementos de mejora para activación de promotores eucarióticos . El mejorador puede ser combinado en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el anticuerpo, pero de preferencia se ubica en un sitio 5' del promotor.
Transcripción de componente de terminación Vectores de expresión empleados en células hospederas eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducción 5 ' y ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducción del anticuerpo que codifica ARNm. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino. Ver WO94/11026 y el vector de expresión ahí descrito.
Selección y transformación de células hospederas Células hospederas convenientes para clonación o expresión de ADN en los vectores aquí, son procariotas, levaduras o células eucariotas superiores descritas anteriormente. Procariotas convenientes para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Un hospedero de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) . Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes.
Anticuerpo de longitud íntegra, proteínas de fusión de anticuerpo, y fragmentos de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando la glicosilacion y función efectora Fe no se requieren, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) que por sí misma muestra efectividad en • destrucción de células de tumor. Anticuerpos de longitud íntegra tienen mayor vida media en circulación. Producción en E. coli es más rápida y más efectiva en costo. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5 , 648 , 237 (Cárter et . al.), la patente de los E.U.A. No. 5 , 789 , 199 (Joly et al.), la patente de los E.U.A. No. 5 , 840 , 523 (Simmons et al.), que describen región de inicio de traducción (TIR = Translation Initiation Región) y secuencias de señal para optimizar expresión y secreción. Ver también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003 ) , pp. 245 -254 , que describe expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Después de expresión, el anticuerpo puede aislarse de pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través, por ejemplo de una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. Purificación final puede llevarse a cabo similar al proceso para purificar anticuerpo expresado por ejemplo en células CHO.
Además de procariotas, microbios eucarioticos tales como hongos filamentosos o levaduras son hospederos de expresión o clonación convenientes para vectores de codificación de anticuerpo. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de repostero común, es lo más comúnmente empleado entre los microorganismos hospederos eucarioticos inferiores . Sin embargo, una cantidad de otros géneros, especies y cepas comúnmente están disponibles y son útiles aquí, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospederos de luyveromyces tales como, e.g., ?. lactis, ?. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotoler ns , y K. marxianus ; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis ; y hongos filamentosos tales como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospederos Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Para una revisión que discute el uso de levaduras y hongos filamentosos para la producción de proteínas terapéuticas, ver, por ejemplo Gerngross, Nat . Biotech. 22:1409-1414 (2004) .
Ciertas cepas de levaduras y hongos pueden seleccionarse <en donde se han "humanizado" rutas de glicosilacion que resultan en la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilacion parcial o totalmente humano. Ver, por ejemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (que describe humanización de la ruta de glicosilacion en Pichia pastoris); y Gerngross et al., supra.
Células hospederas convenientes para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos . Numerosas cepas de baculovirus y variantes y células hospederas de insectos permisivas correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de fruta) , y Bombyx mori, se han identificado. Una variedad de cepas virales para transíección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-'l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden emplearse como el virus aquí de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Cultivos de células de plantas de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, lenteja de agua (Lemnaceae) , alfalfa (M. truncatula) , y tabaco también pueden emplearse como hospederos. Ver, por ejemplo las patentes de los.E.U.A. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (describen tecnología PLANTIBODIESTM para producir anticuerpos en plantas transgériicas) .
Células de vertebrados pueden emplearse como hospederos, y propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se han vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares hospederas de mamífero útiles son línea CVl de riñon de mono por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino ( DCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Otras líneas celulares de hospedero de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares hospederas de mamífero, adecuadas para producción de anticuerpos, ver, e.g., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268.
Células hospederas se transforman con los vectores de clonación de expresión anteriormente-descritos para producción de anticuerpo y cultivados en medios nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Cultivo de las células hospederas Las células hospederas empleadas para producción de anticuerpo de esta invención, pueden cultivarse en una variedad de medios . Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y Medio Eagle Modificado con Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102 : 255 (1980), patentes de los E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de re-expedición de los E.U.A. No. 30,985 pueden emplearse como medios de cultivo para las células hospederas . Cualquiera de estos medios puede ser suplementado según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden incluirse a concentraciones apropiadas que se conocerán por aquellos con destreza en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y semejantes, son aquellas previamente empleadas con la célula hospedera seleccionada para expresión, y serán aparentes a la persona con destreza ordinaria.
Purificación de anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse en forma intracelular, en el espacio periplásmico, o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce en forma intracelular, como una primera etapa, los desechos de partículas, ya sea células hospederas o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela pasta celular en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) sobre aproximadamente 30 min. Los desechos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado 'al medio, sobrenadantes de estos sistemas de expresión, en general primero se concentran utilizando un filtro de concentración de proteínas , comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y antibióticos pueden incluirse para evitar el crecimiento de contaminantes adversos .
La composición de anticuerpo preparada de las células pueden purificarse utilizando por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, con ' cromatografía de afinidad que es una de las etapas de purificación típicamente preferidas. La conveniencia de proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio de inmunoglobulina Fe que está presente en el anticuerpo. Proteína A puede emplearse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ??, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)) . Proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz de la cual el ligando de afinidad se enlaza, más a menudo es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten más rápidos gastos de flujo y más cortos tiempos de procesamiento que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX™resin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una 'resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromato enfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.
Siguiendo cualesquiera etapas de purificación preliminares, la mezcla comprende el anticuerpo de interés y contaminantes pueden someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH, utilizando un amortiguador de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, de preferencia realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M de sal).
En general, diversas metodologías para preparar anticuerpos para utilizar en investigación, prueba y clínicas están bien establecidas en la técnica, consistentes con las metodologías anteriormente-descritas y/o como se considera apropiado por una persona con destreza en la técnica para un anticuerpo particular de interés .
Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunocon ugados (referidos en forma intercambiable como "conjugados de anticuerpo-fármaco" o "ADCs") que comprenden un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotoxicos, tales como un agente quimioterapéutico, una droga o fármaco, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina de prote na, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, planta o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) .
Los inmunoconjugados se han empleado para suministro local de agentes citotoxicos, es decir, drogas que exterminan o inhiben el crecimiento o proliferación de células, en el tratamiento de cáncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinión in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23 (9 ) : 1137-1146 ; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; patente de los E.U.A. No. 4,975,278). Los inmunoconjugados permiten el suministro dirigido de una porción de fármaco a un tumor, y la acumulación intracelular ahí, en donde la administración sistémica de fármacos no conjugados puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad a células normales así como células de tumor que se buscan eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Ambos anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales se han reportado como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol. Immunother . 21:183-87). Fármacos empleados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Toxinas empleadas en conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cáncer Inst. 92 (19) : 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y calicheamicina (Lode et al (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342) . Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos por mecanismos que incluyen enlace tubulina, enlace de ADN, o inhibición de topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos de receptor de proteína.
ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murino dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos B malignos y normales y radioisótopo lllln o 90Y ligado por un quelador-enlazador de tiourea (Wiseman et al (200Ó) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 (7) :766-77; Wiseman et al (2002) Blood 9 (12 ): 4336-42 ; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10) :2453-63 ; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15) :3262-69) . Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no Hodgkin de célula B (NHL) , la administración resulta en citopenias severas y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals) , un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por un anticuerpo huCD33 enlazado a calicheamicina, fue aprobado en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7) :686; patentes de los E.U.A. Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado mediante enlazador disulfuro SPP a la porción de fármaco maitansinoide, DM1, avanza en pruebas Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tal como de colon, pancreático, gástrico y otros cánceres. MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal antígeno de membrana específica anti-próstata (PSMA = anti-prostate specific membrane antigen) ligado a la porción de fármaco maitansinoide, DM1, está bajo desarrollo por su tratamiento potencial de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, fueron conjugados con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos a Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos a CD30 en malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnol . 21 (7 ): 778-784 ) y están bajo desarrollo terapéutico.
En ciertas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterapéutico u otra toxina. Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen aquí (por ejemplo, con anterioridad) . Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina- A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo WO 93/21232 publicada en octubre 28, 1993. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 1311, 1311?, 90Y y 186Re. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento-proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe por Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminapentaacético etiquetado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.
Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina, maitansinoides , dolastatinas , aurostatinas , un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan aquí .
Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (longitud íntegra o fragmentos) conjugado con una o más moléculas de maitansinoide .
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir polimerización de tubulina. La maitansina priero se aisló del arbusto africano Maytenus serrata (patente de los E.U.A. No. 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como un maitansinol y C-3 maitansinol ésteres (patente de los E.U.A. No. 4,151,042). Maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se describen por ejemplo, en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.
Porciones de droga maitansinoides atractivas en conjugado de drogas o fármacos-anticuerpo debido a que son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) susceptibles a derivatización con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los enlazadores no disulfuro a anticuerpos, (iii) estable en plasma, y (iv) efectivos contra una variedad de líneas celulares de tumor.
Inmunocon ugados que contienen maitansinoides , métodos para producir los mismos, y su uso terapéutico, se describen por ejemplo, en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe inmunocon ugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal humano. El conjugado se encontró que es altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumor en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjugados en donde se conjuga un maitansinoide mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que enlaza a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, u otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que liga el oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado maitansinoide-TA.1 se prueba in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa antígeno de superficie 3 x 105 HER-2 por célula. El conjugado de fármaco logra un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que puede incrementarse al aumentar el número de moléculas maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones .
Conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan por enlace químico de un anticuerpo con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de cualquiera del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Ver, por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,208,020 (la descripción de la cual aquí se incorpora expresamente por . referencia) . Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo han mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperará que mejore la citotoxicidad sobre el uso del anticuerpo desnudo. Maitansinoides son bien conocidos en la técnica y puede ser sintetizados por técnicas conocidas o aislados de fuentes naturales. Maitansinoides convenientes se describen, por ejemplo en la patente de los E.U.A. No. 5,208,020 y en otras patentes y publicaciones que no son de patente referidas previamente. Maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como diversos maitansinol ésteres .
Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para producir conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo por ejemplo aquellos descritos en la patente de los E.U.A. No. 5,208,020 o la patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y la Solicitud de Patente de los E.U.A. No. de Serie 10/960,602, presentada en octubre 8, 2004, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador S CC pueden prepararse como se describe por la Solicitud de Patente de los E.U.A. No. de Serie 10/960,602, presentada en octubre 8, 2004. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos lábiles peptidasa., o grupos lábiles esterasa, como se describe en las patentes anteriormente identificadas, grupos disulfuro y tioéter se prefieren. Grupos enlazadores adicionales se describen y ejemplifican aquí.
Conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ásteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p- azidobenzoil ) hexan-diamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Agente de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.
El enlazador puede conectarse a la molécula maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede formarse por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales . La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-4 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
Auristatinas y dolastatinas En . algunas modalidades, el inmunocon ugado comprende un anticuerpo conjugado a dolastatina o análogos y derivados peptídicos de dolastatina, las auristatinas (Patentes de los E.U.A. Números 5635483; 5780588) . Las dolastatinas y auristatinas se han mostrado que interfieren con la dinámica de microtúbulos , hidrólisis GTP, y división nuclear y celular (Woike et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12 ): 3580-3584) y tienen actividad anti cáncer (Patente de los E.U.A. Número 5663149) y antifungal (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción de fármacos dolastatina y auristatina puede conectarse o agregarse al anticuerpo a través del extremo N (a ino) o el extremo C (carboxilo) de la porción de fármaco peptídico (WO 02/088172) .
