BRPI0913827A2 - Anticorpo monoclonal, método para inibir a atividade de notch2, método para tratar uma doença, método para tratar uma malignidade, método para tratar um melanoma, usos de um anticorpo e anticorpo nrr anti-notch2 - Google Patents

Abstract

anticorpo monoclonal, método para inibir a atividade de notch2, método pra tratar uma doença, método para tratar uma malignidade, método para tratar um melanoma, usos de um anticorpo e anticorpo nrr anti-notch2 a invenção fornece anticorpos anti-notch, e especialmente, anticorpos que se ligam à nrr notch2, e métodos de uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA A NOTCH2 NRR E INIBE A ATIVIDADE DE NOTCH2, MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA

ASSOCIADA COM O AUMENTO DA EXPRESSÃO OU ATIVIDADE DE NOTCH2, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULAS B, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM MELANOMA E USO”

REFERÊNCIA CRUZADA PARA O PEDIDO RELACIONADO Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente BR Provisório US 61/101.917, depositado em 01 de outubro de 2008, cuja o divulgação é incorporada ao presente pela referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se de maneira geral ao campo da : = <= biologia molecular. Mais especificamente, -a' presente” invenção- referesseza — 0 anticorpos anti-Notch, incluindo anticorpos anti-região regulatória negativa . : (NRR) de Notch2, e o uso dos mesmos. Também são fornecidos anticorpos 2 e | Anti-Notch1 NRR e métodos de uso. i mo TT OT O O ANTECEDENTES DA lNVENÇÃO A família do receptor Notch é uma classe de receptores o transmembrana evolutivamente conservadas que transmitem sinais que afetam o desenvolvimento de organismos tão diversos tais como ouriços do mar e seres humanos. Os receptores Notch e seus ligantes, Delta e Serrate (conhecido como Jagged em mamíferos) são proteinas transmembrana com grandes domínios extracelulares que contêm repetições similares ao do fator de crescimento epidérmico (EGF). O número de parálogas de Notch difere entre as espécies. Por exemplo, há quatro receptores Notch em mamíferos 26 —(Notch1-Notch4), duas na Caenorhabditis elegans (LIN-12 e GLP-1) e uma na Drosophila melanogaster (Notch). Receptores Notch são proteoliticamente transformados durante o transporte para a superfície celular por uma protease similar à furina no sítio S1 na extremidade N-terminal do domínio transmembrana, produzindo uma subunidade Notch extracelular (ECN) e uma subunidade Notch transmembrana (NTM) Estas duas subunidades permanecem associadas de maneira não covalente e constituem o receptor heterodimérico maduro da superfície celular.

Os receptores Notch e a via de sinalização de Notch estão revisados, por exemplo, em Aster et al.

Annu.

Rev.

Pathol.

Mech.

Dis. 3:587-613, 2008 e Bolos et al.

Endocrine Reviews 28:339- 363, 2007. As subunidades Notch2 ECN contêm 36 repetições N-terminal o similares a EGF seguida por três repetições tandem Lin 12/ Notch que (LNR) que precedem o sítio S1, Cada módulo LNR contém três pontes de dissulfeto e um grupo de residuos ácidos e polares conservados previstos para coordenar — - ——umion cálcio, Dentro da região de repetições-EGF-existem sítios de ligação — " ' para os ligantes de ativação. : oo o Notch2 NTM compreende uma região extracelular (que : abrigao = . ' ' 15 “sitio de clivagem 82), um segmento transmembrana (que abriga o sítio de vagem S3), e uma grande porção intracelular que inclui um domínio RAM28, ||| seis repetições anquirina, um domínio de transativação e a sequência PEST o carboxi-teminal.

A associação estável das subunidades ECN e NTM é dependente de um domínio de heterodimerização (HD) compreendendo a extremidade carboxi-terminal da ECN (denominada HD-N) e a extremidade amino-terminal extracelular da NTM (denominada HD-C). Antes da ativação induzida por ligante, o Notch é mantido em uma conformação de repouso por uma região regulatória negativa (NRR), que compreende as três LNRs e O dominio HD.

A estrutura cristalina da Notch2 NRR é descrita em Gordon et al. (2007) Nature Structural & Molecular Biology 14:295-300, 2007. A ligação de um ligante Notch à subunidade ECN inicia duas clivagens proteolíticas sucessivas que ocorrem através da proteólise intermembranosa regulada.

A primeira clivagem pela metaloprotease

(ADAM17) no sítio S2 torna a subunidade transmembrana de Notch suscetível à segunda clivagem no sítio S3 próximo ao folheto interno da membrana plasmática.

O sítio de clivagem S3, que é catalisada por um complexo muitiproteína contendo presenilina e nicastrina e promovendo a atividade y- secretase, libera a porção intracelular da subunidade transmembrana de Notch, permitindo a sua translocação para o núcleo e ativação da transcrição dos genes alvos. (Para uma revisão da clivagem proteolítica de Notch, vide, por exemplo, Sisodia et al.

Nat, Rev.

Neurosci. 3:281-290, 2002.) oe Cinco ligantes de Notch das classes similares a Jagged e Deita- like (Jagged-like e Delta-like) foram identificados em humanos (Jagged1 (também denominado de Serrate1), Jagged2 (também denominado de — — -— Serrate2); Delta-ikei (também denominado -DLL1), Delta-like3 "(também — É - ' denominado DLL3), e Delta-like4 (também denominado DLL4)). Cada um dos ligantes é uma proteína transmembrana de passagem única com um N-terminal o i as conservado com motivos Deita, Serrate, LAG-2 (DSL) essenciais para a ligação NE ao Notch.

Uma série de rn módulos EGF-/ike | C-terminais no | motivo DsL o precedem o segmento que atarvessa a membrana, Ao contrário dos receptores Notch, os ligantes possuem curtas caudas citoplasmáticas de 70-215 o aminoácidos na extremidade C-terminal.

Além disso, outros tipos de ligantes foram relatados (por exemplo, DNER NB3, e F3/Contactina). (Para uma revisão de ligantes de Notch e da ativação de Notch mediada por ligante, vide, por exemplo, D'Souza et al., Oncogene 27:5148-5167, 2008). A via de Notch está ativa durante diversos processos do desenvolvimento e processos fisiológicos, incluíndo aqueles que afetam a —neurogênese em moscas e vertebrados.

Em geral, a sinalização Notch está envolvida na inibição lateral, decisões de linhagem, e o estabelecimento de limites entre os grupos de células (vide, por exemplo, Bray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006). Uma variedade de doenças humanas, incluindo o câncer e doenças neurodegenerativas têm se mostrado como resultantes de mutações nos genes que codificam receptores Notch e seus ligantes (vide, por exemplo, Nam et al.

Curr.

Opin.

Chem.

Biol. 6:501-509, 2002). A conexão entre a sinalização Notch desenfreada e a malignidade foi reconhecida pela primeira vez quando uma translocação cromossômica recorrente t(7; 9) (q34; q34. 3), que cria uma variante truncada, constitutivamente ativa de Notch1t humana foi identificada em um subconjunto de leucemia linfoblástica aguda humana (LLA- T) (vide, por exemplo, Aster ef al., Annu.

Rev.

Pathol.

Mech, Dis. 3:587-613, o 2008). Em modelos de camundongos, a sinalização Notch1 tem se mostrado essencial para o desenvolvimento de células T e que os sinais mediados por Notch1 promovem o desenvolvimento de células T em detrimento do e desenvolvimento.de células-B. (vide, por exemplo, Wilson -et all.

Exp.

Med. — 7 7 194 :1003-1012, 2001). O Notch2 também está envolvido em certos: tipos de câncer.

A : Especificamente, Noteh2 está superexpresso na leucemia linfocítica crônica de O células B 1LLC-B), que por sua Vêz leva a superexpressão de CD23, uma mo característica das células da LLC-B. (Vide, Hubmann et al, Blood 99:3742- 3747, 2002). Tanto Notch2 como Notch1 são altamente expressos em células e de mieloma múltiplo (células B do plasma canceroso), e o estímulo com o ligante aumenta significativamente o crescimento das células tumorais. (Vide, Jundt et al, Blood 103:3511-3515, 2004). O Notch2 e os efetores a jusante são superexpressos no melanoma (vide Hoek et al.

Cancer Res. 64:5270-5282, 2004;. Seykora et al, Am J Dermatopatho! 25:6-11, 2003), e o focus de Notch2 é recorrentemente amplificado na linhagem de células de melanoma (Jonsson etal Oncogene, 26:4738-4748. , 2007). Atém disso, numerosos estudos têm relacionado a sinalização aberrante de Notch2 ao câncer de mama e outros tumores sólidos (revisado por Leong e Karsay, Blood 107:2223-2233, 2006). Notch2 também é necessário para o desenvolvimento das células B da zona marginal. (vide, Pillai ef al., Annu. Rev. Immunol. 23161-196, 2005). Dado o envolvimento da sinalização de Notch em uma ampla variedade de doenças humanas, fica claro que ainda existe a necessidade de agentes que possam regular a sinalização de Notch e que possuam atributos 5 —clínicose sejam favoráveis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. À invenção descrita no presente atende a essa necessidade e oferece outros benefícios. Todas as referências citadas no presente, incluindo patentes e o publicações, são incorporadas ao presente pela referência em sua totalidade.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A invenção fornece anticorpos anti-Notch e métodos de uso dos — mesmos. — — — ..— — — — — - Em um aspecto, é fornecido um anticorpo monoclonal que se liga : a Notch2 NRR., Em um exemplo de realização, o anticorpo inibe a atividade do e - Noteh2. Em outro exemplo de realização, o anticorpo não se liga Ds significativamente a um membro da família Notch diferente de Notch2. Em = — outro exemplo de realização, o anticorpo se liga a Notch2 NRR de camundongo e Notch2 NRR humano. Em outro exemplo de realização, o anticorpo se liga a o Notch2 NRR com um Kd de < 1 x 10. Em um exemplo de realização adicional, é fornecido um anticorpo monoclona! que se liga a Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende: (a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácido de acordo com a sequência consenso da SEQ ID NO: 3; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido daSEQIDNo: 4 (o) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 5; (d) uma HVRL1I compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 10; (e) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 14; e () uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 19; Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ |D NOs: 1-2; uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de . e aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 6-9; uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11-13, e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs:15 -18. Em um exemplo de realização, a NAO

112.02 = = HVRHTcompráchds d sequência de amincácidos da SEQ 1D NO: 1, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, a HVR-L2 : 15 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; é aHVRIBO " compreende a sequência de aminoácidos -da-SEQ- ID-NO15:Emoutã om o TO exemplo de realização, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da e SEQ ID NO: 2, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, eaHVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ iD NO: 16. Em outro exemplo de realização, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e a HVR-L3 compreende a sequência de —aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em outro exemplo de realização, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em qualquer um dos exemplos de realização descritos acima, o anticorpo compreende ainda de pelo menos uma região estrutural selecionada a partir de uma região estrutural aceptora 2 VH humana e uma região estrutural de consenso VL kappa — subgrupo! humano.

Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo monoclonal que se liga a Notch2 NRR em que o anticorpo compreende um domínio variável de : cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com 6 uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 20-21 e | 10 um domínio variável de cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ . 1DNO: 22-25, Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma identidade de sequência de pelo LL. Menos 90% com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 e um domínio variável de cadeia leve com identidade de sequência de pelo menos 80% com o eg sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em um exemplo dê = realização, o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, e o domínio variável de cadeia leve o compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO; 21 e um domínio variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de sequência com à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23-25. Em um exemplo de realização, o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ 1D NO: 21, e o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ 1D NOs: 23-25. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo selecionado a partir do anticorpo D, anticorpo D-1, anticorpo D-2 ou anticorpo D-3. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que se liga ao domínio LNR-A e o domínio HD-C de Notch2. Em outro aspecto, um anticorpo anti-Notch2 NRR é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab); . Em outro aspecto, um anticorpo anti-Notch2 NRR é um anticorpo humanizado, quimérico ou humano. o Qualquer um dos exemplos de realização acima pode estar presente de maneira isolada ou em combinação. Em outro aspecto, é fornecido um método de inibição da atividade “en——==- Notch2, compreendendo o dito método. a exposição de uma, célula que expressa Notch2 a um anticorpo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima. Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar uma i doença associada com aumento da expressão ou atividade de Notch2, Tm — compreendendo o método a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo a um indivíduo que necessite da mesma como em qualquer exemplo de realização acima. Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar uma o doença maligna de células B, em que o dito método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo a um indivíduo que necessite de tal conforme qualquer exemplo de realização acima. Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar um melanoma, em que o dito método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo a um indivíduo que necessite de tal conforme qualquer exemplo de realização acima.

Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar uma doença associada com o aumento da expressão ou atividade de Notch1, compreendendo o dito o método na coadministração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Notch1t NRR a um indivíduo que necessite de tal e um agente terapêutico selecionado a partir de dexametasona e tamoxifeno, em que o agente terapêutico reduz a diferenciação celular intestinal alterada causada pelo anticorpo. Em um exemplo de realização, o distúrbio é uma malignidade decélulas-T.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 exibe as sequências da região hipervariável (HVR) de cadeia pesada H1, H2 e H3 de anticorpos monocionais anti-Notch2 NRR o designado como Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e anticorpos D-3, conforme descrito no Exemplo B(1). As posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat como descrito TO OT Tabor Omo mom mo ee ee ee me A Figura 2 exibe as sequências HVR de cadeia leve L1, L2 e L3 -” - de anticorpos monoclonais anti-Notch2 NRR designado como Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e anticorpos D-3, conforme descrito no Exemplo 7 7” B(1). As posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com o sistéma |U de numeração de Kabat como descrito abaixo. e A Figura 3 mostra um alinhamento das sequências da região variável de cadeia pesada do anticorpo D, anticorpo D-1, anticorpo D-2 e anticorpo D-3. As HVRs estão inseridas em caixas, conforme descrito no Exemplo B(1). A Figura 4 mostra um alinhamento das sequências da região variável de cadeia leve do anticorpo D, anticorpo D-1, anticorpo D-2 e anticorpo D-3. As HVRs estão inseridas em caixas. As Figuras 5A e 5B mostram exemplos de sequências da região estrutural de consenso variável pesada (VH) aceptora humana para a utilização na prática da presente invenção. Os identificadores de sequência são os seguintes:

- região estrutural de consenso VH humano subgrupo | “A” menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35). - região estrutura! de consenso VH humano subgrupo | “B”, “C" e “D” menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID NOs: 36, 37, 34, 35; SEQ 1DNOs:36,37,38,35,e SEQ ID NOs: 36, 37, 39, 35). - região estrutural de consenso VH humano subgrupo 1! “A” menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOs: 40, 41, 42, 35). - região estrutural de consenso VH humano subgrupo 1 “B”, "C" e Ô “D” menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID NOs: 43, 44, 42, 35; SEQ 1IDNOs: 43, 44, 45,35, e SEQ ID NOs: 43, 44, 46 e 35). - região estrutural de consenso VH humano subgrupo Il “A” menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 35). — Re - - CT TT região estrutural de consenso VH humano subgrupo | “B”, “C" e “D” menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID NOs: 50, 51, 49, 35; SEQ 15º ÍD'NOs: 50, 51, 52, 356 SEQID NOs: 50,51, 53, 38) cm 0 = 7 5 7 e a si === -região-estrutural-aceptora-VH -humana “A” menos-CDRs -de—— - — Kabat (SEQ ID NOs: 54, 48, 55, 35). e - regiões estruturais aceptoras VH humana “B" e “C" menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID NOs: 50, 51, 55, 35, e SEQ ID NOs: 50,51,56,35). - região estrutural aceptora 2 VH humana “A” menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOs: 54, 48, 57, 35). - região estrutural aceptora 2 VH humana “B”, “C” e “D” menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID NOs: 50, 51, 57, 35; SEQ ID NOs: 50,51,58,35,eSEQID NOs: 50, 51, 59, 35). A Figura 6 exibe exemplos de sequências da região estrutural de consenso variável leve (VL) aceptora humana para a utilização na prática da presente invenção.

Os identificadores de sequência são os seguintes:

1n1

- região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo |]

(Kv1): SEQ ID NOs: 860, 61, 62, 63 - região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo |!

(Kv2): SEQ ID NOs: 64, 65, 66, 63 - região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo |Il|

(xv3): SEQ ID NOs: 67, 68, 69, 63 - região estrutural de consenso Vl. kappa humano subgrupo IV

(Kv4): SEQ ID NOs: 70, 71, 72,63 CS A Figura 7 mostra as sequências da região estrutural das cadeias levee pesada do huMAb4DS5-8. Os números em sobrescrito/negrito indicam as posições de aminoácidos de acordo com Kabat. ee ' A Figura 8 mostra as sequências da região estrutural das cadeias leve e pesada do huMAb4D5-8 com as modificações indicadas.

Os números em sobrescrito/negrito indicam as posições de aminoácidos de acordo com “OU is Rabat, NAAS ITA “o As Figuras 9A e 9B mostram que ós anticorpos ánti-NRR1 é anti ' NRR2 se ligam especificamente aos seus receptores cognatos como descrito no Exemplo B(1). (A) ensaio de ELISA mensurando a ligação do anti-NRR1 o (painel esquerdo) e anti-NRR2 (painel direito) aos fragmentos de proteina NRR purificados a partir de cada um dos quatro receptores Notch humanos (h) e murinos (m). A ligação, descrito como Asso No eixo y é representada graficamente contra uma titulação de anticorpos anti-NRR1 ou anti-NRR2. (B) ensaio de FACS mensurando a ligação do anti-NRR1 (painéis 1-6 ) ou anti- NRR2 (painéis 7-12) em células KI-CHO não transfectadas (painéis 1, 4,7 e 10), células KI-CHO transfectadas estavelmente com N-myc-Notch1 (painéis 2,5, 8 e 11) ou células KI-CHO transfectadas estavelmente com N-myc- Notch2 (painéis 3, 6, 9 e 12). Os transgenes N-myc-Notch foram expressos sob o controle do promotor induzível tet; linha inferior, controle de expressão na ausência da indução com doxiciclina (-Dox); linha superior, expressão induzida após a adição de doxiciclina (+Dox), observe que a linhagem K1-CHO expressa endogenamente Notch2, que é detectado pelo anti-NRR2 na presença e ausência de doxiciclina (por exemplo, comparar os painéis 7 e 10).

As Figuras 10º-C exibem que o anti-NRR1 e anti-NRR2 inibem especificamente a sinalização de seus receptores alvo, incluíndo os receptores que carregam mutações ativadoras conforme descrito no Exemplo B(2) e B(3). (A) ensaio co-cultura mensurando a inibição da sinalização Notch1 pelo anti- o NRR1. As células NIH-ST3 estavelmente transfectadas com Jag1i foram utilizadas para induzir a sinalização Notch em células NIH-3T3 estavelmente transfectadas com Notch1 (exceto para “-Jag1", que usou células NIH-3T3 não transfectadas no lugar de células que expressam Jag1)..A sinalização Notch foi. mensurada utilizando um gene repórter Notch (expressão controlada pelo promotor dependente de CSL de luciferase de firefly) e é expressa em relação ao controle da expressão gênica (expressão induzida por promotor constitutivo = " “da luciferase Renilla) normalizados para as condições DAPT (definido como um valor de 1). +Jag1, ensaio de co--cultura padrão; DMSO, apenas veículo DAPT; DAPT, 5 uM em DMSO; a-gD, anticorpo controle de isotipo em 2000 ng/ml; a- o NRR1, anticorpos anti-NRR1 nas concentrações indicadas, os quatro últimos ensaios incluíram 80 nom! de a-NRR1 ou um a-gD mais fragmentos de proteina purificada NRR de Notch1 ou Notch2, conforme indicado (+Y<NRR1 ou +NRR2). (B) ensaio co-cultura mensurando a inibição da sinalização Notch2 pelo anti-NRR2, Células NIH-3T3 transfectadas estavelmente com Jag1 foram utilizadas para induzir a sinalização Notch em células U87MG, que expressam altos níveis de Notch2. O ensaio foi realizado conforme descrito em (A). (C) o ensaio de co-cultura mensurando a inibição da sinalização Notch1 pelo anti- NRR1 a partir de receptores Notch1 do tipo selvagem ou mutantes, O ensaio foi realizado como em (A), exceto que as células expressando receptores foram geradas pela transfecção de plasmídeos que expressam os receptores Notch1 indicados.

WT, Notch1 do tipo selvagem; APEST, Notcht sem o domínio PEST; L1I594P, Notchtl carregando a mutação pontual ativadora constitutivamente indicada, E25, 625 ng/ml de anticorpos isotipo controle; a- —NRR1,625 ng/ml de anticorpos anti-NRR1; DMSO, apenas veículo GSI; DAPT, 5 mM em DMSO; CmpE, 1 uM de composto E em DMSO.

As Figuras 11 A-D mostram que os anticorpos anti-NRR1 e anti- NRR2 funcionam como inibidores receptor-específico in vivo, conforme descrito o no Exemplo B(4). Camundongos balb/c foram injetados quatro vezes a cada quatro dias com 5 mg/kg de controle isotípico -9D, a-NRR1 ou a-NRR2, e as células foram coletadas do timo ou baço no dia 13, um dia após a quarta dose. — — (A) as.medidas.de peso-do timo.-Os pesos dos-FTimos (em-mg) são expressos. — - em relação ao peso total do corpo (em g). Os valores representam a média mais o desvio padrão de três camundongos por grupo. (B ) contagem de 15” Células do timo. (C) FACS CD4 é CD8 para identificar células T duplo positivas — | " To CD4'/CD8*. Os números representam “a porcentagem de células do timo nas Tm Populações duplo negativa, único-positiva e duplo-positiva.

Com relação ao o controle anti-gD (77,5%), o anti-NRR1 reduziu drasticamente a percentagem de célutas na população CD4*/CD8* (5,89 %), enquanto que o anti-NRR2 (80 %) não teve efeito significativo. (D) FACS CD21 e CD23 para identificar as células B da zona marginal.

Os números representam a porcentagem média + desvio padrão (a partir de três animais) de células dentro do portão MZB, que está enquadrado e os valores de p estão igualmente anotados; gráficos representativos de um dos três animais de cada grupo são graficamente representados, Com relação ao controle anti-gD (6,61 %), o antir-NRR2 praticamente eliminou as células MZB (0,97%), enquanto que o anti-NRR1 (6 %) não teve efeito significativo.

Nas Figuras 12A-D, uma estrutura de 2,2 À de anti-NRR1

Fab/NRR1 co- cristalina indica que o anti-NRR1 contata simultaneamente os domínios LNR-A, LNR-B e HD-C, conforme descrito no Exemplo B (5). (A) Tabela resumindo a ligação de a-NRR1 ou a-NRR2 aos fragmentos de proteínas quiméricas Notch1 NRR ou Notch2 NRR.

Os fragmentos de proteína NRR indicados (azul escuro, sequências Notch1, azul claro, sequências Notch2) foram expressos como proteínas secretadas fundidas com a fosfatase alcalina para permitir medições rápidas de ligação do anticorpo em um ensaio baseado em placa.

Após usar a atividade da fosfatase alcalina para normalizar o a expressão e secreção de NRR, um meio de cultura contendo as proteínas quiméricas NRR indicadas foi adicionado a uma placa de 96 poços que havia sido revestida com a-NRR1, a-NRR2 ou anticorpo isotipo controle (utilizado — . —. paraavaliara-ligação.de fundo (inespecífica), dado.não mostrado). A.ligação.— — do anticorpo foi avaliada pela mensuração da atividade da fosfatase alcalina : que permaneceu ligada à placa.

Y, ligação forte; N, sem ligação observada, W, | 15 ligação fraca observada. (B) Estrutura do Noteh NRR1 humano.

NRR1 é 7 7 NS exibido como um esboço Cr-alfa.

C Os três íons de cálcio nos motivos LNR são — NS exibidos como esferas.

A posição do sítio de clivagem S2 é marcada com uma seta. (C) A superposição de NRR1 sobre NRR2 (cadeia A de pdb código 2004), 0 com base nos átomos estruturalmente conservados.

NRR1 (sombreado) e NRR2 (branco) são exibidos como traços C-alfa. (D) vista em livro aberto da interface entre NRR1 (esquerda) e a-NRR1 Fab (à direita, o limite entre as cadeias pesada e leve é mostrado como uma linha preta tracejada). A extensão ao qual a área de superfície acessível ao solvente está coberta pela formação do complexo é indicada.

Os resíduos que estão cobertos em pelo menos 50% são marcados, com resíduos NRR idênticos no Notch1 e Notch2 marcado em letras pretas (vide também a Figura 18). As Figuras 13A-C exibem que a antiNRR1I causa uma hiperproliferação em células endoteliais, conforme descrito no Exemplo B(6).

(A) ensaio in vitro de proliferação de células endoteliais.

As HUVECs foram revestidas em grânulos Cytodex e co-cultivadas com fibroblastos da pele.

As culturas eram submetidas a falso tratamento (mock) (controle) ou tramento com 1 puM de DBZ, 5 yg/ml de a-NRR1 ou 5 pg/ml de a-DII4. Barra = 100 um. (B) as medidas do comprimento da germinação a partir das culturas em (A). (O) Ensaio na retina de camundongos neonatos para a proliferação de células endoteliais e angiogênese.

Os camundongos neonatos foram injetados em P1 e P3 com os anticorpos indicados e as retinas foram preparadas em P5 para oe visualizar a perfusão da isolectina ou do marcador de proliferação Ki67. Painéis lell Barra = 1 mm.

Painéis Ill - VI representam ampliações de parte dos painéis | e Il, barra = 0,2 mm. — — — — As Figuras 14A-E mostram que. o anticorpo. seletivo.bloqueando a. — = sinalização de Notch1 interrompe a angiogênese tumoral e inibe o crescimento do tumor, conforme descrito no Exemplo B(7). Gráficos de três modelos de | | 15 tumores xenoenxertados exibindo o volume tumoral (média a EPM) em 7 " —— —" finção do tempo após o tratamento com os anticorpos indicados: a- Ragweed ||| (controle negativo), a-VEGF ou a-NRR1. Os valores de p são exibidos para a comparação a-Ragweed contra a-NRR1. (A) modelo Calu6. (6) modelo HM7. o (C) modelo HM7 com a titulação da dose de a-NRR1. (D) coloração da célula endotelial em cortes representativos do tumor a partir do modelo Calu6 mostrado em (A). Os anticorpos utilizados no modelo de xenotransplante são mostrados na parte superior.

DAPI e a-CD31 foram usados para coloração do DNA e células endoteliais, respectivamente, A linha inferior dos painéis mostram as imagens fundidas.

Barra = 50 um. (E) quantificação da coloração com CD31 exibida em (D). Usando o software “ImageJ” para quantificar a coloração de CD31 e DAPI em imagens semelhantes às mostradas em (D), em relação a coloração de CD31 (coloração de CD31 normalizada pela DAPI) foi representada graficamente para cada um dos três tratamentos com anticorpos em relação ao controle a-Ragweed, que foi definido para um valor de 1, os dados representam a média +/- desvio padrão sobre os 8 campos de imagem.

As Figuras 15A-C mostram que o anticorpo seletivo bloqueando Notch1 é suficiente para alterar o destino celular no intestino delgado, conforme — descritonoExemplo B (8). (A Alteração de peso corporal total (média +/- desvio padrão) em função do tempo.

Os camundongos foram tratados conforme descrito para Figura 11 com isotipo controle anti-cgD, LTBR-Fc, anti-NRR1 ou . anti-NRR2. As setas marcam o dia da administração. (B) Análise por imuno- oe histoquímica do intestino delgado.

Os camundongos foram tratados com as concentrações indicadas de isotipo controle anti-gD, DBZ ou anti-NRR1 nos dias 0, 2 e 6, e os intestinos delgados foram preparados para análise por — imuno-histoquímica no dia.7. Em cada linha .conforme indicado, a-coloração-é— — mostrada para hematoxilina e eosina (H&E), Alcian Blue para mucina e para . — evidencializar as células caliciformes secretoras, lisozima para marcar células i 15 de Paneth, Ki 67 para evidencializar a proliferação e Hes1 como um alvo a = TT jusante do Notch1. Vide as Figuras 19 e 20 para a análise do intestino grosso no dia 7 e do intestino delgado no dia 2, respectivamente.

Barra = 40 um. (C) Comparação da inibição específica de Notchl versus Notch2 sobre a o diferenciação das células do intestino delgado.

Os intestinos delgados a partir do estudo descrito em (A) foram preparados para a coloração de Alcian Blue e marcação com Ki-67, um dia após a dose final com a-gD, a-NRRi1 ou a-NRR2, conforme indicado.

Barra = 50 um.

A Figura 16 exibe que o anti-NRR1I é um potente inibidor da sinalização Notch1 induzida por diversos ligantes, conforme descrito no Exemplo B(2): Os ensaios de Co-cultura da sinalização Notch1 foram realizados conforme descrito na Figura 10A, exceto que as células expressando o ligante expressaram Jag1, Jag2 ou DLL1, como conforme indicado.

A Figura 17 mostra o baixo rendimento de construções de proteína quimérica Notch1 NRR/Notch2 NRR, conforme descrito no Exemplo B(5). A tabela completa a Figura 12A, listando as proteinas quiméricas NRR que renderam pouca ou nenhuma atividade de fosfatase alcalina secretada, sugerindo que às quimeras estavam enoveladas erroneamente ou instáveis.

Para aqueles fragmentos que renderam uma atividade da fosfatase alcalina fraca, mas detectável, a ligação de a-NRR1 ou a-NRR?2 está resumida. ---, sem expressão e ligação não testável; N, sem expressão ou ligação; W, expressão o ou ligação fraca.

A Figura 18 exibe a conservação de residuos NRR1 contatados pelo anti-NRR1, conforme descrito no Exemplo B(1) e B(5). Alinhamento da —r——sequência de aminoácidos-do- domínio Notch1 -NRR-humano (SEQ iD NO: 26)——— domínio Notcht NRR de camundongo (SEQ ID NO: 27), domínio Notch2 NRR : humano (SEQ ID NO: 28) e domínio Notch2 NRR de camundongo (SEQ ID NO: 29), com os limites de sub-domínio exibidos à direita.

O Notch1 NRR " humano está listado como a sequência de referência, e os resíduos nas outras o sequências NRR que são idênticas àquelas de Notch1 humano estão exibidas em negrito.

Os resíduos que são pelo menos 25% cobertos na estrutura do 80 anti-NRR1-Fab/Notch1-NRR (Figura 12) estão indicados, com linhas sólidas versuslinhas tracejadas refletindo um grau aumentado para o qual os resíduos estão encobertos, Dos 21 aminoácidos que estão pelo menos 25% cobertos na sequência Notch1 humana, todos os 21 são idênticos à sequência Notch1 de camundongo mas apenas seis são idênticos nas sequências do Notch2 humano e de camundongo (mais uma sétima diferença conservadora de T no lugar de S na S1712 do Notch1 humano), dos quais os resíduos idênticos e "cobertos" nas sequências Notch2, nenhum está na classe dos > 75% cobertos.

Esta comparação de sequência é consistente com (a) a forte ligação do anti-NRR1 (afinidades aproximadamente iguais) para ambos Notch1 humano e de camundongos e (b) a falta da ligação de anti-NRR1 ao Notch2 humano e de camundongo. Além disso, todos os resíduos enterrados estão sob LNR-A, LNR-B e HD-C, de acordo com o experimento de troca de domínio mostrado nas Figuras 11A e 17.

A Figura 19 mostra que o anticorpo seletivo bloqueando Notch1 é suficiente para alterar o destino celular no intestino grosso, conforme descrito no Exemplo B(8). Análises histopatológicas das amostras de intestino grosso tomadas no dia 7 a partir do experimento descrito na Figura 15B.

ô A Figura 20 mostra o desenvolvimento de alterações no destino de células intestinais dois dias após o bloqueio de Notch1, conforme descrito no Exemplo B(8). Análises histopatológicas de amostras do intestino delgado tomadas ao dia 2 a partir do experimento descrito na Figura 15B, que exibe as amostras coletadas no dia 7. — — — —— = o A Figura 21 exibe que o anti-NRR1 não bloqueia a sinalização 15- induzida por Notch2 in vitro, conforme descrito no Exemplo B(2). Ensaio de co... o — cultura em células US7MG, conforme descrito na Figura 10B. Embora o anti NRR1 iniba potencialmente a sinalização Notch1 in vitro (Figura 10A) e in vivo (Figuras 11A-C ), ela não afeta a sinalização Notch2, mesmo quando utilizada o em uma concentração (1000 ng/ml ) que está mais de 100 vezes acima do 1Cso.

Esse resultado é coerente com a ligação específica do anti-NRR1 à Notch1 (Figuras 9 e 12), bem como a falta de inibição do anti-NRR1 para Notch2 in vivo (Figura 11D).

A Figura 22 exibe os possíveis efeitos sinérgicos de anti-NRR1 e anti-NRR2 na diferenciação de células intestinais, conforme descrito no Exemplo B8.

A Figura 23 mostra que a dexametasona resgata, ao menos parcialmente, o fenótipo intestinal causado pelo anti-NRR1, conforme descrito no Exemplo B(9).

As Figuras 24A e B mostram que o bloqueio seletivo de Notch1 ou Notch2 minimiza ou evita a metaplasia de células caliciformes associadas com a inibição de pan-Notch, enquanto que o bloqueio de ambos Notch1 e Notch2 causas uma metaplasia grave nas células caliciformes. (A) Conforme descrito no Exemplo B8, os camundongos foram tratados com 5 mg/kg de anti-NRR1, anti-NRR2, ou ambos, ou um controle negativo com anticorpo anti-gD nos dias marcados com setas; é exibido a mudança de peso corporal total (média +/- desvio padrão) em função do tempo. (B) Análise imuno-histoquímica do e intestino delgado de camundongos tratados como em (A), com Alcian Blue para mucina para evidencializar células caliciformes secretoras. As figuras 25A e 25B mostram que o anti-NRR2 (referido como "anti-N2”) inibe o crescimento de linhagens de células de melanoma humano — — SK23-IMVI in.vitro, conforme descrito.no Exemplo-B(10).-/ — — = > - - A Figura 26 mostra o efeito do anti-NRR2 (referido como “anti- Notch2”) em cinco linhagens de células de linfomas de células B difusos : grandes (LOGCB) (listadas à direita). Conforme descrito no Exemplo B (9, o - : crescimento de uma das linhagens de células “DB”, foi fortemente inibida pelo É tratamento com anti-NRR2. o Figura 27 exibe o efeito de anti-NRR2 (referido como "“anti- —Notch2”) sobre o crescimento da linhagem celular DB LDGCB ao longo do tempo, conforme descrito no Exemplo B(11).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção fornece anticorpos isolados que se ligam a Notch e métodos de uso dos mesmos, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento —dedoenças associadas com à expressão ou atividade de Notch. L-TécniCAS GERAIS As técnicas e procedimentos descritos ou mencionados na presente invenção são, em geral, bem compreendidos e comumente empregados pelo uso da metodologia convencional pelos técnicos hábeis no assunto como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3º.

