JP5710487B2 - 抗ｎｏｔｃｈ２抗体および使用方法 - Google Patents

抗ｎｏｔｃｈ２抗体および使用方法 Download PDF

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Description

（関連出願の説明）
本出願は、２００８年１０月１日に出願した米国仮特許出願番号６１／１０１９１７の優先権を主張する。その開示は出典明記によって完全に本明細書において援用される。
（技術分野）
本発明は、概して分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ２ネガティブ制御領域(ＮＲＲ)抗体含む抗Ｎｏｔｃｈ抗体とその使用に関する。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体とその使用方法も提供される。
Ｎｏｔｃｈレセプターファミリーは、ウニやヒトと同じくらい多様な有機体の発達に作用するシグナルを伝達する、進化上保存された膜貫通型レセプターの一種である。Ｎｏｔｃｈレセプター及びそのリガンドであるＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ(哺乳動物ではＪａｇｇｅｄとして知られる)は、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様レセプターを含有する大きな細胞外ドメインを有する膜貫通型タンパク質である。Ｎｏｔｃｈパラログの数は種間で異なる。例えば、哺乳動物では４つ(Ｎｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ４)、線虫では２つ(ＬＩＮ-１２及びＧＬＰ-１)、及びキイロショウジョウバエでは１つ(Ｎｏｔｃｈ)のＮｏｔｃｈレセプターがある。Ｎｏｔｃｈレセプターは、膜貫通ドメインのＮ末端側の部位Ｓ１でｆｕｒｉｎ様プロテアーゼによって細胞表面への運搬の間にタンパク分解性にプロセシングされ、細胞外Ｎｏｔｃｈ(ＥＣＮ)サブユニット及びＮｏｔｃｈ膜貫通サブユニット(ＮＴＭ)が生じる。これら２つのサブユニットは、非共有的に結合したままで、成熟したヘテロダイマー細胞表面レセプターを構成する。ＮｏｔｃｈレセプターおよびＮｏｔｃｈシグナル伝達経路は、例えば、Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3: 587-613, 2008およびBolos et al., Endocrine Reviews 28:339-363, 2007に概説される。
Ｎｏｔｃｈ２ ＥＣＮサブユニットは、３６のＮ末端ＥＧＦ様リピートの後に、Ｓ１部位に先行する３つのタンデムリピートＬｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈリピート(ＬＮＲ)モジュールを含有する。各ＬＮＲモジュールは、カルシウムイオンを調整することが予測される３つのジスルフィド結合と一群の保存された酸性かつ極性の残基を含有する。ＥＧＦリピート領域内に、活性化リガンドのための結合部位が位置する。
Ｎｏｔｃｈ２ ＮＴＭは、細胞外領域(Ｓ２切断部位を内部に持つ)、膜貫通部分(Ｓ３切断部位を内部に持つ)、及びＲＡＭドメイン、６つのアンキリンリピート、トランスアクチベーションドメイン及びカルボキシ末端ＰＥＳＴ配列を含む大きな細胞内部分を含む。ＥＣＮ及びＮＴＭサブユニットの安定な結合は、ＥＣＮのカルボキシ終末端(ＨＤ−Ｎと称される)及びＮＴＭの細胞外アミノ末端(ＨＤ−Ｃと称される)を含むヘテロ二量体化ドメイン(ＨＤ)に依存している。リガンド誘導性の活性化の前に、Ｎｏｔｃｈは、３つのＬＮＲとＨＤドメインを含むネガティブ制御領域(ＮＲＲ)によって静止立体構造に維持される。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲの結晶構造は、Gordon et al., (2007) Nature Structural & Molecular Biology 14:295-300, 2007において報告される。
ＥＣＮサブユニットへのＮｏｔｃｈリガンドの結合により、制御された膜内タンパク質分解により生じる２つの連続的なタンパク質分解性切断が開始する。部位Ｓ２のメタロプロテアーゼ(ＡＤＡＭ１７)による第一切断によって、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの、原形質膜の内側の小葉の近くの部位Ｓ３での第二切断が起こりやすくなる。プレセニリンとニカストリンを含む多タンパク質複合体により触媒される部位Ｓ３切断は、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの細胞内部分を遊離し、核に転位させ、標的遺伝子の転写を活性化する。(Ｎｏｔｃｈのタンパク分解性切断の概要については、Sisodia et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:281-290, 2002を参照のこと)。
Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａ様クラスの５つのＮｏｔｃｈリガンドは、ヒト(Ｊａｇｇｅｄ１(Ｓｅｒｒａｔｅ１とも称される)、Ｊａｇｇｅｄ２(Ｓｅｒｒａｔｅ２とも称される)、Ｄｅｌｔａ様１(ＤＬＬ１とも称される)、Ｄｅｌｔａ様３(ＤＬＬ３とも称される)、及びＤｅｌｔａ様４(ＤＬＬとも称される))において同定された。各々のリガンドは、Ｎｏｔｃｈを結合するために必須の、保存されたN末端のＤｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、ＬＡＧ−２(ＤＳＬ)モチーフを有する一回膜貫通タンパク質である。ＤＳＬモチーフに対する一連のＥＧＦ様モジュールＣ末端は膜に拡がる(membrane-spanning)部分に先行する。Ｎｏｔｃｈレセプターとは異なり、リガンドは、Ｃ末端に７０−２１５アミノ酸の短い細胞質の尾部を有する。さらに、他のタイプのリガンドも報告されている(例えばＤＮＥＲ、ＮＢ３、及びＦ３／コンタクチン)。(Ｎｏｔｃｈリガンドおよびリガンド媒介性Ｎｏｔｃｈ活性化の概要については、D'Souza et al., Oncogene 27:5148-5167, 2008を参照のこと)。
Ｎｏｔｃｈ経路は、ハエ及び脊椎動物の神経発生に作用するプロセスなど、多様な発達上及び生理学上のプロセスの際に機能する。通常は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、側方抑制、系統決定及び複数の細胞群間の境界の形成に関与する(例としてBray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006を参照)。癌及び神経変性障害を含む多様なヒトの疾患は、Ｎｏｔｃｈレセプター又はそのリガンドをコードする遺伝子の突然変異によるものであることが示されている(例としてNam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501-509, 2002を参照)。ヒトＮｏｔｃｈ１の切断された構造的に活性な変異体を造る反復性のｔ(７;９)(ｑ３４;ｑ３４.３)染色体転座がヒト急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)のサブセットにおいて同定された時に、非常に多くのＮｏｔｃｈシグナル伝達と悪性腫瘍との関連が初めて認識された。(例としてAster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3: 587-613, 2008を参照)。マウスモデルでは、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達はＴ細胞発達に必須であり、Ｎｏｔｃｈ１が媒介するシグナルがＢ細胞発達を犠牲にしてＴ細胞の発達を促すことが示された。(例としてWilson et al., J. Exp. Med. 194: 1003-1012, 2001を参照)。
また、Ｎｏｔｃｈ２は特定の癌に関与する。特に、Ｎｏｔｃｈ２はＢ細胞慢性リンパ球性白血病(Ｂ−ＣＬＬ)において過剰発現され、次にＢ−ＣＬＬ細胞の特徴であるＣＤ２３の過剰発現を引き起こす。(Hubmann et al., Blood 99:3742-3747, 2002を参照)。Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２は複数の骨髄腫細胞(癌性の血漿Ｂ細胞)において高く発現され、リガンドによる刺激により腫瘍細胞増殖を強く増加する。(Jundt et al., Blood 103:3511-3515, 2004を参照)。Ｎｏｔｃｈ２および下流のエフェクターはメラノーマにおいて過剰発現され(Hoek et al., Cancer Res. 64: 5270-5282, 2004；Seykora et al., Am J Dermatopathol 25:6-11, 2003を参照)、Ｎｏｔｃｈ２遺伝子座はメラノーマ細胞株において反復的に増幅される(Jonsson et al., Oncogene, 26:4738-4748, 2007)。加えて、数多くの研究により、異常なＮｏｔｃｈ２シグナル伝達が乳癌および他の固形腫瘍に関連づけられた(Leong and Karsay, Blood 107:2223-2233, 2006に概説される)。また、Ｎｏｔｃｈ２は、周辺帯Ｂ細胞発達に必要である。(Pillai et al., Annu. Rev. Immunol. 23:161-196, 2005を参照)。
様々なヒトの疾患にＮｏｔｃｈシグナル伝達が関与すると考えると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を制御し、治療薬としての開発に適した臨床上の貢献がある薬剤が求められ続けていることは明らかである。本明細書において記述される発明は、この必要性を満たし、他の利点を提供する。
特許出願及び出版物を含め本明細書において引用するすべての文献は、出典明記によってすべてが援用される。
本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ抗体およびその使用方法を提供する。
一態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合するモノクローナル抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、Ｎｏｔｃｈ２活性を阻害する。他の実施態様では、抗体は、Ｎｏｔｃｈ２以外のＮｏｔｃｈファミリに有意に結合しない。他の実施態様では、抗体は、マウスＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲおよびヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する。他の実施態様では、抗体は、１０ｎＭ以下のＫｄでＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する。
さらなる実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合するモノクローナル抗体であって、
(a) 配列番号：３のコンセンサス配列と一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(d) 配列番号：１０のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(e) 配列番号：１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び、
(f) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む抗体が提供される。
そのような実施態様では、抗体は、配列番号：１−２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；配列番号：６−９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；そして、配列番号：１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含む。そのような実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：６のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１１のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１５のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：７のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１１のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号：８のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１２のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１３のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。上記何れかの実施態様では、抗体は、ヒトＶＨアクセプター２フレームワークおよびヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも一のフレームワークをさらに含む。
他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合するモノクローナル抗体であって、配列番号：２０−２１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：２２−２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：２２のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む。そのような実施態様では、重鎖可変ドメインは配列番号：２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号：２２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：２３−２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む。そのような実施態様では、重鎖可変ドメインは配列番号：２１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号：２３−２５から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２又は抗体Ｄ-３から選択した抗体と同じエピトープに結合する単離された抗体が、提供される。他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２のＬＮＲ−ＡドメインおよびＨＤ−Ｃドメインに結合する単離された抗体が、提供される。
他の態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２の断片から選択される抗体断片である。他の態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、ヒト化、キメラ又はヒトの抗体である。
上記何れかの実施態様は単独でも組み合わせてもよい。
他の態様では、上記何れかの実施態様の抗体にＮｏｔｃｈ２を発現する細胞を曝すことを含む、Ｎｏｔｃｈ２活性の阻害方法が、提供される。他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２の発現又は活性の増加と関連する疾患の治療方法であって、必要とする被検体に、上記何れかの実施態様の抗体の有効量を投与することを含む方法が、提供される。他の態様では、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療方法であって、必要とする被検体に、上記何れかの実施態様の抗体の有効量を投与することを含む方法が、提供される。他の態様では、メラノーマの治療方法であって、必要とする被検体に、上記何れかの実施態様の抗体の有効量を投与することを含む方法が、提供される。
他の態様では、Ｎｏｔｃｈ１の発現又は活性の増加と関連する疾患の治療方法であって、必要とする被検体に、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と、デキサメサゾンおよびタモキシフェンから選択した治療薬の有効量を同時に投与することを含み、該治療薬が抗体によって生じる変化した腸管細胞の分化を低減する方法が、提供される。そのような実施態様では、疾患はＴ細胞悪性腫瘍である。
実施例Ｂ(１)に記載のように、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３と称する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲモノクローナル抗体のＨ１、Ｈ２およびＨ３重鎖高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列を示す。アミノ酸位は、後述するようにカバット番号付けシステムに従って番号をつける。 実施例Ｂ(１)に記載のように、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３と称する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲモノクローナル抗体のＬ１、Ｌ２およびＬ３軽鎖ＨＶＲ配列を示す。アミノ酸位は、後述するようにカバット番号付けシステムに従って番号をつける。 抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３の重鎖可変領域配列のアライメントを示す。実施例Ｂ(１)に記載のように、ＨＶＲは囲って示す。 抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３の軽鎖可変領域配列のアライメントを示す。ＨＶＲは囲みで示す。 本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒト可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク配列を示す。配列識別子は以下の通りである：−ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：３２、３３、３４、３５)。−ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３６、３７、３４、３５；配列番号：３６、３７、３８、３５；及び、配列番号：３６、３７、３９、３５)。−ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：４０、４１、４２、３５)。−ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：４３、４４、４２、３５；配列番号：４３、４４、４５、３５；及び、配列番号：４３、４４、４６及び３５)。−ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：４７、４８、４９、３５)。−ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：５０、５１、４９、３５；配列番号：５０、５１、５２、３５；及び、配列番号：５０、５１、５３、３５)。−ヒトＶＨアクセプターフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：５４、４８、５５、３５)。−ヒトＶＨアクセプターフレームワーク「Ｂ」及び「Ｃ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：５０、５１、５５、３５；及び、配列番号：５０、５１、５６、３５)。−ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：５４、４８、５７、３５)。−ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：５０、５１、５７、３５；配列番号：５０、５１、５８、３５；及び、配列番号：５０、５１、５９、３５)。 本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒト可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク配列を示す。配列識別子は以下の通りである：−ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(κｖ１)：配列番号：６０、６１、６２、６３。−ヒトＶＬκサブグループIIコンセンサスフレームワーク(κｖ２)：配列番号：６４、６５、６６、６３。−ヒトＶＬκサブグループIIIコンセンサスフレームワーク(κｖ３)：配列番号：６７、６８、６９、６３。−ヒトＶＬκサブグループIVコンセンサスフレームワーク(κｖ４)：配列番号：７０、７１、７２、６３。 ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖および重鎖のフレームワーク配列を示す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。 ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖及び重鎖のフレームワーク配列を修飾とともに示す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。 実施例Ｂ(１)に記載のように、抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２抗体がそれらの同族レセプターに特異的に結合することを示す。(Ａ) ４人のヒト(ｈ)およびマウス(ｍ)それぞれのＮｏｔｃｈレセプター由来の精製したＮＲＲタンパク質断片への、抗ＮＲＲ１(左パネル)および抗ＮＲＲ２(右パネル)の結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイ。結合は、抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２の力価に対して、ｙ軸上にＡ５６０として示す。(Ｂ) 形質移入しなかったＫ１-ＣＨＯ細胞(パネル１、４、７および１０)、Ｎ−ｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ１を安定して形質移入したＫ１-ＣＨＯ細胞(パネル２、５、８及び１１)、又はＮ−ｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ２を安定して形質移入したＫ１-ＣＨＯ細胞(パネル３、６、９および１２)への抗ＮＲＲ１(パネル１−６)又は抗ＮＲＲ２(パネル７−１２)の結合を測定するＦＡＣＳアッセイ。Ｎ−ｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ導入遺伝子は、誘導可能なｔｅｔプロモーターの制御下で発現した。下列、ドキシサイクリンによる誘導の非存在下(-Ｄｏｘ)でのコントロール発現、上列、ドキシサイクリン添加(＋Ｄｏｘ)後に誘導された発現。Ｋ１-ＣＨＯ株はＮｏｔｃｈ２を内因的に発現し、その発現はドキシサイクリンの有無の下で抗ＮＲＲ２によって検出される点を注記する(例えば、パネル７および１０を比較する)。 実施例Ｂ(２)およびＢ(３)に記載のように、抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２が、活性化突然変異を保因するレセプターを含み、標的とするレセプターからのシグナル伝達を特異的に阻害することを示す。(Ａ) Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の抗ＮＲＲ１阻害を測定する共培養アッセイ。Ｊａｇ１を安定して形質移入したＮＩＨ-３Ｔ３細胞を用いて、Ｎｏｔｃｈ１を安定して形質移入したＮＩＨ-３Ｔ３細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を誘導した(「-Ｊａｇ１」を除く、これはＪａｇ１発現細胞の代わりに形質移入されなかったＮＩＨ-３Ｔ３細胞を使用した)。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈリポーター遺伝子(ホタルルシフェラーゼのＣＳＬ依存性プロモーター作動性発現)を使用して測定され、ＤＡＰＴ状態(１の値として定める)に正規化したコントロール遺伝子発現(ウミシイタケのルシフェラーゼの恒常的プロモーター作動性発現)との相対で表す。＋Ｊａｇ１、標準物質共培養アッセイ；ＤＭＳＯ、ＤＡＰＴベヒクル単独；ＤＡＰＴ、ＤＭＳＯ中５μＭ；α-ｇＤ、２０００ｎｇ／ｍｌのアイソタイプコントロール抗体；α-ＮＲＲ１、示した濃度の抗ＮＲＲ１抗体；最後の４つのアッセイは、８０ｎｇ／ｍｌのα-ＮＲＲ１又はα-ｇＤと、示す通りの(＋ＮＲＲ１又は＋ＮＲＲ２)精製したＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲタンパク質断片を含む。(Ｂ) Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の抗ＮＲＲ２阻害を測定する共培養アッセイ。Ｊａｇ１を安定して形質移入したＮＩＨ-３Ｔ３細胞を用いて、Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を誘導すると、このＵ８７ＭＧ細胞はＮｏｔｃｈ２を高レベルで発現した。アッセイは、(Ａ)に記載のように実施した。(Ｃ) 野生型又は変異体Ｎｏｔｃｈ１レセプターからのＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の抗ＮＲＲ１阻害を測定する共培養アッセイ。レセプター発現細胞が、示したＮｏｔｃｈ１レセプターを発現するプラスミドの一過性の形質移入によって生成されたことを除き、(Ａ)のようにアッセイを実施した。ＷＴ、野生型Ｎｏｔｃｈ１；ＰＥＳＴ、ＰＥＳＴドメインを欠くＮｏｔｃｈ１；Ｌ１５９４Ｐ、示した構造的活性化点突然変異を保因するＮｏｔｃｈ１；Ｅ２５、６２５ｎｇ／ｍｌのアイソタイプコントロール抗体；α-ＮＲＲ１、６２５ｎｇ／ｍｌの抗ＮＲＲ１抗体；ＤＭＳＯ、ＧＳＩベヒクル単独；ＤＡＰＴ、ＤＭＳＯ中５μＭ；ＣｍｐＥ、ＤＭＳＯ中１μＭの化合物Ｅ。 実施例Ｂ(４)に記載のように、抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２がインビボでレセプター特異的インヒビターとして機能することを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５ｍｇ／ｋｇのα-ｇＤアイソタイプコントロール、α-ＮＲＲ１又はα-ＮＲＲ２を４日ごとに４回注射し、４回目の投与後第１日目の１３日目に胸腺又は脾臓から細胞を回収した。(Ａ) 胸腺重量測定値。胸腺重量(ｍｇ)は総体重(ｇ)その相対で表される。値は、１群につき３匹のマウスについての平均＋標準偏差を表す。(Ｂ) 胸腺細胞数。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重ポジティブＴ細胞を識別するためのＣＤ４およびＣＤ８ ＦＡＣＳ。数字は、二重ネガティブ、単一ポジティブ及び二重ポジティブの集団における胸腺細胞の割合を表す。抗ｇＤコントロール(７７．５％)と比較して、抗ＮＲＲ１は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋集団における細胞の割合を劇的に低減した(５．８９％)のに対して、抗ＮＲＲ２は有意な影響はなかった(８０％)。(Ｄ) 周辺帯Ｂ細胞を識別するためのＣＤ２１およびＣＤ２３ ＦＡＣＳ。数字は、ＭＺＢゲート内の細胞の平均割合±標準偏差(３匹の動物)を表す。この値は囲みで示し、ｐ値も示す。各群の３匹の動物のうちの１匹からの代表的な点プロットをグラフに示す。抗ｇＤコントロール(６．６１％)と比較して、抗ＮＲＲ２はＭＺＢ細胞をほとんど取り除いた(０．９７％)のに対して、抗ＮＲＲ１は有意な影響はなかった(６％)。 実施例Ｂ(５)に記載のように、抗ＮＲＲ１ Ｆａｂ／ＮＲＲ１共結晶の２．２Å構造は、抗ＮＲＲ１がＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−ＢおよびＨＤ−Ｃドメインと同時に接触することを示す。(Ａ) Ｎｏｔｃｈ１-ＮＲＲ又はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲキメラタンパク質断片へのα-ＮＲＲ１又はα-ＮＲＲ２の結合をまとめた表。示したＮＲＲタンパク質断片(濃青色、Ｎｏｔｃｈ１配列；淡青色、Ｎｏｔｃｈ２配列)は、プレートに基づくアッセイにおける抗体結合の迅速な測定を可能にするためのアルカリホスファターゼに融合させた分泌タンパク質として発現された。ＮＲＲ発現および分泌について正規化するためにアルカリホスファターゼ活性を用いた後に、示したＮＲＲキメラタンパク質を含む培養液を、α-ＮＲＲ１、α-ＮＲＲ２又はアイソタイプコントロール抗体(バックグラウンド結合を評価するために用いた、図示せず)にてコートした９６ウェルプレートに添加した。抗体結合は、プレートに結合したままであったアルカリホスファターゼ活性を測定することによって評価した。Ｙ、強力な結合；Ｎ、観察される結合なし；Ｗ、観察される弱い結合。(Ｂ) ヒトＮｏｔｃｈ ＮＲＲ１の構造。ＮＲＲ１はＣ−アルファ挿絵として示す。ＬＮＲモチーフ内の３つのカルシウムイオンは球で示す。Ｓ２切断部位の位置は矢印で示す。(Ｃ) 構造的に保存された原子をベースとしたＮＲＲ２上のＮＲＲ１の重ね合わせ(ｐｄｂコード２ＯＯ４の鎖Ａ)。ＮＲＲ１(陰影)およびＮＲＲ２(白色)をＣ−アルファ線として示す。(Ｄ) ＮＲＲ１(左)とα-ＮＲＲ１ Ｆａｂ(右、黒色の点線として示す重鎖と軽鎖の間の境界)との間の境界の図。溶媒アクセス可能表面領域が複合体形成によって埋没される範囲を示す。少なくとも５０％が埋没している残基を標識し、標識したＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２内の同一ＮＲＲ残基を黒色のフォントで示した(図１８も参照のこと)。 実施例Ｂ(６)に記載のように、抗ＮＲＲ１によって内皮細胞過剰出芽が生じることを示す。(Ａ) インビトロ内皮細胞出芽アッセイ。ＨＵＶＥＣをＣｙｔｏｄｅｘビーズ上にコートし、皮膚線維芽細胞と共に共培養した。培養物は、偽処理(コントロール)又は１μＭのＤＢＺ、５μｇ／ｍｌのα-ＮＲＲ１ないし５μｇ／ｍｌのα-Ｄｌｌ４にて処理した。バー＝１００μｍ。(Ｂ) (Ａ)の培養物からの出芽長測定値。(Ｃ) 内皮細胞出芽および脈管形成についてのマウス新生仔レチナールアッセイ。Ｐ１及びＰ３にマウス新生仔に示した抗体を注射し、Ｐ５に網膜を調製して、増殖のためのイソレクチン又はＫｉ６７マーカーの灌流を視覚化した。パネルIおよびII、バー＝１ｍｍ。パネルIII〜VIは、パネルIおよびIIの一部の拡大を示す。バー＝０．２ｍｍ。 実施例Ｂ(７)に記載のように、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の選択的な抗体遮断が腫瘍脈管形成を破壊し、腫瘍増殖を阻害することを示す。α-ブタクサ(ネガティブコントロール)、α-ＶＥＧＦ又はα-ＮＲＲ１による処理後の時間に対する腫瘍体積(平均＋／−ＳＥＭ)を示す３つの腫瘍異種移植片モデルについてのグラフ。Ｐ値は、α-ブタクサ対α-ＮＲＲ１の比較について示す。(Ａ) Ｃａｌｕ６モデル。(Ｂ) ＨＭ７モデル。(Ｃ) α-ＮＲＲ１の用量力価とＨＭ７モデル。(Ｄ) (Ａ)に示すＣａｌｕ６モデルからの代表的な腫瘍切片における内皮細胞染色。異種移植片モデルに使用する抗体を上に示す。ＤＡＰＩ及びα-ＣＤ３１を用いて、それぞれＤＮＡ及び内皮細胞を染色した。パネルの下列は合併した画像を示す。バー＝５０μｍ。(Ｅ) (Ｄ)に示すＣＤ３１染色の定量化。(Ｄ)に示すのと同様な画像においてＣＤ３１及びＤＡＰＩ染色を定量化するためにＩｍａｇｅＪを使用して、相対的なＣＤ３１染色(ＤＡＰＩ染色に正規化したＣＤ３１染色)を、値を１とするα-ブタクサコントロールと比較して３つそれぞれの抗体処理についてグラフにした。データは、８つの画像についての平均±標準偏差を表す。 実施例Ｂ(８)に記載のように、Ｎｏｔｃｈ１の選択的な抗体遮断が小腸の細胞運命を変えるために十分であることを示す。(Ａ) 時間に対する総体重変化(平均＋／−標準偏差)。図１１について記載したように、マウスは、抗ｇＤアイソタイプコントロール、ＬＴ Ｒ−Ｆｃ、抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２にて処置した。矢印は投薬の日を示す。(Ｂ) 小腸の免疫組織化学分析。マウスは、０、２および６日目に示した濃度の抗ｇＤアイソタイプコントロール、ＤＢＺ又は抗ＮＲＲ１にて処置し、７日目に小腸を免疫組織化学分析のために調製した。各列に示すように、ヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)、ムチンと分泌杯状細胞を標識するためのアルシアンブルー、パネート細胞を標識するためのリゾチーム、増殖のためのＫｉ-６７、およびＮｏｔｃｈ下流の標的としてのＨｅｓ１についての染色を示す。