KR101789338B1 - 이소형 특이적 항-ｈｅｒ４ 항체 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 HER4 JM-a 이소형을 발현하는 암을 검출하고 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 개시한다.

Description

이소형 특이적 항-ＨＥＲ４ 항체 {ISOFORM SPECIFIC ANTI-HER4 ANTIBODIES}
관련 출원
본 출원은 35 USC 119(e) 하에서 2008년 11월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/117,903호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 가출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 암을 검출하고 치료하는데 유용한 항체 및 그러한 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다.
ErbB/HER 수용체는 EGFR (ErbB1 또는 HER1로도 공지됨), HER2 (c-Neu, ErbB2), HER3 (ErbB3), 및 HER4 (ErbB4)를 포함하는 수용체 티로신 키나제의 서브패밀리를 형성한다. ErbB 수용체는 세포 반응, 예컨대 세포 증식, 분화, 이동 또는 생존을 야기하는 다수의 EGF 유사 성장 인자에 의해 선택적으로 활성화된다. ErbB 수용체는 글리코실화된 세포외 도메인, 단일 막횡단 도메인, 및 티로신 키나제 효소를 포함하는 세포내 도메인으로 이루어진다. 수용체 세포외 도메인에의 리간드 결합은 수용체의 이량체화에 후속하여, 키나제 도메인의 활성화, 수용체 자가인산화 및 다중 하류 신호전달 캐스케이드를 촉발한다 (1).
EGFR 및 HER 2는 널리 확립되어 있는 종양 유전자이며, 암 약물의 표적이다. 이들은 다양한 상피 및 신경 악성종양의 발병기전과 관련이 있고, 이들의 과다활성은 불량한 환자 결과와 관련된다 (2-4). 이들 수용체의 기능을 차단하는 모노클로날 항체 및 작은 분자량 키나제 억제제 둘 모두를 비롯한 표적화된 치료제는 임상 시험에서 환자의 생존에 있어 치료 효과를 나타내었다. 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)™, 임클론 인크.(Imclone, Inc.))은 EGFR에 대한 리간드 결합을 차단하여 수용체 이량체화, 자가인산화 및 신호전달 경로의 활성화를 감소시키는 키메라 모노클로날 항체이다 (5). 세툭시맙은 최근에 말기 화학내화성 결장직장암 및 두경부의 국소적 또는 지역적 후기 편평 세포 암종에 대한 임상 용도를 승인받았다. 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)™, 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.))은 ErbB2를 과다발현하는 유방암을 치료하기 위해 아주반트 설정 및 후기 질환 둘 모두에서 최근에 사용되고 있는, HER2의 세포외 도메인에 대한 인간화 모노클로날 항체이다 (6-9).
HER4 수용체 길항제는 과도한 이동 및/또는 증식 또는 평활근 세포를 제어하고, 특히 협착증을 치료하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 미국 특허 제7,332,579호를 참조한다.
암에서의 HER4의 중요성에 대한 이해는 저조하다. 몇몇 관찰결과는 HER4 수용체가 다양한 암에서 하향조절되거나, 또는 그의 발현이 에스트로겐 수용체 발현과 같이 유익한 예후 마커와 관련이 있음을 보여준다 (10, 11). 한편, HER4는 갑상선암 (12), 난소암 (13), 및 유방암 (14)과 같은 몇몇 암에서 뿐만 아니라 수모세포종 (15), 및 상의세포종 (16)에서 발현 수준이 높은 것으로 보고되었다. 게다가, 임상 결과에 있어서 HER4 발현 수준의 중요성은 충돌하고 있다 (17). 이러한 상반되는 데이터에 대해 그럴듯한 설명 중 하나는 단일의 HER4 유전자로부터 선택적 스플라이싱에 의해 4가지의 구조적 및 기능적으로 상이한 이소형이 생성된다는 것이다 (18, 19). 이들 이소형은 상이한 조직 분포 프로파일을 갖고, 유방암 세포주에서 종양형성을 촉진하는 능력이 서로 상이하다 (26).
따라서, HER4 매개 장애를 보다 정확하게 치료하기 위해 HER4 수용체의 특정 이소형에 대한 치료제를 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 측면은 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 단리된 항-HER4 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항-HER4 항체 mAb 1479와 JM-a 이소형에 대한 결합을 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체 mAb 1479가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다.
또 다른 실시양태에서, HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 단리된 항-HER4 항체는 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체 mAb 1479로부터의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 모노클로날 항체 mAb 1479의 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 친화성 성숙된 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 항-HER4 항체는 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체 mAb 1479 또는 그의 인간화 형태를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-HER4 항체는 세포독성제에 연결된다.
일부 실시양태에서, HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 단리된 항-HER4 항체는 HER4 JM-a 이소형에 특이적이지 않은 항-HER4 항체 보다 심독성이 낮다.
본 발명의 또 다른 측면은 암 세포를 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체의 치료 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, HER4 JM-a 이소형을 발현하는 암 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 HER4 엑토도메인 쉐딩을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 유방암 세포, 난소암 세포 또는 수모세포종 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 HER4 JM-a 이소형을 발현하는 암 환자에게 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 HER4 엑토도메인 쉐딩을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료할 암은 유방암, 난소암 또는 수모세포종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 암성 세포가 HER4 JM-a 이소형을 발현하는 환자를 선별하고, 상기 환자에게 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체의 치료 유효량을 투여하는 것에 의한, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 HER4 엑토도메인 쉐딩을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료할 암은 유방암, 난소암 또는 수모세포종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 암성 세포가 증가된 수준의 쉐딩된 Her4 엑토도메인을 포함하는 환자를 선별하고, 상기 환자에게 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체의 치료 유효량을 투여하는 것에 의한, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 HER4 엑토도메인 쉐딩을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료할 암은 유방암, 난소암 또는 수모세포종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 암 요법과 관련된 심독성의 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자의 암은 HER4 JM-a 이소형을 과다발현한다. 한 실시양태에서, 환자의 암은 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 증가된 수준의 쉐딩된 Her4 엑토도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 유방암, 난소암 또는 수모세포종이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포를 JM-a HER4 이소형에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 샘플에서 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양에서 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 진단하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 검출 방법은 HER4의 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체를 종양으로부터 수득한 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 종양에서의 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준을 비암성 대조군 샘플에서의 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준과 비교하는 것을 포함한다.
도 1은 별법적 막근접 도메인 HER4 이소형 JM-a (서열 1) 및 JM-b (서열 2)를 보여주는 다이아그램이다.
도 2는 특정 HER4 모노클로날 항체의 특징을 기술한 표이다.
도 3은 HER4 이소형 JM-a CYT-2 또는 JM-b CYT-1를 발현하는 COS-7 세포에 대한 mAb 1479 및 대조군 항체, sc-283의 결합 특이성을 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다.
도 4는 상이한 ErbB 수용체를 안정적으로 발현하는 NIH 3T3-7d 및 NR6 세포에 대한 mAb 1479 및 대조군 항체 항-EGFR (sc-03), 항-HER2 (sc-284), 항-HER3 (sc-285)의 결합 특이성을 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다.
도 5는 세포 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 분석된, HER4 JM-a CYT-2, HER4 JM-b CYT-1, EGFR, HER2, 또는 HER3을 발현하는 NIH 3T3-7d 및 NR6 형질감염체에 대한 mAb 1479의 결합 특이성을 보여주는 그래프이다 (회색 칼럼). mAb 1479 결합을 항-EGFR (sc-03), 항-HER2 (sc-284), 항-HER3 (sc-285) 및 항-HER4 (sc-283)의 결합 (백색 칼럼의 모든 대조군 항체의 결합)과 비교하였다 (1:1000 (좌측) 또는 1:100 (우측)으로 희석한 것).
도 6은 인간 신장 조직 용해물에서 쉐딩된 HER4 엑토도메인에 대한, 및 재조합 HER4 엑토도메인에 대한 mAb 1479의 결합을 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다.
도 7은 재조합 HER4 엑토도메인 및 mAb 1479로 수행한 시험관내 결합 검정의 결과를 보여준다.
도 8은 재조합 HER4 엑토도메인에 대한 mAb 1479의 결합을 측정한 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)의 비선형 친화성 곡선이다.
도 9는 엑토도메인 쉐딩을 검출하기 위한, mAb 1479를 이용한 17 쌍의 정상 유방 (N)/유방 종양 (T) 조직 샘플의 웨스턴 블롯 분석이다. 100 kDa HER4 엑토도메인 (회색) 및 150 kDa 전장 HER4 (백색)의 발현 수준의 농도측정 정량화는 각 웨스턴 레인의 아래에 나타낸다.
도 10은 농도측정에 의해 정량화한, 17개의 매칭된 정상 및 유방 종양 조직 쌍에서 HER4 엑토도메인 및 전장 수용체의 평균 발현을 나타낸 그래프이다. *, 엑토도메인으로 나타난 전체 HER4의 분획은 매칭된 정상 조직 대조군과 비교할 경우 종양 조직 내에서 더 컸다 (회색 박스; P<0.05; 윌콕슨(Wilcoxon) 부호 순위 검정).
도 11a는 NRG-1 자극된 MCF-7 유방암 세포의 HER4 티로신 인산화에 대한 mAb 1479의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다. 막을 항-HER4 (아브캄(Abcam)) 및 대조군으로서 항-액틴으로 재블롯팅하였다. 도 11b는 HER4 JM-a CYT-2를 발현하는 COS-7 형질감염체의 배양 배지로의 100 kDa HER4 엑토도메인의 쉐딩에 대한 mAb 1479의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다. 동일한 실험으로부터의 전체 세포 용해물을 항-HER4 (아브캄) 및 항-액틴을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 12는 HER4의 절단가능한 JM-a 이소형의 유비퀴틴화에 대한 mAb 1479의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다.
도 13은 HER4 발현 수준에 대한 mAb 1479의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯 분석이다.
도 14는 인간 유방암 세포주 T-47D 및 MCF-7의 증식에 대한 mAb 1479의 효과를 대조군 항체 2C4와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 15는 연질 한천 콜로니 형성 검정에 의해 밝혀진 바와 같은, 인간 유방암 세포주 T-47D 및 MCF-7의 부착 비의존적 성장에 대한 mAb 1479의 효과를 대조군 항체 3g6과 비교하여 보여주는 그래프이다.
상세한 설명
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 당업자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가지며, 다음 문헌에 기재된 바와 일치한다: 문헌 [Singleton et al., 1994 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY]; 및 [Janeway et al., 2001 Immunobiology: the immune system in health and disease 5th Ed., Garland Publishing, New York].
본원에서 사용되는 용어 "HER4 폴리펩티드" 또는 "HER4 수용체"는 달리 구체적으로 문맥상 나타내지 않는 한, 예를 들어 유럽 특허 출원 번호 (EP) 599,274; 문헌 [Plowman at al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)]; 및 [Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]에 개시되어 있는 HER4 유전자로부터 생성된 임의의 천연 또는 변이체 폴리펩티드를 지칭한다. 한 실시양태에서, HER4 유전자는 인간 HER4 유전자이다. 용어 "HER4" 및 "ErbB4"는 당업계에서 구별없이 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 형태, 자연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 형태), 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함하며, 글리코실화 및 GPI 변형과 같은 자연 발생 번역후 변형을 포함할 수 있다.
용어 "야생형"은 일반적으로 자연 발생 HER4 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
"천연 서열 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로, 용어 "천연 서열 폴리펩티드"는 특정 폴리펩티드의 자연 발생 말단절단 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 자연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함하며, 글리코실화 등과 같은 자연 발생 번역후 변형을 포함할 수 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 우세한 천연 서열 폴리펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 폴리펩티드를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 아미노산 서열내의 특정 위치에서 치환, 결실, 및/또는 삽입을 보유한다.
"서열 동일성"은 아미노산 서열 변이체에서 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고 필요하다면 갭을 도입한 후 동일한 잔기의 백분율로서 정의된다. 이러한 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 중 하나는 제넨테크, 인크.의 소유로 미국 20559 워싱턴 디씨 소재의 미국 저작권청(United States Copyright Office)에 1991년 12월 10일자로 사용자 문서로 제출된 "Align 2"로, 그 코드는 WO 2007/001851에서 확인된다.
"세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인은 소수성 도메인의 유형을 확인하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인됨이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 다양할 수 있지만, 본원에서 초기에 확인된 도메인의 어느 한 말단에서 약 5개 이하의 아미노산이 상이할 가능성이 가장 크다.
본원의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다 (문헌 [Miller et al., 2003 Jour. of Immunology 170:4854-4861]). 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라 항체일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유래된 것일 수도 있다. 항체는 특이적 항원을 인식하고 이와 결합할 수 있는 단백질이다 (문헌 [Janeway et al., 2001 Immunobiology: the immune system in health and disease, 5th Ed., Garland Publishing, New York]. 표적 항원은 일반적으로 여러 항체상의 CDR에 의해 인식되는, 에피토프라 불리기도 하는 다수의 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 1종 초과의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적 항원 (이러한 표적은 암 세포, 또는 자가면역 질환과 관련이 있는 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 또는 그의 일부와 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 분자의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스 중 어느 것일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종, 예를 들어 인간, 뮤린 또는 토끼로부터 유래될 수 있다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 문헌 [Basic & Clinical Immunology, 8th edition, Stites and Terr (eds.), Mcgraw-Hill, Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994 at Chapter 6]을 참조한다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) (카파 및 람다라 불리는 2가지 유형이 존재함) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 다양한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.
"모 항체"는 천연 또는 야생형 서열을 포함할 수 있다. 모 항체는 관심 표적 항원, 예를 들어 생물학상 중요한 폴리펩티드에 대해 작용할 수 있다. 또한, 비폴리펩티드 항원 (예를 들어, 종양-회합 당지질 항원; US 5091178 참조)에 대해 작용하는 항체도 고려된다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 항체이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대해 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체의 95 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 자연 환경의 1종 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 미니바디 (minibody) (US 5641870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10): 1057-1062]; [Olafsen et al., 2004 Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323]), Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암 세포 항원, 바이러스성 항원 또는 미생물 항원과 면역특이적으로 결합하는 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및 글리코실화 차이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않는 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유익하다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., 1975 Nature 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어: US 4816567; US 5807715 참조)에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기한 바와 같이 면역화시켜서, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발한다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 면역화한 후, 림프구를 단리한 다음, 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding 1986 Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 Academic Press]). 항체는 또한 문헌 [Clackson et al., 1991 Nature 352:624-628]; [Marks et al., 1991 J. Mol. Biol. 222:581-597]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 치환시키거나 (US 4816567; 및 문헌 [Morrison et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열을 비이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 융합시킴으로써 변형시켜 "키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드"를 생성할 수 있다. 비이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인 대신 사용될 수도 있고, 또는 이것이 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용되어 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
본원에서 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이며, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 "키메라" 항체, 및 또한 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (US 4816567; 및 문헌 [Morrison et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]). 본원의 관심 키메라 항체에는 비인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 포함된다.
비인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 결합되어 있는 H 쇄 둘 모두의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이러한 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다 (문헌 [Jones et al., 1986 Nature 321:522-525]; [Riechmann et al., 1988 Nature 332:323-329]; [Presta 1992 Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596]; [Verhoeyen et al., 1988 Science 239:1534-1536]; [Sims et al., 1993 J. Immunol. 151:2296]; [Chothia et al., 1987 J. Mol. Biol. 196:901]). 다른 방법은 모든 인간 항체의 특정 경쇄 또는 중쇄 하위군의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 이용한다 (문헌 [Carter et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al., 1993 J. Immunol. 151:2623]).
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 면역화시 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재 하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 이용할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제시킨다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 그러한 배선 돌연변이체 마우스로 전달하면 항원 접종시 인간 항체가 생성될 것이다 (문헌 [Jakobovits et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551]; [Jakobovits et al., 1993 Nature, 362:255-258]; [Bruggemann et al., 1993 Year in Immuno. 7:33]; US 5545806; US 5569825; US 5591669; US 5545807; 및 WO 1997/17852).
"시스테인-조작된" 항체는 임의의 형태의 야생형 뮤린 모 모노클로날 항체, 인간 또는 인간화 항체의 하나 이상의 아미노산이 시스테인 아미노산으로 대체된 항체이다. 조작된 시스테인 아미노산은 유리 시스테인 산이고, 쇄내 또는 쇄간 디술피드 유닛의 일부가 아니다. 시스테인 아미노산에 대한 하나 이상의 코돈이 도입되도록 관심 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA를 변형시키거나 "조작하고", 이에 따라 유리 시스테인이 세포독성 약물에 대한 접합과 같은 추가의 변형을 위해 발현된 항체 상에서 이용될 수 있다.
"항원"은 항체와 선택적으로 결합할 수 있는 소정의 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연 발생 또는 합성 화합물이다. 세포의 세포 막은 "세포 표면 노출된 항원"을 제공할 수 있다.
항체는 항원에 대한 결합이 항원의 에피토프를 표적화하는데 유용한 항체-항원 복합체를 형성하기에 충분한 친화성 및 특이성을 갖는 경우, 분자적 표적 또는 관심 항원에 "결합"한 것이다. 항원의 에피토프는 세포의 표면 상에서 노출될 수 있거나, 또는 단리된 단백질 상에 제시될 수 있다.