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Lippincott Company, 1993). 11 DEFINIÇÕES Para os propósitos de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que necessário, os termos usados na forma singular também incluirão o plural e vice-versa.

No caso de qualquer definição estabelecida abaixo conflitar com qualquer documento incorporado ao presente pela referência, a definição definida abaixo — prevalecerá.

O termo "anticorpo" na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monocionais, anticorpos polictonaisa e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos e biespecíficos) formado por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos desde que estes exibam a atividade biológica desejada.

Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado TITIcATITATA elourecuperado a partir de um componente do seu ambiente natural.

Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que" * ---- -- . poderiam interferir no uso diagnóstico, terapêutico ou pesquisa para o anticorpo —... 15 e podem incluir enzimas, hormônios é outros solutos: proteináceos. ou não proteináceos.

Em alguns exemplos de realizações,-o-anticorpo é purificado (1) CO em mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado, por exemplo, TO o pelo método de Lowry e, em alguns exemplos de realização, em mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, através do uso de um sequenciador do tipo spinning cup; ou (3) até a homogeneidade pr SDS- PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras utilizando, por exemplo, azul de Coomassie ou coloração de prata, O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente.

Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado é preparado através de pelo menos uma etapa de purificação, “Anticorpos nativos” são normalmente glicoproteinas heterotetraméricas de cerca de 150.000 D, compostas de duas cadeias leves

(L) idênticas e duas cadeias pesadas (HR) idênticas.

Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações de bissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunogiobulina.

Cada cadeia leve e pesada também contém pontes de bissulfeto intracadeias regularmente espaçadas.

Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (V4), seguido por um número de domínios constante.

Cada cadeia leve contém um domínio ' variável em uma extremidade (V., e um domínio constante na sua outra e extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada.

Acredita-se que resíduos de 1UTTÍTISCCCAaminoácido particulares formam uma relação entre a cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada.

COUT Treme : Jo . A expressão "anticorpo anti-Notch1 NRR" ou "um anticorpo que eo 15 se liga a Notch1 NRR" refere-se a um anticorpo que-é capaz de se ligar a.

Notch1 NRR com afinidade suficiente-para-que-o anticorpo se : torne útil para o OU uso diagnóstico e/ou como agente terapêutico direcionado contra Notch1. TT e Preferencialmente, a extensão de ligação de um anticorpo anti-Notch1 NRR a uma proteina Notch1 NRR não relacionada, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo para a Notchit NRR conforme mensurado, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a Noteh1 NRR tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 uM, < 100nNM, £ 10 nM, € 1 nM, ou £ 0,1NM.

Em determinados exemplos de realização, um anticorpo anti-Notch1t NRR se liga contra um epítopo de Notch, que está conservado entre Notch de diferentes espécies, por exemplo, roedores (camundongos, ratos), e primatas.

A expressão "anticorpo anti-Notch2 NRR" ou "um anticorpo que se liga a Notch2 NRR" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a

Notch2 NRR com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil para o uso diagnóstico e/ou como agente terapêutico direcionado contra Notch2. Preferencialmente, a extensão de ligação de um anticorpo anti-Notch2 NRR a uma proteina Notch2 NRR não relacionada, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo para a Notch2 NRR conforme mensurado, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a Notch2 NRR tem uma constante de dissociação (Kd) de $ 1 UM, < 100NM, Ss 10 AM, £€ 1 nM, ou s 0,1nNM.

Em determinados exemplos de o realização, um anticorpo anti-Notch2 NRR se liga contra um epítopo de Notch, que está conservado entre Notch de diferentes espécies, por exemplo, roedores (camundongos, ratos), e primatas.

TOTO TrTrco A-"região variável” ou "domínio variável” de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada “ou leve do aârticófpo: O----- - . domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como “VH". O domínio ——. 15 variável da cadeia leve pode ser referido como: “Vl”: Estes domínios são : geralmente as porções mais variáveis de-um-anticorpo.e. contém os sítios de OU ligação ao antígeno.

TO Ss O termo "variável" refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem amplamente na sequência entre os anticorpos e são utilizados na especificidade de ligação de cada anticorpo específico para o seu antigeno específico.

No entanto, a variabiidade não é distribuída uniformemente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos.

Ela está concentrada em três segmentos denominados de regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada.

As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais (frameworks) (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem 4 regiões FR cada, adotando em grande parte uma configuração de folha beta, conectadas por três HVRs, que formam alças (loops) que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta.

As HVRs de cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (vide Kabat et a, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a o participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo. . As “cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente “TT CICTC distintos, denominados kappa (K) € lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes, TO TT TT TTitrssreeis oo A Dependendo das sequências de aminoácidos dos domínios —--—— 18 constantes de suas cadeias pesadas, ós anticorpos (imunoglobulinas) podem e ser atribuídos a diferentes classes Existem-cinco. classes principais de OU imunoglobulinas: 19A, 19D, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas o em subclasses (isotipos), por exemplo, IGG, I9G>2, I9G3, I9Ga, IgA, e 1gAz.

Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de a, B, 8 e e respectivamente.

As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas de maneira geral, por exemplo, em Abbas et al.

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As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo" são utilizadas no presente de forma alternada,

para se referir a um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, e não como fragmentos de anticorpos como descrito abaixo.

As expressões se referem particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que possui uma região Fc.

Um *anticorpo nú” para os propósitos da presente invenção é um anticorpo que não está conjugado a uma fração citotóxica ou radiomarcador. “Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, compreendendo preferivelmente a região de ligação ao o *antígeno deste.

Exemplos de fragmentos de anticorpos inciuem Fab, Fab', F(ab'); e fragmentos Fv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de “OTTO CÍagmentos de anticorpos. eo.

A digestão de anticorpos pela papaína produz dois fragmentos” - - e idênticos de ligação ao antígeno, denominados fragmentos “Fab”, cada qual 18 comum único sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento “Ec” residual, cujo — . nome reflete a sua capacidade de rápida-cristalização.

O tratamento com 3 NM pepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém dois sítios de ligação a OTTO antígenos e ainda é capaz de reticular o antígeno. 0 “Fv” é o menor fragmento de anticorpo que contém um sítio de ligação ao antígeno completo.

Em uma realização, uma cadeia de duas espécies de Fv consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e em um de cadeia leve em estreita associação não-covalente.

Em uma espécie de Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável da cadeia pesada e um da cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um —peptídeo ligante flexível de tal forma que a cadeias leves e pesadas possam se associar em uma estrutura "dimérica" análoga àquela do Fv de duas cadeias.

É nesta configuração que as três HVRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL.

Coletivamente, as seis HVRs conferem a especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo.

Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicos para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer e ligar ao antigeno, embora em menor afinidadedoqueo site de ligação inteiro.

O fragmento Fab contém o domínio constante de cadeia leve e pesado e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro - domínio constante (CH1) da cadeia pesada.

Os fragmentos Fab' diferem dos oe fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na extremidade carbóxi- terminal do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteinas a partir da região de articulação do anticorpo.

Fab-SH é a designação da “TTIT-=-- presente invenção para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteina do domínio constante sustenta(m) um grupo tio! livre.

Fragmentos de anticorpos F(ab)x --- -... NS foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que possuem : pontes de cisteinas entre eles.

Outros acopláâmentos químicos. de fragmentos de anticórpos 6ão também conhecides. cm TO Fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única" ou TOM “scFv"compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, no qual estes 0 domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo.

Geralmente, o polipeptíideo scFv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL, permitindo que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno.

Para uma revisão de scFv vide Pluckthun, em The Pharmacology of Monocional Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg e Moore., (Springer-Verlag, Nova lorque), págs. 269-315. O termo “diacorpos”" refere-se à fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, em que tais fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Por meio do uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia, e criar dois sítios de ligação ao antígeno.

Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos.

Diacorpos são descritos mais detalhadamente, por exemplo, nas Patentes EP 404.097; documento WO 1993/01161; e em Hollinger et al!., Proc.

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Med. 9:129-134. o A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente refere-se à um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que COTTUTRS compreendem à. população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência Maturat--- 1... o que podem estar presentes em quantidades menores.

Assim, o adjetivo —.... 15 “monoclonal" indica o caráter do aânticórpo como-não- sendo obtido a partir de = uma mistura de anficóipos distintos Em-certas. realizações, tal anticorpo CT monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende uma sequência de TS o polipeptídeo que liga um alvo, em que a sequência de polipeptídeo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência peptídica de ligação alvo a partir de uma diversidade de sequências polipeptídicas.

Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone a partir de uma série de clones, tal como um pool de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante.

Deve-se compreender que a sequência de ligação ao alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para aprimorar a afinidade ao alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para aprimorar sua produção na cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico e etc., e que um anticorpo que compreendendo a sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monocional desta invenção.

Ao contrário das preparações com anticorpo políicional, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epíitopos), cada anticorpo monocional de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado à um único determinante sobre um antígeno.

Além de sua especificidade, as preparações com anticorpo monoclonal são vantajosas por serem tipicamente livre de contaminação por outras imunoglobulinas. ê O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como a necessidade de se produzir qualquer anticorpo CTÍTTCCATCpoRuM método específico, Por exemplo, os anticorpos monocionais a serem utilizados de acordo com a presente invenção, podem ser produzidos por uma cc cc. . : . série de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, NL Kohler e Mitstein, Nature, 256:495-97' (1975); -Hongo et al., Hybridoma, 14 Er. a — 253-260 (1905), Harlow êt al; Antibodies:-A-Laboratory Manual, (Cold Spring NA Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling ef al, in: Monoclonal o Antibodies e T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, Patente US 4.816.567), tecnologias de exibição por fago (vide Clackson e! a/., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J.

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5.661.016; Marks et al.Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al. —Nature368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, Ínfem. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem so 6 especificamente anticorpos “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica com, ou homóloga a, sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencendo a uma classe A ou Subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da.cadeia é idêntico — - - - - o com, ou homóloga as, sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies, ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, ee 15* bem &ômo fragmentos destés anticorpos, desde due eles exibam a atividade ||| i cc biológica desejada (vide, por exemplo Patente US 4.816 /BB7; e Momisonefal, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos o incluem anticorpos PRIMATIZEDO onde a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivado de um anticorpo produzido por, por exemplo, macacos imunizados com o antígeno de interesse. Formas “humanizadas” de anticorpos não-humanos (tal como, murino) são anticorpos quiméricos que contém uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Em um exemplo de realização, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) —emque resíduos de uma HVR do receptor foram substituídos pelos resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejada(s). Em alguns casos, os resíduos FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, anticorpos humanizados podem conter resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são produzidas para refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das alças (loops) hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs Ú o são de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado poderá também compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fo), tipicamente a de uma imunoglobulina humana, Para maiores detalhes, vide, por exempla, Jones el. al... Nature — - - - - “O O O 391:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Veja também, por exemplo, Vaswani e

2. 15 = Hamilton, AnÃ. Allergy, Asthiná & iramuriol 1:1057115 11698). Harris, Biochem. | Soc: Transactions-23:1035-1038-(1995); Hurle é Gross, Cum Op. Biotech | NS 56:428-433 (1994); e Patentes US 6.982.321 e US 7.087.409. Um “anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de o aminoácido que corresponde à sequência de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzido pelo uso de qualquer técnica para a produção de anticorpos humanos conforme descrito no presente. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não-humanos de ligação ao antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no —estado da técnica, incluindo bibliotecas de exibição por fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descritos em Cole et al. Monoclonal

Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e Boerner et al. J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Veja também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5:368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir esses anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desativados, por exemplo, o xenocamundongo (xenomice) imunizado (vide, por exemplo, Patente US 6.075.181 e US

6.150.584 com relação à tecnologia XENOMOUSES). Vide também, por o exemplo, Lú et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 103:3557-3562 (2006) sobre anticorpos humanos gerados por meio da tecnologia de hibridoma de células B humanas. eee o termo “região hipervariáve!, “HVR”. ou “HV”, quando utilizado. -— -— + - no presente refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. ie o 8 Gerâlmênie, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na NT (81 CC e --H2-H3)-etrês nã VUICT, LZ, T3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exbema |U maior diversidade dentre as seis HVRs e acredita-se que a H3 em particular, e desempenha um papel único na conferencia da especificidade fina aos anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000);. Johnson e Wu, em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed, Human Press, Fairfield, NJ, 2003). De fato, anticorpos camelídeos de ocorrência natural constituído por apenas uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência da cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers Casterman et al, Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996). Diversos delineamentos da HVR são utilizados e englobados no presente documento. As regiões determinantes de complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade das sequências e são as mais comumente usadas (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological

Interest, 5º Ed, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991). Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J.

Mol.

Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs do AbM representam um acordo entre as HVRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo s programa “Oxford Molecular ABM antibody modeling software". O "contato" das HVRs é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino disponíveis.

Os resíduos de cada uma destas HVRs são descritas a seguir.

Alça (Loop) Kabat ADM Chothia Contato o [| L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 —LSO0-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 Le 13 L89197 L189-L97 . LOI-LOG. -L8D-1L96- — - — = = = *--" TITO H1 H31-H356B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeração de Kabat) Aee - 46 0 x HaiHas (R26035 HieHãa úHacHas o o (Numeração de Thotiay mm H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 Ho5-H102 Ho6-H101 H93-H101 o As HVRs podem compreender “HVRs estendidas” da seguinte forma: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 9295-102 (H3) na VM.

Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al, supra para cada uma dessas definições.

Resíduos da "região estrutural” (framework) ou "FR" são aqueles — resíduos do domínio variável que não são resíduos da HVR conforme definido no presente.

Os termos “numeração do resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração da posição do aminoácido como em Kabat" e variações destes, se refere ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat ef al. supra.

Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos, oque corresponde a redução ou inserção em uma FR ou HVR do domínio variável.

Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c, etc., de o acordo com Kabat), após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada.

A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma e =. — — Seqguência.numerada de Kabat."padrão"”. = = — = -=- = = ms mom my - 7 O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, os resíduos 1-107 Ae Í 15 da cadeia leve e residuos 1 13 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat ef al. -“— ——— Sequences of Immunological Interest. 5th Ed.

Public Health Service, National || NS Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). O "sistema de numeração EU" ou o "índice EU" é geralmente usado quando se faz referencia a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et a/. Supra (1991). O “índice EU como em Kabat” refere-se a numeração do resíduo do anticorpo humano IgG1 EU.

Salvo quando disposto de outra maneira no presente documento, referência aos números de resíduos no domínio variável de anticorpos significa a numeração de resíduos utilizando o sistema de numeração de Kabat.

Salvo quando expresso de outra maneira na presente invenção, as referências aos números de resíduos no domínio constante de anticorpos referem-se à numeração dos resíduos pelo sistema de numeração EU (vide, por exemplo, Pedido de Patente US 2008/0181888, Figuras para a numeração EU).

Um anticorpo “maturado por afinidade” é um anticorpo que possui uma ou mais alterações em um ou mais HVRs do mesmo que resulta na melhora da afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno, comparado ao anticorpo parental que não possuí tal(ais) alteração(ões). Em um exemplo de realização os anticorpos maturados por afinidades preferidos irão possuir afinidades nanomolares ou ainda picomolares ao antígeno alvo.

Anticorpos maturados por afinidade são produzidos pelo uso de determinados procedimentos conhecidos no estado da técnica.

Marks, et a/., Biotechnology oe 10:779-783 (1992) descrevem, por exemplo, a maturação por afinidade através da mistura (shuffling) do dominio VL e VH.

A mutagênese aleatória da HVR efou resíduos da região estrutural é descrita em, por exemplo, Barbas, et al, ee Proc.

Nat Acad.

Sci, USA 91:3809-3813(1994);.Shier.et.al., Gene 4169:147-155— > - - - (1995); Yelton et al, J.

Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson ef al., J.

Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J.

Mol.

Biol. 226:889-896 e. : “= cas (1999 i oe coro co TOS eU anticorpo de “Bloqueio” ou anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga.

Determinados anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem de o forma completa ou substancial a atividade biológica do antígeno.

Um “anticorpo agonista”, conforme utilizado conforme utilizado no presente, é um anticorpo que mimetiza parcialmente ou totalmente pelo menos uma das atividades funcionais de um polipeptídeo de interesse.

Os anticorpos “inibidores do crescimento” são aqueles que impedem ou reduzem a proliferação de uma célula que expressa um antígeno —aoqualo anticorpo se liga.

O anticorpo pode, Por exemplo, prevenir ou reduzir a proliferação de células cancerosas in vitro e/ou in vivo.

Os anticorpos que “induzem a apoptose" são aqueles que induzem à morte celular programada, conforme determinado por ensaios de apoptose padrões, como a ligação da anexinaa V, fragmentação do DNA, retração das células, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas da membrana (chamadas de corpos apoptóticos). Um anticorpo com "funções efetoras" refere-se às atividades biológicas atribuídas a região Fc (uma sequência nativa da região Fc ou uma sequência de aminoácido variante da região Fc) de um anticorpo, e variam de . acordo com o isotipo do anticorpo.

Exemplos de funções efetoras incluem: oe ligação de C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCO); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular -— —.— (porexemplo;receptor de célula.B), e-ativação-de-células BZ = — — — — — — O termo "região Fc" é usado no presente para definir uma região . C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a sequência A 6 nativa de regiões Fce regiões Fc variantes.

Embora os limites da região Fc da a “cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada — NES da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um o resíduo de aminoácidos na posição Cys226, ou a partir da Pro230, até a região carboxi-terminal desta.

A lisina C-terminal (resíduo 477 de acordo com sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou pela construção de um ácido nucleico recombinante que codifca uma cadeia pesada do anticorpo.

Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos podem incluir populações de anticorpos com todos resíduos K447 removidos, populações de — anticorpos sem a remoção dos resíduos K447, e populações de anticorpos com uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma "função efetora” de uma sequência nativa da região Fc.

Exemplos de "função efetora"

incluem a ligação de C1q; CDC; ligação ao receptor de Fc; ADCC; fagocitose; regulação negativa "down regulation" dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.

Tais funções efetoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável do anticorpo) e podem ser avaliadas usando os vários ensaios conforme divulgado, por exemplo, em Definições da presente invenção. , Uma “região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência o de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza.

Região Fc humana de sequência nativa inclui uma região Fc de IgG, humano de sequência nativa (alótipos não-A e A); região Fc eae Lt IgG? humano de sequência nativa; região Fc.-de-lgG3-humano de sequência — = * 7 nativa, região Fc de IgG, humano de sequência nativa, bem como as variantes de ocorrência natural destas. : eee o 15 oo Uma “fegião Fc variante" “compreende uma sequência de e —— =" — grinóscidos quê difere da região Pc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência, uma ou mais o substituição(õdes) de aminoácido(s). Preferivelmente, a região Fc variante possui pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparada a uma região Fc de sequência nativa ou a uma região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental.

À região Fc variante da presente invenção irá possuir preferencialmente cerca de — pelomenos 80% de homologia com uma sequência da região Fc nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptideo parental, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta.

Os termos “receptor de Fc” ou “FcR” descrevem um receptor que se liga a uma região Fc de um anticorpo.

Em alguns exemplos de realização, um FcR é um FCR nativo humano.

Em alguns exemplos de realização, um FCR é aquele que se liga a um anticorpo !9gG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FeyR!, FeyRIl, e FeyRiHI, incluindo variantes alélicas e formas que sofreram splícing alternativo destes receptores.

Receptores FeyRil incluem FeyRIiIA (um "receptor de ativação") e FCyRIIB (um "receptor de inibição"), que possuem sequências similares de aminoácidos que diferem entre si o principalmente em seus domínios citoplasmáticos.

O receptor de ativação FeyRIIA possui um motivo de ativação com base em imunoreceptor tirosina (UTAM), no seu domínio citoplasmático.

O receptor de inibição FeyRIIB possuí A LU motivo de inibição com base em. imunoreceptor tirosina—(ITiM) no seu — - - domínio citoplasmático. (vide, por exemplo, Daêron, Annu.

Rev. immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revistos, por exemplo, em Ravetch e Kinet NS - = 46” Annã, Re lamunol Siast-62 (1961)[ Câpei et al, immunomethods 4:25-34 e 11998): e de Maas etal u Lab.

Clin Med 126:330-41 (1995). Outras FERS,ÉU| incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, são englobadas pelo termo “FeR” na presente invenção. o O termo “receptor de FC” ou “FcR” também inclui o receptor — neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (Guyer et al, J.

Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al, J.

Immunol. 24:249(1994)), e regula a homeostase das imunoglobulinas.

Métodos para a medição da ligação ao FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie e Ward., Immunol.

Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al, Nafure — Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J.

Biol.

Chem. 279(8):6213- 6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.) A ligação ao FeRn humano in vivo e a meia vida no soro dos polipeptídeos que se ligam a FcRn humano com alta afinidade de ligação podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou transfectados com linhagens de células humanas expressando FcRn humano, ou administrado em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. O documento WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos com ligação aos FcRs melhorada ou diminuída. Vide também, por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):8591-6604 (2001). "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Em determinados exemplos de [ ligação, as células expressam pelo menos FCyRIlIl e realizam função(ões) efetora(s) de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células e = .—Mmatadoras naturais. (natural killer eu NK);-monócitos;-células- T-citotóxicas e 7 o neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte natural, por exemplo, do sangue. : e 16 TOS “Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" e e — — — —+ADCC* referem-se à uma forma de citotoxicidade em que a lg secretada ligada aos receptores Fc (Fcrs) presentes em certos tipos de células citotóxicas (por o exemplo, células NK (natural killer), neutrófilos e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a um antígeno sobre a célula-alvo e, em seguida, mate a célula-alvo com citotoxinas. As células primárias para mediara a ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIl, enquanto que os monócitos expressam FeyRI, FeyRill e FeyRIIl. À expressão FCcR em células hematopoiéticas é resumida na tabela 3, página 464 de Ravetch et al, Anmnu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para avaliar a — atividade ADCC de uma molécula de interesse, podem ser realizados ensaios ADCC in vitro, tais como os descritos nas Patentes US 5.500.362 ou US

5.821.337 ou Patente US 6.737.056 (Presta). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células PBMC e células NK. Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal conforme descrito em Clynes et al, PNAS (USA) 95:652-656 (1998). “Citotoxicidade dependente de complemento" ou “CDC” refere-se alisede uma célula alva na presença de complemento.

A ativação da via clássica do sistema complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) ao anticorpo (de subclasse apropriada) que está ligada ao seu antígeno cognato, Para avaliar a ativação e do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro ef al., J.

Immunol.

Methods 202:163 (1996). Os polipeptídeos variantes com alterações nas sequências de aminoácidos da — — — região Fc (polipeptideos-com-uma região-Fc variante): e-aumento ou diminuição — = 7 da capacidade de ligação ao C1q estão descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US 6.194.551 B1 e documento WO 1999/51642. Vide também, por UU " exemplo, Idusogie et al.

J: Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Na - Ns "o temo "anticorpo compreendendo região Fo refere-se : a um anticorpos que compreende uma região FC.

A lisina C-terminal (resíduo 477 de e acordo com sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do polipeptídeo, ou pela construção de um — ácido nucleico recombinante codificador do anticorpo.

Consequentemente, uma composição compreendendo um anticorpo contendo uma região Fc de acordo com a presente invenção, pode compreender com K447, com todos os resíduos K447 removidos, ou uma mistura de anticorpos com e sem resíduos K447. “Afinidade de ligação" refere-se, em geral, à força da soma total de interações não-covalentes entre um sítio de ligação isolado de uma molécula (tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como, um antigeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo,

refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). À afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção.

Anticorpos de baixa afinidade ligam de forma fraca o antígeno e tendem a dissociar rapidamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade ligam o antígeno de forma mais forte e permanecem ligados por mais oe tempo.

Uma variedade de métodos para mensurar a afinidade de ligação são conhecidos no estado da técnica, no qual qualquer um deles podem ser utilizados para os propósitos da presente invenção.

Exemplos de realização “= .— .especificosilustrativos e exemplares-para-mensurar-a afinidade de-ligação são — 7 descritos a seguir. . : Em um exemplo de realização, "Kd" ou J valor de Kd"deacordo 0 “com a presente invenção é mensurado por um teste de ligação com antígeno o NS MT radiomarcado (RIA) realizado com a versão | Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno como descrito pelo seguinte ensaio.

A afinidade de ligação da o solução dos Fabs pelos antígenos é mensura equilibrando o Fab com uma mínima concentração de antígeno marcado com 11º? na presença de uma titulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida, capturando os antígenos ligados com uma placa revestida com anticorpos anti-Fab (vide, por exemplo, Chen, et al., (1999) J.

Mol Biol 293:865-881).865-881). Para estabelecer as condições do ensaio, placas de múltiplos poços MICROTITERº (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de anticorpo —antiFab de captura (Cappel Labs), em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e, em seguida, é feito o bloqueio com albumina bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 ºC). Em uma placa não adsorvente (Nunc f 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno 1125] são misturados com diluições seriadas de um Fab de interesse (por exemplo, coerente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12 em Presta et al., Cancer res. 57:4593-4599 (1997)). A Fab de interesse é, em seguida, incubado durante a noite, no entanto, a incubação pode continuar por um longo período (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado.

Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para a incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então retirada e a placa lavada oito vezes, com 0,1% de Tween-20º em PBS. | oe Após as placas estarem secas, 150 ul/poço de cintilante (MicroScint-20º; Packard) é adicionado, e as placas são contadas em um contador TOPCOUNT gamma (Packard) por dez minutos, As concentrações de cada Fab que resulta 2 — em menos ou iguala 20% do máximo de ligação são-escolhidas-para a- cc — co utilização em ensaios de ligação competitiva.

De acordo com outro exemplo de realização Kd ou valor de Kd é e “ mênsurado pelo ensaio de ressonância plasmónica de Cguperfície utilizando o TA — BIACÓrEB-Z000 ou BlAcore&W-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºCcom | o chips CM5 de antígeno imobilizado — 10 Unidades de Resposta (RU). Resumidamente, chips biosensores de dextrano carboximetilados (CMS, o BlAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-NV-(3-dimetilaminopropil)- —carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.

O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 ug/ml (- 0,2 uM) antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 plminuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteina acoplada.

Após a injeção do antígeno, etanolamina 1 M é adicionada —para bloquear grupos que não reagiram.

Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetados em PBS com 0,05% de surfactante Tween-20 (PBST) a 25 ºC em uma taxa de fluxo de cerca de 25 plímin.

A velocidade de associação (Kon) € a velocidade de dissociação

(ko) São calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BliAcore Evaluation Software version 3.2) pelo ajuste simultâneo de sensogramas de associação e dissociação.

A constante do equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como à relação kot/Kon.

Vide, por exemplo., Chen, Y.etal, (1999) J.

Mol, Biol. 293: 8865-881. Se a medida for superior a 10º M*? S" pelo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima, então a taxa pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de oe fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a25ºC de 20 nM de um anticorpo anti-antígeno (na forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno = mensurado em espectrômetro,-tal como -um-espectrofotômetro equipado-com— = - válvula do tipo stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM- Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta. e . = Uma “Velocidade de entrada” ou “velocidade de associação” ou Na ks”, de acordo a presente invenção também pode ser determinada utilizando e.

NS mesmo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima usando um sistema o BlAcoreTM-2000 ou BlAcoreTM-3000 (BlAcore Inc., Piscataway, NJ). O termo “substancialmente semelhante” ou “substancialmente o mesmo", conforme utilizado no presente, denota um grau de semelhança suficientemente elevado entre dois valores numéricos (por exemplo, um associado a um anticorpo da invenção e o outro associado a um anticorpo de referência/comparação) de tal forma que um técnico hábil no assunto iria considerar a diferença entre os dois valores como de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística no contexto da característica biológica mensurada pelos valores citados (por exemplo, valores Kd). A diferença entre os dois valores é, por exemplo, inferior a 50%, inferior a 40%, inferior a 30%, inferior a 20% e/ou inferior a 10% em função do valor de referência/comparação.

As frases “substancialmente reduzida” ou “substancialmente diferentes”, como utilizadas no presente, denotam um grau de diferença suficientemente elevada entre dois valores numéricos (geralmente, um —associadoa um anticorpo da invenção e o outro associado a um anticorpo de referência/comparação) de tal forma que um técnico hábil no assunto iria considerar a diferença entre os dois valores como sendo estatisticamente - significante no contexto da característica biológica mensurada pelos valores e citados (por exemplo, valores Kd). A diferença entre os dois valores é, por exemplo, superior a 10%, superior a 20%, superior a 30%, superior a 40%, e/ou superior a 50% em função do valor de referência/comparação.

— m— —————— Uma- “região-estrutural- humana-aceptora” ou “região estrutural — e aceptora humana" para os propósitos da presente invenção é uma região , estrutural compreendendo a.. sequência de aminoácidos de uma região = — estrutural Vi ou Vw derivada de uma região estrutural da imunoglobulina humana, ou uma região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural humana aceptora "derivada de" uma região estrutural de uma imunogiobulina o humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido desta ou pode conter uma alteração na sequência de aminoácidos pré-existente. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos pré-existentes são de 10 ou menos, nove ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, É ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Quando as alterações de aminoácidos pré-existentes estão presentes em um VH, essas alterações ocorrem preferencialmente em apenas três, dois, ou uma das posições 71H, 73H e 78h, por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora V, é idêntica em sua sequência com a sequência da região estrutural da imunoglobulina humana V, ou sequência da região estrutural de consenso humano. -Q- Uma "região estrutural de consenso humano" é uma região estrutural que representa os mais comumente resíduos de aminoácidos que ocorrem em uma seleção de sequências da região estrutural V, ou V, da —imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção das sequências V4 ou Vida imunoglobulina humana é originada de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al. supra Em um exemplo de realização, para o V.1, o o subgrupo é subgrupo kappa | como em Kabat ef al. supra Em um exemplo de realização, para o Vi, o subgrupo é subgrupo Il! como em Kabat ef al. supra Uma "região estrutural de consenso VH subgrupo ll” compreende «== - a-sequência de-consenso obtida a partir-das sequências de-aminoácidos-no- — subgrupo Ill variável pesada de Kabat et al. supra. Em um exemplo de realização, uma região estrutural receptora humana é derivada da região e estrutural de consenso VH subgrupo UM e. composta por uma sequência de NS aminoácidos que compreende pelo menos uma parte ou a totalidade decada | uma das seguintes sequências: (SEQ ID NO: 50) - H1 (SEQ ID NO: 51) - H2 e (SEQ ID NO: 57 ou 59) - H3 (SEQ ID NO: 35). Em alguns exemplos de realização, o último resíduo (811) da SEQ ID NO: 35 é substituído por uma alanina.

Uma “região estrutural de consenso VL subgrupo |!" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoácidos no subgrupo | kappa variável leve de Kabat et al. supra. Em um exemplo de realização, a sequência de aminoácidos da região estrutural de consenso — subgrupo] VH compreende pelo menos uma parte ou a totalidade de cada uma das seguintes sequências: (SEQ ID NO: 60) - L1 (SEQ ID NO: 61), L2 (SEQ ID NO: 62) - L3 (SEQ ID NO: 63). “purificada” significa que uma molécula está presente em uma amostra em uma concentração de pelo menos 95%, em peso, ou pelo menos 98% em peso da amostra na qual ela está contida.

Uma molécula “isolada” de acido nucléico é uma molécula de ácido nucléico que está separada de pelo menos uma outra molécula de acido nucléico com a qual está comumente associada, por exemplo, em seu ambiente natural.

Uma molécula isolada de ácido nucléico inclui ainda uma molécula de ácido nucléico contida nas células que normalmente expressam a molécula de ácido nucléico, mas a molécula de ácido nucléico está presente e extracromossomalmente ou em um local cromossômico que é diferente da sua localização cromossômica natural.

O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere- - — . a uma molécula -de-ácido-nucléico-capaz de transportar outro ácido nucléico——= ao qual ele foi ligado.

Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um — DNA de fita dupla circular ao qual, segmentos de DNA adicionais podem ser ligados.

Outro tipo de vetor é um vetor fago.

Outro tipo de vetor é um vetor =— viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do " genoma viral.

Determinados vetores são capazes de realizar replicação oe autônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, sendo, desta forma, replicado junto com o genoma hospedeiro.

Adicionalmente, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão —operacionalmente ligados.

Tais vetores são denominados na presente invenção como “vetores de expressão recombinantes" ou simplesmente, "vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão para uso em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente presentes na forma de plasmídeos.

De acordo com o presente relatório descritivo, os termos “plasmídeo" e “vetor” podem ser utilizados de forma alternada, sendo que o termo “plasmídeo” é a forma de vetor mais comumente utilizada. “Polinucleotídeo” ou "ácido nucléico”, utilizada na apresente Ss invenção de forma intercambiável, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA.

Os nucleotídeos podem ser deoxiribonucieotídeos, ribonucleotideos, nucleotídeos modificados ou bases, R €/ou análogos destes, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um o polímero pela DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética.

Um polinucleotideo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos.

Se presente, a modificação na

—. estrutura do nucleotídeo-pode ser .realizada antes ou após..a montagem. do polímero.

A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes — não-nucleotídeos, Um polinucleotídeo pode conter modificações feitas após de síntese, como a conjugação com um marcador.

Outros tipos de modificações NS incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais nucleotídeos de = ocorrência natural com um análogo, modificações em internucleotídeos tais o como, por exemplo, aquelas com ligações não-carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (tal como fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas que contêm frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinal, plyL-lisinay etc), aquelas com intercalantes (tal como acridina, psoraleno, etc.), aquelas que contêm quelantes (tais como, metais, metais radioativos, bóro, metais oxidativos, etc.), aquelas que contêm alquilantes, aquelas com ligações modificadas (tal como ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como as formas não modificadas de polinucleotídeos.

Adicionalmente, qualquer um dos grupos hidroxila geralmente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados para suportes sólidos ou semi-sólidos.

A extremidade terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilada .ou substituída com unidades de moléculas orgânicas de proteção ou aminas de 1 a 20 átomos de carbono.

Outras hidroxilas podem ainda ser derivatizadas para grupos protetores.

Os polinucleotídeos podem ainda conter formas análogas de açúcares ribose ou deoxiribose são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'- o O-metil-, 2'-O-alil, 2-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carboxílico, i 10 açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos = acíclicos, e nátogos de nucleosídeos básicos tais como metil-ribosídeo, Uma... — — ou mais das ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação : — alternativos.

Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não se limitam — 1 a realzaçõesem que o fosfato é substituído por P(O)S(“ticato”), P(S)S = 7 ("diticato”), "(O)NR2 (famidato”), P(OJR, P(OJOR', CO ou CH2 (formacetalM, ||| em que cada R ou R' é independentemente H ou alquil substituído ou não- substituído (1-20 C.) contendo opcionalmente uma ligação éter (-0-), arila, o alquenila, cicloalquila, cicloalquenila, ou araldila.

Nem todas as ligações no —polinucleotíideo precisam ser idênticas.

A descrição anterior aplica-se a todos os polinucleotídeos descritos no presente, incluindo RNA e DNA. “"Oligonucleotídeo," da forma utilizada no presente, refere-se geralmente a polinucleotídeos curtos e de fita simples, geralmente sintéticos, que normalmente apresentam, mas não necessariamente, menos de cerca de 200 nucleotideos de comprimento Os termos “oligonucleotídeo” e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos.

A descrição acima para polinucleotídeos —é igualmente e completamente aplicável para oligonucleotídeos.

O termo “Notch”, da forma como é utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer Notch nativo (Notch1-4) a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como os primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, ratos e camundongos), salvo quando indicado em contrário O termo engloba formas de Notch “de comprimento total" não processadas, bem como qualquer forma de Notch que resulte da transformação na célula.

O termo também abrange formas variantes que ocorrem naturalmente de Notch, por exemplo, as variantes com splicing o alternativo ou variantes alélicas.

O termo “Notcht”, da forma como é utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer Notchf nativo a partir de qualquer fonte de - e vertebrados, incluindo mamíferos, como os.primatas.(poór exemplo,..humanos) e... — = roedores (por exemplo, ratos e camundongos), salvo quando indicado em contrário.

O termo engloba formas de Notch1t “de comprimento total” não 7 15 processadas, bem como qualquer forma de Notcht que “Tesulte da 7 : —— -ransformação na célula.

O fermo também abrange formas variantes que | ocorrem naturalmente de Notch1, por exemplo, as variantes com splicing o alternativo ou variantes alélicas.

O termo “Notch2”, da forma como é utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer Notch2 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como os primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, ratos e camundongos), salvo quando indicado em contrário.

O termo engloba formas de Notch2 “de comprimento total” não processadas, bem como qualquer forma de Notch2 que resulte da transformação na célula.

O termo também abrange formas variantes que ocorrem naturalmente de Notch2, por exemplo, as variantes com splicing alternativo ou variantes alélicas.

O termo “atividade de Notch2”" refere-se a sinalização Notch2. Um agente (por exemplo, um anticorpo) que “inibe a atividade de Notch2" diminui significativamente a sinalização Notch2 em relação ao nível de sinalização Notch2 observada em um controle adequado sob condições substancialmente idênticas.

Em determinados exemplos de realização, a atividade Notch2 pode ser avaliada por um ensaio repórter adequado, conforme descrito na presente invenção no Exemplo B(2). Em determinados exemplos de realização, a atividade Notch2 pode ser avaliada mensurando a geração de células na zona ' B marginal, conforme descrito na presente invenção no Exemplo B(4). Em oe determinados exemplo de realização, a diminuição da sinalização Notch2 é, pelomenos, 2-, 3-, 4 -, 5-, ou 10 vezes abaixo do limiar observado no controle.

O termo "Notch2 NRR" refere-se a uma região de Notch2 — —. composta portrês módulos LNR (LNR-A, LNR-B, e LNR-C ) e o domíinio-HD—. = - (HD-N e HD-C). Sequências exemplares de Notch2 NRR humano e de camundongo são mostradas na Figura 18 (SEQ ID NOs: 28 e 29, o 15 Tespectivamente). O Notch2 NRR pode consistir de fragmentos não ligados 7 i TES — —covalentemente, por exemplo, resultantes da transformação de Notch2 em S1, O bem como uma sequência polipeptídica contígua.

A título de exemplo, e com referência à Figura 18, o Notch2 NRR humano podem consistir dos o aminoácidos 1422-1677 do Notch2 humano (SEQ ID NO: 75) ou, —alternativamente, dos aminoácidos 1422-1608 da SEQ ID NO: 75 covalentemente ligados aos aminoácidos 1609-1677 da SEQ ID NO: 75. , “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos” com relação à uma sequencia polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referencia, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público, tal como os softwares BLAST, —BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo o comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O — -— programa- de computador para-comparação. de sequências ALIGN-2 é de. — autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, : 5 Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o nº de Registro de Direitos 7 NE Autorais Norte-Americano —TXUS10087. O programa ALIGN-2 está = NM publicamente disponível pela Genentech, Inc., San Francisco do Sul, Califórnia, o ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinado sequência de aminoácido A que contenha uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B ) é calculado da seguinte forma:

100 vezes a fração XY No qual, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliados como coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é à quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento o da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de | 10 aminoácidos de A para B não seja igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. À menos que especificamente = e .indicado- em contrário, todos os—valores- percentuais- de —identidade - de- = — sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2.

i 15 - 7 um "distúrbio" ê qualquer condição « ou doença que possa se = B o “peneficiar de um tratamento com uma composição ou método da presente | Ss invenção. Isto inclui distúrbios agudas e crônicas incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos o não limitantes de distúrbios de serem tratados na presente invenção incluem condições como o câncer. As “malignidades de células B" também denominadas de "neoplasias de células B" incluem, mas não estão limitadas a doença de Hodgkin (por exemplo, a doença de Hodgkin do subtipo predominância linfocitária (LPHD)), linfoma não-Hodgkin (LNH); linfomas de célula centro — folicular (FCC) e leucemia linfocítica aguda (LLA, também chamada de LLA-B), Leucemia Linfoblástica de Precursor B; leucemia linfocítica crônica (LLC, também chamada de LLC-B); leucemia de células cabeludas; linfomas de células B da zona marginal (incluindo dos tipos nodal, MALT, e esplênico);

mieloma múltiplo (plasmocitoma, mieloma das células plasmáticas); linfomas de células pequenas não clivadas (por exemplo, linfoma de Burkitt); linfomas de células grandes (incluindo de grandes células difuso (células B), de células mistas difuso, e linfoma imunobiástico); linfoma de células do manto, linfoma linfocítco de pequenas células, linfomas relacionados com a AIDS e macroglobulinemia de Waldenstrôm. O linfoma indolente é uma doença incurável de crescimento lento, no qual o paciente sobrevive em média entre seis e 10 anos após numerosos períodos de remissão e recaída; linfomas o agressivos são formas de linfoma com rápido crescimento e de alto grau que abrange algumas categorias de graus intermediários do LNH, ” O termo “melanoma” referese a um tumor maligno de "——melanócitos que são enéohtrados” principalmente ha pele, mas que” também—* são encontrados nos olhos (melanoma uveal) ou nos intestinos. OA Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações = como tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula que está sendo tratada, e pode — * ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. o Os efeitos desejáveis de tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado doentio, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio, ou para retardar a progressão de ' 25 uma doença ou distúrbio.

Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente” é um vertebrado. Em certas realizações, vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esportes, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas camundongos e ratos. Em algumas realizações, o mamífero é um humano.

O termo “formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em uma forma que permita que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação deveria ser administrada. Tais formulações podem ser estéreis.

Uma formulação "estéril" é asséptica ou livre de todos os oe microorganismos viventes e seus esporos. Uma “quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado — —- profilático ou-terapêutico desejado: = —— — m— —7—— = 7 Uma “quantidade terapeuticamente efica”r de uma substância/molécula da presente invenção pode variar de acordo com fatores 2 - como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula suscitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz engloba uma quantidade que é aquela em o que qualquer efeito tóxico ou prejudicial da substância/molécula seja superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes ou no início do estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz poderia ser menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

A expressão “agente citotóxico”, da forma como é utilizada no presente refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular elou causa a destruição ou morte celular. A expressão destina-se a incluir isótopos

Ss4 radioativos (tais como AP!!, 1191, (125, yº, Re'*, Re", sm, Bi?!?, pº?, pº? e isótopos radioativos de Lu) agentes quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamíicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, enzimas nucleotídicas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas de toxina ou toxinas ezimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos ou variantes destas), e os oe diversos agentes antitumorais ou anti-ccâncer divulgados abaixo.

Outros agentes citotóxicos estão descritos abaixo.

Um agente tumoricida causa a destruição das células tumorais.

A — Uma “toxina” é qualquer -substância -capaz de -ter- um refeito= — - - prejudicial sobre o crescimento ou a protiferação de uma célula.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico. útil no í 15 “tratamento do câncer.

Exemplos de agentes quimioterápicos incluem os — — ——— —- "agentes alquilantes como tiotepa e Ticlofosfamida (Cytoxan O); sulfonato de — alguila como improsulfano busulfano e piposulfano; aziridinas — como ES benzodopa, —“carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo Altretamina, trietilenemelamina trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina e bullatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MarinolO), beta-lapachona, lapachol, colchicina, ácido betulínico, camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HICAMTIN O&), CPT- 11 (irinotecano, Camptosar&), acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina); —briostatina; calistatinay CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina, e bizelesina); podofitotoxina, ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (especialmente a criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-

TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; Mostardas de nitrogênio, como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, ifosfamida, estramustina, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfaltano, novembicina, fenesterina, trofosfamida, prednimustina, mostarda de uracila; nitrosouréias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, Nimustina e ranimnustina, antibióticos, tais como os antibióticos enedina (por exemplo, —caliqueamicina, especialmente —gamail caliqueamicina e : caliqueamicina omegal1 (vide, por exemplo, Nicolaou et a, Angew Cem Intl Ed o Engl, 33:183-186 (1994)); CDP323, um inibidor oral da alfa-4 integrina; dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamíicina, bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos cromoproteina relacionadas com o antibiótico — — = enedina);-aclacinomisinas;-actinomicina, autramicina -Azasserina; Bleomicinas — = 7 cactinomicina, — carabicina, — carminomicina, —carzinofiina, “Cromomiícinas, dactinomicina, = daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-0x0-L-Norleucina, .- .

| 15 doxorrubicina, (incluindo a adriamicinaOQ, morfolino-doxorrubicina, o Ns cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino doxorrubicina, injeção de cloridrato de doxorrubicina lipossomal (DOXIL &), doxorrubicina lipossomal TLC D-99 PS (Miocet&), doxorrubicina lipossomal peglilada (CAELIX [)) e deoxidoxorubicina), epirrubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, Mitomicinas como a mitomicina-C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicin, porfiromícina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, Estreptonigrina, estreptozocina, Tubercidina, zinostatina, ubenimex, zorubicina; anti-metabólitos tais como o metotrexato, gemcitabina (GEMZAR &), tegafur (UFTORAL O&), capecitabina (Xeloda &), uma epotilona, e 5 -fluorouracila (E FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato, análogos da purina como a fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina como azacitidina ancitabina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina,

floxuridina; andrógenos como epitiostanol calusterona, propionato de dromostalonona, mepitiostana, testolactona; anti-adrenais, como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, como o ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida, ácido aminolevulínico; eniluracil;

amsacrina; bestrabucila; bisantreno; defofamina; edatraxato demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetatode eliptinium; epotilona; etoglucida; nitrato de gálio, hidroxiuréia; lentinano; lonidainina; maitansinóides como a maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; pentostatina; oe fenamet; nitraerina; pirarubicina; losoxantrona, 2-etilhidrazida; procarbazina; complexo polissacarídeo PSKO (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rhizoxina; sizofirana; spirogermânio, ácido tenuazônico; triaziquona;

e 2,2 2'triclorotrietilamina; tricotecenos. (especialmente-toxina T-2, verracurina A; <= — - roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINAGÇ, FILDESINGO); dacarbazina; mannomustina; Mitobronitol; Mitolactol; Pipobromano; gacitosina;

o 1s ârabinosida (Ara-C'); tiotepa; taxóide, por Exemplo, paclitaxel (Taxol &), o - - ——— ——toimulação de nanopartículas de albumina projetadas de pacíítaxel (ABRAXANE?) e docetaxel (Taxotere&); cloranbucili 6-tioguanina;, o mercaptopurina; metotrexato; agentes de platina como a cisplatina, oxaliplatina (por exemplo, Eloxatin &), e carboplatina; vincas que impedem a polimerização da tubulina a formação de microtúbulos, incluindo a vimblastina (VELBAN O), vincristina (Oncovin &), vindesina (ELDISINA &, FILDESIN &) e vinorelbina (NAVELBINA O&), etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; Novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como o ácido retinóico, incluindo bexaroteno (Targretin &); bifosfonatos, tais como clodronato (por exemplo, BONEFOSO& ou OSTACO), etidronato (DIDROCAL O), NE-S8095, ácido zoledrônico/zoledronato (Zometa &), alendronato (FOSAMAX O&), pamidronato (Aredia O&), tiludronate (Skelid &), ou risedronato

(Actonel &); troxacitabina (um análogo da citosina 1,3-dioxolano nucleosídeos); oligonucleotídeos antisense, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes envolvidos em vias de sinalização e na proliferação de células aberrantes, como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas como a vacina TERATOPES e vacinas de terapia gênica, por exemplo, a vacina ALLOVECTINO, vacina LEUVECTINO e vacina VAXIDO, um inibidor da topoisomerase (por exemplo, LURTOTECAN &); rmRH (por exemplo, ABARELIX &); BAI4390086 (sorafenib, oe Baier); SU-11248 (sunitinib, SUTENT &, Pfizer); perifosina, inibidores da a COX-2 (por exemplo celecoxib ou etoricoxib), inibidor de proteossomo (por exemplo, PS341), o bortezomib (Velcade &); CCl-779; Tipifarnib (R11577); — — —orafenib, ABT510;-inibidor Bcl-2, tais como o sódio oblimersen-(Genasense-&); — - -

pixantrona; inibidores do EGFR (vide definição abaixo), inibidores da tirosina quinase (vide definição abaixo), inibidores da serina-treonina quinase como = 2 Tapamiícina (sirolimus, Rapamune o, inibidores da famesiltransferase como lonsfarnib (SC-6636, SARASARTM) e sais farmaceuticamente aceitáveis, ||| ácidos ou derivados de quaisquer dos itens acima, bem como combinações de o dois ou mais dos itens acima acima, como tal como CHOP, uma abreviatura de uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e — prednisona; e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINO), combinada com 5-FU e leucovorina.

Agentes quimioterápicos conforme definido na presente invenção são “agentes anti-hormonais"” ou “terapêuticos endócrinos” que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos dos hormônios que podem — promover o crescimento do câncer.

Eles podem ser hormônios em si, incluindo, mas não se limitando a: antiestrogênios com perfil misto de agonista/antagonista, incluindo, tamoxifeno (Nolvadex &), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTONO), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EvistaO&),

trioxifeno, queoxifeno, e moduladores seletivos de receptores de estrogênio (SERMs) como SERMS3; anti-estrogênios puros sem propriedades agonistas, tais como fulvestrant (FASLODEXGQO) e EMBOO (tais agentes podem bloquear a dimerização do receptor de estrógeno (ER), inibir a ligação do DNA, aumentar oltumoverdo ER, e/ou suprimir os níveis do ER); inibidores de aromatase, incluindo inibidores da aromatase, tais como esteróides e formestano, exemestano (Aromasina &) e os inibidores de aromatase não esteroidais, como ' anastrazol (Arimidex &), letrozol (Femara O) e aminoglutetimida, e outros o inibidores de aromatase incluindo vorozole (RIVISOR & ), acetato de megestrol (MEGASE OQ), fadrozol e 4(5)-imidazóis; agonistas hormonais liberadores de hormônio luteinizante, incluindo leuprolide (LupronO e ELIGARDO), buserelina “= —goserelina, e-tripterelina; esteróides -sexuais, -incluindo-progestinas tais como==—=m = acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, estrógenos, como dietilestilbestrol e Premarina, e andrógenos/retinóides como fluoximesterona, - oe " qualquer ácido transretiônico e fenretinida; onapristona; anti-progesterona, O “ infra-reguladores de receptor « de estrógeno (ERDs), anti-andrógenos, tais como nilutamida, flutamida e bicalutamida e sais, ácidos ou derivados de quaisquer dos itens acima farmaceuticamente aceitáveis, bem como combinações de o duas ou mais das opções acima.

Um “agente inibidor do crescimento", quando utilizado no presente refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de células (tal como uma célula expressando Notch) tanto in vitro como in vivo.

Assim, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a porcentagem de células (tal como uma célula expressando Notch) na fase S.

Exemplos de fatores inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em outra fase que não a fase S), como agentes que induzem o impedimento à fase G1 e o impedimento à M.

Os bloqueadores da fase M clássicos incluem a Vincas (vincristina e vinblastina),) Taxanos e os inibidores da topoisomerase, tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposide e bleomicina.

Aqueles agentes que interrompem a fase G1 também extravasam sua interrupção para a fase S, por exemplo, os agentes alquilantes de DNA como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil e Ara-C.

Mais informações podem ser encontradas em “The Molecular Basis of Cancer”, Eds Mendelsohn e Israel.

Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami ef al. (WB Saunders: oe Philadelphia, 1995), por exemplo, a pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anticâncer ambas derivadas do teixo.

O docetaxel (Taxotere*, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu é um análogo 2 = . —- Semisintético do paclitaxel (Taxol?, Bristol-Myers: Squibb). -O paclitaxel em — — - docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir dos dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos prevenindo 2a despolimerização, Oque. 7 15 resulta na inibição da mitose nas células. oO e TT WEComPoSÇÕEs EMÉTODOS = Ns A presente invenção é baseada em parte na identificação de o agentes que se ligam a Notch, por exemplo, anticorpos e fragmentos destes.

Em exemplos de realização específicos, a invenção se refere a agentes que se ligam à região de regulação negativa (NRR) de Notch2, tais como anticorpos isolados que se ligam Notch2 NRR e fragmentos destes.

Tais anticorpos são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de doenças associadas com a expressão e/ou atividade de Notch2 (por exemplo, o aumento da expressão ou atividade). Em exemplos de realização específicos, os anticorpos —antiNotch2 NRR são úteis para o diagnóstico ou tratamento do câncer, por exemplo, de células B malignas e melanoma.

Consequentemente, a presente invenção fornece métodos, composições, kits e artigos manufaturados relacionados com ligantes de Notch2 NRR.

A - ANTICORPOS ANTI-NoTCH2 NRR

1. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE FAGO EXEMPLARES São fornecidos no presente anticorpos monoclonais exemplares que foram derivados de uma biblioteca de fago, conforme descrito no exemplo BB. Um anticorpo designado “Anticorpo D" que se liga a Notch2 NRR foi isolado. Esse anticorpo foi maturado por afinidade o suficiente para gerar anticorpos designados de Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3. As sequências da cadeia pesada e cadeia leve das regiões hipervariáveis (HVRs) do Anticorpo D, o Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3 são exibidas nas Figuras 1e2. As sequências da cadeia pesada e cadeia leve dos domínios variáveis do Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3 são exibidas nas - - — .— Figuras.3 e 4, Exemplos de.realização adicionais- de-anticorpos-anti-Noteh2 = == - NRR são fornecidos como se segue. : ; Em um aspecto, é fornecido um anticorpo - que se liga Re " 156 especificamente a Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende pelo menos "TT um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados a partir de: O (a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de o aminoácido de acordo com a sequência consenso da SEQ ID NO: 3; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido daSEQIDNo:4; (o) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 5; (d) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 10; (e) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 14; e (O) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 19;

Em um aspecto adicional, o anticorpo compreende um HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco HVRs selecionadas a partir de (a), (b), (d ), (e) e (É) acima. Em um aspecto adicional, o anticorpo compreende (a), (b), (c), (d), (e) e (Nf) acima. Com relação a (a), (d), (e) e (f), uma ou mais das seguintes modalidades são contempladas: HVR-H1 compreendendo uma sequência de amincácido “selecionada a partir das SEQ ID NOs: 1-2; HVRL1 : compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir das SEQ CS ID NOs: 6-9; HVR-L2 comprreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11-13, e HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir das SEQ ID NOs:15 -18.

e e e e. —- Em outroaspecto, é--fornecido um anticorpo que -se diga = — — especificamente a Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende uma HVR-H1 : compreendendo uma sequência de aminoácidos em conformidade soma e ' 15 sequência consenso da SEQ ID NO: 3, HVR-H2 compreendendo a sequência - 77 7 de aminoácidos da SEQ TD NO: 4, é HVR-H3 compreendendo a sequência de | O aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Em um exemplo de realização, a HVR-H1 é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID o NOs:1-2.

Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente a Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 10, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos em conformidade com a SEQ ID NO: 14, e uma —HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos em conformidade com a SEQ ID NO: 19. Os seguintes exemptos de realização são contemplados em qualquer combinação: A HVR - L1 é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NOs:6-9; HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NOs: 11-13,e HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ 1D NOs:15-18. Em um exemplo de realização, um anticorpo que se liga a Notch2 NRR compreende uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em um exemplo de realização, um anticorpo que se liga a Notch2 NRR compreende uma HVR-11 compreendendo oe a sequência de aminoácidos da SEQ 1D NO: 7; uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em um exemplo de — — -— fealização-um.anticorpo que-se-liga-a Noteh2-NRR compreende uma HVRE1 = = — - compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ 1D No: 12, e uma HVR- eo : , El compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em um — " exemplo de realização, um anticorpo que se liga a Notch2 NRR compreende = uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; e uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

18. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente à Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 1; (bh uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 4; (o) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 5;

(d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 6; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 11; e (o uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 15; Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente ao Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende: oe (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQIDNo: 2; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido ——— da SEQ [ID No:-4;- e T— =— Fo (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido - — da SEQ ID No: 5; 2 . - NS e e: S 15 (d) uma HVR-Li compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 7; " i "a (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 11; e e (D uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido daSEQ/IDNo: 16; Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente ao Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 2; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 4; (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 5;

(d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 8; (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 12; e (D uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ (ID No: 17; Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente ao Notch2 NRR, em que o anticorpo compreende: e (a) uma HVR-Hi compreendendo a sequência de aminoácido da SEQIDNo: 2; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido . —- . —daSeEQIDNo:4, -— - mm — — m— e - (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido . da SEQ ID No: 5; . ; : ' ; - — - = ' (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido MO daSEQIDNÇH& o (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 13; e o (N) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido daSEQID No: 18; Em exemplos de realização específicos, qualquer um dos anticorpos acima compreende ainda de pelo menos uma região estrutural selecionada a partir de uma região estrutural de consenso VH subgrupo Me uma região estrutural de consenso VL subgrupo |. Em exemplos de realização específicos, um anticorpo anti-Notch2 NRR é maturado por afinidade.

Por exemplo, um ou mais das seguintes substituições nas posições HVR indicadas (numerada como em Kabat) podem ser feitas em qualquer combinação:

na HVR-H1 (SEQ ID NO: 1): S28T; T30S; na HVR-L1 (SEQ ID NO:6): S28N; 129N ou V; S30R ou K; S31R; Yv32F na HVR-L2 (SEQ ID NO:11): G5OR; S53| ou T; ASSE na HVR-L3 (SEQ ID NO: 15): S931 ou R; L96W ou H Os anticorpos específicos divulgados na presente invenção, ou seja, anticorpos D, bem como as formas maturadas por afinidade do anticorpo D (D-1, D-2 e D-3 ), podem ser submetidas a uma maturação por afinidade adicional.

Assim, são o prestadas as formas maturadas por afinidade de qualquer um dos anticorpos descritos na presente invenção.

Em exemplos de realização específicos, um anticorpo anti-Notch2 - - — . NRR possuindo qualquer. uma das. sequências.

HVR .acima pode conte-ainda-- — - - qualquer sequência adequada do domínio variável da região estrutural, desde que à atividade de ligação ao Notch2 NRR seja substancialmente mantida.

Em A - 15. “certos exemplos de realização, um anticorpo anti-Noteh2 NRR compreende ————— - vma sequência da região estrutura) de consenso variável pesada (VH) humana, como em qualquer sequência da região estrutural de consenso VH exibida nas Figuras 5A e 5B.Em um exemplo de realização, a sequência de consenso VH o compreende uma sequência de consenso da região estrutural de cadeia pesada subgrupo ll humana, por exemplo, conforme exibido nas Figuras 5A e 5B.

Em outro exemplo de realização, a sequência da região estrutural de consenso VH compreende uma sequência da região estrutural “aceptora2”, por exemplo, conforme exibido nas Figuras 5A e 5B.

Em um exemplo de realização específico, a sequência consenso da região estrutural VH compreende FR1- —FR4da Aceptora2B ou Aceptora2D, onde FR4 é constituído pela SEQ ID NO: (Figuras 5A e 5B ), sendo o último resíduo da SEQ ID NO: 35 (S11) opcionalmente substituído por alanina.

Em um exemplo de realização ainda mais específico, a sequência consenso da região estrutural VM compreende as sequências das SEQ ID NOs: 50, 51, 57 ou 58 e 35, onde S11 da SEQ ID NO: 35 é opcionalmente substituído por alanina.

Em certos exemplos de realização, um anticorpo anti-Notch2 NRR possuindo qualquer uma das sequências HVR acima pode ainda compreender uma sequência da região estrutural de consenso variável leve (VL) humana, conforme exibido nas Figuras 68A e 6B.

Em um exemplo de realização, a sequência de consenso VL compreende uma sequência (Kv1) da região estrutural de consenso VL kappa subgrupo | humano, por exemplo, conforme oe exibido nas Figuras 6A e 6B.

Em outro exemplo de realização, a sequência de consenso da região estrutural VL compreende FR1-FR4 do huMAb4D5-8 conforme mostrado nas Figuras 7 ou 8. Em um exemplo de realização = . — específico, a sequência. consenso-da-região-estrutural- Vi. -compreende as — - - sequências da SEQ ID NOs: 60, 61, 62 e 63. : Em outro aspecto, um anticorpo anti-Notch2 NRR compreende Me uma sequência “de domínio variável de cadeia pesada (VH) possuindo pelo menos BO%, 0T%, D2%, 03%, 04%, 05%, H67%, A7%%, 96%, SON ou 100% de identidade na sequência com a sequência de aminoácidos selecionada a partir ' das SEQ ID Nos: 20-21. Em alguns exemplos de realização, uma sequência o VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo compreendendo tal sequência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Notch2 NRR.

Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido ou deletado —da sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 20-21. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Em um exemplo de realização específico, a VM compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que está em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 3, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 5. Em tal exemplo de realização, a HVR-H1 é composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NOs: 1-2. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente a anti-Notch2 NRR, em que o dito anticorpo compreende um e domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 22-25. Leo.

EM alguns exemplos, de. realização, .uma sequência-Vl: possuindo-pelo-menos- -— - 7 90%, 91%, 902%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo substituições conservadoras), inserções ou e * 15 "deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo = -« Qompreendendo tal sequência de aminoácidos e Zinda sim mantêm a capacidade =|| de se ligar ao Notch2 NRR.

Em alguns exemplos de realização, um totalde 1a 10 aminoácidos foi substituído, inserido ou deletado da sequência de o aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 22-25. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionada(s) a partir de (a) uma HVR-Lt compreendendo uma sequência de aminoácidos que está em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 10, (b) uma HVR-L2 —compreendendo uma sequência de aminoácidos está em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 14, e (c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que está em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 19. Em um exemplo de realização, o VL compreende uma, duas ou trêê HVRs selecionada(s) a partir de: (a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NOs:6- 9, (b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionados a partir da SEQ ID NOs:11-13, e (c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NOs:15-18. Em um exemplo de realização, o VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionada(s) a partir de: (a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (b) uma HVR-L2 compreendendo oe uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:11, e (c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:15, Em outro ' exemplo de realização, o VL compreende uma, duas ou três HVRs — . .— Sselecionadá(s)ã partir de: (a) uma HVR-Li-compreendendo uma sequência der =— > aminoácidos da SEQ ID NO:7, (b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:11, e (c) uma HVR-L3 e Ú 15 ' compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ D NOs:16. Em outro exemplo de realização, o VL compreende uma, duas ou três HVRsS | selecionada(s) a partir de: (a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de o aminoácidos da SEQ ID NO:8, (b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:12, e (0) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:17. Em outro exemplo de realização, o VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionada(s) a partir de: (a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, (bj) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:13, e (0) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs:18. Em determinados exemplos de realização das sequências variantes de VH e VL previstas acima, podem ocorrer substituições, inserções ou deleções dentro das HVRs.

Em tais exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao antígeno.

Por exemplo, podem ser feitas alterações conservadoras nas HVRs que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação.

Em certos casos, as alterações nas HVRs podem realmente melhorar a afinidade do anticorpo.

Tais alterações podem ser feitas nos “hotspots” da HVR (ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática), a fim oe de aumentar a afinidade do anticorpo. (Vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol.

Biol, 207:179-196, 2008). Em certos exemplos de realização das sequências VH e VL variantes fomecidas acima, cada HVR está conservada — “-= .(inalterada)-ou -não -possuí mais de que uma substituição= simples “de — 7 7 aminoácido, inserção ou exclusão. : — Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga - - especificamente à Notch2 NRR, em que [) anticorpo compreende um VH como "em qualquer uma das modalidades previstas acima, e uma VL come em - qualquer das modalidades previstas acima.

Em um exemplo de realização, o oe anticorpo compreende um VH possuindo pelo menos 90%, 91 %, 92 %, 93%, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100% de identidade na sequência coma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, e um VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade na sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em tal exemplo de realização, a VM compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: uma HVR-H1 compreendendo a sequência de —amincácidoda SEQ ID No: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ 1D No: 4, (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 5, e a VL que compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 6, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 11; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 15. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos daSEQIDNO:20,e uma VWVL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Notch2 NRR que se liga especificamente à Notch2 NRR compreende uma VH possuindo oe pelo menos 90%, 91 %, 92 %, 93%, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100% de identidade na sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, e uma VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, — - 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade.na.sequência com-a sequência = - - de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NOs: 23-25. Em tal exemplo de realização, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir o 7 15 de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ 15 o TO Nor 3; (6) uma AVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NS No: 4, (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID oe No: 5, e a VL que compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido selecionada a partirda SEQ ID No: 7-9, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido a partir da SEQ 1D No: 11-13; e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido a partir da SEQ ID No: 16-18. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada à partir da SEQ ID NO: 23-25. Em certos exemplos de realização, é fornecida a forma maturada por afinidade de qualquer um dos anticorpos acima.

Em realizações adicionais, é fornecida uma proteína recombinante que se liga especificamente à Notch2

NRR, em que a proteina recombinante compreende de sítio(s) de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos acima.

Em tal realização, uma proteína recombinante compreende qualguer uma ou mais das HVRs fornecidas acima.

Em determinados exemplos de realização, é fornecido um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos acima.

Em um exemplo de realização, é fornecido um vetor compreendendo o polinucleotídeo.

Em um exemplo de realização, é fornecido uma célula hospedeira 2 eme O Compreendendo o vetor.

Em uma realização, a célula hospedeira é eucariótica.

Em uma realização, a célula hospedeira é uma célula CHO.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo anti-Notch2 NRR, onde o método compreende o cultivo da célula hospedeira em condições - = =" OO CG adequadas para à expressão do polinucleotíideo que codifica o anticorpo, e o isolamento do anticorpo. e e 18 200 * 2. ANTICORPOS ExEMPLARES ÁDicioNAIS || VOU NA e. 2 + + - Em um exemplo dê rêálização; à invenção fornece úm anticorpo | ' anti-Notch2 NRR isolado que inibe a atividade de Notch2. Por exemplo, os oe anticorpos da presente invenção podem modular um ou mais aspectos da sinalização Notch2, incluindo a interrupção de qualquer via de sinalização —Notch2 biologicamente relevante.

Em um exemplo de realização adicional, a invenção fornece um anticorpo anti-Notch2 NRR isolado que se liga a Notch2 NRR com uma Kd < 100 NM.

Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-Notch2 NRR se liga a Notch2 NRR com uma Kd < 10 NM, £ 1 AM, ou £ 0,1 nM.

Conforme —descritonos Exemplos da presente invenção, o anticorpo D-3 fago exemplar se liga com uma Kd de 5 nM.

Conforme está bem estabelecido no estado da técnica, a afinidade de ligação de um ligante ao seu receptor pode ser determinada utilizando qualquer um dentre uma série de ensaios, e expressos a em termos de uma variedade de valores quantitativos. Assim, em um exemplo de realização, a afinidade é expressa como valores Kd e reflete a afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com efeitos de avidez minimizados). Geralmente, e preferencialmente, a afinidade de ligação é mensurada de maneira in vitro, seja em um modo sem células ou em modo associado à célula. Qualquer um dentre uma série de ensaios conhecidos no estado da técnica, incluindo aquelas descritas no presente, podem ser usadas para se obter as medidas de afinidade, incluindo, por exemplo, Biacore, OO) radioimuncensaio (RIA) e ELISA. Em outro exemplo de realização, um anticorpo isolado que se liga ao Notch2? NRR é fornecido, onde o anticorpo não se liga de maneira == significante a um membro da família Notch diferente de Notch2 (ou seja, Notch1, 3 e 4 em mamíferos). Tal anticorpo pode ser identificado por meio dos ensaios fornecidos no Exemplo B(1). Em um exemplo de realização, o Aanticorposeligaa um Noteh2 NRR humano e um Noteh2 NRR de pelomenos UU uma outra espécie não humana, por exemplo, camundongo. Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado o que se liga ao mesmo epítopo ao qual um anticorpo fornecido na presente invenção se liga. Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que anti-Notch2 NRR que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo selecionado a partir do anticorpo D, anticorpo D-1, anticorpo D-2 e anticorpo D-

3. Em outro exemplo de realização, a invenção fornece um anticorpo anti- Notch2 NRR que compete com um anticorpo selecionado a partir do Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3. Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga a pelo menos um domínio selecionado a partir do dominio LNR-A e o domínio HD-C de Notch2. Em um exemplo de realização, o anticorpo se liga tanto ao domínio LNR-A como ao domínio HD-C. Em outro exemplo de realização, o anticorpo se liga adicionalmente aos domínios LNR-B e/ou HD-N. Estes domínios estão delineados na Figura 18.

As realizações acima de anticorpos anti-Notch2 NRR podem estar presentes de maneira isolada ou em qualquer combinação. Além disso, qualquer anticorpo anti-Notch2 NRR descrito na presente invenção pode possuir um ou mais das seguintes aspectos: Em exemplos de realização específicos, um anticorpo anti-Notch2 NRR é um anticorpos monocional. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Notch2 NRR é um fragmento de o anticorpo selecionado a partir de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab). Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Notch2 NRR é um anticorpo humanizado, humano ou quimérico.