７日目の大腸と、２日目の小腸の分析については図１９および２０を参照のこと。バー＝４０μｍ。(Ｃ) 小腸細胞分化に対するＮｏｔｃｈ１−とＮｏｔｃｈ２−の特異的阻害の比較。(Ａ)に記載の試験の小腸を、示すようにα-ｇＤ、α-ＮＲＲ１又はα-ＮＲＲ２の最終投与の１日後にアルシアンブルーおよびＫｉ-６７のために調製した。バー＝５０μｍ。 実施例Ｂ(２)に記載のように、抗ＮＲＲ１は、複数のリガンドによって誘導されるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の強力なインヒビターであることを示す。示すようにリガンド発現細胞がＪａｇ１、Ｊａｇ２又はＤｌｌ１を発現したことを除いて、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の共培養アッセイを図１０Ａに記載のように実施した。 実施例Ｂ(５)に記載のように、低収率のＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ／Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲキメラタンパク質コンストラクトを示す。この表は図１２Ａを補足するものであり、分泌アルカリホスファターゼ活性をほとんど又はまったく生じさせないＮＲＲキメラタンパク質を挙げる。これは、キメラが誤って折り畳まれた（ミスホールド）か又は不安定であることを示唆する。弱いが検出可能なアルカリホスファターゼ活性を生じさせる断片について、α-ＮＲＲ１又はα-ＮＲＲ２の結合をまとめる。---、試験できない発現および結合；Ｎ、発現又は結合なし；Ｗ、弱い発現又は結合。 実施例Ｂ(１)およびＢ(５)に記載のように、抗ＮＲＲ１が接触するＮＲＲ１残基の保存を示す。ヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲドメイン(配列番号：２６)、マウスＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲドメイン(配列番号：２７)、ヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲドメイン(配列番号：２８)およびマウスＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲドメイン(配列番号：２９)のアミノ酸配列アライメント。サブドメインの境界を右に示す。ヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲは参照配列として挙げ、ヒトＮｏｔｃｈ１の残基と同一である他のＮＲＲ配列内の残基を太字で示す。実線対残基が埋没される増加した程度を反映している点線については、少なくとも２５％、抗ＮＲＲ１−Ｆａｂ／Ｎｏｔｃｈ１−ＮＲＲ構造(図１２)に少なくとも２５％埋没される残基の外形を描き、残基が埋没される程度の増加に応じて破線から実線で示す。ヒトＮｏｔｃｈ１配列に少なくとも２５％埋没される２１のアミノ酸のうち、２１すべてがマウスＮｏｔｃｈ１配列において同一であるが、６つだけは、ヒトおよびマウスのＮｏｔｃｈ２配列において同一である(ヒトＮｏｔｃｈ１ Ｓ１７１２のＳの代わりに７番目に保存的な相違も含め)。Ｎｏｔｃｈ２配列内のこれらの同一かつ「埋没された」残基はいずれも、７５％より多く埋没したクラスにはない。この配列比較は、(ａ)ヒトおよびマウスのＮｏｔｃｈ１への強い抗ＮＲＲ１結合(ほぼ等しい親和性)と、(ｂ)ヒトおよびマウスのＮｏｔｃｈ２への抗ＮＲＲ１結合の欠如と一致している。さらに、埋没した残基すべてはＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ-ＢおよびＨＤ−Ｃ内にあり、図１１Ａ及び１７に示すドメインｓｗａｐ実験と一致している。 実施例Ｂ(８)に記載のように、Ｎｏｔｃｈ１の選択的な抗体遮断が大腸の細胞運命を変えるために十分であることを示す。図１５Ｂに記載の実験から７日目に採取した大腸試料の組織病理学的分析。 実施例Ｂ(８)に記載のように、腸管細胞の運命変化がＮｏｔｃｈ１を遮断した２日後に生じることを示す。７日目に採取した試料を示す図１５Ｂに記載の実験から２日目に採取した小腸試料の組織病理学的分析。 実施例Ｂ(２)に記載のように、抗ＮＲＲ１はインビトロのＮｏｔｃｈ２誘導性シグナル伝達を遮断しないことを示す。図１０Ｂに記載のように、Ｕ８７ＭＧ細胞の共培養アッセイ。抗ＮＲＲ１はインビトロ(図１０Ａ)及びインビボ(図１１Ａ−Ｃ)のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を阻害するが、ＩＣ５０を１００倍上回る濃度(１０００ｎｇ／ｍｌ)で用いた場合でさえ、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達には作用しない。この結果は、抗ＮＲＲ１のＮｏｔｃｈ１への特異的結合(図９及び１２)並びにインビボでのＮｏｔｃｈ２の抗ＮＲＲ１阻害の欠如(図１１Ｄ) と一致している。 実施例Ｂ８に記載のように、腸管細胞の分化に対する抗ＮＲＲ１及び抗ＮＲＲ２の潜在的相乗的作用を示す。 実施例Ｂ(９)に記載のように、デキサメサゾンが抗ＮＲＲ１によって生じる腸管の表現型を少なくとも部分的にレスキューすることを示す。 Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の選択的な遮断がｐａｎ−Ｎｏｔｃｈ阻害と関係する杯状細胞異形成を最小化するかまたは回避するのに対して、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２の遮断により深刻な杯状細胞異形成が引き起こされる。(Ａ) 実施例Ｂ８に記載のように、マウスに、５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１、抗ＮＲＲ２又はその両方又はネガティブコントロール抗体抗ｇＤを、矢印で示した日に投与した。時間に対する総体重変化(平均＋／−標準偏差)を示す。(Ｂ) 分泌杯状細胞を標識するためのムチンのためのアルシアンブルーを用いた、(Ａ)のように処置したマウスの小腸の免疫組織化学分析。 実施例Ｂ(１０)に記載のように、抗ＮＲＲ２(「抗Ｎ２」と称する)はインビトロのヒトメラノーマ細胞株ＳＫ２３およびＬＯＸ−ＩＭＶＩの増殖を阻害することを示す。 ５つのびまん性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)細胞株(右に一覧を示す)に対する抗ＮＲＲ２(「抗Ｎｏｔｃｈ２」と称する)の効果を示す。実施例Ｂ(１１)に記載のように、細胞株のうちの１つ（「ＤＢ」）の増殖は、抗ＮＲＲ２による処置によって強く阻害された。 実施例Ｂ(１１)に記載のように、経時的なＤＢ ＤＬＢＣＬ細胞株の増殖に対する抗ＮＲＲ２(「抗Ｎｏｔｃｈ２」と称する)の効果を示す。
（本発明の実施態様の詳細な説明）
本発明は、Ｎｏｔｃｈに結合する単離された抗体、および例えばＮｏｔｃｈの発現又は活性と関連する疾患の診断又は治療のための同抗体の使用方法を提供する。
Ｉ．一般的な技術
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に、十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；及び、Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)。
ＩＩ．定義
本出願を理解するために、以下の定義を適用し、必要な場合はいつでも、単数で使用した用語には複数形も含まれ、その逆もそうである。以下に示すいずれかの定義が出典明記によって本明細書中に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下の定義を調節してよい。
本明細書中の「抗体」は最も広義に用いられ、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２のインタクトな抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を表す限りにおける抗体断片を包含する。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、タンパク質は、(１)例えばローリー法で測定した場合９５％を超える抗体、ある実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで十分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
「抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体」又は「Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合することができ、Ｎｏｔｃｈ１を標的とする診断及び／又は治療上の薬剤として有用である抗体を指す。好ましくは、関係のないＮｏｔｃｈ以外のタンパク質に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、異なる種、例えば齧歯動物(マウス、ラット)および霊長類のＮｏｔｃｈ間で保存されるＮｏｔｃｈのエピトープに結合する。
「抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体」又は「Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲを結合することができ、Ｎｏｔｃｈ２を標的とする診断及び／又は治療上の薬剤として有用である抗体を指す。好ましくは、関係のないＮｏｔｃｈ以外のタンパク質に対する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、異なる種、例えば齧歯動物(マウス、ラット)および霊長類のＮｏｔｃｈ間で保存されるＮｏｔｃｈのエピトープに結合する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＨＶＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣへの抗体の関与を示す。
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)(W.B. Saunders, Co., 2000)に概説されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された融合大分子の一部であり得る。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ほぼインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
本明細書中の「ネイキッド抗体」は、細胞障害性部分又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来している、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えばJones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また例としてVaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；米国特許第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号も参照のこと。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)において記述される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ カバット ＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
カバット番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基を指す場合に用いられる(軽鎖のおよそ残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３)(例えばKabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、イムノグロブリン重鎖定常領域を指す場合に用いられる(例えば上掲のKabat et al.において報告されたＥＵインデックス)。「カバットにおけるＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けする残基を意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する(例えば、米国特許出願２００８／０１８１８８８Ａ１のＥＵ番号付けに関する図を参照のこと)。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られているある手順を用いて生産されてよい。例えば、Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、例としてBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「ブロック(遮断)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。あるブロック抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的ないしは完全に阻害する。
本明細書中で用いる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を部分的ないし完全に模倣する抗体である。
「増殖阻害性」抗体は、抗体が結合する抗原を発現している細胞の増殖を妨げるか又は低減するものである。例えば、抗体は、インビトロおよび／またはインビボの癌細胞の増殖を妨げる又は低減しうる。
「アポトーシスを誘発する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス性本体と呼ばれる)といった、標準的なアポトーシスアッセイにより決定される、プログラムされた細胞死を誘発するものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中の定義に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の配列同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)を結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 例としてRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。今後同定されるものも含め、他のＦｃＲも本明細書中の「ＦｃＲ」なる用語に包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)：国際公開２００４／９２２１９(Hinton et al.)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号又は同第６７３７０５６号(Presta)に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更して(変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド)Ｃ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、例として米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合を包含しうる。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に結合親和性を測定するための具体的な例示的実施態様を記載する。
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで示されるような、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する(例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをTopcountＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる用語は、当業者が２つの数値(例えば、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較値の例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
ここで用いる「実質的に低減する」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」又は「ヒトアクセプターフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。ある実施態様では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみ起こり、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａであってよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、上掲のKabat等によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、上掲のKabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、上掲のKabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、上掲のKabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ヒトアクセプターフレームワークはＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークに由来し、以下の配列：(配列番号：５０)−Ｈ１−(配列番号：５１)−Ｈ２−(配列番号：５７又は５９)−Ｈ３−(配列番号：３５)の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、配列番号：３５の最後の残基(Ｓ１１)はアラニンに置換されている。
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、上掲のKabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列：(配列番号：６０)−Ｌ１−(配列番号：６１)−Ｌ２−(配列番号：６２)−Ｌ３−(配列番号：６３)の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
「精製」とは、分子が、含まれる試料中の重量にして少なくとも９５％、又は重量にして少なくとも９８％の濃度で試料中に存在することを意味する。
「単離された」核酸分子は、例えば天然の環境に通常付随している少なくとも一の他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子を通常発現するが、その核酸分子がその天然の染色体位置と異なる染色体位置にあるか又は染色体外に存在する、細胞に含まれる核酸分子を含む。
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二本鎖ＤＮＡを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後になされる修飾(一又は複数)、例えば標識との結合を含みうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
本明細書において使われるように、特に明記しない限り、「Ｎｏｔｃｈ」なる用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物の供与源由来の任意の天然のＮｏｔｃｈ(Ｎｏｔｃｈ１−４)を指す。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＮｏｔｃｈ並びに細胞内のプロセシングから生じるＮｏｔｃｈの任意の形態を包含する。また、この用語は、Ｎｏｔｃｈの天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
本明細書において使われるように、特に明記しない限り、「Ｎｏｔｃｈ１」なる用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物の供与源由来の任意の天然のＮｏｔｃｈ１を指す。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＮｏｔｃｈ１並びに細胞内のプロセシングから生じるＮｏｔｃｈ１の任意の形態を包含する。また、この用語は、Ｎｏｔｃｈ１の天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
本明細書において使われるように、特に明記しない限り、「Ｎｏｔｃｈ２」なる用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物の供与源由来の任意の天然のＮｏｔｃｈ２を指す。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＮｏｔｃｈ２並びに細胞内のプロセシングから生じるＮｏｔｃｈ２の任意の形態を包含する。また、この用語は、Ｎｏｔｃｈ２の天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
「Ｎｏｔｃｈ２活性」なる用語はＮｏｔｃｈ２シグナル伝達を指す。「Ｎｏｔｃｈ２活性を阻害する」薬剤(例えば抗体)は、実質的に同一の条件下で適切なコントロールにおいて観察されるＮｏｔｃｈ２シグナル伝達のレベルと比較して、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達を有意に減少する。ある実施態様では、本明細書中実施例Ｂ(２)に記載のように、Ｎｏｔｃｈ２活性は適切なレポーターアッセイによって評価されてよい。ある実施態様では、本明細書中実施例Ｂ(４)に記載のように、Ｎｏｔｃｈ２活性は周辺Ｂ領域細胞の生成を測定することによって評価されてよい。ある実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の減少は、コントロールにおいて観察されるレベルの少なくとも２、３、４、５又は１０分の１である。
「Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ」なる用語は、３つのＬＮＲモジュール(ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−ＢおよびＬＮＲ−Ｃ)およびＨＤドメイン(ＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃ)からなるＮｏｔｃｈ２の領域を指す。例示的なヒトおよびマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ配列は、図１８(それぞれ配列番号：２８および２９)に示される。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲは、例えばＳ１でのＮｏｔｃｈ２のプロセシングにより生じる非共有結合断片、並びに単一の近接するポリペプチド配列からなってよい。例として、そして、図１８に示すように、ヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲは、ヒトＮｏｔｃｈ２(配列番号：７５)のアミノ酸１４２２−１６７７、あるいは、配列番号：７５のアミノ酸１６０９−１６７７に非共有的に結合した配列番号：７５のアミノ酸１４２２−１６０８からなってよい。
ここで同定した参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
「疾患」は、本発明の組成物又は方法による治療により利益を得る任意の状態又は症状である。
これには、哺乳動物の問題の疾患の素因になる病的状態を含み、慢性及び急性の疾患が含まれる。本明細書において治療される疾患の非限定的な例は、癌などの状態等である。
「Ｂ細胞新生物」とも称される「Ｂ細胞悪性腫瘍」には、ホジキン病(例えばリンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)；非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；濾胞性中心細胞リンパ腫(ＦＣＣ)；急性リンパ性白血病(ＡＬＬ、Ｂ−ＡＬＬとも称される)；前駆体Ｂ−リンパ芽球性白血病；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ、Ｂ−ＣＬＬとも称される)；ヘアリー細胞白血病；周辺帯Ｂ細胞リンパ腫(結節性、ＭＡＬＴおよび脾臓タイプを含む)；多発性骨髄腫(形質細胞腫、プラズマ細胞骨髄腫)；小さい非切れ込み型細胞リンパ腫(例えばバーキットリンパ腫)；大細胞リンパ腫(びまん性大細胞(Ｂ細胞)、びまん性混合細胞および免疫芽球性リンパ腫を含む)；マントル細胞リンパ腫；小リンパ球性リンパ腫；ＡＩＤＳ関連のリンパ腫およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれるがこれらに限定されない。緩徐進行性リンパ腫は遅生育の不治の疾患であり、平均的な患者は多くの寛解と再燃の期間を経て６〜１０年生き延びる。悪性のリンパ腫は、高悪性度及びいくつかの分類の中悪性度のＮＨＬを含む、即育型のリンパ腫である。
「メラノーマ」なる用語は、初めに皮膚に見られるが、眼(ブドウ膜メラノーマ)又は腸にも見られるメラニン細胞の悪性腫瘍を指す。
ここで使用されるところの「治療」(及び「処置」又は「治療する」などの変形句)は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるため又は疾患又は疾病の進行をゆっくりにするために用いられる。
「個体」、「被検体」又は「患者」は脊椎動物である。ある実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。ある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「薬学的製剤」なる用語は、有効である活性成分の生物学的活性を許容するような形態で存在し、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性がある他の成分を含まない調製物を指す。このような製剤は無菌であってよい。
「無菌の」製剤は、防腐性であるか、又は生きているすべての微生物およびそれらの胞子を含まない。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回る量を包含する。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死ないしは破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な作用を有することができる任意の物質である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばNicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)；ＣＤＰ３２３、経口α-４インテグリンインヒビター；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(ＤＯＸＩＬ(登録商標))、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、テガフール(ＵＦＴＯＲＡＬ(登録商標))、カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))、エポチロン及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)およびドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ薬剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン(例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標))及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))およびビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えばベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロネート(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロネート(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ))；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリホシン、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；ティピファニブ(Ｒ１１５７７)；オラフェニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２インヒビター、例えばオブリメルセンナトリウム(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲインヒビター(以降の定義を参照)；チロシンキナーゼインヒビター(以降の定義を参照)；セリン−スレオニンキナーゼインヒビター、例えばラパマイシン(シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標))；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、例えばロナファーニブ(ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ)；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
本明細書において定義される化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、遮断又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌療法」が含まれる。これらは、ホルモン類そのもの、例として、混合アゴニスト／アンタゴニスト特性を有する抗卵胞ホルモン、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標))、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(FARESTON(登録商標))、イドキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、ラロキシフェン(EVISTA(登録商標))、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及び選択的なエストロゲンレセプター修飾因子(SERM)、例えばＳＥＲＭ３、アゴニスト特性のない純粋な抗卵胞ホルモン、例えばフルベストラント(FASLODEX(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲンレセプター(ＥＲ)二量体化を遮断、ＤＮＡ結合を阻害、ＥＲ代謝回転を増加、及び／又は、ＥＲレベルを抑制してもよい)、アロマターゼ阻害剤、例としてステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばホルメスタン及びエキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、及び非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール(anastrazole)(ARIMIDEX(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))及びアミノグルテチミド、及び他のアロマターゼ阻害剤、例としてボロゾール(RIVISOR(登録商標))、メゲストロールアセテート(MEGASE(登録商標))、ファドロゾール及び４の(５)-イミダゾール、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン及びトリプトレリン(tripterelin)、性ステロイド、例としてプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、すべてのトランスレチノイン酸及びフェンレチニド、オナプリストン、抗プロゲステロン、エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)、抗アンドロゲン物質、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド）、及び、上記いずれかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体、並びに上記の２以上の組み合わせを含むが、これらに限定するものではない。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞(例えばＮｏｔｃｈを発現する細胞)の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞(例えばＮｏｔｃｈを発現する細胞)の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、例えば１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