용어 "특이적인 결합" 또는 특정 분자적 표적 또는 관심 항원 또는 특정 분자적 표적 또는 관심 항원 상의 에피토프"에 특이적으로 결합한다" 또는 특정 분자적 표적 또는 관심 항원 또는 특정 분자적 표적 또는 관심 항원 상의 에피토프"에 특이적인"은 비특이적인 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 미표지 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 미표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다. 한 실시양태에서, 이같은 용어는 분자가 어떠한 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에도 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다. 별법적으로, 이같은 용어는 표적에 대한 Kd가 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 또는 그 초과인 분자에 의해 기술될 수 있다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계 공지의 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다.
"항체-항원 복합체" 또는 "항체-약물 접합체-항원 복합체"는 특이적 결합의결과로 형성된다. 예를 들어, 항체가 HER4에 특이적으로, 또는 HER4의 이소형에 특이적으로 결합하는 항체인 경우, 이는 통상적으로 천연 HER4 또는 그의 이소형에서 발견되는 하나 이상의 에피토프에 우세하게 결합할 것이며, 다른 항원 또는 단백질 또는 다른 HER4의 이소형과는 현저한 결합 친화성 (예를 들어, 비특이적 결합 친화성 또는 교차반응성)을 갖지 않는 항체일 수 있다. 그러한 실시양태에서, 비-HER4, 또는 HER4의 다른 이소형에 대한 비특이적 결합 친화성 또는 교차 반응 결합의 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)에 의한 측정시, 10％, 5％, 2％, 또는 1％ 미만일 것이다.
본원에서 "무손상 항체"는 VL 및 VH 도메인, 및 또한 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 항체의 Fc 불변 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에서 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체-의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 및 세포 표면 수용체, 예컨대 B 세포 수용체 및 BCR의 하향 조절을 포함한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘다 내에 초가변 영역이라 불리우는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FR에 의해 아주 근접하게 묶여 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하는데; VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 많은 초가변 영역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초한 것이며, 가장 흔히 사용되고 있다 (문헌 [Kabat et al., 1991]). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk 1987 J. Mol. Biol. 196:901-917]). "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한 것이다. 각각의 이들 초가변 영역의 잔기를 아래에 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 단백질의 정렬된 서열의 카바트 데이터베이스에 따른 카바트 넘버링을 이용할 것이다 (문헌 [Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250]; [Johnson and Wu 2000 Nuc. Acids Res. 28(1):214-218]. 초가변 영역 또는 "상보성 결정 영역" 위치는 일반적으로 다음과 같다: 아미노산 24-34 (VL CDR-L1), 아미노산 49-56 (VL CDR-L2), 아미노산 89-97 (VL CDR-L3), 아미노산 26-35A (VH CDR-H1), 아미노산 49-65 (VH CDR-H2), 및 아미노산 93-102 (VH CDR-H3). 초가변 영역은 또한 "확장된 초가변 영역", VL CDR-L1의 경우 아미노산 24-36 및 VL CDR-L2의 경우 아미노산 46-56을 포함할 수 있다. 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 1991, 상기 문헌]에 따라 넘버링된다. 본원에서의 목적상 "변경된 초가변 영역"은 내부에 하나 이상 (예를 들어, 1개 내지 약 16개) 아미노산 치환(들)을 포함하는 초가변 영역이다. 본원에서의 목적상 "비변형된 초가변 영역"은 이것이 유래된 비인간 항체와 동일한 아미노산 서열, 즉 내부에 하나 이상의 아미노산 치환이 없는 초가변 영역이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형은 문헌 [Kabat et al., 1991, 상기 문헌]에서 항체 캄필레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 몇 개 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어 카바트에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. "인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al., 1991]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서는, VH의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다. "VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al., 1991]의 가변 중쇄 하위군 III 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. "VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al., 1991]의 가변 경쇄 카파 하위군 I 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다.
"친화성 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 항체와 비교해서 항원에 대한 항체의 친화성이 개선된, 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 친화성 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 가질 것이다. 친화성 성숙 항체는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling) (문헌 [Marks et al., 1992 Bio/Technology 10:779-783]), 또는 CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발 (문헌 [Barbas et al., 1994 Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; [Schier et al., 1995 Gene 169:147-155]; [Yelton et al., 1995 J. Immunol. 155:1994-2004]; [Jackson et al., 1995 J. Immunol. 154(7):3310-9]; 및 [Hawkins et al., 1992 J. Mol. Biol. 226:889-896])에 의해 친화성 성숙된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위와 항원-결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 형태에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면상의 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.
Fab 단편 역시 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2가지 명백한 별개 유형 (카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭됨) 중의 하나로 지정될 수 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 추가로 Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 포함한다 (문헌 [Plueckthun 1994 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]).
용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 내에서 VL에 연결된 VH (VH-VL)를 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 하여, 2개의 항원-결합 부위를 생성한다 (EP 404,097; WO 1993/11161; 문헌 [Hollinger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448] 참조).
용어 "항체-약물 접합체" 또는 "면역접합체"는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함한다.
"유리 시스테인 아미노산"은 모 항체에서 조작되고, 티올 관능기 (-SH)를 가지며, 분자내 또는 분자간 디술피드 브릿지로서 또는 달리 그의 일부로서 쌍형성하지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "티올 반응성 값"은 유리 시스테인 아미노산의 반응성에 대한 정량적 특성이다. 티올 반응성 값은 티올-반응성 시약과 반응하는, 시스테인 조작된 항체 내의 유리 시스테인 아미노산의 백분율이고, 최대 1의 값으로 전환된다. 예를 들어, 100％ 수율로 티올-반응성 시약, 예컨대 비오틴-말레이미드 시약과 반응하는 시스테인-조작된 항체 상의 유리 시스테인 아미노산은 티올 반응성 값이 1.0인 비오틴-표지된 항체를 형성할 것이다. 80％ 수율로 티올-반응성 시약과 반응하는, 동일하거나 상이한 모 항체로 조작된 다른 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 0.8일 것이다. 티올-반응성 시약과 전혀 반응하지 못하는, 동일하거나 상이한 모 항체로 조작된 다른 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 0이다. 특정 시스테인의 티올 반응성 값 결정은 ELISA 검정, 질량 분광분석법, 액체 크로마토그래피, 오토라디오그래피, 또는 다른 정량적 분석 시험에 의해 수행할 수 있다. 시스테인 조작된 항체를 포획가능하게 하고 시스테인 반응성의 비교 및 정량화를 가능하게 하는 티올-반응성 시약에는 비오틴-PEO-말레이미드 ((+)-비오티닐-3-말레이미도프로피온아미딜-3,6-디옥사옥타인디아민 (문헌 [Oda et al., 2001 Nature Biotechnology 19:379-382], 피어스 바이오테크놀로지 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)), 비오틴-BMCC, PEO-요오도아세틸 비오틴, 요오도아세틸-LC-비오틴, 및 비오틴-HPDP (피어스 바이오테크놀로지 인크.), 및 Nα-(3-말레이미딜프로피오닐)바이오시틴 (MPB, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 오리건주 유진 소재)이 포함된다. 비오티닐화, 이관능성 및 다관능성 링커 시약의 기타 상업적인 공급처는 몰레큘라 프로브스 (오리건주 유진 소재) 및 시그마(Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재)를 포함한다.
항체 또는 항체-약물 접합체는 세포 표면 항원과의 복합체를 형성한 후, 세포 표면 막 상에 존재하는 항원-항체 복합체 또는 항원-항체-약물 접합 복합체가 세포 표면으로부터 제거되고 생화학 반응을 통해 세포 그 자체로 통합될 경우 "내재화된다". 따라서 몇몇 가능한 후-엔도솜 운송대사 경로가 복합체와 관련이 있을 수 있다. (평론 [Schroeder et al., 2001 "Recent advances in membrane microdomains: rafts, caveolae, and intracellular cholesterol trafficking." Exp Biol. Med (Maywood) Nov;226(10):873-90], [Spooner et al., 2006 "Retrograde transport pathways utilized by viruses and protein toxins" Virol J. 2006; 3: 26] 참조). 변성된 단백질에 대해 제조된 항체는 웨스턴 블롯에 유용할 것이지만, 세포 표면 에피토프에 결합하거나 항원-항체 복합체를 형성할 것으로 기대되지 않으며, 따라서 내재화되지 않을 것이다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 불변 영역과 결합하는 수용체를 의미한다. 또한, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하며, 여기에는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (평론 [Daeron 1997 Annu. Rev. Immunol. 15:203-234] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet 1991 Annu. Rev. Immunol. 9:457-92]; [Capel et al., 1994 Immunomethods 4:25-34]; 및 [de Haas et al., 1995 J. Lab. Clin. Med. 126:330-41]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (문헌 [Guyer et al., 1976 J. Immunol. 117:587] 및 [Kim et al., 1994 J. Immunol. 24:249]).
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 그의 동족 항원과 결합되는 항체 (적절한 서브클래스의 항체)와 결합하는 것에 의해 개시된다 (문헌 [Gazzano-Santoro et al., 1996 J. Immunol. Methods 202:163]).
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 후속해서 표적 세포를 용해시키는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet 1991 Annu. Rev. Immunol. 9:457-92]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, US 5500362 및 US 5821337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 불변 영역 수용체 (FcR)를 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함된다. 이펙터 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치를 둘 모두 지칭하며, 이것의 목적은 표적화된 병리 상태 또는 장애를 방지하거나 늦추는 (감소시키는) 것이다. 치료가 필요한 대상체는 이미 장애를 가진 대상체 뿐만 아니라, 상기 장애에 걸리기 쉬운 대상체 또는 상기 장애를 예방해야 하는 대상체를 포함한다. 대상체 또는 포유동물은 본 발명의 방법에 따라 치료량의 항체, 또는 그의 항체-약물 접합체를 수여받은 후에, 환자가 하나 이상의 다음과 같은 것에 있어서 관찰가능하고/거나 측정가능한 감소를 나타내거나, 또는 하나 이상의 다음과 같은 것이 존재하지 않는 것으로 나타내는 경우에 암이 성공적으로 "치료된" 것이다: 암 세포 수의 감소 또는 암 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 암의 연질 조직 및 골로의 전파를 비롯해서, 주변 장기로의 암 세포의 침윤의 억제 (즉 어느 정도로의 감소 또는 중지); 종양 전이의 억제; 종양 성장의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도로의 완화; 이환율 및 사망률의 감소, 및 삶의 질 개선. 항체, 또는 그의 항체-약물 접합체가 어느 정도로 기존 암 세포의 성장을 방지할 수 있고/있거나 사멸시킬 수 있으면, 그것은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 질환의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 파라미터는 전문의에게 익숙한 통상의 절차에 따라 쉽게 측정할 수 있다. 암 요법의 경우, 효능은 예를 들어 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응률 (RR)을 판단하여 측정할 수 있다. 전이는 병기분류 시험 및 칼슘 수준 및 기타 효소에 대한 뼈 스캔 및 시험 (암이 뼈로 퍼졌는지를 결정하기 위함)으로 측정할 수 있다. 또한, CT 스캔을 사용하여 골반 및 림프절 영역에 퍼져있는지를 알아볼 수도 있다. 흉부 X-선 및 공지된 방법에 의한 간 효소 수준의 측정을 이용하여 폐 및 간 각각에 전이되었는지를 확인한다. 질환을 모니터링하기 위한 다른 통상적인 방법은 경직장 초음파검사법 (TRUS) 및 경직장 침 생검법 (TRNB)을 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물의 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함하고, 악성이든 양성이든 간에 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 결장암, 편평 세포 암 (예를 들어, 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암 ("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포 암, 위암(gastric or stomach cancer), 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 수모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암(kidney or renal cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두경부암 및 또한 흑색종을 포함한다.
폴리펩티드를 "과다발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비암성 세포에 비해, 그의 세포 표면에서 유의하게 더 높은 수준의 폴리펩티드를 갖는 것이다. 이러한 과다발현은 증가된 전사 또는 번역으로 인한 것일 수 있고, 이는 결국 유전자 수준에서의 비정상 또는 변화 (예를 들어, DNA 돌연변이 또는 변경), mRNA 스플라이스 변형, 또는 특정 유전자 전사 인자, 프로모터 또는 인핸서의 활성에 있어서의 변경으로 인한 것일 수 있다. 과다발현은 세포 표면상에 존재하는 수용체 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정에서 (예를 들어 면역조직화학 검정; IHC를 통해) 판단할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 예를 들어 형광 계내 혼성화 (FISH; WO 1998/45479 참조), 서던 블롯팅 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 실시간 정량적 역전사효소 PCR (qRT-PCR)을 통해 세포 내 수용체-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다.
용어 "세포 증식 장애" 및 "증식 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련이 있는 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식 장애는 암이다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암세포의 수를 감소시키고/거나; 종양 크기를 감소시키고/거나; 주변 장기로의 암세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도로 느리게 하거나 정지시키고/거나); 종양 전이를 억제하고/거나; 종양 성장을 어느 정도로 억제하고/거나; 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 완화시킬 수 있다. 약물이 기존 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도라면, 이것은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 용어 "세포증식 억제"는 세포의 기능을 제한하는 효과, 예컨대 세포의 성장 또는 증식을 제한하는 효과를 지칭한다. 예를 들어, 암 요법에서, 효능은 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응률 (RR)을 판단하여 측정할 수 있다.
용어 "표지"는 항체에 공유적으로 부착될 수 있고, 다음과 같은 기능을 하는 임의의 모이어티를 의미한다: (i) 검출 가능한 신호를 제공하거나; (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전이)를 변형시키거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호 작용을 안정화시키거나 또는 결합 친화성을 증가시키거나; (iv) 전하, 소수성, 외형 또는 기타 물리적 파라미터에 의해 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성 또는 세포 투과성에 영향을 미치거나; 또는 (v) 포획 모이어티를 제공하여 리간드 친화성, 항체/항원 결합성, 또는 이온 착화를 조정.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "제약상 허용되는 염"은 ADC의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적 염에는 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트 또는 타르트레이트 염이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 기타 반대 이온의 내포를 포함할 수 있다. 반대이온은 화합물 상의 전하를 안정화시키는 모든 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 추가로, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 여러 개의 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우에는 다수 개의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
"제약상 허용되는 용매화물"은 하나 이상의 용매 분자 및 ADC의 회합체를 지칭한다. 제약상 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 및 에탄올아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 그에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예에는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)®, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)®가 포함된다.
조성물 및 방법
HER4 이소형
선택적 스플라이싱에 의해 단일의 HER4 유전자로부터 4 종의 구조적 및 기능적으로 상이한 이소형이 생성된다 (18, 19). 이소형 중 2 종은 세포내 세포질 도메인이 상이하다 (이소형 CYT-1 및 CYT-2). CYT-1은 세포질 도메인 내에 16개의 아미노산 삽입물을 갖는 반면, CYT-2는 삽입물을 갖지 않는다 (18). CYT-1 이소형은 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3-K)에의 커플링을 매개할 수 있지만, CYT-2 이소형은 그렇지 않다 (20, 21).
다른 두 이소형 (JM-a 및 JM-b)은 세포외 막근접 영역에서의 23 또는 13개의 별법적 아미노산 삽입물에 있어서 차이가 있다 (도 1). JM-a는 막근접 영역 내에 23개의 아미노산을 갖는 이소형이고
Figure 112011048244402-pct00001
, JM-1b는 이 영역 내에 13개의 아미노산을 갖는 이소형이다
Figure 112011048244402-pct00002
.
세포외 이소형 JM-a는 종양 괴사 인자-α-전환 효소 (TACE)에 의해 절단될 수 있는 반면 (22), JM-b 이소형은 프로테이나제-내성이 있다 (23). TACE에 의한 절단은 γ-세크레타제 활성을 수반하는 HER4의 제2 절단을 촉발한다 (24). 그 결과, 세포막으로부터 세포내 도메인 (ICD)이 방출되고, 핵으로 전위되어, 여기서 유전자 전사를 조절하는 기능을 할 수 있다 (25-28).
HER4 이소형이 종양형성에 있어서 그 역할이 상이하다는 가설과 일치하게, 절단가능한 HER4 JM-a CYT-2 이소형은 리간드 비의존적 활성을 나타내고, 암 세포 성장을 촉진하지만, 절단불가능한 대응물 JM-b CYT-2는 그렇지 않다 (26). 또한, 세포내 HER4 에피토프의 핵내 편재는 세포 표면에서의 HER4 편재와 비교할 경우 보다 짧은 생존기간과 관련이 있고 (29), 이는 HER4 절단이 종양 진행을 조절할 수 있음을 시사한다. 이들 동일한 절단가능한 이소형은 앞서 유방암 환자 샘플의 임상 시리즈에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다 (18, 26).
또한, JM-a 및 JM-b 이소형은 상이한 조직 분포 패턴을 나타낼 뿐만 아니라, JM-a 이소형은 심장 조직에서 존재하지 않는다 (23).