' — — 3. ERAGMENTOS DE ANTICORPOS — =— == A presente invenção engloba fragmentos de anticorpos. Fragmentos de anticorpos podem ser gerados por meios tradicionais, tai como e por digestão enzimática ou por técnicas recombinantes. Em determinadas circunstâncias, há vantagem de se utilizar fragmentos de anticorpos ao invés : de anticorpos completos. O menor o tamanho dos fragmentos permite a oe depuração rápida, e pode levar a um melhor acesso aos tumores sólidos. Para uma revisão de fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et a/. (2003) Nat.

Med 9:129-134, Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio da digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan ef al., Science 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab, Fv e ScFv podem ser todos expressos e » secretados em E. coli e assim permitindo a produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab'): (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab'), podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')) com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores recuperados são o descritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em determinadas realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento Fv de — cadeia única (scFv).. Vide, por -exemplo, o-documento -WO -93/16185; as = - patentes US 5.571.894; e US 5.587.458, O Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; " - 7 18 por isso, elas são adequadas para ligação não específica Teduzida durante a | TT utilização in vivo. As proteinas de fusão sFv podem ser « construídas para gerar O a fusão de uma proteína efetora na extremidade amino ou carbóxi terminal de um sFv. Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de o anticorpo pode ser também um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente US 5.641.870, por exemplo. Tais anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

4. ANTICORPOS HUMANIZADOS A invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos de humanização de anticorpos não-humanos são conhecidos no estado da técnica, Por exemplo, um anticorpo humanizado pode conter um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados de resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et af, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et a/.,, Nature, 332:323-327 (1988) Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio da substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados" são anticorpos quiméricos (US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente oe de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos da região hipervariável e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por =— resíduos de sitios:análogos em-anticorpos de-roedores. “= —— — = A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto e pesados, a. serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados pode e serimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o então chamado ”" método de “melhor adequação”, a sequência do domínio variável de um NE anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de e . sequências de domínio variável humano conhecido. A sequência humana que é mais próxima da sequência do roedor é então aceita como a região estrutural humana para o anticorpo humanizado. Vide, por exemplo, Sims ef al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. A mesma região estrutural pode ser utilizada para vários anticorpos —humanizados diferentes. Vide, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 89: 4285 (1992); Presta ef al, J. Immunol., 151: 2623 (1993). Além disso, É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis.

Para atingir este objetivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas.

Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os técnicos do assunto, Programas de computador estão disponíveis e mostram e ilustram a provável estrutura conformacional tridimensional de sequências de imunoglobulina o candidatas selecionadas.

A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da —— “* imunoglobulina candidata de se ligar ao seu,.antígeno.

Desta forma,.os resíduos. .—. FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e importada, de forma que seja atingida a característica de anticorpo desejada, — 16 tal como maior afinidade para o(s) antigeno(s) alvo(s). Geralmente, os resíduos “ da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação aos antígenos.

Ss : 5. ANTICORPOS HUMANOS Anticorpos humanos da invenção podem ser construídos pela combinação da(s) sequência(s) do domínio variável do clone Fv selecionado a partir de uma biblioteca de exposição por fagos de origem humana com aís) sequência(s) do domínio constante conhecida(s), conforme descrito acima.

Alternativamente, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser preparados por meio do método de hibridoma.

Linhagens celulares de mieloma — humano e heteromieloma humano/camundongo para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritos, por exemplo, por Kozbor, J. immunol. 133, 3001 (1984), e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, Estados

Unidos, 1987) e Boerner ef al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobuliva endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Ja) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na complete inibição da produção de anticorpos endógenos. A transferência do oe conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais linhagens germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits ef al., Proc. Natl. Acad. "Sci. USAT90:2551 (1993); Jakobovits-et- al, Nature 362:255-258-61993); — Bruggermann ef ai., Year in Immuno., 7:33 (1993). = A transferência de genes pode também ser utilizada para derivar " 15 anticorpos a partir de anticorpos não humanos, por exemplo, de roedores, em — que o anticorpo humano possui afinidades e especificidades similares ao do anticorpo não humano inicial. De acordo com este método, que também é denominado “impressão de epítopos", o gene da região variável tanto de o cadeia leve quanto de cadeia pesada de anticorpos não humanos obtidos por meioda técnica de exibição de fagos é substituído com um repertório de genes de domínio V humanos, criando um população de scFv ou Fab quiméricos com cadeia não humana/cadeia humana. A seleção com o antígeno resulta no isolamento de um Fab ou scFv quiméricos com cadeia não humana/cadeia humana onde a cadeia humana restaura o sítio de ligação de antígenos — destruído, ou seja, o epítopo governa (imprime) a escolha da cadeia humana parceira. Quando o processo for repetido, a fim de substituir a cadeia não humana remanescente, é obtido um anticorpo humano (vide documento WO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos não humano por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem resíduos de CDR ou FR de origem não humana.

6. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS Anticorpos biespecíficos são anticorpos monocionais — que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em realizações específicas, uma das A) especificidades de ligação é para a Notch2 e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epitopos diferentes da proteina Notch2. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para concentrar agentes citotóxicos nas cêélulas-que-==m cc OCO ---+-*+*--"EXprêssam Notch2. Estes Anticorpos possuem um braço de ligação à Notch2 e um braço que se liga ao agente citotóxico, por exemplo, uma saporina, anti- uu interferon-a, alcalóide de vinca, cadeia À dê riciõa, metotrexato “ou hapteno NEN marcado com isótopo-radisativoOs- anticorpos biespecíficos podem ser |U - preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos destes e (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab)2). Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que às duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Devido a classificação aleatória de cadeias pesadas e leves de —imunoglobulinas, ditos hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. À purificação da molécula correta, que normalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, é on um tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos.

Procedimentos similares são descritos no documento WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993, e em Traunecker ef al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios combinando antigeno-anticorpo) são fundidos às sequências de domínio constante de imunoglobulina.

A fusão, por exemplo, está preferivelmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos oe parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Em exemplos de realização específicos, a primeira região constante de cadeia pesada (CH) contém o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das — — .— fusões.

Os.DNAs que codificam as-fusões de.cadeia-pesada-de-imunoglobulina — - - e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de : expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro 7 apropriado.

Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções : " Ú ——— —- “mútuas dos 3 fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razães desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecem . os rendimentos ideais.

É possível, entretanto, inserir as sequências de o codificação para 2 ou todas as 3 cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resulta em alto rendimento ou quando as razões não foram de nenhuma significância específica.

Em uma realização preferida da presente abordagem, OS anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de —imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço.

Descobriu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado a partir de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de — produção de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser elaborada para maximizar o percentual! de e heterodímeros que são recuperados da cultura de célula recombinante. À interface compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um anticorpo de dominio constante. Neste método, uma ou mais das cadeias laterais de — - — aminoácidos pequenas da interface-da -primeira- molécula de anticorpo-são —— - - - substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades” compensatórias de tamanho similar ou idêntico para cadeia(s) Tateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo OSS — ——— através da substituição de cadeias laterais de « aminoácidos grandes com NS cadeias menores (tal como alanina ou treonina). Esta realização fornece um Lema? mecanismo para o aumento no rendimento do heterodímero sobre outros o produtos finais indesejados, tais como homodímeros. Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos “"heteroconjugados” ou reticulados. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, e outro a biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para dirigir células do sistema imune a células indesejadas (US

4.676.980), e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO — 92/00373, e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos pelo uso de quaisquer métodos convenientes de reticulação. Agentes de reticulação apropriados são conhecidos no estado da técnica, e são descritos, por exemplo, na patente US 4.676.980, dentre uma série de técnicas de reticulação.

Técnicas para a geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura.

Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligações químicas.

Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')>. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e evitar a oe formação de dissulfeto intermolecular.

Os fragmentos Fab' gerados são, então, convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab”-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por meio da redução com “ee o mMercaptoetilamina e. é misturado. com. uma -quantidade -equimolar -do -outro = — —- - derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico.

Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utiizados como agentes para a e imobilização seletiva de enzimas. mecmomotot mt 1 9 TS = == -Brogressos recentés possibilitaram a recuperação direta dos | fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para se formar anticorpos biespecíficos.

Shalaby et al, J.

Exp.

Med, 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')) de anticorpo —biespecífico totalmente humanizado.

Cada fragmento Fab' foi secretado da E. coli separadamente e submetido ao acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico.

O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura de células recombinante também foram: descritas.

Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, utilizando zíperes de leucina. Kostelny ef al., J. Iimmunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão gênica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodimeros de anticorpos. A tecnologia de “diacorpo” descrita por Hollinger et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) forneceu o um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vi) conectado a um domínio variável de cadeia leve (V1) por um — — — ligante-queé curto-demais -para-permitir-co emparelhamento entre-os dois + - SS” domínios sobre a mesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vy e V. de um fragmento são forçados à emparelhar-se com os dominios V e VR oe. 16 complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação NS “de antígenos. Também foi relatada outra estratégia para a fabricação de o fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv de cadeia simples S (sFv). Vide Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994). Anticorpos com mais de duas valências também são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt ef al, J. Immunol. 147: 60 (1991).

7. ANTICORPOS MULTIVALENTES Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno para o qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivatentes (que são diferentes daqueles da classe IgM), com três ou mais sítios de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalente), que podem ser facilmente produzidos pela expressão recombinante de ácidos nucleicos que codificam as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode incluir um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação ao antígeno. Em determinadas realizações, o domínio de dimerização compreende (ou consiste de) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc, três ou mais sítios de ligação ao antígeno amino-terminal a região Fc. Em determinadas realizações, o anticorpo multivalente compreende (ou consiste de) três a oito sítios de ligação - e antigênica. Em um desses exemplos de realização, o anticorpo multivalente compreende (ou consiste de) quatro sítios de ligação antigênica. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (por exemplo, =. — — vas, cadeias polipeptídicas)- onde -a(s) -cadeia(s) —-polipeptídica(s) = - - - compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) conter VD1-(X1),-VD2-(X2),-Fc, onde VD1 é mo í 1 primeiro domínio variável, vD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma : —— — cadeia polipeptídica de uma região F Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(,) 8 compreender: A cadeia da região VH-CH1-ligante flexíivel-VH-CH1-Fce, ou cadeia região VH-CH1-VH-CH1-Fe. O anticorpo multivalente da presente invenção pode compreender ainda de pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptideos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender entre cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve contemplados na presente 26 invenção compreendem um domínio variável de cadeia leve e compreendem, opcionalmente, um domínio CL.

8. ANTICORPOS DE DomÍNIO ÚNICO Em alguns exemplos de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de domínio único.

Um anticorpo de domínio único é uma cadeia polipeptídica única compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo.

Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1). Em um exemplo de realização, um anticorpo de domínio único é constituído por todos ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo. o 9. ANTICORPOS VARIANTES Em alguns exemplos, é(são) contemplada(s) modificação(ões) na(s) sequência(s) de aminoácido(s) dos anticorpos descritos na presente — — = >—invenção Por exemplo, pode ser desejável melhorar-a afinidade-de-ligação = e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo.

As sequências de aminoácidos variantes do anticorpo podem ser preparadas pela introdução de 0 Ú 15 "alterações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou o NS “pela síntese de peptídeos. | Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de 8 aminoácidos do anticorpo.

Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas.

As alterações nos aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do anticorpo em questão no momento em que sequência é feita Um método útil para a identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese é denominado —“mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, (1989) Science, 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo alvo ou grupo de resíduos alvos é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lis e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno.

Esses locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados pela introdução de outras variantes ou variantes adicionais nos sítios, ou para os sítios, de — substituição.

Desta forma, enquanto o sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos é predeterminada, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser predeterminada.

Por exemplo, para analisar o desempenho . de uma mutação em um dado sítio, a varredura de ala ou mutagênese aleatória o é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de antagonistas expressas são selecionadas para a atividade desejada.

As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de e. carbóxi e/oucamino-terminais que variam:de comprimento desde um resíduo = 7º até polipeptíideos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.

Exemplos Me ' 15 de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- o -- — —teminal.

Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo com uma enzima (por exemplo, 8 ADEPT) ou um polipeptideo que aumente a meia vida do anticorpo no soro.

Em determinadas realizações, um anticorpo da invenção é alterado para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado.

À glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-ligada quanto O-ligada.

N- ligada refere-se à ligação de uma unidade de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina.

As sequências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequencias de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina.

Desta forma, a presença de qualquer destas sequências de tripeptídeos no polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial.

A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou S-hidroxilisina também possam ser utilizados.

A adição ou deleção de sítios de glicosilação ao anticorpo é acompanhada, de forma conveniente pela alteração da sequência de aminoácido de modo que uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados) é criada ou removida.

À rs alteração pode também ser feita através da adição, deleção ou substituição de o um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do anticorpo original! (parasítios de glicosilação O-ligados). Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratos — — -— ligados a estes-podem-ser-alterados; Anticorpos-nativos-produzidos por célutas! = = de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarideo ramiíficado, bianternário que geralmente está ligado por uma ligação Naum Asn297 do 16 domínio cH2 da região Fc.

Vide, por exemplo, Wright et al. (1997 ) TIBTECH o Tm “ 5:26.32. Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, | manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como ê uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo bianternário.

Em alguns exemplos de realização, as modificações dos —oligossacaríideos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

Por exemplo, as variantes de anticorpos são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexa (direta ou indiretamente) a uma região Fc.

Essas variantes podem ter a função ADCC melhorada.

Vide, por exemplo, as Publicações de US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co.

Ltd) Exemplos de publicações relacionadas com variantes de anticorpos "defucosilados" ou "com deficiência de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/81739; WO

2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WOZ2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares que produzem anticorpos defucosilados incluem células Lec13 CHO deficiente na fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente US 2003/0157108 AJ1, Presta, o L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams ef al., Especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO Kknockout (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki ef al. — <= “= Biotech. -Bioeng. 87 : 614 (2004); Kanda,-Y. et al; Biotechnol. Bioengs * = ' 94(4):680-688 (2006); e documento WOZ2003/085107). : . . . Variantes de anticorpos são fornecidos adicionalmente em . ' oligossacarídeos divididos, por exemplo, onde um oligossacarídeo bianternário — NS “anexado a | região Fo do anticorpo é cortado pela GloNAc. Tais variantes de NS anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Fa Exemplos de tais anticorpos variantes são descritos, por exemplo, no e documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al); (Umana et al) na Patente US

6.602.684, e US 2005/0123546 (Umana et al). Também são fornecidos variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem ter a função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpos estão descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et a/); documento WO —1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.). Em determinadas realizações, um variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ainda mais a função ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu). Tais substituições podem ocorrer em combinação com qualquer uma das variações descritas ácima.

Em um exemplo de realização, a invenção contempla um anticorpo variante que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras, que torna este anticorpo um candidato desejável para muitas aplicações no qual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais.

Em certos o exemplos de realização, as atividades Fc do anticorpo são medidas para assegurar que só as propriedades desejadas sejam mantidas.

Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução / -— . - —-depleçãodos-CDC e/ou-atividades ADEGC. -Por-exemplo, ensaios -de-ligação” 7 oO com o receptor Fc (FCR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorpo . não tenha ligação ao FoyR (e portanto carece da atividade ADCC), mas o o : mantém a capacidade de ligação ao FCRn.

As células primárias para a úÚúÚúÚúÚúÚúÚúÚúÚúÚúÚúÚúÚúôã NS “mediação de ADCC, as células NK, expressam unicamente FeyRIII, enquanto monócitos expressam FoyRI, FeyRIU e FoyRIIl.

A expressão FCR em células ja hematopoiéticas é resumida na tabela 3, página 464 de Ravetch et al, Annu. o Rev.

Immunol. 9:457-92 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse é descrita na Patente US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, 1., et al.

Proc.

Nat Acad.

Sci.

USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, | et al., Proc.

Nat Acad.

Sci.

USA 82:1499-1502 (1985); US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J.

Exp.

Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, métodos de ensaio não radioativo — podem ser utilizados (vide, por exemplo, ACTITY ensaio de citotoxicidade não radioativo por citometria de fluxo (CeliTechnology, Inc., Mountain View, CA, e CyTotox 968 ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes et al,, Proc.

Nat Acad.

Sci, USA 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1g e, portanto, carece de atividade CDC.

Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo, : Gazzano-Santoro et al., J.

Immunol.

Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et oe al, Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J.

Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)) A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos e = —conhecidos.no.estado.da técnica (víde-por-exemplo, Petkova;-S.B: et-alInt'l — - - Immunol. 18(12):1759-1769 (2006). : São fornecidos outros tipos de variantes possuindo uma ou mais A 16 “gubstituições de aminoácidos.

Os Gítios de maior interesse para mutagênese TM 7” de substituição incluem as regiões hipervariáveis, “mas também são | o contempladas alterações de FR.

Substituições conservadoras são exibidas na o Tabela 1 sob o título de “substituições preferidas”. As alterações mais substanciais, denominadas de “substituições exemplares" são apresentadas na Tabela 1, ou conforme descrito abaixo com referência às classes de aminoácidos.

As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados, por exemplo, para uma atividade desejada, tal como uma melhor ligação ao antígeno, diminuição da imunogenicidade, ADCC ou CDC melhorada, etc.

TABELA 1 Arg (R) Lis; Gln; Asn Lis

; in TRA Substituições Resid Asn (N) Gin; His; Asp, Lis; Arg Asp O)

O eo SO Asp On

STO His (H) Asn; Gln; Lis; Arg lie (1) Leu; Val; Met; Ala; Leu e Fen; Norleucina Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Fen o E : [RO AR AE e e seo

O

TE o Tir (Y) Trp; Fen; Tre; Ser Val (V) Ile; Leu; Met; Fen; Leu Ala; Norleucina Modificações nas propriedades biológicas de um anticorpo podem ser realizadas por meio da seleção de substituições que afetam (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) a carga ou hidrofobicidade da — molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda Ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nova lorque (1975)):

(1) Apolares: Ala (A), Va! (V), Leu (L), lle (1), Pro (P), Fen (F), Trp (W), Met (M) (2) Sem carga polar: Gli (G), Ser (S), Tre (7), Cis (C), Tir (Y), Asn (N), Glh (Q) (3) Ácido: Asp (D), Glu (E) (4) Básico: Lis (19), Arg (R), His(H) : Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: o (1) Hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr, asn, gln; (3) ácido: asp, glu ee e e (Mbásiconhis.lys.args = em = mm mms om om or 7 OO (5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: gly, pro; (6) aromático: trp, tyr, phe. : BR | TE Substituições não conservadoras Ccausarão a substituição de um TOO ———— membro de uma dessas classes por outra classe.

Tais resíduos substituídos — O também podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou nos o locais (não-conservados) restantes.

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas modificadas (por exemplo, aprimoradas) com relação ao anticorpo parental! do qual é(são) gerado(s). Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo maturado por afinidade que pode ser facilmente gerado usando técnicas de maturação de afinidade baseadas na exibição por fago.

Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7 sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio.

Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas de fagos filamentosos fundidos a pelo menos uma parte da proteína da cápside do fago (por exemplo, o produto do gene "1 de M13) empacotado dentro de cada partícula.

As variantes exibidas por fago são, então, selecionadas de acordo com a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). A fim de identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese por varredura (por exemplo, varredura de alanina) pode ser realizada para identificar resíduos de regiões o hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. —Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo antigeno-anticorpo para identificar pontos de contato o - entre o.anticorpo .e.o antígeno.

Tais-.resíduos-de contato-e residuos-vizinhos — — - * são candidatos à substituição de acordo com as técnicas conhecidas no estado : da arte, incluíndo aquelas elaboradas no presente.

Uma vez que tais variantes - - . são produzidos, o painel de variantes é submetido à seleção utilizando técnicas MS “conhecidas no estado da arte, incluindo aquelas descritas no presente, e os NM anticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes ES podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos no estado da técnica.

Estes métodos incluem, mas não se limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagênese mediada por oligonucieotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese —porPCR e cassete de mutagênese de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo.

Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo da invenção, gerando assim uma ss região Fc variante.

A região Fc variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc da I9G1, IgG2, I9G3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos incluindo odeuma dobradiça de cisteina.

De acordo com esta descrição e os ensinamentos no estado da técnica, contempla-se em alguns exemplos de realização, que um anticorpo da invenção pode compreender uma ou mais alterações em comparação com a oe contraparte homóloga do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc.

Estes anticorpos, porém, mantém sensivelmente as mesmas características exigidas para a utilidade terapêutica, comparativamente ao seu homólogo do tipo — - - -— Selvagem.

Por exemplo, podem ser feitas algumas alterações na-região-Fc, que ==> alteraram (isto é, ou melhoram ou diminuem) a ligação ao Ciq e/ou a ' . citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, como descrito MR ' 15 no documento WO99/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738- 40 (1986); Patente US 5646260. Patente US. 5624821, e documento || WO94/29351 relativas a outros exemplos de região Fc variantes.

O documento o WO00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com ligação ao FcRs melhorada ou diminuída.

O conteúdo dessas publicações de patentes é especificamente incorporado ao presente pela referência.

Vide também, por exemplo, Shields et al.

J.

Biol.

Chem. 9(2):6591- 6604 (2001). Anticorpos com a meia vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal! (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs matenos para o feto (Guyer et al., J.

Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al. , J.

Immunol. 24:249 (1994)), são descritos na Patente US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estes anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn.

As variantes de polipeptídeos com sequências de aminoácidos da região Fc alteradas e capacidade de ligação ao Ciq aumentada ou diminuída são descritos na Patente US 6.194.551 B1, documento WOSS9/51642. O conteúdo dessas publicações de patentes é especificamente incorporado ao presente pela referência. Vide, também, Idusogie et al. |. Immunol. 164: 4178-4184 (2000. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos possuem modificações na interface dos polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc, onde as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estas oe alterações incluem a introdução de uma protuberância em um primeiro polipeptideo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo de Fc, onde a protuberância é posicionada na cavidade de modo a promover o complexo 2 2 - — ..entreo primeiro e segundo-polipeptídeo de Fc. Métodos para-produção-dem = - 7 anticorpos com estas modificações são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 5,731,168. eee O Em outro aspecto, pode ser desejável a criação de anticorpos — A " modificados com cisteina, Por exemplo, “thioMAbs”, no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em o exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis do anticorpo. Pela substituição de tais resíduos com cisteina, os grupos tióis reativos são assim posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de drogas ou moléculas ligantes de drogas, como as descritas na presente invenção. Em determinadas realizações, um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substítuídos por cisteina: V205 (numeração Kabat ) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada e S400 (numeração EU) da cadeia pesada da região Fc.

10. ANTICORPOS DERIVATIVOS Os anticorpos da invenção podem ainda ser modificados para conter moléculas adicionais não proteinácias que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Preferivelmente, as moléculas adequadas para derivatização do anticorpo são polimeros hidrossolúveis. Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, 56 polietilenoglicol (PEG) copolímeros de etileno-glicol/propilenoglico|, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, polí-1, 3-dioxolano, — poli-1,3,6-trioxano, — copolímero — etileno/maleica anidrido, poliaminoácidos (homopolimeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli e (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co- polímeros de óxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O polietitenoglico! = — —— propionaldeído pode-ter vantagens no-processo de fabricação devido à-sua — = 7 estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros : acoplados por - - " anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os NS “polímeros podem s ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, o .

número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser e determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitado a, propriedades específicas ou funções do anticorpo de ser melhorado, se os anticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.

Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e fração não-proteinácia que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, o grupamento não- proteinácio é um nanotubo de carbono (Kam ef al, Proc. Natl. Acad. Sci. 102: —11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece o grupamento não-proteinácio a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-agrupamento não-proteinácio são mortas. B — ALGUNS MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

7. ALGuns MétoODOS BASEADOS Em HIBRIDOMAS Os anticorpos monoclonais da invenção pode ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito primeiramente por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), e adicionalmente descritos, por exemplo, em Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º Ed. 1988); Hammerling et al. e Em: Monocional Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y,, 1981), e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) sobre hibridomas humano-humano. Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, - = “= .-«naPatente.US 7.189.826-em sobre-a produção de-anticorpos IM monoclonais* = — humanos naturais a partir de linhagens de célula de hibridoma. A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de Trioma) é descrita em Vollmers e, Brandlein o 1s Histology ana Histopathology, 20 (3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, — “Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 Ns (2005). e Por várias outras técnicas de hibridoma, vide, por exemplo, US 2006/258841, US 2006/183887 (anticorpos totalmente humanos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229 e US

7.078.492 e US 7.153.507. Um protocolo exemplar para a produção de anticorpos monoclonais utilizando o método de hibridoma é descrito a seguir. Em um exemplo de realização, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado para suscitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam de forma especifica a proteína utilizada para imunização. Os anticorpos são elevados em animais por meio de múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de um polipeptideo compreendendo Notch2 e ou fragmentos deste (por exemplo, Notch2 NRR), e um adjuvante, tal como monofosforil lipídico À (MPL)/trealose dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem.

Research, Inc., Hamilton, MT). Um polipeptídeo compreendendo Notch2 ou um fragmento deste pode ser preparado usando métodos conhecidos no estado da técnica, comoosmétodosrecombinantes, alguns dos quais estão descritos na presente invenção.

O soro dos animais imunizados é analisado para detecção de anticorpos anti-Notch2 e imunizações intensificadoras são opcionalmente administradas.

Os linfócitos de animais para produção de anticorpos anti- e Notch2 são isolados.

Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.

Os linfócitos são, em seguida, fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão apropriado, tal como o polietilenoglicol, para 7” “formar uma célula" de hibridoma— Vide, por exemplo, *"GodingMonoclonal —— - Antíbodies: Principles and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986). : Células de mieloma que podem ser utilizadas são aquelas que se fundem = - eficientemente, suportam a produção estável « em alto nível de anticorpos pelas o células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT.

Células de mieloma exemplares incluem, mas não se limitam e a; linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis a pelo American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA.

Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/camundongo também foram descritas para à produção de anticorpos monocionais humanos (Kozbor, J.

Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur ef al., — Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, 1987)). As células de hibridoma assim preparadas podem ser semeadas e cultivadas em um meio de cultura, por exemplo, um meio que contem uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não-fundidas.

Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente — hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.

Preferencialmente, métodos de cultura de célucas de hibridomas sem soro são usadas para reduzir o uso de soro de origem animal, tais como soro bovino fetal, conforme oe descrito, por exemplo, em Even et al.

Trends in Biotechnology, 24(3),105-108 (2006). Oligopeptideos como ferramentas para melhorar a produtividade - = <— das culturas de-células de hibridoma-são' descritos- em “Franek; “Trends if = - Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005 ). Especificamente, os meios de : cultura padrões são enriquecidos com certos aminoácidos (alanina, .serina |. s asparagina, prolina), ou com as frações de hidrolisado protéico, ea apoptose ee NS pode ser significativamente suprimida por oligopeptídeos sintéticos, constituído de três a seis resíduos de aminoácidos.

Os peptídeos estão presentes em 8 concentrações milimolares ou mais elevadas.

O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monocionais dirigidos contra o antígeno.

Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma pode ser determinada através de imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro como, por exemplo, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA). A 26 afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard.

Vide, por exemplo, Munson ef al., Anal.

Biochem., 107:220 (1980). Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão, Vide, por exemplo, Goding, supra.

Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio —D-MEM ouRPMI-1640. Além disso, células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores ascíticos em um animal.

Os anticorpos monocionais secretados pelos subclones são apropriadamente separados do meio de cultura, liquido ascítico ou soro por meio de procedimentos e convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteina A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

Um procedimento para o isolamento de eo proteinas, a partir de .células. de. hibridoma está. descrito-nas Patentes US — - - - 2005/176122 e US 6.919.436. O método inclui o uso de sais mínimos, tais como sais liotrópicos, no processo de ligação e de preferência também sem OU 15 péquenas quantidades de solventes orgânicos no processo de eluição. oo 2 AGUNSMETODos DESGEGÁOPEBIBLIOTEGAS || Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos ê utilizando bibliotecas combinatórias para selecionar anticorpos com a atividade ou atividades desejada.

Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida —noestado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleção tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas.

Esses métodos estão descritos, em geral, em Hoogenboom et al.

Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al, Ed., Human Press, Totowa, NJ (2001)). Por exemplo, um método para gerar anticorpos de interesse é pelo uso de uma biblioteca de fagos de anticorpo tal como descrito em Lee et al.

J.

Mol.

Biol. (2004 ) 340(5):1073-93. Em princípio, os clones sintéticos de anticorpos são selecionados pela triagem de bibliotecas de fago contendo fagos que exibem vários fragmentos da região variável de anticorpos (Fv) fundidos na proteina da cápside do fago Essas bibliotecas de fago são testadas por cromatografia de afinidade contra o antígeno desejado.

Clones expressando fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são absorvidos pelo antígeno e, assim, separados dos clones que não se ligam na biblioteca.

Os clones que se ligam são então eluídos do antígeno e podem ainda ser enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígenos.

Qualquer um dos anticorpos da presente invenção pode ser obtido pela concepção de um procedimento de e seleção adequado para selecionar o clone do fago de interesse seguido pela construção de um anticorpo de comprimento total usando as sequências Fv a partir do clone de fago de interesse e a sequência adequada da região

— — — constante (FO) descrita em Kabat et- al Sequences- of—Proteins- of= = 0 Immunological Interest, quinta edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD

(1991), vols. 1-3. Me BR ' Ú Em certos exemplos de ligação, o domínio de ligação de antígeno de úum anticorpo é formado por duas regiões variáveis (V) de cerca deito NS aminoácidos, selecionados, cada um, a partir de cadeias leve (VL) e pesada e (VH), que apresentam ambas, três alças hipervariáveis (HVRs) ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os domínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente no fago, tanto como fragmentos Fvy de cadeia simples (scFv), em que VH e VL são covalentemente ligados por meio de um peptídeo flexível e curto, quanto como fragmentos Fab, em que são, cada um, fundidos a um domínio constante, e interagem de forma não-covalente, conforme descrito em Winter et al, Ann.

Rev.

Immunol., 12: 433-455 (1994). 26 —Daforma utilizada no presente, clones fagos que codificam scFv e clones fagos que codificam Fab são coletivamente referenciados como “clones fagos FY" ou “clones FvY”. Repertórios de genes VH e VL podem ser clonados.

separadamente por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados de forma aleatória em bibliotecas de fagos, que podem então ser pesquisados para os clones de ligação ao antígeno, conforme descrito em Winter et al., Ann.

Rev.

Immunol,, 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem a necessidade de construção de hibridomas.

Alternativamente, o repertório inicial (naive) pode ser clonado para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos, para uma faixa ampla de antígenos não-próprios (non-self) e e também próprios (self, sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al, EMBO J, 12: 725-734 (1993) Finalmente, bibliotecas iniciais (naíive) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem de - —- — Segmentos de.gene V.não.rearranjados-a partir-de-células tronco, e-utilizando —-- primers de PCR que contém sequência aleatória para codificar as regiões ' CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito MR 156º Por Hoogenboom é Winter, J.

Mol.

Biol., 227: 381-388 (1992). “TT — -Etm certos exemplos de realização, | fagos filamentosos são utilizados para exibir fragmentos de anticorpos pela fusão com a proteina de eo revestimento menor plll.

Os fragmentos de anticorpos podem ser exibidos como fragmentos Fv de cadeia simples, em que os domínios VH e VL são conectados na mesma cadeia polipeptídica por um espaçador de polipeptídeo flexível, tal como descrito por Marks ef al., J.

Mol.

Biol., 222: 581-597 (1 991), ou como fragmentos Fab, em que uma cadeia é fundida a plll e a outra é secretada no periplasma de células hospedeiras bacterianas, onde ocorre a montagem da estrutura da proteína de revestimento-Fab que passa a ser —exibidona superfície de fagos pelo deslocamento de algumas das proteínas do revestimento do tipo selvagem, conforme descrito em Hoogenboom et al., Nucl.

Acids Res., 19: 4133-4137 (1991). Em geral, ácidos nucléicos que codificam fragmento gênico do anticorpo são obtidos a partir de células imunes coletadas de humanos e animais.

Se uma biblioteca influenciada a favor de clones anti-Notch2 (por exemplo, clones anti-Notch2), se desejado, o indivíduo é imunizado com Notch2 (ou Notch2 NRR) para gerar uma resposta ao anticorpo, e células do baço e/ou células B circundante ou outros linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperadas da construção da biblioteca.

Em uma realização, uma biblioteca de fragmento de gene de anticorpo humano, influenciada a favor de clones anti-Notch2 humano é obtida pela geração de respostas de anticorpos oe anti-Notch2 em camundongos transgênicos que carregam um arranjo gênico de imunoglobulina humana funcional (e carecem de um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional), de modo que a imunização ao Notch2 eleva as = ..— — células.Bparaaprodução-de anticorpos humanos contra Notch2-A geração dem == —- 7 camundongos transgênicos que produzem anticorpos humanos está descrita abaixo. — PO NS o enriquecimento adicional para populações de células reativas e As “anti-Notch2 pode ser c obtida pelo uso de um procedimento de seleção apropriado, para isolar células B que expressam anticorpo de ligação à Notch2 8 específico na membrana, tal como pela separação celular com cromatografia por afinidade de Notch2 ou adsorção de células em Notch2 está marcado com fluorocromo seguida pela seleção das células ativadas pela fluorescência (FACS). Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ou outras PBLs de um doador não-imunizado fornece uma melhor representação do repertório de anticorpo possível, e também permite a construção de uma — biblioteca de anticorpo pelo uso de qualquer espécie animal (humana ou não- humana) em que Notch2 não é antigênico.

Para bibliotecas que incorporam construção gênica de anticorpo in vitro, as células tronco são coletadas do sujeito para fornecer ácidos nucléicos que codificam segmentos gênicos de anticorpo não rearranjados.

As células imunes de interesse podem ser obtidas de uma série de espécies animais, tal como humano, camundongo, rato, lagomorfos, luprinos, caninos, felinos, porcos, bovinos, equinos e espécies de aves etc.

Ácidos nucléicos que codificam segmentos gênicos variáveis de anticorpos (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados de células de interesse e amplificados.

No caso de bibliotecas gênicas VH e VL rearranjadas, o DNA desejado pode ser obtido pelo isolamento de DNA genômico ou RNAm o de linfócitos, seguido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com primers que reconhecem as extremidades 5' e 3' de genes VH e VL rearranjados , conforme descrito em Orlandi et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci. (USA), 86: 3833- e — 3837 (1989), produzindo, desta forma, .repertories diversos de gene V para = + - - expressão.

Os genes V podem ser amplificados de cDNA e DNA genômico, com primers reversos na extremidade 5' do exon que codifica o domínio Á Ae : 15 “maduro, e primers diretos com base no segmento a, conforme descrito em cr OWandrerál (1969) 6 em Ward ef àr, Nature, 341: 544-546 (1989). Entretanto, UU para a amplificação de cDNA, primers reversos podem também ser baseados ê no exon líder, conforme descrito por Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), e primers diretos na região constante, conforme descrito em Sastry et al., Proc.