ＩＩＩ．組成物および方法
本発明は、Ｎｏｔｃｈ結合薬剤、例えば抗体ないしその断片の同定にある程度基づく。特定の実施態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ２ネガティブ制御領域(ＮＲＲ)結合剤、例えばＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ及びその断片を結合する単離された抗体に関する。このような抗体は、例えば、Ｎｏｔｃｈ２の発現および／または活性(例えば発現又は活性の増加)と関係する疾患の診断又は治療に有用である。特定の実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、癌、例えばＢ細胞悪性腫瘍およびメラノーマの診断又は治療に有用である。したがって、本発明は、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ結合に関連した方法、組成物、キットおよび製造品を提供する。
Ａ．抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体
１．例示的なファージライブラリ由来の抗体
実施例Ｂに記載のように、ファージライブラリから得られた例示的なモノクローナル抗体は、本明細書において提供される。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する「抗体Ｄ」と称する抗体を単離した。その抗体は、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３と称する抗体を生成するために親和性成熟した。抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３の重鎖及び軽鎖の高頻度可変領域(ＨＶＲ)は、図１および２に示す。抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３の重鎖および軽鎖の可変ドメインの配列は、図３および４に示す。さらに、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の実施態様は以下の通りに提供する。
一態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、
(a) 配列番号：３のコンセンサス配列と一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(d) 配列番号：１０のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(e) 配列番号：１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び、
(f) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６のＨＶＲを含む抗体が提供される。
更なる態様では、抗体は、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、上記の(ａ)、(ｂ)、(ｄ)、(ｅ)および(ｆ)から選択される少なくとも１、２、３、４又は５のＨＶＲとを含む。更なる態様では、抗体は上記の(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)および(ｆ)を含む。(ａ)、(ｄ)、(ｅ)および(ｆ)について、以下の何れか一又は複数の実施態様が考慮される。ＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号：１−２から選択されるアミノ酸配列を含む。ＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号：６−９から選択されるアミノ酸配列を含む。ＨＶＲ-Ｌ２は、配列番号：１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含む。そして、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号：１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、配列番号：３のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２および配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３を含む抗体が提供される。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号：１−２から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、配列番号：１０のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、配列番号：１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含む抗体が提供される。以下の実施態様は何れかの組み合わせて考慮される。ＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号：６−９から選択されるアミノ酸配列を含む。ＨＶＲ-Ｌ２は、配列番号：１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含む。そして、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号：１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含む。他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含む。他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含む。他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含む。
一実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、
(a) 配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(d) 配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(e) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(f) 配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む抗体が提供される。
他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、
(a) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(d) 配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(e) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(f) 配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む抗体が提供される。
他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、
(a) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(d) 配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(e) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(f) 配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む抗体が提供される。
他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、
(a) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(d) 配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(f) 配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む抗体が提供される。
ある実施態様では、上記何れかの抗体は、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークおよびＶＬサブグループIコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも一のフレームワークをさらに含む。
ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は親和性成熟している。例えば、示したＨＶＲ位置(カバット番号による)内に以下の何れか一又は複数の置換が何れかの組合せでなされていてよい。
- ＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：１)において：Ｓ２８Ｔ；Ｔ３０Ｓ；
- ＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：６)において：Ｓ２８Ｎ；Ｉ２９Ｎ又はＶ；Ｓ３０Ｒ又はＫ；Ｓ３１Ｒ；Ｙ３２Ｆ
- ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：１１)において：Ｇ５０Ｒ；Ｓ５３Ｉ又はＴ；Ａ５５Ｅ
- ＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１５)において：Ｓ９３Ｉ又はＲ；Ｌ９６Ｗ又はＨ
本明細書中に開示する特定の抗体、すなわち抗体Ｄ並びに抗体Ｄの親和性成熟した形態(Ｄ-１、Ｄ-２及びＤ-３)は、更に親和性成熟されてもよい。したがって、本明細書中に記載の何れかの抗体の親和性成熟形態が提供される。
ある実施態様では、上記何れかのＨＶＲ配列を有する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲへの結合活性が実質的に維持されているならば、任意の好適なフレームワーク可変ドメイン配列を更に含んでよい。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、図５Ａ及びＢに示すいずれかのＶＨコンセンサスフレームワーク配列のような、ヒトの可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク配列を含む。一実施態様では、ＶＨコンセンサスフレームワーク配列は、例えば図５Ａ及びＢに示す、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。他の実施態様では、ＶＨコンセンサスフレームワーク配列は、例えば図５ＡおよびＢに示す、「アクセプター２」フレームワーク配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨフレームワークコンセンサス配列はアクセプター２Ｂ又はアクセプター２ＤのＦＲ１−ＦＲ４を含み、このときＦＲ４は配列番号：３５(図５Ａおよび５Ｂ)を含み、この配列番号：３５の最後の残基(Ｓ１１)が場合によってアラニンに置換されている。さらに特定の実施態様では、ＶＨフレームワークコンセンサス配列は、配列番号：５０；５１；５７又は５９；及び３５の配列を含み、このとき配列番号：３５のＳ１１は場合によってアラニンに置換されている。
ある実施態様では、上記何れかのＨＶＲ配列を有する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、図６Ａおよび６Ｂに示す、ヒト可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク配列を更に含んでよい。一実施態様では、ＶＬコンセンサスフレームワーク配列は、例えば図６Ａおよび６Ｂに示す、ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(κｖ１)配列を含む。他の実施態様では、ＶＬフレームワークコンセンサス配列は、図７又は８に示すように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８のＦＲ１−ＦＲ４を含む。特定の実施態様では、ＶＬフレームワークコンセンサス配列は、配列番号：６０、６１、６２および６３の配列を含む。
他の態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、配列番号：２０−２１から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換(例えば保存的置換)、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：２０−２１から選択されるアミノ酸配列において合計１〜１０のアミノ酸が、置換、挿入および／または欠失していた。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で(すなわちＦＲで)起こる。特定の実施態様では、ＶＨは、(a) 配列番号：３のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１、(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２、および(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。そのような実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号：１−２から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合する抗体であって、配列番号：２２−２５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む抗体が提供される。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換(例えば保存的置換)、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：２２−２５から選択されるアミノ酸配列において合計１〜１０のアミノ酸が、置換、挿入および／または欠失していた。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で(すなわちＦＲで)起こる。特定の実施態様では、ＶＬは、(a) 配列番号：１０のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１４のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。そのような実施態様では、ＶＬは、(a) 配列番号：６−９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。そのような実施態様では、ＶＬは、(a) 配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。他の実施態様では、ＶＬは、(a) 配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。他の実施態様では、ＶＬは、(a) 配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。他の実施態様では、ＶＬは、(a) 配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
上記の変異ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失がＨＶＲ内で起こってもよい。このような実施態様では、前記の変更が抗原を結合するための抗体の能力を実質的に低減しない限り、置換、挿入又は欠失は一又は複数のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合能を実質的に低減しない保存的な変更は、ＨＶＲ内になされてもよい。場合によって、ＨＶＲ内の変更は、実際のところ抗体親和性を向上させてもよい。このような変更は、抗体親和性を増やすために、ＨＶＲ「ホットスポット」(すなわち体細胞の成熟過程の間に高頻度で突然変異を起こすコドンによってコードされる残基)内になされてもよい。(例としてChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008を参照)。上記の変異ＶＨおよびＶＬ配列の特定の実施態様では、各々のＨＶＲは、保存されている(不変である)か、又は単一のアミノ酸の置換、挿入又は欠失のみを含有する。
他の態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲを特異的に結合する抗体であって、上記に示すいずれかの実施態様のＶＨと、上記に示すいずれかの実施態様のＶＬとを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨと、配列番号：２２のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＬとを含む。そのような実施態様では、ＶＨは、(a) 配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１、(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２、および(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含み、ＶＬは、(a) 配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲを特異的に結合する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨと、配列番号：２３−２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＬとを含む。そのような実施態様では、ＶＨは、(a) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１、(b) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２、および(c) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含み、ＶＬは、(a) 配列番号：７−９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２、および(c) 配列番号：１６−１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号：２３−２５から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
ある実施態様では、上記何れかの抗体の親和性成熟した形態が提供される。更なる実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲを特異的に結合する組み換えタンパク質であって、上記何れかの抗体の抗原結合部位(一又は複数)を含む組み換えタンパク質が提供される。そのような実施態様では、組み換えタンパク質は、上記何れかの一又は複数のＨＶＲを含む。
ある実施態様では、上記何れかの抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。一実施態様では、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。一実施態様では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。一実施態様では、宿主細胞は真核生物のものである。一実施態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。一実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の製造方法であって、抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に適する条件下で宿主細胞を培養し、抗体を単離することを含む方法が提供される。
２．他の例示的な抗体
一実施態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ２活性を阻害する単離された抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を提供する。例えば、本発明の抗体は、任意の生物学上関連するＮｏｔｃｈ２シグナル伝達経路の破壊を含むＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の一又は複数の態様を調整しうる。
さらなる態様では、本発明は、１００ｎＭ以下のＫｄでＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲを結合する単離された抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を提供する。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下のＫｄでＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲを結合する。本明細書中の実施例に記載のように、例示的なファージ抗体Ｄ-３は５ｎＭのＫｄで結合する。当分野で十分に確立されているので、リガンドのそのレセプターに対する結合親和性は様々なアッセイの何れかを用いて決定され、様々な定量的値で表されうる。したがって、一実施態様では、結合親和性は、Ｋｄ値として表され、(例えば、結合力効果を最小限にすることによって)内因性の結合親和性を反映する。一般に、そして、好ましくは、無細胞又は細胞関連のいずれの環境であっても、結合親和性はインビトロで測定される。例えばＢｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)およびＥＬＩＳＡを含め、本明細書中に記載のものを含め、当分野で公知の多くのアッセイの何れかを用いて、結合親和性測定値を得ることができる。
他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する単離された抗体であって、Ｎｏｔｃｈ２以外のＮｏｔｃｈファミリメンバー(すなわち哺乳動物のＮｏｔｃｈ１、３および４)とは有意に結合しない抗体が提供される。このような抗体は、実施例Ｂ(１)に示すアッセイを使用して同定されてよい。一実施態様では、抗体は、ヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲと、少なくとも一つの他の非ヒト種、例えばマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する。
他の実施態様では、抗本明細書中に示す抗体と同じエピトープに結合する単離された抗体が提供される。一実施態様では、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３から選択した抗体と同じエピトープに結合する単離された抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体が提供される。他の実施態様では、本発明は、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３から選択される抗体と競合する抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を提供する。他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２のＬＮＲ−ＡドメインおよびＨＤ−Ｃドメインから選択される少なくとも一つのドメインに結合する単離された抗体が提供される。そのような実施態様では、抗体は、ＬＮＲ−ＡドメインおよびＨＤ−Ｃドメインの両方に結合する。他の実施態様では、抗体は、さらにＬＮＲ-Ｂおよび／またはＨＤ−Ｎドメインに結合する。これらのドメインは図１８に記載する。
抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の前記実施態様は、単独で、または何れかの組合せで存在してもよい。さらに、本明細書に記載の何れかの抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、以下の形質の何れか一又は複数を保持してよい。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２断片から選択される抗体断片である。他の実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、ヒト化、ヒト又はキメラの抗体である。
３．抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素的消化によって、あるいは組換え法によって生産することができる。ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さなサイズの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。ある種の抗体断片の概説については、Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照のこと。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。ある実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されうる。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
４．ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を含む。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が従来技術に既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、一般に「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は、基本的にヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature, 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基が、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖いずれも、抗原性を減らすために重要である。いわゆる「最良に適合する(ベストフィット)」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。ついで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(例としてSims等(1993)J. Immunol. 151:2296；Chothia等(1987)J. Mol. Biol. 196:901を参照)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用することができる。例としてCarter等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta等(1993)J. Immunol., 151:2623を参照。
更には、抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが一般に好ましい。この目的を達成するために、一方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の、ありそうな三次元立体配置的構造を図解し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンの、その抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このように、レシピエント及び重要な配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的とする抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原の結合に対する影響に、直接的に且つ最も実質的に関わっている。
５．ヒト抗体
本発明のヒト抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)に記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の投与によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)；Bruggermann等, Year in Immunol., 7: 33 (1993)を参照のこと。
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖パートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照）。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
６．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施態様では、結合特異性の一つはＮｏｔｃｈ２に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、Ｎｏｔｃｈ２の２つの異なるエピトープに結合しうる。ある実施態様では、二重特異性抗体はＮｏｔｃｈ２を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＮｏｔｃｈ２結合アーム及び細胞傷害剤、例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテンと結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある実施態様では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させる。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合しうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)への用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製できる。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合するだけでなく、ヒト乳房腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片の製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。ある実施態様では、二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオでは、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ある実施態様では、多価抗体は３から約８の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。かかる一実施態様では、多価抗体は４つの抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(例えば２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ-ＣＨ１-可動性リンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここでの多価抗体は、少なくとも２つ(例えば４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここでの多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。ここで考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によってはＣＬドメインを更に含む。