이소형 특이적 항체
본 발명의 한 측면은 HER4의 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 JM-a 막근접 영역을 포함하는 무손상 전장 HER4 수용체 뿐만 아니라 가용성 HER4 엑토도메인 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는
Figure 112011048244402-pct00003
을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열
Figure 112011048244402-pct00004
에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 또 다른 측면은 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 단리된 항-HER4 항체를 제공하며, 상기 항체는 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 mAb 1479 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 mAb 1479 모노클로날 항체 유래의 인간화 또는 친화성 성숙 항체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체 mAb 1479로부터의 단편을 포함하는 항-HER4 항체를 제공한다. 상기 항체는 HER4의 JM-a 이소형에 특이적이다. 한 실시양태에서, 상기 단편은 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, mAb 1479로부터의 단편은 초가변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 한 실시양태에서, mAb 1479로부터의 단편은 중쇄 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, mAb 1479로부터의 단편은 경쇄 초가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 mAb 1479의 경쇄 및 중쇄 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 VH1, VH2, 또는 VH3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 적어도 2종의 VH1, VH2, 및 VH3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 모든 3종의 VH1, VH2, 및 VH3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 VL1, VL2, 또는 VL3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 적어도 2종의 VL1, VL2, 및 VL3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 모든 3종의 VL1, VL2, 및 VL3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 적어도 1종, 2종, 또는 3종의 VH1, VH2, 또는 VH3 초가변 영역 및 적어도 1종, 2종, 또는 3종의 VL1, VL2, 및 VL3 초가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 모든 3종의 VH1, VH2, 또는 VH3 초가변 영역 및 모든 3종의 VL1, VL2, 및 VL3 초가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, mAb 1479로부터의 단편은 가변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 한 실시양태에서, mAb 1479로부터의 단편은 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, mAb 1479로부터의 단편은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 mAb 1479의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단편은 JM-a 이소형에 대한 항체의 결합 특이성을 현저하게 감소시키지 않는 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 생성된 항-HER4 항체 mAb 1479와 JM-a 이소형에 대한 결합을 경쟁하는 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체 mAb 1479가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 모노클로날 항체 mAb 1479가 결합하는 에피토프는 HER4 엑토도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체 mAb 1479가 결합하는 에피토프는 아미노산 서열
Figure 112011048244402-pct00005
의 적어도 일부를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체 mAb 1479가 결합하는 에피토프는 아미노산 서열
Figure 112011048244402-pct00006
를 포함한다.
일부 실시양태에서, JM-a 이소형 특이적 항체는 키메라, 인간 또는 인간화 항체이다.
일부 실시양태에서, JM-a 이소형에 특이적인 항-HER4 항체는 HER4 티로신 인산화를 감소시킨다. 수용체 티로신 인산화의 억제는 다른 ErbB 수용체의 세포외 도메인을 표적으로 하는 치료용 항체의 항-종양 활성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (39, 48, 49). HER4 인산화에 대한 항-HER4 항체의 효과는 당업계에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 측정할 수 있고, 그 한 가지 예를 본원의 실시예 1 및 5에 기재한다. 간략하게, HER4를 발현하는 세포를 항-HER4 항체로 처리한 다음, NRG-1로 자극한다. 세포를 용해시키고, 일반적인 항-HER4 항체, 예컨대 HFR-1 (R&D, 미네소타주 미네아폴리스 소재)로 면역침전시키고, SDS-PAGE 겔로 분리하고, 항-포스포티로신 항체, 예컨대 4G10 (업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology), 뉴욕주 레이크 플래시드 소재)을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한다. 블롯을 스캐닝하고, 스캐닝 농도계에 의해 분석하여, 정량적 분석을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서는 대조군을 포함한다. 한 실시양태에서, 대조군은 항-HER4 항체 처리의 부재하에서 NRG-1에 의해 자극되어 HER4를 발현하는 세포 샘플을 포함한다. 세포는 처리된 세포와 마찬가지로 웨스턴 블롯에 의해 분석된다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 HER4 티로신 인산화를 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, JM-a 이소형에 특이적인 항-HER4 항체는 HER4 절단을 감소시킨다. HER4가 절단되면 100 kDa 엑토도메인 단편이 유리된다. 이러한 사건을 또한 엑토도메인 쉐딩이라 지칭한다. HER4 절단에 대한 항-HER4 항체의 효과는 당업계에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 측정할 수 있고, 그 한 가지 예를 본원의 실시예 1 및 5에 기재한다. 간략하게, 항-HER4 항체로 처리한 HER4를 발현하는 세포의 세포 배양 배지에서 엑토도메인의 존재를 측정하여 HER4 절단의 감소를 검출할 수 있다. 절단은 포르볼 13-미리스테이트 12-아세테이트 (PMA)를 검정에 포함시키는 것에 의해 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서는 대조군을 포함한다. 한 실시양태에서, 대조군은 항-HER4 항체를 처리하지 않은 HER4를 발현하는 세포의 세포 배양 배지에서 엑토도메인의 존재를 측정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 HER4 절단을 적어도 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, JM-a 이소형에 특이적인 항-HER4 항체는 내재화된다. 항체의 내재화는 항체-접합된 독소를 HER4 JM-a 이소형을 발현하는 암성 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, JM-a 이소형에 특이적인 항-HER4 항체는 HER4 내재화를 촉진한다. 티로신 수용체 키나제의 내재화는 수용체의 하향조절과 관련이 있다. 한 실시양태에서, 항-HER4 항체는 세포 표면 상의 HER4의 양을 적어도 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 만큼 감소시킨다. HER4 내재화에 대한 항-HER4 항체의 효과는 당업계에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 측정할 수 있고, 그 한 가지 예를 본원의 실시예 1 및 6에 기재한다.
일부 실시양태에서, HER4의 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항-HER4 항체는 HER4 JM-a 이소형에 특이적이지 않은 항-HER4 항체보다 심독성이 낮다. 심독성은 많은 수용체 티로신 키나제 억제 치료제와 관련된 부작용이다 (62, 63). HER4의 JM-a 이소형에 특이적인 항체는 JM-b 이소형을 인식하는 항-HER4 항체에 비해 환자에서 낮은 심독 효과를 생성하는 것으로 예상되는데, 이는 JM-a 이소형이 심장 조직에 존재하지 않기 때문이다 (23). 환자에서의 심독성은 심부전, 좌심실 기능장애 (LVD), 심근 허혈, 고혈압, 정맥 혈전색전증, 서맥, 및 QT 간격 (심장의 전기 주기에서 Q 파의 시작점과 T 파의 끝점 사이의 시간 측정치) 연장을 비롯한 수많은 증상에 의해 증명된다.
화합물의 심독성은, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 진단 모델을 사용하여 측정할 수 있다.
심독성의 시험관내 측정은 심장 세포를 시험 화합물에 노출시키고, 세포 외양 또는 세포 아폽토시스 비율에서 임의의 변화를 관찰하여 행할 수 있다. 세포 외양에 있어서의 관련 변화로는 미토콘드리아 팽윤 및 변성이 포함된다. 세포 아폽토시스는, 예를 들어 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 데옥시우리딘 5-트리포스페이트 틈 말단 표지화에 의해 모니터링할 수 있다. 추가로, 세포에 의한 아폽토시스와 관련된 화학물질 또는 효소의 증가된 분비는 심독성을 암시한다. 그러한 화학물질 또는 효소에는 트로포닌, 나트륨이뇨 펩티드, 예컨대 B-유형의 N-말단 프로펩티드 (프로-BNP), 시토크롬-C 및 카스파제-9가 포함된다. 배양된 세포 모델로서 사용가능한 심장 세포로는 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스 또는 래트로부터 수득한 원시 또는 배양된 성체 또는 신생아 심실 근세포 (심장근육세포)가 포함된다. (62-64).
심독성의 생체내 측정은, 예를 들어 시험 화합물을 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스 또는 래트에 주사하고, 모델의 심장 조직의 구조, 심장 미토콘드리아 외양 및 기능 및/또는 모델의 심장 조직 아폽토시스 비율에 대한 시험 화합물의 효과를 관찰하는 것에 의해 수행할 수 있다 (62). 적출 심장 모델, 또는 랑겐도르프 표본이 또한 화합물의 심독성을 측정하는데 유용하다 (63).
또한, 심독성은 임상적 관찰에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 심부전 및 LVD는 환자 병력 및 신체 검사를 진단 테스트, 예컨대 심전도 (EKG), 흉부 방사선촬영, 및 다중게이트 획득 스캔 (MUGUA)과 조합하여 임상 진단에 의해 측정한다. 심근 허혈은 심근 괴사를 검출하고, EGK에서의 변화를 검출하고, 심장 효소의 증가된 상승을 검출하는 신체 검사에 의해 측정한다. 고혈압은 환자의 혈압을 측정하여 판단한다. 혈압이 140/90 mm Hg 이상인 환자를 일반적으로 고혈압 환자로 간주한다. 정맥 혈전색전증은 압축 초음파, 단층 혈관조영술, 자기 공명 폐혈관조영술, 또는 핵 의학 기술에 의해 검출된다. 서맥은 일반적으로 심박수가 분당 60 비트 미만인 것으로 정의되고, EKG 또는 홀터(Holter) 모니터 분석과 조합하여 심박수를 측정하여 검출한다. QT 간격 연장은 심장의 전기 활성의 이상이고, EKG 분석에 의해 판단할 수 있다. 일반적으로, QT 간격이 440 밀리초 이하이면 정상인 것으로 간주되고, QT 간격이 남성에서 450 밀리초를 초과하고 여성에서 470 밀리초를 초과하면 일반적으로 연장된 것으로 간주한다. (64).
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 통상의 수단, 예컨대 효소 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 상황에서는, 온전한 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 충실성 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 가수분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이러한 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 숙련된 전문인에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 동 제5,587,458호를 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합체를 생성시키도록 구축될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인의 것이다. 인간화는 본질적으로, 윈터(Winter) 및 공동연구자들의 방법 (문헌 [Jones et al., (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536])에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이후, 설치류와 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크로서 수용한다. 예를 들어, 문헌 [Sims et al., (1993) J. Immunol., 151:2296]; [Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196:901]을 참조한다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 여러가지 상이한 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al., (1993) J. Immunol., 151:2623]을 참조한다.
추가로, 항원에 대한 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기재한 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 구축할 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 의해 설명된 바 있다.
면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선(germ-line) 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제시킨다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수도 있고, 이때 인간 항체는 출발 비인간 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"이라고도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원을 기초로 선택한 결과로서, 인간 쇄가 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비인간 쇄의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위를 복원하는 비인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되고, 즉, 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비인간 쇄를 대체하기 위해 상기 과정을 반복하면 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 HER4 JM-a 이소형에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 HER4 JM-a 이소형의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 HER4 JM-a 이소형 발현 세포에 편재시키는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 HER4 JM-a 이소형 결합 아암, 및 예를 들어 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐과 같은 세포독성제에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에는 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2종 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 1차 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 2차 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에도 기재된 바 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 가수분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시킨다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기술한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학 커플링 반응을 실시하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재된 바 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 후에 재산화시켜서 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성에 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 1개 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 한 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
단일-도메인 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조). 한 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 구현된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 원하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발의 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 지칭된다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입물은 길이가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물 및 또한 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로 탄수화물 모이어티를 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 통해 수행될 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 2분지의 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al., (1997) TIBTECH 15:26-32]을 참조한다. 상기 올리고사카라이드는 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 및 또한 2분지형 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정의 개선된 특성을 지닌 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
예를 들어, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 지닌 항체 변이체가 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 지닐 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 US 2003/0157108 (프레스타, 엘.(Presta, L.)); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교 코포레이션, 리미티드.(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개공보의 예에는 다음이 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌 [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]. 푸코스가 제거된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (프레스타, 엘); 및 WO 2004/056312 A1 (아담스(Adams) 등) (특히, 실시예 11)) 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 수반한 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지의 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체에서는 푸코실화가 감소되고/되거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 상기 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (장-마이레트(Jean-Mairet) 등); US 특허 제6,602,684호 (움마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 (움마나 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 (라주, 에스.(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764 (라주, 에스.)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 추가로 개선시켜 주는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 치환은 상기 언급된 모든 변이와 조합해서 일어날 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체 내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 원하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합은 없지만 (따라서, ADCC 활성이 없을 수 있음), FcRn 결합 능력은 유지되는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcRI, FcRII 및 FcRIII을 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 제5,500,362호 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 별법적으로, 비방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동세포계수를 위한 악티(ACTI)™ 비방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 검정을 수행할 수도 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해서 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 결정 역시 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 기타 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발에서의 위한 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만 FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 하기 표 1에 "예시적 치환"으로 명명되거나 아미노산 클래스를 언급하며 아래에 추가로 기재된 보다 실질적인 변화가 제공된다. 아미노산 치환을 관심 항체 내로 도입하고, 생성물을 예를 들어 원하는 활성, 예컨대 개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 개선된 ADCC 또는 CDC 등에 대해 스크리닝할 수 있다.
Figure 112011048244402-pct00007
항체의 생물학적 특성에 있어서의 변형은, (a) 치환 영역에서 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서의 폴리펩티드 주쇄에 영향을 미치거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 수행될 수 있다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
별법적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하여 이루어진다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로 또는 나머지 (비보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 한 유형에는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것이 포함된다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화성 성숙 항체이고, 이는 파지 디스플레이에 기초한 친화성 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성시킬 수 있다. 간략하게 설명하면, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 파지 외피 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부에 대한 융합체로서 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 본원에서 상술된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 하여 본원에 기재된 기술을 포함한, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝하고, 한 가지 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 지닌 변이체를 추가 개발을 위해 선별할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
본원 명세서 및 당업계의 교시 내용에 따르면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 야생형 대응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 영역에 하나 이상의 변경을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고 이러한 항체는 이의 야생형 대응물과 비교하여 치료학적 유용성에 요구되는 실질적으로 동일한 특성을 유지할 것이다. 예를 들어, WO99/51642에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래할 특정 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 생각된다. Fc 영역 변이체의 기타 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 동 제5,624,821호; 및 WO94/29351을 참조한다. WO00/42072 (프레스타) 및 WO 2004/056312 (로우만(Lowman))에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 본원에 참고로 명확하게 포함된다. 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 또한 참조한다. 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 US2005/0014934 A1 (힌톤(Hinton) 등)에 기술되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합성을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551 B1호, WO 99/51642에 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 본원에 참고로 명확하게 포함된다. 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면 내에서의 변형을 포함하는 항체를 제공하며, 이러한 변형은 이종이량체화를 용이하게하고/하거나 촉진시킨다. 이들 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내로의 돌출부 도입 및 제2 Fc 폴리펩티드 내로의 공동의 도입을 포함하고, 여기서 상기 돌출부는 상기 공동 내에 위치하여 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시킬 수 있다. 이러한 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 다음 잔기들 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체의 특정 제조 방법
특정 하이브리도마-기반 방법
본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되고, 예를 들어 문헌 [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)], 및 인간-인간 하이브리도마에 관한 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)]에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가의 방법에는, 예를 들어 하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 천연 IgM 항체의 생성에 관한 미국 특허 제7,189,826호에 기재된 방법이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 [Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
다양한 기타 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들어 US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 제7,078,492호 및 동 제7,153,507호를 참조한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜은 다음과 같이 기술된다. 한 실시양태에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화시킴으로써, 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. HER4 JM-a 이소형, 또는 그의 단편 및 아주반트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (리비 이뮤노켐. 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.) 몬타나주 해밀턴 소재)를 포함하는 폴리펩티드를 피하 (sc) 또는 복강내로 (ip) 다회 주사하여 동물에서 항체를 생성시킨다. HER4 JM-a 이소형 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 그 일부가 본원에서 추가로 기재되는, 재조합 방법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-HER4 JM-a 이소형 항체에 대해 검정하고, 부스터 면역화를 임의로 투여한다. 항-HER4 JM-a 이소형 항체를 생산하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 별법적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다.
이어서, 림프구를 하이브리도마 세포를 형성하는데 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]을 참조한다. 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포주에는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능)로부터 유도된 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배지, 예를 들어 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함 (HAT 배지)할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)]에 기재된 바와 같이, 태아 소 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해서 무-혈청 하이브리도마 세포 배양 방법을 사용한다.
문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에는 하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 도구로서 올리고펩티드가 기재되어 있다. 특히, 표준 배양 배지를 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)이나 단백질 가수분해물 분획으로 풍부하게 하면, 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해서 아폽토시스가 유의하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 더 높은 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지에 대해 HER4 JM-a 이소형에 결합하는 모노클로날 항체의 생산을 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]을 참조한다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Goding, 상기 문헌]을 참조한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하는 하나의 절차가 US 2005/176122 및 미국 특허 제6,919,436호에 기재되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소한의 염, 예컨대 친액성 염의 사용을 포함하고, 바람직하게는 또한 용출 과정에서 소량의 유기 용매의 사용을 포함한다.
특정 라이브러리 스크리닝 방법
본 발명의 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌 [Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리를 사용하는 것을 통한다.
