KR20110061600A - 항-노치2 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-노치 항체, 및 특히 노치2 NRR에 결합하는 항체, 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-노치2 항체 및 사용 방법 {ANTI-NOTCH2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2008년 10월 1일에 출원된 미국 가출원 제61/101,917호를 우선권 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항-노치2 음성 조절 영역 (NRR) 항체를 비롯한 항-노치 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 항-노치1 NRR 항체 및 사용 방법을 또한 제공한다.
노치 수용체 패밀리는 성게 및 인간 만큼 다양한 유기체에서 발달에 영향을 주는 신호를 전달하는, 진화적으로 보존된 막횡단 수용체의 클래스이다. 노치 수용체 및 그의 리간드, 델타(Delta) 및 세라트(Serrate) (포유동물에서는 Jagged라고도 알려져 있음)는 표피 성장 인자 (EGF)-유사 반복부를 함유하는 대형의 세포외 도메인을 갖는 막횡단 단백질이다. 노치 파라로그(paralogue)의 수는 종마다 차이가 있다. 예를 들어, 포유동물에는 4가지 노치 수용체 (노치1-노치4), 캐노해브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에는 2가지 노치 수용체 (LIN-12 및 GLP-1), 및 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에는 1가지 노치 수용체 (노치)가 존재한다. 노치 수용체는 막횡단 도메인의 N-말단쪽의 S1 부위에서 퓨린-유사 프로테아제에 의해 세포 표면으로 운반되는 동안 단백질분해 처리되어, 세포외 노치 (ECN) 서브유닛 및 노치 막횡단 서브유닛 (NTM)을 생성시킨다. 이들 2개의 서브유닛은 비-공유결합으로 결합된 채로 유지되어 성숙한 이종이량체성 세포 표면 수용체를 구성한다. 노치 수용체 및 노치 신호전달 경로는, 예를 들어 문헌 [Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 2008], 및 [Bolos et al., Endocrine Reviews 28:339-363, 2007]에서 고찰된다.
노치2 ECN 서브유닛은 36 N-말단 EGF-유사 반복부에 이어서, S1 부위 앞쪽에 3개의 일렬로 반복된 Lin 12/노치 반복부 (LNR) 모듈을 함유한다. 각각의 LNR 모듈은 3개의 디술피드 결합 및 칼슘 이온을 배위한다고 예상되는 일군의 보존된 산성 및 극성 잔기를 함유한다. EGF 반복부 영역 내에는 활성화 리간드를 위한 결합 부위가 있다.
노치2 NTM은 세포외 영역 (S2 절단 부위를 보유함), 막횡단 절편 (S3 절단 부위를 보유함), 및 대형의 세포내 부분 (RAM23 도메인, 6개의 안키린 반복부, 트랜스활성화 도메인 및 카르복시-말단 PEST 서열을 포함함)을 포함한다. ECN 및 NTM 서브유닛의 안정한 회합은 ECN의 카르복시 말단부 (HD-N이라고 함) 및 NTM의 세포외 아미노 말단부 (HD-C라고 함)를 포함하는 이종이합체 도메인 (HD)에 의존한다. 리간드-유도된 활성화 이전에, 노치는 3개의 LNR 및 HD 도메인을 포함하는 음성 조절 영역 (NRR)에 의해 휴면 구조를 유지한다. 노치2 NRR의 결정 구조는 문헌 [Gordon et al., (2007) Nature Structural & Molecular Biology 14:295-300, 2007]에 보고되어 있다.
노치 리간드가 ECN 서브유닛에 결합하면 조절된 막내 단백질분해를 통해 일어나는 2개의 연속적인 단백질분해 절단이 개시된다. S2 부위에서의 메탈로프로테아제(ADAM17)에 의한 제1 절단에 의해, 노치 막횡단 서브유닛은 원형질막의 내부 리플릿(leaflet)에 가까운 S3 부위에서의 제2 절단에 대해 민감해진다. 프레세닐린 및 니카스트린을 함유하고 γ-세크레타제 활성을 촉진하는 다중단백질 복합체에 의해 촉매되는 S3 부위 절단은 노치 막횡단 서브유닛의 세포내 부위를 자유롭게 하여 그가 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사를 활성화하게끔 한다. (노치의 단백질분해 절단의 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Sisodia et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:281-290, 2002]을 참조.)
인간에서 Jagged 및 델타-유사 클래스의 5가지 노치 리간드 (Jagged1 (세라트1이라고도 함), Jagged2 (세라트2라고도 함), 델타-유사1 (DLL1이라고도 함), 델타-유사3 (DLL3이라고도 함), 및 델타-유사4 (DLL4라고도 함))가 확인되었다. 각각의 리간드는 노치 결합에 필수적인 보존된 N-말단의 델타, 세라트, LAG-2 (DSL) 모티프를 갖는 1회-통과 막횡단 단백질이다. DSL 모티프에 대해 C-말단에 있는 일련의 EGF-유사 모듈은 막에 걸쳐있는(membrane-spanning) 절편의 앞쪽에 있다. 노치 수용체와 달리, 리간드는 C-말단에서 70-215개의 아미노산으로 이루어진 짧은 세포질 꼬리를 갖는다. 또한, 다른 유형의 리간드가 보고되었다 (예를 들어, DNER, NB3, 및 F3/콘택틴(Contactin)). (노치 리간드 및 리간드-매개 노치 활성화에 대한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [D'Souza et al., Oncogene 27:5148-5167, 2008.] 참조.)
노치 경로는 파리 및 척추동물에서 신경발생에 영향을 미치는 것을 비롯해서, 다양한 발생 및 생리 과정 동안 기능을 한다. 일반적으로, 노치 신호전달은 측부 억제, 계열 선택, 및 세포 그룹간 경계의 확립을 수반한다 (예를 들어 문헌 [Bray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006] 참조). 암 및 신경변성 장애를 비롯한 다양한 인간 질환이 노치 수용체 또는 이의 리간드를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이로 인해 야기된다는 것이 밝혀졌다 (예를 들어 문헌 [Nam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501-509, 2002] 참조). 억제되지 않은 노치 신호전달 및 악성종양 사이의 관계는 인간 노치1의 절단된, 본질적으로 활성인 변이체를 생성하는 반복적인 t(7;9)(q34;q34.3) 염색체 전좌가 인간 급성 림프모구성 백혈병 (T-ALL)의 하위세트에서 확인되었을때 처음 인지되었다 (예를 들어, 문헌 [Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 2008] 참조). 마우스 모델에서, 노치1 신호전달은 T 세포 발생에 필수적이며, 노치1-매개 신호전달이 B 세포 발생을 훼손시키면서 T 세포 발생을 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어 문헌 [Wilson et al., J. Exp. Med. 194:1003-1012, 2001] 참조).
노치2는 또한 특정 암과 관련이 있다. 특히, 노치2는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 (B-CLL)에서 과다발현되고, 이는 차례로 B-CLL 세포의 특징인 CD23을 과다발현시킨다. (문헌 [Hubmann et al., Blood 99:3742-3747, 2002] 참조.) 노치1 및 노치2는 둘 모두 다발성 골수종 세포 (암성 혈장 B 세포)에서 고도로 발현되며, 리간드에 의한 자극은 종양 세포 성장을 강력하게 증가시킨다. (문헌 [Jundt et al., Blood 103:3511-3515, 2004] 참조.) 노치2 및 하류 이펙터는 흑색종에서 과다발현되며 (문헌 [Hoek et al., Cancer Res. 64:5270-5282, 2004]; [Seykora et al., Am J Dermatopathol 25:6-11, 2003] 참조), 노치2 유전자좌는 흑색종 세포주에서 반복해서 증폭된다 (문헌 [Jonsson et al., Oncogene, 26:4738-4748, 2007]). 또한, 많은 연구들에 의해 비정상적인 노치2 신호전달과 유방암 및 그 밖의 충실성 종양과의 관련성이 밝혀졌다 (문헌 [Leong and Karsay, Blood 107:2223-2233, 2006]에서 고찰됨). 노치2는 또한 변연부 B 세포 발생에 요구된다. (문헌 [Pillai et al., Annu. Rev. Immunol. 23:161-196, 2005] 참조.)
폭넓게 다양한 인간 질환에서의 노치 신호전달의 관련성을 감안하면, 치료제로 개발하기에 최적인 임상적 기여를 갖는 노치 신호전달을 조절하는 작용제가 지속적으로 필요하다는 것은 분명하다. 본원에 기술된 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 기타 이점을 제공한다.
특허 출원 및 공개공보를 비롯하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
본 발명은 항-노치 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 노치2 NRR에 결합하는 모노클로날 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 노치2 활성을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 노치2 이외의 노치 패밀리 구성원에는 현저하게 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 마우스 노치2 NRR 및 인간 노치2 NRR에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 10 nM 이하의 Kd로 노치2 NRR에 결합한다.
추가 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 모노클로날 항체가 제공되며, 여기서 항체는
(a) 서열 3의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 10의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(e) 서열 14의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(f) 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
이러한 한 실시양태에서, 항체는 서열 1-2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열 6-9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열 11-13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 서열 15-18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, HVR-H1은 서열 1의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 15의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 또 다른 실시양태에서, HVR-H1은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 16의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 또 다른 실시양태에서, HVR-H1은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 17의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 또 다른 실시양태에서, HVR-H1은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 18의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 인간 VH 수용자 2 프레임워크 및 인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크로부터 선택된 하나 이상의 프레임워크를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 노치2 NRR에 결합하는 모노클로날 항체가 제공되며, 여기서 항체는 서열 20-21로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 22-25로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 22의 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 도메인은 서열 22의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 21의 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인과 서열 23-25로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 도메인은 서열 23-25로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2 또는 항체 D-3으로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 또 다른 측면에서, 노치2의 LNR-A 도메인 및 HD-C 도메인에 결합하는 단리된 항체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 항-노치2 NRR 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편이다. 또 다른 측면에서, 항-노치2 NRR 항체는 인간화 항체, 키메라 항체 또는 인간 항체이다.
임의의 상기 실시양태는 단독으로 또는 조합되어 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, 노치2를 발현하는 세포를 임의의 상기 실시양태에서의 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 노치2 활성을 억제하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 상기 실시양태에서의 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, B-세포 악성종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 상기 실시양태에서의 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, B-세포 악성종양을 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 흑색종의 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 상기 실시양태에서의 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 흑색종을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 노치1의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-노치1 NRR 항체 및 덱사메타손 및 타목시펜으로부터 선택된 치료제를 공동투여하는 것을 포함하는, 노치1의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 치료제는 항체로 인해 야기된 장 세포 분화의 변경을 감소시킨다. 이러한 한 실시양태에서, 장애는 T-세포 악성종양이다.
도 1은 실시예 B(1)에서 기술된 바와 같은, 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3으로 지정된 항-노치2 NRR 모노클로날 항체의 H1, H2, 및 H3 중쇄 초가변 영역 (HVR) 서열을 나타낸다. 아미노산 위치는 하기에서 기술하는 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 것이다.
도 2는 실시예 B(1)에서 기술된 바와 같은, 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3으로 지정된 항-노치2 NRR 모노클로날 항체의 L1, L2, 및 L3 경쇄 HVR 서열을 나타낸다. 아미노산 위치는 하기에서 기술하는 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 것이다.
도 3은 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 중쇄 가변 영역 서열의 정렬을 보여준다. HVR은 실시예 B(1)에서 기술한 바와 같이 박스로 에워싼 것이다.
도 4는 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 경쇄 가변 영역 서열의 정렬을 보여준다. HVR은 박스로 에워싼 것이다.
도 5a 및 5b는 본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 예시적인 수용자 인간 가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크 서열을 보여준다. 서열 식별자는 다음과 같다:
- 인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 32, 33, 34, 35).
- 인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 "B", "C" 및 "D" 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 36, 37, 34, 35; 서열 36, 37, 38, 35; 및 서열 36, 37, 39, 35).
- 인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 40, 41, 42, 35).
- 인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 "B", "C" 및 "D" 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 43, 44, 42, 35; 서열 43, 44, 45, 35; 및 서열 43, 44, 46 및 35).
- 인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 47, 48, 49, 35).
- 인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 "B", "C" 및 "D" 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 50, 51, 49, 35; 서열 50, 51, 52, 35; 및 서열 50, 51, 53, 35).
- 인간 VH 수용자 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 54, 48, 55, 35).
- 인간 VH 수용자 프레임워크 "B" 및 "C" 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 50, 51, 55, 35; 및 서열 50, 51, 56, 35).
- 인간 VH 수용자 2 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 54, 48, 57, 35).
- 인간 VH 수용자 2 프레임워크 "B", "C" 및 "D" 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 50, 51, 57, 35; 서열 50, 51, 58, 35; 및 서열 50, 51, 59, 35).
도 6은 본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 예시적인 수용자 인간 가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크 서열을 보여준다. 서열 식별자는 다음과 같다:
- 인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (κv1): 서열 60, 61, 62, 63
- 인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 (κv2): 서열 64, 65, 66, 63
- 인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 (κv3): 서열 67, 68, 69, 63
- 인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 (κv4): 서열 70, 71, 72, 63
도 7은 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 서열을 보여준다. 위첨자의 볼드체 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 8은 표시된 변형을 갖는 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 서열을 보여준다. 위첨자의 볼드체 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 항-NRR1 및 항-NRR2 항체가 실시예 B(1)에 기술된 바와 같이, 그의 동족 수용체에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다. (a) 각각의 4 가지의 인간 (h) 및 뮤린 (m) 노치 수용체로부터 정제된 NRR 단백질 단편에 대한 항-NRR1 (좌측 패널) 및 항-NRR2 (우측 패널)의 결합을 측정한 ELISA 검정. y-축에 A560으로 나타낸 결합을 항-NRR1 또는 항-NRR2의 적정과 비교하여 그래프로 나타내었다. (b) 형질감염되지 않은 K1-CHO 세포 (패널 1, 4, 7 및 10), N-myc-노치1로 안정하게 형질감염된 K1-CHO 세포 (패널 2, 5, 8 및 11) 또는 N-myc-노치2로 안정하게 형질감염된 K1-CHO 세포 (패널 3, 6, 9 및 12)에 대한 항-NRR1 (패널 1-6) 또는 항-NRR2 (패널 7-12)의 결합을 측정한 FACS 검정. N-myc-노치 형질전환유전자는 유도가능한 tet 프로모터의 제어하에 발현되고; 아랫줄은 독시시클린 유도의 부재하에서의 대조군 발현이며 (-Dox); 윗줄은 독시시클린을 부가한 이후의 유도된 발현이고 (+Dox); K1-CHO 세포주는 노치2를 내생적으로 발현하며, 이는 독시시클린의 존재 또는 부재하에서 항-NRR2에 의해 검출되는 것에 주목한다 (예를 들어, 패널 7 및 10을 비교).
도 10a-c는 항-NRR1 및 항-NRR2가 실시예 B(2) 및 B(3)에서 기술한 바와 같이, 활성화 돌연변이를 운반하는 수용체를 비롯한 표적화된 수용체로부터 신호전달을 특이적으로 억제함을 보여준다. (a) 노치1 신호전달의 항-NRR1 억제를 측정한 공동배양 검정. Jag1로 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포를 사용하여 노치1로 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포 ("-Jag1"은 제외, Jag1-발현 세포 대신 형질감염되지 않은 NIH-3T3 세포를 사용함)에서의 노치 신호전달을 유도하였다. 노치 리포터 유전자 (반딧불이 루시페라제의 발현을 유도하는 CSL-의존성 프로모터)를 사용하여 노치 신호전달을 측정하였고, 이는 DAPT 조건에 대해 표준화된 (1의 값으로 규정함) 대조군 유전자 발현 (레닐라 루시페라제의 발현을 유도하는 구성 프로모터)에 비례하여 발현되었다. +Jag1, 표준 공동배양 검정; DMSO, DAPT 비히클 단독; DAPT, DMSO 중의 5 μM; α-gD, 2000 ng/ml에서의 이소형 대조군 항체; α-NRR1, 표시된 농도에서의 항-NRR1 항체; 마지막 4개의 검정은 80 ng/ml의 α-NRR1 또는 α-gD 중 어느 하나 플러스 표시한 바와 같은 정제된 노치1 또는 노치2 NRR 단백질 단편 (+NRR1 또는 +NRR2)을 포함하였다. (b) 노치2 신호전달의 항-NRR2 억제를 측정하는 공동배양 검정. Jag1에 의해 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포를 사용하여 노치2를 높은 수준으로 발현하는 U87MG 세포에서의 노치 신호전달을 유도하였다. 본 검정은 (a)에서 기술한 바와 같이 수행하였다. (c) 야생형 또는 돌연변이 노치1 수용체로부터의 노치1 신호전달의 항-NRR1 억제를 측정한 공동배양 검정. 본 검정은 수용체-발현 세포를 표시된 노치1 수용체를 발현하는 플라스미드에 의한 일시적인 형질감염에 의해 생성하는 것을 제외하고 (a)에서와 같이 수행하였다. WT, 야생형 노치1; △PEST, PEST 도메인 결핍 노치1; L1594P, 표시된 구성적으로-활성화 점 돌연변이를 운반하는 노치1; E25, 625 ng/ml 이소형 대조군 항체; α-NRR1, 625 ng/ml 항-NRR1 항체; DMSO, GSI 비히클 단독; DAPT, DMSO 중의 5 μM; CmpE, 1 μM DMSO 중의 화합물 E.