８．単一ドメイン抗体
ある実施態様では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体(Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。一実施態様では、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
９．抗体変異体
ある実施態様では、ここに記載された抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列中に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に開示されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増加又は減少させるために改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いることができる。
抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)の一又は複数が作製され又は取り除かれるように変化させることによって簡便に達成される。該変化はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、欠失、又は置換によってなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変更してもよい。哺乳動物細胞によって生産される天然の抗体は典型的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般に結合させられる分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright等 (1997) TIBTECH 15:26-32を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム部」としてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含みうる。ある実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾を、ある種の改善された性質を有する抗体を作り出すためになしてもよい。
例えば、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する抗体変異体が提供される。かかる変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号 (Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業）を参照のこと。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体変異体に関する文献の例には以下のものが含まれる：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコシル化欠損Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願番号２００３／０１５７１０８号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８，ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号)などがある。
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。かかる抗体変異体は低減したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。かかる抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）；米国特許第６６０２６８４号（Umana等）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana等）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体もまた提供される。かかる抗体変異体は、例えば国際公開第９７／３００８７号（Patel等）；国際公開第９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを更に改善する一又は複数のアミン酸置換を含むＦｃ領域を含み、例えばＦｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥｕ番号付け）の置換である。かかる置換は上述の変異の何れかとの組合せで起こりうる。
ある実施態様では、本発明は、これをインビボでの抗体の半減期が重要であるがある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）が不必要であるか有害である多くの用途のための望ましい候補にする、エフェクター機能の全てではないが幾らかを有する抗体変異体を考慮する。ある実施態様では、所望の性質のみが維持されるようにする抗体のＦｃ活性が測定される。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認できる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（よってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞のＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現がRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３にまとめられている。興味ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及び Hellstrom, I 等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５８２１３３７号(Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えばフローサイトメトリーのためのACTITM非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ (Promega, Madison, WI)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、興味ある分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えばClynes等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されているもののような動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイをまた実施して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S.及びM.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定はまた当該分野で知られている方法を使用して実施することもできる(例えばPetkova, S.B. 等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
一又は複数のアミノ酸置換を有する他の抗体が提供される。置換突然変異について関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。「例示的置換」と名前を付けたより実質的な変化が表１に提供され、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載される。アミノ酸置換を、興味有る抗体中に導入し、例えば所望される活性、例えば改善された抗原結合性、免疫原性の低減、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ等について生成物をスクリーニングできる。
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抗体の生物学的性質における修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより達成されうる。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
（１）無極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このような置換された残基も、保存的置換部位か、更に好ましくは残存する(非保存的)部位に、導入することができる。
一つの種類の置換による変異体は、親抗体(例えばヒト化抗体又はヒト抗体)の一以上の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる開発用に選択される得られた変異体は、それらが生産された親抗体に対して変更された（例えば改善された）生物学的特性を有しているであろう。例示的な置換変異体は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟法を使用して簡便に生産されうる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６〜７の部位)を変異させることにより、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物)の少なくとも一部への融合物として、糸状のファージ粒子から表示される。ついで、ファージディスプレイされた変異体は、その生物的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、系統的変異導入法(例えばアラニンスキャニング)を行って、抗原結合に有意に貢献する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又は付加的に、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することにより、抗体と抗原との接触点を同定することが有効である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに説明するものを含む当該分野で知られている技術による置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されたら、ここに記載のものを含む当該分野で知られている技術を用いて変異体パネルのスクリーニングを行い、更なる開発のために一又は複数の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一以上のアミノ酸位置に一のアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域)を含みうる。
本明細書及び従来技術の教示によれば、ある実施態様では、本発明の抗体は、対応する野生型の抗体と比較した場合、例えばＦｃ領域内に、一又は複数の変更を有すると考えられる。それでも、これらの抗体は、その野生型の同等物と比較した場合、治療的有効性に必要なほぼ同一の特性を保持している。例えば、国際公開第９９／５１６４２号等に記載されているように、Ｆｃ領域に、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)に変化(つまり効果の改善又は低減)をもたらす特定の変更を実施することが考慮される。Ｆｃ領域の変異体の他の例に関し、Ducan及びWinter, Nature 322:738-40 (1998)；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。国際公開第００／４２０７２号(Presta)及び国際公開第ＷＯ ２００４／０５６３１２号(Lowman)はFcRへの結合が改善された又は低減された抗体変異体を記載している。これらの特許文献の内容は出典明示により特にここに援用される。またShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。増加した半減期と新生児型Fcレセプター(FcRn)への結合が改善された抗体は、母体IgGsの胎児への移動の原因であるが(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号(Hinton等)に記載されている。これらの抗体はＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。変更されたＦｃ領域アミノ酸と増加又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。この特許文献の内容を出典明示により特にここに援用する。またIdusogie等, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
他の態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を含み、該修飾がヘテロ二量体化を容易にし及び／又は促進するむ抗体を提供する。これらの修飾は、第一のＦｃポリペプチド内に突部を、第二のＦｃポリペプチド内にキャビティを導入することを含み、ここで、第一及び第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するように突部がキャビティに位置させ得る。これらの修飾を有する抗体の生産方法は当該分野で知られており、例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されている。
また他の態様では、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は抗体の接近可能部位で生じる。その残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に位置させられ、ここで更に記載されるように、薬剤部分又はリンカー-薬剤部分のような他の部分に抗体をコンジュゲートさせるために使用されうる。ある実施態様では、次の残基の何れか一又は複数がシステインで置換されうる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。
１０．抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。
Ｂ．抗体作製方法
１．ハイブリドーマベース法
本発明のモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記述され、更に例えばHongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988)； Hammerling等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)、及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)でヒト-ヒトハイブリドーマに関するものた記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができる。更なる方法には、例えばハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生産に関する米国特許第７１８９８２６号に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はVollmers及びBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)並びに Vollmers及びBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
様々な他のハイブリドーマ技術については、例えば、米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；米国特許出願公開第２００６／１８３８８７号（完全なヒト抗体）、米国特許出願公開第２００６／０５９５７５号；米国特許出願公開第２００５／２８７１４９号；米国特許出願公開第２００５／１００５４６号；米国特許出願公開第２００５／０２６２２９号、及び米国特許第７０７８４９２号及び第７１５３５０７号を参照のこと。 ハイブリドーマ法を使用するモノクローナル抗体を製造するための例示的プロトコルは次のように記載されている。一実施態様では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスターを免疫して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を製造するか又は製造できるリンパ球を誘発する。Ｎｏｔｃｈ２又はその断片（例えばＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ）を含んでなるポリペプチドとアジュバント、例えばモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／ジクリノミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)の複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって抗体を動物中に産生させる。Ｎｏｔｃｈ２又はその断片を含んでなるポリペプチドは、当該分野で知られている方法、例えばその幾らかがここに更に記載されている組換え法を使用して調製することができる。免疫化した動物からの血清を抗Ｎｏｔｃｈ２抗体についてアッセイし、追加免疫を場合によっては行う。抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を生産する動物からのリンパ球が単離される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
ついで、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を使用してハイブリドーマ細胞と融合されてハイブリドーマ細胞が形成される。例えば、Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，pp.59-103 (Academic Press，1986)を参照のこと。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高水準の抗体発現を支持し、かつＨＡＴ培地等の培地に感受性のミエローマ細胞を使用することができる。例示的なミエローマ細胞には、限定されないが、マウスミエローマ株、例えばソークインスティチュート細胞分譲センター(Salk Institute Cell Distribution Center)、San Diego，California，USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの、及びアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，Maryland USAから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５細胞等が含まれる。ヒトミエローマ及びマウス−ヒト異種ミエローマ細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
このようにして調製されたハイブリドーマは、例えば非融合の親ミエローマ細胞の成長又は生存を妨げる一又は複数の物質を含む培地のような適切な培地に播種され増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。好ましくは、無血清ハイブリドーマ細胞培養法を用いて、例えばEven等, Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)に記載されているように、仔ウシ血清のような動物由来血清の使用を減じる。
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてオリゴペプチドがFranek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)に記載されている。すなわち、標準培養培地にある種のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）を富ませ、又はタンパク加水分解産物画分を富ませ、３から６のアミノ酸残基からなる合成オリゴヌクレオチドによってアポトーシスを有意に抑制することができる。ペプチドはミリモル以上の濃度で存在する。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地について、Ｎｏｔｃｈ２に結合するモノクローナル抗体の生産をアッセイできる。ハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイにより測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード分析により決定することができる。例えば、Munson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)を参照のこと。
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンが制限希釈法によりサブクローニングされ、標準的方法で増殖されうる。例えば上掲のGodingを参照。この目的のために好適な培養培地は、例えばＤ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖されうる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、又は血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィー等の慣用の免疫グロブリン精製方法により好適に分離される。ハイブリドーマ細胞からのタンパク質の単離のための一手順は米国特許出願公開第２００５／１７６１２２号及び米国特許第６９１９４３６号に記載されている。該方法は、結合法においてリオトロピックな塩のような最小の塩を用いること、また好ましくは溶離法において少量の有機溶媒を用いることを含む。
２．ライブラリースクリーニング方法
本発明の抗体は、所望の活性又は活性群を持つ抗体をスクリーニングするためにコンビナトリアルライブラリーを使用することによって作製されうる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望される結合特性を有する抗体のためにかかるライブラリーをスクリーニングするために様々な方法が知られている。かかる方法は一般にHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)に記載されている。例えば、興味ある抗体を生産する一方法は、Lee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されたファージ抗体ライブラリーを使用することによる。
原理的には、合成クローンが、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を表示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。かかるファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティクロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合可能なＦｖ断片を発現するクローンを抗原に吸着させ、よってライブラリー中の非結合クローンから分離させる。ついで、結合クローンを抗原から溶離させ、抗原吸着／溶離の更なるサイクルによって更に濃縮されうる。本発明の抗体の何れも、興味あるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味あるファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 1-3巻に記載の適切な定常領域（Ｆｃ）配列を用いての完全長抗体クローンの構築によって得ることができる。
ある実施態様では、抗体の抗原結合ドメインは、各一が軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖由来で双方が３つの超可変ループ又は相補鎖決定領域（ＣＤＲｓ）を提示する約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成される。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短く可動性のペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はそれぞれ定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片として、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。ここで使用される場合、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えることができ、これを、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することができる。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対して高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化もせずに、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対するヒト抗体の単一源を提供することが可能である。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードせしめ、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。
ある実施態様では、繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片をディスプレイするのに用いられる。該抗体断片は、例えば、Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のように、ＶＨ及びＶＬドメインが可動性ポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている一本鎖Ｆｖ断片として、あるいは、例えば、Hoogenboom等，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のように、一つの鎖がｐＩＩＩと融合し、他方の鎖が、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上にＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがディスプレイされるようになる細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片として、ディスプレイされうる。
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗Ｎｏｔｃｈ２クローン（例えば抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲクローン）に有利になるように偏ったライブラリーが望ましい場合には、検体をＮｏｔｃｈ２（又はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ）で免疫化して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である循環Ｂ細胞を、ライブラリー構築のために回収する。好ましい実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２免疫化により、Ｎｏｔｃｈ２に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗Ｎｏｔｃｈ２クローンに好ましいヒト抗体遺伝子断片ライブラリーを、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（及び機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウス中で抗Ｎｏｔｃｈ２抗体応答を生じせしめることによって得る。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
抗Ｎｏｔｃｈ２反応性細胞集団の更なる濃縮は、適切なスクリーニング手法を使用してＮｏｔｃｈ２特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、Ｎｏｔｃｈ２アフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識Ｎｏｔｃｈ２への細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって得ることができる。
あるいは、非免疫化ドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの利用によって可能な抗体レパートリーのより良い提示が得られ、またＮｏｔｃｈ２が免疫原性ではない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を利用した抗体ライブラリーの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子構築を取り込むライブラリーに関しては、幹細胞を被検体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。興味ある免疫細胞は、様々な動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、興味ある細胞から回収して増幅する。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望されるＤＮＡは、Orlandi等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることが可能であり、これによって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。該Ｖ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWard等，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた順方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jones等，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、順方向プライマーは、Sastry等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandi等(1989)又はSastry等(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。ある実施態様では、例えば、Marks等，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrum等，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在する全ての入手可能なＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリーの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandi等(1989)に記載のようにＰＣＲプライマー内の一端へタグとして導入することができ、又はClackson等，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグプライマーを用いて更なるＰＣＲ増幅を行う。