Modalidades de auristatina ejemplares incluyen las porciones DE y DF del fármaco monometil auristatina enlazado en el extremo N, descritas en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 10/983,340, presentada en noviembre 5, 2004, la descripción de la cual se incorpora expresamente por referencia en su totalidad.
Típicamente, porciones de fármacos basados en péptido pueden prepararse al formar un enlace péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos péptido. Estos enlaces péptido puede prepararse por ejemplo de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (ver E. Schroder and K. Lübke, «The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocida en el campo de química de péptidos . Las porciones de fármaco auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de las Patentes de los E.U.A. Números 5635483; 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R. , et al. Sinthesis, 1996, 719-725; and Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans . 1 5:859-863. Ver también Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7) :778-784; "Monomethilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", la Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 10/983,340, presentada en noviembre 5, 2004, aquí incorporada por referencia en su totalidad (que describe por ejemplo enlazadores y métodos para preparar compuestos de monometilvalina tales como MAE y MMAF conjugados con enlazadores) .
Calicheamicina En otras modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos calicheamicina es capaz de producir interrupciones o rupturas de ADN de doble hebra a concentraciones subpicomolar . Para la preparación de conjugados de la familia calicheamicina, ver Patentes de los E.U.A. Números 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cianamid Compani) . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden emplearse incluyen pero no están limitados a, ???, 2?, a3?, N-acetil-??? , PSAG y T11 (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de los E.U.A. otorgadas a American Cianamid anteriormente mencionadas) . Otro fármaco antitumor al que puede conjugarse el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto calichea icina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora enormemente sus efectos citotóxicos .
Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse a los anticuerpos, incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las patentes de los E.U.A. Números 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (Patente de los E.U.A. Número 5,877,296).
Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse, incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada en octubre 28, 1993.
La presente invención además contempla un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleol tica (por ejemplo una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como deoxiribonucleasa; DNasa) .
Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen e isótopos radiactivos de At211, 1131, 1125, 190, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32, Pb212 de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gamagráficos , por ejemplo tc99m o 1123, o una etiqueta espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear RMN (NMR) (también conocido como formación de imagen por resonancia magnética, mri= magnetic resonance imaging) , tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, fluoro-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro .
Las radio- u otras etiquetas pueden incorporarse en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o puede ser sintetizado por síntesis química de aminoácidos utilizando adecuados precursores de aminoácidos que involucran por ejemplo flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas tales como tc99m o 1123, Rel86, Rel88 y Inlll pueden conectarse mediante un residuo cisteína en el péptido. Itrio-90 puede conectarse mediante un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophis . Res. Commun. 80: 49-57) puede emplearse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphi" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Conjugados del anticuerpo y agentes . citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexan-diamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazonio benzoil ) -etilen-diamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminepentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14 es una agente quelante ejemplar para conjugación de radionüclido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador foto lábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de los E.U.A. Número 5,208,020), puede emplearse.
Los compuestos contemplan expresamente, pero no están limitados a ADC preparado con reactivos de entreenlazadores : BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC , SMPB, SMPH, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona)benzoato) , que están comercialmente disponibles (pór ejemplo de Pierce Biotechnologi , Inc., Rockford, IL., U.S. A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Manual de Solicitudes y Catálogo.
Preparación de conjugados de fármaco anticuerpo En los conjugados fármaco anticuerpo (ADC) , un anticuerpo (Ab) se conjuga con una o más porciones de fármaco (D) , por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 20 porciones de fármaco por anticuerpo a través de un enlazador (L) . El ADC de la Fórmula I puede prepararse por varias rutas, que emplean reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por aquellos con destreza en la técnica, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido por reacción con una porción de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una porción de fármaco con un reactivo enlazador bivalente para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido por reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo. Métodos adicionales para preparar ADC se describen aquí .
Ab-(L-D)p I El enlazador puede estar compuesto por uno o más componentes enlazadores . Componentes enlazadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-fe"), p-aminobenziloxicarbonil ( "PAB" ) , N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC ) , y N-Succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes enlazadores adicionales se conocen en la técnica y algunos se describen aquí. Ver también "Monomethilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 10/983,340, presentada en noviembre 5, 2004, los contenidos de la cual aquí se incorporan por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades , el enlazador puede comprender residuos aminoácido. Componentes enlazadores aminoácido ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-fe) . Tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gli-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gli-gli-gli ) . Residuos aminoácido que comprenden un componente enlazador aminoácido incluyen aquellos que ocurren naturalmente, asi como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que no son de origen natural tales como citrulina. Componentes enlazadores de aminoácido pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para rompimiento enzimático por enzimas particulares, por ejemplo una proteasa asociada con tumor, catepsina B, C y D, o una plasmina proteasa.
Grupos nucleofílieos en anticuerpos incluyen, pero no están limitados a: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína, y (iv) grupos amino o azúcar hidroxilo en donde el anticuerpo está glicosilado. Grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílieos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como ésteres HS, ésteres HOBt, haloformiatos , y haluros de ácido; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles es decir puentes cisteina. Anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos enlazadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol ) . Cada puente cisteina de esta manera formará teóricamente dos nucleófilos tiol reactivos. Grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) resultando en conversión de una amina en un tiol. Grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o su fragmento) al introducir uno, dos, tres, cuatro o más residuos cisteina (por ejemplo preparar anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos aminoácido cisteina no nativos) .
Conjugados de anticuerpo-fármaco también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir porciones electrof licas , que pueden reaccionar con sustituyentes nucleof licos en el reactivo enlazador o el fármaco. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden ser oxidados, por ejemplo con reactivos de oxidación peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o porciones de fármaco. Los grupo base Schiff imina resultantes pueden formar un enlace estable o pueden ser reducidos por ejemplo por reactivos borohidruro para formar enlaces amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glicosilado ya sea con galactosa oxidasa o metaperyodato de sodio puede dar por resultado grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que puedan reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Técnicas Bioconjugado) . En otra modalidad, proteínas que contienen residuos serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con metaperyodato de sodio, resultando en producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente de los E.U.A. Número 5362852) . Este aldehido puede reaccionarse con una porción de fármaco o nucleófilo enlazador .
Igualmente, grupos nucleofílieos en una porción de fármaco incluyen pero no están limitados a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, hidracina carboxilato, y arilhidracida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ásteres HOBt, haloformiatos , y haluros de ácido; (ii) alquil y benzil haluros tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo y maleimida.
En forma alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotoxico puede elaborarse por ejemplo por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del con ugado .
Todavía en otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en blanco prev io de tumor, en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por eliminación de conjugado no ligado de la circulación utilizando un agente de liberación y después administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga a un agente citotoxico (por ejemplo un radionúcleo) .
Usos Terapéuticos Los anticuerpos aquí descritos pueden emplearse para el tratamiento de cáncer, incluyendo tumores pre-cancerosos, no metastáticos y cancerosos (por ejemplo, cáncer de etapa temprana) , o par el tratamiento de un sujeto con riesgo en desarrollar cáncer, por ejemplo, cáncer de mama. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo también pueden emplearse para tratar o evitar enfermedades no malignas, tales como desordenes autoinmunes y neurológicos .
Los anticuerpos que son específicos para la isoforma JM-a encuentran utilidad particular en tratamiento de cánceres u otros desordenes caracterizados por la expresión de la isoforma JM-a. En una modalidad, la isoforma JM-a se expresa en las células de cáncer a un nivel superior que en células no cancerosas del mismo tipo de células o en células no cancerosas adyacentes a las células cancerosas . En algunas modalidades, la isoforma JM-a se expresa a niveles que son al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% superiores que los niveles de expresión en las células no cancerosas .
Los anticuerpos que son específicos para la isoforma JM-a encuentran utilidad particular en tratamiento de cánceres u otros desordenes caracterizados por un nivel incrementado de ectodominio HER4 desprendido. Como se presenta en los Ejemplos, una serie de muestras de tejido de cáncer de mama y tejido de mama normales histológicas recolectadas de la misma paciente, demostraron que la liberación de ectodominio HER4 soluble se incrementa significativamente en el cáncer de mama cuando se compara con el tejido de control normal acoplado. Además, la localización nuclear de un epítopo HER4 intracelular se asocia con resultado clínico desfavorable cuando se compara con la expresión HER4 membranoso, indicando que el rompimiento HER4 mejorado se asocia con prueba de supervivencia (29). En una modalidad, el nivel de ectodominio HER4 desprendido presente en la célula de cáncer está a un nivel superior que en células no cancerosas del mismo tipo de célula o en células no cancerosas adyacentes a las células cancerosas. En algunas modalidades, el nivel de ectodominio HER4 desprendido es al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% superior que el nivel el ectodominio HER4 desprendido en células no cancerosas .
Ejemplos particular de cánceres que sobre expresan la isoforma JM-a y/o tienen niveles incrementados de ectodominio HER4 desprendido incluyen cánceres de mama, cánceres de ovarios y meduloblastoma (15) (60) . Cánceres con niveles incrementados de Mutaciones HER4 también se expresan para responder favorablemente a tratamiento con los anticuerpos que ligan específicamente a la isoforma HER4 JM-a. Estos cánceres incluyen cáncer pulmonar y melanoma (65) (66) .
En algunos aspectos de la invención, un paciente se selecciona por tratamiento con un anticuerpo que es específico para la isoforma JM-a con base en determinar que el paciente tiene cáncer u otro desorden caracterizado por la expresión o sobre expresión de la isoforma JM-a. Como se discute en detalle en la siguiente Sección de Métodos de Diagnóstico, la expresión de la isoforma HER4 JM-a puede detectarse utilizando una cantidad de métodos incluyendo métodos que detectan la presencia del polipéptido de isoforma JM-a, la presencia de polinucleótido de isoforma JM-a, o la presencia del ectodominio HER4 desprendido.
Métodos de Diagnóstico Otro aspecto de la invención proporciona métodos para determinar la presencia de la isoforma HER4 JM-a. En una modalidad, la presencia de la isoforma HER4 JM-a se determina al detectar la expresión de la isoforma JM-a. En una modalidad, la expresión de la isoforma HER4 JM-a se determina al detectar la presencia del polipéptido isoforma JM-a. En una modalidad, la expresión de la isoforma HER4 JM-a se determina al detectar la presencia del polinucleótido isoforma JM-a. En otra modalidad, la expresión de la isoforma HER4 JM-a se determina al detectar la presencia de ectodominio HER4 desprendido.
Una variedad de métodos para detectar la expresión del polipéptido de la isoforma HER4 JM-a y/o la presencia del ectodominio HER4 desprendido puede emplearse e incluye, por ejemplo, análisis inmunohistoquímico , inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, ensayo de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y semejantes. Por ejemplo, un método opcional para detectar la expresión del polipéptido isoforma HER4 JM-a y/o ectodominio HER4 desprendido en un tejido o muestra, comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo específico para la isoforma HER4 JM-a, un fragmento de enlace de isoforma HER4 JM-a, o una proteína recombinante que contiene una región de enlace de antígeno de un anticuerpo específico de isoforma HER4 JM-a; y después detectar el enlace del polipéptido isoforma HER4 JM-a o el ectodominio HER4 desprendido en la muestra.
En modalidades particulares de la invención, la expresión del polipéptido isoforma HER4 JM-a o la presencia del ectodominio HER4 desprendido en una muestra se examina utilizando protocolos de tinción e inmunohistoquímica. La tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido se ha mostrado que es un método confiable para estimar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") utilizan un anticuerpo para sondear y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente por métodos cromogénicos o fluorescentes.