도 11a-d는 실시예 B(4)에 기술한 바와 같은, 생체내 수용체 특이적 억제제로서의 항-NRR1 및 항-NRR2 기능을 보여준다. Balb/c 마우스에 매 4 일 마다 4 회 5 mg/kg의 α-gD 이소형 대조군, α-NRR1 또는 α-NRR2를 주사하고, 4 번째 투여의 하루 뒤인 13 일째에 흉선 및 비장으로부터 세포를 수확하였다. (a) 흉선 중량 측정. 흉선 중량 (단위 mg)을 총 체중 (단위 g)에 대해 표현하였다. 값은 그룹 당 세 마리의 마우스에 대한 평균 플러스 표준 편차로 나타내었다. (b) 흉선 세포 계수. (c) CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포를 확인하기 위한 CD4 및 CD8 FACS. 숫자는 이중 음성, 단일 양성 및 이중 양성 집단에서의 흉선 세포의 백분율을 나타낸다. 항-gD 대조군 (77.5％)에 비해, 항-NRR1은 CD4+/CD8+ 집단에서의 세포의 백분율을 상당히 감소시킨 반면 (5.89％) 항-NRR2는 어떤 현저한 효과도 없었다 (80％). (d) 변연부 B 세포를 확인하기 위한 CD21 및 CD23 FACS. 숫자는 박스로 표시한 MZB 게이트 내의 세포의 평균 백분율 ± 표준 편차 (3 마리의 동물로부터)를 나타내며; p 값을 또한 주목하고; 각 그룹에서 세 마리의 동물 중 한 마리로부터의 대표적인 도트 플롯을 그래프로 나타낸다. 항-gD 대조군 (6.61％)에 비해, 항-NRR2는 MZB 세포를 거의 제거한 반면 (0.97％) 항-NRR1은 어떤 현저한 효과도 없었다 (6％).
도 12a-d에서, 항-NRR1 Fab/NRR1 공결정의 2.2 Å 구조는 항-NRR1이 실시예 B(5)에 기술한 바와 같이 LNR-A, LNR-B 및 HD-C 도메인에 동시에 접촉함을 나타낸다. (a) α-NRR1 또는 α-NRR2의 노치1-NRR 또는 노치2 NRR 키메라 단백질 단편에 대한 결합을 요약한 표. 표시된 NRR 단백질 단편 (진청색, 노치1 서열; 연청색, 노치2 서열)은 알칼리성 포스파타제에 융합된 분비된 단백질로 발현되어 플레이트 기초 검정에서 항체 결합의 신속한 측정을 가능하게 한다. NRR 발현 및 분비를 표준화하기 위해 알칼리성 포스파타제 활성을 사용한 후, 표시된 NRR 키메라 단백질을 함유하는 배양 배지를 α-NRR1, α-NRR2 또는 이소형 대조군 항체 (배경 결합을 평가하기 위해 사용됨, 나타내지 않음)로 코팅된 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 항체 결합은 플레이트에 여전히 결합되어 있는 알칼리성 포스파타제 활성을 측정하여 평가하였다. Y, 강한 결합; N, 결합이 관찰되지 않음; W, 약한 결합이 관찰됨. (b) 인간 노치 NRR1의 구조. NRR1을 C-알파 카툰으로 나타내었다. LNR 모티프 내의 3 개의 칼슘 이온은 구로서 나타내었다. S2 절단 부위의 위치는 화살표로 표시하였다. (c) 구조적으로 보존된 원자에 기초하여 NRR2 상에 NRR1을 중첩시킨 것 (pdb 코드 2OO4로부터의 사슬 A). NRR1 (음영) 및 NRR2 (백색)를 C-알파 트레이스로 나타낸다. (d) NRR1 (좌측) 및 α-NRR1 Fab (우측, 검정 점선으로 나타낸 중쇄 및 경쇄 사이의 경계) 사이의 계면의 오픈-북 뷰. 복합체 형성에 의해 감춰지는 용매 접근가능 표면 부위의 범위를 보여준다. 적어도 50％ 만큼 감춰지는 잔기를 표지하였고, 노치1 및 노치2에서의 동일한 NRR 잔기는 검정색 글씨로 표지하였다 (또한 도 18 참조).
도 13a-c는 실시예 B(6)에서 기술한 바와 같이 항-NRR1이 내피 세포의 과다발아를 야기함을 보여준다. (a) 시험관내 내피 세포 발아 검정. HUVEC를 사이토덱스(Cytodex) 비드에 코팅하고, 피부 섬유모세포와 함께 공동배양하였다. 배양물을 가상 처리하거나 (대조군), DBZ 1 μM, α-NRR1 5 μg/ml 또는 α-Dll4 5 μg/ml로 처리하였다. 막대 = 100 μm. (b) (a)의 배양물에서의 발아 길이 측정. (c) 내피 세포 발아 및 혈관신생에 대한 신생 마우스 망막 검정. 신생 마우스에 P1 및 P3에 표시된 항체를 주사하고, 이소렉틴의 관류 또는 증식에 대한 Ki67 마커를 가시화하기 위해 P5에 망막을 표본화하였다. 패널 I 및 II, 막대 = 1 mm. 패널 III-VI는 패널 I 및 II의 부분을 확대한 것을 나타낸다. 막대 = 0.2 mm.
도 14a-e는 실시예 B(7)에 기술한 바와 같이 노치1 신호전달의 선택적 항체 차단이 종양 혈관신생을 방해하고, 종양 성장을 억제함을 보여준다. 표시된 항체로 처리한 이후의 종양 부피 (평균 +/- SEM) 대 시간을 보여주는 3종의 종양 이종이식 모델의 그래프: α-돼지풀 (음성 대조군), α-VEGF 또는 α-NRR1. P 값은 α-돼지풀 vs. α-NRR1 비교치를 나타낸다. (a) Calu6 모델. (b) HM7 모델. (c) α-NRR1 용량 적정에 의한 HM7 모델. (d) (a)에 나타낸 Calu6 모델로부터의 대표적인 종양 절편에서의 내피 세포 염색. 이종이식 모델에 사용된 항체를 상단에 나타낸다. DAPI 및 α-CD31을 사용하여 DNA 및 내피 세포를 각각 염색하였다. 패널의 아랫줄은 합한 이미지를 보여준다. 막대 = 50 μm. (e) (d)에 나타낸 CD31 염색의 정량화. 이미지J를 사용하여 (d)에 나타낸 것과 유사한 이미지에서 CD31 및 DAPI 염색을 정량화하고, 상대적인 CD31 염색 (DAPI 염색에 대해 표준화한 CD31 염색)을 α-돼지풀 대조군 (값 1로 설정함)과 비교하여 각각의 3종의 항체 처리에 대해 그래프화하였고; 데이터는 8개의 이미지 필드에 걸쳐 평균 +/- 표준 편차로 나타내었다.
도 15a-c는 실시예 B(8)에서 기술한 바와 같이, 노치1의 선택적인 항체 차단이 소장에서 세포 운명을 바꾸는데 충분함을 보여준다. (a) 총 체중 변화 (평균 +/- 표준 편차) vs. 시간. 마우스를 도 11에 도시한 바와 같이 항-gD 이소형 대조군, LTβR-Fc, 항-NRR1 또는 항-NRR2으로 처리하였다. 화살표는 투여일을 나타낸다. (b) 소장의 면역조직화학적 분석. 마우스를 표시된 농도의 항-gD 이소형 대조군, DBZ 또는 항-NRR1로 0, 2 및 6 일째에 처리하고, 7 일째에 면역조직화학적 분석을 위해 소장을 표본화하였다. 나타낸 각 행에서, 염색은 해모톡실린 및 에오신 (H & E)에 대한 것, 뮤신에 대해 분비 배상 세포를 표시하기 위해서는 알시안 블루, 파네스 세포를 표시하기 위해서는 리소자임, 증식에 대해서는 Ki-67 및 노치 하류 표적으로서는 Hes1로 나타낸다. 7 일째의 대장 및 2 일째의 소장 분석에 대해서는 각각 도 19 및 20을 참조한다. 막대 = 40 μm. (c) 소장 세포 분화에 대한 노치1- 대 노치2-특이적 억제의 비교. (a)에 기술한 연구로부터 소장을 α-gD, α-NRR1 또는 α-NRR2의 최종 투여 다음날에, 표시한 바와 같이 알시안 블루 및 Ki-67에 대해 표본화하였다. 막대 = 50 μm.
도 16은 실시예 B(2)에 기술된 바와 같이 항-NRR1이 다중 리간드에 의해 유도된 노치1 신호전달의 강력한 억제자임을 보여준다. 리간드 발현 세포가 나타낸 바와 같이 Jag1, Jag2 또는 Dll1을 발현하는 것을 제외하고, 도 10a에 기술한 바와 같이 노치1 신호전달의 공동배양 검정을 수행하였다.
도 17은 실시예 B(5)에 기술한 바와 같은, 저수율의 노치1 NRR/노치2 NRR 키메라 단백질 구축물을 보여준다. 표는 분비된 알칼리성 포스파타제 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 NRR 키메라 단백질을 열거한 도 12a를 보충하며, 이는 키메라가 잘못 폴딩되거나 또는 달리 불안정함을 제시한다. 약하지만 검출가능한 알칼리성 포스파타제 활성을 나타내는 단편의 경우, α-NRR1 또는 α-NRR2의 결합은 다음과 같이 요약된다. ---, 발현되지 않고 검사 불가능하게 결합됨; N, 전혀 발현되거나 결합되지 않음; W, 약하게 발현 또는 결합됨.
도 18은 실시예 B(1) 및 B(5)에 기술된 바와 같이 항-NRR1에 의해 접촉된 NRR1 잔기의 보존을 보여준다. 인간 노치1 NRR 도메인 (서열 26), 마우스 노치1 NRR 도메인 (서열 27), 인간 노치2 NRR 도메인 (서열 28) 및 마우스 노치2 NRR 도메인 (서열 29)의 아미노산 서열 정렬, 우측에는 하위-도메인 경계를 나타냄. 인간 노치1 NRR을 참고 서열로 열거하고, 다른 NRR 서열에서 인간 노치1과 동일한 잔기를 볼드체로 나타낸다. 항-NRR1-Fab/노치1-NRR 구조에서 감춰진 적어도 25％의 잔기 (도 12)를 잔기가 감춰진 정도의 증가를 반영하는 실선 대 점선과 함께 개략적으로 나타낸다. 인간 노치1 서열에서 적어도 25％ 감춰진 21개의 아미노산 중에서, 21개는 모두 마우스 노치1 서열에서와 동일하지만, 인간 및 마우스 노치2 서열에서는 단지 6개 만이 동일하고 (더하여, 인간 노치1 S1712에서 S 대신 T인 7 번째의 보존적 차이가 있음); 노치2 서열에서 동일하고 "감춰진" 잔기 중에서, 어떤 것도 75％를 초과하여 감춰진 클래스에는 속하지 않는다. 이러한 서열 비교는 (a) 인간 및 마우스 노치1 둘 모두에의 강력한 항-NRR1 결합 (대략 동일한 친화성) 및 (b) 인간 및 마우스 노치2에의 항-NRR1 결합의 결여과 일치한다. 또한, 감춰진 잔기는 모두 LNR-A, LNR-B 및 HD-C 내에 놓여있고, 이는 도 11a 및 17에 나타낸 도메인 교체 실험에서와 일치한다.
도 19는 실시예 B(8)에서 기술한 바와 같이, 노치1의 선택적인 항체 차단이 대장에서 세포 운명을 바꾸는데 충분함을 보여준다. 도 15b에서 기술한 실험으로부터 7 일째에 채취한 대장 샘플의 조직병리학적 분석.
도 20은 실시예 B(8)에서 기술한 바와 같이, 노치1을 차단한 후 2 일째에 소장 세포의 운명이 변화됨을 보여준다. 도 15b (이는 7 일째에 채취한 샘플을 나타냄)에서 기술한 실험으로부터 2 일째에 채취한 소장 샘플의 조직병리학적 분석.
도 21은 실시예 B(2)에서 기술한 바와 같이 항-NRR1이 시험관내에서 노치2-유도된 신호전달을 차단하지 않음을 보여준다. 도 10b에서 기술한 바와 같은 U87MG 세포에서의 공동배양 검정. 항-NRR1은 시험관내 (도 10a) 및 생체내 (도 11a-c)에서 노치1 신호전달을 강력하게 억제하였지만, IC50을 100 배 초과하는 농도 (1000 ng/ml)로 사용한 경우에도 노치2 신호전달에는 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 노치1에 대한 항-NRR1의 특이적 결합 (도 9 및 12) 뿐만 아니라 생체내 노치2의 항-NRR1 억제의 결여 (도 11d)와 일치한다.
도 22는 실시예 B8에 기술한 바와 같은, 장 세포 분화에 대한 항-NRR1 및 항-NRR2의 가능한 상승 효과를 보여준다.
도 23은 실시예 B(9)에 기술한 바와 같이, 덱사메타손이 항-NRR1에 의해 야기된 장 표현형을 적어도 부분적으로 복구시킴을 보여준다.
도 24a 및 b는 노치1 또는 노치2의 선택적 차단이 전반적인-노치 억제와 관련된 배상 세포 화생을 최소화하거나 회피시키는 반면에, 노치1 및 노치2 둘 모두의 차단은 심각한 배상 세포의 화생을 야기함을 보여준다. (a) 실시예 B8에서 기술한 바와 같이, 마우스에 화살표로 표시한 날에 5 mg/kg의 항-NRR1, 항-NRR2, 또는 둘 모두, 또는 음성 대조군 항체 항-gD를 투여하고; 총 체중 변화 (평균 +/- 표준 편차) vs. 시간을 나타낸다. (b) 분비 배상 세포를 표시하기 위해 뮤신에 대한 알시안 블루를 이용한, (a)에서와 같이 처리한 마우스로부터의 소장의 면역조직화학적 분석.
도 25a 및 25b는 실시예 B(10)에 기술한 바와 같이, 항-NRR2 ("항-N2"라 칭함)가 시험관내에서 인간 흑색종 세포주 SK23 및 LOX-IMVI의 성장을 억제함을 보여준다.
도 26은 5종의 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 세포주 (우측에 열거함)에 대한 항-NRR2 ("항-노치2"라 칭함)의 효과를 보여준다. 실시예 B(11)에 기술한 바와 같이, 세포주 중 하나, "DB"의 성장은 항-NRR2에 의한 처리에 의해 강력하게 억제되었다.
도 27은 실시예 B(11)에 기술된 바와 같이, 시간의 경과에 따른 DB DLBCL 세포주의 성장에 대한 항-NRR2 ("항-노치2"라 칭함)의 효과를 보여준다.
본 발명의 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 노치에 결합하는 단리된 항체 및 그의 사용 방법, 예를 들어 노치의 발현 및 활성과 관련된 질환을 진단 또는 치료하는 방법을 제공한다.
I. 일반적인 기술
본원에서 기재되거나 언급되는 기술 및 절차는 당업자가 일반적으로 잘 이해하고 있고, 통상적인 방법, 예컨대 하기 문헌에 기재되어 있는 널리 사용되는 방법에 의해 흔하게 사용된다: 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., (2003))]; [the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodis: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)].
II. 정의
본 명세서를 이해하기 위해 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 경우에는 언제라도 단수로 사용된 용어들이 복수도 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 하기 기재된 임의의 정의가 본원에서 참고문헌으로 포함된 임의의 문헌과 모순되는 경우에는 하기 기재가 우선한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 구성분으로 확인되어 이러한 천연 환경으로부터 분리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 일부 실시양태에서 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제하였다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
"천연 항체"는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 다양한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.
용어 "항-노치1 NRR 항체" 또는 "노치1 NRR에 결합하는 항체"는 항체가 노치1을 표적화함에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 노치1 NRR에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 항-노치1 NRR 항체가 관련없는 비-노치 단백질에 결합하는 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정될 때 항체의 노치1 NRR에 대한 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, 노치1 NRR에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하이다. 특정 실시양태에서, 항-노치1 NRR 항체는 다양한 종, 예를 들어 설치류 (마우스, 래트) 및 영장류로부터의 노치에서 보존된 노치의 에피토프에 결합한다.
용어 "항-노치2 NRR 항체" 또는 "노치2 NRR에 결합하는 항체"는 항체가 노치2를 표적화함에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 노치2 NRR에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 항-노치2 NRR 항체가 관련없는 비-노치 단백질에 결합하는 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정될 때 항체의 노치2 NRR에 대한 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하이다. 특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 다양한 종, 예를 들어 설치류 (마우스, 래트) 및 영장류로부터의 노치에서 보존된 노치의 에피토프에 결합한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 상기 도메인은 일반적으로 항체의 대부분의 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이의 서열에서 광범위하게 상이함을 지칭하고 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 그의 특정 항원에 대해 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역 (HVR)으로 불리우는 3가지 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 HVR에 의해 연결된 베타-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 HVR은 상기 FR 영역에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)라고 불리는 2개의 분명하게 구분되는 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 추가로 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나뉘어질 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 다양한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체 및 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 이하에서 정의하는 항체 단편이 아니라, 그의 실질적인 무손상 형태의 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원의 목적상 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 있고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2쇄 Fv 종은 밀접하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이러한 형상에서는, 각 가변 도메인의 3개 HVR이 상호 작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화성이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래는, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL). 동일한 쇄의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)는 또한, 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이라는 것이 아니라 항체의 특징을 나타내는 것이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 일반적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 방법에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선별 방법은 복수 개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화성 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 이것의 생성 개선, 생체내 이것의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체 제제는 이것의 특이성에 추가하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린으로 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득하였다는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특별한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,807호; 동 제5,545,806호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 및 동 제5,661,016호; 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함한 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이지만 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종에서 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 상기 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체에는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 항원으로 면역시킴으로써 생성된 항체로부터 유래된 것인 PRIMATIZED® 항체가 포함된다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수여자의 HVR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 비인간종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 교체된 것인 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 보다 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 제6,982,321호 및 동 제7,087,409호를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 그것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조를 위한 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함한 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기술된 방법들이 인간 모노클로날 항체를 제조하는데 이용가능하다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]도 참조한다. 인간 항체는, 항원 시험접종에 반응하여 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스에 항원을 투여하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 동 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]도 참조한다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 본원에서 사용될 때 서열에서 초가변이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR - VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄 만으로 이루어진 자연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정적이다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초한 것이며, 가장 흔히 사용되고 있다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아 (Chothia)는 그 대신 구조적 루프의 위치를 나타낸다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기가 다음에 제시된다:
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HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 HVR 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형 형태는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 편집(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 그 내부로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대하여 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 결정할 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 색인 (index)"은 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 EU 색인 참조). "카바트에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제US 2008/0181888 A1호에서 EU 넘버링에 대한 도면 참조).
