JP5364137B2 - Egfl7に対する抗体とその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般に、脈管の発達を調整するために有用である組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、ポリペプチドを上皮細胞増殖因子様ドメイン7(EGFL7)ポリペプチドに結合する抗体に関する。本発明は、さらに、血管新生と関係する症状および疾患の診断及び治療に関する。
脈管供給の発達は、多くの生理学的及び病理学的なプロセスに基本的に必要である。胚及び腫瘍のような活発に発達する組織は十分な血液供給を必要とする。これは、血管新生と一般に呼ばれるプロセスにより新規な脈管形成を促すプロ血管新生因子を生産することによってこの必要性が満たされる。脈管形成は、以下の工程のすべて又は多数を伴う複雑であるが、規則正しい生物学的現象である:a) 内皮細胞(EC)が既存のECから増殖するか又は始原細胞から分化する;b) ECが移動して合体し、索状構造を形成する;c) 次いで脈管性索が管形成をして中央に内腔を有する脈管を形成する、d) 既存の索又は脈管から出芽して二次脈管を形成する;e) 原始脈管叢がさらに再造形及び再構築する;そして、f) 周囲に内皮細胞が集まり、内皮管を覆い、脈管に維持及び調節的な機能を与える;このような細胞には、小毛細管のための周細胞、より大きな脈管のための平滑筋細胞及び心臓の心筋細胞が含まれる。Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997);Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002);Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003)。
本発明は、治療に特に有用性があることを示す特性を有するEGFL7に対する抗体の同定にある程度基づく。
ある態様では、本発明は、抗EGFL7 mumab 4F11.1.8、抗EGFL7 mumab 10G9.1.6、及び抗EGFL7 mumab 18F7.1.8のハイブリドーマによって産生される抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、(a) 4F11 CDR-L1配列KASQSVDYDGDSYMS(配列番号:5);(b) 4F11 CDR-L2配列GASNLES(配列番号:6);(c) 4F11 CDR-L3配列QQNNEDPYT(配列番号:7);(d) 4F11 CDR-H1配列TYGMS(配列番号:8);(e) 4F11 CDR-H2配列WINTHSGVPTYADDFKG(配列番号:9);及び、(f) 4F11 CDR-H3配列LGSSA(配列番号:10)からなる群から選択される一又は複数の相補性決定領域(CDR)を含んでなる抗EGFL7抗体を提供する。ある実施態様では、前記抗体の軽鎖は、KASQSVDYDGDSYMS (配列番号:5)、GASNLES (配列番号:6)、及びQQNNEDPYT (配列番号:7)から選択されるCDR配列の少なくとも1、少なくとも2又は3つすべてを含む。ある実施態様では、前記抗体の重鎖は、TYGMS(配列番号:8)、WINTHSGVPTYADDFKG(配列番号:9)およびLGSSA(配列番号:10)から選択されるCDR配列の少なくとも1、少なくとも2又は3つすべてを含む。ある実施態様では、前記抗体の軽鎖は、KASQSVDYDGDSYMS(配列番号:5)、GASNLES(配列番号:6)およびQQNNEDPYT(配列番号:7)から選択されるCDR配列の少なくとも1、少なくとも2又は3つすべてを含み、前記抗体の重鎖は、TYGMS(配列番号:8)、WINTHSGVPTYADDFKG(配列番号:9)およびLGSSA(配列番号:10)から選択されるCDR配列の少なくとも1、少なくとも2又は3つすべてを含む。ある実施態様では、前記抗体の軽鎖は配列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR(配列番号:1)を含む。ある実施態様では、前記抗体の重鎖は配列:QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS(配列番号:2)を含む。
ある実施態様では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟された抗体、ヒト抗体又は二重特異性抗体である。ある実施態様では、抗体は抗体断片である。
ある実施態様では、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、これらのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある実施態様では、ベクターは発現ベクターである。ある実施態様では、本発明は、前記ベクターを含む、原核生物及び真核生物の細胞(哺乳動物細胞を含む)などの宿主細胞を提供する。ある実施態様では、本発明は、(a) 適切な宿主細胞内で発現ベクターを発現させ、(b) 抗体を回収することを含む、抗EGFL7抗体の作製方法を提供する。
本明細書中の発明は、例えば、EGFL7の発現及び/又は活性の増加又は望ましくない発現及び/又は活性などのEGFL7の発現及び/又は活性に関連する疾患状態の治療又は予防に有用な、抗EGFL7抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、癌、腫瘍、及び/又は細胞増殖性疾患を治療するために用いられる。
他の態様では、本発明の抗EGFL7抗体は、様々な組織及び細胞型でのEGFL7留置などのEGFL7の検出及び/又は単離のための試薬としての有用性を見出す。
さらに、本発明は、抗EGFL7抗体の作製方法、抗EGFL7抗体をコードするポリヌクレオチド、及び抗EGFL7抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集 (1987))。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、タンパク質は、(1)ローリー法で測定した場合95%を超える抗体、時には99重量%を超えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「エピトープ」は、抗体が選択的に結合する抗原の部分である。ポリペプチド抗原では、エピトープは一般的におよそ4〜10のアミノ酸のペプチド部分である。