Para preparación de muestra, una muestra de tejido o de células de un mamífero (típicamente un paciente humano) puede emplearse. Ejemplos de muestras incluyen, pero no están limitados a, biopsia de tejido, sangre, aspirado pulmonar, esputo, fluido linfático, etc. La muestra puede obtenerse por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a escisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una modalidad, la muestra se fija e incrusta en parafina o semejantes.
La muestra de tejido puede quedar fija (es decir conservada) por metodología convencional {Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology, " 3* edición (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston División McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Una persona con destreza en la técnica apreciará que la selección de un fijador se determinas para el propósito para el cual se va a teñir histológicamente la muestra o analizar de otra manera. Una persona con destreza en la técnica también apreciara que la duración de fijado depende del tamaño de la muestra de tejido y el fijador empleado. A manera de ejemplo, formalina amortiguada neutra, Bouin o paraformaldehído, pueden emplearse para fijar una muestra.
En general, la muestra primero de fija y después deshidrata a través de una serie ascendente de alcoholes, infiltra e incrusta con parafina u otro medio de seccionado de manera tal que la muestra de tejido pueda seccionarse. En forma alterna, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. A manera de ejemplo, la muestra de tejido puede incrustarse y procesarse en parafina por metodología convencional (ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , supra) . Ejemplos de parafina que puede emplearse incluye pero no esta limitados a, Paraplast, Broloid, y Tissuemay. Una vez que la muestra de tejido se incrusta, la muestra puede seccionarse por un microtomo o semejantes (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). A manera de ejemplo para este procedimiento, las secciones pueden estar en el intervalo de aproximadamente tres mieras a aproximadamente cinco mieras de espesor. Una vez seccionadas, las secciones pueden conectarse a porta objetos por varios métodos estándar. Ejemplos de adhesivos de porta objetos incluyen, pero no están limitados a, silano, gelatina, poli-L-lisina y semejantes. A manera de ejemplo, las secciones incrustadas en parafina pueden conectarse a porta objetos cargados positivamente y/o porta objetos revestidos con poli-L-lisina.
Si la parafina se ha empleado como el material de incrustación, las secciones de tejido en general se desparafinan y rehidratan en agua. Las secciones de tejido pueden ser desparafinadas por varias metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, xilenos y una serie gradualmente descendiente de alcoholes pueden emplearse (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , supra) . En forma alterna, pueden emplearse agentes no orgánicos desparafinantes comercialmente disponibles tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas) .
De manera opcional, subsecuente a la preparación de la muestra, una sección de tejido puede ser analizada utilizando IHC. IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridización in-situ por fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles, ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, el enlace del anticuerpo al antígeno objetivo (por ejemplo, isoforma HER4 JM-a) se determina directamente. Este ensayo directo utiliza un reactivo etiquetado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario etiquetado con enzimas, que puede visualizarse sin mayor interacción de anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, anticuerpo primario sin conjugar liga al antígeno y después un anticuerpo secundario etiquetado liga al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga a una etiqueta enzimática, un substrato cromogénico o fluorogénico se agrega para proporcionar visualización del antígeno. Amplificación de señal ocurre debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario.
El anticuerpo primario y/o secundario utilizado para inmunohistoquimica, típicamente será etiquetado con una porción detectable. Numerosas etiquetas están disponibles que en general pueden agruparse en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 1C, 125I, 3H, y 131I. El anticuerpo puede etiquetarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocole in Immunology, Volumes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs . (1991) por ejemplo y la radioactividad puede medirse utilizando conteo de centelleo. (b) Partículas de oro coloidal. (c) Etiquetas fluorescentes, incluyendo pero no limitadas a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , Rojo Texas, rodamina, fluoresceína, dansil, Lisamina, umbeliferona , ficocriterina, ficocianina o fluoróforos comercialmente disponibles tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera uno o más de los anteriores. Las etiquetas fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Iwmunology, supra, por ejemplo. Fluorescencia puede ser cuantificada utilizando un fluorimetro. (d) Diversas etiquetas de substrato-enzima están disponible y la Patente de los E.U.A. Número 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima en general cataliza una alteración química del substrato cromogenico que puede medirse utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, que puede medirse espectrofotométricamente . En forma alterna, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminescencia del substrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describieron anteriormente. El substrato quimioluminescente se vuelve electrónicamente excitado por una reacción química y puede entonces emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los E.U.A. Número 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato dehidrogenasa,. ureasa, peroxidasa tales como peroxidasa de rábano picante (HRPO) , fosfatasa alcalina, ?-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa y semejantes. Técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyma-Antibody Conjugates for use in Enzima Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed.-J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981) .
Ejemplos de combinaciones de substrato-enzima incluye por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un substrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor colorante (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o hidrocloruro de 3,3 ' , 5, 5 * -tetrametil benzidina (TMB)-) ; (ii) Fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como substrato cromogénico; y (iii) ?-D-galactosidasa ( ?-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-?-galactosidasa) o substrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil- ?-D-galactosidasa) .
Numerosas otras combinaciones de substrato-enzima están disponibles para aquellos con destreza en la técnica. Para una revisión general de estas, ver las Patentes de los E.U.A. Números 4,275,149 y 4,318,980. En ocasiones, la etiqueta se conjuga indirectamente con el anticuerpo. La persona con destreza estará al tanto de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de etiquetas mencionadas anteriormente pueden conjugarse con avidina, o vice versa. La biotina liga selectivamente con avidina y de esta manera, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. En forma alterna, para lograr conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno y uno de los diferentes tipos de etiquetas anteriormente mencionados se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno . De esta manera, puede lograrse conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo.
Además de los procedimientos de preparación de muestra discutidos anteriormente, adicional tratamiento de esta sección de tejido, antes de, durante o después de IHC puede ser conveniente. Por ejemplo, método de recuperación de epítopo, tales como calentamiento de la muestra de tejido en amortiguador citrato puede llevarse a cabo (ver, por ejemplo, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)).
Siguiendo una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone a anticuerpo primario por un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones convenientes de manera tal que el anticuerpo primario liga al antígeno de proteína objetivo en la muestra de tejido. Condiciones apropiadas para lograr esto pueden determinarse por experimentación rutinaria. La extensión de enlace de anticuerpo de la muestra se determina al utilizar cualquiera de las etiquetas detectables discutidas anteriormente. De preferencia, la etiqueta es una etiqueta enzimática (por ejemplo HRPO) que cataliza una alteración química del substrato cromogénico tal como el cromógeno 3 , 3 ' -diaminobenzidina . De preferencia la etiqueta enzimática se conjuga al anticuerpo, que liga específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo cabra anti-conejo) .
Especímenes así preparados pueden montarse y cubrirse con cubre objetos. La evaluación de porta objetos se determina entonces, por ejemplo utilizando un microscopio, y criterios de intensidad de tinción, rutinariamente empleados en la técnica, pueden emplearse.. Como un ejemplo, criterios de intensidad de tinción pueden evaluarse como sigue: TABLA 2 Patrón de Tinción calificación No hay tinción observada en las 0 células .
Tinción débil/escasamente 1+ perceptible se detecta en más de 10% de las células.
Tinción débil a moderada se 2 + observa en más de 10% las células .
Tinción moderada a fuerte se 3 + observa en más de 10% de las células En métodos alternos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico de isoforma HER4 JM-a, bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-antígeno, y después detectar el complejo. La presencia del complejo puede ser detectada en una cantidad de formas, tal como transferencia Western y procedimientos ELISA, para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo utilizando este formato de ensayo están disponibles, ver, por ejemplo, las patentes de los E.U.A. Nos. 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto ensayos de un solo sitio como dos sitios o "emparedados" de los tipos no competitivos, así como en los ensayos de enlace competitivos tradicionales . Estos ensayos también incluyen enlace directo de un anticuerpo etiquetado a un antígeno objetivo.
Ensayos emparedados están entre los ensayos más útiles y comúnmente empleados. Una cantidad de variaciones de la técnica de ensayo emparedado existen, y todas se pretenden abarcadas por la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, un anticuerpo no etiquetado se inmoviliza en un substrato sólido, y la muestra a probarse se pone en contacto con la molécula ligada. Después de un periodo de incubación conveniente, por un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo anticuerpo-antígeno , un segundo anticuerpo específico de antígeno, etiquetado con una molécula reportera capaz de producir una señal detectable, se agrega e · incuba entonces, permitiendo tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo-etiquetado con anticuerpo-antígeno. Cualquier material sin reaccionar es lavado por arrastre, y la presencia del antígeno se determina por observación de una señal producida por la molécula reportera. Los resultados ya pueden ser cualitativos, por simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse al comparar con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de antígeno.
Variaciones del ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo, en donde tanto la muestra como el anticuerpo etiquetado se agregan en forma simultánea al anticuerpo ligado. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad, incluyendo cualesquiera variaciones menores como será fácilmente aparente. En un ensayo emparedado directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad para el biomarcador ya se liga en forma covalente o pasiva a una superficie sólida. La superficie sólida típicamente es de vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente empleados son celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en la forma de tubos, perlas, discos de microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para conducir un inmunoensayo . Los procesos de enlace son bien conocidos en la técnica y en general consisten de enlazar covalentemente entrelazamiento o adsorción física, el complejo polímero-anticuerpo se lava en preparación para la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra a probar después se agrega al complejo de fase sólida e incuba por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo condiciones convenientes (por ejemplo de temperatura ambiente a 40 grados C tal como entre 25 grados C y 32 grados C inclusive) para permitir enlace de cualquier sub-unidad presente en el anticuerpo. Después del periodo de incubación, la fase sólida de la sub-unidad anticuerpo se lava y seca e incuba con un segundo anticuerpo específico para una porción del biomarcador. El segundo anticuerpo se enlaza a una molécula reportera que se utiliza para indicar el enlace del segundo anticuerpo al marcador molecular.
Un método alterno involucra inmovilizar el antígeno objetivo en la. muestra y después exponer el blanco inmovilizado al anticuerpo específico que puede o no ser etiquetado con una molécula reportera. Dependiendo de la cantidad del objetivo o blanco y la fuerza de la señal de molécula reportera, un objetivo ligado puede ser detectable por etiquetado directo con el anticuerpo. En forma alterna, un segundo anticuerpo etiquetado, específico al primer anticuerpo se expone al complejo primer anticuerpo-objetivo o blanco para formar un complejo terciario blanco-primer anticuerpo y un segundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula reportera. Por "molécula reportera" , como se emplea en la presente especificación, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analítica identificable que permite la detección de anticuerpo ligado a antígeno. Las moléculas reporteras más comúnmente empleadas en este tipo de ensayo ya son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclido (es decir radioisótopos) y moléculas quimioluminescentes .