"친화성 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는, 그의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화성 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어는 피코몰의 친화성을 갖는다. 친화성 성숙 항체는 당업계에 공지된 특정 절차를 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙이 기술되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용되는 "효능제 항체"는 목적하는 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.
"성장 억제" 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 예를 들어, 항체는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 암 세포의 증식을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
"아폽토시스를 유도하는" 항체는 표준 아폽토시스 검정, 예컨대 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성에 의해 판단되는 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 항체이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변할 수도 있긴 하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 위치 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단으로의 연신으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동성이 바람직하게 약 80％ 이상, 가장 바람직하게는 그와의 상동성이 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 그와의 상동성이 약 95％ 이상일 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체, 예를 들어 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조.) FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 고찰된 바 있다. 추후에 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton 등) 참조).
인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체를 기재한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성의 세포 (예를 들어 NK 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비형 Ig가, 상기 세포독성의 이펙터 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 의미한다. ADCC, NK 세포를 매개하는 1차 세포는 FcγRIII 만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 그러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하에의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참고한다.
용어 "Fc 영역 포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 의미한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.
"결합 친화성"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화성"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화성을 나타낸다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)로써 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함한, 당해 분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로, 항원과 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로, 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫동안 결합된 상태로 있다. 결합 친화성을 측정하는 각종 방법이 당해 분야에 공지되어 있는데, 이들 모두가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화성 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 아래에 설명한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에서 설명되는 바와 같이, 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화한 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단하였다. 비흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65 시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어, 1 시간 동안) 인큐베이션하기 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 트윈-20(TWEEN-20)™으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (scintillant) (마이크로신트-20(MICROSCINT-20)™; 패커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (패커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 검정에서 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 약 10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크. (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (약 0.2 μM)으로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주사한다. 항원 주사 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈-20™ 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시 피팅함으로써 단순 일대일 랭그뮈어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106M-1s-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 장착 분광분석기 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합 비율" 또는 "회합율" 또는 "kon"은 또한 상기한 바와 같은 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 시스템 (비아코어, 인크. 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 상기 설명된 바와 같이 판단할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교값의 함수로서, 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만, 및/또는 약 10％ 미만이다.
본원에서 사용되는 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하도록 2개의 수치값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과, 및/또는 약 50％ 초과이다.
본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크" 또는 "인간 수용자 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이미 존재하는 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이미 존재하는 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 기존의 아미노산 변화가 VH에 존재하는 경우, 바람직하게는 이들 변화가 위치 71H, 73H 및 78H 중의 단지 3개, 2개 또는 1개에서만 일어나는 경우, 예를 들어 이들 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열 면에서 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]의 가변 중쇄 하위군 III 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 수용자 프레임워크는 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크로부터 유래되고, 하기 각각의 서열 중 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다: (서열 50)-H1-(서열 51)-H2-(서열 57 또는 59)-H3-(서열 35). 일부 실시양태에서, 서열 35의 마지막 잔기 (S11)는 알라닌으로 치환된다.
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]의 가변 경쇄 카파 하위군 I 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 하기 각각의 서열 중 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: (서열 60)-L1-(서열 61)-L2-(서열 62)-L3-(서열 63).
"정제된"은 그를 함유하는 샘플의 적어도 95 중량％, 또는 적어도 98 중량％의 농도로 분자가 샘플 내에 존재함을 의미한다.
"단리된" 핵산 분자는 예를 들어 그의 자연 환경에서 그와 통상적으로 회합되는 하나 이상의 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 핵산 분자를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 더 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외부에 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하고자 의도된다. 한 유형의 벡터는 그 내부에 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스성 벡터이다. 특정 벡터는 벡터가 그 내부에 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터", 또는 단순히 "재조합 벡터"로서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 합성 후에 이루어진 변형(들), 예를 들어 표지에 대한 접합을 포함할 수 있다. 다른 종류의 변형은 예를 들어 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡(cap)" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 비하전된 연결기 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결기 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 갖는 것, 팬던트 모이어티, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터(alkylator)를 함유하는 것, 변형 연결기 (예를 들어, 알파 아노머(anomer) 핵산 등)를 갖는 것과, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기가, 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가적인 뉴클레오티드에의 추가적인 연결이 제조되도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑(capping) 기 모이어티로 치환될 수 있다. 또 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사체, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비시클릭 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결이 대체 연결기로 대체될 수 있다. 상기 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결기를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬임)로 교체되는 실시양태를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오티드 (반드시 이러한 것은 아님)인 짧은, 일반적으로 단일 가닥인 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적 의미를 갖는 것이 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "노치"는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 노치 (노치1-4)를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 비프로세싱된 노치 뿐만 아니라 세포에서 프로세싱된 임의의 형태의 노치를 포함한다. 상기 용어는 또한 노치의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "노치1"은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 노치1을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 비프로세싱된 노치1 뿐만 아니라 세포에서 프로세싱된 임의의 형태의 노치1을 포함한다. 상기 용어는 또한 노치1의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "노치2"는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 노치2를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 비프로세싱된 노치2 뿐만 아니라 세포에서 프로세싱된 임의의 형태의 노치2를 포함한다. 상기 용어는 또한 노치2의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
용어 "노치2 활성"은 노치2 신호전달을 지칭한다. "노치2 활성을 억제하는" 작용제 (예를 들어, 항체)는 실질적으로 동일한 조건하에서 적절한 대조군에서 관찰되는 노치2 신호전달 수준과 비교하여 노치2 신호전달을 현저하게 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 노치2 활성은 본원의 실시예 B(2)에서 기술한 바와 같은 적합한 리포터 검정에 의해 평가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 노치2 활성은 본원의 실시예 B(4)에서 기술한 바와 같이 변연부 B 세포의 생성을 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 노치2 신호전달의 감소는 대조군에서 관찰되는 수준의 적어도 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 10-배 미만이다.
용어 "노치2 NRR"은 3개의 LNR 모듈 (LNR-A, LNR-B, 및 LNR-C) 및 HD 도메인 (HD-N 및 HD-C)으로 이루어진 노치2의 영역을 지칭한다. 예시적인 인간 및 마우스 노치2 NRR 서열을 도 18에 나타낸다 (각각 서열 28 및 29). 노치2 NRR은 예를 들어 S1에서 노치2의 프로세싱에 의해 야기된 비공유적으로 연결된 단편으로 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 단일의 인접한 폴리펩티드 서열로 이루어질 수도 있다. 예로서 도 18을 참고하면, 인간 노치2 NRR은 인간 노치2의 아미노산 1422-1677 (서열 75)으로, 또는 이와 달리, 서열 75의 아미노산 1609-1677에 비공유적으로 연결된 서열 75의 아미노산 1422-1608으로 이루어질 수 있다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후의 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었고, 소스 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작국(U.S. Copyright Office) (워싱턴 D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)으로부터 공개적으로 입수가능하거나 소스 코드로부터 수집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 유닉스 운영 체제, 바람직하게는 디지털 유닉스 V4.0D에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2가 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 또는 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 ％ 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 또는 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 ％ 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100×X/Y의 분수값
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치(match)로 스코어링되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 ％ 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 ％ 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급하지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 ％ 아미노산 서열 동일성 값은 바로 앞 단락에서 기재한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 구한다.
"장애"는 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용한 치료가 유익할 임의의 상태 또는 질환이다. 이것은 포유동물이 문제가 되는 장애에 걸리기 쉽게 하는 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애를 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적인 예에는 암과 같은 상태가 포함된다.
"B-세포 신생물"이라고도 불리는 "B-세포 악성종양"에는 호지킨병 (예를 들어, 림프구 우세 호지킨병 (LPHD)); 비-호지킨 림프종 (NHL); 여포성 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL, B-ALL이라고도 불림); 전구체 B-림프모구성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병 (CLL, B-CLL이라고도 불림); 모발상 세포 백혈병; 변연부 B-세포 림프종 (결절형, MALT형 및 비장형을 포함); 다발성 골수종 (형질세포종, 형질 세포 골수종); 소 비균열 세포 림프종 (예를 들어, 버킷의 림프종); 대세포 림프종 (미만성 거대 세포 (B-세포), 미만성 혼합 세포 및 면역모세포 림프종을 포함); 외투 세포 림프종; 소림프구성 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬(Waldenstrom)의 매크로글로불린혈증이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 무통성 림프종은 천천히 성장하는 불치병으로, 평균적으로 환자는 오랜 기간의 완화 및 재발에 이어 6 년 내지 10 년 사이로 생존하며; 공격성 림프종은 높은 등급 및 일부 중간 등급 카테고리의 NHL을 아우르는 급속하게 성장하는 림프종 형태이다.
용어 "흑색종"은 주로 피부에서 발견되지만 또한 눈 (포도막 흑색종) 또는 장에서도 발견되는 멜라닌세포의 악성 종양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 변형 형태)는 치료할 개체 또는 세포의 천연 과정을 변경시키려는 시도의 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발생을 지연시키거나 질환 또는 장애의 진행을 지연시키는데 사용된다.
"개체", "대상체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "제약 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 나타낸다. 그러한 제제는 멸균성일 수 있다.
"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.
"유효량"은 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 물질/분자의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과를 능가하는 양이다. "예방 유효량"은, 필요한 투여량 및 기간 동안 원하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 이전 또는 보다 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이지만 반드시 그러한 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 제한하고/하거나 세포의 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예를 들어 뉴클레오티드분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소, 또는 그의 단편 및/또는 변이체, 및 아래에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한 것이다. 다른 세포독성제는 이하에 기재되어 있다. 살종양제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 대해 악영향을 가질 수 있는 임의의 물질이다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))] 참조); 경구 알파-4 인테그린 억제제인 CDP323; 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 또한 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (독실(DOXIL)®), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (마이오세트(MYOCET)®, 페길화 리포좀 독소루비신 (케릭스(CAELYX)® 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 미국 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 알부민 조작된 파클리탁셀의 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신 (FILDESIN)®) 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 비롯한, 튜불린 중합이 미세소관 형성을 방지하게 하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®)을 비롯한 레티노이드, 예컨대 레티노산; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®, 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 팔미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적 세포 증식과 관련된 신호전달 경로의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오좀 억제제 (예를 들어 PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제 예컨대 오블리메르센 나트륨 (제나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (아래 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (아래 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 임의의 상기 물질들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 2가지 이상의 상기 물질들의 조합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약자인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료법에 대한 약자인 폴폭스(FOLFOX)를 포함한다.
본원에서 정의되는 화학요법제는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 호르몬 자체, 예를 들어 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이같은 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가르드(ELIGARD)®), 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성별 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스트론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 임의의 상기 물질들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 2가지 이상의 상기 물질들의 조합물을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포 (예컨대 노치를 발현하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기의 세포 (예컨대 노치를 발현하는 세포)의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 통상적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어질 수도 있다. 추가의 정보는 문헌 [Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)]의 예를 들어 13 페이지에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®, 론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜 세포에서의 유사분열을 억제한다.
III. 조성물 및 방법
본 발명은 부분적으로 노치 결합제, 예를 들어 항체 및 그의 단편의 확인을 기초로 한다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 노치2 음성 조절 영역 (NRR) 결합제, 예컨대 노치2 NRR에 결합하는 단리된 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 이같은 항체는 예를 들어 노치2의 발현 및/또는 활성 (예를 들어, 증가된 발현 또는 활성)과 관련된 장애의 진단 또는 치료에 유용하다. 구체적 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 암, 예를 들어 B-세포 악성종양 및 흑색종을 진단 또는 치료하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 노치2 NRR 결합과 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
A. 항-노치2 NRR 항체
1. 예시적 파지 라이브러리-유래 항체
본원에서는 실시예 B에서 기재한 바와 같은, 파지 라이브러리로부터 유래된 예시적 모노클로날 항체를 제공한다. 노치2 NRR에 결합하는 "항체 D"로 지정된 항체를 단리하였다. 상기 항체는 친화성 성숙되어 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3으로 지정된 항체를 생성하였다. 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 중쇄 및 경쇄 초가변 영역 (HVR)의 서열을 도 1 및 2에 나타낸다. 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열은 도 3 및 4에 나타낸다. 항-노치2 NRR 항체의 추가의 실시양태는 이하에 제공한다.
한 측면에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 이하에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다:
(a) 서열 3의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 10의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(e) 서열 14의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2;
(f) 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
추가 측면에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열 및 상기의 (a), (b), (d), (e) 및 (f)로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 HVR을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 추가 측면에서, 항체는 상기의 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)를 포함한다. (a), (d), (e) 및 (f)와 관련하여, 임의의 하나 이상의 하기 실시양태가 고려된다: HVR-H1은 서열 1-2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L1은 서열 6-9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L2는 서열 11-13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L3은 서열 15-18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열 3의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, HVR-H1은 서열 1-2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열 10의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 14의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 하기 실시양태의 임의의 조합이 고려된다: HVR-L1은 서열 6-9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L2는 서열 11-13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L3은 서열 15-18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 항체는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는
(a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(e) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(f) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는
(a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(e) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(f) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는
(a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(e) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(f) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는
(a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(f) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 항체는 추가로 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 및 VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크로부터 선택된 적어도 하나의 프레임워크를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 친화성 성숙된 것이다. 예를 들어, 표시된 HVR 위치 (카바트 넘버링됨)에서의 다음과 같은 임의의 하나 이상의 치환이 임의의 조합으로 이루어질 수 있다:
- HVR-H1 (서열 1)에서: S28T; T30S;
- HVR-L1 (서열 6)에서: S28N; I29N 또는 V; S30R 또는 K; S31R; Y32F
- HVR-L2 (서열 11)에서: G50R; S53I 또는 T; A55E
- HVR-L3 (서열 15)에서: S93I 또는 R; L96W 또는 H
본원에서 개시하는 특정 항체, 즉 항체 D 및 항체 D의 친화성 성숙된 형태 (D-1, D-2 및 D-3)는 추가로 친화성 성숙될 수 있다. 따라서, 본원은 기재된 임의의 항체의 친화성 성숙 형태를 제공한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 HVR 서열을 갖는 항-노치2 NRR 항체는 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 더 포함할 수 있고, 단 이것은 노치2 NRR에 대한 결합 활성은 실질적으로 보유하는 것이다. 특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같은 임의의 VH 컨센서스 프레임워크 서열 중에서 인간 가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 컨센서스 프레임워크 서열은 예를 들어 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같은 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, VH 컨센서스 프레임워크 서열은 예를 들어 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같은 "수용자 2" 프레임워크 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH 프레임워크 컨센서스 서열은 수용자 2B 또는 수용자 2D의 FR1-FR4를 포함하며, 여기서 FR4는 서열 35를 포함하고 (도 5a 및 5b), 서열 35의 마지막 잔기 (S11)는 알라닌으로 임의로 치환된다. 추가의 특정 실시양태에서, VH 프레임워크 컨센서스 서열은 서열 50; 51; 57 또는 59; 및 35의 서열을 포함하고; 여기서 서열 35의 S11은 알라닌으로 임의로 치환된다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 HVR 서열을 갖는 항-노치2 NRR 항체는 추가로 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같은 인간 가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, VL 컨센서스 프레임워크 서열은 예를 들어 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같은 인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (κv1) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, VL 프레임워크 컨센서스 서열은 도 7 또는 8에 나타낸 바와 같은 huMAb4D5-8의 FR1-FR4를 포함한다. 특정 실시양태에서, VL 프레임워크 컨센서스 서열은 서열 60, 61, 62 및 63의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-노치2 NRR 항체는 서열 20-21로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성을 갖는 VH 서열은 참고 서열과 비교하여 치환 (예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-노치2 NRR 항체는 노치2 NRR에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 20-21로부터 선택된 아미노산 서열에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 특정 실시양태에서, VH는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 3의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 이러한 실시양태에서, HVR-H1은 서열 1-2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 항체는 서열 22-25로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성을 갖는 VL 서열은 참고 서열과 비교하여 치환 (예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-노치2 NRR 항체는 노치2 NRR에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 22-25로부터 선택된 아미노산 서열에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 특정 실시양태에서, VL는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 10의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 이러한 실시양태에서, VL는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 6-9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 11-13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 15-18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 이러한 실시양태에서, VL는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 이러한 또 다른 실시양태에서, VL는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 이러한 또 다른 실시양태에서, VL는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 이러한 또 다른 실시양태에서, VL는 다음으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 내에서 일어날 수 있다. 그와 같은 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 그러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경이 HVR에서 이루어질 수 있다. 특정 경우에, HVR에서의 변경은 실제로 항체 친화성을 향상시킬 수 있다. 그와 같은 변경은 항체 친화성을 증가시키기 위해 HVR "핫스팟(hotspot)" (즉, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도의 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기)에서 이루어질 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008.] 참조). 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 보존되거나 (변경되지 않거나), 또는 하나를 초과한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하지 않는다.
또 다른 측면에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는 상기에서 제공한 임의의 실시양태에서의 VH, 및 상기에서 제공한 임의의 실시양태에서의 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 22의 아미노산 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 이러한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함하고, VL은 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 항-노치2 NRR 항체는 서열 21의 아미노산 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열 23-25로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 이러한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함하고, VL은 (a) 서열 7-9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 11-13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 16-18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 23-25로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 항체의 친화성 성숙 형태를 제공한다. 추가 실시양태에서, 노치2 NRR에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 제공하며, 여기서 재조합 단백질은 임의의 상기 항체의 항원 결합 부위(들)를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 재조합 단백질은 상기에서 제공한 임의의 하나 이상의 HVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 한 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하고, 항체를 단리하는 것을 포함한다.