Natl Acad Sci (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, degeneração pode ser incorporada nos primers, conforme descrito em Orlandi ef a/. (1989) ou Sastry et af. (1989). Em algumas realizações, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo uso de primers de PCR alvos para cada família de gene V, para amplificar todos os arranjos VH e —VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucléico de células imunes, por exemplo, conforme descrito no método de Marks ef al., J.

Mol.

Biol., 222: 581- 597 (1991), ou conforme descrito no método de Orum et a, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para a clonagem do DNA amplificado em vetores de expressão, sítios de restrição raros podem ser introduzidos no primer de PCR como uma marca em uma extremidade, conforme descrito em Orlandi et al. (1989), ou pela amplificação por PCR adicional com um primer marcado, conforme descrito em Clackson ef al., Nature, 352: 624-628 (1991). Repertórios de genes V rearranjados sinteticamente podem ser derivados in vitro de segmentos de gene V.

A maior parte dos segmentos de gene VH humanos pode ser clonada e sequenciada (relatada em Tomlinson ef al., J.

Mol.

Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeada (relatado em Matsuda et al, e Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas as conformações principais da alça H1 e H2) podem ser utilizados para gerar diversos repertórios de gene VH com primers de PCR que codificam alças H3 . —.— — 9dediversassequências e comprimentos, conforme descrito-em-Hoogenhboom-e — = - - Winter, J.

Mol.

Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios de VH podem também ser produzidos com toda a diversidade de sequência, focada em uma alça Ae i 15 (loop) H3 longa de um único comprimento : conforme descrito em Barbas et al, — -- Pio Nat Acad.

Sof USA, 86; 4457.4467 (1992). Segmentos Mk e VA ||| humanos foram clonados e sequenciados (descrito em Williams e Winter, Eur. ê J.

Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser utilizados para produzir repertórios de cadeia leve sintéticos.

Os repertórios de gene V sintéticos , com base na faixa de vezes de VH e VL, e comprimento de L3 e H3, codificarão anticorpos de diversidade estrutural considerável.

Seguindo a amplificação dos DNAs que codificam o gene V, segmentos de gene V de linhagem germinativa podem ser rearranjados in vitro de acordo com métodos de Hoogenboom e Winter, J.

Mol.

Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos pela combinação de repertórios de gene VH e VL juntos em diversas formas.

Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e vetores recombinados in vitro, por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et a!., Gene, 128: 119-126

(1993), ou in vivo por infecção combinatória, por exemplo, o sistema loxP descrito em Waterhouse et al., Nucl.

Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). O método de recombinação in vivo explora a natureza de cadeia dupla de fragmentos Fab para superar o limite no tamanho de biblioteca imposto pela eficiência de transformação em E. coli.

Repertórios VH e VL iniciais (naíve) são clonados de forma separada, um em um fagomídeo e o outro em um vetor de fago.

As duas bibliotecas são então combinadas por infecção de fago de bactéria contendo fagomídeo, de forma que cada célula contém uma e combinação diferente, e o tamanho da biblioteca é limitado apenas pelo número de células presente (cerca de10*? clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH e VL sejam 2 =. =recombinados em um-único replicon, e-são-co-embalados em vírion de fago.-— —- - - Estas diversas bibliotecas fornecem um grande número de anticorpos diversos : de boa afinidade (K. de cerca de O ML To Alternativamente, os repertórios podem ser clonados de forma Ns “sequencial no mesmo | Vetor, tal como descrito em Barbas et al., | Proc.

Nat DN Acad.

Sci, USA, 88: 7978-7982 (1991), ou unidos por PCR e então clonados, ê conforme descrito em Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991). A junção por PCR pode também ser utilizada para unir DNAs VH e VL com DNA que codifica um espaçador peptídico flexível para formar repertórios de Fv de cadeia simples (scFv). Ainda em outra técnica, a “junção por PCR em célula” (in cell PCR assembly) é utilizada para combinar genes VH e VL nos linfócitos por PCR e então os repertórios dos genes ligados são clonados, conforme descrito em Embleton et a!., Nucl.

Acids Res., 20: 3831-3837 (1992). Os anticorpos produzidos por bibliotecas iniciais (naive) (tanto naturais quanto sintéticos) podem ser de afinidade moderáda (Ka de cerca de 10º a 107 M?), mas maturação da afinidade pode também ser mimetizada in vitro pela construção e nova seleção de bibliotecas secundárias, conforme descrito em Winter et al. (1994), supra.

Por exemplo, uma mutação pode ser introduzida de forma aleatória in vitro pelo uso de polimerase passível de erro (descrito em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins et al, J.

Mol.

Biol, 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc. —Natl Acad.

Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação da afinidade pode ser realizada por mutação aleatória de uma ou mais CDRs, por exemplo, pelo uso de PCR com primers que carregam sequências aleatórias transportando o CDR de interesse, nos clones Fv individuais selecionados e oe selecionando os clones de afinidades mais altas.

O documento WO 9607754 (publicado em 14 de março de 1996) descreveu um método para indução da mutagênese em uma região determinante de complementaridade de uma OL .— -cadeialeve de-imunogiobulina para criar .uma-biblioteca- de-genes de cadeia= - — > leve.

Outra realização eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionados pela exibição por fago com repertórios de variantes de domínio V de ocorrência e natural, obtidos a partir de doadores não-imunizados, e seleção para alta — = — ——— “afinidade em diversos ciclos de reorganização da cadeia, conformedescrtoem —úUÚ| " Marks et at, Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção 8 de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de 10º M ou * menos, A seleção das bibliotecas pode ser realizada por qualquer técnica conhecida no estado da técnica.

Por exemplo, Notch2 (ou Notch2 NRR) pode ser utilizado para revestir as paredes das placas de adsorção, expresso em células hospedeiras fixadas nas placas de adsorção ou utilizado na seleção de células, ou conjugado com biotina para captura com esferas revestidas com —estreptoavidina, ou utilizado em qualquer outro método conhecido no estado da técnica para selecionar bibliotecas de exibição por fago.

As amostras de biblioteca de fago são colocadas em contato com Notch2 imobilizado sob condições apropriadas para a ligação de pelo menos uma porção das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares, são selecionadas de forma a imitar condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e então eluídos por ácido, tal com descrito em Barbas ef al., Proc Natl Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por áicali, conforme descrito em Marks et al., |. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por competição de antígeno de Notch2, por exemplo, em um procedimento simílar ao método de competição de antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 6824-628 (1991).

eo Fagos podem ser enriquecidos de 20-1.000 vezes em um único ciclo de seleção. Adicionalmente, os fagos enriquecidos podem ser crescidos em culturas bacterianas e submetidos a etapas adicionais de seleção.

1r— : A-eficiência de seleção depende de-diversos fatores-incluindo as << —— cinéticas de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos de - Anticorpos em um único fago podem se engajar : simultaneamente: com o — antigeno. Anticorpos com rápida dissociação cinética (e fraca afinidade de ligação) podem ser retidos pelo uso de lavagens curtas, exibição por fago | mMultivalente e alta densidade de revestimento de antígeno na fase sólida. À ê alta densidade não apenas estabiliza o fago por meio de interações multivalente, mas favorece a nova ligação do fago que foi dissociado. À — seleção de anticorpos com cinéticas de dissociação lentas (e boa afinidade de ligação) pode ser promovida pelo uso de longas lavagens e exibição por fago monovalente, conforme descrito em Bass ef al., Proteins, 8: 309-314 (1990) e no documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antígeno, conforme descrito em Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentes afinidades para Notch2, mesmo com afinidades que diferem levemente. Entretanto, mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo, conforme realizado em algumas das técnicas de maturação da afinidade) é comum de gerar diversos mutantes, a maioria ligando ao antígeno, e poucos com alta afinidade. Com a limitação de Notch2, fagos de alta afinidade raros podem estar fora da competição (competed ouf). Para reter todos os mutantes de alta afinidade, fagos podem ser incubados com excesso de Notch2 —biotinilado, mas com o Notch2 biotinitlado a uma concentração de molaridade mais baixa que a constante de afinidade molar alvo para Notch2. Os fagos de ligação de alta afinidade podem então ser capturados por esferas paramagnéticas revestidas com estreptoavidina. Esta “captura de equilíbrio” <C permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, com uma sensibilidade que permite o isolamento de clones mutantes com uma afinidade tão pequena quanto duas vezes maior a partir de um grande excesso de fagos com afinidade mais baixa. As condições utilizadas - — + - - coco 7 a na lavagem de fagos ligados a uma fase sólida podem também ser manipuladas para discriminar com base nas cinéticas de dissociação. i

1. Clones 'anti-Notch2 podem ser selecionados Com base em sua | CU

0. atividade Em-um-exemplo-de-realização, à invenção fornece anticorpos anti O Notch2 que se liga a células vivas que expressam naturalmente Notch2. Em ê um exemplo de realização, a invenção fornece anticorpos anti-Notch2 que bloqueiam a ligação entre um ligante de Notch2 e o Notch2, mas não bloqueia a lgação entre o Notch2 e uma segunda proteina. Clones Fvy que correspondem aos ditos anticorpos anti-Notech2 podem ser selecionados pelo (1) isolamento de clones anti-Notch2 de uma biblioteca de fago, conforme descrito acima, e opcionalmente a amplificação da população de clones de fago isolada por meio do crescimento da população em um hospedeiro bacteriano apropriado; (2) seleção do Notch2 e uma segunda proteína contra os quais são desejados atividades de bloqueio e não-bloqueio, respectivamente; (3) adsorção dos clones de fago anti-Notch2 para imobilizar Notch2; (4) uso de um excesso da segunda proteina para eluir quaisquer clones indesejados que reconheçam determinantes de ligação de Notch2 que sobrepõe ou compartilham determinantes de ligação da segunda proteína; e (5) eluição dos clones que permaneceram adsorvidos após a etapa (4). Opcionalmente, os clones com as propriedades de bloqueio/não-bloqueio desejadas podem ser adicionalmente enriquecidos por meio da repetição dos procedimentos de seleção descritos uma ou mais vezes no presente.

O DNA que codifica o anticorpo monocional derivado do hibridoma ou os clones Fv exibidos por fago da invenção são facilmente ê isolados e sequenciados pelo uso de procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de primers de oligonucleotídeos desejados para amplificar especificamente as regiões codificantes da cadeia leve e pesada de interesse a partir de um molde (template) de DNA de hibridoma ou-fago).-Uma vez-isolado,- - - ' Oo o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. cofi, células cos de AA —símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, Na ———— — ----de-outraforria, não produzem proteina de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.

Artigos de ê revisão de expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica anticorpo incluem Skerra et al, Curr.

Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e — Pluckthun, íimmunol.

Revs, 130: 151 (1992). O DNA que codifica os clones Fv de acordo com a presente invenção pode ser combinado com sequências de DNA conhecidas que codificam regiões constantes de cadeia leve e/ou pesada (por exemplo, as sequências de DNA apropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et al., Supra), para formar clones que codificam cadeias leve e/ou pesada, de forma parcial ou integral.

Aprecia-se que regiões constantes de qualquer isotipo possa ser utilizada para este propósito, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, 1gD, e IgE, e que estas regiões constantes possam ser obtidas a partir de qualquer espécie animal ou humana. Um clone Fv derivado do DNA de domínio variável de uma espécie animal (tal como humana) e então fundido ao DNA da região constante de outras espécies animais para formar sequências de codificação para “híbrido”, cadeia leve e/ou cadeia pesada de comprimento total é incluída na definição de anticorpo “quimérico” e “híbrido”, conforme utilizado no presente. Em uma realização, um clone Fv derivado de DNA variável humano é fundido a DNA de região constante humana para í formar sequência(s) de codificação para cadeias leve e/ou pesada humana de ê comprimento total ou parcial. O DNA que codifica o anticorpo anti-Notch2 derivado de um hibridoma da invenção também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para o dominio constante de.cadeia leve e pesada, - - - “7 A cTO “por “sequências homólogas derivadas de clones hibridomas murinos (por exemplo, como no método de Morrison ef a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 81: e | 15 6661.6855 (1984). O DNA que codifica o hibridoma ou o anticorpo derivado do —-- —— —-elene-Fv-ou-fragmentos podem ainda ser MFodificados por junção covalente à = " sequência codificadora de imunoglobulina na totalidade ou em parte da e sequência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Desta forma, anticorpo "quimérico" ou “híbrido” são preparados tendo a especificidade de ligação do clone Fv ou anticorpo derivado do clone do hibridoma da invenção.

3. VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES Os anticorpos também podem ser produzidos usando métodos recombinantes. Para a produção recombinante de um anticorpo anti-Notch2, os ácidos nucléicos que codificam o anticorpo são isolados e inseridos em um vetor replicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão. O DNA que codífica o anticorpo monoclonal pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo,

sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de se ligar, especificamente, a genes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis.

Os componentes vetores, geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. a) Componente sequência de sinal O anticorpo da invenção pode ser produzido de forma o recombinante não apenas diretamente, mas também como uma fusão de polipeptideo com um polipeptídeo heterólogo, que é preferencialmente uma sequência sinal ou outro polipeptíideo que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteina madura ou polipeptídeo.

A sequência sinal — — - - - NE heteróloga selecionada, é aquela que é reconhecida e processada ( ou seja, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira.

Para células . 15 hospedêirãs procarióticas que não reconhecem à sequencia sinal do anticorpo ' - -————nativo-a sequência sinál é substituída por uma sequência sinal Frocarótica " selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, ' ê lIpp, ou líderes de enterotoxina || estáveis ao calor.

Para a secreção em levedura a sequência sinal pode ser, por exemplo, o lider invertase de levedura, fator a-líder (incluindo líderes fator a do Saccharomyces e Kluyveromyces), ou fosfatase ácida líder, a glucomílase líder de C. albicans, ou o sinal descrito no documento WO 90/13646. Na expressão celular de mamíferos, as sequências sinais de mamíferos bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal g:D da herpes simplex, estão disponíveis. b) Origem de Replicação Tanto os vetores de clonagem quanto os vetores de expressão contém uma sequência de ácido nucleico que permite a replicação do vetor em uma ou mais células hospedeiras selecionadas.

Geralmente, em vetores de clonagem esta sequência é a que permite que O vetor se replique independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro, e inclui as origens de replicação ou sequências de replicação autônomas. Tais sequências são bem conhecidas para uma série de bactérias, leveduras e vírus. À origem de s replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias gram-negativas, a origem do plasmídeo 211 é apropriada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores o de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o componente origem de e replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode normalmente ser utilizada apenas porque ela contém o promotor precoce). eee .o) Componente de seleção genética — - = — = = == - == —-"” o Os vetores de expressão e clonagem irão conter um gene de seleção, também denominado como marcador selecionável. Genes deseleção = " típicos codificam proteínas que (a) conferem Tesistência a antibióticos ou outras — - - = — toxinas, tal como ampícilina, Tneomicina, r metotrexato, ou Tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes essenciais ê não disponíveis a partir do meio complexo, tal como, o gene que codifica D- alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um medicamento para suspender o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e, assim, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante utilizam drogas como a —neomicina, ácido micofenólico e higromícina.

Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para receberem os ácidos nucléicos de codificação dos anticorpos, como DHFR, glutamina sintetase (GS), timidina quinase, metalotioneína-l e -ll, preferencialmente genes metalotioneina de primatas, adenosina deaminase, ornitina descarboxilase, etc Células transformadas com o gene de seleção DHFR, por exemplo, são identificadas, em primeiro lugar, através do cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx), concorrente antagonista de DHFR. Sob essas condições, o gene da DHFR é Se amplificado junto com qualquer ácido nucléico co-transformado. Uma linhagem “ celular de ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096) pode ser utilziada. Alternativamente, as células transformadas com o gene GS são

2. . — — identificadas através da.cultura de transformantes-em meio de cultura:contendo = = L-metionina sulfoximina (Msx), um inibidor da GS. Sob essas condições, o gene GS é amplificado junto com qualquer ácido nuctéico co-transformado. O Le. - 15 sistema de seleção 1 amplificação Gs pode ser usado em combinação com 6) — = — sistema de seleção/âmplificação DHFR descrita aeima. UU Alternativamente, células hospedeiras (particularmente, células 8 hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA que codificam o anticorpo, à proteina DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através de crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente US 4.965.199. Um gene de seleção apropriado para uso em leveduras é o gene trpt presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al, Nature, 282:39 (1979). O gene trpf fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura que não apresenta a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)), A presença da lesão trp1 no genoma da célula hospedeira de levedura oferece então um ambiente eficaz para a transformação de detecção pelo crescimento na ausência de triptofano.

Da mesma forma, cepas de leveduras deficientes de /eu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos que sabidamente carregam o gene tleu2. Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular pKD1 de 1,6 pm podem ser utilizados para a transformação de leveduras de Kluyveromyces.

FE) Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi relatado para K. lactis, Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Vetores de expressão de múltiplas cópias e estáveis para secreção de albumina madura de soro humano. recombinante-por= = - - OO linhagens industriais de Kluyveromyces também foram descritos.

Fleer et a/., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991). ee ' 15 d) Componente Promotor aorgATIS SI OO . e Os vêtores de dlonagem é de expressão normalmente contêm um | promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ê ligado ao ácido nucléico que codifica o anticorpo.

Os promotores apropriados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de lactose e B-lactamase, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac.

Entretanto, são apropriados outros promotores bacterianos conhecidos.

Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica oanticorpo.

São conhecidas sequências promotoras para eucariontes.

Virtualmente todos os genes eucarióticos contêm uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases a montante (upstream) do sítio onde é iniciada a transcrição.

Outra sequência localizada a 70 a 80 bases a montante (uspstream) do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo.

Na extremidade 3' da maior parte dos genes eucarióticos, encontra-se uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli-A à extremidade 3' da sequência de codificação.

Todas estas sequências são inseridas adequadamente em vetores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras apropriadas para uso com ê hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, e glicose-6-fosfato isomerase, . 3-fosfoglicerato -mutase,- piruvato -quinasem - + - triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores inducíveis ee . 15 que possuem a vantagem adicional de transcrição “controlada através de -— —— -- condições de crescimento, são as Tegiões promotoras : para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas ) associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.

Vetores e promotores apropriados para uso em expressão de levedura são descritos adicionalmente na patente EP 73.657. Amplificadores de leveduras também são utilizados vantajosamente com promotores de leveduras.

A transcrição de anticorpos a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como polioma vírus, vírus da catapora, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de maior preferência, Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células — hospedeiras.

Os promotores, inicial e final, do vírus SV40 são obtidos convenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que também contém a origem viral SV40 de replicação.

O promotor inicial imediato do ê citomegalovirus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento de restrição Hindlll E.

Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito na — - — —-Patente US 4.119.446. Uma.modificação deste sistema é-deserita na Patente="="= - - US 4.601.978. Veja também Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de interferon-B humana em células de camundongos sob CA o 15 controle de um “promotor timidina quinase do virus da herpes simplex. -——— - - - “Alternativamente, a repetição terminal longa “de vírus do Sarcoma de Rous == - pode ser utilizada como promotor. e e) Componente Elemento Amplificador A transcrição de um DNA codificador do anticorpo da presente invenção por eucariontes superiores é frequentemente aumentada pela inserção de uma sequência amplificadora no vetor.

Muitas sequências amplificadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteina e insulina). Tipicamente, entretanto, pode-se utilizar um amplificador (enhancer) de um vírus de célula eucariótica.

Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o lado posterior (late side) da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador anterior ao promotor do citomegalovírus, o amplificador do polioma sobre o lado posterior da origem de replicação, e amplificador do adenovírus.

Veja também Yaniv, Nature 297: 17-

18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação de promotores eucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetor em posição 5' ou 3' para a sequência codificadora de anticorpo, mas encontra-se localizado, preferencialmente, em um sítio a 5' do promotor.

f) Componente de término de transcrição Vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungo, inseto, células vegetais, animais, humanas, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) irão apresentar, ê adicionalmente, sequências necessárias para a terminação da transcrição e paraa estabilização do RNAm. Tais sequências são comumente disponíveis a partir da extremidade 5', ocasionalmente 3', regiões não-traduzidas de DNAs — - —- ou. cDNAs virais ou eucarióticos. Estas- regiões- contêm: segmentos-dez= = - - nucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do MRNA codificador do anticorpo. Um componente de término — oe de transcrição ati é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento — —— “póvino. Veja 6 documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito. | q) Seleção e transformação de células hospedeiras e Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores da presente invenção são células de procariotos, leveduras, ou células eucarióticas superiores descritas acima, Células hospedeiras apropriadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteríaceae como a Escherichia ou, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Enwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, tal como a Serratia —marcescans, e Shigella, bem como Bacílli tal como o B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. ficheniformis 41P descrita na DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como a P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é a É. coli 294

(ATCC 31.446), embora outras cepas sejam apropriadas, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. Anticorpo de comprimento total, proteínas de fusão de anticorpo e fragmentos de anticorpos podem ser produzidos em bactéria, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico (por exempio, uma toxina) que ele próprio exibe uma atividade eficaz na destruição ê de células tumorais. Anticorpos de comprimento total possuem meia-vida maiores na circulação. A produção em E. coli é mais rápida e apresenta melhor custo-benefício. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos — — — .em bactérias, vide-por exemplo,-a- Patente-US 5:648:237-(Carter et. al); US- - = —-

5.789.199 (Joly et al.), US 5.840.523 (Simmons et al.) que descrevem a região de início de tradução (TIR) e sequências sinais para otimizar a expressão E O. : 15 Secreção. Vide também Chariton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 TT EKC Lo Ed, Humana Press, Fairfield, NJ, 2003 ), págs 245-254,. descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli, Após a ê expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir do macerado celular de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificado através de, por exemplo, uma — coluna de proteina À ou G, dependendo do isotipo. À purificação final pode ser realizada de forma similar ao processo para a purificação do anticorpo expresso, por exemplo, em células CcHO. Além de procariotos, micróbios eucariotos tais como, fungos filamentosos e leveduras são hospedeiros adequados para a clonagem ou expressão dos vetores que codificam o anticorpo. Saccharomyces cerevisiae ou fermento comum é o microorganismo eucarioto mais comumente utilizado dentre os microorganismos hospedeiros eucariotos inferiores. Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e

Úteis para a presente invenção, tal como, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; hospediros como, por exemplo, K. factis, K. fragilis (ATCC

12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, e K.

marxianus; yarrowia (EP 402.226), Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis, e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicílium, Tolypocladium e Aspergíllus, tal como A.

$ nidulans e A. níger. Para uma revisão da discussão sobre o uso de leveduras e fungos filamentosos na produção de proteinas terapêuticas, vide, por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004 ). e. — — -Certos-fungos-e leveduras podem ser selecionados nos-quais-as .- - vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente | humano. Vide, — e por exemplo, Li et al. Nat. Biotech. 24:210-215 (2006 ) (descrevendo a RS “humanização da via de glicosilação em Pichia pastoris) e Gerngross eta, mo supra. o Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados) Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovirus e células hospedeiras de insetos variantes e correspondentes permissivos a partir de hospedeiros como, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquitos), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de cepas virais para a transfecção está disponível publicamente, por exemplo, o variante de 1-1 da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente na transfecção de células da Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e lentilha-d'água (Lemnaceae), alfafa (M. truncatula) e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US

6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES? para produção de anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados podem ser usadas como hospedeiras e ê a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou- se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por — — - SV40(COS-7,ATCC CRL 1651); linhagem de-rim-embriônico humano (células — = - 293 ou 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) Graham et al. J. Gen. Yirol 36:59 (1977); Moe ' 5 células de rim de hamster filhotes (BHK, ATCC cel 10); células de ovário de o o Tameter chinês/-DHFR (CHO, Uriaub et al, Proc Nail Acad Sei USA 774216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243- e 251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim do : macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de ratos do tipo búfalo (buffalo rat liver cells) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. 256 Sci 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO' - DHFR (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células do mieloma, como NSO0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Imprensa Humana, Fairfield, NJ, 2003 ), págs 255-268.255-268. As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpos e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser ê apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. h) Cultura Das Células Hospedeiras — = e = -As células -hospedeiras- utilizadas—para-a produção de-um— - - anticorpo dessa invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios de ' .. Cultura. Meios de crescimento comercialmente disponíveis, tais como o meio DL 7 15 Ham's “F1O (Sigma), Meio Essencial Minimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 NE (Sigma), e Meio de Eagle modificado “da Dulbecco (DMEM, Sigma) são Na adequados para o cultivo de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos o meios descritos em Ham et al., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704, US 4.657.866, US

4.927.762, US 4.560.655, US 5.122.469 documentos WO 90/03430; WO 87/00195; ou o pedido de Patente US 30.985, podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer dos ditos meios podem ser suplementados conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferina, ou fator de crescimento —epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como à droga GENTAMYCINO), elementos traços (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente.

Quaisquer outros suplementos “necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que seria conhecida pelos técnicos no assunto.

As condições de cultura tais como, temperatura, pH, e similares são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o técnico hábil no assunto. i) Purificação de Anticorpo à Quando técnicas recombinantes são utilizadas, os anticorpos ê podem ser produzidos intracelularmente, no espaço periplasmático ou secretados diretamente no meio.

Se o anticorpo é produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, tanto de — — células hospedeiras quanto fragmentos lisados, -são- removidos; por exemplo; = por centrifugação ou ultra-filtração.

Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 . (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos secretados no espaço — periplasmático da E. coli.

Em resumo, a pasta celular é fundida na presença de | acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenimetilsulfonifluoreto (PMSF) durante 50 ' minutos.

Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. ê - — Quando o anticorpo é secretado no meio, o sobrenadante destes sistemas de expressão são, em geral, primeiramente concentrados através do uso de um filtro de concentração protéico comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de utrafiltração Amicon ou Míillipore Pellicon.

Um inibidor de protease tal como o PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes indesejados.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada através do uso, por exemplo, da cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade estando entre uma das etapas de purificação tipicamente preferencial. A adequação da proteína À como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteina À pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas humanas y1, y2 ou v4 (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteina G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para a y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). À matriz ao qua! o ligante de afinidade é acoplado é mais frequentemente, agarose, mas $ também outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poros controlados ou polifestirenodivinil)benzeno permitem velocidade de fluxo mais rápido e tempo de processamento mais curto do que TT -- — aqueles” que” podem-ser “alcançados com a agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio Ch13, a resina Bakerbond ABXº (J. T. Baker, a — Philipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para a purificação de em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em o heparina SEPHAROSE”, cromatografia em uma resina de troca catiônica ou ê aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocusação, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo utilizando um tampão de eluição com um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (tal como, cerca de 0 a 0,25 M de sal).

Em geral, várias metodologias para a preparação de anticorpos para uso na pesquisa, experimentação e clínica estão bem estabelecidas no estado da técnica, em conformidade com as metodologias acima descritas e/ou consideradas adequadas por um técnico hábil no assunto para um anticorpo específico de interesse. €. IMUNOCONJUGADOS A presente invenção também fornece imunoconjugados (denominados de forma intercambiável como “conjugados de anticorpo-droga” ou “ADCs”) que compreendem um anticorpo conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, ta! como agente quimioterápico, uma droga, um agente inibidor do ê crescimento, uma toxina (tal como, uma toxina protéica, uma toxina enzimaticamente ativa de bactéria, fungo, planta, ou de origem animal, ou fragmentos do mesmo), ou um isótopo radioativo (por exemplo, um vero 7 radioconjugado). " Imunoconjugados têm sido utilizados para o fornecimento local de agentes citotóxico, tal como, drogas que matam ou inibem o crescimento ou a proliferação de células, no tratamento do câncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology | : 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos e Epenetos (1999) 3 AntiCançer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv.

Drug Deliv. Rev. 26:151-172; Patente US 4.975.278). Os Imunoconjugados permitem o fornecimento direcionado (alvo) de uma unidade de droga a um tumor, e acúmulo intracelular no local de fornecimento, onde a administração sistemática de drogas não conjugadas pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais, bem como as células tumorais a serem eliminadas (Baldwin et a/., Lancet (15 de março de 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," em Monocional Antibodies '84: Biological and Clinical Applications (A. Pinchera et al, eds) pp. 475-506. Ambos os anticorpos policionais e monoclonais foram descritos como úteis nestas estratégias (Rowland et a/, (1986) Cancer

Immunol.

Immunother. 21:183-87). As drogas utilizadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et a/., (1986) supra). As toxinas utilizadas em conjugados de anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tal como a toxina da difteria, toxinas vegetais tal como rícino, toxinas de moléculas pequenas tais como geldanamicina (Mandler et al (2000) J.

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ZEVALINO (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) é um conjugado de anticorpo-radioisótopo composto por um anticorpo monoclonal murino 19G1 " kappa direcionado contra o antigeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos e radioisótopo In*** ou Y ligado por um quelante-ligante de tiouréia (Wiseman et al (2000) Eur.

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MYLOTARG'!Y (gemtuzumab ozogamicin Wyeth — Pharmaceuticals), um conjugado de anticorpo-droga composto de um anticorpo hucD33 ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; Patente US Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116;

5767285; 5773001). Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), um conjugado de anticorpo-droga composto de anticorpo huC242 ligado pelo ligante dissulfeto SPP a uma unidade de droga maitansinóide, DM1, está avançado nos estudos de fase || para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, tais como câncer do cólon, pancreático, gástrico, e outros cânceres.

MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc), um conjugado de anticorpo-droga composto de um anticorpo monocional de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) ligado a uma unidade de droga $ maitansinóide, DM1, está em desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores de próstata Os peptídeos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram — - conjugados para-anticorpos monoclonais quiméricos-cBR96 (específico para = Lewis Y em carcinomas) e cAC1O (específico para CD30 em doenças hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784) ee e - 16 estão sobo desenvolvimento terapêutico.

NNE Em algumas realizações, um imunoconjugado compreende um " " anticorpo e um agente quimioterápico ou outra toxina, Os agentes 8 quimioterápicos úteis na geração de imunoconjugados são descritos no presente (acima). Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizadas inlcuem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas | aeruginosa), cadeia A de rícino, cadeia A de abrin, cadeia A de modeccin, alfa- sarcin, proteínas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidores de momordica —charantia, curcin, crotin, inibidores de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restrictocina, fenomicina, enomicina, e tricotecenos.

Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Uma variedade de radionuclídeos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados.

Exemplos incluem Bi22, (1*1, nº, Yº, e Re". Os conjugados de anticorpo e agente citotóxico são produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piriditditio!) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimídato HCl), ésteres ativos (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeido), compostos bis-azidos (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6- 8 diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4- —dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de rícino pode ser preparada conforme descrito por Vitetta ef af, Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com. carbono—-- 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para a conjugação do radionuclídeo ao anticorpo. Vide o documento WO 94/11026.

Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de — " “molécula pequena, tal como caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas, tricotecena, e CC1065, e os derivados destas toxinas que e possuem atividade de toxina, também são contemplados pela presente invenção.

1. MAITANSINA E MAITANSINÓIDES Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo (de comprimento total ou fragmentos) conjugado a uma ou mais moléculas maitansinóide.

Os maitansinóides são inibidores mitóticos que agem pela inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi primeiramente isolada a partir de arbusto do leste Africano Mayfenus serrata (Patente US 3.896.111). Posteriormente, descobriu-se que determinados micróbios também produziam maitansinóides, tal como maitansinol e ésteres de C-3 maitansinol (Patente US

4.151.042). Maitansinol sintético, derivados e análogos do mesmo são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4.137.230; 4.248.870;

4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269;

4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650;

4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533. Unidades de droga maitansinóide são unidades de droga atrativas em conjugados de anticorpo-droga uma vez que são: (i) relativamente acessíveis para preparar por fermentação ou modificação química, ê derivatização de produtos de fermentação, (ii) passíveis de derivatização com grupos funcionais apropriados para a conjugação através de ligantes não- dissulfetos para anticorpos, (iii) estáveis no plasma, e (iv) eficazes contra uma =—=— variedade delinhagens de-células tumorais. —=—= — — — Imunoconjugados contendo maitansinóides, métodos para a " -- — Produção dos mesmos e seu uso terapêutico são descritos, por exemplo, nas patentes US Nos. 5.208.020, 5.416.064 e Patente EP O 425 235 B1, a = descrição das quais está integralmente incorporada ao presente como ND referência. Liu et af, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) e descreveu imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 direcionado contra câncer coloretal humano. Verificou-se que o conjugado é altamente citotóxico para células de câncer de cólon cultivadas, e demonstrou uma atividade antitumoral em um ensaio de crescimento de tumor in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127- 131 (1992) descreve imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado via um ligante dissulfeto a um anticorpo murino A7 que se liga a um antígeno nas linhagens celulares de câncer de cólon humano, ou à outro anticorpo murino monocional TA.1 que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxidade do conjugado TA. 1-maitansinóide foi testada in vitro na linhagem celular de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula.

O conjugado de droga atingiu um grau de toxicidade similar a droga maitansinóide livre, que poderia ser aumentada através do aumento do número de moléculas maitansinóide por molécula de anticorpo.

O conjugado A7-maitansinóide demonstrou baixa citotoxidade sistêmica em camundongos.

Os conjugados de anticorpo-maitansinóide são preparados por ligação química de um anticorpo a uma molécula maitansinóide, sem diminuir à significativamente a atividade biológica tanto do anticorpo quanto da molécula $ maitansinóide.

Vide, por exemplo, a patente US 5.208.020 (a descrição da mesma é expressamente incorporada ao presente como referência). Uma média de 3 a 4 moléculas de maitansinóide conjugadas por molécula de 7 e âniticorpo Mostrou "eficácia em aumentar a citotoxidade-das células: alvo-sem —- . afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora mesmo - -- uma molécula de toxina/anticorpo fosse esperada como capaz - de aumentar a . —. 15 citotoxidade pelo uso de um anticorpo naked.

Os maitansinóides são bem = O conhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados por técnicas || NNE . conhecidas ou isolados de fontes naturais, Maitansinóides apropriados são e descritos, por exemplo, na patente US 5.208.020 e em outras patentes e artigos científicos referenciados mais acima.

Maitansinóides preferidos são —maitansino!l e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como diversos ésteres de maitansinol.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos no estado da técnica para a produção de conjugados de anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou patente EP 0 425 235 B1, Chari ef al, Cancer Research 52:127-131 (1992), e patente US 2005/016993 A1, a descrição dos quais está incorporada ao presente como referência.

Os conjugados de anticorpo-maitansinóide que compreendem o componente ligante SMCC podem ser preparados conforme descrito no documento US 2005/016993 A1. Os grupos ligantes incluem grupos dissulfeto, grupos tioéteres, grupos de ácido lábil, grupos fotolábeis, grupos de peptidase tábil, ou grupos de esterase lábil, conforme descritos pelas patentes acima, grupos dissulfeto e tibéter sendo os preferidos. Grupos de ligação adicionais são descritos e exemplificados no presente.