En el caso de un inmunoensayo de enzima, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación existe, que están fácilmente disponibles a la persona con destreza. Enzimas comúnmente empleadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los substratos a utilizarse con enzimas específicas en general se seleccionan para la producción, ante hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear substratos fluorogénicos , que generan un producto fluorescente en vez de los substratos cromogénicos anteriormente anotados. En todos los casos, el anticuerpo etiquetado con enzima se agrega al complejo primer anticuerpo-marcador molecular, permitiendo ligar, y después se lava por arrastre el exceso de reactivo. Una solución que contiene el substrato apropiado después se agrega al complejo del anticuerpo-antígeno-anticuerpo . El substrato reaccionará con la enzima ligada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que además puede cuantificarse, usualmente en forma espectrofotométrica, para dar una indicación de la cantidad de biomarcador que está presente en la muestra. En forma alterna, compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo etiquetado con fluorócromo adsorbe la energía de luz, induciendo un estado a excitabilidad en la molécula, seguido por emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en EIA, el anticuerpo etiquetado fluorescente se deja que ligue al complejo primer anticuerpo-marcador molecular. Después de lavar por arrastre el reactivo no ligado, el complejo terciario restante después se expone a la luz de la longitud de onda apropiada. La fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Técnicas EIA y de inmunofluorescencia ambas están muy bien establecidas en la especialidad. Sin embargo, otras moléculas reporteras, tales como radioisótopo, moléculas guimioluminescentes o bioluminescentes , también pueden emplearse.
Métodos de la invención además incluyen protocolos que examinan la presencia y/o expresión de AUNms de isoforma HER4 JM-a en una muestra celular o tejido. Métodos para la evaluación de las ARms en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo ensayos de hibridización utilizando sondas de ADN complementarias (tal como hibridización in situ utilizando ribosondas etiquetadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para isoforma HER4 JM-a, y otros métodos de detección de tipo amplificación tales como por ejemplo ADN ramificado, SISBA, TMA y semejantes) .
Muestras de células o tejido de mamíferos pueden ensayarse convenientemente para ARNms de isoforma HER4 JM-a utilizando transferencia Northern, transferencia en mancha (dot blot) o análisis PCR. Por ejemplo, ensayos RT-PCR tales como ensayos PCR cuantitativos son bien conocidos en la técnica'. Estos métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de ARNm de isoforma HER4 JM-a en una muestra biológica (por ejemplo por examen simultáneo de los niveles de una secuencia de AR m de control comparativa de un gen "constitutivo" tal como un miembro de la familia actina) . Protocolos específicos para determinar la presencia de ARNm de isoforma HER4 JM-a se describen en Junttila, T.T., et al, Clin. Cáncer Res. 2003:9:5346-5357 (19) .
Modalidades materiales de este aspecto de la invención incluyen cebadores de isoforma HER4 JM-a y pares cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleotidos de la invención o de cualesquiera partes específicas de los mismos, y sondas que hibridizan en forma selectiva o específica a moléculas de ácido nucleico de la invención o a cualquier parte del mismo. Sondas pueden ser etiquetadas con un marcador detectable, tal como por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminescente, quelador de metal o enzima. Estás sondas y cebadores pueden emplearse para detectar la presencia de polinucleotidos de isoforma HER4 JM-a en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa polipéptidos de isoforma HER4 JM-a. Como se comprenderá por la persona con destreza, una gran cantidad de diferentes cebadores y sondas pueden prepararse con base en las secuencias que aquí se proporcionan y emplean efectivamente para amplificar, clonar y/o determinar la presencia y/o niveles de ARNms de isoforma HER4 JM-a.
Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan ARNms, tales como ARNms de isoforma HER4 JM-a, en una muestra celular o tejido por tecnología de microhileras o micromatrices . Utilizando microhileras de ácido nucleico, muestras de AR m y de control de prueba de muestras de tejido de control y prueba, se transcriben en forma inversa y. etiquetan para generar sondas ADNc . Las sondas después se hibridizan a una matriz de ácidos nucleicos inmovilizada en un soporte sólido. La matriz se configura de manera tal que la secuencia y posición de cada miembro de la matriz se conoce. Por ejemplo, una selección de genes que tienen potencial para expresarse en ciertos estados de la enfermedad, pueden disponerse en un soporte sólido. Hibridización de una sonda etiquetada con un miembro de matriz particular, indica que la muestra de la cual se deriva la sonda expresa ese gen. Análisis de expresión de gen diferencial de tejido enfermo puede proporcionar información valiosa. Tecnología de microhilera o micromatriz utiliza técnicas de hibridización de ácido nucleico y tecnología de cómputo para evaluar el perfil de expresión de ARNm de miles de genes dentro de un solo experimento (ver, e.g. , WO 01/75166 publicado en octubre 11, 2001; (ver, por ejemplo patente de los E.U.A. No. 5,700,637, patente de los E.U.A. No. 5,445,934, y patente de los E.U.A. No. 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21 (Suppl) : 15-19 (1999) para una discusión de fabricación de matriz) . Micromatrices de ADN son matrices miniatura que contienen fragmentos de gen que ya son sintetizados directamente sobre o aplicados por puntos sobre vidrio u otros substratos. Miles de genes usualmente se representan en una sola matriz. Un experimento de micromatriz típico involucra las siguientes etapas: 1) preparación de blanco etiquetado en forma fluorescente a partir de ARN aislado de la muestra, 2) hibridización del blanco etiquetado a la micromatriz, 3) lavar, teñir y explorar la matriz, 4) análisis de la imagen explorada y 5) generación de los perfiles de expresión de gen. Actualmente dos tipos principales de micromatrices de ADN se utilizan: matrices de oligonucleótido (usualmente 25 a 70 meros) y matrices de expresión de gen que contiene productos PCR preparados a partir de ADNcs. Para formar una matriz, oligonucleótidos ya pueden ser prefabricados y aplicados por puntos a la superficie o sintetizados directamente en la superficie (in situ) .
El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatriz comercialmente disponible que comprende matrices fabricadas por síntesis directa de oligonucleótidos en una superficie de vidrio. Matrices de Gen/Sonda: Oligonucleótidos, usualmente 25 meros, se sintetizan directamente sobre una oblea de vidrio por una combinación de fotolitografía basada en semiconductor y tecnología de síntesis química en fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400,000 diferentes oligos y cada oligo está presente en millones de copias. Ya que las sondas oligonucleótidos se sintetizan en ubicaciones conocidas en la matriz, los patrones de hibridización y las intensidades de señal pueden ser interpretados en términos de identidad de gen y niveles de expresión relativos por el programa Affymetrix Microarray Suite. Cada gen se representa en la matriz por una serie de diferentes sondas oligonucleotido. Cada par de sondas consiste de un oligonucleotido de perfecto apareamiento y un oligonucleotido de incorrecto apareamiento. La sonda de perfecto apareamiento tiene una secuencia exactamente complementaria con el gen particular y de esta manera mide la expresión del gen. La sonda de apareamiento incorrecto difiere de la sonda de apareamiento perfecto por una sola substitución base en la posición base central, perturbando el enlace de la transcripción de gen objetivo. Esto ayuda a determinar la hibridización no específica y fondo que contribuye a la señal medida para el oligo de apareamiento perfecto. El programa Microarray Suite substrae las intensidades de hibridización de las sondas de apareamiento incorrecto de aquellas de las sondas de apareamiento perfecto, para determinar el valor de intensidad absoluto o específico para cada conjunto de sondas. Sondas se eligen con base en la información actual de Genbank y otros depósitos de nucleótidos. "Las secuencias se consideran que reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Un Horno GeneChip Hybridization (horno de "rosticería" ) se emplea para llevar a cabo la hibridización de hasta 64 matrices a la vez. La estación fluídica realiza lavado y tinción de las matrices de sonda. Es completamente automatizada y contiene cuatro módulos, con cada módulo que contiene una matriz de sonda. Cada módulo se controla independientemente a través del programa Microarray Suite, utilizando protocolos fluídicos preprogramados . El explorador es un explorador de fluorescencia láser confocal que mide la intensidad de fluorescencia emitida por ARNc etiquetado ligado a las matrices de sonda. La estación de trabajo de computadora con el programa Microarray Suite controla la estación fluídica y el explorador. El programa Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones fluídicas utilizando hibridización preprogramada, protocolos de lavado y tinción para la matriz de sonda. El programa también adquiere y convierte datos de intensidad de hibridización en requisito de presencia/ausencia por cada gen utilizando algoritmos apropiados. Finalmente, el programa detecta cambios en la expresión de genes entre experimentos por análisis de comparación y formatea la salida en archivos .txt, que pueden emplearse con otros programas para mayor análisis de datos.
La expresión de una isoforma HER4 JM-a también puede estimarse al examinar amplificación de genes y deleción de genes. La amplificación o deleción de genes puede medirse por cualquiera de una amplia variedad de protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia punto (análisis de ADN) , o hibridización in situ (e.g., FISH) , utilizando una sonda etiquetada en forma apropiada, métodos citogenéticas o hibridización genómica comparativa (CGH) utilizando una sonda etiquetada de manera apropiada. A manera de ejemplo, estos métodos pueden emplearse para detectar deleción o amplificación de genes de isoforma HER4 JM-a.
La expresión de la isoforma HER4 JM-a en uría muestra de células o tejido también puede examinarse mediante ensayos basados en actividad o funcionales. Por ejemplo, la expresión de la isoforma HER4 JM-a puede detectarse al determinar el efecto de tratamiento con enzima que convierte factor-alfa de necrosis de tumor (TACE) en muestras de células o tejidos que se sospecha expresan isoforma HER4 JM-a .
Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones farmacéuticas de conjugados de fármaco-anticuerpo terapéuticos (ADC) de la invención, típicamente se preparan para administración parenteral, es decir bolo, inyección intravenosa, intratumor con un vehículo parenteral farmacéutico aceptable y en una dosis unitaria de forma inyectable estéril. Un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que tiene el grado de pureza deseado se mezcla opcionalmente con diluyentes, portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticos aceptables (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st edición (2005) ed. Univ. of the Sciences Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins) , en la forma de una formulación liofilizada o una solución acuosa.
Diluyentes, portadores, excipientes y estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) .
Los ingredientes farmacéuticos activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Estas técnicas, se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st edition (2005) ed. Univ. of the Sciences Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins.
Pueden elaborarse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen¦ matrices semi permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen ADC, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinil alcohol)), polilactidas (patente de los E.U.A. No. 3773919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico - ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico .
Las formulaciones incluyen aquellos adecuadas para las rutas de administración anteriores. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitarias y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Técnicas y formulaciones en general se encuentran en Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form. lst edition (August 1, 2001) Ed ark Gibson, US Informa Healthcare, Marcel Dekker, CRC Press (ISBN-10 1574911201); Handbook of Pharmaceutical Excipients 5th edition (December 14, 2005) Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, and Sián C. Owen APhA Publications (ISBN-10: 1582120587).
Estos métodos incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con el portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan al llevar de manera uniforme e íntima en asociación el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, de ser necesario, conformar el producto.
Suspensiones acuosas de la invención contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Estos excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, croscarmelosa, povidona, metilcelulosa, hidroxipropil metilceluosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia, y agentes dispersantes o humectantes tales como una fosfatida de origen natural (por ejemplo, lecitina) , un producto de condensación de un alquilen óxido con un ácido graso (por ejemplo, polioxietileri estearato) , un producto de condensación de etilen óxido con un alcohol alifático de cadena larga (por e emplo, heptadecaetilenoxicetanol) , un producto de condensación de etilen óxido con un éster parcial derivado de un ácido graso y hexitol anhídrido (por ejemplo, polioxietilen sorbitan monooleato) . La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservadores tales como etil o n-propil p-hidroxi-benzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes endulzantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión oleaginosa o acuosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida utilizando aquellos agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión convenientes que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como una solución en 1, 3-butan-diol o preparada como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, aceites no volátiles estériles pueden emplearse convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite no volátil suave puede emplearse incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como ácido oleico igualmente pueden emplearse en la preparación de productos inyectables .