2. 추가의 예시적 항체
한 실시양태에서, 본 발명은 노치2 활성을 억제하는 단리된 항-노치2 NRR 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 임의의 생물학적으로 관련이 있는 노치2 신호전달 경로를 분열시키는 것을 포함하여, 하나 이상의 노치2 신호전달 측면을 변조시킬 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 노치2 NRR에 100 nM 이하의 Kd로 결합하는 단리된 항-노치2 NRR 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 노치2 NRR에 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 0.1 nM 이하의 Kd로 결합한다. 본원의 실시예에 기재한 바와 같이, 예시적인 파지 항체 D-3은 5 nM의 Kd로 결합한다. 당업계에서 널리 확립된 바와 같이, 리간드의 그의 수용체에 대한 결합 친화성은 임의의 다양한 검정을 이용하여 판단할 수 있고, 다양한 정량적인 값으로 표현할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 결합 친화성은 Kd 값으로 표현되고, 이는 내인성 결합 친화성을 반영한다 (예를 들어, 최소화된 결합력 효과를 가짐). 일반적으로 및 바람직하게, 결합 친화성은 세포 무함유 환경이든 세포 관련 환경이든 관계없이 시험관 내에서 측정된다. 예를 들어, 비아코어, 방사선면역검정 (RIA), 및 ELISA를 비롯한 본원에 기재된 것들을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다수의 검정을 이용하여 결합 친화성 측정치를 얻을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 노치2 NRR에 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 여기서 항체는 노치2 이외의 노치 패밀리 구성원 (즉, 포유동물에서 노치1, 3 및 4)에는 현저하게 결합하지 않는다. 그러한 항체는 실시예 B(1)에서 제공하는 검정을 이용하여 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 노치2 NRR 및 적어도 하나의 다른 비-인간종, 예를 들어 마우스의 노치2 NRR에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2 및 항체 D-3으로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항-노치2 NRR 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2 및 항체 D-3으로부터 선택된 항체와 경쟁하는 항-노치2 NRR 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 노치2의 LNR-A 도메인 및 HD-C 도메인으로부터 선택된 적어도 하나의 도메인에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 항체는 LNR-A 도메인 및 HD-C 도메인 둘 모두에 결합한다. 이러한 또 다른 실시양태에서, 항체는 추가로 LNR-B 및/또는 HD-N 도메인에 결합한다. 그러한 도메인은 도 18에 도시한다.
항-노치2 NRR 항체의 상기 실시양태는 단독으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 또한, 본원에서 기재하는 임의의 항-노치2 NRR 항체는 임의의 하나 이상의 다음과 같은 특징을 가질 수 있다: 특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 인간화, 인간 또는 키메라 항체이다.
3. 항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어 효소적 소화, 또는 재조합 기술에 의해 생성할 수 있다. 특정 상황에서는, 온전한 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 충실성 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다. 특정한 항체 단편의 고찰을 위해 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이러한 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 동 제5,587,458호를 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고, 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합체를 생성시키도록 제조될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
4. 인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 초가변 영역 서열로 상응하는 인간 항체의 서열을 치환함으로써 윈터(Winter) 및 공동 연구원의 방법 (문헌 [Jones et al., (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536)])에 따라 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소를 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크로서 허용한다. 예를 들어, 문헌 [Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296]; [Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901]을 참조한다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 다양한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al., (1993) J. Immunol., 151:2623]을 참조한다.
항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 일반적으로 더욱 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
5. 인간 항체
본 발명의 인간 항체는 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 언급된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 합함으로써 구축할 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가, 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기술되어 있다.
면역화 시, 내인성 이뮤노글로불린은 생산하지 않고 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스 내 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제시킨다고 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.
유전자 셔플링이 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 또한 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 친화성 및 특이성이 유사하다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"으로도 불리는 상기 방법에 따라, 상기한 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성시킨다. 항원에 의한 선별로 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되고, 여기서 인간 사슬이 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 사슬의 제거시 파괴된 항원 결합 부위를 복원하며, 즉 에피토프가 인간 사슬 파트너의 선택을 좌우한다 (임프린팅한다). 나머지 비-인간 사슬을 대체하기 위해 프로세스가 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (PCT WO 93/06213 (1993년 4월 1일 공개) 참조). CDR 그래프팅(grafting)에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는, 완전히 인간형인 항체를 제공한다.
6. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 하나의 결합 특이성은 노치2에 대한 것이며, 나머지는 임의의 기타 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 노치2의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를, 노치2를 발현하는 세포에 위치시킬 수도 있다. 이들 항체는 노치2-결합 아암, 및 세포독성제, 예컨대 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (콰드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개), 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 불균일한 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 높은 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2종 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 유도하거나 상기 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우에는 하나의 발현 벡터 내에 2종 또는 3종 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생산에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합되거나 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포로 표적화하고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089)하는 것과 관련하여 제안된 바 있다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께 적합한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에도 기재된 바 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 방법이 기술되어 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 메르캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학 커플링 반응을 실시하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재된 바 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성에 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 동일 쇄의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 1개의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되고, 이에 의해 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 또 다른 제조 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
7. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위가 있는 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이루어진다). 이러한 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이루어진다). 다가 항체는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
8. 단일-도메인 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈탐; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조). 한 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
9. 항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 구현된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이같은 변형에는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행할 수 있지만, 단 최종 구축물은 요구되는 특성을 가져야 한다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은, 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이 "알라닌-스캐닝 돌연변이유발"로 칭해진다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu과 같은 하전된 잔기), 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 그 후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적인 또는 또 다른 변이체를 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 성과를 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 또 다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들어 ADEPT용)가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화로는 전형적으로 N-연결된 글리코실화 또는 O-연결된 글리코실화가 있다. N-연결된이란 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 의미한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당, N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위에 대해)이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 변경은 본래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이분지의 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al., (1997) TIBTECH 15:26-32]을 참조한다. 이러한 올리고사카라이드에는 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이분지 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정의 개선된 특성을 지닌 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
예를 들어, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 지닌 항체 변이체가 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 지닐 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제US 2003/0157108호 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교사(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍성" 항체 변이체에 관한 공개공보의 예에는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]이 포함된다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 제US 2003/0157108 A1호 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams 등, 특히 실시예 11)]), 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)가 포함된다.
이등분된 올리고사카라이드를 수반한 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지의 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 저하된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등); US 특허 제6,602,684호 (Umana 등); 및 US 2005/0123546 (Umana 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel 등); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 추가로 개선시켜 주는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 치환은 상기 언급된 모든 변이와 조합해서 일어날 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체 내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 목적하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 없지만 (따라서, ADCC 활성이 없기 쉬움), FcRn 결합 능력은 유지되는 것을 확실히 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 제5,500,362호 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 제5,821,337호 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 이와 달리, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.) 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스 96 (CytoTox 96)® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재)). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 이와 달리 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 검정이 또한 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합성 및 생체내 소거/반감기 결정은 또한, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 기타 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 표 1에서 "예시적 치환"으로 명명되는, 또는 아미노산 부류와 관련하여 이하에서 추가로 기재하는 바와 같은 보다 실질적인 변화를 제공한다. 아미노산 치환을 관심 항체 내로 도입하고, 생성물을 대상으로 예를 들어 목적 활성, 예를 들어 개선된 항원 결합성, 저하된 면역원성, 개선된 ADCC 또는 CDC 등에 관하여 스크리닝할 수 있다.
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항체의 생물학적 특성 면에 있어서의 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체 형태로서의, 치환 부위에서 폴리펩티드 골격의 구조에 영향을 미치거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 달성할 수 있다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 다음 군으로 분류할 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):
(1) 비극성 : Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
이와 달리, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류할 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 상기 치환되는 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로, 또는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 한 유형에는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것이 포함된다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화성 성숙 항체이고, 이는 파지 디스플레이에 기초한 친화성 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성시킬 수 있다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체는 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, M13의 유전자 III 산물)에 대한 융합체로서 사상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행할 수 있다. 이와 달리 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 하여 본원에 기재된 기술을 포함한, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝하고, 한 가지 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 지닌 변이체를 추가 개발을 위해 선별할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
본원 명세서 및 당업계의 교시 내용에 따르면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 야생형 대응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 영역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고 이러한 항체는 이의 야생형 대응물과 비교하여 치료학적 유용성에 요구되는 실질적으로 동일한 특성을 유지할 것이다. 예를 들어, WO99/51642에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 초래할 특정 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 생각된다. Fc 영역 변이체의 기타 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO94/29351을 참조한다. WO00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 본원에 참고로 명확하게 포함된다. 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 또한 참조한다. 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 US2005/0014934 A1 (Hinton 등)에 기술되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합성을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551 B1호, WO 99/51642에 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 본원에 참고로 명확하게 포함된다. 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면 내에서의 변형을 포함하는 항체를 제공하며, 이러한 변형은 이종이량체화를 용이하게하고/하거나 촉진시킨다. 상기 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내에 돌출부를, 제2 Fc 폴리펩티드 내에 캐비티를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 돌출부는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시키기 위해 캐비티 내에 위치할 수 있다. 상기 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 대체시킨, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 요망될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되도록 하고, 이를 사용하여 항체를 본원에서 추가로 기재하는 바와 같은 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 이하의 잔기를 시스테인으로 치환시킬 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).
10. 항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 이들의 혼합물이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제작에서의 장점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에 치료법에서 사용될 것인지 여부 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
B. 항체의 특정 제조 방법
1. 특정 하이브리도마-기초 방법
본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되고, 예를 들어 인간-인간 하이브리도마와 관련된 문헌 [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)], 및 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)]에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가의 방법에는, 예를 들어 하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 천연 IgM 항체의 생성에 관한 미국 특허 제7,189,826호에 기재된 방법이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 [Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
다양한 기타 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들어 US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 제7,078,492호 및 동 제7,153,507호를 참조한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜은 다음과 같이 기술된다. 한 실시양태에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화시킴으로써, 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 노치2 또는 그의 단편 (예를 들어, 노치2 NRR) 및 아주반트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (리비 이뮤노켐. 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.) 몬타나주 해밀턴 소재)를 포함하는 폴리펩티드를 피하 (sc) 또는 복강내로 (ip) 다회 주사하여 동물에서 항체를 유도한다. 노치2 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 그 일부가 본원에서 추가로 기재되는, 재조합 방법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-노치2 항체에 대해 검정하고, 부스터 면역화를 임의로 투여한다. 항-노치2 항체를 생산하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 이와 달리, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다.
이어서, 림프구를 하이브리도마 세포를 형성하는데 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]을 참조한다. 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포주에는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능)로부터 유도된 것이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987)]).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배지, 예를 들어 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함 (HAT 배지)할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)]에 기재된 바와 같이, 태아 소 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해서 무-혈청 하이브리도마 세포 배양 방법을 사용한다.
문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에는 하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 도구로서 올리고펩티드가 기재되어 있다. 특히, 표준 배양 배지를 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)이나 단백질 가수분해물 분획으로 풍부하게 하면, 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해서 아폽토시스가 유의하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 더 높은 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 노치2에 결합하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]을 참조한다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Goding, 상기 문헌]을 참조한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하는 하나의 절차가 US 2005/176122 및 미국 특허 제6,919,436호에 기재되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소한의 염, 예컨대 친액성 염의 사용을 포함하고, 바람직하게는 또한 용출 과정에서 소량의 유기 용매의 사용을 포함한다.
2. 특정 라이브러리 스크리닝 방법
본 발명의 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌 [Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리를 사용하는 것을 통한다.
원칙적으로, 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선별된다. 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이같은 파지 라이브러리가 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 그후, 결합 클론이 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가적인 사이클에 의해 추가로 강화될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 관심 파지 클론을 선별하는데 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구축함으로써 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 항원 결합 도메인은 둘 모두 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 제시하는 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역 (경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩)으로부터 형성된다. 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유적으로 연결된 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 VH 및 VL이 불변 도메인에 각각 융합되어 비-공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 가변 도메인이 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용되는 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭한다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되어 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있고, 그 후, 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 이 라이브러리에서 항원-결합 클론을 검색할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 별법적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 항원 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브(naive) 레퍼토리가 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리가 또한 합성적으로 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 소수 코트 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사상 파지가 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기술된 바와 같이, 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 사슬 상에서 VH 및 VL 도메인이 연결된 단일쇄 Fv 단편으로서, 또는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기술된 바와 같이, 1개의 사슬은 pIII에 융합되고 다른 1개는 박테리아 숙주 세포 주변세포질로 분비되어, 여기서 일부 야생형 코트 단백질을 치환함으로써 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리가 파지 표면 상에 디스플레이되게 되는 Fab 단편들로서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 수득하였다. 항-노치2 클론 (예를 들어, 항-노치2 NRR 클론)에 유리하게 편향된 라이브러리를 원하는 경우에는 대상체를 노치2 (또는 노치 2 NRR)로 면역화하여 항체 반응을 생성하고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구 (PBL)를 회수하여 라이브러리를 구축한다. 바람직한 실시양태에서, 항-노치2 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 노치2 면역화가 노치2에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 갖는 (또한 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 마우스에서 항-노치2 항체 반응을 생성함으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에서 기술된다.
항-노치2 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농축물은 예를 들어 노치2 친화성 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 노치2에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 노치2-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 절차를 이용하여 얻을 수 있다.
별법적으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용함으로써, 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 예시를 제공하고, 또한 노치2가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축물이 혼입된 라이브러리에 대해, 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 줄기 세포를 수확한다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산이 관심 세포로부터 회수되어, 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리에 이어서 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기술된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머로의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 원하는 DNA가 수득될 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. 문헌 [Orlandi et al., (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기술된 바와 같이, 성숙형 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 후방향 프라이머 및 J-절편을 기초로 하는 전방향 프라이머로, V 유전자가 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 후방향 프라이머가 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기술된 바와 같이 리더(leader) 엑손을 기초로 할 수 있고, 전방향 프라이머가 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기술된 바와 같이 불변 영역을 기초로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al., (1989)] 또는 [Sastry et al., (1989)]에 기술된 바와 같이 축퇴성(degeneracy)이 프라이머에 혼입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 설명된 바와 같이 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 설명된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA의 발현 벡터 내로의 클로닝을 위해, 문헌 [Orlandi et al., (1989)]에 기술된 바와 같이 한쪽 말단에서 태그로서 PCR 프라이머 내에, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기술된 바와 같이 태그가 부착된 프라이머로의 추가적인 PCR 증폭에 의해, 희귀한 제한 부위가 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되어 있으며 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고되어 있음); 이러한 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 입체구조 포함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다. 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기술된 바와 같이 모든 서열 다양성이 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점이 맞춰진 VH 레퍼토리가 또한 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이를 기초로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭에 이어서, 배선 V-유전자 절편이 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 서로 다양한 방식으로 조합하여 구축할 수 있다. 각 레퍼토리를 다양한 벡터내에서 제조하고, 벡터를 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 재조합적 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 바와 같은 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합할 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 이. 콜라이 형질전환 효율로 인한 라이브러리 크기의 한계를 극복하기 위해 Fab 절편의 2쇄 속성을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리를 하나는 파지미드에서, 다른 하나는 파지 벡터에서 서로 달리 클로닝한다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합하여 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 개수로만 한정된다 (약 1012 클론). 양 벡터는 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에서 재조합되어 파지 비리온 내에 공동패키징되도록 하는 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이러한 거대 라이브러리는 양호한 친화도 (Kd -1가 약 10-8 M)를 갖는 다양한 항체를 대량으로 제공한다.
별법적으로, 레퍼토리들은 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기술된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리된 후 클로닝될 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성시키는데 PCR 어셈블리가 또한 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합시킨 후, 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하는데 "세포내 PCR 어셈블리"가 사용된다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 친화성이 중등도일 수 있지만 (Kd -1이 약 106 내지 107 M-1), 문헌 [Winter et al., (1994), 상기 문헌]에 기술된 바와 같이 제2 라이브러리의 구축 및 이로부터의 재선별에 의해 시험관 내에서 친화성 성숙이 또한 모방될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 에러 경향이 있는(error-prone) 폴리머라제 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관 내에서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가적으로, 예를 들어 관심 CDR에 스패닝된 무작위 서열을 보유하는 프라이머로의 PCR을 사용하여, 선별된 개별적인 Fv 클론에서 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화성이 더 높은 클론을 스크리닝함으로써 친화성 성숙이 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에 이뮤노글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 또 다른 효과적인 접근법은, 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 여러 회의 쇄 재셔플링(reshuffling)으로 보다 높은 친화성에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화성이 약 10-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, 노치2 (또는 노치2 NRR)는 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용하거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현시키거나, 세포 분류에서 사용하거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합하거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용할 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건하에 고정된 노치2와 접촉시킨다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선별된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산으로, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리로, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차에 따른 노치2 항원 경쟁으로 용출시킨다. 단일 라운드의 선별로 파지가 20 내지 1,000 배 강화될 수 있다. 또한, 강화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가적인 선별 라운드에 적용될 수 있다.
선별 효율은 세정 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지 여부를 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화성)의 항체는 단시간 세정, 다가 파지 디스플레이 및 고체상 내의 항원의 높은 코팅 밀도를 사용함으로써 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 장려한다. 느린 해리 동역학 (및 양호한 결합 친화성)의 항체의 선별은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기술된 바와 같은 1가 파지 디스플레이 및 장시간 세정, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기술된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.
노치2에 대한 상이한 친화성, 심지어 근소하게 상이한 친화성을 갖는 파지 항체 사이에서 선택할 수도 있다. 그러나, 선별된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 일부 친화성 성숙 기술에서 수행된 바와 같음)는 항원에 가장 강하게 결합하고, 몇몇은 보다 고친화성을 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. 노치2를 제한하여, 드문 고친화성 파지를 경쟁시켜 선별할 수 있다. 보다 고친화성의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오티닐화된 노치2와 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오티닐화된 노치2는 노치2에 대한 표적 몰 친화성 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 그후, 고친화성-결합 파지가 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이같은 "평형 포획"은 친화성이 더 낮은 과량의 파지로부터 친화성이 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 이들의 결합 친화성에 따라 선별되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세정하는데 사용된 조건이 해리 동역학을 기초로 식별하도록 또한 조작될 수 있다.