Conjugados de anticorpo e maitansinóide podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes acopladores de proteínas bifuncionais tais como N-succinimídil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCCO), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (tais como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraideído), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e comostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2 4-dinitrobenzeno). Os agentes de acoplamento particulamente preferidos são N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carisson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para fornecer uma ligação dissulfeto.

O ligante pode estar ligado à molécula de maitansinóide em diversas posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada pela reação com um grupo hidróxi utilizando técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetil, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila, e na posição C-20 que possui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol.

2. AURISTATINAS E DOLASTATINAS Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a dolastatinas ou análogos peptídicos de dolastatina e derivados, a auristatinas (patente US 5635483; 5780588). Demonstrou-se que —dolastatinase auristatinas interferem com a dinâmicas do microtúbulo, hidrólise GTP, e divisão celular e nuclear (Woyke et af (2001) Antimicrob, Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividade anticâncer (US 5663149) à e antifúngica (Pettit et a! (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). 8 A unidade de droga dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo pelo terminal N (amino) ou o terminal C (carboxila) da unidade de droga peptídica (WO 02/088172). Exemplos de realizações de auristatina incluem as unidades-de- = cc o co "9CCÍCCC droga monometilauristatina ligadas ao N-terminal DE e DF, descritas em “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, patente la US 10/083,340, depositada em 5 de novembro de 3004, a descrição da qual o.

1... estáincorporadaaopresentecomóreferêficia em sua ftalíidade. ||| NS Tipicamente, unidades de droga com base em peptídeo podem [À ser preparadas pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais fragmentos de aminoácidos e/ou peptídeos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (vide E. Schrôder e K. Lúbke, “The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química peptídica. As | unidades de droga auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: US 5635483; US 5780588; Pettit et a/ (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit ef af (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. Vide também Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784; “Monomethylvalihne = Compounds Capable of

Conjugation to Ligands", patente US 10/983,340, depositada em 5 de novembro de 2004, incorporada ao presente como referência em sua totalidade (descrevendo, por exemplo, ligantes e métodos de preparação de compostos monometilvalina tais como MMAE e MMAF conjugados aos ligantes).

3. CALIQUEAMICINA Em outras realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de dupla ê fita em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, vide as patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116,

5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.206 (todas da American Cyanamid Company). Os análogos estruturais, de. caliqueamíicina- que- podem" - “o «== =" $6 Lfilizados incluem, mas sem limitar-se a, y11, a21, a3l, N-acetily11, PSAG e 811 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer o . 15. .Reseaích 58:2925:2028 (1998) é as paréntes US mMéncionadas acima da O... American..Cyanamid)-— Outra droga —antiturmoral que o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antíifolato. Tanto a caliqueamicina quanto QFA $$ possuem sitios de ação intracelulares e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celular destes agentes através da internalização mediada por anticorpo, aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos.

4. OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados aos anticorpos incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e S-fluorouracila, a família dos agentes conhecidos coletivamente como complexo 1LL-E33288 descritos nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (patente US 5.877.296). Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos dos mesmos que n——

podem ser utilizadas incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina difteria cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de rícino, cadeia A de abrin, cadeia A de modeccin, cadeia A de alfa-sarcin, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. ê A presente invenção contempla adicionalmente — um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (tal como, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease, tal como uma deoxiribonuclease; DNase).. 2.122 22 é eso oO Es ri TITO OO nro Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo.

Uma variedade de isótopos A * rádicativos é disponível para à produção de anticorpos radioconjugados. 2 Exemplos incluem AB STS, YO, Ret, TRE, Sm A, BR, pe Pp??? e isótopos radioativos de Lu.

Quando o conjugado é utilizado para detecção, ele 8 pode compreender um átomo radioativo para estudos escintigráficos, por exemplo, teºm ou 11%, ou uma marcação spin para imagem de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem de ressônancia magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo -131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

As radiomarcações ou outras podem ser incorporadas no conjugado de formas conhecidas.

Por exemplo, o peptideo pode ser —biosintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos apropriados que envolvem, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio.

As marcações tais como tom ou 11, Re", Re"! e nº! podem ser ligadas via resíduos de cisteina no peptídeo. ——

Ítrio-90 pode ser ligado via resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para incorporar —iodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Conjugados de anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteina bifuncionais, tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), ê iminotiolano (IT), derivados bíifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HC), ésteres ativos (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeíido), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados , bis-diazônio. (tal. como -bis-(p-diazoniobenzoil)-- - mí etilenodiamina), diisocianatos (tal como toluene 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,56-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, UM. * imunótóxico de rícino pode ser preparado conforme “descrito em Vitetta et al. e 1 Science 238:1098"(1987)" O ácido” iisolocianatobenzil-S-metildietileno | triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um exemplo de 8 agente quelante para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Vide o documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante de clivagem" que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante de ácido lábil, um ligante sensível a peptidase, um ligante fotolábil, um ligante dimetil ou um ligante contendo dissulfeto (Chari et al, Cancer Research 52:127-131 (1992); patente US 5,208,020) pode ser usado.

Os compostos expressamente contemplam, mas sem limitar-se a, —ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC- SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, a partir de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA). Vide páginas 467-498, 2003-2004 de Applications Handbook e Catálogo.

5. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO-DROGA Nos conjugados de anticorpo-droga (ADC), um anticorpo (Ac) é —conjugadoa uma ou mais unidades de droga (D), por exemplo, cerca de 1a cerca de 20 unidades de droga por anticorpo, através de um ligante (L). O ADC de Fórmula | pode ser preparado por diversas rotas, empregando reações químicas orgânicas, condições e reagentes conhecidos dos técnicos no 8 assunto, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente de ligante bivalente, para formar Ab-L, via uma ligação covalente, seguida pela reação com uma unidade de droga D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma unidade de droga com.um reagente-ligante bivalente; para - “ CU O formar D-L, via uma ligação covalente, seguida pela reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos adicionais para a preparação de ADC NO são descritos ho presente. ' oco TOO A e ABB o O ligante pode ser composto de um ou mais componentes $$ ligantes. Exemplos de componentes ligantes incluem 6-maleimidocaproil (MC”), maleimidopropanoil (“MP”), valina-citrulina (“val-cit"), — alanina- fenilalanina (“ala-fen”), p-aminobenziloxocarbonila (“PAB”), N-Succinimídil 4-(2- piridiitio) pentanoato (“SPP”), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano- 1 carboxilato (“SMCC), e N-Succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato (CSIAB”). Componentes ligantes adicionais são conhecidos do estado da técnica e alguns são descritos no presente. Vide também "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, patente US 10/983,340, depositada em 5 de novembro de 2004, os conteúdos da qual estão incorporados ao presente como referência em sua totalidade. Em algumas realizações, o ligante pode compreender resíduos de

SR aminoácido.

Exemplos de componentes ligantes de aminoácidos incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo.

Exemplos de dipeptídeos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-fen). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gli-val-cit) 56 eglicina-glicina-glicina (gli-gli-gli). Resíduos de aminoácidos que compreendem um componente ligante de aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos de ocorrência NR não-natural, tal como citrulina.

Componentes ligantes de aminoácidos podem 8 ser designados e otimizados em sua seletividade por clivagem enzimática, através de enzimas particulares, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease plasmina. eee Grupos nucleofílicos de anticorpos-incluem, 'mas-sem-limitar:ise- ar " ' (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadeia lateral, por exemplo lisina, (iii) grupos tióis de cadeia lateral, por exemplo cisteina, e (iv) grupos e ' 156 âmino ou hidroxil açúcar onde o anticorpo é glicosilado.

Grupos amina, tfiol e e ———--—- -tidróxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em unidades ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) [ ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tal como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila, e grupos maleimida.

Determinados aticorpos possuem intercadeias dissulfeto redutíves, tal como pontes de cisteína.

Anticorpos podem ser produzidos reativos para conjugação com reagents ligantes pelo tratamento com um agente de redução tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteina irá então formar, teoricamente, dois nucleófilos tióis reativos.

Grupos nucleofílios adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em tiol.

Grupos tióis reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) pela introdução de um, dois, três, rn ———

quatro ou mais resíduos de cisteina (por exemplo, pela preparação de anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido cisteina não-nativos). Conjugados de anticorpo e droga podem também ser produzidos pela modificação do anticorpo para introdução de unidades eletrofílicas, que podem reagir com substituintes que podem reagir com substituintes nucleofítlicos no reagente ligante ou droga.

Os açúcares dos anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes periodato ê oxidantes, para formar grupos aldeídos ou cetonas que podem reagir com o grupo amina dos reagentes ligantes ou unidades de droga.

Os grupos base Schiff imina resultantes podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, por exemplo, por reagentes borohidreto-para formar ligações amina * TOTO estáveis.

Em uma realização, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicositado com glactose oxidase ou meta-periodato de Sódio pode gerar o o 15 “grupos carbonila taldeido e cetona) na proteína que pode reagir com grupos - --——— -— -apropriados nã droga (Hermanson, técnicas de bioconjugado). Em outra realização, proteínas contendo residues serina ou treonina N-terminal podem Ss reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no í lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146: US 5362852). Tal aldeído pode ser reagido com uma unidade de droga ou nucleófilo ligante.

Da mesma forma, grupos nucleofílicos em uma unidade de droga incluem, mas sem limitar-se a: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, e arilhidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nas unidades ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila, tal como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila, e grupos e maleimidas.

De forma alternativa, uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e agente citotóxico pode ser produzido, por exemplo, por técnicas recombinantes ou de síntese de peptídeo.

O comprimento do DNA pode compreender regiões respectivas que codificam as duas porções do conjugado, adjacente uma a outra ou separadas por uma região que codifica um peptídeo ligante, que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um ê “receptor” (tal como estreptavidina), para utilização em tumor pré-alvo, em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não-ligado da circulação, pelo uso de um agente de limpeza e então administração de um. "ligante" (por .exemplo; avidina), que é” | TO TITO conjugado a um agente citotóxico (tal como um radionucleotídeo). D.

MÉTODOS eee ee “O as-- co co 1.MétoDós DEDIAGNÓSTICO E MÉTODOS DE DETECÇÃO ee ee e" En Ur áspecto, os anticorpos de acordo com à presente invenção são úteis para a detecção da presença de Notch2 em uma amostra | 6 biológica.

O termo “detecção”, da forma utilizada no presente, engloba a detecção quantitativa ou qualitativa.

Em algumas realizações, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como tecido cancerígeno.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de detecção da presença de Notch2 em uma amostra biológica.

Em determinadas realizações, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo anti-Notch2 (por exemplo, um anticorpo anti-Notch2 NRR) sob 26 condições que permitem a ligação do anticorpo anti-Notch2 a Notch2, e detecção da formação de um complexo entre o anticorpo anti-Notch2 e Notch2. Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de dignosticar uma disfunção associada com expressão aumentada de Notch2. —

Em algumas realizações, o método compreende o contato de uma célula teste com um anticorpo anti-Notch2; a determinação dos níveis de expressão (tanto quantitativamente quanto qualitativamente) de Notch2 pela célula teste, através da detecção da ligação do anticorpo anti-Notch2 a Notch2; e comparação dos —níveisde expressão de Notch2 pela célula teste com o nível de expressão de Notch2 por uma céluta controle (por exemplo, uma célula normal do mesmo tecido de origem da célula teste, ou uma célula que expressa Notch2 a niveis comparáveis a uma célula normal, ou um nível médio de expressão entre as ê células de múltiplo controle), em que um nível mais alto de expressão de —Notch2 pela célula teste, conforme comparação com a célula controle, indica a presença de uma disfunção associada com a expressão aumentada de Notch2. Em algumas realizações, a célula teste .é .obtida..a partir de- um: indivíduo?” — NS “OO suspeito de possuir uma disfunção associada com a expressão aumentada de Notch2. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção: celular es 15 * proliférativa, tal como um câncer ou tumor. rs OO OA o =" -' — Exemplos de disfunções que Podem ser diagnosticadas utilizando o anticorpo da presente invenção incluem câncer, tal como malignidades de [ célula B, melanoma, matlignidades de célula T (tal como T-ALL), câncer de mama, câncer de cérebro, câncer cervical, câncer do cólon, e câncer pancreático.

Alguns outros métodos podem ser utilizados para detectar a ligação de anticorpos a Notch2. Tais métodos incluem, mas sem limitar-se a, ensaios de ligação de antígeno que são bem conhecidos no estado da técnica, tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente de ligação a enzima), imuncoensaios do tipo “sandwiích”, ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imuncensaios de proteína A, e imunohistoquímica (IHC). Em algumas realizações, os anticorpos são marcados, Às marcações incluem, mas sem limitar-se a, marcações ou unidades que são detectadas diretamente (tais como marcações fluorescentes, cromofóricas, de elétron-denso, quimiluminescente, e radioativas), bem como unidades, tais como enzimas ou ligantes que são indiretamente detectados, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Exemplos de marcações incluem, mas sem limitar-se a, os radioisótopos P*?, C'*º, ÚÉ ne 1º, fluoróforos tal como quelatos terrosos raros ou fluoresceina e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por FA exemplo, luciferase de vaga-lumes e luciferase bacterianas (patente US

4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidase de raiz forte (HRP), fosfatase alcalina, B-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo o. . Oxidases, por. exemplo, glicose .oxidase, galactose oxidase; eglicose=6:fosfato” Po desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e oxidase xantina, acoplada com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar O um precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase, ou mieroperoxidase, UU TATA biótinalávidina, marcadores de spin, marcações de Ppacteriofago, radicais livres estáveis e similares. 6 Em algumas realizações, os anticorpos são imobilizados em uma É matriz insolúvel. A imobilização pode acarretar na separação de um anticorpo antiNoteh2 de qualquer Notch2 que permaneça livre na solução. Convencionalmente, esta etapa é realizada tanto pela insolubilização do anticorpo anti-Notch2 antes do procedimento de ensaio, quanto pela adsorção para uma matriz ou superfície insolúvel em água (Bennich et al, US

3.720.760), ou por acoplamento covalente (por exemplo, utilizando reticulação de glutaraldeido), ou pela insolubilização do anticorpo anti-Notch2 após a formação de um complexo entre o anticorpo anti-Notch2e Notch2, por exemplo, por imunoprecipitação. Deve-se compreender que qualquer das realizações descritas —

acima, de diagnóstico ou detecção, pode ser realizada utilizando um imunoconjugado da presente invenção no lugar de ou em adição à um anticorpo anti-Notch2.

2. MÉTODOS TERAPÊUTICOS Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo, e in vivo. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para a inibição da atividade Notch2, tal como sinalização de Notch2, in vivo ou in vitro, em que o método 6 compreende a exposição de uma célula a um anticorpo anti-Notch2 NRR de acordo com a presente invenção sob condições que permitem a ligação do anticorpo a Notch2. Em algumas realizações, a célula é uma célula 2 - - - - Ccancerígena,.tal.como-uma célula-B cancerígena ou uma-céluta de melanoria, * IO Em uma realização, um anticorpo anti-Notch2 NRR de acordo cm a presente invenção pode ser utilizado para a inibição da atividade Notch2, em que 6. método compreende a exposição de Notch2 a um anticorpo anti-Notch2 NRR-=— e ——— — - “de ácórdo com à presente invenção, de forma que a atividade Notch2 seja inibida. e Um anticorpo anti-Noteh2 NRR de acordo com a presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, para o tratamento de disfunções associadas com a expressão e/ou atividade de Notch2, tal como, disfunções associadas com expressão ou atividade aumentada de Notch2, ou disfunções em que a expressão ou atividade de Notch2 contribui para um estado patogênico. Uma “disfunção associada com o aumento da expressão ou atividade de Notch2"” refere-se a uma disfunção em que a expressão ou — atividade de Notch2 é significativamente mais alta que o normal. Em um aspecto, um anticorpo de acordo com a presente invenção é utilizado para tratar ou prevenir um câncer, tal como malignidades de célula B, melanoma, malignidades de célula T (tal como T-ALL), câncer de mama,

Câncer de cérebro, câncer cervical, câncer do cólon, e câncer pancreático.

Em algumas realizações, um anticorpo anti-Notch2 NRR é utilizado para tratar um câncer, tal como câncer de mama, uma malignidade de célula B ou melanoma.

Em um aspecto adicional, um anticorpo de acordo com a presente invenção é utilizado para tratar ou prevenir um câncer, especificamente um tumor sólido contendo células tronco cancerígenas.

Células tronco cancerígenas são capazes de se proliferar para dar lugar células tronco cancerígenas adicionais, bem como outras populações de célula tumoral.

Vide ê Al-Hajj et al., Proc.

Nat'l Acad.

Sci.

USA 100: 3983-3988 (2003). Acredita-se queas células tronco cancerígenas contribuem para a recorrência de cânceres e a resistência de cânceres para terapias com droga.

Receptores Notch foram - = - — identificados como marcadores .de-célula troneo cancerígenas e-como um alvo” = 7 para eliminar células tronco cancerígenas responsáveis pela formação e ' recorrência de tumores sólidos.

Vide WO 2008/091641. Tais tumores sólidos incluem, mas sem limitar-se a, cânceres de mama, de cólon, pancreático, da e — ==" próstata, do pulmão, da cabeça e pescoço, retal, e coloretal. | Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para o 6 tratamento de um câncer que compreende a administração a um indivíduo que ' necessite do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo coma presente invenção, Em algumas realizações, um método para o tratamento de câncer compreende a administração a um indivíduo que necessite, de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com à presente invenção e&, opcionalmente, pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como aqueles descritos abaixo.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados tanto sozinhos quanto em combinação com outras composições na terapia.

Por exemplo, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional e/ou adjuvante.

Em algumas realizações, um anticorpo anti-Notch1 (tal como um anticorpo anti-Notcht NRR) é administrado com um agente terapêutico adicional que inibe ou reduz a diferenciação celular intestinal alterada, que seria de outra forma induzida pelo anticorpo anti-Notch1. Em algumas realizações, o agente terapêutico adicional é dexametasona ou tamoxifeno.

Tal terapia combinada seria útil, por exemplo, no tratamento de disfunções angiogênicas, incluindo angiogênese associada a tumor, e câncer.

Em 8 determinadas realizações, um anticorpo anti-Notch2 (tal como um anticorpo antiNotch2 NRR) é administrado com um agente terapêutico adicional, tal como um agente quimioterápico.

Dita terapia combinada seria útil, por exemplo, “2 - - notratamento.de.câncer, tal-como malignidadesde-célula"B e melanomã; mes As terapias combinadas descritis acima englobam a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são . . . : 15 incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas), e o -— — -* — administração separada, em que a administração do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a 8 administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ainda ser utilizados em combinação com terapia de radiação.

Em um aspecto, pelo menos alguns dos anticorpos de acordo com a presente invenção podem ligar Notch2 de espécies diferentes da espécie humana.

Assim, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para ligar Notch2, por exemplo, em uma cultura de célula —mamífera que expressa Notch2 endógeno ou recombinante, em humanos, ou em outros mamíferos que possuem Notch2 com o que um anticorpo de acordo com a presente invenção reage de forma cruzada (por exemplo, chimpanzé, babuíno, saguis, macacos rhesus e cynomolgus, porco, rato ou camundongo).

Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é utilizado em um método para a ligação de Notch2 em um indivíduo que sofre de disfunção associada com expressão e/ou atividade aumentada de Notch2, em que o método compreende a administração ao indivíduo, do anticorpo de forma que o Notch2 do indivíduo seja ligado.

Em uma realização, o Notch2 é Notch2 humano, e o indivíduo é um indivíduo humano.

De forma alternativa, o indivíduo pode ser um mamífero que expressa Notch2, ao qual um anticorpo de acordo com a presente invenção se liga.

Adicionalmente, o ê indivíduo pode ser um mamífero que no qual Notch2 foi introduzido (por exemplo, por administração de Notch2 ou por expressão de um transgene que codifica Notch2). me e 2 + Um anticorpo-de- acordo com=a -presente “invenção pode ser= - administrado a um humano para fins terapêuticos.

Ainda, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado aum mamífero não O 15 “humano que expressa Notoh2, com [) quato anticorpo reage de forma cruzada e TT tal como, um primata, porco, Tato, ou camundongo), para fins veterinários ou como um modelo animal de doença humana.

Com relação a este ultimo, tais Ss modelos animais podem ser úteis para a avaliação da eficácia terapêutica de anticorpos de acordo com a presente invenção (tal como teste de dosagens e regimes de administração). Um anticorpo de acordo com a presente invenção (e qualquer agente terapêutico adicional ou adjuvante) pode ser administrado por qualquer meio — apropriado, incluindo administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejável para tratamento local, administração intralesional.

Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea.

Adicionalmente, o anticorpo é apropriado para administração por infusão de pulso, em particular, com doses decrescentes do anticorpo.

A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, tal como injeção, incluindo injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, se a administração é breve ou crônica.

A localização da ligação alvo de um anticorpo da presente invenção pode ser levada em consideração na preparação e administração do anticorpo.

Quando a ligação alvo for uma molécula intracelular, determinadas realizações da presente invenção possibilitam que o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo seja introduzido na célula onde a ligação ê alvo está localizada.

Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser expresso de forma intracelular como um intracorpo.

O termo “intracorpo”, da forma utilizada no presente, refere-se a um ee anticorpo ou porção de ligação de. antígeno. do -mesmo que é expresso-de = "o forma intracelular e que é capaz de se ligar de forma seletiva a uma molécula alvo, conforme descrito em Marasco, Gene Therapy 4 11-15 1997; o Kohtêrmann, Methods 34: 163170 (2004); patente US 6.004.940 e US ++ 8,3291737 pédidos de palentes US 2003/0104402, e documentos WO 2003/077945. Vide também, por exemplo, o documento WO 96/07321 9 publicado em 14 de março de 1996, com relação ao uso de terapia gênica para | gerar anticorpos intracelulares.

A expressão intracelular de um intracorpo pode ser efetuada pela introdução de um ácido nucléico que codifica o anticorpo desejado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo (que não apresenta a sequência líder do tipo selvagem e sinais secretórios normalmente associados com o gene que codifica aquele anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno) em uma célula alvo.

Um ou mais ácidos nucléicos que codificam o todo ou uma porção de um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser fornecido a uma célula alvo, de forma que um ou mais intracorpos são expressos, que são capazes de se ligar a um polipeptideo alvo intracelular e modular a atividade do a ——

polipeptídeo alvo.

Qualquer método padrão de introdução de ácidos nucléicos em uma célula pode ser utilizado, incluindo, mas sem limitar-se a, microinjeção, injeção balística, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, lipossomos, e transfecção com retrovirus, adenovírus, vírus adeno-associados, e vetores de vaccíniaque carregam o ácido nucléico de interesse.

Em algumas realizações, o ácido nucléico (opcionalmente contido em um vetor) pode ser introduzido nas células do paciente por métodos in vivo . e ex vivo.

Em um exemplo de fornecimento in vivo, o ácido nucléico é injetado 8 diretamente no paciente, por exemplo, em um sítio onde intervenções terapêuticas são necessárias.

Em um exemplo adicional de fornecimento in vivo, o ácido nucléico é introduzido em uma célula utilizando transfecção com - - —. fyVetores virais (tal como .adenovírus,-vírus Herpes simplex 1; ou-virus adeno- = —

associados) e sistemas com base em lipídeos (lipídeos úteis para transferência mediada por lipídeo do gene são, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol). Re

1 Paraa revisão de determinados marcadores genéticos e protocolos de terapia NS -* — — "gênica, vide Andeison ef al., Sciênce 256:808-813 (1992), e WO 93/25673 e as referências ali citadas.

Em um exemplo de tratamento ex vivo, as células dos Ss pacientes são removidas, o ácido nucléico é introduzido nas células isoladas, e as células modificadas são administradas ao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas nas membranas porosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, patente US 4.892.538 e US 5.283.187). Um vetor comumente utilizado para o fornecimento ex vivo de um ácido nucléico é o vetor retroviral.

Em outra realização, anticorpos de internalização são fornecidos.

Os anticorpos podem possuir determinadas características que aumentam o fornecimento de anticorpos nas células, ou podem ser modificados para possuir tais características.

Técnicas para alcançar tais realizações são bem conhecidas no estado da técnica, Por exemplo, a cationização de um anticorpo é conhecida por facilitar sua absorção nas células (vide, por exemplo, a patente US 6.703.019). Lipofecções ou lipossomos podem também ser utilizados para fornecer o anticorpo às células.

Onde fragmentos de anticorpo são utilizados, o menor fragmento inibitório que se liga especificamente à proteína alvo pode ser vantajoso.

Por exemplo, com base nas sequências de região variável de um anticorpo, moléculas de peptíideo podem ser designadas, que retém a capacidade de se ligar à sequência de proteina alvo.

Ditos peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos pela tecnologia do DNA ê recombinante.

Vide, por exemplo, Marasco et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 90:7889-7893 (1993). A entrada dos anticorpos nas células alvo pode ser aumentada - = — por outros métodos -conhecidos -no -estado -da -técnica= Por “exemplo, 7" 7 determinadas sequências, tais como aquelas derivadas de HIV Tat ou proteína : de Anfennapedia homeodomain, são capazes de direcionar: uma absorção Re eficaz de proteínas heterólogas ao longo das membranas celulares.

Vide, por A — — — exêmplo, Chen et al., Proc.

Nati.

Acad.

Sci.

USA (1999), 96:4325-4329. Quando a ligação alvo de um anticorpo está localizada no Ss cérebro, determinadas realizações de acordo com a presente invenção permitem que o anticorpo atravesse a barreira hemato-encefálica.

São conhecidas no estado da técnica diversas abordagens para o transporte de moléculas ao longo da barreira hemato-encefálica, incluindo, mas sem limitar- se a, métodos físicos, métodos com base em lipídeo, métodos com base em células tronco, e receptor e métodos com base em canal.

Métodos físicos de transportar um anticorpo ao longo da barreira —hemato-encefálica incluem, mas sem limitar-se a, contornando inteiramente a barreira hemato-encefálica, ou criando aberturas na barreira hemato- encefálica.

Métodos de contorno incluem, mas sem limitar-se a, injeção direta no cérebro (vide por exemplo, Papanastassiou et a/., Gene Therapy 9: 398-406

(2002)), fornecimento aumentado de infusão/convenção intersticial (vide, por exemplo, Bobo et a/., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 91: 2076-2080 (1994)), e implementação de um dispositivo de fornecimento no cérebro (vide, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); e Gliadel WafersT", Guildford Pharmaceutical). Métodos de criação de abertura na barreira incluem, mas sem limitar-se a, ultrassonografia (vide, por exemplo, patente US No. 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, por administração de manitol hipertônico (Neuweit, E.

A., implication of the Blood-Brain Barrier and its 6 Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilização, por exemplo, por bradikinina ou permeabilizante A-7 (vide, por exempio, patentes US 5.112.596, US 5.268.164, US 5.506.206, e US 5.686.416), e transfecção de — =— — neurônios que transpõe a barreira hemato-encefálica-com”vetorês conterito TT : genes que codificam o anticorpo (vide, por exemplo, a patente US 2003/0083299). : : ' ' Co Como - . ' Métodos com base em lipídeo de transporte de um anticorpo af o longo da barreira nemato-encefálica incluem, mas sem limitar-se a, o encapsulamento do anticorpo em lipossomos que são acoplados aos o fragmentos de ligação de anticorpo que se ligam aos receptores no endotélio - vascular da barreira hemato-encefálica (vide, por exemplo, a patente US 20020025313), e revestimento do anticorpo em partículas de lipoproteínas de baixa densidade (vide, por exemplo, patente US 20040204354) ou apolipoproteína E (vide, por exemplo, patente US 20040131692). Métodos com base em células tronco, de transporte de um anticorpo ao longo da barreira hemato-encefálica implica em engenharia genética de células progenitoras neuronais (NPCs) para expressão do anticorpo de interesse e então a implementação de células tronco no cérebro do indivíduo a ser tratado.

Vide Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005 publicação online avançada (reportando que NPCs de engenharia genética para expressar o fator neurotrófico GDNF, reduziu os sintomas do mal de Parkinson quando implantadas nos cérebros de modelos de roedores e primatas). Métodos com base em canal e receptor, de transporte de um anticorpo ao longo da barreira hemato-encefálica incluem, mas sem limitar-se a, o uso de bloqueadores de glicocorticóide para aumentar a permeabilidade da barreira hemato-encefálica (vide, por exemplo, publicações de patentes US Nos. 2002/0065259, 2003/0162695, e 2005/0124533); a ativação dos nanais de $ê potássio (vide, por exemplo, a publicação de patente US No. 2005/0089473), a inibição os transportadores de droga ABC (vide, por exemplo, publicação de patente US No. 2003/0073713); revestimento dos anticorpos com uma - — . -—transferina e-modulação da-atividade:de um ou mais receptores-de transferina” (vide, por exemplo, publicação de patente US No. 2003/0129186), e . — . cationizaçãodos anticorpos (vide, por exemplo, patente US No. 5.004.697). 1. . O 16 o | Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem Ex SS o — formulados, dosados E administrados de uma forma consistente com as boas práticas médicas.

Fatores a serem considerados neste contexto incluem, em 8 particular, a disfunção a ser tratada, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da disfunção, o sítio de fornecimento do agente, o método de administração, O regime de administração, e outros fatores conhecidos dos técnicos no assunto. o anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agents normalmente utilizados para prevenir ou tratar a disfunção em questão.

A quantidade eficaz de tais agentes adicionais depende da quantidade de 26 anticorpo presente na formulação, o tipo de disfunção ou tratamento, e outros fatores discutidos acima.

Ditos agentes são normalmente utilizados nas mesmas dosagens e com as mesmas rotas de administração aqui descritas, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada.

Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo de acordo com a presente invenção (quando utilizado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para ' fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, histórico clínico do paciente, e 6 resposta ao anticorpo, e a critério do médico.

O anticorpo é administrado de forma apropriada ao paciente apenas uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 ug/kg a —. = - —15-mg/kg (tal como-9,Img/kg a 10mg/kg) de-anticorpgo pode set uma dosagem mom inicial candidata para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua.

Uma dosagem diária 0 . - | 15 “típica deve variar de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos TO — fatores mencionados acima. | Para administrações repetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente sustentado Ss até uma supressão desejada dos sintomas da doença.

Um exemplo de dosagem de anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.

Assim, uma ou mais dosagens de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destes) pode ser administrada ao paciente.

Estas doses podem ser administradas de forma intermitente, por exemplo, toda a semana ou a cada três semanas, (por exemplo, de forma que o paciente receba de cerca de 2 a cerca de 20, ou por exemplo de cerca de 6 — doses do anticorpo). Uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode ser administrada.

Um exemplo de regime de dosagem compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por uma dose semanal de manutenção de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. Deve-se compreender que quaisquer dos métodos terapêuticos acima descritos podem ser realizados utilizando um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além do anticorpo anti-Notch2.

3. ENSAIOS Anticorpos Anti-Notch2 NRR de acordo com à presente invenção 6 podem ser caracterizados por suas propriedades fisico/quimicas e/ou por suas atividades biológicas por diversos ensaios conhecidos do estado da técnica. A) ENSAIOS DE ATIVIDADE = — ” Em um “aspecto; os ensaios “são fornecidos para identificar " anticorpos anti-Notch2 (tal como, anticorpo anti-Notch2 NRR) que possuem atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a inibição - - ou redução da atividade de Notch2, por exemplo, sinalização de Notch2. Os — " NS anticorpos que possuem tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro também são fornecidos. Ss Em algumas realizações, um anticorpo anti-Notch2 NRR de acordo com a presente invenção é testado com relação a sua capacidade de inibir a geração de células B de zona marginal. Um exemplo de ensaio é fornecido nos exemplos. Em algumas realizações adicionais, um anticorpo de acordo com a presente invenção é testado com relação a sua capacidade de inibir a expressão de um gene repórter que responde à sinalização de Notch2. Um exemplo de ensaio é fornecido nos Exemplos. B) ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS Ém um aspecto, um anticorpo de acordo com a presente invenção é testado com relação a sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, através de métodos conhecidos, como ELISA, Westem blot, etc. Em outro aspecto, os ensaios de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monocional) que compete com um anticorpo de acordo com à presente invenção.

Em uma realização, um anticorpo compete com Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2, ou Anticorpo —D-3paraligaçãoa Notch2. Nesta realização, um anticorpo competitivo se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo de conformação linear ou conformacional) que é ligado pelo Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2, ou Anticorpo D-3. Em outra realização, um anticorpo competitive se liga ao 6 mesmo epítopo (ou seja, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pelo antt-NRR1 conforme descrito no Exemplo B(5), ou seja, um epítopo que compreende domínios LNR-A, LNR-B e HD-C de Notch1 NRR.

Exemplos de — — ensaio de competição incluem,.mas sem limitar-se a, ensaios de .rotina,tais — - -- como os fornecidos em Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Métodos de exemplos detalhados para o mapeamento de um epitopo ao quai um: anticorpo 7 7 : “ — — se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols, in B Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Dois Ss anticorpos são definidos como “ligando ao mesmo epítopo" se cada um bloquear a ligação do outro em 50% ou mais.

Em um exemplo de ensaio de competição, Notch2 NRR imobilizado é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado, que se liga a Noteh2 NRR (tal como, Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2, ou Anticorpo D-3) e um segundo anticorpo não-marcado que está sendo testado com relação a sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para ligação a Notch2 NRR.

O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma.

Como um controle, Notch2 NRR imobilizado é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não-marcado.

Após incubação sob condições que permitam a ligação do primeiro anticorpo a Notch2 NRR, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade da marcação associada com Notch2 NRR imobilizado é medida, Se a quantidade de marcação associada com Notch2 NRR imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste, com relação a amostra controle, indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação a Notch2 NRR.

Em um aspecto, os anticorpos de acordo com a presente ê invenção podem ser adicionalmente caracterizados por uma série de ensaios, incluindo, mas sem limitar-se a, sequenciamento do N-terminal, análises de aminoácidos, cromatografia líquida de alta pressão com exclusão de tamanho — — não desnaturante (HPLC), espectrometria de massa, cromatografia de troca - - iônica e digestão de papaína. . Deve-se compreender que qualquer um dos ensaios acima pode ser realizado pelo uso de um imunoconjugado da presente invenção no lugar TO eouem adição ao anticorpo antiNoteh2 NRR. | TM NS E.

ARTIGOS MANUFATURADOS o Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo manufaturado contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima.

O artigo manufaturado compreende um recipiente e um rótulo ou uma bula no recipiente ou associado ao mesmo.

Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc.

O recipiente pode ser formado a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico.