La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con el material portador para producir una forma de dosis sencilla, variará dependiendo del hospedero tratado y el modo de administración particular. Por ejemplo, una solución acuosa pretendida para infusión intravenosa puede contener desde aproximadamente 3 a 500 µg del ingrediente activo por mililitro de solución, a fin de que pueda ocurrir infusión de un volumen conveniente a una velocidad de aproximadamente 30 mL/hr.
Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes , amortiguadores, bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes .
Aunque administración oral de agentes terapéuticos de proteínas es desfavorecida debido a la hidrólisis o desnaturalización en el intestino, formulaciones adecuadas para administración oral pueden prepararse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o tabletas cada una que contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo.
Las formulaciones pueden ser empacadas en recipientes de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo ampolletas y frascos sellados, y pueden ser almacenadas en una condición seca por congelado ( liofilizadas ) solo requieriendo la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua, para inyección inmediatamente antes de uso. Soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se preraran a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo previamente descrito. Formulaciones de dosis unitarias son aquellas que contienen una dosis diaria o sub- dosis diarias unitarias, como se describió previamente, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.
Las composiciones de la invención también pueden formularse como inmunoliposomas . Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil pasa suministro de un fármaco o droga a un mamífero. Los componentes de liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar al arreglo lípido de las membranas biológicas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe por Epstein et al 1985 Proc. Nati. Acad. Sci . USA 82:3688; Hwang et al 1980 Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030; patente de los E.U.A. No. 4485045; patente de los E.U.A. No. 4544545; patente de los E.U.A. No. 5013556; WO 1997/38731. Liposomas pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Liposomas pueden ser extrudidos a través de filtros de tamaño de poros definido para dar por resultado liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab' de las composiciones de la presente invención pueden conjugarse a liposomas (Martin et al 1982 J. Biol. Chem. 257:286-288), mediante una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma (Gabizon et al 1989 J. National Cáncer Inst. 81 (19) : 1484. ) Anticuerpos de la invención serán formulados, dosificados y administrados en una forma consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración de este contexto incluyen el desorden particular tratado, el mamífero particular tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del desorden, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos por los practicantes médicos. El anticuerpo no requiere ser, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes actualmente empleados para evitar o tratar el desorden en cuestión. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de desorden o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos en general se emplean en las mismas dosis y con las rutas de administración descritas aquí, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis descritas aquí, o en cualquier dosis y por cualquier ruta que se determine en forma empírica/clínica como apropiada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza solo o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica de paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico a cargo. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente en un tiempo o sobre una serie de tratamientos . Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 ug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0.1 mg/kg-10 mg/kg) del anticuerpo pueden ser dosis candidato iniciales para administración al paciente, ya sea por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 ug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas sobre varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento en general será sostenido hasta que ocurra una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo será en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) pueden ser administradas al paciente. Estas dosis pueden ser administradas de manera intermitente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera tal que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Una dosis de carga inicial superior, seguida por una o más dosis menores puede administrarse. Un régimen de dosis ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de' aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales .
Se entiende que cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores puede llevarse a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo .
Terapia de combinación Un anticuerpo de la invención puede combinarse en una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosis como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades anti-cáncer. El segundo compuesto de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosis, puede tener actividades complementarias al anticuerpo de la combinación de manera tal que no afectan adversamente entre sí.
El segundo compuesto puede ser un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal y/o cardioprotector . Estas moléculas están presentes convenientemente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención también puede tener una cantidad terapéutica efectiva de un agente quimioterapéutico tal como un inhibidor de formación de tubulina, un inhibidor de topoisomerasa, un intercalador de ADN, o un aglutinante de ADN.
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración de un agente anti-cáncer identificado de acuerdo con esta invención. La terapia de combinación puede ser administrada como un régimen secuencial o simultáneo. Cuando se administra en forma secuencial, la combinación puede administrarse en dos o más administraciones. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde hay un periodo de tiempo mientras que ambos agentes activos (o todos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas .
Ejemplos de esta terapia de . combinación incluyen combinaciones con agentes uimioterapéuticos tales como erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm. ) , bortezomib (VELCADE®, Millenium Pharm.), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca) , sutent (SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis) , imatinib mesilato (GLEEVEC®, Novartis) , PTK787/ZK 222584 (Novartis), oxaliplatina (Eloxatin®, Sanofi) , 5-FU (5-fluorouracil) , leucovorina, Rapamicina (Sirolimus , RAPAMUNE®, yeth) , lapatinib ( YKERB®, GSK572016, GlaxoSmithKline) , lonafarnib (SCH 66336) , sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs.), y gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca) , AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) , agentes alquilantes tales como tiotepa ciclofosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona) ; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, K -2189 y CBl-TMl); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, chlorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina, calicheamicina, calicheamicina gammall y calicheamicina omegall; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediina relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicin, carminomicina, carzinofilin, cromomicinais , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIA ICINA® doxorubicina (incluyendo morfolin-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidin, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andró-genos tales como calusterona, dromostanolon propionato, epitiostanol , mepitiostano , testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial T-2 toxina, verracurina A, roridin A y anguidina) ,: uretano ; vindesina,-dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol'; pipobroman,- gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J. ) , formulación de nanopartículas de paclitaxel de alúmina, libre de Cremofor ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil; GEMZAR® gemcitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-ll; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticos aceptables, de cualquiera de los anteriores .
Esta terapia de combinación también incluye: (i) agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir acción de hormonas en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERMs) , incluyendo, por ejemplo tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen, droloxifen, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristona, y FARESTON-toremifen; (ii) inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® megestrol acetato, AROMASIN® exemestano, formestani, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol y anastrozol ARIMIDEX®; (iii) anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo 1,3-dioxolan nucíeósido citosina) ; (iv) inhibidores de aromatasa; (v) inhibidores de proteína quinasa, tal como por ejemplo inhibidores de la ruta EGFR (EGFR, HER2 , HER3 , y HER4) ; (vi) inhibidores de quinasa lípida; (vii) oligonucleótidos antisentido, en particular aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; (viii) ribozimas tales como el inhibidor de expresión VEGF (por ejemplo, ribozima A GIOZYME®) y un inhibidor de expresión HER2; (ix) vacunas tales como vacunas de terapia de genes, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa LURTOTECAN® 1; ABARELIX® rmRH; (x) agentes anti-angiogénicos tales como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) ; y (xi) sales, ácidos o derivados farmacéuticos aceptables, de cualquiera de los anteriores.
Programas de preparación y dosificación para estos agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determine empíricamente por el practicante con destreza. Programas de dosis y preparación para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, (1992) Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y demostrar ser "sinergística" , es decir el efecto logrado cuando los ingredientes activos empleados en conjunto es mayor que la suma de los efectos que resultan utilizar los compuestos por separado. Un efecto sinergístico puede lograrse cuando los ingredientes activos son: (1) co-for ulados y administrados o suministrados en forma simultánea en una formulación de dosis unitaria combinada,-(2) suministrados al alternar o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se suministran en terapia alterna, un efecto sinergístico puede alcanzarse cuando los compuestos se administran o suministran secuencialmente, por ejemplo por diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante terapia alterna, una dosis efectiva de cada ingrediente activo se administra secuencialmente, es decir en serie, mientras que en terapia de combinación, dosis efectivas de dos o más ingredientes activos se administran en conjunto .
Artículos de Manufactura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura o "equipo" que contiene materiales útiles para el tratamiento de los desórdenes descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente. El inserto de empaque puede referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos y que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos. Recipientes adecuados incluyen por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, empaques blíster, etc . Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico.
En una modalidad, el artículo de manufactura comprende un recipiente y una formulación de un anticuerpo anti-HER4, o su conjugado anticuerpo- fármaco, contenido dentro del recipiente. El artículo además puede comprender opcionalmente una etiqueta fija al recipiente, o un inserto de empaque incluido con el recipiente, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico del tumor. El recipiente que contiene la formulación es efectivo para almacenar y suministrar el agente terapéutico y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . La etiqueta o inserto de empaque indica que la formulación se emplea para tratar la condición de selección, tal como cáncer. En forma alterna, o adicionalmente, el artículo de manufactura además puede 'comprender un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéutico aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , salino amortiguado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Depósito de Material Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC): Material No . Dep . ATCC . Fecha de Depósito Her-4 1H10.1E5 PTA-9655 diciembre 11, 2008 Este depósito se hizo bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito- de Microorganismos con el Propósito de Procedimientos de Patentes y sus Reglamentos (Tratado de Budapest) . Esto asegura mantenimiento de un cultivo viable del depósito por 30 años a partir de la fecha del depósito. El depósito se hará disponible por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un convenio entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al público al emitir la patente de los E.U.A. pertinente y al dejar abierta al público cualquier solicitud de patente de los E.U.A. o extranjera, lo que surja primero y asegura disponibilidad de la progenie a quien esté determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas de los E.U.A. que tenga derecho de acuerdo con 35 USC '122 y las reglas del Comisionado de acuerdo con ello (incluyendo 37 CFR 1.14 con referencia particular a 886 OG 638) .
La cesionaria de la presente solicitud ha convenido en que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera, cuando se cultiva bajo condiciones convenientes, los materiales serán reemplazados rápidamente ante notificación con otros de los mismos. Disponibilidad del material depositado no se considerará como una licencia para practicar la invención en contravención con los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes .
La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir a una persona con destreza en la técnica el practicar la invención. La presente invención no habrá de limitarse en alcance por las construcciones depositadas, ya que las modalidades depositadas se pretenden para ilustrar sólo ciertos aspectos de la invención y cualesquiera construcciones que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El depósito del material aquí no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida es inadecuada para permitir la práctica . de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni habrá de considerarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representan. Sin duda, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí, serán aparentes a aquellos con destreza en la técnica a partir de la anterior descripción y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Se entiende que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema específico o situación, estará dentro de las capacidades de una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la luz de las enseñanzas aquí contenidas. Ejemplos de productos de la presente invención son procesos representativos para su aislamiento, uso y manufactura aparecen a continuación, pero no habrán de considerarse que limiten la invención.
Todas las patentes y referencias de literatura citadas en la presente especificación aquí se incorporan expresamente por referencia en su totalidad.
EJEMPLOS Ejemplo 1 - Materiales y Métodos Anticuerpos Anti-HER .
Oligonucleótidos específicos se sintetizaron en base a la secuencia HER4 DNA (30) . ARN celular total se extrajo de células MDA-MB-453 y utilizó como una plantilla en RT PCR, para generar la secuencia de codificación del dominio extracelular HER4 humano (ECD) .
Uha proteína de fusión gDHER4 ECD se construyó al ligar las secuencias de codificación para los aminoácidos 1-52 de la glicoproteína D tipo 1 del virus herpes simple a las secuencias que codifican aminoácidos 26-640 de HER4 humano. (61) El ADNc gDHER4 ECD se inserta en el vector de expresión basado en citomegalovirus pRK5. Esta construcción se transfectó en forma transitoria en células 293 de riñon embriónico humano utilizando un protocolo de precipitación con fosfato de calcio estándar.
Una columna de afinidad se preparó al acoplar el anti-gD monoclonal 5B6 a CNBR sefarosa (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia) . El- sobrenadante de células 293 transíectadas gDHER4 ECD se concentró 20-40 veces en una membrana ym30 (Amicon, Beverly MA) y cargó en la resina de afinidad. La columna se lavó con PBS y el receptor se eluyó con ácido acético 100 M/NaCl 500 mM pH 2.4. HER4 ECD se intercambió de amortiguador en PBS y concentró. Concentración de proteína se determinó por OD280.