항-노치2 클론은 활성을 기초로 선별할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본래 노치2를 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 항-노치2 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 노치2 리간드와 노치2 사이의 결합을 차단하지만 노치2 리간드와 제2 단백질 사이의 결합을 차단하지 않는 항-노치2 항체를 제공한다. 그러한 항-노치2 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 설명된 파지 라이브러리로부터 항-노치2 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 노치2 및 제2 단백질을 선별하고; (3) 항-노치2 파지 클론을 고정된 노치2에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정자와 겹치거나 공유하는 노치2-결합 결정자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용출시킴으로써 선택할 수 있다. 임의로, 본원에 기술된 선별 절차를 1회 이상 반복함으로써 원하는 차단/비-차단 특성을 가진 클론을 추가로 강화시킬 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 원하는 모노클로날 항체의 합성물을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 고찰 논문에는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151 (1992)]이 포함된다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]으로부터 얻을 수 있음)과 조합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소형 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이같은 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 다른 동물종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 기재된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 인간 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-노치2 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어 하이브리도마 클론에서 유래된 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형될 수도 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결시켜 하이브리도마 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA를 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
3. 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
항체는 재조합 방법을 사용하여 생성할 수도 있다. 예를 들어, 항-노치2 항체를 재조합 생성하기 위해, 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 상기 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 일반적으로 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
a) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비의 경우에는, 천연 신호 서열을 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함), 또는 산-포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현시에는, 포유동물 신호 서열 및 또한 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
b) 복제 기점
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 둘다 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 숙주 염색체 DNA와 상관없이 벡터를 복제할 수 있는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (전형적으로, SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
c) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 불리는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실러스(Bacilli)의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 계획에서 생존한다. 이러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별성 마커의 또 다른 예는 항체-코딩 핵산을 흡수하기에 적격한 세포를 확인시켜 줄 수 있는 것인데, 예를 들어 DHFR, 글루타민 신테타제 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 있다.
예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, DHFR 유전자를 기타 모든 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭시킨다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예컨대 ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.
별법적으로, GS 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 GS의 억제제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, GS 유전자를 기타 모든 공동-형질전환시킨 핵산과 함께 증폭시킨다. GS 선별/증폭 시스템을 상기 언급된 DHFR 선별/증폭 시스템과 병용해서 사용할 수 있다.
별법적으로, 관심 항체, 야생형 DHFR 유전자 및 또 다른 선별가능 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커에 대한 선별제, 예컨대 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다. [문헌 Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이후, 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 병변의 존재는 트립토판 없이 성장하는 것으로 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법적으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 K. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되어 있다. 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시된 바 있다. 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].
d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25개 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70개 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 존재한다. 모든 이러한 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 글리콜분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련이 있는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 등의 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용가능하여야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득하였다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득하였다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 별법적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로 사용할 수 있다.
e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이것의 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100 내지 270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터 역시 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 이에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
g) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터 내 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스, 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 예를 들어 치료용 항체를 그 자체만으로도 종양 세포 파괴에 있어서 유효한 세포독성제 (예를 들어 독소)와 접합시킨 경우에 박테리아에서 생성시킬 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 더 길다. 이. 콜라이 내에서의 생성은 보다 신속하고 보다 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 설명하고 있는 U.S. 5,648,237 (Carter 등), U.S. 5,789,199 (Joly 등), 및 U.S. 5,840,523 (Simmons 등)을 참고한다. 또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후, 항체를 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리시킬 수 있고, 예를 들어 이소형에 따라서 단백질 A 또는 G 칼럼을 통하여 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포 내에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 빵 효모가 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 하기 예시하는 수많은 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하고 유용하다: 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 K. 락티스, K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니게르(A. niger). 치료용 단백질을 생성하기 위하여 효모 및 섬유상 진균을 사용하는 것에 관한 논의를 고찰하기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]을 참조한다.
글리코실화 경로를 "인간화"시킴으로써, 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 지닌 항체를 생성시키는 특정의 진균 및 효모 균주를 선별할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] (피키아 파스토리스에서의 글리코실화 경로의 인간화에 대해 기재함); 및 [Gerngross et al., 상기 문헌]을 참조한다.
글리코실화된 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체 (척추 동물 및 무척추 동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과일파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서의 바이러스로서 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 좀개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae)), 알팔파 (M. 트룬카튤라(M. truncatula)), 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 동 제6,040,498호, 동 제6,420,548호, 동 제7,125,978호, 및 동 제6,417,429호 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하는 플랜티바디(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 숙주로서 사용할 수 있고, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)] 참조); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)] 참조); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (베로-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)] 참조); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주에는 DHFR- CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정의 포유동물 숙주 세포주에 관한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268]을 참조한다.
숙주 세포를 상기 기재된 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.
h) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re.30,985에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
i) 항체의 정제
재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 세포 내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생성될 수도 있고, 또는 배지로 직접 분비될 수도 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하였다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 저해하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중의 하나이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절형 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그 소재)가 정제에 유용하다. 회수할 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 칼럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 이용될 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물로 pH 약 2.5 내지 4.5의 용출 완충액을 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
일반적으로, 조사, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하는 각종 방법론이 당해 분야에 널리 정립되고 있고, 이는 상기 언급된 방법론과 일치하고/하거나 관심있는 특별한 항체에 대해 당업자에게 인지되는 바와 같다.
C. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 (상호교환가능하게 "항체-약물 접합체", 또는 "ADC"로서 언급됨)를 제공한다.
면역접합체는, 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포의 성장 또는 증식을 사멸 또는 억제하는 약물의 국부 전달을 위해 사용되어 왔다 (문헌 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]; [Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146]; [Payne, G. (2003) i 3:207-212]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 제4,975,278호). 면역접합체는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 내부의 세포내 축적을 허용하고, 여기서 이들 비접합된 약물 물질의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506]). 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두가 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87]). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (문헌 [Rowland et al., (1986) 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al., (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메카니즘에 의한 세포독성 효과에 영향을 줄 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이 되거나 활성이 감소되는 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙 티욱세탄, 비오겐(Biogen)/이덱(Idec))은 티오우레아 링커-킬레이트화제에 의해 결합된, 정상 및 악성 B 림프구의 표면에서 발견되는 CD20 항원에 대해 지시된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 111In 또는 90Y 방사성동위원소로 이루어진 항체-방사성 동위원소 접합체이다 (문헌 [Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al., (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]). 제발린은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 활성을 갖지만, 투여는 대부분의 환자에서 중증 및 장기 혈구감소증을 일으킨다. 칼리케아미신에 연결된 huCD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신, 와이어쓰 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병 치료용으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 제4970198호; 동 제5079233호; 동 제5585089호; 동 제5606040호; 동 제5693762호; 동 제5739116호; 동 제5767285호; 동 제5773001호). 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.)) (디술피드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체-약물 접합체)은 CanAg을 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 및 기타 암의 치료를 위해 II 상 시험이 진행되고 있다. MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), 비지엘 바이올로직스(BZL Biologies), 이뮤노겐, 인크.) (메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체-약물 접합체)는 전립선 종양의 잠재적인 치료를 위해 개발되고 있다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)이 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스(Lewis) Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적)에 접합되었고 (문헌 [Doronina et al., (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784]), 치료용으로 개발 중이다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 항체 및 화학치료제 또는 다른 독소를 포함한다. 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 본원에서 설명된다 (예를 들어, 상기와 같이). 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 방사능접합된 항체의 생성을 위한 다양한 방사선핵종이 이용가능하다. 이것의 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.
1. 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 이후, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 발견되었다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호, 동 제4,248,870호, 동 제4,256,746호, 동 제4,260,608호, 동 제4,265,814호, 동 제4,294,757호, 동 제4,307,016호, 동 제4,308,268호, 동 제4,308,269호, 동 제4,309,428호, 동 제4,313,946호, 동 제4,315,929호, 동 제4,317,821호, 동 제4,322,348호, 동 제4,331,598호, 동 제4,361,650호, 동 제4,364,866호, 동 제4,424,219호, 동 제4,450,254호, 동 제4,362,663호 및 동 제4,371,533호에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 또는 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 이들의 치료 용도는 예를 들어 그 개시내용이 본원에 참고로 명백하게 포함되는 미국 특허 제5,208,020호; 동 제5,416,064호; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 상기 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타냈다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 쥐 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 쥐 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포당 3x105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호를 참조한다 (그 개시 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함됨). 항체 분자 당 평균 3개 또는 4개로 접합된 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증진시키는 효능을 나타냈지만, 독소/항체 분자 1개일지라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증진시킬 것이라 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지의 기술에 의해 합성될 수도 있고 천연 공급원으로부터 단리될 수도 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비-특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 그 개시 내용이 본원에 분명하게 참고로 포함되는 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 0 425 235 B1; 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 및 미국 특허 출원 공개공보 제US 2005/016993 A1에 개시된 것을 포함하는, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 많은 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 US 2005/016993 A1에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 연결기는 상기 언급된 특허에 개시된 바와 같이 디술피드기, 티오에테르기, 산 불안정성 기, 광 불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다. 추가의 연결기는 본원에 기재되고 예시되어 있다.
항체 및 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 2기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 디술피드 연결을 제공하기 위해 특히 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]), 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결부는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
2. 아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 예를 들어 아우리스타틴 (미국 특허 제5635483호; 동 제5780588호)에 접합된 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분할을 방해하고 (문헌 [Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 활성 (US 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 지닌 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 잔기는 펩티드성 약물 잔기의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 그 개시내용의 전문이 분명하게 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands")에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기재의 약물 잔기는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합 형성으로 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder 및 K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조할 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 5,635,483; US 5,780,588; 문헌 [Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 2004년 11월 5일에 출원된 미국 연속 출원 제10/983,340호의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" (예를 들어, 링커, 및 링커에 접합된 모노메틸발린 화합물, 예를 들어 MMAE 및 MMAF의 제조 방법을 개시함)을 참고한다.
3. 칼리케아미신
다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 부류의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단부를 생성할 수 있다. 칼리케아미신 부류의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 제5,712,374호, 동 제5,714,586호, 동 제5,739,116호, 동 제5,767,285호, 동 제5,770,701호, 동 제5,770,710호, 동 제5,773,001호, 동 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니(American Cyanamid Company))을 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1을 포함하고 이로 제한되지 않는다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
4. 다른 세포독성제
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양 물질은 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 동 제5,770,710호에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)을 포함한다.
사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위해서, 항체는 높은 방사능의 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 (spin) 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사능 표지 또는 다른 표지를 공지의 방식으로 접합체 내에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수도 있고, 또는 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수도 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57])을 이용하여 요오드-123을 도입할 수 있다. 문헌 [Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광 불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
화합물은 상업적으로 이용가능한 (예를 들어 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드)로부터) 다음 가교결합제 시약을 사용하여 제조된 ADC를 명백히 고려하고 이로 제한되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트). 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 467-498 페이지를 참조한다.
5. 항체 약물 접합체의 제조
항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 항체당 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 접합된다. 화학식 I의 ADC는 다음을 포함하는, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로를 통해 제조될 수 있다: (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 D-L을 형성시킨 후, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 방법. ADC를 제조하는 추가의 방법은 본원에 기재되어 있다.
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I
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분에는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")가 포함된다. 부가적인 링커 성분이 당업계에 공지되어 있고, 일부는 본원에서 기재된다. 또한, 2004년 11월 5일 출원된 미국 연속 출원 제10/983,340의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"을 참조하고, 그 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연적으로 발생하는 것들 및 또한 소수의 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이들의 선택도 측면에서 디자인되고 최적화될 수 있다.
항체상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 당 히드록실기 또는 아미노기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 처리를 통해 항체를 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵기를 형성할 것이다. 리신을 2-이미노티올란 (트라우트 시약)과 반응시켜서 아민을 티올로 전환시킴으로써 추가의 친핵성 기를 항체에 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그보다 많은 수의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편)에 도입될 수 있다.
항체 약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위한 항체의 변형에 의해 생산될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당을 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜서 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 염기 기는 안정적인 연결부를 형성할 수도 있고, 또는 예를 들어 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정적인 아민 연결부를 형성할 수도 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤)기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (헤르만슨, 바이오컨쥬케이트 테크닉스(Hermanson, Bioconjugate Techniques)). 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 첫번째 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; 미국 5362852). 그러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵기와 반응할 수 있다.
유사하게, 약물 모이어티 상의 친핵기는 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
별법적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 접합체의 2개 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
D. 방법
1. 진단 방법 및 검출 방법
한 측면에서, 본 발명의 항체는 생물학적 샘플에서 노치2의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 암성 조직을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중 노치2의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 노치2에 대한 항-노치2 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 항-노치2 항체 (예를 들어, 항-노치2 NRR 항체)와 접촉시키고, 항-노치2 항체와 노치2 사이에 복합체가 형성되는지 검출하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 노치2의 증가된 발현과 관련된 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 시험 세포를 항-노치2 항체와 접촉시키고; 노치2에 대한 항-노치2 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에 의한 노치2의 발현 수준을 (정량적으로 또는 정성적으로) 판단하고; 시험 세포에 의한 노치2의 발현 수준을 대조군 세포 (예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직에서 기원하는 정상 세포, 또는 상기 정상 세포와 대등한 수준으로, 또는 다중 대조군 세포 중에서의 발현의 평균 수준으로 노치2를 발현하는 세포)에 의한 노치2의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 대조군 세포에 비해 시험 세포에 의한 노치2의 더 높은 발현 수준이 노치2의 증가된 발현과 관련된 장애의 존재를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 시험 세포는 노치2의 증가된 발현과 관련된 장애가 있는 것으로 의심되는 개체로부터 수득하였다. 일부 실시양태에서, 상기 장애는 세포 증식성 장애, 예컨대 암 또는 종양이다.
본 발명의 항체를 이용하여 진단할 수 있는 예시적 장애에는 암, 예를 들어 B-세포 악성종양, 흑색종, T-세포 악성종양 (예를 들어, T-ALL), 유방암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암 및 췌장암이 포함된다.
특정의 다른 방법을 이용하여 노치2에 대한 항체의 결합을 검출할 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 잘 공지된 항원 결합 검정, 예를 들어 웨스턴 블롯, 방사면역검정, ELISA (효소 연결된 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정, 및 면역조직화학 (IHC)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 항체를 표지한다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예를 들어, 형광, 발색, 전자 밀집 (electron-dense), 화학발광, 및 방사성 표지), 및 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 댄실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예를 들어 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 항체는 불용성 매트릭스 상에 고정된다. 고정은 용액 중에 유리된 상태로 남아 있는 임의의 노치2로부터 항-노치2 항체를 분리하는 것을 수반할 수 있다. 이것은 통상적으로 검정 절차 전에 항-노치2 항체의 불용화에 의해, 수불용성 매트릭스 또는 표면에 대한 흡착에 의해 (U.S. 3,720,760 (Bennich 등)), 또는 공유 커플링 (예를 들어, 글루타르알데히드 가교결합 사용)에 의해, 또는 예를 들어 면역침전에 의해 항-노치2 항체와 노치2 사이의 복합체 형성 후에 항-노치2 항체의 불용화에 의해 달성된다.
진단 또는 검출에 대한 상기 실시양태 중 임의의 것은 항-노치2 항체 대신 또는 이것 이외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
2. 치료 방법
본 발명의 항체는, 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 노치2 활성, 즉 노치2 신호전달을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 노치2에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 세포를 본 발명의 항-노치2 NRR 항체에 노출시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 암 세포, 예를 들어 암성 B-세포 또는 흑색종 세포이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-노치2 NRR 항체는 노치2 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있고, 이 방법은 노치2를 본 발명의 항-노치2 NRR 항체에 노출시켜 노치2 활성을 억제하는 것을 포함한다.
본 발명의 항-노치2 NRR 항체는, 예를 들어 노치2의 발현 및/또는 활성과 관련된 장애, 예를 들어 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애 또는 노치2의 발현 또는 활성이 발병 상태에 기여하는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. "노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애"란 노치2 발현 또는 활성이 정상 보다 현저하게 높은 장애를 지칭한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 암, 예를 들어, B-세포 악성종양, 흑색종, T-세포 악성종양 (예를 들어, T-ALL), 유방암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암 및 췌장암을 치료 또는 예방하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 항-노치2 NRR 항체는 암, 예컨대 유방암, B-세포 악성종양 또는 흑색종을 치료하는데 사용된다.
추가 측면에서, 본 발명의 항체는 암, 특히 암 줄기 세포를 함유하는 충실성 종양을 치료 또는 예방하는데 사용된다. 암 줄기 세포는 증식되어 추가적 암 줄기 세포 뿐만 아니라 다른 종양 세포 집단을 야기할 수 있다. 문헌 [Al-Hajj et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 100: 3983-3988 (2003)]을 참조한다. 암 줄기 세포는 암의 재발 및 약물 요법에 대한 암의 내성에 기여하는 것으로 여겨된다. 노치 수용체는 암 줄기 세포 마커로서, 그리고 충실성 종양의 형성 및 재발과 관련이 있는 암 줄기 세포를 제거하기 위한 표적으로서 확인되어 있다. WO 2008/091641을 참조한다. 그와 같은 충실성 종양에는 유방암, 결장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 두경부암, 직장암 및 결장직장암이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 암 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명의 항체, 및 이하에서 제공하는 바와 같은 적어도 하나의 부가적인 치료제를 임의로 포함하는 제약 제제를 유효량 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 적어도 하나의 부가적인 치료제 및/또는 아주반트와 공동투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-노치1 항체 (예를 들어, 항-노치1 NRR 항체)를 그러한 항-노치1 항체에 의해 달리 유도되는 변경된 장 세포 분화를 억제 또는 감소시키는 부가적인 치료제와 함께 투여한다. 특정 실시양태에서, 부가적인 치료제는 덱사메타손 또는 타목시펜이다. 그러한 조합 요법은, 예를 들어 종양-관련 혈관신생을 비롯한 혈관신생 장애 및 암을 치료하는데 유용할 것이다. 특정 실시양태에서, 항-노치2 항체 (예를 들어, 항-노치2 NRR 항체)는 부가적인 치료제, 예를 들어 화학요법제와 함께 투여된다. 그러한 조합 요법은 암, 예컨대 B-세포 악성종양 및 흑색종을 치료하는데 유용할 것이다.
상기 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함된다), 및 개별 투여를 포함하고, 개별 투여시에, 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 방사선 요법과 조합될 수도 있다.