원칙적으로, 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선별된다. 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이같은 파지 라이브러리가 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 그후, 결합 클론이 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가적인 사이클에 의해 추가로 강화될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 관심 파지 클론을 선별하는데 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구축함으로써 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 항원 결합 도메인은 둘 모두 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 제시하는 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역 (경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩)으로부터 형성된다. 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유적으로 연결된 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 VH 및 VL이 불변 도메인에 각각 융합되어 비-공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 가변 도메인이 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용되는 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭한다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되어 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있고, 그 후 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 여기서 항원-결합 클론을 조사할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 별법적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 항원 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브(naive) 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다.
특정 실시양태에서, 소수 코트 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 필라멘트형 파지가 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기술된 바와 같이, 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 사슬 상에서 VH 및 VL 도메인이 연결된 단일쇄 Fv 단편으로서, 또는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기술된 바와 같이, 1개의 사슬은 pIII에 융합되고 다른 1개는 박테리아 숙주 세포 주변세포질로 분비되어, 여기서 일부 야생형 코트 단백질을 치환함으로써 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리가 파지 표면 상에 디스플레이되게 되는 Fab 단편들로서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득하였다. 항-HER4 JM-a 이소형 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요망되는 경우, 대상체를 항체 반응을 생성하도록 HER4 JM-a 이소형으로 면역화시키고, 라이브러리 구축을 위해 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 기타 말초혈 림프구 (PBL)를 회수한다. 바람직한 실시양태에서, 항-HER4 JM-a 이소형 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 HER4 JM-a 이소형 면역화가 HER4 JM-a 이소형에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 생성하도록 기능적 인간 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 갖는 (또한 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결여된) 트랜스제닉 마우스에서 항-HER4 JM-a 이소형 항체 반응을 생성함으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에서 기술된다.
항-HER4 JM-a 이소형 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농축물은, 예를 들어 플루오로크롬-표지된 HER4 JM-a 이소형에 대한 친화성 크로마토그래피 또는 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 HER4 JM-a 이소형-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 절차를 이용하여 얻을 수 있다.
별법적으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용함으로써, 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 예시를 제공하고, 또한 HER4 JM-a 이소형이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축물이 혼입된 라이브러리에 대해, 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 줄기 세포를 수거한다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산이 관심 세포로부터 회수되어, 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리에 이어서 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기술된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머로의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 원하는 DNA가 수득될 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. 문헌 [Orlandi et al., (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기술된 바와 같이, 성숙형 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 역방향 프라이머 및 J-절편을 기초로 하는 정방향 프라이머로, V 유전자가 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머가 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기술된 바와 같이 리더(leader) 엑손을 기초로 할 수 있고, 정방향 프라이머가 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기술된 바와 같이 불변 영역을 기초로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al., (1989)] 또는 [Sastry et al., (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축퇴성을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 설명된 바와 같이 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 설명된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al., (1989)]에 기재된 바와 같이 한 말단에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그가 부착된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되어 있으며 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고되어 있음); 이러한 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태 포함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다. 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기술된 바와 같이 모든 서열 다양성이 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점이 맞춰진 VH 레퍼토리가 또한 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이를 기초로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭에 이어서, 배선 V-유전자 절편이 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 서로 다양한 방식으로 조합하여 구축할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 이. 콜라이 형질전환 효율로 인한 라이브러리 크기의 한계를 극복하기 위해 Fab 절편의 2쇄 속성을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리를 하나는 파지미드에서, 다른 하나는 파지 벡터에서 서로 달리 클로닝한다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합하여 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 개수로만 한정된다 (약 1012 클론). 양 벡터는 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에서 재조합되어 파지 비리온 내에 공동패키징되도록 하는 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이러한 거대 라이브러리는 양호한 친화성 (Kd-1가 약 10-8 M)를 갖는 다양한 항체를 대량으로 제공한다.
별법적으로, 레퍼토리를 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터 내에서 순차적으로 클로닝할 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리한 다음 클로닝할 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성시키는데 PCR 어셈블리가 또한 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합시킨 후, 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하는데 "세포내 PCR 어셈블리"가 사용된다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 친화성이 중등도일 수 있지만 (Kd-1이 약 106 내지 107 M-1), 문헌 [Winter et al., (1994), 상기 문헌]에 기술된 바와 같이 제2 라이브러리의 구축 및 이로부터의 재선별에 의해 시험관 내에서 친화성 성숙이 또한 모방될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 에러 경향이 있는(error-prone) 폴리머라제 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관 내에서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가적으로, 예를 들어 관심 CDR에 스패닝된 무작위 서열을 보유하는 프라이머로의 PCR을 사용하여, 선별된 개별적인 Fv 클론에서 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화성이 더 높은 클론을 스크리닝함으로써 친화성 성숙이 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에 이뮤노글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 또 다른 효과적인 접근법은, 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 여러 회의 쇄 재셔플링으로 보다 높은 친화성에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화성이 약 10-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, HER4 JM-a 이소형은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용하거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현시키거나, 세포 분류에서 사용하거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합하거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용할 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건하에서 고정된 HER4 JM-a 이소형과 접촉시킨다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선별된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법에 유사한 절차로 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 단일 라운드의 선별로 파지가 20 내지 1,000 배 강화될 수 있다. 또한, 강화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가적인 선별 라운드에 적용될 수 있다.
선별 효율은 세정 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지 여부를 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화성)의 항체는 단시간 세정, 다가 파지 디스플레이 및 고체상 내의 항원의 높은 코팅 밀도를 사용함으로써 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 장려한다. 느린 해리 동역학 (및 양호한 결합 친화성)의 항체의 선별은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기술된 바와 같은 1가 파지 디스플레이 및 장시간 세정, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기술된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.
HER4 JM-a 이소형에 대한 상이한 친화성, 심지어 근소하게 상이한 친화성을 갖는 파지 항체 사이에서 선별할 수도 있다. 그러나, 선별된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 일부 친화성 성숙 기술에서 수행된 바와 같음)는 항원에 가장 강하게 결합하고, 몇몇은 보다 고친화성을 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. HER4 JM-a 이소형을 제한하여, 드문 고친화성 파지를 경쟁시킬 수 있다. 보다 고친화성의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오티닐화된 HER4 JM-a 이소형과 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오티닐화된 HER4 JM-a 이소형은 HER4 JM-a 이소형에 대한 표적 몰 친화성 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 그후, 고친화성-결합 파지가 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이같은 "평형 포획"은 친화성이 더 낮은 과량의 파지로부터 친화성이 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 이들의 결합 친화성에 따라 선별되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세정하는데 사용된 조건이 해리 동역학을 기초로 식별하도록 또한 조작될 수 있다.
항-HER4 JM-a 이소형 클론은 활성을 기초로 선별할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본래 HER4 JM-a 이소형을 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 항-HER4 JM-a 이소형 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 HER4 JM-a 이소형과 HER4 리간드, 예컨대 뉴레귤린 사이의 결합을 차단하지만 뉴레귤린과 제2 단백질 사이의 결합을 차단하지 않는 항-HER4 JM-a 이소형 항체를 제공한다. 그러한 항-HER4 JM-a 이소형 항체에 대응하는 Fv 클론은 (1) 상기 설명된 파지 라이브러리로부터 항-HER4 JM-a 이소형 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 HER4 JM-a 이소형 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-HER4 JM-a 이소형 파지 클론을 고정된 HER4 JM-a 이소형에 흡착시키고; (4) 과잉의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정자와 겹치거나 공유하는 HER4 JM-a 이소형-결합 결정자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용출시킴으로써 선택할 수 있다. 임의로, 본원에 기술된 선별 절차를 1회 이상 반복함으로써 원하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론을 추가로 강화시킬 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 원하는 모노클로날 항체의 합성물을 수득하였다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 고찰 논문에는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151 (1992)]이 포함된다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]으로부터 얻을 수 있음)과 조합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소형 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이같은 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 다른 동물종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 기재된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분 길이의 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-HER4 JM-a 이소형 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어 하이브리도마 클론에서 유래된 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열로 치환하는 것에 의해 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형될 수도 있다. 비이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결시켜 하이브리도마 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA를 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
항체는 재조합 방법을 사용하여 생성할 수도 있다. 항-HER4 JM-a 이소형 항체를 재조합 생성하기 위해, 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 발현시킨다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비를 위해서는, 천연 신호 서열을 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로미세스(Saccharomyces) 및 클루이베로미세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현시에는, 포유동물 신호 서열 및 또한 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
복제 기점
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 둘다 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 숙주 염색체 DNA와 상관없이 벡터를 복제할 수 있는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (전형적으로, SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 불리는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실러스(Bacilli)의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 계획에서 생존한다. 이러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 대해 적합한 선별가능한 마커의 또 다른 예는 만족할 만하게 세포의 확인을 가능하게 하는 것들로, 항체-코딩 핵산, 예컨대 DHFR, 글루타민 신테타제 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 포함된다.
예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, DHFR 유전자를 임의의 다른 공동 형질전환된 핵산과 함께 증폭시킨다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예컨대 ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.
별법적으로, GS 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 GS의 억제제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, GS 유전자를 임의의 다른 공동 형질전환시킨 핵산과 함께 증폭시킨다. GS 선별/증폭 시스템을 상기 언급된 DHFR 선별/증폭 시스템과 병용해서 사용할 수 있다.
별법적으로, 관심 항체, 야생형 DHFR 유전자 및 또 다른 선별가능한 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별제, 예컨대 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이후, 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 병변의 존재는 트립토판 없이 성장하는 것으로 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로미세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법적으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 K. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되어 있다. 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로미세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시된 바 있다. 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].
프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25개 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70개 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 존재한다. 모든 이러한 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 글리콜분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련이 있는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 등의 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용가능하여야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 별법적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로 사용할 수 있다.
인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이것의 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터 역시 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 이에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터 내 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 또한 바실러스, 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 예를 들어 치료용 항체를 그 자체만으로도 종양 세포 파괴에 있어서 유효한 세포독성제 (예를 들어 독소)와 접합시킨 경우에 박테리아에서 생성시킬 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 더 길다. 이. 콜라이 내에서의 생성은 보다 신속하고 보다 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 설명하고 있는 U.S. 5,648,237 (칼터(Carter) 등), U.S. 5,789,199 (졸리(Joly) 등), 및 U.S. 5,840,523 (시몬스(Simmons) 등)을 참고한다. 또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후, 항체를 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리시킬 수 있고, 예를 들어 이소형에 따라서 단백질 A 또는 G 칼럼을 통하여 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포 내에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 빵 효모가 가장 흔하게 사용된다. 그러나, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 K. 락티스, K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니게르(A. niger)와 같은 수많은 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하고 유용하다. 치료용 단백질을 생성하기 위하여 효모 및 사상 진균을 사용하는 것에 관한 논의를 고찰하기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]을 참조한다.
글리코실화 경로를 "인간화"시킴으로써, 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 지닌 항체를 생성시키는 특정의 진균 및 효모 균주를 선별할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (피키아 파스토리스에서의 글리코실화 경로의 인간화를 기술함); 및 [Gerngross et al., 상기 문헌]을 참조한다.
글리코실화된 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체 (척추 동물 및 무척추 동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서의 바이러스로서 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 좀개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae)), 알팔파 (M. 트룬카튤라(M. truncatula)), 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 동 제6,040,498호, 동 제6,420,548호, 동 제7,125,978호, 및 동 제6,417,429호 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하는 PLANTIBODIESTM 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 숙주로서 사용할 수 있고, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양 하에 성장하도록 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주에는 DHFR-CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정의 포유동물 숙주 세포주에 관한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268]을 참조한다.
숙주 세포를 상기 기재된 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.
숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
항체의 정제
재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 세포 내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생성될 수도 있고, 또는 배지로 직접 분비될 수도 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질 가수분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 저해하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중의 하나이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절형 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그 소재)가 정제에 유용하다. 회수할 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 칼럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 이용될 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물로 pH 약 2.5 내지 4.5의 용출 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
일반적으로, 조사, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하는 각종 방법론이 당해 분야에 널리 정립되고 있고, 이는 상기 언급된 방법론과 일치하고/하거나 관심있는 특별한 항체에 대해 당업자에게 인지되는 바와 같다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 (구별없이 "항체-약물 접합체", 또는 "ADC"로 지칭됨)를 제공한다.
면역접합체는, 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포의 성장 또는 증식을 사멸 또는 억제하는 약물의 국부 전달을 위해 사용되어 왔다 (문헌 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]; [Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146]; [Payne, G. (2003) i 3:207-212]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 제4,975,278호). 면역접합체는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 내부의 세포내 축적을 허용하고, 여기서 이들 비접합된 약물 물질의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506]). 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두가 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87]). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (문헌 [Rowland et al., (1986) 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al., (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메카니즘에 의해 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이 되거나 활성이 감소되는 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙 티욱세탄, 바이오젠/이덱(Biogen/Idec))은 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소, 및 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 작용하는 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체로 구성된 항체-방사성 동위원소 접합체이다 (문헌 [Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al., (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 제발린은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 활성을 갖지만, 투여는 대부분의 환자에서 중증 및 장기 혈구감소증을 일으킨다. 칼리케아미신에 연결된 huCD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신, 와이어쓰 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의한 급성 골수성 백혈병 치료용으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 제4970198호; 동 제5079233호; 동 제5585089호; 동 제5606040호; 동 제5693762호; 동 제5739116호; 동 제5767285호; 동 제5773001호). 디술피드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.))은 CanAg을 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 및 기타 암의 치료를 위해 II상 시험 중이다. 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노겐, 인크.)는 전립선 종양의 잠재적인 치료를 위해 개발되고 있다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)이 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스(Lewis) Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액 악성종양 상의 CD30에 특이적)에 접합되었고 (문헌 [Doronina et al., (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784]), 치료용으로 개발 중이다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 항체 및 화학치료제 또는 다른 독소를 포함한다. 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 본원에서 설명된다 (예를 들어, 상기와 같음). 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 방사성접합된 항체의 생성을 위한 다양한 방사선핵종이 이용가능하다. 이것의 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.
메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 이후, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 발견되었다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 동 제4,248,870호; 동 제4,256,746호; 동 제4,260,608호; 동 제4,265,814호; 동 제4,294,757호; 동 제4,307,016호; 동 제4,308,268호; 동 제4,308,269호; 동 제4,309,428호; 동 제4,313,946호; 동 제4,315,929호; 동 제4,317,821호; 동 제4,322,348호; 동 제4,331,598호; 동 제4,361,650호; 동 제4,364,866호; 동 제4,424,219호; 동 제4,450,254호; 동 제4,362,663호; 및 동 제4,371,533호에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 또는 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 이들의 치료 용도는 예를 들어 그 개시내용이 본원에 참고로 명백하게 포함되는 미국 특허 제5,208,020호; 동 제5,416,064호; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 상기 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타냈다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 쥐 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 쥐 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포당 3x105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호를 참조한다 (그 개시 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함됨). 항체 분자 당 평균 3-4개로 접합된 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증진시키는 효능을 나타냈지만, 1개의 독소/항체 분자일지라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증진시킬 것이라 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지의 기술에 의해 합성될 수도 있고 천연 공급원으로부터 단리될 수도 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비-특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 개시내용이 본원에 참고로서 명확하게 포함되는 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 제0 425 235 B1호, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)] 및 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시된 것을 비롯하여, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 다수의 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기는 상기 언급된 특허에 개시된 바와 같이 디술피드기, 티오에테르기, 산 불안정성 기, 광 불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다. 추가의 연결기는 본원에 기재되고 예시되어 있다.
항체 및 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 디술피드 연결을 제공하기 위해 특히 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]), 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결부는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 예를 들어 아우리스타틴 (미국 특허 제5635483호; 동 제5780588호)에 접합된 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분할을 방해하고 (문헌 [Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 활성 (US 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 지닌 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 그 개시내용의 전문이 분명하게 본원에 참고로 포함되는 미국 연속 출원 제10/983,340호 (2004년 11월 5일 출원; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands")에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기재의 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합 형성으로 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조할 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 5635483; US 5780588; 문헌 [Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 2004년 11월 5일자로 출원된 미국 연속 출원 제10/983,340호의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" (예를 들어, 링커, 및 링커에 접합된 모노메틸발린 화합물, 예를 들어 MMAE 및 MMAF의 제조 방법을 개시함)을 참고한다.
칼리케아미신
다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 부류의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단부를 생성할 수 있다. 칼리케아미신 부류의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 제5,712,374호, 동 제5,714,586호, 동 제5,739,116호, 동 제5,767,285호, 동 제5,770,701호, 동 제5,770,710호, 동 제5,773,001호, 동 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니(American Cyanamid Company))을 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
다른 세포독성제
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양 작용제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 동 제5,770,710호에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제 부류, 및 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)을 포함한다.
사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위해서, 항체는 높은 방사성의 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 (spin) 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 다른 표지를 공지의 방식으로 접합체 내에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수도 있고, 또는 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수도 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57])을 이용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 [Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광 불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 시판하는 (예를 들어 피어스 바이오테크놀로지, 인크. (미국 일리노이주 록포드 소재)로부터의) 가교결합 시약을 사용하여 제조된 ADC를 명백하게 고려하지만, 이로 제한되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트). 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 467-498 페이지를 참조한다.