Ratones Balb/c se inmunizaron con aproximadamente 5 µg de HER4 ECD en Emulsión RIBI MPL + TDM + CWS (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) en sus plantas de las patas posteriores, las semanas 0, 1, 2 y 3. Los ratones inmunizados se probaron por respuesta de anticuerpo por ELISA. Los ratones con los títulos más altos se les dieron 5 µg adicionales de HER4 ECD en RIBI durante la semana 4. Tres días después, los linfocitos de los nodos poplíteos e inguinales se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653 utilizando polietilen glicol 4000 al 50% (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis , IN) por el procedimiento de Oi y Herzenberg, 1980. Células fusionadas se revistieron a una densidad de 200,000 células por pozo en placas de cultivo de tejido de 96 pozos y selección de hibridoma utilizando suplemento de medio HAT (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) empezó un día posterior a fusión. Empezando el día 10, los sobrenadantes de hibridoma se cribaron por la presencia de anticuerpos específicos de HER4 utilizando un ensayo de captura radiactivo. Clones que producen anticuerpo estable se obtuvieron por dilución limitante y grandes cantidades de mAbs específico se produjeron en ascitis. Los anticuerpos se purificaron en columnas de proteína A-Sefarosa (Fermentech, Inc., Edimburg, Escocia) y almacenan estériles en PBS a 4°C.
Te idos .
Secciones congeladas de corazón y riñon humanos normales se obtuvieron de un pequeño de cuatro años de edad que murió de un choque eléctrico. Diecisiete pares de muestras de tejido congelados instantáneamente que representan cáncer de mama humano y tejido periférico histológicamente normal del mismo paciente fueron amablemente suministrados por el Dr. Manolo M. Morente, Red de Bancos de Tumores Nacional Española, Centro de Cáncer Nacional Español, (CNIO) , Madrid, España. El uso de todas las muestras de tejido fue aprobado por una Junta de Revisión Institucional y se obtuvo un consentimiento informado de todos los sujetos del estudio.
Cultivo Celular.
Transíectantes COS-7, NIH 3T3-7d que expresan células EGFR, HER2 o HER3 (31) y HEK293 EBNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) se mantuvieron en DMEM, y células T-47D y MCF-7 en RPMI, suplementadas con FCS al 10% (Autogen Bioclear UK Ltd. , Wiltshire, UK) y solución de L-glutamina-penicilina-estreptomicina al 1% (Sigma-Aldrich) .
Construcciones de Plásmido.
Los plásmidos de expresión pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2 , pcDNA3. lHER4JM-bCYT-2, pcDNA3.1IHER4JM-aCYT-2-HA y pcDNA3. lHER4JM-bCYT-2-HA (26, 32) se emplearon para expresar en forma transitoria isoformas HER4 con o sin etiquetas epítope de hemaglutinina carboxiterminal (HA) en células COS-7. Para generar construcción HER4 muerta de quinasa, el sitio de enlace putativo ATP dentro del dominio quinasa de HER4 se mutó (K751R) en pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2 utilizando el equipo de mutagénesis dirigida por sitio (Stratagene) para producir pcDNA3. lHER4JM-aCYT-2-K75lR. Para generar secuencia de codificación de ectodominio pcDNA3.1HER4ECD HER4 se derivó de pcDNA3. lHER4JM-aCYT-l (26) de longitud íntegra por PCR utilizando el cebador 5' TTG GTA CCG CAC CAT GAA GCC GGC GAC AGG AC (SEQ ID NO: 3 ) y el cebador 3' T TAT CTC GAG TTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG TTG TGG TAA AGT GGA ATG (SEQ ID NO: 4). El cebador 5 ' introduce una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción Kpn I y una secuencia de enlace de ribosoma antes del codón de inicio de la secuencia HER4. El cebador 3 ' introduce una secuencia de codificación de hexahistidina, un nuevo codón de parada y una secuencia de reconocimiento Xho I después del último aminoácido extracelúlar His647 de HER4 J -a (23) .
Transfecciones .
Células revestidas en placas de 24 pozos (4 x 104) o placas de 6 pozos (1.5 x 105) se transfectaron con 0.5 - 1 µg de plásmido apropiado utilizando Reactivo de Transfeccion FuGENE 6 (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Producción de dominio extracelúlar recom inante de HER4.
Células HEK293 EBNA transfectadas con pcDNA3.1HER4ECD se seleccionaron en medio que contiene 150 g ml de Higromicina B (Roche) y después de clonación mantienen en la presencia de 75 µg/ml de Higromicina B. Antes de recuperar el ectodominio soluble del medio, las células se cultivaron en DMEM que contiene FCS al 0.5%. El ectodominio etiquetado HIS se purifica de medio de cultivo recolectado por cromatografía de afinidad de quelato de metal inmovilizado (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK) por gradiente de pH escalonado.
Ilumine-precipitación y análisis de transferencia Western.
Para estudiar la especificidad de isoforma de anticuerpos anti-HER4 monoclonales (células COS-7 se transíectaron transitoriamente con pcDNA3. lHER4JM-aCYT-2 , pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2 , o vector -pcDNA3.1. Veinticuatro horas después, las células se lavaron con PBS enfriado por hielo, lisaron en amortiguador de lisis (Tritón X-100 al 1%, Tris-HLC 10 mM (pH 7.4), EDTA 1 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 2 mM, 10 µg ml de aprotinina, 10 µg ml de leupeptina, ortovanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 10 mM y fosfato de sodio 10 mM) y centrifugaron. Los sobrenadantes se evaporaron o no a 95°C por 5 minutos en amortiguador de muestra con o sin ditiotreitol (DTT) y analizaron por SDS-PAGE y transferencia Western, como se describió previamente (21) . Expresión ErbB en transíectantes NIH 3T3-7d se analizó por transferencia Western bajo condiciones no reductoras utilizando los siguientes anticuerpos primarios: anti-EGFR (sc-03), anti-HER2 (sc-284) , anti-HER3 (sc-285) (todos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , y mAb 1479.
Para análisis Western de proteína HER4 en tejido de mama, secciones de 80 um de bloques de tejido congelado se cortaron, homogeneizaron y lisaron en amortiguador de lisis durante la noche a 4°C en un agitador. Alícuotas de lisado equivalentes a 50 µg de proteína total, se analizaron por transferencia Western bajo condiciones no reductoras.
Para estudiar el efecto de mAb 1479 en fosforilación HER4, células MCF-7 y T-47D se ayunaron durante la noche en RPMI sin suero y trataron con o sin 1 µg ml de mAb 1479 por una hora antes de estímulo por 30 minutos con 50 µg/ml de neuregulina-1 (NRG-1; R&D, Minneapolis, M ) . Lisados celulares equivalentes a 1 mg de proteína total se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-HER4 (HFR-1) , separaron en geles SDS-PAGE y analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) .
Para estudiar ubiquitinación HER4, células COS-7 se transíectaron transitoriamente con plásmidos que codifican JM-a CYT-1 o JM-a CYT-2 de longitud íntegra junto con ubicuitina etiquetada Flag (Katz et al. 2002), y analizaron por inmunoprecipitación HER4 seguido por transferencia Western anti-Flag, como se describió previamente (32). Las células fueron tratadas por una hora con o sin 2 g/ml de mAb 1479 antes de análisis.
Tinción de Inmunofluorescencia .
Células COS-7 se desarrollaron en cubreobjetos y transfectaron con vector de control pcDNA3. lHER4JM-aCYT-2-HA, pcDNA3. lHER4JM-bCYT-2-HA, o pcDNA3.1. Veinticuatro horas después de que las células de transfección se fijaran con metanol, tiñeran con anti-HER4 (HFR-1; Neomarkers, Fremont, CA) o anti-HA (Roche) en dilución 1:100, seguido por incubación con Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón o Alexa Fluor 568 cabra anti-rata (ambas de Molecular Probes, Leiden, Holanda) en dilución 1:250. Cubreobjetos se montaron con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) . Todas las imágenes se obtuvieron de Olympus BX60 . (Olympus, Hamburg, Alemania), microscopio de fluorescencia.
Iiununohistoquímica.
Secciones congeladas (5 µ?) se tiñeron utilizando 20 µg/ml de anticuerpos primarios mAb 1479, anti-HER4 (HFR-1) , anti-CD44 (Hermes-3; amablemente suministrados por Dr. Sirpa Jalkanen, University of Turku, Turku, Finlandia) , o un anticuerpo que reconoce un antígeno de célula T de pollo (3g6; amablemente suministrado por Dr. Sirpa Jalkanen), y anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón (1:200) o HRP-conjugado cabra anti-ratón (1:100; Santa Cruz Biotechnology) . Para tinción de peroxidasa se trataron secciones con sustrato DAB peroxidasa (Vector Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante seguido por tinción con hematoxilina . Para tinción de inmunofluorescencia se trataron secciones con 25 mg/ml de 1,4-diazabiciclo [2.2.2. ] octano (Sigma-Aldrich) para evitar foto blanqueo. Todos los portaobjetos se montaron con mo iol (Calbiochem) y visualizaron por microscopio de fluorescencia Olympus BX60.
Ensayo de enlace in vitro.
Ectodominio HER4 recombinante etiquetado HIS (2 /¿g) se incubó con o sin 0.5 µg de mAb 1479 o 3g6. Formación de complejo entre el ectodominio y otras proteínas se visualizó por transferencia Western con anticuerpo anti-penta HIS (Molecular Probes) en condiciones sin reducción.
Análisis de ruptura HER4.
Para estudiar el efecto de mAb 1479 en ruptura HER4, células T-47D se ayunaron por 2 horas sin suero y trataron por 1 hora con 1 j g/ml de mAb 1479 antes de estimular la ruptura con 100 ng/ml de forbol 13-miristato 12-acetato (PMA; Sigma-Aldrich) (23, 33).
Para estudiar el efecto de mAb 1479 en excreción basal de ectodominio HER ' en medio de cultivo, COS-7 que expresa transitoriamente HER4 JM-a CYT-2 se trataron con o sin 1 µg/ml de mAb 1479 o 1475 por veinticuatro horas. Excreción de ectodominio se analizó de 60 µ 1 de muestras de medio directamente recolectadas de platos de cultivo celular por transferencia Western con mAb 1464anticuerpo anti-HER4.
Intemalización de HER4.
Células COS-7 se desarrollaron en cubre objetos y transfectaron con pcDNA3. lHER4JM-aCYT-2 o pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2K751R (32) y Rab5a-GFP (34) sin actividad de quinasa. Veinticuatro horas después de transfección, las células se trataron por 5 minutos o 2 horas con 1 µg/ l de mAb 1479. Las células se fijaron con metanol y tiñeron con Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón. Cubre objetos se montaron con medio de montaje Vectashield. Imágenes se obtuvieron por microscopio confocal LSM 510 Meta (Cari Zeiss,,Inc, Thornwood, Y) Ensayo de proliferación MTS.
Células T-47D y MCF-7 se ayunaron durante la noche y revistieron (1.5 x 104/pozo) en placas de 96 pozos en RPMI que contiene FCS tratado con carbón vegetal al 5% y 1 µg/ml de mAb 1479 o 10 //g/ml 2C4 (Genentech Inc., South San Francisco, CA) . El número de células viables se estimó en puntos en tiempo indicados con Ensayo de Proliferación Celular No Radioactivo CellTiter 96® (Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayo de crecimiento independiente de anclaje.