한 측면에서, 적어도 일부의 본 발명의 항체는 인간 이외의 종으로부터의 노치2에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 내인성 또는 재조합 노치2를 발현하는 포유동물 세포 배양물, 인간, 또는 본 발명의 항체와 상호작용하는 노치2를 갖는 다른 포유동물 (예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 명주원숭이, 시노몰구스 및 레서스 원숭이, 돼지, 래트 또는 마우스)에서 노치2와 결합시키는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 증가된 노치2 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 앓고 있는 개체에게 항체를 투여함으로써 개체 내 노치2에 결합시키는 것을 포함하는, 상기 개체에서 노치2를 결합시키는 방법에 사용된다. 한 실시양태에서, 노치2는 인간 노치2이고, 개체는 인간 개체이다. 다르게는, 개체는 본 발명의 항체가 결합하는 노치2를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 개체는 노치2가 도입된 (예를 들어, 노치2의 투여에 의해 또는 노치2를 코딩하는 형질전환유전자의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다.
본 발명의 항체는 치료 목적으로 인간에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학적 목적을 위해서 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 상기 항체가 상호 작용하는 노치2를 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지, 래트 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 동물 모델과 관련하여, 이같은 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어 투여량 및 투여의 경시적 과정을 테스트하는데) 유용할 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제 또는 보조제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료를 위해 필요하다면, 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항체는 특히 항체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여하는 것이 적합하다. 용량은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 간단한지 또는 만성인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해서 수행될 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 위치는 항체의 제조 및 투여에 있어서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자일 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 결합 표적이 위치하는 세포에 도입되도록 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 내부체로서 세포내에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "내부체"는 예를 들어 문헌 [Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997)]; [Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)]; 미국 특허 제6,004,940호 및 동 제6,329,173호; 미국 특허 출원 공개공보 제2003/0104402호, 및 PCT 공개공보 제WO2003/077945호에 기재된 바와 같이, 세포내에서 발현되고 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 또한, 예를 들어 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 관한, 1996년 3월 14일에 공개된 WO96/07321을 참조한다.
내부체의 세포내 발현은 표적 세포로의 목적하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 (항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자에 정상적으로 회합되어 있는 야생형 리더 서열 및 분비 신호가 결여된 것)을 도입하는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 모든 또는 일부의 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 표적 세포에 전달하여 하나 이상의 내부체를 발현시킬 수 있고, 이는 세포내 표적 폴리펩티드에 결합하여 표적 폴레펩티드의 활성을 조정할 수 있다. 핵산을 세포에 도입하는 임의의 표준 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 미세주사, 탄도 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀, 및 관심 핵산을 운반하는 레트로바이러스성, 아데노바이러스성, 아데노-관련 바이러스성 및 우두 벡터에 의한 형질감염이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 환자의 세포에 생체내적 방법 및 생체외적 방법으로 도입할 수 있다. 생체내 전달의 일례에서, 핵산을 환자에, 예를 들어 치료적 개입이 요구되는 부위에 직접 주사한다. 생체내 전달의 추가의 예에서, 바이러스성 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 제I형 단순 포진 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스)에 의한 형질감염 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 이용하여 핵산을 세포에 도입한다. 특정 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 고찰을 위해, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)], 및 WO 93/25673 및 거기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 생체외 치료의 예에서는, 환자의 세포를 제거하고, 단리된 세포에 핵산을 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접적으로, 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화하여 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 동 제5,283,187호 참조). 핵산의 생체외 전달을 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스성 벡터이다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 내재화하는 방법이 제공된다. 항체는 세포 내로의 항체의 전달을 강화하는 특정 특성을 지닐 수 있거나, 또는 이같은 특성을 지니도록 변형될 수 있다. 이를 달성하기 위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포내로의 그의 흡수를 용이하게 하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,703,019호 참조). 리포펙션 또는 리포솜을 또한 사용하여 항체를 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소형 억제성 단편이 유리하다. 예를 들어 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 그러한 펩티드는 화학적으로 합성하고/하거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]을 참조한다.
표적 세포 내로의 항체의 진입이 당업계에 공지된 방법에 의해 강화될 수 있다. 예를 들어, 특정 서열, 예컨대 HIV Tat 또는 안테나페디아(Antennapedia) 호메오도메인(homeodomain) 단백질이 세포막을 가로지르는 이종성 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329]을 참조한다.
항체의 결합 표적이 뇌에 위치한 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 항체를 제공한다. 물리적 방법, 지질-기반 방법, 줄기 세포-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 수송 분자에 대한 당업계에 공지된 몇몇 접근법이 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 물리적 방법에는, 혈액-뇌 장벽을 완전히 포위하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 포위 방법에는 뇌로의 직접 주사법 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 세포간 주입/전달-강화 전달법 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내 전달 장치 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 길포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical)의 글리아델 웨이퍼즈(Gliadel Wafers)™가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 장벽 내 구멍 생성 방법에는 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2002/0038086호 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)]), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어, 미국 특허 제5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호 및 제5,686,416호 참조), 및 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의한, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2003/0083299호 참조)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 지질-기반 방법에는, 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피세포 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링되는 리포좀에 항체를 봉입시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제20020025313호 참조), 및 저-밀도 리포단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제20040204354호 참조) 또는 아포리포단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제20040131692호 참조)로 항체를 코팅하는 것이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 줄기 세포-기반 방법은 신경 전구 세포 (NPC)가 관심의 대상이 되는 항체를 발현하도록 유전자 조작한 다음, 치료할 개체의 뇌에 줄기 세포를 이식하는 것을 수반하였다. 2005년 12월 15자 온라인판 문헌 [Behrstock et al., (2005) Gene Ther.] (신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전자 조작된 NPC는 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식 시, 파킨슨 질환의 증상을 감소시킴을 보고함)을 참조한다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법에는 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제2002/0065259호, 제2003/0162695호 및 제2005/0124533호 참조); 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제2005/0089473호 참조); ABC 약물 수송체의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제2003/0073713호 참조); 트랜스페린에 의한 항체 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제2003/0129186호 참조); 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 제5,004,697호 참조)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 우수 의료 실무와 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개개의 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의료 전문인에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로, 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합으로 사용될 때)은 치료될 질병의 종류, 항체의 종류, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 따라 결정될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 종류 및 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 분자가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보이다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 큰 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 다음, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시되는 용량 섭생은 항체 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량을 투여한 다음, 매주 항체 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정법에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 치료 방법은 항-노치2 항체 대신 또는 이것 이외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
3. 검정
본 발명의 항-노치2 NRR 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
a) 활성 검정
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-노치2 항체 (예를 들어, 항-노치2 NRR 항체)를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 노치2 활성, 예를 들어 노치2 신호전달의 억제 또는 감소를 포함할 수 있다. 또한, 생체내에서 및/또는 시험관내에서 상기 생물학적 활성을 갖는 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-노치2 NRR 항체는 변연부 B 세포의 생성을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 예시적 검정을 실시예에 제공한다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 노치2 신호전달에 반응하는 리포터 유전자의 발현을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 예시적 검정을 실시예에 제공한다.
b) 결합 검정 및 기타 검정
한 측면에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 사용하여 본 발명의 항체와 경쟁하는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)를 확인한다. 한 실시양태에서, 항체는 노치2에 대한 결합에 대해 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 또는 항체 D-3과 경쟁한다. 그러한 실시양태에서, 경쟁 항체는 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 또는 항체 D-3이 결합하는 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 경쟁 항체는 실시예 B(5)에 기재한 바와 같이 항-NRR1이 결합하는 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체구조 에피토프), 즉 노치1 NRR의 LNR-A, LNR-B 및 HD-C 도메인을 포함하는 에피토프에 결합한다. 예시적인 경쟁 검정으로는 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]에서 제공되는 것과 같은 일상적인 검정이 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세는 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다. 각각 다른 것의 결합을 50％ 이상 차단하는 경우 두 항체는 "동일한 에피토프에 결합하는 것"이라 지칭된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 노치2 NRR을 노치2 NRR에 결합하는 1차 표지된 항체 (예를 들어, 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 또는 항체 D-3) 및 노치2 NRR에의 결합에 대해 1차 항체와 경쟁하는 능력이 시험될 2차 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 2차 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 1차 표지된 항체를 포함하고 2차 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 고정된 노치2 NRR을 인큐베이션한다. 노치2 NRR에 대한 1차 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 인큐베이션한 후, 과잉의 비결합 항체를 제거하고, 고정된 노치2 NRR과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 노치2 NRR과 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이것은 2차 항체가 노치2 NRR에의 결합에 대해 1차 항체와 경쟁함을 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 일련의 검정에 의해 추가로 특성화될 수 있다.
임의의 상기 검정은 항-노치2 NRR 항체 대신 또는 이것에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
E. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서는, 상기 언급된 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조 용품은 용기, 및 용기상에 있거나 그와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는, 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 단독 또는 또 다른 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 봉지 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택 병태를 치료하는 데 사용됨을 표시해준다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체 또는 면역접합체가 포함된 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제가 포함된 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제품은, 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 표시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 용품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제시된 일반적인 설명을 기초로 하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
A. 재료 및 방법
1. 항-노치2 NRR 항체의 생성
항-노치2 NRR 항체를 확인하기 위한 라이브러리 분류 및 스크리닝
선별된 상보성 결정 영역 (H1, H2, H3, L3)에서 인간 IgG 레퍼토리의 천연적 다양성을 모방하는 합성적 다양성을 갖는 인간 파지 항체 라이브러리를 사용하여 패닝하였다. Fab 단편이 M13 박테리오파지 입자의 표면 상에 2가로서 디스플레이되었다. (문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073-1093 (2004)] 참조.) 노치2 NRR 단편은 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템 또는 293T 세포에 의해 에피토프 태그 (플래그 또는 6xHis)에 융합된 분비 단백질로서 발현되었고, 이것은 친화성 크로마토그래피에 의해 90％를 초과하는 순도로 정제되고 광산란에 의해 응집이 결여된 것으로 시험되었다. 노치2 NRR 항원의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
눈크 96 웰 맥시소르프(Maxisorp) 면역플레이트를 표적 항원 (10 μg/ml) 으로 밤새 4℃에서 코팅하고, 파지 차단 완충액 PBST (포스페이트 완충 염수 (PBS) 및 1％ (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05％ (v/v) 트윈-20)으로 1 시간 동안 실온에서 차단하였다. 항체 파지 라이브러리 VH (예를 들어, 문헌 [Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004] 참조) 및 VH/VL (문헌 [Liang et al., J. Mol. Biol. 366: 815-829, 2007] 참조)를 항원 플레이트에 따로 첨가하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 항원 코팅된 플레이트를 PBT (0.05％ 트윈-20을 함유하는 PBS)로 10회 세척하고, 결합된 파지를 50 mM HCl 및 500 mM NaCl로 30 분 동안 용출시키고, 동 부피의 1 M 트리스 염기 (pH 7.5)로 중화시켰다. 회수한 파지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 후속 선별 라운드 동안, 항원 코팅된 플레이트와 항체 파지의 인큐베이션은 2 내지 3 시간으로 줄이고, 플레이트 세척의 엄격성은 점차 증가시켰다.
4 라운드의 패닝 이후에, 현저하게 풍부해진 것으로 관찰되었다. 각 VH 및 VH/VL 라이브러리 분류로부터 96 클론을 골라내어 이들이 인간 및 뮤린 노치2 NRR 둘 모두에 특이적으로 결합하는지 여부를 측정하였다. 이들 클론의 가변 영역을 PCR 서열분석하여 특유한 서열 클론을 확인하였다.
스폿 경쟁 ELISA에 의해 파지 항체의 친화성의 순위를 매겼다. 추가로, 경쟁 파지 결합 ELISA에 의해 파지 항체 IC50 값을 측정하였다. 인간 및 뮤린 노치2 NRR 둘 모두에 결합하는 특유한 파지 항체를 골라내어, 시험관내 세포 검정에서 평가하기 위해 전장 IgG에 대해 재개편시켰다.
개별 클론의 VL 및 VH 영역을 LPG3 및 LPG4 벡터로 각각 클로닝하고, 포유동물 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 칼럼을 정제하여 관심 클론을 IgG에 대해 재개편시켰다.
항체 D의 친화성 향상을 위한 구축물 라이브러리
파지미드 pW0703 (M13 박테리오파지의 표면 상에 1가 Fab를 디스플레이하는 파지미드 pV0350-2b로부터 유래됨 (문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004])은 친화성 성숙을 위한 VH/VL 라이브러리로부터 항체 D의 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 가변 도메인을 이식하기 위한 라이브러리 주형으로 작용하였다. 이어서, 라이브러리 주형의 CDR-L3에 종결 코돈을 혼입시켰다. 친화성 성숙을 위해, 야생형 뉴클레오티드에 우호적인 70-10-10-10의 염기 혼합물을 이용하는 오염된 올리고뉴클레오티드(poisoned oligonucleotide) 전략을 이용하여 선별된 위치에 대략 50％의 돌연변이율을 도입하는 약한 무작위화 전략을 사용하였다 (문헌 [Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)]). 구체적으로 CDR-L1의 위치 28-32, CDR-L2의 50 및 53-55, CDR-L3의 91-94 및 96, CDR-H1의 28-35, CDR-H2의 50-58, CDR-H3의 95-100의 잔기를 표적화하였다. 또한, 약하게-무작위화된 CDR 루프, L1/L2/L3, L3/H1/H2 및 L3/H3가 조합된 3개의 서로다른 라이브러리를 구축하였다.
친화성을 개선하기 위한 파지 분류 전략
친화성 개선 선별을 위해, 파지 라이브러리를 제1 라운드에 대해 플레이트 분류하고, 이어서 5 라운드의 용액 분류를 실시하였다. 라이브러리는 인간 및 뮤린 노치2 NRR에 대하여 개별적으로 분류하였다. 제1 라운드의 플레이트 분류에서, 3 라이브러리를 1％ BSA 및 0.05％ 트윈 20 중의 약 3 O.D./ml의 파지 주입을 이용하여 실온에서 2 시간 동안 표적 코팅된 플레이트 (눈크 맥시소르프 플레이트)에 대해 별개로 분류하였다. 다음 라운드의 용액 분류의 경우, 플레이트 분류의 제1 라운드로부터 전달된 1 O.D./ml 파지를 1％ 수퍼블록(Superblock) (피어스 바이오테크놀로지) 및 0.05％ 트윈20을 함유하는 100 ㎕ 완충액 중에서 50 nM의 비오티닐화된 표적 단백질 (농도는 모 클론 파지 IC50 값을 기초로 함)과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 1％ 수퍼블록으로 추가로 10 배 희석하고, 웰당 100 ㎕를, 실온에서 15분 동안 온화하게 진탕시키면서 뉴트라비딘-코팅된 웰 (5 ㎍/ml)에 적용하여 비오티닐화된 표적 결합 파지가 포획되게 하였다. 이어서, 상기 웰을 PBS-0.05％ 트윈 20으로 10회 세척하였다. 배경 결합을 측정하기 위해, 비오티닐화 되지 않은 표적과 함께 파지를 함유하는 대조군 웰을 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포획시켰다. 결합된 파지를 0.1 N HCl에 의해 20 분 동안 용출시키고, 1/10 부피의 1 M 트리스 (pH 11)로 중화시키고, 역가를 측정하고, 다음 라운드를 위해 전달하였다. 다음에, 선택 가혹도를 증가시키는 두가지 방법과 함께, 용액 분류를 4 라운드 더 수행하였다. 첫번째 방법은 비오티닐화된 표적 단백질 농도를 10 nM에서 0.5 nM으로 감소시키는 것에 의한 온-레이트 선택에 대한 것이고, 두번째 방법은 과량의 비-비오티닐화된 표적 단백질 (100 내지 500 배 더)을 첨가하여 실온에서 더 약한 결합자를 경쟁에서 탈락시키는 것에 의한 오프-레이트 선택에 대한 것이다. 또한, 파지 주입을 감소시켜 (0.1 내지 0.5 O.D/ml) 배경 파지 결합을 저하시켰다.
고 처리량 친화성 스크리닝 ELISA (단일 스팟 경쟁)
제6 라운드 분류로부터 콜로니를 가려내고, 96-웰 플레이트 (팔콘(Falcon))에서, 50 ㎍/ml의 카르베니실린 및 1E10/ml의 KO7을 함유하는 500 ㎕/웰의 2YT 배지 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 동일한 플레이트로부터, XL-1 감염된 모 파지의 콜로니를 대조군으로 가려내었다. 96-웰 눈크 맥시소르프 플레이트를 웰당 100 ㎕의 인간 및 뮤린 노치2 NRR 단백질 (1 ㎍/ml)로 PBS 중에서 4℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 별개로 코팅하였다. 플레이트를 1％ BSA 65 ㎕로 30분 동안 차단시키고, 1％ 트윈 20 40 ㎕로 추가 30분 동안 차단시켰다.
파지 상청액을 10 nM의 표적 단백질을 함유하거나 함유하지 않는 ELISA (효소 연결된 면역흡착 검정) 완충액 (0.5％ BSA, 0.05％ 트윈20을 포함하는 PBS)으로 1:5로 희석하여 총 부피가 100 ㎕가 되게 하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 F 플레이트 (눈크) 중에서 인큐베이션하였다. 표적 단백질을 함유하거나 함유하지 않는 75 ㎕의 혼합물을 표적 단백질 코팅된 플레이트와 나란히 옮겼다. 플레이트를 15분 동안 온화하게 진탕시켜 미결합 파지가 표적 단백질 코팅된 플레이트에 포획되게 하였다. 플레이트를 PBS-0.05％ 트윈 20으로 적어도 5회 세척하였다. ELISA 완충액 (1:5000) 중의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체를 첨가함으로써 결합을 정량화하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-0.05％ 트윈 20으로 적어도 5회 세척하였다. 다음에, 웰 당 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H2O2) (키르케가르트-페리 래버러토리즈(Kirkegaard­Perry Laboratories), 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 1 M 인산 (H3PO4) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 각 웰의 황색의 OD (광학 밀도)를 측정하였다. OD 감소율 (％)을 다음의 공식에 의해 계산하였다.