国際公開公報00/42072(Presta) にFcRへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
「個体」、「被検体」又は「患者」は脊椎動物、例えば特にヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物には、限定するものではないが、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが含まれる。
本発明の物質/分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。
「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
本発明は、医薬組成物を含む組成物であって、抗EGFL7抗体を含んでなる組成物、及び、抗EGFL7抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書で用いられるように、組成物は、EGFL7に結合する一又は複数の抗体、及び/又はEGFL7に結合する一又は複数の抗体をコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、適切な担体、例えばバッファなどの薬学的に受容可能な賦形剤を含みうる。これは当分野で周知である。
本発明の抗EGFL7抗体は望ましくはモノクローナルである。また、本明細書中で提供される抗EGFL7抗体のFab、Fab'、Fab'-SH及びF(ab')2断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、従来の方法、例えば酵素消化により作製されるか、組換え体技術により生成されてもよい。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、後述する診断目的及び治療目的のために有用である。
本発明の抗EGFL7モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作製することができる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
EGFL7を産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製したEGFL7を付着させることが可能である。基質へのEGFL7タンパク質の付着は、Methods in Enzymology, 44巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第1級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Fab、Fv及びScFv抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したFab及びF(ab')2断片は米国特許第5869046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開93/16185;米国特許第5571894号;及び米国特許第5587458号を参照のこと。Fv及びsFvは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である;したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeck, W. H. Freeman and Company (1992)を参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5641870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
本発明のヒト抗EGFL7抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したFvクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗EGFL7抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は,例えば,Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはEGFL7に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、EGFL7タンパク質の2つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はEGFL7を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はEGFL7結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
抗体のアミノ酸変異体の他の種類は、抗体の元のグリコシル化パターンが変化したものである。このような変化には、抗体に見られる一又は複数の糖類の欠失、及び/又は抗体に存在しないグリコシル化部位の一又は複数の付加が含まれる。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr、asn、gln;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばFc領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、WO99/51642などに記載のようにC1q結合及び/又は補体依存性細胞障害(CDC)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるFc領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Fc領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及び国際公開公報94/29351を参照。国際公開公報00/42072(Presta)及び国際公開公報2004/056312(Lowman)は、FcRへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。半減期が増加して、胎児への母性IgGの移送を担う(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994))新生児Fcレセプター(FcRn)への結合が改善している抗体は、米国特許公開2005/0014934A1 (Hinton 等)に開示されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するFc領域を含んでなる。Fc領域アミノ酸配列が変更されてC1q結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第6,194,551号B1、国際公開公報99/51642に開示される。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