항체 약물 접합체의 제조
항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 항체당 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 접합된다. 하기 화학식 I의 ADC는 (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 것을 비롯한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다. ADC를 제조하는 추가의 방법은 본원에 기재되어 있다.
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I
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분에는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")가 포함된다. 부가적인 링커 성분이 당업계에 공지되어 있고, 일부는 본원에서 기재된다. 또한, 2004년 11월 5일 출원된 미국 연속 출원 제10/983,340호의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"를 참조하고, 그 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드에는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)이 포함된다. 예시적인 트리펩티드에는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)이 포함된다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것들 및 또한 소수의 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-회합 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이들의 선택도 측면에서 디자인되고 최적화될 수 있다.
항체상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 당 히드록실기 또는 아미노기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 처리를 통해 항체를 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵기를 형성할 것이다. 리신을 2-이미노티올란 (트라우트 시약)과 반응시켜서 아민을 티올로 전환시킴으로써 추가의 친핵성 기를 항체에 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그보다 많은 수의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편)에 도입될 수 있다.
항체 약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위한 항체의 변형에 의해 생산될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜서 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 염기성 기는 안정적인 연결부를 형성할 수도 있거나, 또는 예를 들어 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정적인 아민 연결부를 형성할 수도 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤)기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (헤르만슨, 바이오컨쥬케이트 테크닉스(Hermanson, Bioconjugate Techniques)). 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 첫번째 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 그러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵기와 반응할 수 있다.
유사하게, 약물 모이어티 상의 친핵기는 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
별법적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 접합체의 2개 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
치료 용도
본원에 기재된 항체는 전암성, 비전이성 및 암성 종양을 비롯한 암 (예를 들어, 초기 병기의 암)을 치료하거나, 암, 예를 들어 유방암이 생길 위험이 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 항체 및 항체 단편은 비악성 질환, 예컨대 자가면역 및 신경계 장애를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
JM-a 이소형에 특이적인 항체는 JM-a 이소형을 발현하는 것을 특징으로 하는 암 또는 다른 장애를 치료하는데 특정 유용성이 발견된다. 한 실시양태에서, JM-a 이소형은 동일한 세포 유형의 비암성 세포 또는 암성 세포에 인접한 비암성 세포에서보다 암 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 일부 실시양태에서, JM-a 이소형은 비암성 세포에서의 발현 수준보다 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％ 초과의 수준으로 발현된다.
JM-a 이소형에 특이적인 항체는 쉐딩된 HER4 엑토도메인 수준이 증가된 것을 특징으로 하는 암 또는 다른 장애를 치료하는데 특정 유용성이 발견된다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 동일한 환자에서 수집한 일련의 조직학적으로 정상인 유방 조직 및 유방암 조직 샘플에서, 가용성 HER4 엑토도메인의 방출이 매칭된 정상 대조군 조직과 비교할 경우 유방암에서 현저하게 증가된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 세포내 HER4 에피토프의 핵 편재는 막성 HER4 발현과 비교할 경우 바람직하지 않은 임상 결과와 관련이 있었고, 이는 향상된 HER4 절단이 불량한 생존과 관련됨을 나타낸다 (29). 한 실시양태에서, 암 세포내에 존재하는 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준은 동일한 세포 유형의 비암성 세포 또는 암성 세포에 인접한 비암성 세포에 비해 더 높다. 일부 실시양태에서, 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준은 비암성 세포에서의 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준보다 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％ 더 높다.
JM-a 이소형을 과다발현하고/하거나 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준이 증가된 암의 특정 예에는 유방암, 난소암, 및 수모세포종이 포함된다 (15) (60). 또한 HER4 돌연변이 수준이 증가된 암도 HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 항체에 의한 치료에 바람직하게 반응할 것으로 예상된다. 그러한 암에는 폐암 및 흑색종이 포함된다 (65) (66).
본 발명의 일부 측면에서, 환자가 JM-a 이소형을 발현하거나 과다발현하는 것을 특징으로 하는 암 또는 다른 장애를 갖는 것으로 판단된 것에 기초하여 JM-a 이소형에 특이적인 항체로 치료할 환자를 선별한다. 이하의 진단 방법 섹션에서 상세하게 논의되는 바와 같이, HER4 JM-a 이소형의 발현은 JM-a 이소형 폴리펩티드의 존재, JM-a 이소형 폴리뉴클레오티드의 존재, 또는 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하는 방법을 비롯한 다수의 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
진단 방법
본 발명의 또 다른 측면은 HER4 JM-a 이소형의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, HER4 JM-a 이소형의 존재는 JM-a 이소형의 발현을 검출하여 측정한다. 한 실시양태에서, HER4 JM-a 이소형의 발현은 JM-a 이소형 폴리펩티드의 존재를 검출하여 측정한다. 한 실시양태에서, HER4 JM-a 이소형의 발현은 JM-a 이소형 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하여 측정한다. 또 다른 실시양태에서, HER4 JM-a 이소형의 발현은 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하여 측정한다.
HER4 JM-a 이소형 폴리펩티드의 발현 및/또는 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하기 위한 다양한 방법을 이용할 수 있고, 그러한 방법에는 예를 들어 면역 조직화학적 분석, 면역침전, 웨스턴 블롯 분석, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 등이 포함된다. 예를 들어, 조직 또는 샘플에서 HER4 JM-a 이소형 폴리펩티드의 발현 및/또는 쉐딩된 HER4 엑토도메인을 검출하는 임의적 방법은 샘플을 HER4 JM-a 이소형에 특이적인 항체, 그의 HER4 JM-a 이소형 결합 단편, 또는 HER4 JM-a 이소형 특이적 항체의 항원 결합 영역을 함유하는 재조합 단백질과 접촉시키고; 이어서 샘플에서 HER4 JM-a 이소형 폴리펩티드 또는 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 결합을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 샘플에서 HER4 JM-a 이소형 폴리펩티드의 발현 또는 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재는 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 나타난 바 있다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.
샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 조직 생검, 혈액, 폐 흡인물, 객담, 림프액 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하나 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 포매된다.
조직 샘플은 통상의 방법으로 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York]; [The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정제를 선택할 수 있음을 알 것이다. 당업자는 또한 고정시키는 시간의 길이는 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 달라질 것임을 알 것이다. 예로서, 중성 완충된 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후에 농도가 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시켜서 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 포매시킨다. 별법적으로, 조직을 절편화하여 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예로서, 조직 샘플을 통상의 방법으로 파라핀에 포매시키고 처리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조직 샘플이 포매되면, 샘플을 마이크로톰 등으로 절편화시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 이러한 절차의 예로서, 절편의 두께는 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있다. 절편화되면, 절편을 여러가지 표준 방법을 통해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예로서, 파라핀 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.
파라핀이 포매재로서 사용된 경우, 조직 절편을 일반적으로 탈파라핀화하고 물에 재수화시킨다. 조직 절편은 통상적인 여러가지 표준 방법을 통해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점차적으로 농도가 감소하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 별법적으로, 시판되는 탈파라핀화 비-유기 작용제, 예를 들어 Hemo-De7 (CMS, 텍사스주 휴스톤 소재)을 사용할 수 있다.
임의로, 샘플 제조 후에, 조직 절편을 IHC를 사용하여 분석할 수 있다. IHC는 추가의 기술, 예컨대 형태적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 조합하여 수행될 수 있다. 2가지 일반적인 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정을 이용할 수 있다. 첫번째 검정에 따르면, 항체의 표적 항원 (예를 들어, HER4 JM-a 이소형)에 대한 결합을 직접 측정한다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서는, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우, 항원이 가시화되도록 발색 또는 형광 기질을 첨가한다. 여러 2차 항체가 1차 항체상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 수많은 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사선동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 이용하여 측정할 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자.
(c) 형광 표지, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 댄실, 리사민(Lissamine), 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌 또는 시판되는 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 물질 중 임의의 하나 이상의 유도체. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중 일부에 대한 개관을 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술로 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 별법적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에 측정 (예를 들어, 화학발광계 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제).
수많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 동 제4,318,980호를 참조한다. 때때로, 표지는 항체에 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 4가지 넓은 카테고리의 표지 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수도 있고, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 별법적으로, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해서, 항체는 작은 합텐과 접합되고, 상기 언급된 표지의 여러 유형 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합이 달성될 수 있다.
앞서 논의된 샘플 제조 절차 외에도, IHC 이전, IHC 동안 또는 IHC 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시트레이트 완충제 중에서 조직 샘플을 가열하는 것과 같은 에피토프 복구 방법을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al., Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편을 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 적합한 조건하에 충분한 기간 동안 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적합한 조건은 통상적인 실험으로 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 임의의 1종을 사용하여 결정한다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예를 들어 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어 HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
이와 같이 제조한 시료를 장착하여 커버 글라스를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 통상 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다. 일례로서, 염색 강도 기준은 다음과 같이 평가될 수 있다.
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별법적 방법에서, 샘플을 항체-항원 복합체 형성에 충분한 조건하에서 HER4 JM-a 이소형 특이적 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 복합체의 존재는 수많은 방법, 예컨대 혈장 및 혈청을 비롯한 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차를 이용하여 검출할 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 제4,016,043호, 동 제4,424,279호 및 동 제4,018,653호를 참조한다. 이들은 비-경쟁 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정, 및 또한 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 모두 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 항원에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.
샌드위치 검정은 가장 유용하고 일반적으로 이용되는 검정 중 하나이다. 샌드위치 검정 기술의 수많은 변형이 존재하고, 모두가 본 발명에 포함된다. 간략하게 설명하면, 전형적인 순방향 검정에서, 미표지 항체를 고체 기판에 고정시키고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 항체-항원 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안, 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 리포터 분자로 표지된 항원에 특이적인 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 다른 복합체의 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척해 내고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수 있거나, 또는 공지된 양의 항원을 함유하는 대조군 샘플과 비교하여 정량화될 수 있다.
순방향 검정에 대한 변형은 동시 검정을 포함하고, 여기서 샘플 및 표지된 항체 둘 모두가 결합된 항체에 동시에 첨가된다. 이들 기술은 쉽게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 순방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 1차 항체는 고체 표면에 공유 또는 수동 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역검정 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척된다. 이후, 시험할 샘플의 분취액을 고체 상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛이 결합할 수 있게 하는 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예컨대 25℃ 내지 32℃ 포함)하에 충분한 기간 동안 (예를 들어, 2분 내지 40분 또는 더 편리하다면 밤새) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 2차 항체는 분자 마커에 대한 2차 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
대안적인 방법은 샘플 중에 표적 항원을 고정시킨 후, 상기 고정된 표적을 리포터 분자로 표지될 수도 있고 표지되지 않을 수도 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 결합된 표적은 항체로 직접 표지함으로써 검출가능할 수 있다. 별법적으로, 1차 항체에 특이적인 2차 표지된 항체를 표적-1차 항체 복합체에 노출시켜 표적-1차 항체-2차 항체 3원 복합체를 형성시킨다. 상기 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 이러한 유형의 검정에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사선동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역검정의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러나, 쉽게 인지될 바와 같이, 당업자가 쉽게 이용가능한 다양한 여러가지 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 생성되는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기한 발색 기질이 아닌 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에, 효소 표지된 항체가 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가되어 결합한 후, 과량의 시약을 세척하여 제거한다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 상기 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성할 것이고, 이는 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시하도록 일반적으로는 분광학적으로 추가로 정량될 수 있다. 별법적으로, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 광을 사용한 조사에 의해 활성화될 때, 형광색소 표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상에서 광을 방출한다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 1차 항체-분자 마커 복합체에 결합하도록 허용된다. 결합되지 않은 시약은 세척하여 제거한 후, 잔여 3차 복합체를 이어서 적절한 파장의 광에 노출시킨다. 관찰된 형광은 관심 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 둘다 당업계에 널리 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예컨대 방사선동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자를 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플에서 HER4 JM-a 이소형 mRNA의 존재 및/또는 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예를 들어 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예를 들어 HER4 JM-a 이소형에 특이적인 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플을 HER4 JM-a 이소형 mRNA에 대해 편리하게 검정할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 검정, 예컨대 정량적 PCR 검정은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법은 (예를 들어, 액틴 패밀리 구성원과 같은 "하우스키핑" 유전자의 비교가능한 대조군 mRNA 서열 수준과 동시에 조사하는 것에 의해) 생물학적 샘플 내에서 HER4 JM-a 이소형 mRNA의 수준을 측정하는 것을 가능하게 하는 하나 이상의 단계를 포함한다. HER4 JM-a 이소형 mRNA의 존재를 측정하는 특정 프로토콜이 문헌 [Junttila, T.T., et al., Clin. Cancer Res. 2003:9:5346-5357 (19)]에 기재되어 있다.
본 발명의 상기 측면의 주요 실시양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 특정 부분의 특이적인 증폭을 허용하는 HER4 JM-a 이소형 프라이머 및 프라이머쌍 및 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 임의의 부분에 선택적으로 또는 특이적으로 혼성화하는 프로브를 포함한다. 프로브는 검출가능한 마커, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다. 그러한 프로브 및 프라이머는 샘플 내의 HER4 JM-a 이소형 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해, 그리고 HER4 JM-a 이소형 폴리펩티드를 발현하는 세포를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 매우 많은 상이한 프라이머 및 프로브를 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 제조할 수 있고, 클론의 증폭 및/또는 HER4 JM-a 이소형 mRNA의 존재 및/또는 수준을 측정하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 임의적 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA, 예컨대 HER4 JM-a 이소형 mRNA를 조사하거나 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용함으로써, 시험 및 대조군 조직 샘플로부터의 시험 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이후, 프로브를 고체 지지체에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 상기 어레이를 이 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있게 배열한다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현될 잠재력을 갖는 유전자의 선택물을 고체 지지체상에 배열할 수 있다. 특정 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는, 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현함을 나타낸다. 질환 조직의 차별적 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술에서는 단일 실험 내에서 수천 개 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 혼성화 기술 및 전산화 기술을 이용한다. (예를 들어, 2001년 10월 11일자로 공개된 WO 01/75166 참조; 어레이 제작의 논의에 대해서는 예를 들어 미국 5,700,637, 미국 특허 5,445,934, 및 미국 특허 5,807,522, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)]; [Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판에서 직접 합성되거나 이것으로 스팟팅되는 유전자 단편을 함유하는 미니어처 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상적으로 단일 어레이로 나타낸다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 하기 단계를 포함한다: 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조, 2) 표지된 표적의 마이크로어레이로의 혼성화, 3) 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4) 스캐닝된 영상의 분석, 및 5) 유전자 발현 프로파일의 생성. 현재, 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로, 25 내지 70 mer) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 　어레이를 형성하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 미리 제작되어 표면에 스팟팅되거나, 또는 표면에서 직접 합성될 수 있다 (계내).
애피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)® 시스템은 유리 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 직접 합성함으로써 제작된 어레이를 포함하는 시판 마이크로어레이 시스템이다.　 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (대체로 25 mer)는 반도체-기재 포토리소그래피 및 고체상 화학적 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 최대 400,000개의 상이한 올리고를 함유하고, 각각의 올리고는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이상의 공지된 위치에서 합성되기 때문에, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 애피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 정체성 및 상대적인 발현 수준의 면으로 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 어레이에서 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 나타난다. 각각의 프로브 쌍은 완전 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 완전 매치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보적인 서열을 갖기 때문에 유전자 발현을 결정한다. 미스매치 프로브는 중심 염기 위치에서의 단일 염기 치환에 의해 완전 매치 프로브과 상이하여 표전 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완전 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 백그라운드 및 비-특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 감하여 각 프로브 세트에 대한 절대 강도 값 또는 특이적 강도 값을 결정한다. 프로브는 진뱅크(Genbank) 및 기타 뉴클레오티드 정보보관소의 최근 정보를 기초로 선택한다. 상기 서열은 유전자의 3' 말단의 독특한 영역을 인식한다고 여겨진다. 진칩 혼성화 오븐(GeneChip Hybridization Oven) ("회전식(rotisserie)" 오븐)을 사용하여 한번에 최대 64개 어레이의 혼성화를 수행한다. 플루이딕스 스테이션(fluidics station)은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완벽하게 자동화되어 있고, 4가지 모듈을 함유하며, 각 모듈에는 하나의 프로브 어레이가 들어간다. 각 모듈은 미리 프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 이용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 공초점 레이저 형광 스캐너이며, 이는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출되는 형광 강도를 측정한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어에 의한 컴퓨터 워크스테이션은 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대해 미리 프로그래밍된 혼성화, 세척 및 염색 프로토콜을 이용하여 최대 8개의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한, 상기 소프트웨어는 혼성화 강도 데이터를 수득하고 이것을 적절한 알고리즘을 이용하여 각 유전자에 대한 존재/부재 신호로 전환한다. 마지막으로, 상기 소프트웨어는 실험들 사이의 비교 분석에 의해 유전자 발현의 변화를 검출하고, 결과를 텍스트 파일 형식으로 구성하며, 이를 사용하여 다른 소프트웨어 프로그램으로 추가의 데이터 분석을 수행할 수 있다.