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニングされ配列決定され(Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、マッピングがされている(Matsuda等，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせた全ての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされており(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントを、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリーの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂフラグメントが利用される。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、他方はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリーは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリーの大きさが、存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリーは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ −１）の多くの多様な抗体を提供する。
別法として、該レパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニングし、又はClakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲによってアセンブリした後にクローニングすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、可動ペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することに利用することができる。更に他の技術では、「細胞内でのPCRアセンブリ」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
ナイーブライブラリー(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）である可能性があるが、上掲のWinter等(1994)に記載のように二次ライブラリーから構築して再選択することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。更には、一又は複数のＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、より高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟を行うことが可能である。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年３月１４日に公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化ドナーから得られた天然に生じるＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組換えること、及び数回のチェーン・リシャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ又はそれ未満の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
ライブラリーのスクリーニングは当該分野で知られている様々な技術によって達成することができる。例えばＮｏｔｃｈ２（又はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ）を使用して吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用し、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズでの捕獲のためにビオチンにコンジュゲートさせ、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の当該分野の方法において利用することが可能である。
ファージ粒子の少なくとも一部分を吸着剤に結合させるのに適した条件下で、ファージライブラリーの試料を固定化Ｎｏｔｃｈ２と接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法であるＮｏｔｃｈ２抗原競合によって溶出させる。ファージは、１回目の選択で２０〜１０００倍に濃縮することが可能である。更に、この濃縮されたファージを細菌培養液で増殖させ、更なる回の選択に供することが可能である。
選択の効率は、洗浄の間の解離の動力学、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかを含む多くの要因に依存する。速い解離動態(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の利用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動態(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているような長い洗浄と一価ファージディスプレイの利用、及びMarks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低コーティング密度によって促進することが可能である。
親和性に僅かな違いがあったとしても、Ｎｏｔｃｈ２に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異体を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。Ｎｏｔｃｈ２を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。全てのより高い親和性の変異体を保持するため、ファージを、過剰のビオチン化Ｎｏｔｃｈ２とインキュベートすることが可能であるが、Ｎｏｔｃｈ２の標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化Ｎｏｔｃｈ２と共にインキュベーションできる。ついで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い大過剰のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数に基づいて識別することも可能である。
抗Ｎｏｔｃｈ２クローンは活性に基づいて選択されうる。ある実施態様では、本発明はＮｏｔｃｈ２を天然に発現する生きている細胞に結合する抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を提供する。一実施態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ２リガンドとＮｏｔｃｈ２との結合をブロックするが、Ｎｏｔｃｈ２リガンドと第二タンパク質との結合をブロックしない抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を提供する。このような抗Ｎｏｔｃｈ２抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のようなファージライブラリーから抗Ｎｏｔｃｈ２クローンを単離して、場合によって、好適な細菌宿主中で集団を増殖させることによって、ファージクローンの単離した集団を増幅する；（２）ブロック活性及び非ブロック活性がそれぞれ望まれる第二タンパク質とＮｏｔｃｈ２を選択する；（３）固定されたＮｏｔｃｈ２に抗Ｎｏｔｃｈ２ファージクローンを吸着する；（４）過剰の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップするＮｏｔｃｈ２−結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する；そして、（５）工程（４）の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって、選別できる。場合によっては、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、ここに記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、更に濃縮できる。
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし部分長の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができ、このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができることが理解されるであろう。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、ついで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、ここで用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長又は部分長のヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗Ｎｏｔｃｈ２抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体又は断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。このようにして、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
３．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
抗体はまた組換え法を使用して生産することができる。抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、常套的な手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
ａ）シグナル配列成分
本発明の抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
ｂ）複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
ｃ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物を培養することで同定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）を使用することができる。
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）を含む培養培地中で形質転換体を培養することによって同定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用することができる。
あるいは、興味ある抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーと共に形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
ｄ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは一般に宿主生物体によって認識され抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含むであろう。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許出願公開第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、サルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節されうる。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
ｆ）転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、それ自身が腫瘍細胞の破壊において効果を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、循環中でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。また大腸菌中での抗体断片の発現について記載しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照のこと。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにして行うことができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。治療用タンパク質の生産のための酵母及び糸状真菌の使用を検討している概説には、例えばGerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)を参照のこと。
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを持つ抗体の生産を生じるある種の真菌及び酵母株を選択することができる。例えば、Li等., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (ピキア・パストリスにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載)；及び上掲のGerngross等を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞はまた多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ(Lemnaceae)、アルファルファ(M. truncatula)、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳTMを記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞を宿主として使用することができ、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＮＳ０及びＳｐ２／０のようなミエローマ細胞株が含まれる。抗体生産に適したある種の哺乳動物宿主細胞株については、例えば、Yazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268を参照のこと。
宿主細胞を抗体生産のための上述の発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適切に変性された常套的な栄養培地中で培養する。
ｈ）宿主細胞の培養
この発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
ｉ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生産され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生産された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の増殖を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが典型的には好ましい精製工程である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液に、ｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィーを施すことができる。
一般に、研究、試験及び臨床に使用される抗体を調製するための様々な方法は、当該分野で十分に確立されており、上述の方法と一致し、及び／又は対象の特定の抗体に対して当業者が適切と考えるものである。
Ｃ．免疫コンジュゲート
本発明は、また化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの一又は複数の細胞傷害剤にコンジュゲートした抗体を含んでなる、免疫コンジュゲート（交換可能に「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」とも称される）を提供する。
免疫コンジュゲートは、細胞傷害剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局所的デリバリーに使用されている(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu 等 (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146；Payne, G. (2003) i 3:207-212；Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号)。免疫コンジュゲートは、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積を可能とするものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05；Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等 (編), pp. 475-506)。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であると報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンのような植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許出願公開第１３９１２１３号；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞傷害性効果を奏しうる。ある種の細胞傷害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体-放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等 (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等 (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)を、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療について試験する第二相治験に入っている。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ-２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療用に開発中である。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等 (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療薬開発段階にある。
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは抗体と化学療法剤又は他の毒素を含有する。免疫コンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を本明細書中(上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体と一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン及びＣＣ１０６５のコンジュゲート、並びに毒素活性を有するこれら毒素の誘導体もまたここで検討される。
１．メイタンシン及びメイタンシノイド
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした抗体（完全長又は断片）を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤部分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である、（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、（ｉｉｉ）血漿中で安定、そして（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤部分である。
メイタンシノイドを含む免疫コンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示は出典を明示してここに援用される。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原を発現するヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞傷害度が達成され、該細胞傷害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加し得た。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞傷害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞傷害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞傷害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び米国特許公開２００５／０１６９９３Ａ１(これらの開示内容は出典明記により明示的に援用される)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許公開２００５／０１６９９３Ａ１に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基をここに記載し、例示する。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737(1978))が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、常套的なカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノール類似体のＣ-３位で形成される。
２．アウリスタチン類及びドラスタチン類
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号)にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第５６６３１４９号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第０２／０８８１７２号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願公開第１０／９８３３４０号に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が明示的に援用される。
典型的には、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願公開第１０／９８３３４０号も参照のこと。これらは出典明示によってその全体がここに援用される(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調製方法を開示している)。
３．カリケアマイシン
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブピコモル濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって、抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞傷害効果が大きく向上する。
４．他の細胞傷害剤
抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートを更に考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射又は他の標識が、既知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
該化合物は、限定するものではないが、架橋剤：(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ (スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)で調製されるＡＤＣが明示的に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
５．抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)はリンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)、例えば１抗体につき約１から約２０の薬剤部分にコンジュゲートされる。式ＩのＡＤＣは、（１）抗体の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してＡｂ-Ｌを形成した後、薬剤部分Ｄと反応させること；及び（２）薬剤部分の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してＤ-Ｌを形成した後、抗体の求核基と反応させることを含み、当業者に知られている有機化学反応、状態及び試薬を用いる幾つかの手段によって調製されうる。ＡＤＣを調製するための更なる方法はここに記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ Ｉ
リンカーは、一又は複数のリンカー成分から構成されてもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「ｖａｌ−ｃｉｔ」)、アラニン-フェニルアラニン(「ａｌａ−ｐｈｅ」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当該分野で知られており、その幾つかはここに記載される。また、その内容の全体が出典明示によりここに援用される"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願された米国特許出願公開第１０／９８３３４０号も参照のこと。
ある実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ)、アラニン-フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ)及びグリシン-グリシン-グリシン(ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設計され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性で最適化できる。
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ） 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ） アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。よって、各々のシステイン架橋は、理論的には２の反応性のチオール求核基を形成する。更なる求核基は、チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又はその断片)に導入されうる。
また、抗体薬剤コンジュゲートは、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応しうる求電子性の部分を導入する抗体の修飾によって生産してもよい。グリコシル化された抗体の糖鎖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan及びStroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応させることができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基で、リンカー部分上の求電子性の基及び（ｉ）活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含むリンカー試薬と反応して共有結合を形成可能なもの。
別法として、抗体及び細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製されうる。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含みうる。
また他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートしてもよく、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与した後、清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
Ｄ．方法
１．診断方法と検出方法
一態様では、本発明の抗体は、生体試料中のＮｏｔｃｈ２の存在を検出するために有用である。本明細書中で用いる「検出する」なる用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。ある実施態様では、生体試料は、細胞又は組織、例えば癌性組織を含む。
一態様では、本発明は、生体試料中のＮｏｔｃｈ２の存在を検出する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、Ｎｏｔｃｈ２への抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の結合に許容される条件下で抗Ｎｏｔｃｈ２抗体（例えば抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体）と生体試料を接触させ、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体とＮｏｔｃｈ２との間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む。
一態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ２の発現増加と関係している疾患を診断する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体と試験細胞を接触させ、Ｎｏｔｃｈ２への抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の結合を検出することによって試験細胞によるＮｏｔｃｈ２の発現レベル(量的に又は質的に)を測定し、そして、試験細胞によるＮｏｔｃｈ２の発現レベルをコントロール細胞(例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞、又はこの正常細胞と同等のレベルでＮｏｔｃｈ２を発現する細胞、又は複数のコントロール細胞間の発現の平均レベル)によるＮｏｔｃｈ２の発現レベルと比較することを含み、コントロール細胞と比べて試験細胞によるＮｏｔｃｈ２の発現レベルが高い場合にＮｏｔｃｈ２の発現の増加に関連する細胞増殖性疾患の存在が示される。ある実施態様では、試験細胞は、Ｎｏｔｃｈ２の発現の増加に関連する疾患があると疑われる患者から得られる。ある実施態様では、前記疾患は、癌又は腫瘍などの細胞増殖性疾患である。
本発明の抗体を使用して診断されうる例示的な疾患には、癌、例えばＢ細胞悪性腫瘍、メラノーマ、Ｔ細胞悪性腫瘍(例えばＴ−ＡＬＬ)、乳癌、脳癌、子宮頸癌、大腸癌及び膵癌が含まれる。
ある他の方法は、Ｎｏｔｃｈ２に対する抗体の結合を検出するために用いてもよい。前期の方法には、限定するものではないが、当分野で周知である抗原-結合アッセイ、例えばウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ(抗体結合免疫吸着検定)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び免疫組織化学(ＩＨＣ)が含まれる。
ある実施態様では、抗体は標識される。標識には、限定するものではないが、直接検出される標識又は分子(例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される酵素ないしはリガンドなどの分子が含まれる。例示的な標識には、限定するものではないが、放射性同位体である３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希有土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環のオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために水素ペルオキシダーゼを用いる酵素とカップリングさせたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離基などが含まれる。