O recipiente armazena uma composição que é sozinha ou em combinação com outra composição eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição, e pode apresentar uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo ou imunoconjugado de acordo com a presente invenção. O rótulo ou a bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Ainda, o artigo manufaturado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um anticorpo ou imunoconjugado de acordo com a presente invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico e adicional. O artigo manufaturado nesta realização da presente invenção pode adicionalmente compreender uma bula indicando que as composições podem ser utilizadas para o tratamento de uma condição particular. De forma - - -= - «alternativa ou adicional, 0 artigo-manufaturado pode ainda compreender-um = segundo (ou terceiro) recipiente que compreente um tampão : . farmaceuticamente estável, tal como água. para injeção bacterioestática == " | 15 (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de a — dextrose. Pode-se incluir outros materiais dessiáveis do ponto de “vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e Ss seringas. WV-EXEMPLOS Os exemplos a seguir representam métodos e composições da presente invenção. Deve-se compreender que diversas outras realizações podem ser praticadas, desde considerando a descrição geral fornecida acima. A. MATERIAIS E MÉTODOS

1. GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-NoTCH2 NRR SELEÇÃO DA BIBLIOTECA E ANÁLISE PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ANT!- Nortcrn2 NRR Bibliotecas de anticorpo de fago humano com diversidades sintéticas nas regiões determinantes de complementaridade selecionadas (H1,

H2, H3, L3), imitando a diversidade natural do repertório de IgG humano, foram utilizadas para seleção. Fragmentos Fab foram exibidos de forma bivalente na superfície de partículas de bacteriófago M13. (Vide Lee ef al., J. Mol. Biol. 340:1073-1093 (2004).) Os fragmentos Notch2 NRR foram expressos como proteinas secretadas fundidas a marcações de epítopos (FLAG ou 6xHis) utilizando o sistema de vetor de expressão baculovírus ou células 2937, purificadas a >90% de pureza, utilizando cromatografia de afinidade e testados A para a falta de agregação utilizando dispersão de luz (light scattering). As 6 sequências dos antígenos Notch2 NRR foram conforme segue: FLAG-Humano-Notch2-NRR-6xHis: = — KPpBDDKGSGDVECPQMPELNGGFEAVASNMPDGFICREPPGFSGARCQOSSCGO 7 7

VKCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPRDCESGCASSPCQHGGSCHPORQOPPYYSCQC APPFSGSRCELYTAPPSTPPATCLSQYCADKARDGVCDEACNSHACQWDGGDC : — . SLTMENPWANCSSPLPCWDYINNQCDELCNTVECLFDNFECQGNSKTCKY :

DKYCADHFKDNHCNQGCNSEECGWDGLDCAADQPENLAEGTLVIVVLMPPEQ e LLQDARSFLRALGTLLHTNLRIKRDSQGELMVYPYYGEKSAAMKKQRM

TRRSLPGEQEQEVAGSKVFLEIDNRQCVQDSDHCFKNTDAAAALLASHAIQGT LSYPLVSVVSESLTPERTEFGLVPRGSGHHHHHH (SEQ ID NO:73) Notch2-NRR-FLAG de camundongo: —ADVCPOKPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCOSSCGAVKCRRG

EQCIHTDSGPRCFCLNPKDCESGCASNPCQHGGTEYPQARQPPHYSCRCPPS FGGSHCELYTAPTSTPPATCQSQYCADKARDGICDEACNSHACQWDGGDCS LTMEDPWANCTSTLROWEYINNGCDEQCNTAECLFDNFECQRNSKTCKYDK YCADHFKDNHCDQGCNSEECGWDGLDCASDQPENLAESTLIIVVLLPPEQLL QDSRSFLRALGTLLHTNLRIKADSOGALMVYPYFGEKSAAMKKQKMTRRSLP

EEQEQEQEVIGSKIFLEIDNRQCVADSDACFKNTDAAAALLASHAIAGTLSYPL VSVFSELESPRNARRAGSGDYKDDDDKENLYFQ (SEQ ID NO:74) Imunoplacas Maxisorp Nunc de 96 poços foram revestidas por uma noite a 4ºC com o antígeno alvo (10upg/ml) e foram bloqueadas por 1 hora a temperatura ambiente com tampão de bloqueio de fago PBST (solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 1% (ww) albumina sérica bovina (BSA) e 6 0,05% (v/v) de tween-20). As bibliotecas de fago de anticorpo VH (vide, por exemplo, Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004) e VANL (vide Liang et al, J. Mol. Biol. 366. 815-829, 2007) foram adicionadas às placas de = "——— —antíigeno de forma separada e-incubadas-por uma noite-a temperatura — S 7 ambiente. No dia seguinte, as placas revestidas com antígeno foram lavadas — dez vezes com PBT (PBS com 0,05% Tween-20), e fagos de ligação foram - . “eluídos com 50mM HCl e 500mM NaCt por 30 minutos e neutralizados com um A Tm volume igual de base 1 M Tris (pH 7,5). Os fagos recuperados foram amplificados em células E. coli XL-1 Blue. Durante os estágios de seleção o subsequentes, a incubação do fago de anticorpo com as placas revestidas com antígeno foi reduzida a 2 a 3 horas, e a estringência da placa de lavagem foi gradualmente aumentada. Após 4 ciclos de seleção, um enriquecimento significativo foi observado. 96 clones foram recuperados da classificação de biblioteca de VH e VH/VL para determinar se eles se ligam especificamente ao Notch2 NRR humano e murino. As regiões variáveis destes clones foram sequenciadas por PCR para identificar clones de sequencia única. As afinidades dos anticorpos de fago foram classificadas utilizando ELISA de competição local. Os valores IC50 de anticorpo de fago foram adicionalmente determinados utilizando ELISA de ligação de fago competitivo. Anticorpos de fago único que se ligam a Notch2 NRR humano e murino foram escolhidos e reformulados para IgGs de comprimento total para avaliação de ensaio celular in in vitro. Os clones de interesse foram reformulados em IgGs pela clonagem das regiões V, e Vu de clones individuais nos vetores LPG3 e LPGA4, respectivamente, expressando transitoriamente em células CHO de mamíferos, e purificando com uma coluna protéica A. à BIBLIOTECAS DE CONSTRUÇÃO PARA APRIMORAR A AFINIDADE DO ANTICORPO D' e O fagemídeo pW0703 (derivado do fagemídeo pV0350-2b (Lee et al,J Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)) exibindo Fab monovalente na superfície de bacteriófago M13) serviu como biblioteca modelo para desenhar domínios - —- variáveis de cadeia leve-(V,) e-pesada (Vu4)-de Anticorpo D a partir da biblioteca — - VHWVL para maturação por afinidade. Stop códons foram então incorporados em CDR-L3 da biblioteca modelo. A estratégia de randomização leve foi LL e | 15 utilizada para maturação por afinidade, que introduziu uma taxa de mutação de NE aproximadamente 50% nas posições selecionadas através do us de uma = l estratégia de oligonucleotideo envenenado (poisoned) com misturas de base o 70-10-10-10 favorecendo os nucleotídeos do tipo selvagem (Gallop et al, Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)) Em particular, os resíduos nas posições 28 a 32 de CDR-L1, 50 e 53-55 de CDR-L2, 91-94 e 96 de CDR-L3, 28-35 de CDR-H1, 50-58 de CDR-H2, 9895-100 de CDR-H3, foram marcados. Três bibliotecas diferentes com combinações de loops CDR levemente randomizados, L1/L2/13, L3/H1/H2 e L3/H3, também foram construídos.

ESTRATÉGIA DE SELEÇÃO DE FAGO PARA GERAR UMA AFINIDADE APRIMORADA Para seleção de afinidade aprimorada, bibliotecas de fago foram submetidas a seleção de placa para o primeiro ciclo, seguido por cinco ciclos de seleção de solução. As bibliotecas foram colocadas contra Notch2 NRR humano e murino separadamente.

No primeiro ciclo da seleção de placa, três bibliotecas foram colocadas contra placas alvo revestidas (NUNC Maxisorp plate) separadamente com a entrada de fago de aproximadamente 3 O.D./ml em 1% BSA e 0,05% Tween 20 por 2 horas a temperatura ambiente.

Para os ciclos seguintes de seleção de solução, 1 O.D./ml de fago propagados do primeiro ciclo de seleção de placa foram incubados com 50 nM de proteína alvo biotinilada (a concentração é baseada no valor IC50 do clone de fago parental) em 100yul de tampão contendo 1% de Superblock (Pierce Biotechnology) e e 0,05% de Tween20 por 30 minutos a temperatura ambiente.

A mistura foi adicionalmente diluída 10X com 1% de Superblock, e 100ul/ poço foi aplicado aos poços revestidos com neutravidina (Sug/ml) por 15 minutos a temperatura — — — ambiente, com mistura-suave para capturar fago alvo biotinilado ligado. "Os —- 7 ] poços foram então lavados 10 vezes com PBS-0,05% de Tween 20. Para determinação do perfil de ligação, os poços controle contendo fago comalvos . que não foram biotinilados foram capturados nas placas revestidas com : DL o heutravidina.

Fago ligado foi eluído com 0,1 NHCI por 20 minutos, neutralizado por 1/10 volume de 1M Tris pH11, titulado, e propagado para o próximo ciclo.

À o seguir, 4 ciclos adicionais de seleção por solução foram realizados junto com dois métodos de aumento da estringência de seleção.

O primeiro do qual é para seleção sob taxa, através da redução da concentração de proteína alvo biotinilada de 10 nM a 0,5 nM, e o segundo do qual é para seleção sem taxa pela adição de quantidades em excesso de proteína alvo não-biotinilada (100-500 vezes mais) para competir, fora ligantes fracos, mesmo a temperatura ambiente.

Ainda, a absorção de fago foi reduzida (0,1-0.5 O.D/ml) para ligação de fago de baixo antecedente.

SELEÇÃO DE AFINIDADE EM ALTO RENDIMENTO ELISA (ComPETIÇÃO DE Sítio ISOLADO) Colônias foram recuperadas de 6 ciclos de seleção e deixadas crescer por uma noite a 37ºC em 500 ulf poço de meio 2YT com 5O0ug/ml carbenicilina e 1E10/m! KO7 em placas de 96 poços (Falcon). A partir da mesma placa, uma colônia de fago XL-1 parental infectado foi recuperado como controle.

Placas de 968 poços Nunc Maxisorp foram revestidas com 100ul/ poçode proteina Notch2 NRR humana e murina (1ug/ml) separadamente em PBS a 4ºC por uma noite ou a temperatura ambiente por 2 horas.

As placas foram bloqueadas com 65 ul de 1% BSA por 30 minutos e 40 ul de 1% Tween 20 por mais 30 minutos. 8 O sobrenadante de fago foi diluído 1:5 em ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima) tampão (PBS com 0,5% BSA, 0,05% Tween20) com ou sem 10nM de proteína alvo em um volume total de 100 pl e — incubado por-pelo menos: 1 hora-a-temperatura ambiente em uma-placa*F—" - (NUNC). 75ul da mistura com ou sem a proteina alvo foi transferido, lado a lado, para as placas revestidas de proteína alvo.

A Placa foi levemente = e misturada por 15 minutos para permitir a captura de fagos não ligados à placa o Tevestida de proteína alvo.

À placa foi lavada pelo menos 5 vezes com PBS- | 0,05% Tween 20. A ligação foi quantificada pela adição anticorpo anti-M13 o conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) em tampão ELISA (1:5000) e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente.

As placas foram lavadas com PBS-0,05% Tween 20 pelo menos 5 vezes.

À seguir, 100 yl/ poço de uma razão 1:1 de substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) peroxidase e Solução B peroxidase (H2O2) (Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) foi adicionado aos poços e incubado por 5 minutos a temperatura ambiente.

A reação foi interrompida para adição de 100 ul 1M de ácido fosfórico (H3;PO.) para cada poço e permitida incubar por 5 minutos a temperatura ambiente.

A OD (densidade óptica) da cor amarela em cada poço foi determinada pelo uso de leitor de placa ELISA padrão a 450 nm.

A redução da OD (%) foi calculada pela seguinte equação:

Redução de ODasonm (%) = [(ODasonm de poços com concorrentes) / (ODasonm de poços sem concorrentes))* 100 Em comparação com a redução de ODaysonm (%) do poço do fago parental (100%), os clones que apresentaram uma redução de ODasonm (%) inferior a 50% para ambos os alvos humano e murino, foram selecionados para uma análise de sequência. Clones isolados foram selecionados para 56 — preparação de fago para determinar a afinidade de ligação (phage IC50) contra ambos Notch2 NRR humano e murino, através da comparação com clones 6 parentais. Os clones com maior aprimoramento de afinidade foram reformulados em IgG1 humano e expressos em células de mamíferos. CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-NOTCH2 NRR (BIACORE) — 102 = - As-afinidades-de ligação-de anticorpos anti-Notch2 NRR foram — 7 7? mensuradas por ressonância plasmônica de superfície (SRP) utilizando um instrumento — BIACoreTY-3000. IgGs anti-Notch2 NRR humanas foram = - ' i capturadas por IgG de camundongo anti-humana revestida no chip sensor CM5 . TT para alcançar aproximadamente 200 unidades de resposta (RU). Para medidas " —cinéticas, diluições em série de duas vezes de Notch2 NRR humano e de [ camundongo (3,9 nM a 500nM) foram injetadas em tampão PBT (PBS com 0,05% Tween 20) a 25ºC com uma taxa de fluxo de 30ul/min. As taxas de associação (Ko) e taxas de dissociação (kom) foram calculadas utilizando UM modelo de ligação Langmuir de um para um simples (BlAcore Evaluation Software version 3.2). A constante de dissociação de equilíbrio (Ky) foi calculada como à taxa KorlKon.

2. GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-NoTCH1 NRR A geração e caracterização de determinados anticorpos anti-Notch1 NRR já foi previamente descrita. Vide o pedido de patente US 2009/0081238 A1.

3. ELISA Anticorpo anti-Flag foi utilizado para capturar proteina NRR marcada com Flag de todos os quarto receptores Notch em uma placa de ligação alta de paredes pretas (black walled) (Greiner). O anticorpo NRR e anticorpos E25 controle foram ligados a proteinas NRR e lavados com PBS.

Um anticorpo secundário anti-humano conjugado com fosfatase alcalina (H+L) (Jackson ImmunoResearch) foi utilizado para detectar a ligação anti-NRR e E25. Secundários não ligados foram lavados e a AP foi detectado com substrato PNPP (Pierce). 4, FACS 9 Plasmídeos de expressão foram produzidos, em que o domínio extracelular Notch1l ou Notch2 e domínios de transmembrana foram marcados com myc no N-terminal e expressos sob o controle de um elemento de — — resposta a tetraciclina -(FRE) a-montante--de « um-promotor-imediatamente — 7 anterior a CMV mínimo.

Tais plasmídeos foram transfectados de forma estável . em células CHO-K1 (Clonetech), engenheirados para expressar uma proteína . - Ú so transativadora na presença de Doxicíclina que liga e ativa a TRE no plasmídeo NNE transfectado.

As células foram tratadas com 1ImgimL doxiciclina ou veículo por " 48 horas, e então coradas com anticorpos controle anti-NRR, anti-myc (9E10, s Millipore) ou E25 e anticorpos de cabra anti-humano Alexa 488 ou Alexa 647 secundário (Invitrogen). Após coradas, as células foram corridas na máquina — FACScalibur (BD Biosciences) e 15.000 eventos foram coletados e range gates foram tirados para acessar de forma positiva e negativa as populações coradas.

S.

ENsaIO DE NoTCH REPÓRTER Célutas NIH-3T3 transfectadas de forma estável com Notch 1 ou transfectadas de forma transitória com plasmídeos contendo outros receptores Notch foram co-transfectados com um repórter luciferase de vaga-lume TP-1 responsiva a Notch (12X CSL) e um repórter luciferase Reniílla constitutivamente ativo (pRL-CMV, Promega) para controle da eficácia de transfecção. As células foram deixadas recuperar da transfecção de 6 horas a uma noite. Os tratamentos de anticorpos e células NIH-3T3 transfectadas de forma estável com ligante são utilizadas para estimular as células receptoras.

Após 20 horas, luciferase de vaga-lume e Renilla são medidas com um sistema de ensaio de luciferase Dual Glo (Promega). Oito replicados foram analisados para cada condição pela divisão do sinal de vaga-lume pelo sinal de Renilla para controlar a eficácia de transfecção. Os desvios padrão e médio foram calculados e valores foram normalizados para calcular valores para co-cultura o estimulada com células NIH-3T3 sem ligante transfectado.

6. MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS As sequências Notch1 e Notch2 NRR foram projetadas com sítios — — de restrição únicos-nas junções-entre-os cinco domínios do NRR ENR-A; LNR= 7 7 B; LNR-C; HD-N e HD-C; e produzido pela Blue Heron Technology (Bothell, : WA). A troca de diversos domínios entre as duas sequências sintéticas, usando: - a Ú 15 : os sítios de restrição projetados, gerou proteínas quiméricas NRR. Os « clones . Lo O quiméricos foram montados em um vetor puc1: 9 modificado e transferidas para um vetor contendo SEAP, pCSC.AP, para a expressão. As proteinas NRR o marcadas com AP foram produzidas pela transfecção de células 293T. Após 72 h de cultivo, os meios condicionados foram coletados, depurados por centrifugação, e testados para atividade da AP usando o Sistema “Phospha- Light System" (Applied Biosystems, Bedford, MA). A atividade da AP em cada amostra foi normalizada e um teste de ELISA foi realizado para testar à capacidade da a-NRR1 ou a-NRR2 se ligar a proteinas quiméricas NRR. O ELISA foi realizado da seguinte forma: a-NRR2 ou a-NRR1 foi capturado por —uma placa ligada à anticorpos a-Fc em placas de 96 poços e incubadas com o meio de cultura condicionado durante a noite. A placa foi lavada para remover as proteínas desacopladas, e a proteina capturada foi testada para a atividade da AP usando o Sistema “Phospha-Light System". A atividade resultante da

AP foi utilizada para quantificar a capacidade de cada anticorpo se ligar às proteínas quiméricas específicas a-NRR e inferir epitopos importantes para a ligação.

7. Ensaio De HUVEC Em ESFERAS DE GEL DE FIBRINA Células HUVEC foram cultivadas em esferas de gel de fibrina conforme anteriormente descrito (Nakatsu ef a/., 2003). Esferas cytodex 3 (Amersham Pharmacia Biotech) foram revestidas com 350-400 HUVECs por esfera em 2 mi de meio EGM-2 (Clonetics). Cerca de 200 esferas revestidas com HUVEC $ foram embebidas em coágulo de fibrina em um poço de placa de cultura de tecido de12poços.6X 10º células de fibroblastos Detroit 551 foram semeadas no topo do coágulo e meio contendo 5 pg/ml anti-NRR1, 5 po/ml anti-DLL4, 1 uM DBZ, ou e . — veículo controle. O meio.foi carregado.a.cada dois dias. Depois de.sete a nove dias, ae géis de fibrina foram então fixados com 4% de paraformaldeido e células endoteliais foram coradas com anti-CD31 (R&D Systems AF806) utilizando um anticorpo 7 15. secundário conjugado a FITC para detecção. 7 = = = O TT RBSEnNSsaOoRETINALNEONATALÍNVIVO |U OO NS CD1 recém nascidos foram injetados i.p. a P1 e P3 com 10 mg/kg Ss de controle ragweed ou 20 mg/kg de Notch-1. Os olhos foram colhidos em P5 e fixados com 4% PFA. As retinas foram dissecadas, bloqueadas (5% BSA, 0,5% Triton X-100) para uma hora, seguida pelo tratamento por 10 minutos com 1M citrato de sódio. As retinas foram então incubadas por uma noite 4C com isolectina biotinilada B4 (Sigma) e anticorpo Ki67 (NeoMarkers). As retinas foram subsequentemente lavadas e coradas com estreptavidina Alexa 488 e Cy3 anti-coelho de cabra em 1% BSA, 0,5% Triton X-100. As retinas foram “montadas de forma plana e obtidas imagens das mesmas utilizando um microscópio de epifluorescência.

9. EsTuDOS DE TUMORES /N VIVO A linhagem de células tumorais humanas Calu-6 e HM7 foram cultivadas em meio F12 de Ham, DMEM com baixa glicose 1:1 suplementado com 10% v/v de FBS, 1% v/v de penicilina/estreptomicina, 2 mM L-GIh e 1 mu/ml de Fungizone""Y (Invitrogen'Y, CA), As células foram incubadas a 37 ºC em uma atmosfera de ar de 95% de ar / 5% de CO,. Para os experimentos de xenoenxerto em camundongos, as células tumorais foram suspensas em uma concentração de 1 x 10º ou 1 x 10º células/ml e injetados (100 mlrato) por via subcutânea, no flanco dorsal de camundongos Balb-c nude (Harlan Sprague Dawley, !N). Quando os tumores atingiram um volume de 400 mm?, um grupo Ss foi selecionado aleatoriamente (n = 10) como controles do dia-0. Os camundongos remanescentes foram divididos em grupos de 10 camundongos, e anticorpos fago anti-Notch1 foram administrados ip na dose de 10 mg/kg, — “duas vezes-por semana.

Os tumores transplantados foram” mensurados duas" CV vezes por semana no eixo maior e o no eixo perpendicular conforme descrito. : « — Para cada dia em que os tumores foram mensurados, o volume do tumor de —

cada camundongo foi calculado, e a média do volume tumoral a partir do e " | — anticorpo controle de cada anticorpo (anti-Ragweed ), grupo anti-VEGF foram comparados com o volume tumoral médio dos camundongos tratados com o Anti-Notch1 pelo teste f de Dunnett implementado no sistema JMPTM Statistical Analysis System (versão 5.1 para Windows; SAS Institute, Cary, NC), com um nível de P < 0,05. Os camundongos foram mortos quando o volume tumoral atingiu 2.000 mm?. Os tumores foram seccionados por criostato a 7 micrometros, fixados com acetona e corados com DAPI (Invitrogen), anti-CD31 de hamster (Serotech, Inc.) e um secundário anti-hamster Cy3 (Jackson Immunolabs). As lâminas foram montadas com glicerina Fluorescente (Dako). As imagens foram tiradas com um microscópio Zeiss Axioskop2 e analisados pelo programa imageJ pela área com à coloração DAPI e marcada com Cy3. À marcação por Cy3 foi dividida pela área corada por DAPI para normalização do número de células presentes e os valores foram normalizados para o tumor tratado com anti-Ragweed. Todos os estudos com animais foram conduzidos em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidados Animais.

10. ANÁLISE DE CÉLULAS B DA ZONA MARGINAL Camundongos Balb-c (Jackson) de 12 semanas de idade foram injetados IP duas vezes por semana durante duas semanas com 5 mg/kg de anti-gD, anti-NRR1 ou anti-NRR2. Os esplenócitos foram isolados a partir dos camundongos e foram corados para FACS com B220-PerCP, CD23-PE e o CD21-FITC (BD Biosciences), conforme descrito anteriormente (Saito et al. Immunity, vol. 18, 675-685, maio de 2003).

171. HisToLoGia E IMuNOHISTOQUÍMICA DO TECIDO INTESTINAL DE CAMUNDONGO Seis grupos de seis camundongos CS7BL/6. (Jackson) de 10779

1.1.1.2, ++ Semanas dé idade, réceberam tanto MCT cada dois dias, DBZ a 30 umol/kg a cada dois dias, Anti-NRR1 a 2, 10 ou 0,4 mg/kg como anti-gD controle (HSV- du 10 mg/kg no dia 0, 2.e 6, ou conforme indicado. Os tecidos intestinais de oo camundongos fixados. em formalina-e-emblocadós ém parafina foram cortados SSSSSS “O auma espessura de 3 mícrons. A identificação histoquímica dos tipos celulares o do intestino foi realizada com Afcian blue, conforme recomendado pelo fabricante (PolyScientiífic). Para a coloração anti-Ki67, os cortes foram pré- tratados com solução de recuperação antigênica (S1700, DAKO), e incubada com anticorpo de coelho anti-Ki67 (1:200, clone SP6 clone, Neomarkers). O anticorpo secundário cabra anti-coelho a 7,5 po/mi (Vector labs) foi detectado com o Kit "ABC Vectastain Elite Kit” (Vector labs). Os cortes corados com Ki67 foram contra-corados com hematoxilina de Mayer. Para a coloração de anfi- lisozima, os cortes foram processados na plataforma Discovery XT (Ventana Medical Systems, Inc.), utilizando as condições de recuperação antigênica CC1im, detecção com OmniMap-coelho e hematoxilina Il / com contra- coloração azulada. Para coloração HES-1, anti-HES-1 de rato (clone NM1,

A

MBL, International) foi seguido por TSA-HRP. B. RESULTADOS

7. GERAÇÃO DE ANTICORPOS SINTÉTICOS ESPECIFICAMENTE DIRECIONADOS PARA As REGIÕES REGULADORAS NEGATIVAS DE NorcH1 E NoTcCH2 Para habilitar o antagonismo independente da sinalização Notch1 e Notch2 em humanos e camundongos, foi utilizada a exibição por fago para direcionar a NRR e selecionar anticorpos sintéticos humanos com as seguintes qualidades. Primeiro, cada anticorpo foi selecionado por inibir potencialmente e o seu alvo cognato Notch1 ou Notch2, mas não outros receptores Notch. Em segundo lugar, os anticorpos foram selecionados pela ligação com as sequências alvo humanas para permitir o direcionamento terapêutico. Em terceiro lugar, a fim de descobrir as consequências biológicas que inibem -.- . - -TCC” siNtemicamente Notch1 ou Noteh2 in vivo e estudar as funções desses receptores em modelos de camundongos, os anticorpos foram co-selecionados - 15 para-a ligação com as sequências do'ortólogas” dê camundongo. Em quarto ASCOO o... — lugar, para-evitar-uma-resposta-imune- “antizanticorpo” humano, as régiões TETO determinantes de complementaridade foram clonadas em uma região estrutural o de imunoglobulina humana. Seguindo essa abordagem, conseguimos anticorpos anti-Notch1 NRR e antiNotch2 NRR isolados com cada uma dessas propriedades desejadas. Esses anticorpos possuem várias vantagens sobre inibidores “pan- Notch” que são direcionados a diversos receptores Notch, tal como os inibidores da y-secretase. Como esses anticorpos distinguem receptores Notch individuais, eles podem dissecar as funções distintas desses receptores individuais. Além disso, os inibidores pan-Notch apresentam efeitos colaterais in vivo potencialmente indesejados devido à inibição dupla de ambos Notch1 e Notch2 e, portanto, os anticorpos que são seletivos para Notch1 ou Notch2 podem ser candidatos mais fortes para fins terapêuticos. Os anticorpos anti-

Notch1 NRR e anti-Notch2 NRR isolados de acordo com a abordagem acima são descritos e caracterizados mais detalhadamente adiante.

O isolamento e caracterização de anticorpos anti-Notch1 NRR são discutidos no Pedido de Patente Publicado US 2009/0081238 A1. Um dos anticorpos divulgados no presente pedido, “Anticorpo A-2”, foi caracterizado quanto à sua estrutura e algumas atividades biológicas.

Alguns estudos discutidos nesse pedido são repetidos no presente, Por conveniência, o “Anticorpo A-2" do Pedido de Patente US 2009/0081238 A1 é referido no e presente como “anti-NRR1", O isolamento e a caracterização de anticorpos anti-Notch2 NRR são descritos na presente invenção.

Um anticorpo antic—nRR Notch2, denominado de “Anticorpo D”, foi isolado.

Esse anticorpo foi, maturado, por — - - - - “rc 7" afhidade conforme descrito acima, resultando no Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3. A Figura 1 mostra as sequências da HVR-H1, HVR-H2 e HVR- eo 15 H3 Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo” D-2 é Aúticorpo D3. Ã Figura 2 TITO 2 .— Mostraassequências-da HVR-L1, HVR=12:e HVR-13 Aniticóorpo D;Antieormo Da ||| 1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3. A Figura 3 mostra as sequências da região o variável de cadeia pesada do anticorpo D, anticorpo D-1, anticorpo D-2 e anticorpo D-3. A Figura 4 mostra as sequências da região variável de cadeia leve do Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 e Anticorpo D-3. Por conveniência, o Anticorpo D-3 é referido na presente invenção como “anti- NRR2”. As medições das afinidades de ligação usando à de ressonância plasmônica de superfície (SPR), revelou que o anti-NRR1 se liga com alta e similar afinidade (Ka = 3 nM) à proteina NRR1 purificada tanto de sequência humana quanto de camundongo.

Observou-se uma afinidade similar (K4 = S nM) para os antigenos NRR2 em testes de anti-NRR2. A ligação de ambos os anticorpos apareceu altamente específica para o receptor cognato, foi detectada ligação com sequências humanas ou de camundongo de qualquer um dos outros três receptores não-alvo tanto para anti-NRR1 quanto para anti- NRR2 usando uma variedade de técnicas, incluindo SPR, ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) e separação de células ativadas por fluorescência (FACS) (Figura 9 e dados não mostrados). Por exemplo, os resultados de ELISA mostraram que o anti-NRR1 se liga igualmente bem às proteínas Notch1-NRR purificadas humanas e de camundongos, com a metade máxima de ligação observada em uma concentração de anticorpos de o aproximadamente 0,1 pg/ml.

A ligação de anti-NRR1 não é detectável para ligação com as proteínas Notch2 NRR, Notch3 NRR ou Notch4 NRR humanas ou de camundongos purificadas, mesmo com a maior concentração de anticorpo testado (Figura 9A, painel esquerdo), apesar do fato das sequências. - - - - - -----" Nótchi NRR e Notch2 NRR humanas sejam 45% idênticas (Figura 18), Nós observamos resultados semelhantes para antinRR2, que se ligou .... 45. especificamente às proteínas Notch2 NRR; más não ãs outras proteínas NRR PETIT LL... . deoutrosreceptores-Noteh(Figura-9A, painetdireito). mm IATIDOO Para determinar se o anti-NRR1 e anti-NRR2 também se liga o especificamente à receptores de comprimento total expressos na superfície de | células, utilizou-se a separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Foram avaliados a ligação de Notch1 ou Notch2, cada uma carregando um epítopo myc marcado no N-terminal para distinguir os receptores Notch transgênicos dos receptores Notch expressos endogenamente (especialmente Notch2, o foi expresso pelas células K1-CHO). Expressão do receptor foi induzida em células K1-CHO que eram não transfectadas (Figura 98, painéis 1, 4/7610) transfectadas com myc-Notch1 (Figura 9B, painéis de 2, 5, 8 € 11), ou transfectadas com myc-Notch2 (Figura 9B, Painéis 3, 6, 9 e 12). A ligação do anti-NRR1 às células myc positiva foi observada nas células myc-N1 (Figura 9B, painel 2 ), mas não nas células KI-CHO parentais (Figura 9B, painel 1 ) e somente após a indução (Figura 9B, comparar os painéis 2e5), indicando que o anti-NRR1 se ligou especificamente à Notcht. Em contraste, embora a expressão de myc-Notch2 foi claramente induzida nas células myc-N2 (Figura 9B, compare painéis 3 e 6 ), 0 anti-NRR1 não se ligou a myc-Notch2 (Figura 9B, compare painéis 2 e 3). Foi realizada uma análise similar usando anti- NRR?2 (Figura 9B, painéis 7-12 ), embora esta análise foi complicada pela fuga da expressão do myc-Notch2 na ausência de indução ( Figura 9B, painéis de 6 e 12) e a expressão endógena de Notch2 de hamster na linhagem K1-CHO e (Figura 9B, compare painéis de 7 e 10 painéis de 1 e 4). No entanto, o anti- NRR2 se ligou de maneira significante apenas nas células que expressam myc- Notch2 após a indução, consistente com a ligação específica à Notch2 (Figura 9B, compare painel 9 aos painéis 8 e 12). Nossos resultados. de ligação, 2 2. - o “= "tomados em conjunto, usando proteinas NRR purificadas, bem como a expressão na superfície celular dos receptores de comprimento total o 15. - demonstram quê o anti-NRR1 se'"liga “especificamente ANCICRINRRIenãoa = "CC o... Noteh2-NRR.e.da mesma-forma-anti-NRR2-se liga especificamente à Notehaã- TS NRR e não à Notch1-NRR. Esta especificidade é ainda apoiada por numerosos o estudos estruturais e funcionais descritos abaixo.

2. FUNÇÃO ANTI-NRR1 E ANTI-NRR2 Como INIBIDORES POTENTES E EsPECÍFICOS Da SINALIZAÇÃO NoTCH1 E NoTCH2 IN VITRO Para avaliar se os anticorpos anti-NRR afetam a sinalização Notch, nos primeiramente utilizamos um ensaio de co-cultura que empregava linhagem de células NIH-3T3 geneticamente modificadas para expressar Jag1 como ligante de Notch, ou seja, Notch1 (Figura 10A) ou Notch2 (Figura 10B) como o receptor Notch. Os ensaios refletiram com exatidão a sinalização Notch, pois um forte sinal Notch repórter (luciferase de Firefly) dependia da presença tanto do ligante como dos receptores nas células (Figuras 104 e B, compare -Jag1 com +Jag1), e o nível repórter foi reduzido para a coloração de fundo (basal) quando um GSI (inibidor da y-secretase) foi incluído (Figuras 10A e B, compare DMSO com dApt). A adição de quantidades crescentes de anti-NRR1 inibido a sinalização nas células Notch1, com uma inibição total observada em uma — concentração de anticorpos entre 80 e 400 ng/ml (Figura 10A). Um anticorpo controle humano não conseguiu inibir a sinalização (Figura 10A, compare a titulação a-gGD com NRR1), assim como inúmeros outros anticorpos direcionados para outros antígenos que não Notch1 (dados não mostrados).

sê Para testar se essa atividade inibitória refletida a ligação do anti-NRR1, questionamos se a adição de antigeno NRR1 purificado resgataria a sinalização na presença de uma concentração inibitória (80 ng/ml) de anticorpos anti-NRR1, competindo pela ligação do anticorpo.a Notch1i expresso = = - - o o sobre as células de sinalização. A adição do antigeno NRR1, mas não do antígeno NRR2 (que pareceu ativo e devidamente enovelado em outros i 15 “ensaios, vide Figuia 10b) restatiroú á sinalização para os “níveis controle, DO CTOCO 2 = (Figura 10A,-compare 80 nglimil de ieNRR1 + NRR1 com 80 ngíml de a-NRR1- | sozinho e 80 ng/ml de a-NRR1 + NRR2). Como controle, nem o antígeno o NRR1 nem o antígeno NRR2 afetou a sinalização em co-cultura que continha um anticorpo controle, confirmando que os fragmentos NRR de si nãotêm efeito direto sobre a sinalização Notch (Figura 10A, a- go + NRR1 e a-gD + NRR2). Utilizando células expressando Notch2 para ensaio da atividade anti-NRR2, observamos resultados semelhantes do anti-NRR2 para a sinalização Notch2 (Figura 10B). Ambos os anticorpos inibiram a sinalização induzida por todos os ligantes de Notch que testamos, a saber, —Jag1,Jag2, DIM e DII4 (Figura 16 e dados não mostrados). Em conjunto, estes resultados demonstram que anti-NRR1 e anti-NRR2 são potentes inibidores parálogos específicos para a sinalização Notch1 e Notch2, respectivamente.