Capas de fondo que consisten de 2 mi de RPMI, Bacto agar al 0.5%, y FCS al 10% se aplicaron en placas de 6 pozos. Después de solidificación de las capas de fondo, las capas superiores que consisten de 30,000 células/pozo en 1.2 mi de RPMI, Bacto Agar al 0.33%, y FCS al 10% con o sin 1 µg/ml de mAb 1479 se aplicaron por enzima. Todas las muestras se prepararon en triplicado. Las células se incubaron por 14 días a 37 grados C. Colonias más grandes que 8 células se contaron bajo el microscopio.
Análisis Estadístico.
Prueba t de Student se empleó para análisis estadístico de diferentes puntos de tiempo de MTS y ensayos de agar suave. El análisis incluye cinco MTS independientes y tres experimentos de agar suave independientes . Las cantidades de ectodominio HER4 y HER4 de longitud íntegra en tejidos de tumor contra normales se compararon utilizando pares de tejidos normales/tumor apareados con la prueba de rango con signo Wilcoxon.
Ejemplo 2 - mAb 1479 reconoce selectivamente el rompimiento proteolítico de isoformas JM-a de HER4.
Veintinueve clones de hibridoma que secretan anticuerpos contra el ectodominio de HER4 se cribaron para reconocimiento selectivo de isoformas HER4 (Figura 2). El isotipado de los anticuerpos monoclonales se realizó utilizando un equipo de isotipado Mouse MonoAb ID/SP de Zymed (Zymed, So. San Francisco, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cartografía de epítope se realizo por ELISA de bloqueo cruzado. Los HER4 mAbs se agruparon en epítopes con base en su capacidad para bloquear el enlace de otros por 50% o mayor en comparación con un control mAb irrelevante. La especificidad de los HER4 mAbs se determino en una ELISA la probar la capacidad de los HER4 mAbs biotinilados para ligar dominios extracelulares HER2 (aa 1-645), HER3 (aa 1- 617) y HER4 (aa 1-640) (Genentech, Inc.) revestidos en una placa de ELISA a una concentración de 1 Células COS-7 que expresan en forma transitoria isoformas HER4 con dominios de yuxtamembrana extracelular alternos (JM-a CYT-2 o JM-b CYT-2) se analizaron. Análisis Western se llevo a cabo en tres condiciones que representan diferentes grados de desnaturalización de prote na (Figura 3) . Antes de SDS-PAGE, muestras en la pistas 1-3 de la Figura 3 se disolvieron en amortiguador de muestras sin DTT a temperatura ambiente (sin red.); muestras en las pistas 4-6 se disolvieron en amortiguador de muestras sin DTT pero calentaron por 5 minutos a 95 grados C (sin red. , 95 grados C) ; y muestras en las pistas 7-9 se disolvieron en amortiguador de muestras que contiene DTT así como calentaron por 5 minutos a 95 grados C (reducción) . Los anticuerpos contra el extremo carboxi de HER4 (sc-283 y HFR-1) o contra HA-tag (anti-HA) se emplearon para controlar la eficiencia de transfección.
Uno de los anticuerpos, mAb 1479, que reconoce la isoforma JM-a, pero no la isoforma JM-b, cuando se utiliza como el anticuerpo primario en transferencia Western (Figura 3) . La señal específica de HER4 se redujo en intensidad cunado muestras se hirvieron antes de análisis, y abolió totalmente cuando las muestras se hirvieron al igual que sometieron a condiciones reductoras con DTT. Esto indica que el anticuerpo mAb 1479 solo reconoce la conformación nativa. Bajo condiciones no reductoras HER4 aparece como una banda de 150 kD, cerca del tamaño esperado de 144 kD deducido de ADNc (30) , y bajo condiciones reductoras como una banda de 180 kD (compara Figura 3, panel inferior, pistas 1 vs . 7). La especificidad de mAb 1479 por isoforma JM-a se confirmó por tinción de inmunofluorescencia de células COS-7 que expresan en forma transitoria isoformas HER4 etiquetadas HA, mAb 1479 de nuevo reconoce epítopes solamente en la superficie de transíectores JM-a.
Como los miembros de familia del receptor ErbB son homólogos, la reactividad cruzada de mAb 1479 con otros receptores ErbB se estima por transferencia Western utilizando transíectores NIH 3T3-7d y NR6 que expresan en forma estable los diferentes receptores ErbB (31) . mAb 1479 dio una fuerte señal para HER4 (JM-a CYT-2), con una banda débil en análisis Western de células que sobre expresan EGFR (Figura 4). En la Figura 4, células precursoras (pista 2) o transíectadas (pistas 1 y 3) NIH 3T3-7d y NR6 (pista 4) que expresan diferentes receptores ErbB, se analizaron por transferencia western utilizando anti-EGFR (sc-03), anti-HER2 (sc-284), anti-HER3 (sc-285) o mAb 1479 como el anticuerpo primario. Las células precursoras NIH 3T3-7d y NR6 expresan endógeno HER2 , que se detecta en todos los . transíectores con anti-HER2.
Un ensayo inmunosorbente ligado a enzima basado en células (ELISA) se emplea para ensayar más la reactividad cruzada de mAB 1479. mAb 1479, al. igual que el anticuerpo anti-HER4 de control positivo (sc-283), claramente ligó a transfectores NR6 que expresan HER4 (JM-a CYT-2) incluso a las más bajas concentraciones de anticuerpo (1:1000 1.25 //g/ml de mAB 1479; 0.2 //g/ml de sc-283) probadas (Figura 5). Sin embargo, no se observó enlace de mAb 1479 a células NIH 3T3-7d que expresan EGFR, HER2 o HER3 , o la isoforma JM-b CYT-1 de HER4 incluso a la más alta concentración de anticuerpo probada (1:100, 12.5 //g/ml), mientras que los anticuerpos de control anti-EGFR (sc-03), anti-HER2 (sc-284) , anti-HER3 (sc-285), y anti-HER4 (sc-283) demostraron enlace (1:100, 2 //g/ml) (Figura 5). Estos datos indican que mAb 1479 es específico para la isoforma JM-a de HER4.
Ejemplo 3 - mAb 1479 reconoce el ectodominio de excreción de HER4.
Para resolver si mAb 1479 puede emplearse para analizar selectivamente la expresión de las isoformas .HER4 JM-a in vivo, secciones congeladas de riñon y corazón humanos se estimaron por tinción de inmunofluorescencia . Estos dos tipos de tejido se seleccionaron ya que han mostrado que expresan exclusivamente ya sea isoformas JM-a (riñon) o JM-b (corazón) (23). Como es esperado con base en la especificidad in vitro discutida en el Ejemplo 2, mAb 1479 tiñó específicamente riñon pero no tejido de corazón. Un anticuerpo de control positivo contra el extremo carboxiterminal de HER4 (HFR-1) tiñó ambos tejidos, y no se observo inmunotinción cuando un anticuerpo de control negativo contra proteína de célula T de apoyo (3g6) se empleo. Un anticuerpo contra la proteína anclada en membrana CD44 se emplea para visualizar el compartimiento de membrana celular. El patrón de tinción observado para mAb 1479 difiere del observado para HFR-1. Esto puede explicarse por los diferentes epítopos que reconocen, pero más probablemente por el hecho de que la molécula HER4 se rompe y su ectodominio se excreta en tejido de riñon, como se sugiere por localización de HER4 ICD en el núcleo de células glomerulares . También en soporte de rompimiento HER4 en tejido riñon in vivo, análisis Western de lisado de tejido de riñon demostró que mAb 1479 reconoce dos bandas mayores (Figura 6) . Una migró a 150 kD que corresponde al tamaño de ErbB de longitud íntegra bajo condiciones no reductoras (compare Figura 6, pista 1 vs . Figura 3, pista 1) y la otra más prominente a 100 kD correspondiente al tamaño del ectodominio HER4 recombinante (Figura 6, pistas 1 vs . 2). Una tercer banda que migra a aproximadamente 200 kDa fue similar en tamaño a una banda débil en la pista con ectodominio recombinante y representa dímeros de ectodominio.
Para demostrar en forma más directa que mAb 1479 puede reconocer el ectodominio soluble de HER4, un ensayo de enlace in vitro se llevó a cabo con ectodominio HER4 recombinante y mAb 1479. Cuando el ectodominio y el anticuerpo se incubaron en conjunto formaron un complejo de 250 kDa que se detectó en análisis Western (Figura 7). En este ensayo, ectodominio HER4 recombinante etiquetado con HIS (2 g) se incubó con 0.5 µ? de cualquiera de mAb 1479 o el anticuerpo de control negativo 3g6 por 15 minutos y la formación de una proteína se visualizó por análisis Western bajo condiciones no reductoras utilizando un anticuerpo anti-HIS. En la Figura 7, el ectodominio libre se ve que migra al tamaño de 100 kDa, anticuerpos libres a 150 kDa y el complejo formado por el ectodominio ligado al anticuerpo a 250 kDa.
Neuregulina-1 sola también demostró enlace al ectodominio HER4 recombinante, confirmando que el ectodominio recombinante empleado para la experimentación fue funcional . Aún más, una ELISA con ectodominio HER4 etiquetado con HIS, inmovilizado en placa de micropozo (100 ng) dio un valor Kd de 0.85nM+/-0.077 para la interacción con mAb 1479 (a concentraciones en el intervalo de 0.195 a 100 nM) (Figura 8) . Estas observaciones demuestran que mAb 1479 liga al ectodominio HER4 con una afinidad relativamente alta.
Ejemplo 4 - Se mejora excreción de ectodominio HER4 en cáncer de mama in vivo.
Isoformas JM-a segmentables , así como la enzima TACE capaz de segmentar HER4, se sobre expresan en tejidos de tumor de mama in vivo (29), y epítopo HER4 carboxi terminal se localiza en núcleos más frecuentemente en tejido de cáncer de mama que en epitelio mamario normal histológicamente (35) . Aún más, localización nuclear de inmunoreactividad HER4 se asocia con supervivencia desfavorable cuando se compara con inmunoreactividad de superficie celular (29) . Estos hallazgos implican que la escisión de HER4 y excreción del ectodominio se mejoran en cáncer de mama, en comparación con tejido de mama normal, y que la escisión es de significancia biológica. Para probar si la transformación de tejido de mama histológicamente normal con carcinoma de mama se asocia con excreción mejorada de ectodominio HER4, 17 pares de tejidos de cáncer de mama/mamas normal apareados se analizaron por transferencia Western con mAb 1479 (Figura 9) . Los pares de muestra consistieron de material de tejido congelado de pacientes de cáncer de mama de quienes tanto' el tejido de cáncer como tejido adyacente histológicamente normal estuvieron disponibles. Los datos Western, generados bajo condiciones sin reducción, se calificaron por las intensidades de la señal de 150 kD que representa HER4 de longitud íntegra y la señal 100 kD que representa ectodominio soluble. Nueve de 17 (53%) de las muestras de tumor demostraron incrementada expresión de HER4 total cuando se comparan con el par de tejidos normales apareados. Solo una muestra de tumor (1/17; 6%) no tuvo expresión de HER4 detectable en comparación opuesta a seis muestras de tejido de mama normal sin (6/17; 35%) HER4 detectable. Hallazgos similares de niveles de proteína HER4 mejorados en tejidos de cáncer contra normales, también se obtuvieron por inmunohistoquímica con mAb 1479 utilizando los mismos pares de muestras.