HER4 JM-a 이소형의 발현은 또한 유전자 결실 또는 유전자 증폭을 조사하여 평가할 수 있다. 유전자 결실 또는 증폭은 당업계에 공지된 매우 다양한 프로토콜의 임의의 하나, 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하는 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 혼성화 (예를 들어, FISH), 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 세포유전학 방법 또는 비교 게놈 혼성화 (CGH)에 의해 측정할 수 있다. 예로서, 이들 방법은 HER4 JM-a 이소형 유전자의 결실 또는 증폭을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
조직 또는 세포 샘플내에서 HER4 JM-a 이소형의 발현은 또한 기능 또는 활성 기반 검정에 의해 조사될 수 있다. 예를 들어, HER4 JM-a 이소형의 발현은 HER4 JM-a 이소형을 발현하는 것으로 의심되는 조직 또는 세포 샘플에 대한 종양 괴사 인자-알파-전환 효소 (TACE)의 처리 효과를 측정하여 검출할 수 있다.
제약 제제
본 발명의 치료적 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 전형적으로, 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 단위 투여량의 멸균 주사 형태로, 비경구 투여용, 즉 볼루스, 정맥내, 종양내 주사용으로 제조한다. 목적하는 순도를 가진 항체-약물 접합체 (ADC)를 임의로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 (문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st edition (2005) ed. Univ. of the Sciences Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins]), 동결건조된 제제 또는 수용액제 형태로 제조한다.
허용되는 희석제, 담체, 부형제 및 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
활성 제약 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st edition (2005) ed. Univ. of the Sciences Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 ADC를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 3773919), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 분해가능하지 않은 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해가능한 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
제제는 상기 투여 경로에 적합한 것을 포함한다. 제제는 단위 투여량 형태로 편리하게 존재할 수 있고, 제약 업계에서 널리 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제제는 일반적으로 문헌 [Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form. 1st edition (August 1, 2001) Ed Mark Gibson, US Informa Healthcare, Marcel Dekker, CRC Press (ISBN-10 1574911201)]; [Handbook of Pharmaceutical Excipients 5th edition (December 14, 2005) Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, and Sian C. Owen APhA Publications (ISBN-10: 1582120587)]에서 확인된다.
이러한 방법은 활성 성분을 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 이들 둘다와 균일하고 치밀하게 회합시킨 후에 필요한 경우에는 생성물을 성형하여 제조된다.
본 발명의 수성 현탁액제는 활성 물질을 수성 현탁액제의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 크로스카르멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 자연 발생 포스파티드 (예를 들어 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물 유래의 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 수성 현탁액제는 또한 1종 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시-벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향미제, 및 1종 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 멸균성 주사용 제제, 예를 들어 멸균성 주사용 수성 또는 유성 현탁제의 형태일 수 있다. 상기 현탁액은 상기 언급한 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 바에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제 역시 비독성의 비경구 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액제 또는 현탁액제, 예를 들어 1,3-부탄-디올 중의 용액제일 수도 있고, 또는 동결건조된 분말로서 제조될 수도 있다. 특히, 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로서 멸균 고정유가 통상적으로 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 배합 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산을 주사가능한 제제에 마찬가지로 사용할 수 있다.
담체 물질과 배합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위해 의도된 수용액은 용액 1 mL 당 활성 성분 약 3 내지 500 ㎍을 함유하여, 약 30 mL/시간의 속도의 적합한 부피로 주입될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제가 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액제; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액제를 포함한다.
단백질 치료제를 경구 투여하는 것이 소화관에서의 가수분해 또는 변성로 인해 선호되지 않긴 하지만, 경구 투여용으로 적합한 제제는 별개의 단위, 예를 들어 예정량의 항체를 각각 함유하는 캡슐, 카쉐 또는 정제로서 제조할 수 있다.
제제는 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 포장될 수 있고, 사용 직전에 주사를 위한 멸균 액체 담체, 예를 들어 물을 첨가할 것만이 요구되는 냉동-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉시투여용 주사 용액제 및 현탁액제는 앞서 기재한 종류의 멸균 산제, 과립제 및 정제로부터 제조된다. 단위 투여량 제제는 활성 성분을 본원에서 상기 언급한 바와 같은 1일 용량 또는 단위 1일 분할 용량 또는 그의 적절한 분획으로 함유하는 것이다.
본 발명의 조성물은 면역리포솜으로서 제제화할 수도 있다. "리포솜"은 약물을 포유동물에게 전달하는 데에 유용한, 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포 (vesicle)이다. 통상적으로, 리포좀의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688]; [Hwang et al., 1980 Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030]; US 4485045; US 4544545; US 5013556; WO 1997/38731에 기재된 방법에 의해 제조된다. 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜은 한정된 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 수득하였다. 본 발명의 조성물의 Fab' 단편을 디술피드 쇄간 반응을 통하여 리포솜에 접합시킬 수 있다 (문헌 [Martin et al., 1982 J. Biol. Chem. 257:286-288]). 화학요법제가 리포솜 내에 임의로 함유된다 (문헌 [Gabizon et al., 1989 J. National Cancer Inst. 81(19):1484.]).
본 발명의 항체는 우수 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개개의 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문인에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로, 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합으로 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 따라 결정될 것이다. 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 처치 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보이다. 전형적인 1일 투여량 중 하나는 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 높은 값의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 처치는 일반적으로 상태에 따라서 질환 증상이 원하는 수준으로 억제될 때까지 지속된다. 항체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3 주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 보다 높은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투약법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량으로 투여한 후에 약 2 mg/kg씩의 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 치료 방법은 항체 대신 또는 항체에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
조합 요법
본 발명의 항체는 항암 특성을 갖는 제2 화합물과 제약 조합 제제 내에 또는 조합 요법으로서의 투약법으로 조합될 수 있다. 제약 조합 제제 또는 투약법의 제2 화합물은 조합물의 항체와 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가질 수 있다.
제2 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제, 및/또는 심장보호제일 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다. 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물은 또한 치료 유효량의 화학요법제, 예컨대 튜불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제, DNA 삽입제 또는 DNA 결합제를 함유할 수 있다.
기타 치료 요법을 본 발명에 따라서 확인된 항암제의 투여와 병용할 수 있다. 조합 요법은 동시 또는 순차적 방식으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합물은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 공동 투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때 둘 모두 (또는 모든) 활성 작용제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.
그러한 조합 요법의 예는 화학요법제, 예컨대 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)®, 제넨테크/OSI 팜.(OSI Pharm.)), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®, 밀레니엄 팜.(Millenium Pharm.)), 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카(AstraZeneca)), 수텐트 (SU11248, 화이자(Pfizer)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®, 노파르티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)®, 노파르티스), PTK787/ZK 222584 (노파르티스), 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®, 사노피(Sanofi)), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어쓰(Wyeth)), 라파티닙 (타이커르브(TYKERB)®, GSK572016, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 로나파르닙 (SCH 66336), 소라페닙 (BAY43-9006, 바이엘 랩스(Bayer Labs)), 및 게피티닙 (이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카), AG1478, AG1571 (SU 5271; 수젠(Sugen)), 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제, 칼리케아미신, 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1; 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 또한 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (예를 들어, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오리건주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스톤 소재), 크레모포르-무함유 아브락산(ABRAXANE)™, 알부민, 파클리탁셀의 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너즈(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샤움버그 소재) 및 탁소테레(TAXOTERE)® 독세탁셀 (론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; 겜자르(GEMZAR)® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체와의 조합물을 포함한다.
이러한 조합 요법은 또한 (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜을 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON) 토레미펜; (ii) 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; (iii) 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 또한 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 아로마타제 억제제; (v) 단백질 키나제 억제제, 예컨대 EGFR 경로 (EGFR, HER2, HER3, 및 HER4) 억제제; (vi) 지질 키나제 억제제; (vii) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식과 관련이 있는 신호전달 경로에서의 유전자 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; (viii) 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; (ix) 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; (x) 항-혈관신생제, 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®, 제넨테크), 및 (xi) 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투여 스케줄은 제조사의 지침에 따라 또는 숙련된 전문인에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 이러한 화학 요법을 위한 제제 및 투여 스케줄은 또한 문헌 [Chemotherapy Service, (1992) Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, Md]에 기재되어 있다.
조합 요법은 "상승작용 효과"를 제공할 수 있고, "상승작용 효과를 갖는다"는 것이 입증될 수 있고, 즉 활성 성분들이 함께 사용되는 경우에 달성되는 효과가 이러한 화합물을 별개로 사용할 때 달성되는 효과의 합보다 더 우수하다. 상승작용 효과는 (1) 활성 성분들이 동시 제제화되어 투여되거나 조합된 단위 투여 제제 중에서 동시에 전달되는 경우; (2) 활성 성분들이 별개의 제제로서 교대로 전달되거나 동시에 전달되는 경우; 또는 (3) 활성 성분들이 일부 다른 투약법으로 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우의 상승작용 효과는 화합물들이 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우, 예를 들어 별개의 시린지에서 상이한 주사로 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는 유효 투여량의 각 활성 성분이 순차적으로, 즉 연속적으로 투여되지만, 조합 요법에서는 유효 투여량의 2종 이상의 활성 성분들이 함께 투여된다.
제조품
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품 또는 "키트"가 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 포장 삽입물은 치료 제품의 상업적 포장 내에 통상적으로 포함되는 지시 사항을 언급할 수 있고, 이러한 치료 제품의 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기 사항 및/또는 사용과 관련된 경고에 관한 정보를 함유할 수 있다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 블리스터 팩 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다.
한 실시양태에서, 제조품은 용기와, 이러한 용기 내에 함유된 항-HER4 항체 또는 그의 항체 약물 접합체의 제제를 포함한다. 임의로, 상기 제조품은 종양의 치유적 치료 또는 진단적 검출에 있어서의 당해 조성물의 용도를 기재한, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 용기 내에 포함된 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 제제를 보유하고 있는 용기는 치료제를 저장 및 전달하는 데에 효과적이고, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액제 백 또는 바이알일 수 있음). 상기 표지 또는 포장 삽입물은 제제가 선택된 병태, 예를 들어 암을 치료하는 데 사용된다는 것을 표시한다. 별법적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
물질의 기탁
하기하는 물질을 미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 유니버시티 블러버드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁하였다:
물질 ATCC 기탁 번호 기탁일
Her-4 1H10.1E5 PTA-9655 2008년 12월 11일
이러한 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이의 규정 (부다페스트 조약)의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 규정하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 이는 제넨테크, 인크.와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여시에 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공개시에 (두 시점 중에서 빠른 시점에) 기탁 배양물의 자손체에 대한 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 USC '122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (특히, 886 OG 638에 대한 37 CFR 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 인정된 자에 대한 자손체의 이용가능성을 보장한다.
본원의 양수인은 기탁 중의 물질의 배양물이 적합한 조건하에 배양될 때 사멸 또는 상실 또는 파괴될 경우에, 그 물질을 통지시에 동일한 것으로 신속하게 교체할 것에 동의하였다. 기탁물의 이용가능성은 해당국 특허법에 따라 임의의 정부 당국에서 승인된 권리를 위배하여 본 발명을 실시할 권리로서 해석되지 않아야 한다.
전술된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는데 충분하다고 고려된다. 본 발명은 기탁된 구조물로써 그 범위가 제한되지 않는데, 이는 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면을 단지 예시하기 위한 것이고, 기능상 등가인 임의의 구축물이 본 발명의 범위 내에 있기 때문이다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기록된 명세서가 그의 최선의 방식을 포함하는 본 발명의 임의의 측면의 실시를 가능하게 하기에 부적당하다고 인정하는 것이 아니고, 또한 그가 나타내는 특정 예시로 특허청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형은 전술된 기재로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 특허청구범위 내에 속할 것이다.
본 발명의 교시를 특이적 문제나 상황에 적용하는 것은 본원에 함유된 교시 측면에서 당업자의 능력 내에 있다는 것을 인지해야 한다. 본 발명의 생성물 및 그의 단리, 사용 및 제조에 대한 대표적인 공정의 예를 이하에 나타내지만, 이것이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌은 그 전문이 본원에 명백하게 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1 - 물질 및 방법
항-HER4 항체.
HER4 DNA 서열에 기초하여 특정 올리고뉴클레오티드를 합성하였다 (30). 전체 세포성 RNA를 MDA-MB-453 세포로부터 추출하고, RT PCR에서 주형으로 사용하여, 인간 HER4 세포외 도메인 (ECD) 코딩 서열을 생성하였다.
단순 포진 바이러스 제1형 당단백질 D의 아미노산 1-52 코딩 서열을 인간 HER4의 아미노산 26-640 코딩 서열에 라이게이션하여 gDHER4 ECD 융합 단백질을 구축하였다. (61) gDHER4 ECD cDNA를 시토메갈로바이러스 기반 발현 벡터 pRK5에 삽입하였다. 표준 인산칼슘 침전 프로토콜을 사용하여 이러한 구축물로 인간 배아 신장 293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다.
항-gD 모노클로날 5B6을 CNBR 세파로스 (파마시아 LKB 바이오테크놀로지, 스웨덴 웁살라 소재)에 커플링시켜 친화성 칼럼을 제조하였다. gDHER4 ECD 형질감염된 293 세포로부터의 상청액을 ym30 막 (아미콘(Amicon), 메사추세츠주 비벌리 소재) 상에서 20-40배 농축시키고, 친화성 수지 상에 로딩하였다. 칼럼을 PBS로 세척하고, 수용체를 100 mM 아세트산/500 mM NaCl pH 2.4로 용출시켰다. HER4 ECD를 PBS로 완충제 교환하고 농축시켰다. 단백질 농도는 OD280으로 판단하였다.
RIBI MPL + TDM + CWS 에멀젼 (RIBI 이뮤노켐 리서치 인크.(RIBI ImmunoChem Research Inc.), 몬타나주 해밀턴 소재) 중의 대략 5 ug의 HER4 ECD를 사용하여 제 0 주, 제 1 주, 제 2 주 및 제 3 주에 Balb/c 마우스를 그의 뒷 발바닥으로 면역화시켰다. 면역화된 마우스에 대해 ELISA를 이용하여 항체 반응을 시험하였다. 최고 역가를 갖는 마우스에 제 4 주 동안 RIBI 중의 추가의 5 ug의 HER4 ECD를 주입하였다. 3 일 후에, 문헌 [Oi and Herzenberg, 1980]의 절차에 의해 50％ 폴리에틸렌 글리콜 4000 (베링거 만하임 코포레이션(Boehringer Mannheim Corporation), 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 이용하여 슬와 및 서혜 림프절부터의 림프구를 마우스 골수종 세포주 X63-Ag8.653과 융합시켰다. 융합된 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 200,000개의 세포 밀도로 플레이팅하고, 융합 이후 제 1 일에 HAT 배지 보충물 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스 소재)을 이용하여 하이브리도마 선별을 개시하였다. 제 10 일에 방사성 포획 검정을 이용하여 하이브리도마 상청액에 대한 HER4 특이적 항체의 존재의 스크리닝에 착수하였다. 희석을 제한하여 안정하게 항체를 생산하는 클론을 수득하고, 복수에서 대량의 특정 mAb를 생산하였다. 단백질 A-세파로스 칼럼 (페르멘테크 인크.(Fermentech, Inc.), 스코틀랜드 에든버러 소재) 상에서 항체를 정제하고, 4℃에서 PBS 중에 멸균 저장하였다.
조직.
정상 인간 심장 및 신장의 동결 절편을 감전으로 사망시킨 4 년령의 수컷으로부터 수득하였다. 동일한 환자로부터의 인간 유방암 및 조직학적으로 정상인 주변 조직을 대표하는 17개의 순간 동결 조직 샘플 쌍은 스페인 마드리드에 소재하는 스페인 국립 암 센터 스페인 국립 종양 은행 네트워크 (CNIO)의 마놀로 M. 모렌테 박사(Dr. Manolo M. Morente)가 제공하였다. 모든 조직 샘플의 사용은 연구소 심사 위원회의 승인을 받았고, 모든 연구 대상체로부터 사전 승인을 받았다.
세포 배양.
EGFR, HER2 또는 HER3을 발현하는 COS-7, NIH 3T3-7d 형질감염체 (31) 및 HEK293 EBNA (인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드 소재) 세포를 DMEM 중에 유지시키고, T-47D 및 MCF-7 세포는 10％ FCS (오토겐 바이오클리어 UK 리미티드(Autogen Bioclear UK Ltd), 영국 윌트셔 소재) 및 1％ L-글루타민-페니실린-스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치)이 보충된 RPMI 중에 유지시켰다.
플라스미드 구축물.