ある実施態様では、抗体は不溶性基質に固定される。固定化は、溶液中で遊離したままであるいずれかのＮｏｔｃｈ２から抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を分離することを伴ってよい。これは従来、水不溶性基質ないしは表面に吸着させる(Bennich等, 米国特許第３７２０７６０号)又は共有的にカップリングさせる(例えば、グルタールアルデヒド架橋結合を使用する)などしてアッセイ手順の前に抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を不溶化するか、又は抗Ｎｏｔｃｈ２抗体とＮｏｔｃｈ２との複合体の形成の後に、例えば免疫沈降によって抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を不溶化することによって達成される。
診断ないし検出の上記いずれかの実施態様は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の代わりに、ないしは抗Ｎｏｔｃｈ２抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて行われうることは理解される。
２．治療方法
本発明の抗体は、例えばインビトロ、エクスビボ及びインビボの治療方法において用いられうる。一態様では、本発明は、インビボ又はインビトロでのＮｏｔｃｈ２活性、すなわちＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の阻害方法であって、Ｎｏｔｃｈ２への抗体の結合に許容される条件下で細胞を本発明の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体にさらすことを含む方法を提供する。ある実施態様では、細胞は、癌細胞、例えば癌性のＢ細胞又はメラノーマ細胞である。一実施態様では、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体がＮｏｔｃｈ２活性を阻害するために用いられてよく、前記方法は、Ｎｏｔｃｈ２活性が阻害されるように、Ｎｏｔｃｈ２を本発明の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体にさらすことを含む。
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、例えば、Ｎｏｔｃｈ２の発現及び／又は活性と関係する疾患の治療、例えばＮｏｔｃｈ２の発現又は活性の増加と関係する疾患、又はＮｏｔｃｈ２の発現又は活性が病態に寄与する疾患の治療のために用いられてよい。「Ｎｏｔｃｈ２の発現又は活性の増加と関係する疾患」は、Ｎｏｔｃｈ２発現又は活性が正常より有意に高い疾患を指す。
一態様では、本発明の抗体を用いて、癌、例えばＢ細胞悪性腫瘍、メラノーマ、Ｔ細胞悪性腫瘍(例えばＴ-ＡＬＬ)、乳癌、脳癌、子宮頸癌、大腸癌および膵癌を治療するかまたは予防する。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を用いて、癌、例えば乳癌、Ｂ細胞悪性腫瘍又はメラノーマを治療する。
更なる態様では、本発明の抗体を用いて、癌、特に癌幹細胞を含む固形腫瘍を治療するか又は予防する。癌幹細胞は、増殖して更なる癌幹細胞並びに他の腫瘍細胞群を引き起こすことが可能である。Al-Hajj et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 100: 3983-3988 (2003)を参照。癌幹細胞は、癌の再発および薬物治療に対する癌の耐性に寄与すると考えられている。Ｎｏｔｃｈレセプターは、癌幹細胞マーカーとして、そして、固形腫瘍の形成及び再発の原因である癌幹細胞を取り除くための標的として同定された。国際公開２００８／０９１６４１を参照。このような固形腫瘍には、胸部、大腸、膵臓、前立腺、肺、頭部および頸部、直腸、結腸直腸の癌が含まれるがこれらに限定されない。
一態様では、本発明は、癌の治療方法であって、本発明の抗体の有効量を必要とする個体に投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、癌の治療方法は、本発明の抗体と、場合によって以下に示すような少なくとも一の他の治療薬とを含む薬学的製剤の有効量を、必要とする個体に投与することを含む。
本発明の抗体は、治療において単独で又は他の組成物と組み合わせて用いられてよい。例えば、本発明の抗体は、少なくとも一の更なる治療薬および／またはアジュバントと同時に投与されてよい。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体(例えば抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体)は、別の方法でこのような抗Ｎｏｔｃｈ１抗体によって誘導されうる腸管の細胞分化の変化を阻害するかまたは低減する他の治療薬と共に投与される。ある実施態様では、他の治療薬は、デキサメサゾン又はタモキシフェンである。このような併用療法は、例えば腫瘍関連の血管形成および癌を含む血管形成性疾患を治療する際に有用であろう。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体(例えば抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体)は、更なる治療薬、例えば化学療法剤と共に投与される。このような併用療法は、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍およびメラノーマといった癌を治療する際に有用である。
上述のかかる併用療法には、併用投与（２以上の薬剤が同一又は別個の製剤中に含まれる場合）、及び本発明の抗体の投与が、他の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、本発明の抗体の投与がなされうる別個の投与が含まれる。また、本発明の抗体は放射線療法と組み合わせて用いられてよい。
一態様では、本発明の抗体の少なくとも幾つかはヒト以外の種由来のＮｏｔｃｈ２を結合しうる。従って、本発明の抗体は、例えば内在性ないし組み換えのＮｏｔｃｈ２を発現する哺乳動物細胞培養物において、ヒト患者において、又は本発明の抗体が交差反応するＮｏｔｃｈ２を有する他の哺乳動物（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ、ラット又はマウス）において、Ｎｏｔｃｈ２を結合させるために使用できる。
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｎｏｔｃｈ２の発現および／または活性の増加と関係する疾患を患っている個体においてＮｏｔｃｈ２を結合させる方法に用いられ、この方法は個体においてＮｏｔｃｈ２が結合されるように、個体に抗体を投与することを含む。一実施態様では、Ｎｏｔｃｈ２はヒトＮｏｔｃｈ２であり、個体はヒト個体である。あるいは、個体は、本発明の抗体が結合するＮｏｔｃｈ２を発現する哺乳動物であってよい。また更に、個体は、Ｎｏｔｃｈ２が(例えば、Ｎｏｔｃｈ２の投与によって、または、Ｎｏｔｃｈ２をコードする導入遺伝子の発現によって)導入された哺乳動物であってもよい。
本発明の抗体は、治療的目的のためにヒトに投与されてよい。さらに、本発明の抗体は、獣医学の目的のため、又はヒト疾患の動物モデルとして抗体が交差反応するＮｏｔｃｈ２を発現する非ヒト哺乳動物(例えば霊長類、ブタ、ラット又はマウス)に投与されてもよい。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するため(例えば、投与の用量および時間経過の試験)に有用である。
本発明の抗体(及び任意の更なる治療薬又はアジュバント)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
抗体の調製及び投与において、本発明の抗体の結合標的の位置を考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合、本発明の特定の実施態様では、結合標的が位置する細胞に導入される抗体ないしその抗原結合断片が提供される。一実施態様では、本発明の抗体は、細胞内に細胞内抗体として発現させることができる。本明細書で使用する「細胞内抗体(intrabody)」という用語は、Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997)；Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)；米国特許第６００４９４０号及び同第６３２９１７３号；米国公開特許第２００３／０１０４４０２号及び国際公開第２００３／０７７９４５号に記載のように、標的分子に選択的に結合することができる、細胞内で発現される抗体ないしその抗原結合タンパク質を指す。例として、細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関しては１９９６年３月１４日に公開の国際公開９６／０７３２１も参照のこと。
細胞内抗体の細胞内発現は、標的細胞内に、所望の抗体ないしその抗原結合タンパク質をコードする核酸(当該抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子に通常関連付けられる野生型リーダー配列及び分泌シグナルを欠いている)を導入することにより達成することができる。本発明の抗体のすべて又は一部をコードする一又は複数の核酸は標的細胞に運搬され、細胞内標的ポリペプチドに結合し、標的ポリペプチドの活性を調節することができる一又は複数の細胞内抗体が発現される。細胞に核酸を導入するための何らかの標準的方法を使用することができ、これらの方法には、限定するものではないが、微量注入、弾道的注入、電気泳動、リン酸カルシウム沈降、リポソーム、及び対象の核酸を保因するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びワクシニアベクターによる形質移入が含まれる。
ある実施態様では、核酸(場合によってベクターに含まれている)は患者の細胞内へインビボ及びエクスビボの方法によって導入されてよい。インビボ運搬の一例では、患者の例えば治療的介入を必要とする部位に核酸が直接注入される。インビボ運搬の更なる例では、核酸は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）による形質移入を用いて細胞内に導入される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)、及び国際公開９３／２５６７３及びそこに引用された参考文献を参照のこと。エクスビボ治療の例では、患者の細胞が取り除かれ、核酸がこれら単離した細胞内に導入され、変更した細胞が直接又は、例えば、患者内に着床される多孔性膜内に被包して患者に投与される(例として米国特許第４８９２５３８号および同第５２８３１８７号を参照)。核酸のエクスビボ運搬のために一般的に用いられるベクターはレトロウイルスである。
別の実施態様では、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の運搬を増強する特定の特徴を有することができるか、又はそのような特徴を有するように修飾することができる。これを達成する技術は従来技術に既知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている(例えば、米国特許第６７０３０１９号参照)。リポフェクション又はリポソームも、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質に特異的に結合する最小の抑制性断片が有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に対する結合能を有するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成する、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。例としてMarasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照。
標的細胞への抗体の移入は、当分野で公知の他の方法によって増強することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来の配列のような特定の配列は、細胞膜全体に異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例としてChen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329を参照。
抗体の結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施態様は、血液脳関門を横切る抗体を提供する。血液脳関門を越えて分子を搬送するためには複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、幹細胞に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
血液脳関門に抗体を搬送する物理的方法には、限定するものではないが、血液脳関門を完全に包囲すること、又は血液脳関門に開口部を形成することが含まれる。包囲法には、限定するものではないが、脳への直接注入(例えば、Papanastassiou等, Gene Therapy 9: 398-406 (2002))、間質性注入／対流強化送達(例えば、Bobo等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)参照)、及び脳への送達装置の移植(例えば、Gill等, Nature Med. 9: 589-595 (2003)；及びGliadel WafersTM, Guildford Pharmaceutical参照)が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定するものではないが、超音波(例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８０８６号参照)、浸透圧(例えば、高浸透圧性マンニトールの投与による(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)))、例えば、ブラジキニン又はパーミアライザーＡ−７による透過性化(例えば、米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号参照)、及び抗体をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入(例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号)が含まれる。
血液脳関門を越えて抗体を搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体を封入すること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００２５３１３号参照)、及び低密度リポプロテイン粒子(例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０４３５４号参照)、又はアポリポタンパク質Ｅ(例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３１６９２号参照)中の抗体をコーティングすることが含まれる。
血液脳関門を越えて抗体を搬送する幹細胞に基づく方法は、対象の抗体を発現するように神経前駆細胞(ＮＰＣ)を遺伝的に操作し、次いで、治療する個体の脳に幹細胞を移植することを伴う。詳細なオンライン文献であるBehrstock等 (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005(神経栄養因子ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作したＮＰＣが齧歯類及び霊長類のモデルの脳に移植した場合にパーキンソン病の症状を低減したことを報告している)を参照。
血液脳関門を越えて抗体を搬送するレセプター及びチャネルに基づく方法には、限定するものではないが、グリココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増大させること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号参照)、カリウムチャネルを活性化させること(例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号参照)、ＡＢＣ薬の搬送を抑制すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号参照)、抗体をトランスフェリンでコーティングし、一以上のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号参照)、及び抗体のカチオン化(例えば、米国特許第５００４６９７号参照)が含まれる。
本発明の抗体は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は一又は複数の他の付加的な治療剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
上記いずれかの治療方法は、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の代わりに、ないしは抗Ｎｏｔｃｈ２抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて行われうることは理解される。
３．アッセイ
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、当分野で公知の様々なアッセイによって物理的／化学的な特性及び／又は生物学的活性に特徴がありうる。
ａ）活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有する抗Ｎｏｔｃｈ２抗体(例えば抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体)を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性には、例えば、Ｎｏｔｃｈ２活性、例えばＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の阻害又は低減を含みうる。また、このようなインビボ及び／又はインビトロで生物学的活性を有する抗体が提供される。
ある実施態様では、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、周辺帯Ｂ細胞の生成を阻害するその能力について試験される。例示的なアッセイは実施例に示す。特定の他の実施態様では、本発明の抗体は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達に応答するリポーター遺伝子の発現を阻害するその能力について試験される。例示的なアッセイは実施例に示す。
ｂ）結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどといった公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される他の態様では、競合アッセイを用いて、本発明の抗体と競合する抗体(例えばモノクローナル抗体)を同定してよい。一実施態様では、抗体は、Ｎｏｔｃｈ２への結合について、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２又は抗体Ｄ-３と競合する。そのような実施態様では、競合抗体は、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２又は抗体Ｄ-３が結合する同じエピトープ(例えば線形又は立体構造のエピトープ)に結合する。他の実施態様では、競合抗体は、実施例Ｂ(５)に記載のように抗ＮＲＲ１が結合する同じエピトープ(例えば線形又は立体構造のエピトープ)、すなわちＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲのＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−ＢおよびＨＤ−Ｃドメインを含むエピトープに結合する。例示的な競合アッセイには、限定するものではないが、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)に挙げられるものなどの常套的アッセイが含まれる。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)のMorris (1996) "Epitope Mapping Protocols,"に示される。２つの抗体のそれぞれが５０％以上他の結合をブロックする場合、これらの抗体は同じエピトープに結合すると言える。
例示的な競合アッセイでは、固定されたＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲは、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合する第一標識抗体(例えば抗体Ｄ、抗体Ｄ−１、抗体Ｄ−２又は抗体Ｄ−３)と、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲへの結合について第一抗体と競合する能力について試験されている第二非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。二次抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定したＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲを第一標識抗体を含むが第二非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲへの第一抗体の結合に許容される条件下でのインキュベートの後、過剰な結合していない抗体を取り除き、固定されたＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲと結合している標識の量を測定する。固定されたＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲと結合している標識の量がコントロール試料と比較して試験試料において実質的に減少している場合、二次抗体がＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲへの結合について第一抗体と競合していることが示唆される。
一態様では、本発明の抗体はさらに、限定するものではないが、Ｎ末端配列決定法、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ及びパパイン消化を含む、一連のアッセイによって特徴付けることができる。
上記いずれかのアッセイは、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体の代わりに、ないしは抗Ｎｏｔｃｈ２抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて行われうることは理解される。
Ｅ．製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートを含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以降は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に一般的な記載がなされているので、様々な他の実施態様が実施されうると理解される。
Ａ．材料と方法
１．抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の生成
抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を同定するためのライブラリの分類とスクリーニング
選択された相補性決定領域（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ３）に人工的な多様性を有し、ヒトＩｇＧレパートリの天然の多様性を疑似するヒトファージ抗体ライブラリをパニングのために用いた。Ｆａｂ断片は、Ｍ１３バクテリオファージ粒子の表面上に二価で表出された。(Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073-1093 (2004)を参照)。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ断片は、バキュロウイルス発現ベクターシステム又は２９３Ｔ細胞を使用して、エピトープタグ(ＦＬＡＧ又は６×Ｈｉｓ)に融合した分泌タンパク質として発現され、親和性クロマトグラフィを用いて９０％より多い純度に精製され、光散乱を用いて凝集の欠如について試験した。Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗原の配列は以下の通りである。
Figure 0005710487
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Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを標的抗原(１０μｇ／ｍｌ)にて４℃で終夜コートして、ファージ遮断(ブロック)バッファＰＢＳＴ(リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)と１％(w/v)ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)と０．０５％(v/v)Ｔｗｅｅｎ２０)にて室温で１時間かけて遮断した。抗体ファージライブラリ(例としてLee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004を参照)及びＶＨ／ＶＬ(Liang et al., J. Mol. Biol. 366: 815-829, 2007を参照)を抗原プレートに別々に加え、室温で終夜インキュベートした。翌日、抗原コートプレートをＰＢＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)にて１０回洗浄し、結合したファージを５０ｍＭ ＨＣｌと５００ｍＭ ＮａＣｌにて３０分間かけて溶出し、等量の１Ｍトリス塩基(ｐＨ７．５)にて中和した。回収したファージを大腸菌ＸＬ-１ブルー細胞中で増幅させた。その後の選別ラウンドの間、抗原コートプレートとの抗体ファージのインキュベートを２〜３時間に短縮し、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に上げた。
４ラウンドのパニングの後、有意な濃縮が観察された。ＶＨおよびＶＨ／ＶＬライブラリ分類からそれぞれ９６のクローンを拾い上げ、それらがヒトとマウス両方のＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合したが否かを決定した。これらのクローンの可変領域をＰＣＲ配列決定し、特有の配列クローンを同定した。
ファージ抗体の親和性は、点競合ＥＬＩＳＡを用いて層別化した。さらに、競合ファージ-結合ＥＬＩＳＡを使用してファージ抗体ＩＣ５０値を決定した。ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲを結合する特有のファージ抗体を選択し、インビトロ細胞アッセイでの評価のために完全長ＩｇＧに再編成した。
対象のクローンを、ＬＰＧ３およびＬＰＧ４ベクターのそれぞれに別々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域をクローニングし、哺乳類のＣＨＯ細胞において過渡的に発現させ、プロテインＡカラムにて精製することによって、再編成した。
抗体Ｄの親和性改善のためのコンストラクトライブラリ
ファジミドｐＷ０７０３(ファジミドｐＶ０３５０-２ｂ由来(Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価のＦａｂを表出しているもの)を、親和性成熟のためのＶＨ／ＶＬライブラリからの抗体Ｄの軽鎖(ＶＬ)及び重鎖(ＶＨ)可変ドメインを移植するためのライブラリテンプレートとして用いた。次いで、停止コドンをライブラリテンプレートのＣＤＲ-Ｌ３に組み込んだ。７０−１０−１０−１０混合の野生型ヌクレオチドを好む(favoring)塩基により害を及ぼすオリゴヌクレオチド方策を用いることによって、選択した位置でおよそ５０％の変異率を導入したソフトランダム化方策を用いた。、突然変異誘発ＤＮＡを、により合成した(Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994))。具体的には、ＣＤＲ-Ｌ１の位置２８−３２、ＣＤＲ-Ｌ２の位置５０及び５３−５５、ＣＤＲ-Ｌ３の位置９１−９４及び９６、ＣＤＲ-Ｈ１の２８−３５、ＣＤＲ-Ｈ２の５０−５８、ＣＤＲ-Ｈ３の９５−１００の残基を標的とした。また、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３、Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２およびＬ３／Ｈ３のソフトランダム化ＣＤＲループの組合せを有する３つの異なるライブラリを構築した。
親和性改善を生成するためのファージ分類方策
親和性改善選別のために、ファージライブラリは、第１ラウンドではプレート分類に、その後５回のラウンドでは溶液分類を行った。ライブラリは、それぞれヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに対して分類した。プレート分類の第１ラウンドでは、３つのライブラリを、標的コートプレート(NUNC Maxisorpプレート)に対して別々に分類し、ファージインプットは、室温、２時間で、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中でおよそ３Ｏ.Ｄ／ｍｌであった。後に続く溶液分類のラウンドでは、プレート分類の第１ラウンドにて増殖した１Ｏ.Ｄ.／ｍｌのファージを、５０ｎＭのビオチン化標的タンパク質(この濃度は親のクローンファージＩＣ５０値を基にしている)を含む、１％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ(Pierce Biotechnology)と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００μｌのバッファ中で室温で３０分間インキュベートした。さらに、混合物を１％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋにて１０倍に希釈し、１００μｌ／ウェルをニュートラビジンコートウェルに添加し(５μｇ／ｍｌ)、室温で１５分間、ゆっくりと撹拌しながら、ビオチン化標的をファージに結合させた。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて１０回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化していない標的を有するファージを含むコントロールウェルをニュートラビジンコートプレート上で捕獲した。結合したファージを０．１Ｎ ＨＣｌにて２０分間溶出し、１／１０量の１Ｍ トリスｐＨ１１にて中和し、力価を測定して、次のラウンドのために増殖させた。次に、後続のラウンドの溶液分類はともに、選択ストリンジェンシーを高めた２つの方法により実施した。その一つ目は、１０ｎＭから０．５ｎＭにビオチン化標的タンパク質濃度を減少することによるオンレート(on-rate)選択であり、その二つ目は、弱い結合物を完全に除くために過剰量(１００〜５００倍以上)の非ビオチン化標的タンパク質を添加することによるオフレート(off-rate)選択である。また、ファージインプットはバックグラウンドファージ結合を低くするために低くした(０．１〜０．５Ｏ.Ｄ／ｍｌ)。
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ(単一スポット競合)
第６ラウンド分類からコロニーを拾い、９６ウェルプレート(Falcon)中で５０μｇ／ｍｌカルベニシリンと１Ｅ１０／ｍｌのＫＯ７を含む１５０μｌ／ウェルの２ＹＴ培地にて３７℃で終夜生育させた。同じプレートから、ＸＬ-１感染親ファージのコロニーをコントロールとして拾った。９６ウェルNunc Maxisorpプレートを、１００μｌ／ウェルのヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲタンパク質(１μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳにて、４℃で終夜又は室温で２時間かけてコートした。６５μｌの１％ ＢＳＡにて３０分間、そして４０μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０にてさらに３０分間、プレートをブロックした。