本発明の抗体はEGFL7を結合し、ある実施態様では、限定するものではないが、任意の生物学的な関連のEGFL7生物学的経路の破壊、及び/又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び/又は予防;および/またはEGFL7の発現および/または活性(例えばEGFL7の発現および/または活性の増加)と関係する疾患の治療又は予防を含む、EGFL7-関連の効果の一又は複数の態様を調節しうる。例えば、本発明の抗体は、本明細書中に記載のように、EGFL7へのHUVEC細胞の接着、EGFL7タンパク質コートプレート上のHUVECの移動を遮断する能力についてスクリーニングする。
抗EGFL7抗体の阻害能を決定する他の機能的なアッセイは当分野で公知であり、そのいくつかは本明細書中で例証される。
ある実施態様では、本発明は、増加したエフェクター機能および/または増加した半減期を有する変更した抗体を提供する。
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み取り枠を一致させて結合される。
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域(配列番号:19)である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列(配列番号:20)がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2);イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442);ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75);ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065);マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗EGFL7抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ADC」とも交換可能に称される)を提供する。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号;同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(US 5663149)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分DE及びDFを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 米国特許公開2005/0238649に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤:市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したADCが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる:(1) 共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ab−(L−D)p I
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、6-マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(「PAB」)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(「SMCC」)、及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「SIAB」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、米国特許公開2005/0238649を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本発明の抗体は、例えばインビトロ、エクスビボ及びインビボの治療方法で用いられてもよい。
ある実施態様では、本発明は、本発明の抗EGFL7抗体の有効量を被検体に投与することを含む、血管新生と関係する病的状態を有する被検体の血管新生を低減又は阻害する方法を提供する。これらの状態には、例えば、新生物(カルチノーマを含む)及び、特定の眼症状が含まれる。
本発明の抗体を、一又は複数の抗原分子の発現及び/又は活性に関連する疾患、障害ないし症状を治療、阻害、進行を遅延、再発を予防/遅延、寛解、又は予防するために用いることができる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、1回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の1〜99%で用いる。
本発明は、試料中のEGFL7-抗EGFL7抗体複合体を検出することを含む、EGFL7の検出方法を提供する。本明細書において、用いられる「検出」なる用語は、コントロールに対する参照の有無にかかわらず、定性的及び/又は定量的な検出(測定レベル)を含む。
本発明は、EGFL7の発現及び/又は活性に関連する疾患を診断するための方法であって、該疾患を有する又は有すると思われる患者からの生体試料において、EGFL7-抗EGFL7抗体複合体を検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、EGFL7発現は、発現の増加又は異常な(望ましくない)発現である。