발현 플라스미드 pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2, pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2, pcDNA3.1IHER4JM-aCYT-2-HA 및 pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2-HA (26, 32)를 사용하여 COS-7 세포에서 카르복시말단 헤마글루티닌 (HA) 에피토프 태그를 갖거나 갖지 않는 HER4 이소형을 일시적으로 발현시켰다. 키나제 불활성 HER4 구축물을 생성하기 위해, 부위 지정 돌연변이유발 키트 (스트라타겐(Stratagene))를 사용하여 pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2에서 HER4의 키나제 도메인 내의 추정 ATP 결합 부위를 돌연변이시켜 (K751R) pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2-K751R을 생성하였다. pcDNA3.1HER4ECD를 생성하기 위해,
Figure 112011048244402-pct00010
를 사용한 PCR에 의해 전장 pcDNA3.1HER4JM-aCYT-1로부터 HER4 엑토도메인 코딩 서열이 유래되게 하였다 (26). 5'-프라이머는 HER4 서열의 개시 코돈 앞에 Kpn I 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 및 리보솜 결합 서열을 도입하였다. 3'-프라이머는 HER4 JM-a의 마지막 세포외 아미노산 His647 다음에 헥사히스티딘 코딩 서열, 새로운 종결 코돈 및 Xho I 엔도뉴클레아제 인식 서열을 도입하였다 (23).
형질감염.
24 웰 플레이트 (4 x 104) 또는 6 웰 플레이트 (1.5 x 105) 상에 플레이팅한 세포를 퓨진(FuGENE) 6 형질감염 시약 (로슈(Roche), 독일 만하임 소재)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 0.5 - 1 ug의 적절한 플라스미드로 형질감염시켰다.
HER4의 재조합 세포외 도메인의 생산.
pcDNA3.1HER4ECD에 의해 형질감염된 HEK293 EBNA 세포를 150 ug/ml 히그로마이신 B (로슈)를 함유하는 배지 중에서 선별하고, 클로닝 후 75 ug/ml의 히그로마이신 B의 존재하에 유지시켰다. 배지로부터 가용성 엑토도메인을 회수하기 전에, 세포를 0.5％ FCS를 함유하는 DMEM 중에서 배양하였다. HIS-태그가 부착된 엑토도메인을 수집된 배양 배지로부터 고정된 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (GE 헬스케어(GE Healthcare), 영국 챌폰트 세인트 자일스 소재)에 의해 단계식 pH 구배로 정제하였다.
면역침전 및 웨스턴 블롯 분석.
모노클로날 항-HER4 항체의 이소형 특이성을 연구하기 위해, pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2, pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2, 또는 pcDNA3.1 벡터로 COS-7 세포를 일시적 형질감염시켰다. 24 시간 후에, 세포를 빙냉 PBS로 세척하고, 용해 완충제 (1％ 트리톤 X-100, 10 mM 트리스-HCL (pH 7.4), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 10 ug/ml 아프로티닌, 10 ug/ml 류펩틴, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 10 mM 나트륨 플루오라이드, 및 10 mM 인산나트륨) 중에서 용해시키고, 원심분리하였다. 상청액을 비등시키거나 또는 비등시키지 않고 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하거나 함유하지 않는 샘플 완충제 중에 95℃에서 5 분간 두고, 앞서 기재된 바와 같이 (21) SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. NIH 3T3-7d 형질감염체에서의 ErbB 발현을 다음과 같은 1차 항체를 이용하여 비환원 조건하에서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다: 항-EGFR (sc-03), 항-HER2 (sc-284), 항-HER3 (sc-285) (모두 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) 사의 것), 및 mAb 1479.
유방 조직에서 HER4 단백질의 웨스턴 분석을 위해, 80 um의 동결된 조직 블록 절편을 자르고, 균질화하고, 진탕기 내의 용해 완충제 중에서 밤새 4℃에서 용해시켰다. 50 ug의 총 단백질에 해당하는 용해물의 분취액을 비환원 조건하에서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
HER4 인산화에 대한 mAb 1479의 효과를 연구하기 위해, MCF-7 및 T-47D 세포를 혈청 무함유 RPMI 중에서 밤새 영양분을 공급하지 않은채 두었고, 1 ug/ml의 mAb 1479로 1 시간 동안 처리하거나 처리하지 않은 다음 50 ng/ml 뉴레귤린-1 (NRG-1; R&D, 미네소타주 미네아폴리스 소재)으로 30 분 동안 자극하였다. 1 mg의 총 단백질에 해당하는 세포 용해물을 항-HER4 항체 (HFR-1)로 면역침전시키고, SDS-PAGE 겔에서 분리하고, 및 항-포스포티로신 항체 (4G10; 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology), 뉴욕주 레이트 플라시드 소재)를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
HER4 유비퀴틸화를 연구하기 위해, COS-7 세포를 전장 JM-a CYT-1 또는 JM-a CYT-2를 코딩하는 플라스미드로 플래그 태그가 부착된 유비퀴틴과 함께 일시적으로 형질감염시키고 (문헌 [Katz et al., 2002]), 앞서 기술된 바와 같이 (32) HER4 면역침전에 이어 항-플래그 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 세포를 2 ug/ml mAb 1479로 1 시간 동안 처리하거나 처리하지 않은 다음 분석하였다.
면역형광 염색.
COS-7 세포를 커버슬립 상에서 성장시키고, pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2-HA, pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2-HA, 또는 pcDNA3.1 벡터 대조군으로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에 세포를 메탄올로 고정시키고, 항-HER4 (HFR-1; 네오마커스(Neomarkers), 캘리포니아주 프레몬트 소재) 또는 항-HA (로슈)의 1:100 희석물로 염색한 후, 알렉사 플루오르 488 염소 항-마우스 또는 알렉사 플루오르 568 염소 항-래트 (둘 모두 네덜란드 레이던 소재의 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) 사의 것임)의 1:250 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 커버슬립을 벡타쉴드 마운팅 배지 (벡터 래보러토리즈, 인크.(Vector Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 버링검 소재)와 함께 장착하였다. 모든 이미지는 올림푸스 BX60 (올림푸스(Olympus), 독일 함부르크 소재) 형광 현미경으로 수득하였다.
면역조직화학.
20 ug/ml의 1차 항체 mAb 1479, 항-HER4 (HFR-1), 항-CD44 (헤르메스-3; 핀란드 투르쿠 소재의 투르쿠 대학의 시르파 잘카넨 박사(Dr. Sirpa Jalkanen)가 제공함), 또는 닭 T-세포 항원을 인식하는 항체 (3g6; 시르파 잘카넨 박사가 제공함), 및 2차 항체 알렉사 플루오르 488 염소 항-마우스 (1:200) 또는 HRP-접합된 염소 항-마우스 (1:100; 산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 이용하여 동결 절편 (5 uM)을 염색하였다. 퍼옥시다제 염색을 위해 절편을 제조사의 지침에 따라 DAB 퍼옥시다제 기질 (벡터 래버러터리즈(Vector Laboratories))로 처리한 후, 헤마톡실린으로 염색하였다. 면역형광 염색을 위해, 절편을 25 mg/ml의 1,4-디아자비시클로[2.2.2.]옥탄 (시그마-알드리치)으로 처리하여 광퇴색을 방지하였다. 모든 슬라이드를 모위올(mowiol) (칼바이오켐(Calbiochem))과 함께 장착하고, 올림푸스 BX60 형광 현미경으로 시각화하였다.
시험관내 결합 검정.
재조합 HIS-태그가 부착된 HER4 엑토도메인 (2 ug)을 0.5 ug mAb 1479 또는 3g6과 함께 또는 이들 없이 인큐베이션하였다. 엑토도메인 및 다른 단백질 사이의 복합체 형성을 비환원 조건하에서 항-펜타 HIS 항체 (몰레큘라 프로브스)를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 시각화하였다.
HER4 절단의 분석.
HER4 절단에 대한 mAb 1479의 효과를 연구하기 위해, T-47D 세포를 혈청없이 2 시간 동안 영양분을 공급하지 않은채 두었고, 1 ug/ml mAb 1479로 1 시간 동안 처리한 후 100 ng/ml 포르볼 13-미리스테이트 12-아세테이트 (PMA; 시그마-알드리치)로 절단을 자극하였다 (23, 33).
HER4 엑토도메인의 배양 배지로의 기초 쉐딩에 대한 mAb 1479의 효과를 연구하기 위해, HER4 JM-a CYT-2를 일시적으로 발현하는 COS-7을 1 ug/ml mAb 1479 또는 1475로 24 시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 세포 배양 접시에서 직접 수집한 60 ul의 배지 샘플로부터 항-HER4 항체 mAb 1464에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 엑토도메인 쉐딩을 분석하였다.
HER4 내재화.
COS-7 세포를 커버슬립 상에서 성장시키고, pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2 또는 키나제 불활성 pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2K751R (32) 및 Rab5a-GFP (34)로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에, 1 ug/ml의 mAb 1479로 세포를 5 분 또는 2 시간 동안 처리하였다. 세포를 메탄올로 고정하고, 알렉사 플루오르 568 염소 항-마우스로 염색하였다. 커버슬립을 벡타쉴드 마운팅 배지와 함께 장착하였다. 이미지는 LSM 510 메타 공초점 현미경 (칼 제이스, 인크.(Carl Zeiss, Inc.), 뉴욕주 손우드 소재)으로 수득하였다.
MTS 증식 검정.
T-47D 및 MCF-7 세포를 밤새 영양분을 공급하지 않은채 두고, 5％ 차콜-배제 FCS 및 1 ug/ml mAb 1479 또는 10 ug/ml 2C4 (제넨테크 인크., 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)를 함유하는 RPMI 중의 96 웰 플레이트 상에 플레이팅하였다 (1.5 x 104/웰). 생존 세포의 개수는 셀타이터(CellTiter) 96® 비방사성 세포 증식 검정 (프로메가, 위스콘신주 매디슨 소재)을 제조사의 지침에 따라 이용하여 표시한 시점에 추정하였다
부착 비의존적 성장 검정.
2 ml RPMI, 0.5％ 박토 한천, 및 10％ FCS로 이루어진 바닥층을 6 웰 플레이트에 도포하였다. 바닥층을 응고시킨 후, 1 ug/ml mAb 1479를 함유하거나 함유하지 않는 1.2 ml RPMI, 0.33％ 박토 한천, 및 10％ FCS 중의 30,000 세포/웰로 이루어진 상층을 상부에 도포하였다. 모든 샘플은 3중으로 제조하였다. 세포를 14 일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 8 세포 보다 큰 콜로니를 현미경하에 계수하였다.
통계적 분석.
상이한 시점에서의 MTS 및 연질 한천 검정의 통계적 분석을 위해 스튜던트의 t 검정을 사용하였다. 분석은 5가지의 독립적 MTS 및 3가지의 독립적 연질 한천 실험을 포함하였다. 종양 대 정상 조직에서의 전장 HER4 및 HER4 엑토도메인의 양은 매칭시킨 종양/정상 조직 쌍을 이용하여 윌콕슨 부호 순위 검정에 의해 비교하였다.
실시예 2 - mAb 1479는 HER4의 단백질 가수분해적으로 절단가능한 JM-a 이소형을 선택적으로 인식한다.
HER4의 엑토도메인에 대한 항체를 분비하는 29개의 하이브리도마 클론에 대해 HER4 이소형의 선택적 인식을 스크리닝하였다 (도 2). 지메드 (지메드(Zymed), 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재) 사의 마우스 모노Ab ID/SP 이형판별 키트를 제조사의 지침에 따라 사용하여 모노클로날 항체의 이형판별을 행하였다. 교차 차단 ELISA에 의해 에피토프 맵핑을 수행하였다. 관련없는 mAb 대조군과 비교하여 다른 것의 결합을 50％ 이상 차단하는 HER4 mAb의 능력에 기초하여 이를 에피토프에 대해 그룹화하였다. HER4 mAb의 특이성은 ELISA에서 비오티닐화된 HER4 mAb가 ELISA 플레이트 상에 1 ㎍/ml의 농도로 코팅된 HER2 (aa 1-645), HER3 (aa 1-617) 및 HER4 (aa 1-640 ) 세포외 도메인 (제넨테크, 인크.)에 결합하는 능력을 시험하여 판단하였다.
별법적 세포외 막근접 도메인 (JM-a CYT-2 또는 JM-b CYT-2)과 함께 HER4 이소형을 일시적으로 발현하는 COS-7 세포를 분석하였다. 상이한 단백질 변성 정도를 대표하는 3가지 조건하에서 웨스턴 분석을 실행하였다 (도 3). SDS-PAGE 이전에, 도 3의 레인 1-3의 샘플은 DTT를 함유하지 않는 샘플 완충제 중에서 실온에서 용해시켰고 (비환원); 레인 4-6의 샘플은 DTT를 함유하지 않는 샘플 완충제에 용해시키되 95℃에서 5 분 동안 가열하였고 (비환원, 95℃); 레인 7-9의 샘플은 DTT를 함유하는 샘플 완충제에 용해시켰을 뿐만 아니라 95℃에서 5 분 동안 가열하였다 (환원). HER4의 카르복시 말단 (sc-283 및 HFR-1) 또는 HA-태그 (항-HA)에 대한 항체를 사용하여 형질감염 효율을 조절하였다.
항체 중 하나, mAb 1479는 웨스턴 블롯팅에서 1차 항체로 사용한 경우 JM-a 이소형은 인식하였지만, JM-b 이소형은 인식하지 못했다 (도 3). 분석하기 전에 샘플을 비등시킨 경우 HER4-특이적 신호 강도가 감소되었고, 샘플을 비등시켰을 뿐만 아니라 DTT로 환원 조건하에 두었을 경우에는 완전히 제거되었다. 이는 mAb 1479 항체가 단지 천연 형태만을 인식함을 나타낸다. 비환원 조건하에서, HER4는 cDNA로부터 유추한 예상 크기 144 kD (30)와 인접한 150 kD의 밴드로 나타났고, 환원 조건하에서는 180 kD의 밴드로 나타났다 (도 3, 하단 패널, 레인 1 대 7 비교). JM-a 이소형에 대한 mAb 1479의 특이성은 HA-태그가 부착된 HER4 이소형을 일시적으로 발현하는 COS-7 세포를 면역형광 염색하여 확인하였다. 역시 mAb 1479는 오직 JM-a-형질전환체 표면 상의 에피토프 만을 인식하였다.
ErbB 수용체의 패밀리 구성원이 상동성이기 때문에, 다른 ErbB 수용체를 안정적으로 발현하는 NIH 3T3-7d 및 NR6 형질전환체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 mAb 1479와 다른 ErbB 수용체의 교차 반응성을 평가하였다 (31). mAb 1479는 HER4 (JM-a CYT-2)에 대해 강력한 신호를 나타내었고, EGFR를 과다발현하는 세포로부터의 웨스턴 분석에서는 약한 밴드를 나타내었다 (도 4). 도 4에서, 상이한 ErbB 수용체를 발현하는 모 (레인 2) 또는 형질감염된 (레인 1 및 3) NIH 3T3-7d 및 NR6 (레인 4) 세포를 1차 항체로서 항-EGFR (sc-03), 항-HER2 (sc-284), 항-HER3 (sc-285) 또는 mAb 1479를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 모 NIH 3T3-7d 및 NR6 세포는 내인성 HER2를 발현하였고, 이는 항-HER2를 이용하여 분석한 모든 형질전환체에서 검출되었다.
세포 기반 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 mAB 1479의 교차 반응성을 추가로 검정하였다. mAb 1479 뿐만 아니라 양성 대조군 항-HER4 항체 (sc-283)는, 심지어 시험된 가장 낮은 항체 농도 (1:1000 mAB 1479 1.25 ug/ml; sc-283 0.2 ug/ml)에서도 HER4 (JM-a CYT-2)를 발현하는 NR6 형질감염체에 분명하게 결합하였다 (도 5). 그러나, EGFR, HER2, 또는 HER3, 또는 HER4의 JM-b CYT-1 이소형을 발현하는 NIH 3T3-7d 세포에는 심지어 시험된 가장 높은 항체 농도 (1:100, 12.5 ug/ml)에서도 mAb 1479가 결합하지 않는 것으로 관찰된 반면, 대조군 항체 항-EGFR (sc-03), 항-HER2 (sc-284), 항-HER3 (sc-285), 및 항-HER4 (sc-283)는 결합하는 것으로 나타났다 (1:100, 2 ug/ml) (도 5). 이러한 데이터는 mAb 1479가 HER4의 JM-a 이소형에 특이적임을 나타낸다.