ファージ上清を、１０ｎＭの標的タンパク質を含む又は含まないＥＬＩＳＡ(酵素結合吸着アッセイ)バッファ(０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)にて１:５に希釈して全量を１００μｌとし、Ｆプレート(NUNC)にて室温で少なくとも１時間インキュベートした。標的タンパク質を含む又は含まない７５μｌの混合物を、標的タンパク質コートプレートに並んで移した。プレートを１５分間緩やかに振とうし、標的タンパク質コートプレートに結合していないファージを捕獲させた。プレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡバッファ(１：５０００)に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗Ｍ１３抗体を加えて定量し、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回プレートを洗浄した。次に、３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ(Ｈ２Ｏ２)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌの１Ｍリン酸(Ｈ３ＰＯ４)を加えることによって反応を止め、室温で５分間インキュベートした。各ウェルの黄色の４５０ｎｍのＯＤ(光学密度)を、標準的なＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。ＯＤ減少(％)は、以下の方程式によって算出した。
ＯＤ４５０ｎｍ減少(％)＝[(競合物質を含むウェルのＯＤ４５０ｎｍ)／(競合物質を含まないウェルのＯＤ４５０ｎｍ)]＊１００
親ファージのウェルのＯＤ４５０ｎｍ減少(％)(１００％)と比較して、ヒト及びマウスの標的について５０％より低いＯＤ４５０ｎｍ減少(％)を有するクローンを配列分析に選択した。ファージ調製のために特有のクローンを選択し、親クローンと比較することによって、ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに対する結合親和性(ファージＩＣ５０)を決定した。最も親和性を改善したクローンをヒトＩｇＧ１に再編成し、哺乳動物細胞に発現させた。
抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の特徴づけ(Ｂｉａｃｏｒｅ)
抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００装置を用いた表面プラスモン共鳴(ＳＲＰ)によって測定した。抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲヒトＩｇＧを、ＣＭ５センサーチップ上にコートしたマウス抗ヒトＩｇＧによって捕獲し、およそ２００反応単位(ＲＵ)を達成した。動態測定のために、ヒトおよびマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲの二倍段階希釈物(３．９ｎＭ〜５００ｎＭ)を、３０μｌ／分の流速、２５℃で、ＰＢＴバッファ(０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)に注入した。会合速度(ｋｏｎ)および解離速度(ｋｏｆｆ)は、単一の１対１ラングミュア結合モデル(ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２)を使用して算出した。平衡解離定数(ＫＤ)はｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出した。
２．抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の生成
特定の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の生成および特徴づけは先に述べた。米国特許出願公開番号ＵＳ２００９／００８１２３８Ａ１を参照。
３．ＥＬＩＳＡ
抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、黒色壁のある高い結合プレート(Greiner)において４つすべてのＮｏｔｃｈレセプターから、Ｆｌａｇタグ付加ＮＲＲタンパク質を捕獲した。ＮＲＲ抗体およびＥ２５コントロール抗体はＮＲＲタンパク質に結合し、ＰＢＳにて洗い流した。アルカリホスフェートコンジュゲート抗ヒト(Ｈ＋Ｌ)二次抗体(Jackson ImmunoResearch)を用いて、結合した抗ＮＲＲおよびＥ２５を検出した。結合していない二次抗体を洗い流し、ＡＰはＰＮＰＰ基質(Pierce)にて検出した。
４．ＦＡＣＳ
発現プラスミドは、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインがＮ末端にｍｙｃタグ付加され、ミニマルＣＭＶ最初期プロモータの上流のテトラマイシン反応エレメント(ＴＲＥ)の制御下で発現されるように作製した。これらのプラスミドはＣＨＯ-Ｋ１細胞(Clonetech)に安定して形質移入され、結合して形質移入したプラスミド内のＴＲＥを活性化するドキシサイクリンの存在下でトランス活性化因子タンパク質を発現するように操作した。１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリン又はベヒクルにて４８時間細胞を処理し、次いで、抗ＮＲＲ、抗ｍｙｃ(9E10, Millipore)又はＥ２５コントロール抗体とヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ６４７二次抗体(Invitrogen)とで染色した。染色の後、細胞はＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ機(BD Biosciences)にて実行し、１５０００イベントを回収し、範囲ゲートを描いて、陽性及び陰性に染色した集団を評価した。
５．Ｎｏｔｃｈレセプターアッセイ
Ｎｏｔｃｈ１を安定して形質移入したか又は他のＮｏｔｃｈレセプターを含むプラスミドを過渡的に形質移入したＮＩＨ−３Ｔ３細胞に、Ｎｏｔｃｈ反応ＴＰ−１(１２×ＣＳＬ)ホタルルシフェラーゼレポータと、形質移入効率のコントロールのために構成的に活性なウミシイタケルシフェラーゼレポータ(ｐＲＬ-ＣＭＶ、Promega)とを同時に形質移入した。細胞は、６時間から終夜の形質移入から回復させる。抗体の処理とリガンドを安定して形質移入したＮＩＨ-３Ｔ３細胞を用いてレセプター細胞を刺激する。２０時間後に、ホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼを、二重Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)にて測定する。ホタルシグナルを形質移入効率のためのコントロールのウミシイタケシグナルにて除して、各条件に対して８つの複製物を分析した。平均および標準偏差を算出し、値を規準化して、リガンドを形質移入していないＮＩＨ-３Ｔ３細胞にて刺激した同時培養物について値を算出した。
６．エピトープマッピング合成
Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ配列は、ＮＲＲ −ＬＮＲ−Ａ；ＬＮＲ−Ｂ；ＬＮＲ−Ｃ；ＨＤ−Ｎ；及びＨＤ−Ｃの５つのドメイン間の接合での特有の制限部位により設計され、Blue Heron Technology (Bothell, WA)によって製造された。操作した制限部位を用いて２つの合成配列間の様々なドメインを交換することにより、キメラＮＲＲタンパク質を生成した。キメラクローンは、変更したｐＵＣ１９ベクターにアッセンブリし、発現のためにＳＥＡＰ含有ベクターであるｐＣＳＣ.ＡＰへ移した。ＡＰタグ付加ＮＲＲタンパク質は、２９３Ｔ細胞の形質移入によって生産した。７２時間の培養物の後、馴化培地を回収し、遠心分離法によって浄化し、Ｐｈｏｓｐｈａ-Ｌｉｇｈｔシステム(Applied Biosystems, Bedford, MA)を用いてＡＰ活性について試験した。各試料のＡＰ活性を規準化し、ＥＬＩＳＡを行ってキメラＮＲＲタンパク質を結合するα-ＮＲＲ１又はα-ＮＲＲ２の能力を試験した。ＥＬＩＳＡは以下の通りに実行した。α-ＮＲＲ１又はα-ＮＲＲ２を、９６ウェルフォーマットのプレート結合ａ−Ｆｃ抗体によって捕獲させ、終夜馴化培地にて培養した。プレートを洗浄して結合していないタンパク質を除去し、捕獲したタンパク質はＰｈｏｓｐｈａ-Ｌｉｇｈｔシステムを使用してＡＰ活性について試験した。結果として生じたＡＰ活性を用いて、特定のキメラタンパク質を結合する各α-ＮＲＲ抗体の能力を定量化し、結合のための重要なエピトープを推定した。
７．ＨＵＶＥＣフィブリンゲルビーズアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞は、既に記載されているように(Nakatsu et al., 2003)、フィブリンゲルビーズ上で増殖させた。Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)は、２ｍｌのＥＧＭ-２培地(Clonetics)のビーズにつき３５０−４００のＨＵＶＥＣにてコートした。およそ２００のＨＵＶＥＣコートビーズを、１２ウェル組織培養プレートの１ウェルのフィブリン凝塊に包埋した。６×１０４のデトロイト５５１線維芽細胞を、５ｕｇ／ｍｌの抗ＮＲＲ１、５ｕｇ／ｍｌの抗ＤＬＬ４、１ｕＭのＤＢＺ又はベヒクルコントロールの何れかを含有する培地と凝塊の上にプレートした。培地は２日おきに交換した。次いで、７〜９日後に、フィブリンゲルを４％のパラホルムアルデヒドにて固定し、内皮細胞を、検出のためにＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体を用いて抗ＣＤ３１(R&D Systems AF806)にて染色した。
８．新生仔網膜のインビボアッセイ
ＣＤ１新生仔に、１０ｍｇ／ｋｇのブタクサコントロール又は２０ｍｇ／ｋｇのＮｏｔｃｈ１をＰ１およびＰ３に腹腔内投与した。Ｐ５に眼を採取し、４％ＰＦＡにて固定した。網膜を切り出し、１時間ブロックした後(５％ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ-１００)、１Ｍのクエン酸ナトリウムにて１０分間処理した。次いで、網膜は、ビオチン化したイソレクチンＢ４(Sigma)およびＫｉ６７抗体(NeoMarkers)と共に４℃で終夜インキュベートした。その後網膜を洗浄し、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ４８８およびヤギ抗ウサギＣｙ３を含む１％ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ-１００にて染色した。網膜を平らにマウントし、落射蛍光顕微鏡を使用して撮像した。
９．インビボ腫瘍試験
ヒト腫瘍細胞株Ｃａｌｕ-６およびＨＭ７を、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ、１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎおよび１μｇ／ｍｌファンギゾンＴＭ(InvitrogenTM, CA)を添加したハムのＦ１２、低グルコースＤＭＥＭ１:１中で生育させた。細胞を、９５％空気／５％ＣＯ２の空気下で３７℃でインキュベートした。マウス異種移植片実験のために、腫瘍細胞を、１×１０８又は１×１０９細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、Ｂａｌｂ-ｃヌードマウス(Harlan Sprague Dawley, IN)の背面の脇側に皮下投与した(１００μｌ／マウス)。腫瘍が４００ｍｍ３の体積に達したときに、０日目のコントロールとして、コホートをランダムに選択した(ｎ＝１０)。残りのマウスは１０匹のマウス群に分け、ファージ抗体の抗Ｎｏｔｃｈ１を１０ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回腹腔内投与した。移植した腫瘍は、記述したように長軸及び垂直軸に沿って週２回測定した。腫瘍を測定した各日に、各マウスの腫瘍体積を算出し、各コントロール抗体(抗ブタクサ)、抗ＶＥＧＦ群からの腫瘍体積平均を、ＪＭＰＴＭ統計分析システム(ウィンドウズ用バージョン５.１；SAS Institute, Cary, NC)において実行するＰ＜０．０５レベルのダネットｔ検定によって、抗Ｎｏｔｃｈ１処理マウスの腫瘍体積平均と比較した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを屠殺した。腫瘍は、クリオスタットにて７ミクロンに切り、アセトンにて固定し、ＤＡＰＩ(Invitrogen)、ハムスター抗ＣＤ３１(Serotech, Inc.)及び抗ハムスターＣｙ３二次(Jackson Immunolabs)にて染色した。スライドは、蛍光色素マウンティング培地(Dako)にてマウントした。画像は、ツァイス社製Ａｘｉｏｓｋｏｐ２顕微鏡にて撮像し、ＤＡＰＩ染色およびＣｙ３染色の領域についてＩｍａｇｅＪにて分析した。Ｃｙ３染色はＤＡＰＩ染色の領域にて除して、存在する細胞数に対して規準化し、値は抗ブタクサ処理した腫瘍に対して規準化した。すべての動物実験は、Institutional Animal Care and Use Committeeが承認したプロトコールに従って実施した。
１０．周辺帯Ｂ細胞分析
１２週齢のＢａｌｂ-ｃマウス(Jackson)に、５ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤ、抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２を週２回、２週間腹腔内投与した。既に記載されているように(Saito, et al., Immunity, Vol. 18, 675-685, May 2003)、マウスから脾細胞を単離し、Ｂ２２０-ＰｅｒＣＰ、ＣＤ２３-ＰＥ及びＣＤ２１-ＦＩＴＣ(BD Biosciences)にてＦＡＣＳのために染色した。
１１．マウスの腸組織の組織学および免疫組織化学
６匹の６つの群の１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス(Jackson)に、ＭＣＴを１日おきに、３０ｕｍｏｌ／ｋｇのＤＢＺを１日おきに、１０、２あるいは０．４ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤコントロール(ＨＳＶ−１)を０、２および６日目に、あるいは示したように、投与した。ホルマリン固定しパラフィン包埋したマウス小腸組織を３ミクロン厚で切断した。製造業者(PolyScientific)によって推奨されるように、腸管細胞種の組織化学的識別はアルシアンブルーにて実行した。抗Ｋｉ６７染色のために、切片を、Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液(Ｓ１７００、DAKO)にて前処理し、ウサギ抗Ｋｉ６７(１:２００、クローンＳＰ６、Neomarkers)と共にインキュベートした。７．５μｇ／ｍｌ(Vector labs)の二次ヤギ抗ウサギは、ベクタステインＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット(Vector labs)にて検出した。Ｋｉ６７染色した切片は、マイヤーのヘマトキシリンにて対比染色した。抗リゾチーム染色のために、切片を、ＣＣ１ｍエピトープ回復条件、ＯｍｎｉＭａｐ-ウサギ検出およびベンタナ社のヘマトキシリンＩＩ／ブルーイング対比染色を使用したディスカバリーＸＴプラットフォーム(Ventana Medical Systems, Inc.)にて処理した。ＨＥＳ-１染色のために、抗ラットＨＥＳ-１(クローンＮＭ１、MBL, International)の後にＴＳＡ−ＨＲＰを行った。
Ｂ．結果
１．Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２ネガティブ調節領域を特異的に標的とする合成抗体の生成
ヒトおよびマウスにおけるＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２のシグナル伝達の独立した拮抗作用を可能にするために、発明者等は、ファージディスプレイを使用してＮＲＲを標的とし、合成のヒト抗体のために以下の性質により選択した。第一に、各抗体を、その同族の標的であるＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２を強力に阻害するが、他のＮｏｔｃｈレセプターは阻害しないように選別した。第二に、抗体を、ヒトの標的配列への結合について選別し、治療的ターゲッティングを可能にした。第三に、インビボで全身的にＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２を阻害する生物学的結果を発見するため、そしてマウスモデルにおけるこれらレセプターの機能を調べるために、抗体を、オルソログなマウス配列への結合について同時に選別した。第四に、ヒト抗抗体免疫応答を防止するために、相補性決定領域を、ヒト免疫グロブリンフレームワークにクローニングした。
この手法の後、発明者等は、それぞれ所望の性質を有する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体および抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を成功裏に単離した。これらの抗体は、γ-分泌酵素インヒビターといった複数のＮｏｔｃｈレセプターを標的とする「パンＮｏｔｃｈ」インヒビターよりもいくつかの利点を有する。これらの抗体は個々のＮｏｔｃｈレセプターを区別するので、それら個々のレセプターの異なる機能を分析することができる。さらに、パンＮｏｔｃｈインヒビターは、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２を二重阻害するため、インビボで望ましくない副作用を示しうるので、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２に対して選択的である抗体は治療のためにはより魅力的な候補となりうる。上記の手法に従って単離した抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲおよび抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体は、更に詳細に以下に記述し、特徴を示す。
抗Ｎｏｔｃｈ ＮＲＲ１抗体の単離および特徴づけは、米国特許出願公開番号ＵＳ２００９／００８１２３８Ａ１において述べられている。その出願において開示された抗体の１つである「抗体Ａ−２」は、その構造および特定の生物学的活性に関して特徴付けした。その出願において述べられる試験は本明細書において要約する。便宜上、米国特許出願公開番号ＵＳ２００９／００８１２３８Ａ１の「抗体Ａ−２」は本明細書において「抗ＮＲＲ１」と称する。
抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体の単離および特徴づけをは本明細書において記述する。抗Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲ抗体を単離し、「抗体Ｄ」と称する。その抗体を上記の通りに親和性成熟し、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３とした。図１は、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３のＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を示す。図２は、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３のＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２およびＨＶＲ-Ｌ３配列を示す。図３は、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３の重鎖可変領域配列を示す。図４は、抗体Ｄ、抗体Ｄ-１、抗体Ｄ-２および抗体Ｄ-３の軽鎖可変領域配列を示す。便宜上、抗体Ｄ-３は、本明細書中で「抗ＮＲＲ２」と称する。
表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)を使用した結合親和性の測定により、抗ＮＲＲ１が、マウス又はヒトの配列の精製したＮＲＲ１タンパク質に同等及び高い親和性(Ｋｄ＝３ｎＭ)で結合したことが明らかとなった。発明者等は、抗ＮＲＲ２の試験においてＮＲＲ２抗原と同等の親和性(Ｋｄ＝５ｎＭ)を観察した。両抗体の結合は同族レセプターに対して高い特異性を示した。ＳＰＲ、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)および蛍光標示式細胞分取法(ＦＡＣＳ)を含む様々な技術を用いても、抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２について、他の３つ何れかの非標的レセプターのヒト又はマウスの配列への結合は検出されなかった(図９およびデータは示さない)。例えば、ＥＬＩＳＡ結果により、抗ＮＲＲ１が精製されたヒトおよびマウスのＮｏｔｃｈ１-ＮＲＲタンパク質に等しく十分に結合し、およそ０．１μｇ／ｍｌの抗体濃度で最大半量の結合が観察されたことが示された。ヒトＮｏｔｃｈ１-ＮＲＲとヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ配列は４５％同一であるにもかかわらず(図１８)、抗ＮＲＲ１は、試験した最も高い抗体濃度でさえ、精製したヒト又はマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ、Ｎｏｔｃｈ３-ＮＲＲ又はＮｏｔｃｈ４-ＮＲＲタンパク質への結合が検出されなかった(図９Ａ、左パネル)。発明者等は抗ＮＲＲ２についても同様の結果を観察し、この抗ＮＲＲ２はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲタンパク質に特異的に結合したが他のＮｏｔｃｈレセプターのＮＲＲタンパク質には結合しなかった(図９Ａ、右パネル)。
抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２も細胞の表面に発現される完全長レセプターに特異的に結合するかどうか決定するために、発明者等は蛍光標示式細胞分取法(ＦＡＣＳ)を用いた。発明者等は、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２への結合を評価した。これらはそれぞれ、Ｎ末端にｍｙｃエピトープタグを保持し、内因的に発現されたＮｏｔｃｈレセプター(特にＮｏｔｃｈ２、これはＫ１-ＣＨＯ細胞によって発現された)からのトランスジェニックＮｏｔｃｈレセプターと区別される。レセプター発現は、形質移入されていない(図９Ｂ、パネル１、４、７および１０)、ｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ１を形質移入した(図９Ｂ、パネル２、５、８および１１)、又はｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ２を形質移入した(図９Ｂ、パネル３、６、９および１２)Ｋ１−ＣＨＯ細胞において誘導した。ｍｙｃ陽性細胞に対する抗ＮＲＲ１の結合は、ｍｙｃ−Ｎ１細胞において観察されたが(図９Ｂ、パネル２)、Ｋ１-ＣＨＯ親細胞(図９Ｂ、パネル１)及びその後の導入(図９Ｂ、パネル２および５を比較する)では観察されなかったことから、抗ＮＲＲ１はＮｏｔｃｈ１に特異的に結合したことが示唆された。対照的に、ｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ２発現はｍｙｃ−Ｎ２細胞においてはっきりと誘導されたにもかかわらず(図９Ｂ、パネル３および６を比較する)、抗ＮＲＲ１はｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ２に結合しなかった(図９Ｂ、パネル２および３を比較する)。この分析は、Ｋ１−ＣＨＯ株においてハムスターＮｏｔｃｈ２の誘導(図９Ｂ、パネル６および１２)と内因性発現がない場合にはｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ２が漏出発現するために複雑であったが、発明者等は、抗ＮＲＲ２(図９Ｂ、パネル７−１２)を用いて同様な分析を行った(図９Ｂ、パネル７および１０をパネル１および４と比較する)。それでもやはり、抗ＮＲＲ２は、誘導後にｍｙｃ−Ｎｏｔｃｈ２を発現する細胞にのみ有意に結合し、これはＮｏｔｃｈ２への特異的結合と一致していた(図９Ｂ、パネル９をパネル８および１２と比較する)。まとめると、精製したＮＲＲタンパク質を用いた結合結果並びに完全長レセプターの細胞表面発現は、抗ＮＲＲ１はＮｏｔｃｈ１-ＮＲＲ１に特異的に結合し、Ｎｏｔｃｈ２ ＮＲＲには結合せず、同様に、抗ＮＲＲ２はＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに特異的に結合し、Ｎｏｔｃｈ１-ＮＲＲには結合しないことを示す。この特異性は、後述する数多くの構造的および機能的研究により更に裏付けられる。
２．抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２は、インビトロＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の強力かつ特異的なインヒビターとして機能する
抗ＮＲＲ抗体がＮｏｔｃｈシグナル伝達に作用したかどうかを評価するために、発明者等はまず、ＮｏｔｃｈリガンドとしてＪａｇ１を、又はＮｏｔｃｈレセプターとしてＮｏｔｃｈ１(図１０Ａ)ないしはＮｏｔｃｈ２(図１０Ｂ)を発現するように操作したＮＩＨ-３Ｔ３細胞株を用いて共培養アッセイを行った。強力なＮｏｔｃｈレポーターシグナル(ホタルルシフェラーゼ)がリガンド発現細胞およびレセプター発現細胞の両方の存在に依存していたので、このアッセイはＮｏｔｃｈシグナル伝達を正確に反映しており(図１０Ａ及びＢ、−Ｊａｇ１を＋Ｊａｇ１に比較する)、ＧＳＩ(γ-分泌酵素インヒビター)が含まれる場合には、レポーターレベルはバックグラウンドにまで下がった(図１０ＡおよびＢ、ＤＭＳＯをＤＡＰＴと比較する)。
抗ＮＲＲ１の漸増量の添加によりＮｏｔｃｈ１細胞のシグナル伝達が阻害され、８０から４００ｎｇ／ｍｌの抗体濃度で完全な阻害が観察された(図１０Ａ)。コントロール抗体は、Ｎｏｔｃｈ１以外の抗原に対する他の多くの抗体(データは示さない)のように、シグナル伝達を阻害しなかった(図１０Ａ、α-ｇＤをα-ＮＲＲ１の力価に比較する)。この阻害活性が抗ＮＲＲ１結合を反映していたかどうかを更に試験するために、発明者等は、精製したＮＲＲ１抗原の添加が、シグナル伝達細胞に発現されるＮｏｔｃｈ１への抗体結合に競合することによって、抗ＮＲＲ１抗体の阻害濃度(８０ｎｇ／ｍｌ)の存在下でシグナル伝達を救うか否かを調べた。ＮＲＲ２ではなくＮＲＲ１抗原の添加により(他のアッセイにおいて活性を示し、適切にホールドされたもの；図１０Ｂを参照)、コントロールレベルにまでシグナル伝達を修復した(図１０Ａ、８０ｎｇ／ｍｌのα-ＮＲＲ１＋ＮＲＲ１を８０ｎｇ／ｍｌのα-ＮＲＲ１単独および８０ｎｇ／ｍｌのα-ＮＲＲ１＋ＮＲＲ２と比較する)。コントロールとして、ＮＲＲ１及びＮＲＲ２抗原はいずれもコントロール抗体を含有した共培養物におけるシグナル伝達に作用しなかった。これは、ＮＲＲ断片自体が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対して直接効果を示さないことを裏付けるものである(図１０Ａ、α-ｇＤ＋ＮＲＲ１及びα-ｇＤ＋ＮＲＲ２)。抗ＮＲＲ２活性をアッセイするためにＮｏｔｃｈ２発現細胞を使用して、発明者等は、Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の抗ＮＲＲ２阻害について類似の結果を観察した(図１０Ｂ)。両抗体は、発明者等が試験したＮｏｔｃｈリガンドのすべて、すなわちＪａｇ１、Ｊａｇ２、Ｄｌｌ１およびＤｌｌ４により誘導されるシグナル伝達を阻害した(図１６およびデータは示さない)。まとめると、これらの結果は、抗ＮＲＲ１及び抗ＮＲＲ２はそれぞれＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２からのシグナル伝達の強力なパラログ特異的なインヒビターである。
３．抗ＮＲＲ１は、Ｔ−ＡＬＬにみられる変異レセプターの主要な両種類によるシグナル伝達を阻害する
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が直接腫瘍形成に作用することを示した１つのメカニズムは、Ｔ−ＡＬＬにおけるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の突然変異の活性化によるものである。特に、Ｔ−ＡＬＬにおけるＮｏｔｃｈ１活性化突然変異は２つの広いカテゴリーに分類される。(１)ＰＥＳＴドメインを切断することによりＩＣＤを安定化し、リガンド依存的な様式でシグナル伝達を増加するもの、及び(２)ＮＲＲを不安定化することによりＡＤＡＭを切断し、リガンドに非依存的な様式でシグナル伝達を刺激するもの。抗ＮＲＲ１がこのような変異レセプターによるシグナル伝達を無効にするか否かを試験するために、発明者等は、Ｎｏｔｃｈ１-ＷＴ(Ｎｏｔｃｈ１野生型)、Ｎｏｔｃｈ１−ＰＥＳＴ(ＰＥＳＴドメインを欠くＮｏｔｃｈ１)又はＮｏｔｃｈ１-Ｌ１５９４Ｐを発現するように共培養アッセイを変更した(ＮＲＲのヘテロ二量体化(ＨＤ)ドメインのＬ１５９４Ｐ突然変異を保有するＮｏｔｃｈ１)。野生型Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達について観察されたように(図１０Ｃ、上パネル)、抗ＮＲＲ１は、Ｎｏｔｃｈ１−ΔＰＥＳＴおよびＮｏｔｃｈ１-Ｌ１５９４Ｐによるリガンド依存性及びリガンド非依存性のシグナル伝達を完全に阻害した(図１０Ｃ、中央および下パネル)。ゆえに、抗ＮＲＲ１は、抗体が標的とする同じドメイン内にあり、不安定化するＬ１５９４Ｐ突然変異を含む変異レセプターの両種類によるシグナル伝達を中和(アンタゴナイズ)する。
４．抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２は、インビボでＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２シグナル伝達の強力かつ特異的なインヒビターとして機能する
抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２がインビボでレセプター特異的なインヒビターとして機能するか否かを決定するために、発明者等は、抗体がどのように、遺伝学的技術がＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の役割を確立する細胞運命決定に作用するかについて調査した。具体的には、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の条件的不活性化により既に、Ｎｏｔｃｈ１はリンパ系発達の間にＢ細胞に対するＴ細胞の運命を決定するために重要であるのに対して、Ｎｏｔｃｈ２は脾臓周辺帯Ｂ(ＭＺＢ)細胞を生成するために必要であることが示された。Ｔ細胞発達におけるＮｏｔｃｈ１の重要な機能と一致して、発明者等は、抗ＮＲＲ２ではなく抗ＮＲＲ１にてマウスを処置すると、胸腺重量が有意に低減したことを発見した(図１１ＡおよびＢ)。同様に、抗ＮＲＲ２でなく抗ＮＲＲ１は、胸腺の細胞の総数を激減させ(図１１Ｂ)、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞の生成をほとんど完全に阻害した(図１１Ｃ)。
対照的に、ＭＺＢ細胞を調べると、抗体効果は逆転していた。抗ＮＲＲ２による処置によりＭＺＢ細胞がほとんど除去され(６．６１＋／−０．２５のコントロール値と比較して０．９７＋／−０．４５)、精製した組み換えリンホトキシン−βレセプター(ＬＴβＲ)-Ｆｃ融合タンパク質(ポジティブコントロールとして用いた)(３．４８＋／−０．０６)よりも更に集団を激減した(図１１Ｄ)。抗ＮＲＲ１が抗ｇＤコントロール抗体(６．６１＋／−０．２５；図１１Ｄ)と比較してＭＺＢ集団を有意に低減しなかったので(６．００＋／−０．４４)、この阻害作用は抗ＮＲＲ２に特異的であった。まとめると、これらのインビボ研究は、両抗体が細胞運命決定の生物学上有意な変化を誘導しうるそれぞれの標的の強力なインヒビターであることを示す。さらに、抗ＮＲＲ１はＭＺＢ細胞でなくＴの生成に作用するのに対して、抗ＮＲＲ２はＴ細胞でなくＭＺＢの生成に作用し、各々の抗体はインビボでその意図する標的に特異的に機能する。
５．共結晶構造により、抗ＮＲＲ１はＬＮＲ及びＨＤ−Ｃドメインを架橋し、おそらくＮＲＲ「オフ」立体構造を安定化する
抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２の結合特異性を解明し、抗体アンタゴニスト活性に機構的な洞察をするために、発明者等は、キメラＮＲＲタンパク質のバッテリーに対する両抗体の結合を試験した。具体的には、発明者等は、Ｎｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ２との間の各ＮＲＲサブドメイン(ＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ−Ｂ、ＬＮＲ−Ｃ、ＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃ)を交換することによってキメラＮＲＲを作製し、簡易な検出のためにアルカリホスファターゼに融合させた分泌タンパク質のようにこれらキメラを発現させ、抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２への各キメラＮＲＲの規準化した量の結合を検定した。発明者等が発現させた２６のキメラＮＲＲのうち、１７は分泌タンパク質のように効率的に検出され(図１２Ａ)、７は僅かに検出され、２はバックグラウンドを上回って検出されなかった(図１７)ことから、すべてではないがほとんどのキメラＮＲＲが発現され、適切にホールドされ、分泌されたことが示唆された。ＮＲＲ２の単一ＬＮＲ−ＡドメインをＮＲＲ１主鎖へ交換することにより抗ＮＲＲ１の結合が破壊されたことは(図１２Ａ、キメラＢＣ.ＨｄおよびＮＲＲ２のＬＮＲ−Ａを有する他のすべて)、ＮＲＲ１のＬＮＲ−Ａサブドメインとの抗ＮＲＲ１の接触は結合に必須であることを示す。対照的に、ＮＲＲ２のＬＮＲ-Ｃおよび／またはＨＤ−ＮドメインをＮＲＲ１に交換することが抗ＮＲＲ１結合に作用しなかったことは(図１２Ａ、キメラＡＢ.Ｈｄ、ＡＢＣ.ＨｃおよびＡＢ.Ｈｃ)、これらドメインはいずれも結合特異性に必須であることを示す。最後に、ＡＢ.Ｈｃは、(ＡＢキメラへの弱い結合が観察されたが)完全な抗ＮＲＲ１結合を以前として持つＮＲＲ１サブドメインを最も少なく持つキメラであったことから、ほとんどそしておそらくすべての抗ＮＲＲ１結合特異性に必要な接触はＬＮＲ−Ａ、ＬＮＲ-ＢおよびＨＤ−Ｃドメインに含まれることが示唆された。
抗ＮＲＲ２の特徴付けにより、いくつかは異なっているが、抗ＮＲＲ１について決定されたものと類似の結合パターンが明らかになった。ＮＲＲ１のＬＮＲ−ＡドメインをＮＲＲ２主鎖に交換すると抗ＮＲＲ２結合が完全に破壊されたのに対して、ＬＮＲ−Ｂ又はＬＮＲ−Ｃの交換は作用がなかった。よって、抗ＮＲＲ１の場合のように、抗ＮＲＲ２結合はＮｏｔｃｈ２のＬＮＲ−Ａサブドメインを必要とする。同様に、Ｎｏｔｃｈ２のＨＤ−Ｃドメインも必須であった。ＮＲＲ２の３つのサブドメインのみを有する２つの異なるキメラ(Ｃ.ＨｎおよびＢＣ)はこのアッセイにおいて完全な結合を持っていた。この両キメラは、ＮＲＲ２のＬＮＲ−ＡおよびＨＤ−Ｃサブドメインを共有し、この所見と一致して、ＮＲＲ２のＬＮＲ−Ａ及びＨＤ−Ｃサブドメインのみを含むキメラは抗ＮＲＲ２に対して弱いが検出可能な結合を持っていた。ゆえに、抗ＮＲＲ２結合特異性を決定するサブドメインを定める際には、ドメイン交換実験は、(ａ)ＬＮＲ−ＡおよびＨＤ−Ｃが最も重要(結合特異性に必要かつある程度十分)であることを示し、(ｂ)ＬＮＲ−Ｂ及びＨＤ−Ｎにおける抗体−ＮＲＲ２接触も役割があることを示唆する。
抗ＮＲＲ１のアンタゴニスト活性の分子基礎を更に理解するために、発明者等は、ヒトＮＲＲ１に結合した抗体のＦａｂ断片の２．２Å結晶構造を決定した。この構造は、ＮＲＲ１がヒトＮＲＲ２のものと酷似した緻密な構造を形成し、３つのＣａ２＋結合ＬＮＲモジュールが中心のＨＤドメインの周りに取り巻いていることを示した(図１２ＢおよびＣ)。この構造は、Ｆａｂ結合の見かけの作用は、Ｓ２が切断されず、ゆえにＮｏｔｃｈ１シグナル伝達カスケードが休止したままとなるように、ＬＮＲ-ＨＤ相互作用を安定させることであることが示される。この解釈は、ＦａｂはＳ２部位を直接ふさがないが、その代わりにＨＤ、ＬＮＲ−ＡおよびＬＮＲ−Ｂドメイン間の界面で結合するという所見に裏付けられており(図１２Ｄ)、これはドメイン交換実験と一致している(図１２Ａ)。この界面は、ｆａｂとＮＲＲ１の間で等しく分かれたおよそ２０００Å２の溶媒アクセス表面領域を覆っている。Ｆａｂ重鎖は、ＬＮＲ−Ｂ、ＨＤ−Ｃドメイン内の最終ヘリックス及びＬＮＲ−Ａの周辺と接触する。ＣＤＲ Ｈ３は、ＬＮＲ-ＢとＨＤの間の界面に埋まっている。特に、Ｈ３のＲ９９がＬＮＲ−ＡのＰｈｅ１５０１の主鎖カルボニルに水素結合を形成するのに対して、側鎖の脂肪族部分はＨＤドメインのＬ１７１０と相互作用する。軽鎖は、Ｆａｂによる埋没した表面積のおよそ４０％を占め、ＬＮＲ−Ａ並びにＨＤドメインの最終ヘリックスの前の連結ループと接触する。
また、この構造により、Ｎｏｔｃｈ２よりもＮｏｔｃｈ１に対するＦａｂ特異性の基礎が明らかになる。Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２のＮＲＲドメイン間におよそ４５％の配列同一性があるにもかかわらず、界面に関与する大部分の残基は、２つのタンパク質間で異なっている。例えば、Ｆａｂを結合する際に少なくとも２５％の溶媒アクセス表面領域を覆う２１のＮＲＲ残基のうち、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２において６つしか同一ではない。これら６つの残基は、Ｆａｂエピトープの４分の１未満の表面積でしかなく、エピトープの全体にわたって分布している(図１２Ｄおよび１８)。
６．Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の選択的な阻害は脈管形成を解除する
インビボでの個々のレセプターの機能的な重要性を定めるためにＮｏｔｃｈレセプター特異的抗体を利用し始めるために、発明者等はまず、抗ＮＲＲ１にてＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を選択的にブロックすると哺乳類の脈管形成が破壊するか否かを調べた。数多くの報告は、Ｎｏｔｃｈ経路が血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)の下流で機能し、チップ(tip)細胞とストーク(stalk)細胞の間の内皮細胞運命選択を制御することによって脈管形成に重要な役割を果たすことを示している。Ｄｌｌ４特異的ブロック抗体を含む様々な遺伝的及び生化学的手法を用いた実験は、２つのＮｏｔｃｈレセプターであるＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４は脈管形成においてＤｌｌ４のレセプターとして関与していたが、Ｄｌｌ４をＮｏｔｃｈ血管形成シグナル伝達に関与する重要なＮｏｔｃｈリガンドとして定めた。
発明者等はまず、Ｎｏｔｃｈ１の選択的な阻害がインビトロの内皮出芽に作用するか否かを試験した。ヒト皮膚線維芽細胞と共培養したヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)は、内腔様構造の出芽を生成する。先の研究と同様に、発明者等は、ＤＢＺを使用したパンＮｏｔｃｈ阻害、γ分泌酵素のインヒビター並びにＤｌｌ４の選択的抗体ブロックにより内皮細胞出芽の数と長さが増加したことがわかった。重要なことに、抗ＮＲＲ１を使用してＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を選択的にブロックすることにより類似の表現型が生成した(図１３Ａおよび１３Ｂ)。
抗ＮＲＲ１がインビボで脈管形成に作用するか否かを決定するために、発明者等は、マウス新生仔の網膜脈管構造の発達に基づいてモデルを使用した。抗ＮＲＲ１の全身運搬により、処置した新生仔マウスの網膜脈管構造の発達が劇的に破壊した(図１３Ｃ)。コントロール抗ブタクサ抗体による処置と比較して、抗ＮＲＲ１処置は、密度が高く、緻密で、表面上絡み合った血管網状組織を生成した(図１３Ｃ、パネルＩおよびパネルＩＩＩをそれぞれパネルＩＩ及びＩＶと比較する)。Ｋｉ６７増殖マーカーにて標識して評価したところ、この内皮細胞の集積の増加は増殖の増加と相関していた(図１３Ｃ、パネルＶおよびＶＩを比較する)。血管密度の増加、内皮細胞蓄積および増殖の増加を含むこれらの所見すべては、この同じ新生仔モデルを用いたＤｌｌ４又はγ分泌酵素の阻害後にみられたものと非常に類似しており(データは示さない)、腫瘍脈管構造の分析(図１３Ｄおよび１３Ｅ)およびマウス角膜ポケットアッセイ(データは示さない)を含む他の研究の結果と一致している。発明者等の結果は、抗ＮＲＲ１が強力な生物学的活性を保持していることだけでなく、Ｎｏｔｃｈ４又はＮｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ４の組合せに反して、Ｎｏｔｃｈ１のみの阻害が哺乳類の脈管形成を劇的に崩壊させるために十分であるということを示す。
７．Ｎｏｔｃｈ１の選択的な抗体ブロックは、臨床前モデルの腫瘍成長を阻害する
抗ＮＲＲ１を使用したＮｏｔｃｈ１の選択的ブロックが腫瘍成長を阻害するために十分か否かを決定するために、発明者等は、臨床前腫瘍モデルを使用し、抗ＮＲＲ１、抗ＶＥＧＦ又は抗ブタクサ抗体による処置の後に定着させた腫瘍の成長を比較した。Ｃａｌｕ６およびＨＭ７の両モデルにおいて、抗ＮＲＲ１にて処置した群は、試験した初めの時点、初回投与の３〜４日後でさえ、コントロール群と比較して腫瘍のサイズが有意に減少していた(図１３Ａ−Ｃ)。Ｃａｌｕ６モデルでは、抗ＮＲＲ１群はおよそ２５０ｍｍ３から１００ｍｍ３未満に腫瘍サイズが減少しており、これは抗ＶＥＧＦ群に観察された減少と類似していた。これに反して、抗ブタクサコントロール群の腫瘍は４００ｍｍ３より大きいサイズに成長していた(図１４Ａ)。発明者等は、ＨＭ７モデルを強力に成長させて類似の結果を観察した。抗ＮＲＲ１処置により、１２〜１３日間にわたって腫瘍サイズが静止したまま(図１４Ｂ)又はほぼ静止したまま(図１４Ｃ)であり、これは、コントロール群に観察された２５０ｍｍ３から９００ｍｍ３への６日間の成長と比較して劇的に異なっている(図１４Ｂおよび５Ｃ)。１０および２０ｍｇ／ｋｇの群は２．５および５ｍｇ／ｋｇの群と比較して強い阻害傾向を示したが(図１４Ｃ)、発明者等は、２０ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１用量濃度を用いても腫瘍成長に対する同様な阻害を観察した。
発明者等は、抗血管形成剤に対する応答が十分に立証されているので、Ｃａｌｕ６又はＨＭ７の腫瘍モデルを調査した。抗ＮＲＲ１がＣａｌｕ６モデルの脈管形成を崩壊したか否かを直接試験するために、発明者等は、３つの治療群のマウスの代表的な腫瘍切片の脈管構造を調べた。内皮細胞マーカーであるＣＤ３１の染色をＤＡＰＩを用いてＤＮＡの染色に規準化することによって、発明者等は、抗ＮＲＲ１が他の群と比較してＣＤ３１染色を有意に増加させたことを発見した(図１４Ｄ)。この増加は、統計学的に有意(ｐ＜０．０１)であり、複数の画像にわたって一様に観察された(図１４Ｅ)。これに反して、予想されるように、抗ＶＥＧＦによりＣＤ３１染色が減少した(図１４Ｄおよび１４Ｅ)。ゆえに、Ｎｏｔｃｈ１の選択的なブロックの結果は、Ｄｌｌ４の選択的なブロックに報告される結果と酷似しており、それは同様に、腫瘍ＣＤ３１染色の増加並びに十分に機能していない腫瘍脈管構造の生成を引き起こす。まとめると、これらの結果は、Ｃａｌｕ６及びＨＭ７モデルにおける抗ＮＲＲ１による抗腫瘍作用は、主に腫瘍脈管形成の破壊を反映している。
８．Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２の抗体阻害は、腸管の細胞運命に著しく作用する
複数のＮｏｔｃｈレセプターを阻害するパンＮｏｔｃｈインヒビターであるγ-分泌酵素インヒビター(ＧＳＩ)により、体重損失および腸管のゴブレット細胞異形成が生じる。これは、Ｎｏｔｃｈが腸管の陰窩始原細胞の増殖を維持し、分泌細胞運命への分化を妨げることによって細胞運命を決定する際に働く役割を反映する。(van Es et al., Nature 435:959-963 (2005)を参照)。更に、条件的Ｎｏｔｃｈノックアウトマウスを使用した遺伝子の研究は、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２の破壊が腸管のゴブレット細胞異形成を引き起こすために必要であることを示唆する。(Riccio et al., EMBO Rep. 9: 377-383 (2008)を参照)。発明者等は、抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２を用いて、体重損失および腸管の細胞分化に対する、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２、あるいはその両方の選択的な阻害の効果を決定した。
抗ＮＲＲ１にて処置したマウスは、抗体投薬クールの間、総体重の軽度の減少を示した。抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２を直接比較する第一実験では、発明者等は、抗ＮＲＲ１により総体重の５％が減少したのに対して、抗ＮＲＲ２並びに抗ｇＤおよび抗ＬＴβＲ-Ｆｃコントロール群では体重の増加が観察された(図１５Ａ)。第二の実験では、抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２をそれぞれ用いたＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の選択的な阻害は、体重に対してほとんどあるいはまったく効果がなかった。実験の結果を図２４Ａに示す。ここでは、マウスに、矢印で示される日に５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１(正方形)、抗ＮＲＲ２(三角形)又はコントロール抗体(「α-ｇＤ」、菱形)を投与した。しかしながら、抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２の両方にて処置したマウス(図２４Ａの「Ｘ」)は、７日目という早い時期に開始時の体重のほぼ２０％を失った。
発明者等は、抗ＮＲＲ１処置のみから生じた僅かな体重損失、又は抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２の両方による処置から生じた劇的な体重損失が、腸管の細胞運命決定の変化を反映するか否かを調査した。コントロールとして抗ＮＲＲ１又は抗ｇＤないしＤＢＺをマウスに投与した後、大腸(図１９)及び小腸(図２０)の切片を、様々な組織化学的染色を使用して２日目(図２０)及び７日目(図１５Ｂ)に分析した。ＤＢＺは、ＧＳＩについて既に記載されたのと同じ効果を持っていた(図１５Ｂ、ＤＢＺカラム)。Ｈｅｓ１発現の阻害は、祖先細胞の増殖の減少(Ｋｉ-６７染色で示される)と、ゴブレット細胞集団の劇的なエクスパンション(ムチンのアルシアンブルー染色で示される)と相関していた。また、リゾチーム染色は、ＤＢＺが、二次分泌細胞集団であるパネート細胞の数及び／又は活性を増加したことを示唆した(図１５Ｂ)。この示唆は更に、パネート細胞顆粒についてのアズールＡ−エオジンＢ染色を用いて裏付けられた(データは示さない)。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１は、ＤＢＺによって誘導されたものと区別を付けず腸管の変化を誘導した(図１５Ａ、３０μｍｏｌ／ｋｇのＤＢＺを１０ｍｇ／ｋｇのα-ＮＲＲ１と比較する)。これらの腸管の変化は抗ＮＲＲ１の濃度に依存しており、１０ｍｇ／ｋｇ及び２．０ｍｇ／ｋｇを使用したとき有意な細胞運命変化が観察されたが、０．４ｍｇ／ｋｇを使用したときにはほとんど変化が観察されなかった。大腸は、ＤＢＺおよび抗ＮＲＲ１処置に同様に応答した。両方の処置は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を有意に低減し(図１９、Ｈｅｓ１染色)、祖先細胞の増殖をブロックし(図１９、Ｋｉ-６７)、ゴブレット細胞数を増加させた(図１９、アルシアンブルーおよびＨ＆Ｅ)。腸管の細胞運命変化は、早い時点、この試験の２日目に弱く検出された(図２０；わずかであるが検出可能な変化、ＤＢＺおよび抗ＮＲＲ１によって生じ、Ｋｉ-６７およびアルシアンブルー染色で観察されることを注記する)。
Ｎｏｔｃｈ２シグナル伝達の阻害が腸管の細胞運命決定に同じように作用するか否かを決定するために、発明者等は、大腸(データは示さない)及び小腸(図１５Ｃ、アルシアンブルーおよびＫｉ-６７の染色を示す、図２４Ｂ、アルシアンブルー染色を示す)に対する抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２の効果を直接比較した。抗ＮＲＲ１によって、陰窩祖先細胞でのＫｉ-６７発現の減少と一致したゴブレット細胞異形成が生じたのに対して、抗ＮＲＲ２によっては、検出可能な作用はいずれも生じなかった(図１５Ｃおよび２４Ｂ、抗ＮＲＲ２を抗ｇＤコントロールと比較する)。抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２が、インビボ(図１１)及びインビトロ(図９、１０および２１)の両方でそれぞれＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２のシグナル伝達の強力かつ特異的なインヒビターとして機能するので、これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ２でなく、Ｎｏｔｃｈ１の選択的な阻害が腸管細胞の運命決定を変えるために十分であることを強く示唆する。
腸管細胞の運命決定に対するＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２の阻害効果も調査した。図２２は、抗ＮＲＲ１と抗ＮＲＲ２の、変更した腸管細胞分化に対する相乗効果を示す。雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０、４、７および１１日目に、５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１、５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ２又は５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ１＋５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＲＲ２を投与した。腸を採取し、Ｈ＆Ｅにて染色して、陰窩形態を示した。抗ＮＲＲ１又は抗ＮＲＲ２のみで処置したマウスは、１２日目に腸を採取した。両抗体にて処置したマウスは、この群のマウスは急速に体重を失ったので、６日目に腸を採取した。腸を分析したところ、抗体の組合せにより、抗ＮＲＲ１単独にて処置した後に観察された表現型より重大な表現型が生じた。これは、Ｎｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ２が哺乳類の腸において共に及び一部重複して機能することを示唆する。更なる実験によりこの所見が確認された。図２４Ｂに示すように、抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２にて処置したマウスの腸は、重大なゴブレット細胞異形成を示した。抗ＮＲＲ１単独による処置がいくつかのゴブレット細胞異形成を誘導するために十分であったにもかかわらず、抗ＮＲＲ１単独の効果は、抗ＮＲＲ１と抗ＮＲＲ２の組合せの効果と比較して軽度であった。
まとめると、この結果は、Ｎｏｔｃｈ２ではなくＮｏｔｃｈ１の強力な阻害が部分的な表現型を表すために十分であったが、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２は腸管細胞の分化において重複して機能することを示す。発明者等は、遺伝的研究では報告されていない、この部分的な表現型を検出する我々の能力は、抗ＮＲＲ１が、不完全かもしれないが、条件的遺伝子ノックアウトの後に達成される陰窩の細胞全体にわたって均一かつ強力なＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を阻害することを示すと、仮定する。重要なことに、一般的なＮｏｔｃｈ阻害の特徴であるゴブレット細胞異形成を有意に低減するかまたは妨げることによって、本明細書において報告されるＮｏｔｃｈ１−およびＮｏｔｃｈ２-特異的抗体のインヒビターは、既存のパンＮｏｔｃｈインヒビター、例えばＧＳＩよりも比較的に進歩している。
９．抗ＮＲＲ１腸管表現型のレスキュー
図２３は、デキサメサゾンが抗ＮＲＲ１によって生じた腸管の表現型を少なくとも部分的にレスキューすることを示す。抗体は、以下の通りに雌ＮＣＲ.ヌードマウス(１群につき３匹マウス)の腹膜内(ＩＰ)に投与した。
グループＡ) ベヒクルの組合せ、ＭＣＴ、１日１回、４ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤコントロール抗体、３日おき(図に示さない)；
グループＢ) デキサメサゾン、９０ｍｇ／ｋｇ、毎日(図に示さない)；
グループＣ) 抗ＮＲＲ１、４ｍｇ／ｋｇ、３日おき；
グループＤ) デキサメサゾン、９０ｍｇ／ｋｇ、毎日および抗ＮＲＲ１、４ｍｇ／ｋｇ、３日おき。
ベヒクルは、０．５％(ｗ／ｖ) ヒドロキシプロピルメチルセルロース(Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ４Ｍ)および０．１％(ｗ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ８０を含む水(ＭＣＴ)であり、前もって不都合な臨床効果を引き起こさないことを示した。
９日目に腸を採取し、抗Ｋｉ６７(増殖マーカー)およびアルシアンブルー(ムチン用)にて染色した。この実験は、デキサメサゾンと抗ＮＲＲ１の組合せにて処置したマウスは、抗ＮＲＲ１単独で処置したマウスと比較して軽度の腸管の表現型を現したことから、デキサメサゾンが抗ＮＲＲ１が誘導する分化の変化から腸を保護することを示唆した。
１０．抗ＮＲＲ２はメラノーマ細胞株の成長を抑制する
抗ＮＲＲ１及び抗ＮＲＲ２の、メラノーマ細胞株の成長に対する効果を調査した。ヒトメラノーマ細胞株ＳＫ２３およびＬＯＸ−ＩＭＶＩを、Ｊａｇｇｅｄ-１リガンド(R&D Systems, Minneapolis, MN)でコートしない(−ｊａｇ-１)又はＪａｇｇｅｄ-１リガンドでコートした(＋ｊａｇ-１)９６ウェルプレートに、低密度(ＳＫ２３では４０００細胞／ウェル、ＬＯＸ−ＩＭＶＩでは２５００細胞／ウェル)で２％ＦＢＳを含む培地に播いた。抗ＮＲＲ１(２０ｍｇ／ｍｌ)、抗ＮＲＲ２(２０ｍｇ／ｍｌ)又はγ−分泌酵素インヒビター(ＧＳＩ) ＤＡＰＴ(５μＭ)を培養物に加え、その後１日おきに再添加した。等しい体積のＤＭＳＯをベヒクルコントロールとし、等しい濃度の抗ｇＤ ＨｕＢ６ファージ抗体をアイソタイプコントロール抗体とした。プレートに播いて６日後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ(Promega, Madison, WI)を行った。結果を図２５Ａおよび２５Ｂに示す(抗ＮＲＲ１および抗ＮＲＲ２を「抗Ｎ１」および「抗Ｎ２」とする)。図２５Ａおよび２５Ｂでは、細胞生存度(ｙ軸)を、ＤＭＳＯベヒクル、−ｊａｇ-１コントロールウェルからの値と比較して表した。両メラノーマ細胞株は、抗ＮＲＲ１処置でなく、ＧＳＩ処置(特にＪａｇ１リガンドの存在下)および抗ＮＲＲ２処置に応答して生存度の減少を示した。
１１．抗ＮＲＲ２はインビトロでびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の成長を抑制する
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)は、最も一般的なタイプの非ホジキンリンパ腫である。ＤＬＢＣＬ患者の癌細胞の最近の研究は、患者のおよそ８％がＮｏｔｃｈ２にＰＥＳＴドメイン突然変異を保因していることを示した。この変異は、リガンド活性化後のＮｏｔｃｈ２シグナル伝達を延長することが予測されるものである。(Lee et al., Cancer Sci. 100: 920-926, 2009を参照)。しかしながら、ＤＬＢＣＬ細胞がＮｏｔｃｈ２阻害にどのように応答しているのかはわかっていない。したがって、発明者等は、５つのＤＬＢＣＬ細胞株に対する抗ＮＲＲ２の効果を調査した。図２６の右に列挙するＤＬＢＣＬ株を、３８４ウェルプレートのウェルに数通り３日間成長させた。細胞培養物には示した濃度の抗ＮＲＲ２を含め(図２６および２７では「抗Ｎｏｔｃｈ２」と示す)、これは１０μｇ／ｍｌで開始した３倍段階希釈物に対応している。成長は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ(Promega)を使用して評価し、アイソタイプコントロール抗体による処置と比較して細胞生存度の割合としてプロットした。図２６のデータポイントは、示した抗体濃度での各細胞株についての各々のウェルから得た平均値を表す。図２６に示すように、細胞株の一つ、「ＤＢ」の増殖は、抗ＮＲＲ２による処置によって強く阻害された。図２７は経時的なＤＢ細胞株の増殖を示す。ＤＢ株は１２ウェルプレートのウェル中で生育させ、培養物を、示した濃度のＤＭＳＯ、γ−分泌酵素インヒビターＤＡＰＴ、抗ｇＤアイソタイプコントロール抗体又は抗ＮＲＲ２にて処置した。成長は、播種して培養物を処置した２、３および５日後に生きている細胞(Vi-CELL, Beckman Coulter, Fullerton, CA)を計数することによって評価した。値は、３つの別々の培養物からの測定値の平均±標準偏差を表す。図２７は、抗ＮＲＲ２がインビトロでＤＢ ＤＬＢＣＬ細胞株の成長を抑制することを示す。
前述の発明は明確に理解するために図と例を挙げていくらか詳細に記述したが、この記載及び例は、本発明の範囲を制限するように解釈するものではない。本明細書において引用されるすべての特許及び科学的な文献の開示内容は、出典明記によってその全体に特別に援用される。

Claims (25)

  1. Ｎｏｔｃｈ２ネガティブ制御領域（ＮＲＲ）のＬｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈリピート(ＬＮＲ)−Ａドメインおよびヘテロ二量体化ドメイン(ＨＤ)−Ｃドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈ２活性を阻害するモノクローナル抗体であって、ここで、該抗体は、１０ｎＭ以下のＫｄでマウスＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲおよびヒトＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲに結合し、
    配列番号：１−２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
    配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
    配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
    配列番号：６−９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
    配列番号：１１−１３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び、
    配列番号：１５−１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
    を含む、モノクローナル抗体。
  2. Ｎｏｔｃｈ２以外のＮｏｔｃｈファミリに有意に結合しない、請求項１に記載の抗体。
  3. ＨＶＲ-Ｈ１が配列番号：１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１が配列番号：６のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２が配列番号：１１のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３が配列番号：１５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  4. ＨＶＲ-Ｈ１が配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１が配列番号：７のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２が配列番号：１１のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３が配列番号：１６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  5. ＨＶＲ-Ｈ１が配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１が配列番号：８のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２が配列番号：１２のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３が配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  6. ＨＶＲ-Ｈ１が配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１が配列番号：９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２が配列番号：１３のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３が配列番号：１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  7. ヒトＶＨアクセプター２フレームワークおよびヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも一のフレームワークをさらに含む、請求項１に記載の抗体。
  8. 配列番号：２０−２１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：２２−２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体。
  9. 配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：２２のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項８に記載の抗体。
  10. 重鎖可変ドメインが配列番号：２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
  11. 配列番号：２１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：２３−２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項８に記載の抗体。
  12. 重鎖可変ドメインが配列番号：２１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２３−２５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
  13. Ｆａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２の断片から選択される抗体断片である、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体。
  14. ヒト、ヒト化、又はキメラである、請求項１から１３の何れか一に記載の抗体。
  15. 請求項１から１２の何れか一の抗体を含む、Ｎｏｔｃｈ２活性の阻害剤。
  16. Ｎｏｔｃｈ２の発現又は活性の増加と関連する疾患を治療するための医薬であって、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体の有効量を含有してなる医薬。
  17. Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための医薬であって、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体の有効量を含有してなる医薬。
  18. メラノーマを治療するための医薬であって、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体の有効量を含有してなる医薬。
  19. Ｎｏｔｃｈ２の発現又は活性の増加と関係する疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体の使用。
  20. Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための医薬を製造するための、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体の使用。
  21. メラノーマを治療するための医薬を製造するための、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体の使用。
  22. 医薬として使用するための請求項１から１２の何れか一に記載の抗体。
  23. Ｎｏｔｃｈ２の発現又は活性の増加と関係する疾患の治療に使用するための、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体。
  24. Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体。
  25. メラノーマの治療に使用するための、請求項１から１２の何れか一に記載の抗体。
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