本発明は、本明細書に記載の何れかの抗EGFL7抗体とEGFL7の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗EGFL7抗体は検出可能に標識される。
EGFL7についての分析法では、すべて、1つ又はそれより多い次の試薬を用いる:標識EGFL7アナログ、固定化EGFL7アナログ、標識抗EGFL7抗体、固定化抗EGFL7抗体及び立体コンジュゲート。標識試薬は、「トレーサー」としても知られている。
用いられる標識はEGFL7と抗EGFL7抗体の結合を干渉しないいくらか検出可能な機能がある。イムノアッセイでの使用のための多くの標識が公知であり、例えば、直接検出されうる成分、例えば、蛍光色素、化学発光、及び放射性標識、並びに検出されるように反応される又は誘導体化される酵素などの成分がある。このような標識の例には、ラジオアイソトープ32P、14C、125I、3H、及び131I、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ(米国特許第4737456号)、ルシェフェリン、2,3-ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
試料におけるタンパク質の発現は、免疫組織化学及び染色プロトコールを用いて試験しうる。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法(「IHC」)技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法又は蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。試料の調整では、哺乳動物(典型的にはヒト患者)の組織又は細胞試料を用いてもよい。前記試料は、当分野で公知の様々な手順、限定するものではないが、外科的切除、吸引又は生検などによって採取することができる。組織は新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施態様では、前記試料は固定し、パラフィンなどに包埋する。前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい。当分野の通常の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の通常の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び/又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である。
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。標識は、3,3'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばHRPO)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
このようにして調製される検査材料はマウントしてカバーグラスをかけてもよい。その後、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当分野で通常用いられる染色強度判定基準を用いてもよい。
競合アッセイは、限られた数の抗EGFL7抗体抗原結合部位について試験試料EGFL7と競合するトレーサーEGFL7類似体の能力に依存する。一般的に、抗EGFL7抗体は、競合の前又は競合の後に不溶化して、次いで抗EGFL7抗体に結合したEGFL7とトレーサーを結合していないトレーサーとEGFL7から分離する。この分離は、別の容器へ移す(結合パートナーが予め不溶化された場合)か、又は遠心分離する(結合パートナーが競合反応の後で沈殿した場合)ことにより達成される。マーカー物質の量で測定されるように、試験試料EGFL7の量は結合したトレーサーの量に反比例する。EGFL7の既知量による用量-反応曲線を作成して、試験結果と比較して試験試料に存在するEGFL7の量を量的に決定する。検出可能なマーカーとして酵素が用いられる場合に、これらのアッセイはELISAシステムと呼ばれている。
「均質な」アッセイと称される競合アッセイの他の種類は、相分離を必要としない。ここで、EGFL7と酵素とのコンジュゲートが調製され、抗EGFL7抗体がEGFL7に結合する場合に抗EGFL7抗体の存在により酵素活性が修飾されるように用いられる。この場合、EGFL7又はその免疫学的に活性な断片は、二機能性有機架橋によって、ペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートされる。抗EGFL7抗体の結合が標識の酵素活性を阻害するか又は強化するために、抗EGFL7抗体により使用についてコンジュゲートを選別する。この方法自体は、EMITという名前で広く実施される。
サンドイッチアッセイは、EGFL7又は抗EGFL7抗体の測定のために特に有用である。一連のサンドイッチアッセイにおいて、固定された抗EGFL7抗体を用いて、試験試料EGFL7を吸着し、洗浄によって、試験試料を除去し、結合したEGFL7を用いて第二の標識した抗EGFL7抗体を吸着して、次いで結合した材料を残留するトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は、試験試料EGFL7に正比例する。「同時」サンドイッチアッセイにおいて、試験試料は、標識した抗EGFL7を加える前に分離されない。一抗体として抗EGFL7モノクローナル抗体を、他方の抗体としてポリクローナル抗EGFL7抗体を用いる一連のサンドイッチアッセイは、試料をEGFL7について試験する際に有用である。
前述は、単にEGFL7のための例示的な検出アッセイにすぎない。EGFL7の測定のために抗EGFL7抗体を用いる、現在の他の方法又は今後開発される方法は、本明細書に記載のバイオアッセイを含め、本願の権利内に包含される。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が喘息のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器;と(b)組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を喘息などの特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