OD450nm 감소율 (％) = [(경쟁자 존재 웰의 OD450nm) / (경쟁자 부재 웰의 OD450nm)]*100
모 파지 웰 (100％)에 대한 OD450nm 감소율 (％) 비교에서, 인간 및 뮤린 표적 둘 모두에 대한 OD450nm 감소율 (％)이 50％보다 낮은 클론을 서열 분석을 위해 가려내었다. 파지 제조를 위해 특유의 클론을 선별하여 모 클론과 비교하는 것에 의해 인간 및 뮤린 노치2 NRR 둘 모두에 대한 결합 친화성 (파지 IC50)을 측정하였다. 친화성이 가장 향상된 클론을 인간 IgG1로 재구성하고, 포유동물 세포에서 발현시켰다.
항-노치2 NRR 항체 (비아코어)의 특징규명
비아코어™-3000 기기를 이용한 표면 플라즈몬 공명 (SRP)에 의해 항-노치2 NRR 항체의 결합 친화성을 측정하였다. 항-노치2 NRR 인간 IgG를 CM5 센서 칩 상에 코팅된 마우스 항-인간 IgG로 포획하여 대략 200 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 역학 측정을 위해, 인간 및 마우스 노치2 NRR의 2배 연속 희석물 (3.9 nM 내지 500 nM)을 PBT 완충액 (0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS)에 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 단순 1 대 1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)는 koff/kon의 비로 계산하였다.
2. 항-노치1 NRR 항체의 생성
특정 항-노치1 NRR 항체의 생성 및 특징규명에 대해서는 이전에 기술되었다. 미국 특허 출원 공개공보 제US 2009/0081238 A1호를 참조한다.
3. ELISA
흑색 벽의, 고 결합 플레이트 (그라이너(Greiner)) 내의 모든 4종의 노치 수용체로부터 플래그-태그된 NRR 단백질을 포획하기 위해 항-플래그 항체를 사용하였다. NRR 항체 및 E25 대조군 항체가 NRR 단백질에 결합되었고, PBS로 씻어내었다. 항-인간 (H+L) 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))에 접합된 알칼리성 포스파타제를 사용하여 결합된 항-NRR 및 E25를 검출하였다. 비결합된 2차 항체를 씻어내고, PNPP 기질 (피어스)로 AP를 검출하였다.
4. FACS
발현 플라스미드를 제작하였고, 이는 노치1 또는 노치2 세포외 도메인 및 막횡단 도메인이 N-말단 myc-태그된 것으로, 최소 CMV 즉시형 초기 프로모터의 상류의 테트라시클린 반응 요소 (TRE) 조건하에서 발현된다. 이러한 플라스미드로 형질감염된 플라스미드에서 TRE에 결합하고 이를 활성화하는 독시시클린의 존재하에 트랜스활성화 단백질을 발현하도록 조작된 CHO-K1 세포 (클론테크(Clonetech))를 안정적으로 형질감염시켰다. 세포를 1 mg/mL의 독시시클린 또는 비히클로 48 시간 동안 처리한 다음, 항-NRR, 항-myc (9E10, 밀리포어) 또는 E25 대조군 항체 및 염소 항-인간 알렉사 488 또는 알렉사 647 2차 항체 (인비트로겐)으로 염색하였다. 염색한 후에, 세포를 FACScalibur 기계 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로 가동시켜 15000 사건을 수집하고, 거리 게이트(range gate)를 도출하여 양성적 또는 음성적 염색 집단을 평가하였다.
5. 노치 리포터 검정
노치 1에 의해 안정적으로 형질감염되거나 다른 노치 수용체를 함유하는 플라스미드에 의해 일시적으로 형질감염된 NIH-3T3 세포를 노치-반응성 TP-1 (12X CSL) 반딧불이 루시페라제 수용체 및 구성적으로 활성인 레닐라 루시페라제 수용체 (pRL-CMV, 프로메가)로 공동형질감염시켜 형질감염 효율을 조절하였다. 6 시간 내지 밤새, 세포가 형질감염으로부터 회복되게 하였다. 항체 처리 및 리간드에 의해 안정적으로 형질감염된 NIH-3T3 세포를 사용하여 수용체 세포를 자극하였다. 20 시간 후에, 반딧불이 및 레닐라 루시페라제를 듀얼 글로(Dual Glo) 루시페라제 검정 시스템 (프로메가)으로 측정하였다. 형질감염 효율을 조절하기 위해 반딧불이 신호를 레닐라 신호로 나누어 각 조건에 대해 8개의 복제물을 분석하였다. 평균 및 표준 편차를 계산하고, 그 값을 리간드에 의해 형질감염되지 않은 NIH-3T3 세포에 의해 자극된 공동배양물에 대해 계산된 값에 대하여 표준화하였다.
6. 에피토프 맵핑
합성 노치1 및 노치2 NRR 서열을 NRR의 5개 도메인 사이의 연결지점 - LNR-A; LNR-B; LNR-C; HD-N; 및 HD-C - 에 특유의 제한 부위를 갖도록 설계하고, 블루 헤론 테크놀로지(Blue Heron Technology) (워싱턴주 보츠헬 소재)에 의해 제조하였다. 조작 제한 부위를 이용하여 2개의 합성 서열 사이의 다양한 도메인을 교환하여 키메라 NRR 단백질을 생성하였다. 키메라 클론을 변형된 pUC19 벡터에서 어셈블리하고, 발현을 위해 SEAP 함유 벡터, pCSC.AP로 옮겼다. 293T 세포를 형질감염시켜 AP-태그된 NRR 단백질을 생성시켰다. 72 시간 배양 후, 조건화된 배지를 수집하고, 원심분리에 의해 소거하고, 포스파-라이트 시스템(Phospha-Light System) (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 매사추세츠주 베드포드 소재)을 이용하여 AP 활성을 시험하였다. 각 샘플에서의 AP 활성을 표준화하고, ELISA를 행하여 α-NRR1 또는 α-NRR2가 키메라 NRR 단백질에 결합하는 능력을 시험하였다. ELISA는 다음과 같이 수행하였다: 96-웰 포맷 내의 플레이트 결합된 a-Fc 항체로 α-NRR1 또는 α-NRR2를 포획하고, 조건화된 배지와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하여 비결합 단백질을 제거하고, 포스파-라이트 시스템을 이용하여 포획된 단백질에 대해 AP 활성을 시험하였다. 도출된 AP 활성을 이용하여 각 α-NRR 항체가 특이적 키메라 단백질에 결합하는 능력을 정량화하고, 결합에 중요한 에피토프를 추론해내었다.
7. HUVEC 피브린 겔 비드 검정
HUVEC 세포를 앞서 기재된 바와 같이 (문헌 [Nakatsu et al., 2003]) 피브린 겔 비드 상에서 성장시켰다. 사이토덱스 3 비드 (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))를 2 ml EGM-2 배지 (클로네틱스(Clonetics)) 중에서 비드 당 350-400 개의 HUVEC로 코팅하였다. 약 200 개의 HUVEC 코팅된 비드를 12-웰 조직 배양 플레이트 중의 하나의 웰에서 피브린 응괴에 포매시켰다. 6×104 개의 디트로이트(Detroit) 551 섬유모세포를 응괴 및 5 ug/ml 항-NRR1, 5 ug/ml 항-DLL4, 1 uM DBZ, 또는 비히클 대조군을 함유하는 배지의 상부에 플레이팅하였다. 배지는 매 2일마다 교환하였다. 7일 내지 9일 후, 피브린 겔을 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 내피 세포를 검출용 FITC-접합된 2차 항체를 이용하여 항-CD31 (R&D 시스템즈(R&D Systems) AF806)로 염색시켰다.
8. 신생아 망막 생체내 검정
CD1 신생아에 10 mg/kg의 돼지풀 대조군 또는 20 mg/kg의 노치-1을 P1 및 P3에 복강내로 주사하였다. P5에 눈을 채취하고 4％ PFA로 고정시켰다. 망막을 절개해내고, 1 시간 동안 차단시킨 다음 (5％ BSA, 0.5％ 트리톤 X-100), 1 M 시트르산 나트륨으로 10 분간 처리하였다. 이어서, 망막을 비오티닐화된 이소렉틴 B4 (시그마) 및 Ki67 항체 (네오마커스(NeoMarkers))와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 망막을 세척하고, 1％ BSA, 0.5％ 트리톤 X-100 중의 스트렙타비딘 알렉사 488 및 염소 항-토끼 Cy3으로 염색하였다. 망막을 편평하게 실장하고, 형광현미경을 사용하여 영상화하였다.
9. 생체내 종양 연구
인간 종양 세포주 Calu-6 및 HM7을 10％ v/v FBS, 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-Gln 및 1 ㎍/ml 푼지존(Fungizone)™ (인비트로겐™, 캘리포니아주)로 보충된 햄의 F12, 저 글루코스 DMEM 1:1에서 성장시켰다. 세포를 95％ 공기/5％ CO2 분위기 하에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 마우스 이종이식 실험을 위해, 종양 세포를 1×108 또는 1×109 세포/ml의 농도로 현탁시키고, Balb-c 누드 마우스 (하를란 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley), 인디애나주 소재)의 등쪽 측면에 피하 주사하였다 (100 ㎕/마우스). 종양 부피가 400 mm3에 달하면, 집단을 무작위로 선별하여 (n = 10) 0 일 대조군으로 하였다. 나머지 마우스를 10 마리의 마우스 그룹으로 나누고, 파지 항체 항-노치1을 매주 2회 10 mg/kg의 용량으로 복강내 투여하였다. 이식된 종양을 기재된 바와 같이 가장 긴 축 및 수직 축에 따라 매주 2회 측정하였다. 종양을 측정한 날마다 각 마우스에 대해 종양 부피를 계산하고, 각 대조군 항체 (항-돼지풀), 항-VEGF 그룹으로부터의 종양 부피 평균을 JMPTM 통계 분석 시스템 (윈도우에 대해 버전 5.1; SAS 인스티튜트, 노스캐롤라이나주 캐리 소재)에서 수행되는 던넷(Dunnett)의 t 시험에 의해 P < 0.05의 수준에서 항-노치1-처리된 마우스의 종양 부피 평균과 비교하였다. 종양 부피가 2,000 mm3에 달하였을 때 마우스를 사망시켰다. 종양을 크라이오스탯으로 7 ㎛로 절편화하고, 아세톤으로 고정시키고, DAPI (인비트로겐), 햄스터 항-CD31 (세로테크, 인크.(Serotech, Inc.)) 및 항-햄스터 Cy3 2차 (잭슨 이뮤노랩스(Jackson Immunolabs))로 염색하였다. 슬라이드를 형광 실장 배지 (다코(Dako))에 실장하였다. 영상을 제이스 악시오스콥2(Zeiss Axioskop2) 현미경으로 확보하고, 이미지J에 의해 DAPI 염색 및 Cy3 염색 영역을 분석하였다. Cy3 염색을 DAPI 염색 영역으로 나누어 존재하는 세포의 개수를 표준화하고, 그 값을 항-돼지풀 처리된 종양에 대해 표준화하였다. 모든 동물 연구는 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인하는 프로토콜에 따라 수행하였다.
10. 변연부 B 세포 분석
12 주령의 Balb-c 마우스 (잭슨)에 주당 2회, 2주 동안 5 mg/kg의 항-gD, 항-NRR1 또는 항-NRR2로 복강내 주사하였다. 비장세포를 마우스로부터 단리하여, 앞서 기재된 바와 같이 FACS를 B220-PerCP, CD23-PE 및 CD21-FITC (BD 바이오사이언시즈)로 염색하였다 (문헌 [Saito, et al., Immunity, Vol. 18, 675-685, May 2003]).
11. 마우스 장 조직의 조직학 및 면역조직화학
6 그룹의 6 마리의 10 주령 C57BL/6 마우스 (잭슨)에 MCT를 이틀에 한번, DBZ를 이틀에 한번 30 umol/kg, 항-NRR1을 10, 2, 또는 0.4 mg/kg 또는 항-gD 대조군 (HSV-1)을 0, 2, 및 6 일째에 10 mg/kg, 또는 달리 나타낸 바와 같이 투여하였다. 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 마우스 소장 조직을 3 ㎛ 두께로 절편화하였다. 장 세포 유형의 조직화학적 확인은 알시안 블루를 이용하여 제조사 (폴리사이언티픽(PolyScientific))의 권유에 따라 수행하였다. 항-Ki67 염색을 위해, 절편을 표적 검색 용액 (S1700, DAKO)으로 전처리하고, 및 토끼 항-Ki67 (1:200, 클론 SP6, 네오마커스(Neomarkers))과 함께 인큐베이션하였다. 7.5 μg/ml (벡터 랩스(Vector labs))의 2차 염소 항-토끼는 벡타스타틴 ABC 엘리트 키트(Vectastain ABC Elite Kit) (벡터 랩스)를 이용하여 검출하였다. Ki67 염색된 절편을 메이어(Mayer)의 해모톡실린으로 대비염색하였다. 항-리소자임 염색을 위해, CC1m 에피토프 회수 조건, OmniMap-토끼 검출 및 벤타나 해모톡실린 II를 이용하여 블루잉 대비염색하면서 절편을 디스커버리 XT 플랫폼 (벤타나 메디칼 시스템스, 인크.(Ventana Medical Systems, Inc.)) 상에서 프로세싱하였다. HES-1 염색을 위해, 항-래트 HES-1 (클론 NM1, MBL, 인터내셔널)에 이어 TSA-HRP하였다.
B. 결과
1. 노치1 및 노치2 음성 조절 영역을 특이적으로 표적화하는 합성 항체의 생성
인간 및 마우스에서 노치1 및 노치2 신호전달의 비의존적인 길항작용을 가능하게 하기 위해, 본 발명자들은 파지 디스플레이를 사용하여 다음과 같은 품질로 NRR을 표적화하고 합성 인간 항체를 선별하였다. 먼저, 각각의 항체가 그의 동족성 표적---노치1 또는 노치2---그러나 다른 노치 수용체는 아닌 것을 강력하게 억제하는지에 대해 선별하였다. 두번째로, 치료적 표적화를 가능하게 하기 위해, 인간 표적 서열에의 결합에 대해 항체를 선별하였다. 세번째로, 노치1 또는 노치2를 생체내에서 전신적으로 억제한 생물학적 결과를 확인하고 마우스 모델에서 이들 수용체의 기능을 연구하기 위해, 이종상동성 마우스 서열에의 결합에 대해 항체를 공동 선별하였다. 네번째로, 인간 항-항체 면역 반응을 회피하도록, 상보성 결정 영역을 인간 이뮤노글로불린 프레임워크에서 클로닝하였다.
이러한 접근법에 따라, 본 발명자들은 각각 목적하는 특성을 갖는 항-노치1 NRR 및 항-노치2 NRR 항체를 성공적으로 단리해내었다. 이들 항체는 다양한 노치 수용체, 예컨대 γ-세크레타제 억제제를 표적화하는 "광범위한-노치" 억제제 보다 더 나은 여러 이점을 갖는다. 이들 항체는 개별 노치 수용체를 구분하기 때문에, 이들은 개개의 수용체의 서로 다른 기능을 분석할 수 있다. 또한, 광범위한-노치 억제제는 노치1 및 노치2 둘 모두를 이중으로 억제함으로 인해 생체내에서 원치않는 부작용을 잠재적으로 나타내며, 따라서 노치1 또는 노치2에 대해 선택적인 항체는 치료 목적을 위해 보다 매력적인 후보가 될 수 있다. 상기한 접근법에 따라 단리한 항-노치1 NRR 및 항-노치2 NRR 항체를 이하에서 보다 상세하게 기술하고 그 특징을 규명한다:
항-노치 NRR1 항체의 단리 및 특징규명에 대해서는 미국 특허 출원 공개공보 제US 2009/0081238 A1호에서 논의되어 있다. 상기 출원에서 논의된 항체 중 하나인 "항체 A-2"는 그의 구조 및 특정 생물학적 활성에 대해 특징이 규명되어 있다. 상기 출원에서 논의된 특정 연구를 본원에서 재정리한다. 편의상, 미국 특허 출원 공개공보 제US 2009/0081238 A1호의 "항체 A-2"를 본원에서는 "항-NRR1"이라 지칭한다.
항-노치2 NRR 항체의 단리 및 특징규명에 대해서는 본원에서 기술한다. "항체 D"라 명명하는 항-노치2 NRR 항체를 단리해내었다. 상기 항체를 상기에서 기술한 바와 같이 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3으로 친화성 성숙시켰다. 도 1은 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열을 나타낸다. 도 2는 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 서열을 나타낸다. 도 3은 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 중쇄 가변 영역 서열을 나타낸다. 도 4는 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2, 및 항체 D-3의 경쇄 가변 영역 서열을 나타낸다. 편의상, 항체 D-3을 본원에서는 "항-NRR2"라 지칭한다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 이용한 결합 친화성 측정에 의해, 항-NRR1은 마우스 또는 인간 서열의 정제된 NRR1 단백질에 유사하고 높은 친화성 (Kd = 3 nM)으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 항-NRR2의 시험에서 NRR2 항원에 대해 유사한 친화성 (Kd = 5 nM)을 관찰하였다. 양 항체의 결합은 동족 수용체에 대해 매우 특이적인 것으로 보이고; SPR, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 비롯한 다양한 기술을 사용했을 때 항-NRR1 또는 항-NRR2에 대하여, 인간 또는 마우스의 어떤 다른 3종의 비표적화된 수용체 서열에 대한 결합도 검출되지 않았다 (도 9 및 데이터는 나타내지 않음). 예를 들어, ELISA 결과는 항-NRR1이 정제된 인간 및 마우스 노치1-NRR 단백질에 대략 0.1 μg/ml의 항체 농도에서 관찰된 최대값의 중간값으로 동일하게 결합되는 것으로 나타났다. 항-NRR1은, 인간 노치1-NRR 및 인간 노치2 NRR 서열이 45％ 동일함에도 불구하고 (도 18), 시험된 최고의 항체 농도에서도 정제된 인간 또는 마우스 노치2 NRR, 노치3-NRR 또는 노치4-NRR 단백질에 검출가능하게 결합하지 않았다 (도 9a, 좌측 패널). 본 발명자들은 항-NRR2에 대해서도, 노치2 NRR 단백질에는 특이적으로 결합하지만 다른 노치 수용체로부터의 NRR 단백질에는 특이적으로 결합하지 않는, 유사한 결과를 관찰하였다 (도 9a, 우측 패널).