실시예 3 - mAb 1479는 HER4의 쉐딩된 엑토도메인을 인식한다.
mAb 1479가 생체내에서 HER4 JM-a 이소형의 발현을 선택적으로 분석하는데 사용될 수 있는지 여부를 판단하기 위해, 인간 신장 및 심장의 동결 절편을 면역형광 염색에 의해 평가하였다. 이들 2가지의 조직 유형은 JM-a (신장) 또는 JM-b (심장) 이소형을 독점적으로 발현하는 것으로 밝혀진 바에 따라 선택하였다 (23). 실시예 2에서 논의된 시험관내 선택성에 기초하여 예상되는 바와 같이, mAb 1479는 신장을 선택적으로 염색한 반면, 심장 조직은 그렇지 않았다. HER4 (HFR-1)의 카르복시 말단에 대한 양성 대조군 항체는 두 조직 모두를 염색시켰고, 닭 T 세포 단백질 (3g6)에 대한 음성 대조군 항체를 사용한 경우에는 어떤 면역염색도 관찰되지 않았다. 세포막 구획을 가시화하는데 막 고정된 CD44 단백질에 대한 항체를 이용하였다. mAb 1479에 대해 관찰된 염색 패턴은 HFR-1에 대해 관찰된 것과 상이하였다. 이는 이들이 인식하는 에피토프가 상이하다는 것으로 설명될 수 있지만, 사구체 세포의 핵에서의 HER4 ICD의 편재에 의해 시사되는 바와 같이 HER4 분자가 절단되고 그의 엑토도메인이 신장 조직에서 쉐딩된 것이라는 사실이 보다 그럴듯하다. 또한, 생체내 신장 조직에서의 HER4 절단을 지지하여, 신장 조직 용해물의 웨스턴 분석은 mAb 1479가 2개의 주요 밴드를 인식함을 보여주었다 (도 6). 하나는 비환원 조건하에서의 전장 ErbB의 크기에 상응하는 150 kD로 이동하였고 (도 6, 레인 1 대 도 3, 레인 1 비교), 다른 보다 두드러진 것은 재조합 HER4 엑토도메인의 크기에 상응하는 100 kD로 이동하였다 (도 6, 레인 1 대 2). 약 200 kDa으로 이동한 세번째 밴드는 재조합 엑토도메인 레인에서의 약한 밴드와 크기가 유사하였고, 엑토도메인 이량체를 나타낸다.
mAb 1479가 HER4의 가용성 엑토도메인을 인식할 수 있음을 보다 직접적으로 증명하기 위해, 재조합 HER4 엑토도메인 및 mAb 1479를 이용하여 시험관내 결합 검정을 수행하였다. 엑토도메인 및 항체를 함께 인큐베이션한 경우, 이들은 250 kDa의 복합체를 형성하였다 (웨스턴 분석에 의해 검출됨) (도 7). 이 검정에서, HIS-태그가 부착된 재조합 HER4 엑토도메인 (2 g)을 0.5 ug의 mAb 1479 또는 음성 대조군 항체 3g6과 함께 15 분 동안 인큐베이션하고, 단백질 복합체의 형성을 항-HIS 항체를 이용하여 비환원 조건하에서 웨스턴 분석에 의해 시각화하였다. 도 7에서, 유리 엑토도메인이 크기 100 kDa으로 이동한 것으로 나타났고, 유리 항체는 150 kDa으로, 항체에 결합된 엑토도메인에 의해 형성된 복합체는 250 kDa으로 이동한 것으로 나타났다.
또한, 뉴레귤린-1이 단독으로 재조합 HER4 엑토도메인에 결합하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 실험에 사용된 재조합 엑토도메인이 기능적임을 확인시켜준다. 게다가, 마이크로웰 플레이트 고정된 HIS-태그가 부착된 HER4 엑토도메인 (100 ng)을 이용한 ELISA는 (0.195 내지 100 nM 범위의 농도에서) mAb 1479와의 상호작용에 대한 Kd 값이 0.85 nM+/-0.077임을 보여주었다 (도 8). 이러한 관찰은 mAb 1479가 상대적으로 높은 친화성으로 HER4 엑토도메인과 결합함을 증명한다.
실시예 4 - HER4 엑토도메인 쉐딩은 생체내에서 유방암에서 향상된다.
절단가능한 JM-a 이소형 뿐만 아니라 HER4를 절단할 수 있는 TACE 효소는 생체내에서 유방 종양 조직에서 과다발현되고 (29), 카르복시말단 HER4 에피토프는 조직학적으로 정상인 유방 상피에서 보다 유방암 조직에서 보다 빈번하게 핵으로 편재된다 (35). 게다가, HER4 면역반응성의 핵 편재는 세포 표면 면역반응성과 비교할때 불량한 생존과 관련이 있다 (29). 이러한 결과는 HER4 절단 및 엑토도메인 쉐딩이 정상 유방 조직에 비해 유방암에서 향상되고, 그러한 절단은 생물학적 의의를 가짐을 시사한다. 조직학적으로 정상인 유방 조직의 유방 암종으로의 변환이 향상된 HER4 엑토도메인의 쉐딩과 관련이 있는지 여부를 시험하기 위해, 17개의 매칭된 정상 유방/유방암 조직 쌍을 mAb 1479를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다 (도 9). 샘플 쌍은 암 조직 및 조직학적으로 정상인 인접 조직을 둘 모두 입수할 수 있는 유방암 환자로부터의 동결 조직으로 이루어졌다. 비환원 조건하에서 생성된 웨스턴 데이터를 전장 HER4를 나타내는 150 kD 신호 및 가용성 엑토도메인을 나타내는 100 kD 신호의 강도에 대해 스코어링하였다. 종양 샘플의 17개 중 9개 (53％)에서 매칭된 정상 조직 쌍에 비해 총 HER4 발현이 증가된 것으로 나타났다. 정상 유방 조직 중 6개의 샘플에서 (6/17; 35％) HER4를 검출할 수 없었던 것과 대조적으로, 단지 하나의 종양 샘플 (1/17; 6％)에서만 HER4 발현을 검출할 수 없었다. 또한 동일한 샘플 쌍을 이용한 mAb 1479에 의한 면역조직화학에 의해, 암 대 정상 조직에서 향상된 HER4 단백질 수준에 대해 유사한 결과가 얻어졌다.
흥미롭게도, HER4 엑토도메인에 대한 신호는 HER4 양성 종양 샘플 중 12개 (12/16; 75％)에서 관찰되었지만, HER4 양성 정상 유방 조직 샘플에서는 단지 2개 (2/11; 18％)에서만 관찰되었다. 150 kD 전장 수용체 및 100 kD 엑토도메인에 대한 웨스턴 신호를 농도계로 정량화한 경우, 종양 조직은 정상 조직에 비해 HER4 엑토도메인을 현저하게 더 많이 발현하였다 (P = 0.015) (도 10). 그러나, 전장 HER4의 발현에 있어서의 차이는 통계적으로 의의가 있는 것에 이르지 못했다 (P = 0.33). 검출된 100 kD 엑토도메인의 양은 또한 동일한 샘플에서 HER4의 총량 (100 kD + 150 kD)과 관련이 없었다 (P = 0.15). 이들 데이터는 암 조직에서 엑토도메인 양의 상향조절은 단백질이 더 많이 제조됨으로 인한 단순한 결과가 아님을 시사한다. 또한, 정상 및 종양 조직에서 전장 HER4 수준이 유사한 것으로 밝혀진 2명의 환자 (환자 #1 및 #3) 둘 모두에서, 가용성 엑토도메인은 오직 종양 샘플에서만 존재하는 것으로 밝혀졌다. 종합하면, 이러한 데이터들은 HER4 엑토도메인의 쉐딩이 유방암 진행 동안에 향상되며, mAb 1479는 인간 종양 조직에 의해 쉐딩된 HER4 엑토도메인을 검출하는데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 5 - mAb 1479는 HER4 인산화 및 절단을 억제한다.
HER4 기능에 대한 mAb 1479 결합 결과를 분석하기 위해, JM-a 이소형을 자연적으로 발현하는 MCF-7 유방암 세포에서 HER4 인산화를 측정하였다 (26). MCF-7 세포를 1, 2, 또는 3 시간 동안 0, 1, 또는 10 ug/ml mAb 1479로 자극한 후 15 분 후에 50 ng/ml 뉴레귤린-1 (NRG-1)로 자극하고, HER4의 pTyr1284에 대한 포스포-특이적 항체를 이용하여 HER4 티로신 인산화를 분석하였다. 항-HER4 (아브캄) 및 항-액틴으로 막을 재블롯팅하였다. mAb 1479는 HER4의 NRG-1-자극된 인산화를 현저하게 억제하였다 (도 11a).
또한 HER4의 활성화는 HER4 절단을 조절할 수 있기 때문에 (36), 기초 및 포르볼 13-미리스테이트 12-아세테이트 (PMA)-자극된 HER4 절단 둘 모두에 대한 mAb의 효과를 평가하였다. HER4 JM-a CYT-2를 발현하는 COS-7 형질감염체의 배양 배지로의 100 kDa HER4 엑토도메인의 쉐딩을, 세포를 24 시간 동안 1 g/ml mAb 1479 또는 대조군 항체 mAb 1475로 자극한 후 항-HER4 항체 mAb 1464를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 동일한 실험으로부터의 총 세포 용해물을 항-HER4 (아브캄) 및 항-액틴을 이용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다 (도 11b).
비처리 세포 또는 상이한 HER4 에피토프를 인식하는 mAb1475로 처리한 세포와 비교할 때 mAb 1479의 처리는 COS-7 형질감염체 배지로의 가용성 110 kDa HER4 엑토도메인 쉐딩양을 현저하게 감소시켰다 (도 11b). 이러한 데이터는 mAb 1479가 티로신 인산화 및 HER4 JM-a 이소형의 절단을 차단함을 보여준다.
실시예 6 - mAb 1479는 HER4에 의존적이지만 HER4 키나제 활성에는 비의존적인 메카니즘에 의해 효율적으로 내재화된다.
항-HER2 항체에 의한 종양 성장의 억제는 mAb의 세포내이입을 유도하는 내인성 능력과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (37). mAb 1479는 HER4를 발현하는 세포의 배양 배지로부터 신속하게 고갈되지만, 벡터 대조군 세포의 배지로부터는 그렇지 않은 것으로 관찰되었다. 이것이 mAb의 HER4 매개 내재화로 인한 것인지 여부를 판단하기 위해, HER4 JM-a를 일시적으로 발현하는 COS-7 세포를 mAb 1479로 처리하고, 공초점 현미경에 의해 분석하여, 항체의 세포하 편재를 가시화하였다. 5 분 인큐베이션한 후, mAb 1479는 대부분 세포 표면에서 검출되었다. 그러나, 2 시간 이내에 항체는 시토졸로 내재화되었고, 부분적으로 초기 세포내이입 소포의 마커인 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그가 부착된 Rab5와 함께 공동 편재되었다. JM-b 이소형을 발현하는 세포에서는 어떤 mAb 1479의 세포질 편재도 관찰되지 않았다. HER4 발현에 의존적이기는 하지만, mAb 1479는 또한 키나제 불활성 HER4 JM-a 구축물 (K751R)을 일시적으로 발현하는 COS-7 세포를 분석한 경우에 효율적으로 내재화되었기 때문에 mAb 1479의 내재화는 HER4 키나제 활성을 요구하지 않았다.
또한 mAb 1479는 HER4의 절단가능한 JM-a 이소형의 유비퀴틴화를 향상시키는데, 이는 mAB 1479가 도 12에 나타낸 바와 같이 변성 소포로의 ErB4 세포내이입을 활발하게 자극할 수 있음을 나타낸다. 도 12의 검정은 JM-a CYT-1 또는 JM-a CYT-2를 플래그 태그가 부착된 유비퀴틴과 함께 일시적으로 발현하는 COS-7 세포를 이용하여 수행하였다. 세포를 2 ug/ml mAb1479로 0, 10, 30, 또는 120 분 동안 처리하고, HFR-1에 의한 항-HER4 면역침전 이후 항-플래그 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 HER4 유비퀴틴화를 분석하였다. HER4 단백질의 로딩은 항-HER4 (아브캄) 항체로 재블롯팅하는 것에 의해 조절하였다.
세툭시맙은 EGFR 하향 조절을 용이하게 함으로써 종양 성장을 억제하는 것으로 제안되었다 (38). HER4를 발현하는 세포로의 mAb 1479의 효율적인 내재화가 HER4 하향 조절의 자극과 관련이 있는지 여부를 판단하기 위해, 내인성 HER4를 중간 수준으로 발현하는 MCF-7 세포를 1 μg/ml mAb 1479의 존재하에서 최대 72 시간 배양하고, 전장 HER4의 총 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다 (도 13). 항정 상태의 HER4 단백질 발현 수준을 항-HER4 (아브캄) 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고, 로딩은 항-액틴으로 조절하였다. mAb 1479에 의한 처리는 HER4 항정 상태 수준을 현저하게 감소시켰지만, 대조군 항체 3g6 (1 ug/ml)에 의한 처리는 그렇지 않았다. 그 효과는 이미 2 시간째 시점에 관찰되었고, 72 시간 실험 기간 동안 지속되었다.
실시예 7 - mAb 1479는 유방암 세포의 증식 및 콜로니 형성을 억제한다.
유방암 세포 성장에 대한 mAb 1479의 효과를 연구하기 위해, 인간 유방암 세포주를 이용하여 생존 세포의 양을 측정하는 MTS 검정을 수행하였다. mAb 1479는 T-47D (P = 0.0014) 및 MCF-7 (P = 0.047) 세포의 증식을 현저하게 억제하였다 (도 14). 이 검정에서, 세포주를 1 ug/ml의 mAb 1479 또는 양성 대조군 항체 2C4 (제넨테크)로 표시한 시간 동안 처리하였다. 생존 세포의 개수를 MTS 검정에 의해 추정하였다. 항체는 제 7 일 시점에 생존 세포의 개수를 현저하게 감소시켰다 (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; 스튜던트의 t 검정, 5 번의 독립적 실험을 3중으로 행함). mAb 1479에 의해 관찰된 효과는, 다른 HER 수용체와의 HER2 이종이량체화를 차단하는 항-HER2 항체 2C4 (제넨테크)와 비교할 때, 유사하거나 보다 강력하였다 (39).
mAb 1479는 연질 한천 콜로니 형성 검정에 있어서 T-47D (P < 0.001) 및 MCF-7 (P = 0.043) 세포 둘 모두의 부착 비의존적 성장을 현저하게 억제하였다 (도 15). 제 14 일의 시점에 x 20 필드 당 8 세포 크기를 초과하는 콜로니를 3회 수행된 실험 당 10 현미경 필드로부터 계산하였다. mAb 1479 처리는 대조군 항체 3g6에 비해 제 14 일 시점에서 콜로니의 개수를 현저하게 감소시켰다 (**P<0.01; ***P<0.001; 스튜던트의 t 검정, 3 번의 독립적인 실험을 3중으로 수행함). 평균 및 표준 편차를 도 15에 나타낸다.
참고문헌
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Claims (35)

  1. ATCC 수탁 번호 PTA-9655로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 항체 mAb 1479, 그의 인간화 형태, 또는 CDR 영역 이외의 영역에 치환이 존재하는 보존적 치환체.
  2. 제1항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-9655로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 항-HER4 항체 mAb 1479와 JM-a 이소형에 대한 결합에 대하여 경쟁하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-9655로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 모노클로날 항체 mAb 1479가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체인 항체.
  5. HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 ATCC 수탁 번호 PTA-9655로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 모노클로날 항체 mAb 1479로부터의 항원-결합 항체 단편을 포함하는, HER4 JM-a 이소형에 특이적으로 결합하는 단리된 항-HER4 항체.
  6. 제5항에 있어서, 항원-결합 항체 단편이 모노클로날 항체 mAb 1479의 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
  7. 제5항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  8. 제5항에 있어서, 친화성 성숙된 것인 항체.
  9. 수탁 번호 PTA-9655로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체 mAb 1479 또는 그의 인간화 형태를 포함하는 단리된 항-HER4 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제에 연결된 항체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HER4 JM-a 이소형에 특이적이지 않은 항-HER4 항체 보다 심독성이 낮은 항체.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 항체의 치료 유효량을 포함하는, HER4 JM-a 이소형을 발현하는 암 환자에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 항체가 HER4 엑토도메인 쉐딩(shedding)을 감소시키는 것인 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 암이 유방암, 난소암 또는 수모세포종인 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 항체의 치료 유효량을 포함하는, 환자의 암성 세포가 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 증가된 수준의 쉐딩된 Her4 엑토도메인을 포함하는 환자에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 항체가 HER4 엑토도메인 쉐딩을 감소시키는 것인 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 암이 유방암, 난소암 또는 수모세포종인 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 항체의 치료 유효량을 포함하는, 암 환자에서 암 요법과 관련된 심독성의 위험을 감소시키기 위한 제약 조성물.
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  23. 제18항에 있어서, 암이 HER4 JM-a 이소형을 과다발현하는 것인 제약 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 암이 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여, 증가된 수준의 쉐딩된 Her4 엑토도메인을 포함하는 것인 제약 조성물.
  25. 제18항에 있어서, 암이 유방암, 난소암 또는 수모세포종인 제약 조성물.
  26. 세포를 ATCC 수탁 번호 PTA-9655로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 항체 mAb 1479, 그의 인간화 형태, 또는 CDR 영역 이외의 영역에 치환이 존재하는 보존적 치환체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 샘플에서 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하는 방법.
  27. ATCC 수탁 번호 PTA-9655로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 항체 mAb 1479, 그의 인간화 형태, 또는 CDR 영역 이외의 영역에 치환이 존재하는 보존적 치환체를 종양으로부터 수득한 샘플과 접촉시킴으로써 종양에서 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 환자에서의 종양 진단에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 종양에서의 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준을 비암성 대조군 샘플에서의 쉐딩된 HER4 엑토도메인의 수준과 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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