モノクローナル抗体の産生
新規のヒト分泌型膜貫通型タンパク質、特に血管の発達の調節に関与するものを発見するためにEGFL7を同定してクローニングした。ヒトEGFL7のクローニング及び発現の詳細は、例えば米国特許公開第2003/0224948号A1(この出願ではEGFL7はPRO1449として同定されている)に記載されている。ヒトEGFL7のGenBank(登録商標)寄託番号はNM_016215である。
Egfl7ホモ接合体ノックアウトマウス(Genentechで生成)の足蹠に、Ribiアジュバント(Corixia, Hamilton, MT)にて希釈した大腸菌産生のHis6-タグ化組み換えヒト及びマウスEGFL7タンパク質を週に2回、8用量を投与して免疫化した。高い血清力価を示す10匹のマウスからリンパ節のB細胞を採取し、マウスメラノーマ細胞(X63.Ag8.653;アメリカ培養細胞系統保存機関(登録商標)(ATCC(登録商標)))と融合させた。10〜14日後に、組み換えEGFL7タンパク質を用いた直接ELISAにより、抗体産生について上清をスクリーニングした。ポジティブクローンを2回サブクローニングして単クローン性を達成した。精製した抗体を大規模に生成するために、ハイブリドーマ細胞を、プリスチンで初回刺激したBALB/cマウスの腹腔内に投与するか、又はインテグラバイオリアクターにて培養した。腹水液又は培養液上清を、プロテインA親和性クロマトグラフィ(Pharmacia高速タンパク質液体クロマトグラフィ;Pharmacia, Uppsala, Sweden)にて精製した。更なる分析のために、モノクローナル抗体のうち4F11、10G9および18F7なる3つを選択した。これらのモノクローナル抗体は、2006年1月にATCC(登録商標)に寄託した。
培養プレート上にコートしたEGFL7は、その接着強度はフィブロネクチン及びコラーゲンなどの他の細胞接着分子よりも著しく弱いにもかかわらず、ヒトの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)接着を促すことが既に示されている(Parker等, Nature 428:754-58 (2004))。したがって、発明者等はMab 4F11、10G9および18F7がEGFL7コートプレートへの細胞接着を遮断するか否かを決定するために実験を行った。5μg/mlのフィブロネクチン(Roche)と大腸菌の組み換えヒトEGFL7生成物にてプレートをコートした。PBSにてすすいだ後、HUVEC(Cambrex)を、EGM2培地(Cambrex)に5×105/cm2の密度で播き、140gで5分間遠心して細胞接着を同期させ、その後インキュベートした。抗体活性を分析するために、EGM2培地中のHUVEGを、播く前に0.5、5又は50μg/mlの濃度の抗体を含む50mM トリス/125mM NaCl、pH8.6とともに予めインキュベートした。Mab 4F11、10G9及び18F7のそれぞれは濃度に依存して、ヒト又はマウスのEGFL7タンパク質コートプレートへの細胞接着を遮断し、いずれのMabもフィブロネクチンコートプレートへの細胞接着を遮断しなかった。この遮断はEGFL7に特異的であったことが確認された。
興味深いことに、本発明者等はMab 4F11による遮断は形態に依存していたことを明らかにした。具体的には、抗体は、抗体貯蔵液を50mM トリス/125mM NaClにて調製した場合にはHUVEC細胞接着の遮断に高い有効性があるが、PBSにて調製した場合にはわずかな有効性しか示さなかった。この違いは他の2つのMabでは観察されなかった。
総RNAは、RNeasy(登録商標)ミニキット(Qiagen, Germany)を用いて、マウス抗ヒトEGFL7モノクローナル抗体4F11および10G9を産生するハイブリドーマ細胞から抽出した。4F11および10G9の可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)ドメインは、以下の変性プライマーを用いたRT-PCRを使用して増幅した。
4F11用:
軽鎖(LC)フォワード:5'- GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3'(配列番号:21)
重鎖(HC)フォワード:5'-GATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCT GGGATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGG -3'(配列番号:22)
10G9用:
軽鎖(LC)フォワード:5'- GATCGATATCGTGATGACBCARACTCCACT-3'(配列番号:23)
重鎖(HC)フォワード:5'-GATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG -3'(配列番号:24)
4F11および10G9用:
軽鎖リバース:5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3'(配列番号:25)
重鎖リバース:5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3'(配列番号:26)
Mab 4F11、10G9および18F7を、標準的な方法を用いてアイソタイプIgG2bであることを決定した。
ヒトおよびマウスのEGFL7に対するMabの結合親和性は、室温のファルマシアBIAcore(登録商標)3000(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)(例としてMorton等, Meth. Enzymol. 295:268-94 (1998)を参照)を用いた表面プラスモン共鳴によって決定した。抗EGFL7抗体を一次アミン基を介してセンサーチップ(CM5)に固定した。カルボキシメチル化センサーチップ表面マトリクスを、0.025M N-ヒドロキシスクシニミドと0.1M N-エチル-N'(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの20μl混合物を5μl/分で注入することによって活性化した。10ug/mlの組み換えヒト又はマウスEGFL7タンパク質を含む5〜10μlの10mM 酢酸ナトリウム、pH4.5を5μl/分で注入した。カップリングの後、チップ上の空いている部位は、20μlの1M エタノールアミン、pH8.5を注入して反応を止めた。ランニングバッファは、0.05%ポリソルベート20を含有するPBSであった。動態測定のために、ポリ-Hisタグ化EGFL7のランニングバッファによる2倍段階希釈物を30μl/分の流速で3分間フローセルに対して注入し、結合したポリhisタグ化EGFL7を20分かけて分離した。20μlの10mM グリシン・HCl(pH1.5)を注入することによって結合表面を再生した。活性化されているが固定化された抗体を持たないフローセルを参照細胞として用いた。フローセルに対するポリ-Hisタグ化EGFL7の非特異的な有意な結合はなかった。見かけの結合親和性を算出するために、データは、包括的フィッティングを用いた1:1結合モデルによって分析した。会合および解離速度定数は同時にフィットさせた(BIAevaluationソフトウェア)。50mM トリス/125mM NaClのMab貯蔵液を用いたこれらの実験の結果を表2に示す。