3. ANTI-NRR1 INIBE À SINALIZAÇÃO ATRAVÉS DE AMBAS As CLASSES Dos PRINCIPAIS RECEPTORES MUTANTES ENCONTRADOS NAs LLA-TsS Um mecanismo através do qual sinalização Notch foi demonstrada por afetar diretamente a oncogênese é pela ativação mutacional —dasinalização Notch1i na LLA-T. Em particular, as mutações Notch1 ativadoras na LLA-T caem em duas grandes categorias: (1) aquelas que truncam o domínio PEST, estabilizando o ICD e aumentam a sinalização de uma forma dependente de ligante, e (2) aquelas que desestabilizam as NRR, permitindo Ss assim a clivagem ADAM e estimulando a sinalização de uma forma independente de ligante. Para testar se o anti-NRR1 pode abolir a sinalização através de tais receptores mutantes, nós modificamos o ensaio de co-cultura 2 Para expressar Notch1-WT (Notch1 tipo selvagem .), Notch1-APEST=(Notech1— - - - - NS com falta do domínio PEST), ou Notch1-L1594P (Notch1 portador da mutação L1594P no domínio de heterodimerização (HD) da NRR). Como foi observado e “o * 15 Pará a sinalização Notch1 tipo selvagem (Figura 10C, Painel superior), cant CU

21.22 NRRiTinibiu" completamente à Sinalização dependente de ligante é independente de ligante através de Notch1-APEST e Notch1-L1594P (Figura o 10C, painéis do meio e inferior). Assim, o anti-NRR1 antagoniza a sinalização através de ambas as classes de receptores mutantes, incluíndo a mutação L1594P que cai e desestabiliza o mesmo domínio alvo do anticorpo.

4. ANT-NRR1 E ANTI-NRR2 FUNCIONAM COMO INIBIDORES POTENTES E EspPeciíFicos DA SINALIZAÇÃO NoTCH1 E NoTCH2 IN Vivo Para determinar se o anti-NRR1 e anti-NRR2 funcionam como inibidores receptor-especiífico in vivo, investigamos como os anticorpos afetam as decisões sobre o destino de células para as quais as técnicas genéticas haviam estabelecido o papel de Notchtl ou Notch2. Especificamente, a inativação condicional de Notch1 ou Notch2 anteriormente revelou que Notch1 é fundamental para determinar um destino de células T versus B durante o desenvolvimento linfóide, enquanto que Notch2 é necessário para gerar células B da zona marginal esplênica (MZB). Consistente com uma função crucial para Notch1 no desenvolvimento de células T, descobrimos que o tratamento de camundongos com antiNnRRI, mas não com antinNRR2, reduziu —significativamente o peso do timo (Figuras 11A e B). Da mesma forma, o tratamento com anti-NRR1, mas não com anti-NRR2, reduziu drasticamente o número total de células no timo (Figura 11B) e inibiu quase totalmente a geração de células T duplo positivo CD4+/CD8+ (Figura 11C). e Em contraste, os efeitos de anticorpos foram revertidos quando as células MZB foram examinadas. O tratamento com anti-NRR2 praticamente eliminou as células MZB (0,97 +/- 0,45 em comparação com o valor do controle de 6,61 +/- 0,25), reduzindo a população ainda mais dramaticamente do que à — + rr STOO proteina de fusão (LTBR)-Fc receptor de linfotoxina b recombinante purificada (3,48 +/- 0,06), que serviu como um controle positivo (Figura 11D). Este efeito A - 15 +inibitório foi específicos para antºNRR2 "porque o antiNRR1 não Teduziu

1... 2 —significativamente a população dê MZB (6,00 +/- TD,44) em relação ao controle || | com anticorpos anti-gD (6,61 +/- 0,25; Figura 11D). Em conjunto, estes estudos o in vivo indicam que ambos os anticorpos são potentes inibidores de seus respectivos alvos que podem induzir mudanças biologicamente significativas nas decisões do destino celular, além disso, o anti-NRR1 afeta a geração de células T, mas não de MZB enquanto o anti-NRR2 afeta a geração de células MZB mas não de células T, cada anticorpo funciona especificamente para o seu alvo in vivo.

5. ESTRUTURA CO-CRISTALINA REVELA QuE O ANTI-NRR1 ABRANGE Os DomíÍNIOS LNR E HD-C E PROVAVELMENTE ESTABILIZA À CONFORMAÇÃO "OFF" DA NRR Para elucidar a especificidade de ligação do anti-NRR1 e anti- NRR2 e adquirir conhecimentos mecanicistas sobre a atividade antagonista dos anticorpos, testamos ligação de ambos anticorpos com uma bateria de proteinas NRR quiméricas.

Especificamente, nós fizemos NRRs quiméricas trocando cada um dos subdomínios NRR (LNR-A, LNR-B, LNR -C, N-HD e HD- C) entre Notch1 e Notch2, e expressamos essas quimeras como proteínas secretadas fundidas com fosfatase alcalina para fácil detecção, e foi avaliada a — quantidade de ligação de cada NRR quimérica normalizada para anti-NRR1 ou anti-NRR2. Das 26 NRRs quiméricas expressadas, 17 foram eficientemente detectadas como proteinas secretadas (Figura 12A), 7 foram fracamente detectadas e 2 não foram detectadas acima da coloração de fundo (Figura 17), e sugerindo que a maioria mas não todas NRRs quiméricas foram expressas, enoveladas e secretadas de maneira devida.

Trocando o único domínio LNR-A partir da NRR2 na estrutura principal da NRR1 interrompeu a ligação do anti- NRR1 ( Figura 12A, quimera BC.Hd e todos os outros com .LNR-A. partir da — - : mrSCCO NRR2), indicando que o contato do anti-NRR1 com o subdomínio LNR-A da NRR1 são essenciais para a ligação.

Em contraste, a troca dos domínios LNR- 1 Gelou'HD-Na partir da"NRR2 na NRR1 nao áfeloú á ligação do antiNRRI ' 0 1... (Figura 12A;-quimeras-AB.Hd; ABC:H6- é AB.HG)J, dérioristrando que nenhum — | TOO desses domínios é essencial para a especificidade de ligação.

Por último, o AB.Hc foi a quimera com o menor número de subdomínios NRR1 que ainda suportava a ligação de anti-NRR1 total (embora uma fraca ligação tenha sido observada para a quimera AB), sugerindo que a maioria, e talvez todos os contatos necessários para a especificidade de ligação do anti-NRR1 esteja contida nos domínios LNR-A,-LNR-B e HD-C.

A caracterização de anti-NRR2 revelou um padrão de ligação semelhante àquela definida para o anti-hnRR1, embora com algumas diferenças.

Alternando o domínio LNR-A da NRR1 na estrutural da NRR2 desorganizara totalmente a ligação do anti-NRR2, enquanto a troca do LNRB ou C não teve qualquer efeito, assim, como foi o caso do anti-NRR1, a ligação de anti-NRR2 necessita do subdomínio LNR-A de Notch2. Da mesma forma, o dominio do HD - C de Notch2 também foi essencial.

Duas quimeras diferentes (C.Hn e BC) com apenas três subdomínios de NRR2 suporta a ligação completa em todos esse ensaio, ambas quimeras compartilham os subdomínios LNR-A e HD-C de NRR2 e, de acordo com essa observação, a quimera que continham apenas os subdomínios LNR-A e HD-C suportaram uma fraca, porem detectável ligação do anti NRR2. Assim, ao definir os subdomínios que determinam a especificidade de ligação do anti-NRR2 , as experiências de troca de domínio: (a) revelaram que o LNR-A e HD-C são os 6 domínios mais importantes (necessários e parcialmente suficientes para a especificidade de ligação ); e (b) sugerem que o contato dos anticorpos NRR2 com LNR-B e HD- N pode também desempenhar um papel importante. eee Para melhor compreender . a- base. -molecular -da atividade =" - - antagonística de anti-NRR1, nós determinamos a estrutura cristalina de 2,2 À do fragmento Fab do anticorpo ligado a NRR1 humana.

Esta estrutura revelou ee COCO 467 ue NRR1 forma uma êstjutura compacta muito semelhante a NRR2 humana, o — = —--- com três ca?* ligando módulos LNR envolvido em torno do domínio HD principal (Figuras 12B e C). A estrutura revela que o efeito aparente da ligação oe Fab é estabilizar as interações LNR-HD, em que S2 não é acessível para a clivagem, mantendo assim a cascata de sinalização Notch1 quiescente.

Esta interpretação é apoiada pela observação de que o Fab não oclui diretamente o sítio S2 mas se liga na interface entre os domínios HD, LNR-A e LNR-B (Figura 12D), de acordo com os experimentos de troca de domínio (Figura 12A). Esta interface cobre — 2000 À? de área de superfície acessível ao solvente, divididas igualmente entre a Fab e a NRR1. A cadeia pesada Fab interage com LNR-B, a hélice terminal no domínio do HD-C, e a periferia de LNR-A.

O CDR H3 sítua na interface entre o LNR-B e HD.

Especificamente, R99 a partir de H3 forma uma ligação de hidrogênio para a cadeia carbonil principal de Phe1501 da LNR-A, enquanto a parte da cadeia alifática lateral interage com o 11710 do domínio HD. As cadeia leve conta com - 40% da superfície coberta contribuindo para Fab e contata a alça de conexão antes da extremidade em hélice no domínio HD bem como LNR-A. Essa estrutura também revela a base da especificidade de Fab mais para Notchl do que Notch2. Apesar da identidade de sequência — 45% entre os domínios NRR de Notch1 e Notch2, a maioria dos resíduos envolvidos na interface é distinto entre as duas proteínas. Por exemplo, dos 21 residuos NRR que cobrem pelo menos 25% da área de superfície acessível ao solvente 6 na ligação do Fab, apenas seis são idênticos no Notch1 e Notch2. Estes seis resíduos contribuem com menos de um quarto da superfície do epítopo de Fab e estão distribuídos por todo o epítopo (Figuras 12D e 18). oo. SNBeÇÃO SELETIVA DA SINALIZAÇÃO NOTCH1.DESREGUIA:A ANGIOGÊNESE - "CO Para começar a explorar os anticorpos específicos para o receptor Notch e definir a importância funcional dos receptores individuais. in vivo, e O 16º Primeiro perguntou-se-se-obloqueio seletivo da sinalização NotenT come am - ——— — —NRRY rotfipéria à angiogênese em mamíferos. Vários relatórios indicam que a via Notch funciona a jusante do fator de crescimento endotelial vascular o (VEGF) e desempenha um papel essencial na angiogênese, regulando a escolha o destino da célula endotelial entre as células apicais e células —pedunculares. Experimentos utilizando uma variedade de ferramentas genéticas e bioquímicas, incluindo anticorpos bloqueadores Dlil4-específicos, estabeleceram o DIM como o ligante chave de Notch envolvido na sinalização Notch angiogênica, embora dois receptores de Notch, Notch1 e Notch4, foram implicados como receptores para DII4 na angiogênese.

Primeiro, testamos se a inibição seletiva de Notch1 afeta a germinação de células endoteliais in vitro. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECSs) co-cultivadas com fibroblastos da pele humana geraram brotamentos com estruturas similares a lúmen. Consistente com trabalho anterior, verificamos que a inibição pan-Notch usando DBZ, um inibidor da y-secretase, bem como anticorpo de bloqueio seletivo para DIl4 aumentou o número e o comprimento dos brotamentos de células endoteliais. Mais importante ainda, o bloqueio seletivo da sinalização Notch1 usando o anti- —NRR1gerouum fenótipo semelhante (Figuras 13A e 13B). Para determinar se o anti-NRR1 afeta a angiogênese in vivo, foi utilizado um modelo baseado no desenvolvimento da vascularização da retina em camundongos recém-nascidos. A entrega sistêmica de anti-NRR1 6 interrompeu dramaticamente o desenvolvimento da vascularização na retina em camundongos neonatos tratados (Figura 13c). Em relação ao tratamento com um anticorpo controle anti-ragweed, o tratamento com anti-NRR1 gerou uma rede vascular densa, compacta e aparentemente. emaranhada- (Figura = = - TICO 13C, compare os painéis | e Il! com os painéis Il e IV, respectivamente). Este acúmulo de células endoteliais se correlacionou com o aumento dao + 18º prolféração “avaliada pela-marcação-com-otmareador d de proferação KIB7 À O == (Figura 13C compare os páinéis V é VI ). Todas estas observações, incluíndo o aumento da densidade vascular, o acúmulo de células endoteliais e aumento oe da proliferação, mimetizam aquelas encontradas após a inibição de DIl4 ou y- secretase usando esse mesmo modelo de camundongos recém-nascido (dados —não mostrados) e são consistentes com resultados de outros estudos, incluindo a análise da vascularização tumoral (Figuras 13D e 13E) e do bolso comeal de camundongos (dados não mostrados). Nossos resultados demonstram não só que o ant-NRR1 possuí atividade biológica potente, com também que a inibição de Notch1 sozinho, ao contrário de Noteh4 ou de uma combinação de Notch1 e —Notchd4,é suficiente para interromper drasticamente a angiogênese em mamíferos.

7. BLoqueto SELETIVO DE ANTICORPOS NOTCHT1 INIBE O CRESCIMENTO DO TUMOR Em MopDeLOS PRÉ-CLÍNICOS Para determinar se o bloqueio seletivo de Notch1 usando anti-

NRR1 seria suficiente para inibir o crescimento tumoral, foram utilizados modelos pré-clínicos de tumores e foi comparado com o crescimento de tumores estabelecidos após o tratamento com anti-NRR1, anti-VEGF ou anticorpos anti-ragweed.

Em ambos os modelos Calu6 e HM7, os grupos tratados com antic-NRR1 mostrou uma diminuição significativa no tamanho do tumor em relação ao grupo controle, mesmo nos pontos examinados pela primeira vez, 3-4 dias após a dose inicial (Figuras 13A -C) . No modelo Calu6, o grupo anti-NRR1 exibiu uma diminuição no tamanho do tumor, de cerca de 250 ê mm? a menos de 100 mm?, semelhante à redução observada no grupo anti- VEGF, em contrapartida, os tumores no grupo controle anti-ragweed cresceram a um tamanho superior a 400 mm? (Figura 14A), Observamos resultados Aee Semelhantes usando o modelo HM7 de.crescimento- agressivo; o tratamento” - * ' com anti-NRR1 manteve estático o tamanho do tumor (Figura 14B ) ou quase estática (Figura 14C) durante 12-13 dias, uma diferença dramática em relação: e cc je cabcrescimento-de-seis dias de-250 min páramals de MOO mm? observado no + <= —=— — —grupó “controle (Figuras 14B “e 5C). Observou-se uma inibição similar no crescimento do tumor, utilizando uma faixa de concentrações de anti-NRR1 , oe entre 20 mg/kg e 2,5 mg/kg, embora os grupos tratados com 10 e 20 mg/kg apresentarem uma forte tendência de inibição em relação àos grupos tratados com2,5e5 mg/kg (Figura 14C). Nós investigamos os modelos de tumores Calu6 ou HM? porque a sua resposta aos agentes anti-angiogênicos foi bem documentada.

Para testar diretamente se o anti-NRR1 interrompe a angiogênese no modeio Calu6, examinamos a vascularização do tumor em cortes representativos de camundongos nos três grupos de tratamento.

Normalizando a coloração de CD31, um marcador de células endoteliais, com a coloração do DNA, usando DAPI, descobrimos que o anti-NRR1 aumentou significativamente o CD31 em relação à coloração dos demais grupos (Figura 14D). Este aumento foi estatisticamente significativo (p <0,01), e foi observado de forma consistente ao longo de várias imagens (Figura 14E). Em contrapartida e como esperado, o anti VEGF causou uma redução na coloração CD31 (Figuras 14D e 14E). Os resultados do bloqueio seletivo de Notch1 foram similares aqueles relatados —pelobloqueio seletivo de DII4, que também leva a um aumento na coloração de CD31 no tumor, bem como a geração de um mal funcionamento da vasculatura tumoral. Em conjunto, estes resultados sugerem que os efeitos anti-tumorais exercidos pelo anti-NRR1 nos modelos Calu6ê e HM7 refletem essencialmente ê um distúrbio na angiogênese tumoral.

8. INIBIÇÃO DE AMBOS ANTICORPOS PARA NotTCH1 E NoTcH2 TEM EFEITOS NotáÁvEIS SOBRE O DESTINO DE CÉLULAS INTESTINAIS eee Inibidores da. gama-secretase. (GSls),- que -são “inibidores pam- = > = Notch que inibem múltiplos receptores Notch, causam perda de peso e metaplasia intestinal de células caliciformes, refletindo o papel que o Notch e . O O 45º desêmpenhaná-deteiminação-do destimodias celulas, mantendo a proliferação — || — —- — — de Télulas progenitoras na cripta intestinal e proibindo a diferenciação para um destino de células secretoras. (vide, van Es ef al. Nature 435:959-963 (2005)). o Além disso, estudos genéticos usando camundongos Kknockout com Notch condicional sugerem que o rompimento de ambos Notch1l e Notch2 é necessário para causar a metaplasia intestinal de células caliciformes. (Vide, Riccio ef al. EMBO Rep. 9:377-383 (2008)). Usamos anti-NRR1 e anti-NRR2 para determinar os efeitos da inibição seletiva de Notch1, Notch2, ou ambos, na perda de peso e diferenciação de células intestinais. Os camundongos tratados com anti-NRR1 exibiram uma ligeira diminuição no peso corpóreo total durante o curso de administração dos anticorpos. Em um primeiro experimento comparando diretamente anti-NRR1 e anti-NRR2, descobrimos que o anti-NRR1 causou uma diminuição de 8% no peso corporal total, em contraste com os ganhos de peso observados com a administração de anti-NRR2, bem como anti-gD e antiLTbR-Fe no grupo controle (Figura 15A). Em um segundo experimento, a inibição seletiva de Notch1 ou Notch2 usando anti-NRR1 ou anti-NRR2, respectivamente, resultou em pouco ou nenhum efeito sobre o peso.

Os resultados desse experimento são exibidos na Figura 24A, no qual os ratos receberam doses de 5mg/Kkg de anti-NRR1 (quadrados), anti-NRR2 (triângulos), ou um anticorpo controle ("a- gD", diamantes), nos dias indicados pelas setas.

Entretanto, camundongos tratados tanto com anti-NRR1 como anti-NRR2 (“X” na Figura 24A ) perderam o quase 20% do seu peso corporal inicial em 7 dias.

Nós investigamos se a perda de peso sutil resultantes do tratamento apenas com anti-NRR1, ou a perda de peso mais dramática NA resultante do tratamento. com. ambos. anti-NRRA4 -e -anti-NRR2, refletiu “as” 7 o mudanças na determinação do destino de células intestinais.

Após a administração nos camundongos de anti-NRR1 ou anti-gD ou DBZ como 0... - 46 “eôntioles-cortes-do-intestiro-yrosso (Figura 19) é do infestino delgado foram | — — — —— —ahalisádos no dia 2 (figura 20) e dia 7 (Figura 15B), usando uma variedade de colorações histoquímicas.

Os camundongos tratados com DBZ tiveram os oe mesmos efeitos conforme descrito anteriormente para GSls (Figura 15B, coluna DBZ): inibição da expressão HES1 correlacionada com uma diminuição da proliferação de células progenitoras (conforme mostrado pela coloração Ki - 67) e uma expansão dramática da população de células caliciformes (conforme demonstrado pela coloração da mucina por afcian blue). A coloração da lisozima também sugeriu que DBZ aumentou o número e/ou atividade das células de Paneth, uma segunda população de células secretoras (Figura 15B), —uma sugestão que foi adicionalmente suportada usando Azure A-Eosina B para a coloração de grânulos das células Paneth (dados não mostrados). O anti- NRR1 na concentração de 10 mg/kg induziu alterações intestinais indistinguíveis daquelas induzidas por DBZ (Figura 15A, compare DBZ 30 mmol/kg com antinRR1i 10 mg/kg)» Essas mudanças intestinal foram dependentes da concentração de anti-NRR1, assim, mudanças significativas no destino celular foram observadas com 10 mg/kg e 2,0 mg/kg, , mas poucas, se presentes, mudanças significativas foram observadas utilizando 0,4 mg/kg. O intestino grosso respondeu de forma semelhante ao DBZ e ao tratamento com antiNnRR1: ambos os tratamentos reduziram significativamente sinalização Notch (Figura 19, coloração HES1), bloquearam à proliferação de À células progenitoras (Figura 19, Ki-67) e aumentaram o número de células [É caliciformes (Figura 19, Alcian Blue e H&E). As alterações intestinais do destino celular foram apenas fracamente detectáveis em um ponto de tempo inicial no dia 2 do estudo (Figura 20, notar as pequenas mudanças, porém detectáveis, A 2 causadas tanto por DBZ quanto por.anti-NRR1, observada-em coloração de Ki - o 67 e Alcian Blue).

Para determinar se a inibição da sinalização Notch2 pode também... co 16º afetára determinação-do-destino te célutas infestínais, nós comparamos ||| = ———- diretamente os efeitos do antiNRR1 e antrNRR2 no intestino grosso (dados não mostrados) e intestino delgado (Figura 15C, mostrando a coloração de o Alcian Blue e Ki -67, e Figura 24B, mostrando coloração de alcian blue). ' Enquanto o anti-NRR1 causou metaplasia de células caliciformes que coincidiu com uma diminuição na expressão do Ki -67 nos progenitores da cripta, o anti- NRR2 não causou quaisquer efeitos detectáveis (Figuras 15C e 24B, compare ant-NRR2 com o controle anti-gD), Pelo fato do anti-NRR1 e anticNRR2 funcionarem como inibidores potentes e específicos da sinalização Notch1 e Notch2, respectivamente, tanto in vivo (Figura 11) como in vitro (Figuras 9, 10 e 21), estes resultados sugerem fortemente que a inibição seletiva de Notch1, mas não de Notch2, é suficiente para alterar a determinação do destino da célula intestinal.

O efeito da inibição tanto de Notcht como de Notch2 e na determinação do destino das células intestinais também foi investigado.

À Figura 22 mostra os efeitos sinérgicos de antinRR1 e anti-NRR2 na diferenciação de células intestinais alteradas.

Camundongos fêmeas Balb/c foram tratados com 5 mg/kg de anti-NRR1, 5 mg/kg de anti-NRR2 ou 5 mg/kg de antrkNRR1 acrescido de 5 mg/kg de anti-NRR2 nos dias O, 4,7 e 11. Os intestinos foram coletados e corados com H&E para revelar a morfologia da cripta.

Para camundongos tratados com anti-NRR1 ou anti-NRR2 sozinho, os intestinos foram coletados em 12 dias, para os camundongos tratados com ê ambos os anticorpos juntos, os intestinos foram coletados no dia 6, porque os ratos neste perderam peso rapidamente.

A análise dos intestinos indicou que a combinação de anticorpos resultou em um fenótipo mais grave do que a A observada após o tratamento com anti-NRR1-sozinho; sugerindo-que Noteht-e= - - - - Notch2 funcionam em conjunto e de forma parcialmente redundante no intestino dos mamíferos, Experiências adicionais confirmaram essa O 46 7 obsenvação Conforme mostrado ria Figura-24B, osintestimos de camundengos — ||| - —=—— — tratados Com antiNRR1 e antiNRR2 exibiram metaplasia grave de células ms caliciformes.

Embora o tratamento apenas com anti-NRR1 foi suficiente para o induzir alguma metaplasia de células caliciformes, o efeito do anti-NRR1 foi apenas discreto em relação aos efeitos da combinação de anti-NRR1 e anti- NRR2. Tomados em conjunto, os resultados indicam que a função Notchi e Notch2 agem redundantemente na diferenciação de células intestinais, embora a potente de Notch1 mas não de Notch2 seja suficiente para revelar um fenótipo parcial.

Nós hipotetizamos que a capacidade de detectar esse fenótipo parcial, não relatado previamente em estudos genéticos, reflete que o anti NRR1 fornece uma inibição mais uniforme e potente da sinalização Notch1 nas células da cripta que pode ser alcançada por knockout genético condicional, que pode ser incompleto.

De maneira importante,

reduzindo significativamente ou evitando a metaplasia de células caliciformes que é uma indicação da inibição geral de Notch, os anticorpos inibidores de Notch1 e Notch2 específicos relatados na presente invenção representam um avanço claro em cima dos inibidores pan-Notch existentes, tal como GSIs.

9. RESGATE DO FENÓTIPO INTESTINAL ANTI - NRR1 A Figura 23 mostra que a dexametasona, resgata ao menos parcialmente o fenótipo intestinal causado pelo anti-NRR1, Os anticorpos foram administrados por via intraperitoneal (IP) em camundongos fêmeas NCR.nude Ô (três camundongos por grupo) da seguinte forma: Grupo A) combinação de veículos, MCT, uma vez por dia, anticorpo controle anti-cgD a 4 mg/kg, a cada quatro dias (não mostrado na e e fa e e ee sr sr mmromy om OS O Grupo B ) Dexametasona, 890mg/Kkg, diariamente (não mostrado na figura); | ' ee co as cc empoe)AMENRRIAmÔINg acadaduátodias | cc Gripo D) dexâmetasona, SOmg/kg, diariamente, e Anti-NRR1, 4 mg/kg, a cada quarto dias. e O veículo foi 0,5% (p/v) de hidroxipropilmetilcelulose (Methocel E4M ) e 0,1% (p/v) de Tween-80 em água (MCT), anteriormente indicado para —não causar efeitos clínicos adversos. Os intestinos foram coletados no dia 9 e corados com anti-Ki67 (marcador de proliferação) e Alcian blue (para mucina). Este experimento revelou que os camundongos tratados com a combinação dexametasona mais ant-NRR1 exibiram um fenótipo intestinal mais leve em relação aos camundongos tratados apenas com anti-NRR1, sugerindo que a dexametasona protege o intestino de alterações induzidas por anti-NRR1 na diferenciação.

10. ANTI-NRR2 SuPRIME O CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE MELANOMA O efeito do anti-NRR1 e anti-—NRR2 sobre o crescimento de

. linhagens de células de melanoma foi investigado.

As linhagens de células de melanoma humano SK23 e LOX-IMVI foram semeadas em meio contendo 2% de SFB em baixa densidade (4.000 células/poço para SK23, 2500 células/poço para LOX-IMVI) em placas de 96 poços que foram revestidas sem (- jag-1) ou com ligante Jagged-1 (+jag-1) (R&D Systems, Minneapolis, MN). O anti-NRR1 (20 mg/ml ), anti-NRR2 (20 mo/ml), ou o inibidor de gama-secretase (GSI) dApt (5 mM) foi adicionado às culturas e re-adicionado a cada dois dias, Um volume igual de DMSO serviu como controle do veículo, enquanto que uma ê concentração igual de anticorpos anti-gD fago HuB6 serviu como anticorpo isotípico controle, Ensaios com Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI ), foram realizados seis dias após o plaqueamento.

Os resultados são mostrados nas eee Figuras 25A e 258B (antiiNRR1 e anti-NRR2-são «referidos como “anti-Nt""e”r | oco "anti-N2”). Nas Figuras 25A e 25B, a viabilidade celular (eixo-y) é expressa em relação ao valor do veículo DMSO, poços controle — jag-1 . Ambas às... ... = O 46 linhagens-de células -de-meltanoma exibiram uma diminuição da viabilidade em || - ——--- resposta ao tratamento « con GSI (especialmente na presença do ligante Jag1) e ao tratamento com anti-NRR2, mas não ao tratamento com anti-NRR1. o 11. ANTI-NRR2 SuPRIME O CRESCIMENTO DE LinFoMA DiFuso DE GRANDES CÉLULAS B /N ViTRO O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o tipo mais comum de linfoma não-Hodgkin.

Um recente estudo com células cancerosas de pacientes com LDGCB indicou que aproximadamente 8% dos pacientes portadores de uma mutação no domínio PEST de Notch2, uma mutação que prevê o prolongamento da sinalização Notch2 após a ativação do ligante. (Vide Leeetal.

Cancer Sci. 100:920-926, 2009). No entanto, ao era conhecido como as céluias LDGCB responderiam à inibição de Notch2. Portanto, nós investigamos o efeito do anti-NRR2 em cinco linhagens de células LDGCB.

Às linhagens de LDGCB listadas à direita da Figura 26 foram cultivadas em repetições pro três dias, em poços de uma placa de 384 poços. As culturas de células incluídas nas concentrações indicadas de anti-NRR2 (referido como "anti-Notch2 " nas Figuras 26 e 27 ), corresponderam a três diluições seriadas a partir de 10 pg/ml. O crescimento foi avaliado por testes Cel Titer Glo (Promega), representados como o percentual de viabilidade celular em relação ao tratamento com um anticorpo isotípico controle. Os dados apontados na Figura 26 representam os valores médios obtidos de poços individuais para cada linhagem celular nas concentrações de anticorpos indicadas. Conforme o mostrado na Figura 26, o crescimento de uma das linhagens da células, “DB”, foi fortemente inibida pelo tratamento com anti-NRR2. A Figura 27 mostra o crescimento da linhagem celular DB ao longo do tempo. A linhagem DB foi — - = -ecultivada em poços de uma placa-de 12 poços, e-as-culturas-foram tratadas — FR com DMSO, inibidor da gama-secretase ADPT, anticorpo isotipo controle anti- — - gD ou anti-NRR2 nas concentrações indicadas. O crescimento ) foi avaliado pela - Ms contagem de células viáveis (VI-CELL, Beckman Coutter, Fulleton, CA ), nos NNE dias 2, 3 e 5 após a inoculação e tratamento das culturas. Os valores representam a média das medições a partir de três culturas independentes, o mais ou menos o desvio padrão. A Figura 27 mostra que o anti-NRR2 suprime o crescimento da linhagem de células de LDGCB DB in vitro.

Embora a invenção acima divulgada tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustrações e exemplos para fins de clareza de entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. A divulgação de todas as patentes € literaturas científicas citadas no presente são expressamente incorporadas em sua totalidade pela referência.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES 1 ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA A NOTCH2 i NRR E INIBE A ATIVIDADE DE NOTCH2, onde o anticorpo se liga a Notch2 NRR com uma Kd < 10 nM.

   2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga de maneira significativa a um membro da família Notch que não seja Notch2.

   3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, & caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a Notch2 NRR de camundongo e Notch2 NRR humano.

   4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, “7 7 7 * caracterizado pelo fato de que o-anticorpo compreende 2 2 2 0 e.

   (a) uma HVRH1 compreendendo uma sequência de - = . aminoácidode acordo com a sequência consenso da SEQ ID NO: 3; TS 6) uma HVR+H2 compreendendo a-sequência-dé-amindácido LT >". dasEQIDNo:a; |U OT OTOmoTemenmos o ossos (o) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 5; 8 - (d) uma HVR-L1I compreendendo uma sequência de aminoácidos que está de acordo com a sequência consenso da SEQ ID NO: 10; (e) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 14; e (N) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácido em conformidade com a sequência consenso da SEQ ID NO: 19;

   5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ

   ID NOs: 1-2; uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 6-9; uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11-13, e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir dasSEQIDNOs:15-18.

   6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, a HVR-L1 compreende a sequência de é aminoácidos da SEQ ID NO: 6, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. TO TT Tm 7 —- 7 -ANTICORPO, de- acordo -com a reivindicação 52 : caracterizado pelo fato de que a HVR-H1 compreende a sequência de - = - . CLamincácidos da SEQ ID NO: 2, a HVR-L1 compreende a sequência de — 218 aminoácidos da SEQ ID NO: 7, à AVR-L2 compreemde-a sequência-de——— aminoácidos da SEQ ID NO: 11, e a HVR-L3 compreênde à sequência dê aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Ss 8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que à HVR-H1 compreende a sequência de —amincácidos da SEQ ID NO: 2, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17.

   9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.

   10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende ainda de pelo menos uma região estrutural selecionada a partir de uma região estrutural VM aceptora 2humanae uma região estrutural de consenso VL kappa subgrupo | humano.

   11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender um domínio variável de cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de d aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 20-21 e um domínio variável de cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma seqilência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 22-25. TOTO 7 T- - "12 -ANTICORPO, -de- acordo - com a. reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de . -. cadeia pesada com uma identidade de sequência de pelo menos 90% com a

   0. 16. sequência de amincácidos da SEG ID NO: 206 Um dominio variável de cadeia — > leve com identidade de sequência de pelo menos 90% com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Ss 13. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, e o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.

   14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 e um domínio variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23-25.

   15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, e o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada a —partirdas SEQID NOs: 23-25.

   16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo selecionado a partir do Anticorpo D, Anticorpo D-1, Anticorpo D-2 ou d Anticorpo D-3.

   17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao domínio LNR-A e o TT O dominio HD-O de Noteh2.- seo

   18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das oO NS . .reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um fragmentode anticorpo selecionado a pantirde um-fragmento-Fab, FabílSH, Ev, cocos scFvou(Fabls ||| Rs OTTO 1 709 .

   19. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das 4 reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humano, s humanizado ou quimérico.

   20. MÉTODO DE INIBIR A ATIVIDAIDE NOTCH2, compreendendo o dito o método a exposição de uma célula que expressa Notch2 a um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a

   17.

   21. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA ASSOCIADA COM O AUMENTO DA EXPRESSÃO OU ATIVIDADE DE NOTCH2, compreendendo o método a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer reivindicação de 1-17 a um indivíduo que necessite do mesmo.

   22. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULAS B, compreendendo o método a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo de qualquer reivindicação de 1-17 a um indivíduo que necessite do mesmo.

   5 23. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM MELANOMA, compreendendo o método a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo de qualquer reivindicação de 1-17 à um indivíduo que necessite do mesmo.

   é 24. USO, de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-17, para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença associada com aumento da expressão ou atividade de Notch2.

   "OT TT Tr - - -265 -USO de-um-anticorpo.de-acordo-com qualquer uma das reivindicações de 1-17, para a fabricação de um medicamento para tratar uma ao - malignidade de células B. .

   18 36 USO, de um anticorpo de acordo com qualquéruma das — — reivindicações de 117, para a fabricação de um medicamento para tratar um melanoma.

   Ss 27. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-17, para o uso como um medicamento.

   28. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-17, para o uso no tratamento de uma doença associada com aumento da expressão ou atividade de Notch2.

   29. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-17, para o uso no tratamento de uma malignidade de célulasB.

   30. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-17, para o uso no tratamento de um melanoma.