De manera interesante, la señal para ectodominio HER4 se observó en 12 (12/16; 75%) de muestras de tumor positivo HER4 pero solo en dos muestras de tejido de mama normal positivo HER4 (2/11; 18%) . Cuando las señales Western para el receptor de longitud íntegra 150 kD y el ectodominio de 100 kD se cuantificaron por densitometría los tejidos de tumor expresados significativamente más ectodominio HER4 cuando se comparan con tejidos normales (P = 0.015) (Figura 10). Sin embargo, la diferencia en la expresión de HER4 de longitud íntegra, no llega a significancia estadística (P = 0.33). La cantidad de ectodominio 100 kD detectado tampoco se correlaciona con la cantidad total de HER4 (100 kD + 150 kD) en la misma muestra (P = 0.15). Estos datos sugieren que la regulación por incremento de las cantidades de ectodominio en tejido de cáncer no fue una simple consecuencia de que se elaboró más proteína. Aún más, de las dos pacientes que demostraron similares niveles de HER4 de longitud íntegra en tejidos normales y de cáncer (pacientes #1 y #3), ambas demostraron presencia de ectodominio soluble solo en la muestra de tumor. En conjunto, estos datos indican que la excreción del ectodominio HER4 se mejora durante el avance de cáncer de mama, y que mAb 1479 puede emplearse para detectar ectodominio HER4 excretado por tej ido de tumor humano .
Ejemplo 5 - mAb 1479 suprime fosforilación y segmentación de HER4.
Para analizar las consecuencias de mAb 1479 que enlaza función HER4, se midió fosforilación HER4 en células de cáncer de mama MCF-7 que expresan naturalmente isoformas JM-a (26). Células MCF-7 se estimularon por 1, 2, o 3 horas con 0, 1, o 10 ug/ml de mAb 1479 antes de un estímulo de 15 minutos con 50 ng/ml de neuregulina-1 (NRG-1 ) , y analizaron por fosforilación tirosina HER4, utilizando un anticuerpo fosfo-específico contra pTyrl284 de HER4. La membrana se re-transfirió con anti-HER4 (Abcam) y anti-actina. mAb 1479 suprimió significativamente fosforilación estimulada por NRG-1 de HER4 (Figura HA) .
Ya que la activación de HER4 también puede regular la segmentación de HER4 (36), se estimó el efecto de mAb tanto en segmentación HER4 basal como estimulada con forbol 13-miristato 12-acetato (PMA) . La expresión del ectodominio · HER4 100 kDa en el medio de cultivo de transfectantes COS-7 que expresan HER4 JM-a CYT-2 se analizó por transferencia western con un anticuerpo anti-HER4 mAb 1464 después de estimular las células por 24 h con 1 g/ml de mAb 1479 o un anticuerpo de control mAb 1475. Lisados celulares totales del mismo experimento se analizaron por transferencia western con anti-HER4 (Abcam) y anti-actina (Figura 11B) .
Tratamiento con mAb 1479 disminuye significativamente la cantidad de ectodominio HER4 de 110 kDa soluble, excretado en el medio de transfectantes COS-7, cuando se compara con células no tratadas o células tratadas con mAbl475 que reconocen un diferente epítopo HER4 (Figura 11B) . Estos datos indican que mAb 1479 bloquea fosforilación de tirosiná y segmentación de isoformas HER4 JM-a.
Ejemplo 6 - mAb 1479 se internaliza eficientemente por un mecanismo que depende de HER4 pero independiente de actividad de HER4 quinasa.
La inhibición de crecimiento de tumor por anticuerpos anti-HER2 se ha mostrado que está asociada con una capacidad intrínsica de mAbs para inducir endocitosis (37) . mAb 1479 se observó que se agota rápidamente del medio de cultivo de células que expresan HER4 pero no de medio de células de control de vector. Para plantear si esto se debió a internalización mediada por HER4 de mAb, células COS-7 que expresan transitoriamente HER4 JM-a, se trataron con mAb 1479 y analizaron por microscopía confocal para visualizar la localización sub-celular del anticuerpo. Después de cinco minutos de incubación mAb 1479 se detectó de manera predominante en las superficies celulares. Sin embargo, en dos horas, el anticuerpo se ha internalizado al citosol y parcialmente co-localizado con Rab5 etiquetado con proteína fluorescente verde (GFP = Green Fluorescent Protein) , un marcador de vesículas endocíticas tempranas. No se observó localización citoplásmica de mAb 1479 en células que expresan la isoforma JM-b. Aunque dependiente de la expresión de HER4, la internalización de mAb 1479 no requiere actividad de HER4 quinasa ya que mAb 1479 se internalizó eficientemente también cuando se analizaron células COS-7 que expresan transitoriamente una construcción HER4 JM-a sin actividad quinasa (K751R) . mAb 1479 también mejoró la ubiquitinación de isoformas JM-a segmentables de HER4, indicando que mAB 1479 puede estimular en forma activa la endocitosis ErB4 en vesículas degradativas como se ilustra en la Figura 12. El ensayo en la Figura 12 se realiza utilizando células COS-7 que expresan en forma transitoria JM-a CYT-1 o JM-a CYT-2 junto con ubiquitina etiquetada con Flag. Las células se trataron por 0, 10, 30 o 120 minutos con 2 ug/ml de mAbl479 y analizaron por ubiquitinación de HER4 por inmunoprecipitacion de anti-HER4 con HFR-1 seguido por transferencia western con un anticuerpo anti-Flag. La carga de proteína HER4 se controló al volver a transferir con anticuerpo anti-HER4 (Abcam) .
Cetuximab se ha sugerido que suprime crecimiento de tumor al facilitar regulación por disminución de EGFR (38) . Para plantear si la internalización eficiente de mAb 1479 en células que expresan HER4 asociada con estímulo de regulación por disminución de HER4 , células MCF-7 que expresan niveles moderados de HER4 endógeno, se cultivaron por hasta 72 horas en la presencia de 1 ug/ml de mAb 1479 y los niveles totales de HER4 de longitud íntegra se analizaron por transferencia Western (Figura 13). Niveles de expresión de proteína HER4 de Estado-estable se analizaron por transferencia Western con un anticuerpo anti-HER4 (Abcam) y la carga se controló con anti-actina. Tratamiento con mAb 1479, pero no con el anticuerpo de control 3g6 (1 ug/ml) , disminuye significativamente los niveles de estado estable de HER4. El efecto ya se vió a un punto en tiempo de 2 horas y duró por las 72-horas del experimento.
Ejemplo 7 - mAb 1479 suprime proliferación y formación de colonias de células de cáncer de mama.
Para estudiar . el efecto de mAb 1479 en el crecimiento de células de cáncer de mama, ensayos MTS que miden la cantidad de células viables se llevaron a cabo con líneas celulares de cáncer de mama humano. mAb 1479 suprimió significativamente la proliferación de células T-47D (P = 0.0014) y MCF-7 (P = 0.047) (Figura 14). En este ensayo, las líneas celulares se trataron con 1 ug/ml de mAb 1479 o el anticuerpo de control positivo 2C4 (Genentech) por los periodos indicados de tiempo . El número de células viables se estimaron por ensayo M S. Los anticuerpos reducen significativamente el número de células viables al punto en tiempo a 7-días (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; prueba t-Student, cinco experimentos independientes llevados a cabo en triplicado) . El efecto que se ve con mAb 1479 fue similar o más potente cuando se compara con el anticuerpo anti-HER2 2C4 (Genentech) , que bloquea la heterodimerización HER2 con otros receptores HER (39) . mAb 1479 suprime significativamente el crecimiento independiente de anclaje tanto de células T-47D (P < 0.001) como MCF-7 (P = 0.043) en ensayos de formación de colonia en agar suave (Figura 15) . Colonias con más del tamaño de 8 células por un campo x20 en punto de tiempo 14-días se calcularon de 10 campos de microscopio por experimentos llevados a cabo tres veces. El tratamiento con mAb 1479 reduce significativamente el número de colonias en el punto en tiempo a 14-días cuando se compara con el anticuerpo de control 3g6 (**P<0.01; ***P<0.001; prueba-t Student, tres experimentos independientes llevados a cabo en triplicado) . Desviaciones promedio y estándar se ilustran en la Figura 15.
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Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo de anti-HER4 aislado que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo compite para enlace con la isoforma JM-a con el anticuerpo anti-HER4 mAb .1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene No. de Acceso PTA-9655.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo liga al mismo epítopo que el epítopo al cual liga el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con la ATCC que tiene número de acceso PTA-9655.
4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado.
5. Un anticuerpo anti-HER4 aislado que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a en donde el anticuerpo comprende un fragmento del anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene No. de acceso PTA-9655 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el fragmento comprende la región variable del anticuerpo monoclonal mAb 1479.
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el anticuerpo es humanizado .
8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizado porque el anticuerpo es madurado por afinidad.
9. Un anticuerpo anti-HER4 aislado que comprende anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada con ATCC que tiene No. de Acceso PTA-9655 o su forma humanizada.
10. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un agente citotóxico.
11. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el anticuerpo tiene menos cardiotoxicidad que un anticuerpo anti-HER4 que no es específico para la isoforma HER4 JM-a.
12. Un método para inhibir la proliferación de una célula de cáncer que expresa la isoforma HER4 JM-a, que comprende poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 es el anticuerpo anti-HER4 aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13 , caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 reduce excreción de ectodominio HER4.
15. Un método para tratamiento de cáncer en un paciente cuyo cáncer expresa la isoforma HER4 JM-a, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a .
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 es el anticuerpo anti-HER4 aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
17. El método de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 reduce la excreción del ectodominio HER4.
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovarios o meduloblastoma .
19. Un método para tratar cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas de: a) seleccionar un paciente cuyas células cancerosas expresan la isoforma HER4 JM-a y b) administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente la isoforma HER4 JM-a.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 es el anticuerpo anti-HER4 aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
21. El método de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 reduce la expresión de ectodominio HER4.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovarios, o meduloblastoma.
23. Un método para tratar cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas de: a) seleccionar un paciente cuyas células cancerosas comprenden niveles incrementados de ectodominio Her excretado, en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido; y b) administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 es el anticuerpo anti-HER4 aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 reduce excreción de ectodominio HER4.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovarios, o meduloblastoma .
27. Un método para reducir el riesgo de cardiotoxicidad asociada con terapia de cáncer en un paciente con cáncer, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma HER4 JM-a.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo anti-HER4 es el anticuerpo anti-HER4 aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
29. El método de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracteizado porque el cáncer sobre-expresa a la isoforma HER4 JM-a.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizado porque el cáncer comprende niveles incrementados de ectodominio Her4 excretado en comparación con células no-cancerosas del mismo tipo de tejido.
31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-30, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovarios, o meduloblastoma .
32. Método para detectar la presencia de ectodominio HER4 excretado en una muestra de células, que comprende poner el contacto las células con un anticuerpo que liga específicamente a la isoforma JM-a HER4.
33. Un método para diagnosticar un tumor en un paciente, caracterizado porque comprende detectar la presencia de ectodominio HER4 excretado en el tumor.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la detección comprende poner en contacto un anticuerpo anti-HER4 que liga específicamente a la isoforma JM-a de HER4 con una muestra que se obtiene del tumor .
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque además comprende comparar el nivel de ectodominio HER4 excretado en el tumor al nivel de ectodominio excretado HER4 en una muestra de control no cancerosa.
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