表2.ヒトおよびマウスのEGFL7に対するMabのKD
本発明者等はモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを決定し、最初に各々のMabに結合したEGFL7の領域をマッピングした。293細胞に、図5に示すタンパク質の完全長EGFL7又は切断型を含む発現ベクターを形質移入した。次いで、形質移入した細胞の細胞溶解物のウエスタンブロットを、Mab 4F11、10G9および18F7のプローブにて行った。本発明者等は、各々のMabがEGFL7のEMIタンパク質に結合したことを明らかにした。
各々のMabによって認識される特定のエピトープを限定するために、本発明者等は、EMIドメインの一部を占めるオーバーラッピングポリペプチドを合成し、Mab結合について完全長EGFL7と競合する能力について試験した。例えば、Mab 4F11に用いるポリペプチドの配列は以下の通りである。
本発明者等は、Mab 4F11とEGFL7タンパク質を混合し、10倍モル過剰量のポリペプチドp1、p2およびp3それぞれによって結果として生じる複合体を免疫沈降させ、SDS-PAGEにてそれらを視覚化した。Mab 4F11では、Mab 4F11結合についてp2のみが完全長EGFL7と競合したことが明らかになった。結果から、Mab 4F11が配列CCPを含むEGFL7のエピトープを認識することが示唆される。
本発明者等は、Mab 10G9および18F7がともに、配列RTIY(配列番号33)を含むエピトープを認識することを決定した。
この実施例では、いくつかのモデルにおいて、抗EGFL7 Mabをインビボでの腫瘍増殖の阻害能について試験した。最初にColo205モデル(ヒトの結腸直腸癌)およびA673モデル(ヒトの横紋筋肉腫モデル)においてMab含有PBSを試験した。発明者等は、単剤としてMab含有PBSを用いたところこれらのモデルにおける効果は観察されなかった。
次いで、Mab単独および/またはMabと抗VEGF抗体であるB20.4.1(国際公開第2005/012359号に記載)の組み合わせを試験した。以下の3つのモデルにおいて抗体を試験した。Her2ヒト乳癌モデル(「Fo5モデル」)、ヒト肺癌(NSCLC)モデル(「H1299」)及び別のヒト乳癌モデル(「MDA-MB231」)。これらの腫瘍モデルは十分に樹立されており、例えば、Lee等, Clin Cancer Res. 11(16): 6065-74 (2005);Cameron等, Cancer Cell Int.5: 23 (2005);Finkle等, Clinical Cancer Res. 10: 2499-251(2004)において記述される。各々の動物は、抗ブタクサMab(コントロール);B20.4単独;18F7単独;またはB20.4と4F11、10G9又は18F7にて治療した。簡単に言うと、H1299モデルでは、HRLN雌nu/nuマウスの横腹の皮下に1×107のH1299腫瘍細胞を注入し、MDA-MB231モデルでは、HRLN雌nu/nuマウスの横腹の皮下に5×106のMDA-MB231腫瘍細胞を注入した。各々のモデルでは、平均腫瘍サイズが100mm3に達した場合に抗体治療を開始した(図6〜9の0日目に相当する)。抗ブタクサコントロールMabとB20.4は10mg/kgで週に1回投与し、4F11、10G9及び18F7は10mg/kgで週に2回投与した(図6、8及び9のx軸の下の矢印で示す)。
興味深いことに、本発明者等は、H1299モデルにおけるMab 4F11による治療は、抗VEGF療法(B20.4.1)の中断後の完全な血管回復を阻害することも明らかにした。治療中断後に、腫瘍血管パターンをB20.4.1単独で治療した腫瘍とB20.4.1と4F11で治療した腫瘍との間で比較すると、腫瘍の血管再生に有意な遅延が観察された。これらの結果から、抗VEGF療法と組み合わせた場合に、抗EGFL7療法が相加的又はさらに相乗的な効果を示しうることが強く示唆される。
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。これらの細胞系統は、ブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、細胞系統を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に細胞系統を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した細胞系統が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、通知により細胞系統を同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託された細胞系統の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
前述の発明は、理解を明確にするための図説及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、この説明及び実施例は本発明の権利範囲を限定するものとみなされるものではない。
Claims (3)
- ATCC寄託番号PTA−7345のもと、寄託されたハイブリドーマ。
- ATCC寄託番号PTA−7343のもと、寄託されたハイブリドーマ。
- ATCC寄託番号PTA−7344のもと、寄託されたハイブリドーマ。
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