항-NRR1 및 항-NRR2가 또한 세포의 표면 상에 발현된 전장 수용체에 특이적으로 결합하는지를 판단하기 위해, 본 발명자들은 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 이용하였다. 본 발명자들은 내생적으로 발현되는 노치 수용체 (특히 노치2, 이는 K1-CHO 세포에 의해 발현됨)로부터 트랜스제닉 노치 수용체를 구분하기 위해, 각각 N-말단에 myc 에피토프 태그를 운반하는 노치1 또는 노치2에 대한 결합을 평가하였다. 형질감염되지 않고 남아있거나 (도 9b, 패널 1, 4, 7 및 10), myc-노치1에 의해 형질감염되거나 (도 9b, 패널 2, 5, 8 및 11) 또는 myc-노치2에 의해 형질감염된 (도 9b, 패널 3, 6, 9 및 12) K1-CHO 세포에서 수용체 발현을 유도해내었다. myc-양성 세포에 대한 항-NRR1의 결합이 myc-N1 세포에서 관찰되었지만 (도 9b, 패널 2), K1-CHO 모 세포에서는 관찰되지 않았고 (도 9b, 패널 1), 항-NRR1이 노치1에 특이적으로 결합했음을 보여주는 이후의 유도만이 관찰되었다 (도 9b, 패널 2 및 5 비교). 대조적으로, myc-N2 세포에서 myc-노치2 발현이 명백하게 유도되지만 (도 9b, 패널 3 및 6 비교), 항-NRR1은 myc-노치2에 결합하지 않았다 (도 9b, 패널 2 및 3 비교). 본 발명자들은 항-NRR2를 이용하여 유사한 분석을 수행하였지만 (도 9b, 패널 7-12), 이러한 분석은 유도 부재하에서의 myc-노치2의 누출 발현(leaky expression) (도 9b, 패널 6 및 12) 및 K1-CHO 세포주에서의 햄스터 노치2의 내인성 발현 (도 9b, 패널 7 및 10 내지 패널 1 및 4를 비교)으로 인해 복잡하였다. 그럼에도 불구하고, 항-NRR2은 유도 이후에 myc-노치2를 발현하는 세포에만 현저하게 결합하였고, 이는 노치2에 대한 특이적인 결합과 일치하였다 (도 9b, 패널 9 내지 패널 8 및 12 비교). 종합하면, 정제된 NRR 단백질 및 또한 전장 수용체의 세포 표면 발현을 이용한 본 발명자들의 발견 결과, 항-NRR1이 노치1-NRR1에는 특이적으로 결합하지만 노치2 NRR에는 그렇지 않고, 유사하게 항-NRR2는 노치2 NRR에는 특이적으로 결합하지만 노치1-NRR에는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 이러한 특이성은 하기 기술하는 수많은 구조적 및 기능적 연구에 의해 더욱 지지된다.
2. 시험관내 노치1 및 노치2 신호전달의 강력하고 특이적인 억제제로서 항-NRR1 및 항-NRR2의 기능
항-NRR 항체가 노치 신호전달에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 먼저 노치 리간드로서 Jag1, 또는 노치 수용체로서 노치1 (도 10a) 또는 노치2 (도 10b)를 발현하도록 조작된 NIH-3T3을 활용하는 공동배양 검정을 사용하였다. 강력한 노치 리포터 신호 (반딧불이 루시페라제)가 양 리간드- 및 수용체-발현 세포의 존재에 의존적이고 (도 10a 및 b, -Jag1 및 + Jag1 비교), 리포터 수준은 GSI (γ-세크레타제 억제제)가 포함될 경우 배경으로 감소되기 때문에 (도 10a 및 b, DMSO 및 DAPT 비교) 본 검정은 노치 신호전달을 정확하게 반영한다.
증가량의 항-NRR1이 노치1 세포에서의 신호전달을 억제하는데 더하여, 80 내지 400 ng/ml의 항체 농도에서 완전한 억제가 관찰되었다 (도 10a). 수많은 다른 항체가 노치1 이외의 항원에 대해 지시되는 것처럼 (데이터는 나타내지 않음), 대조군 인간 항체는 신호전달을 억제하는데 실패하였다 (도 10a, α-gD 및 α-NRR1 적정 비교). 이러한 억제 활성이 항-NRR1 결합을 반영하는지 여부를 추가로 시험하기 위해, 본 발명자들은 정제된 NRR1 항원의 첨가가 신호전달 세포 상에서 발현된 노치1에 결합하는 항체와 경쟁하면서 억제 농도 (80 ng/ml)의 항-NRR1 항체의 존재하에서 신호전달을 회복시키는지 여부를 확인하였다. NRR2 항원 (다른 검정에서 활성이며 적절히 폴딩되는 것으로 보임; 도 10b 참조)이 아닌 NRR1의 첨가는 신호전달을 대조군 수준으로 회복시켰다 (도 10a, 80 ng/ml α-NRR1 + NRR1 및 80 ng/ml α-NRR1 단독 및 80 ng/ml α-NRR1 + NRR2을 비교). 대조군으로서, NRR1 또는 NRR2 항원은 어떤 것도 대조군 항체를 함유하는 공동배양물에서 신호전달에 영향을 미치지 않았고, 이는 NRR 단편은 그 자체가 노치 신호전달에 직접적인 효과를 갖지 않음을 확인시켜준다 (도 10a, α-gD + NRR1 및 α-gD + NRR2). 항-NRR2 활성을 검정하기 위해 노치2 발현 세포를 사용한 경우, 본 발명자들은 노치2 신호전달의 항-NRR2 억제에 대해 유사한 결과를 관찰하였다 (도 10b). 양 항체는 모두 본 발명자들이 시험한 모든 노치 리간드, 즉 Jag1, Jag2, Dll1 및 Dll4를 통해 유도된 신호전달을 억제하였다 (도 16 및 데이터는 나타내지 않음). 종합하면, 이러한 결과들은 항-NRR1 및 항-NRR2가 각각 노치1 및 노치2로부터의 신호전달의 강력한 이원성 특이적 억제제임을 보여준다.
3. 항-NRR1은 T-ALL에서 발견된 돌연변이 수용체의 주요 클래스 둘 모두를 통한 신호전달을 억제한다
발암에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 보이는 노치 신호전달을 통한 한가지 메카니즘은 T-ALL에서의 노치1 신호전달의 돌연변이적 활성화를 통한 것이다. 특히, T-ALL에서의 노치1 활성화 돌연변이는 2가지의 넓은 카테고리로 분류된다: (1) PEST 도메인을 절단하여, ICD를 안정화하고 리간드-의존적 방식으로 신호전달을 증가시키는 것, 및 (2) NRR을 불안정화시켜, ADAM 절단을 가능하게 하고 리간드-비의존적 방식으로 신호전달을 자극하는 것. 항-NRR1이 이같은 돌연변이 수용체를 통한 신호전달을 차단할 수 있는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 공동배양 검정을 변형하여 노치1-WT (노치1 야생형), 노치1-△PEST (PEST 도메인이 결여된 노치1), 또는 노치1-L1594P (NRR의 이종이량체 (HD) 도메인에 L1594P 돌연변이를 운반하는 노치1)를 발현시켰다. 야생형 노치1 신호전달에서 관찰되는 바와 같이 (도 10c, 상부 패널), 항-NRR1은 노치1-△PEST 및 노치1-L1594P를 통해 리간드-의존적 및 -비의존적 신호전달을 완벽하게 억제하였다 (도 10c, 중간 및 하부 패널). 즉, 항-NRR1은 항체에 의해 표적화되는 동일한 도메인에 속하고 이를 불안정화시키는 L1594P 돌연변이를 비롯한 돌연변이 수용체 클래스 둘 모두를 통한 신호전달과 길항작용한다.
4. 항-NRR1 및 항-NRR2는 생체내에서 노치1 및 노치2의 강력하고 특이적인 억제제로서 기능한다
항-NRR1 및 항-NRR2가 생체내에서 수용체 특이적인 억제제로서 기능하는지 여부를 판단하기 위해, 본 발명자들은 항체가 어떻게 유전학적 기술이 노치1 또는 노치2에 대한 역할을 확립하는 세포 운명을 결정하는데 영향을 미치는지 조사하였다. 구체적으로, 미리 노치1 또는 노치2를 조건부 불활성화하여, 노치1이 림프 발생동안 T 대 B 세포 운명을 결정하는 열쇄인 반면, 노치2는 비장 변연부 B (MZB) 세포를 생성하는데 요구되는 것을 밝혀내었다. T 세포 발생에서의 노치1의 중요한 기능과 일치하게, 본 발명자들은 항-NRR1로 처리하였지만 항-NRR2로는 처리하지 않은 마우스에서 흉선 중량이 현저하게 감소된 것을 확인하였다 (도 11a 및 b). 마찬가지로, 항-NRR2가 아닌 항-NRR1이 흉선내 세포의 총 개수를 상당히 감소시키고 (도 11b), CD4+/CD8+ 이중-양성 T 세포의 생성을 거의 완전하게 억제하였다 (도 11c).
대조적으로, MZB 세포를 조사한 경우, 항체 효과가 역전되었다. 항-NRR2에 의한 처리는 MZB 세포를 거의 사멸시켰고 (대조군 값 6.61 +/- 0.25에 비해 0.97 +/- 0.45), 양성 대조군으로 제공된, 정제된 재조합 림포톡신-β 수용체 (LTβR)-Fc 융합 단백질 (3.48 +/- 0.06)에 비해 집단을 훨씬 더 상당히 감소시켰다 (도 11d). 항-NRR1은 항-gD 대조군 항체 (6.61 +/- 0.25; 도 11d)에 비해 MZB 집단을 현저하게 감소시키지 않기 때문에 (6.00 +/- 0.44), 이러한 억제 효과는 항-NRR2에 대해 특이적이었다. 종합하면, 이러한 생체내 연구는 양 항체가 모두 세포 운명 결정에 있어서 생물학적으로 현저한 변화를 유도할 수 있는, 그들 각자의 표적에 대한 강력한 억제제이며; 또한, 항-NRR1이 MZB 세포가 아닌 T의 생성에 영향을 미치는 반면 항-NRR2는 T 세포가 아닌 MZB의 생성에 영향을 미치기 때문에, 각 항체는 생체내에서 의도하는 표적에 대해 특이적으로 기능함을 보여준다.
5. 공결정 구조는 항-NRR1이 LNR 및 HD-C 도메인을 가교하며, 아마도 NRR과 "떨어져서" 입체구조를 안정화시키는 것으로 밝혀졌다.
항-NRR1 및 항-NRR2의 결합 친화성을 설명하고, 항체 길항제 활성에 대해 기계론적으로 통찰하기 위해, 본 발명자들은 일련의 키메라 NRR 단백질에 대한 양 항체의 결합을 시험하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 노치1 및 노치2 사이의 NRR 서브도메인 (LNR-A, LNR-B, LNR-C, HD-N 및 HD-C)을 각각 교환하여 키메라 NRR을 제작하고, 이들 키메라를 용이한 검출을 위해 알칼리성 포스파타제에 융합된 분비 단백질로서 발현시키고, 표준화된 양의 각 키메라 NRR의 항-NRR1 또는 항-NRR2에 대한 결합을 검정하였다. 본 발명자들이 발현시킨 26 종의 키메라 NRR 중에서, 17 종이 분비 단백질로서 효율적으로 검출되었고 (도 12a), 7 종은 약하게 검출되었고, 2 종은 배경을 초월하여 검출되지 않았는데 (도 17), 이는 전부는 아니지만 대부분의 키메라 NRR이 발현되어 적절하게 폴딩되고 분비됨을 제시한다. NRR2로부터의 단일 LNR-A 도메인을 NRR1 골격으로 교환한 것은 항-NRR1의 결합을 방해하였는데 (도 12a, 키메라 BC.Hd 및 NRR2로부터의 LNR-A을 함유하는 모든 그 밖의 것), 이는 항-NRR1의 NRR1의 LNR-A 서브도메인과의 접촉이 결합에 본질적임을 나타낸다. 대조적으로, NRR2로부터의 LNR-C 및/또는 HD-N 도메인을 NRR1로 교환한 것은 항-NRR1 결합에 영향을 미치지 않았는데 (도 12a, 키메라 AB.Hd, ABC.Hc 및 AB.Hc), 이는 이들 도메인 중 어느 것도 결합 특이성에 본질적이지 않음을 나타낸다. 마지막으로, AB.Hc는 NRR1 서브도메인을 최소한으로 함유하는 키메라로 여전히 전체 항-NRR1 결합이 지지되는데 (비록 AB 키메라에 대해 약한 결합이 관찰되기는 하지만), 이는 항-NRR1 결합 특이성에 요구되는 접촉의 대부분, 아마도 전부가 LNR-A, LNR-B 및 HD-C 도메인에 함유되어 있음을 제시한다.
항-NRR2의 특징규명에 의해, 약간의 구분되는 차이가 있기는 하지만 항-NRR1에 대해 규정된 것과 유사한 결합 패턴이 밝혀졌다. NRR1의 LNR-A 도메인을 NRR2 골격으로 교환한 것은 항-NRR2 결합을 완전히 방해하는 반면, LNR-B 또는 LNR-C의 교환은 어떤 영향도 없었는데; 즉 항-NRR1의 경우와 마찬가지로, 항-NRR2 결합에도 노치2로부터의 LNR-A 서브도메인이 필요하였다. 마찬가지로, 노치2로부터의 HD-C 도메인이 또한 본질적이었다. NRR2로부터의 단지 3개의 서브도메인을 함유하는 2 종의 서로 다른 키메라 (C.Hn 및 BC)는 본 검정에서 완전한 결합을 지지하였고; 이들 키메라는 둘 모두 NRR2로부터의 LNR-A 및 HD-C 서브도메인을 공유하였으며, 관찰한 바와 일치하게, NRR2로부터의 LNR-A 및 HD-C 서브도메인만을 함유하는 키메라는 항-NRR2에 대해 약하지만 검출가능한 결합을 지지하였다. 따라서, 항-NRR2 결합 특이성을 결정하는 서브도메인을 규정하는데 있어서, 도메인 교환 실험은: (a) LNR-A 및 HD-C이 가장 중요함 (결합 특이성에 있어서 필수적이고 부분적으로 충분함)을 밝혀내었고, (b) LNR-B 및 HD-N 내에서의 항체-NRR2 접촉이 또한 소정의 역할을 함을 제시하였다.
항-NRR1의 길항 활성의 분자적 기초를 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 인간 NRR1에 결합된 항체의 Fab 단편의 2.2Å 결정 구조를 측정하였다. 이러한 구조에 의해 NRR1이 인간 NRR2의 그것과 매우 유사한, 코어 HD 도메인을 둘러싼 3개의 Ca2+ 결합 LNR 모듈을 갖는 조밀한 구조를 형성하는 것으로 밝혀졌다 (도 12b 및 c). 상기 구조는 Fab 결합의 분명한 영향이 S2가 절단을 위해 접근할 수 없도록 LNR-HD 상호작용을 안정화하여 노치1 신호전달 캐스케이드가 중단된 채로 유지시킴을 밝혀내었다. 이러한 해석은 도메인 교환 실험 (도 12a)에서와 일치하게, Fab가 S2 부위를 직접적으로 막지는 않지만 대신 HD, LNR-A 및 LNR-B 도메인 사이의 계면에 결합한다는 관찰에 의해 지지된다 (도 12d). 이러한 계면은 fab 및 NRR1 사이에 동등하게 나뉘어진, 용액이 접근가능한 표면 영역의 약 2000Å2에 묻혀있다. Fab 중쇄는 HD-C 도메인 내의 마지막 헬릭스인 LNR-B 및 LNR-A의 주변부와 접촉한다. CDR H3은 LNR-B 및 HD 사이의 계면에 놓인다. 특히, H3으로부터의 R99는 LNR-A로부터의 Phe1501의 골격 카르보닐과 수소 결합을 형성하는 한편, 측쇄의 지방족 부분은 HD 도메인으로부터의 L1710과 상호작용한다. 경쇄는 Fab에 의해 기여되는 묻힌 표면 영역의 약 40％를 차지하고, HD 도메인 내의 마지막 헬릭스 이전의 연결 루프 뿐만 아니라 LNR-A와 접촉한다.
상기 구조는 또한 노치2보다 노치1에 대한 Fab 특이성의 근거를 설명한다. 노치1 및 노치2의 NRR 도메인 사이의 약 45％의 서열 동일성에 불구하고, 계면에 포함된 대부분의 잔기는 두 단백질 사이에 차이가 있다. 예를 들어, Fab 결합에 대한 용매 접근가능 표면 부위의 적어도 25％가 묻히는 21개의 NRR 잔기 중에서, 단지 6 개 만이 노치1 및 노치2에서 동일하다. 이들 6 개의 잔기는 Fab 에피토프의 표면 영역에 1/4 미만으로 기여하고, 에피토프 전반에 걸쳐 분포된다 (도 12d 및 18).
6. 노치1 신호전달의 선택적 억제는 혈관신생 제약을 완화한다
노치 수용체 특이적 항체의 활용을 개시하여 생체내에서 개별 수용체의 기능적 중요성을 규정하기 위해, 본 발명자들은 먼저 항-NRR1에 의한 노치1 신호전달의 선택적 차단이 포유동물 혈관신생을 방해하는지 여부를 확인하였다. 수많은 보고들은 노치 경로가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 하류에서 기능하며, 정단 세포 및 줄기 세포 사이의 내피 세포 운명 선택을 조절하는 것에 의해 혈관신생에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. Dll4-특이적 차단 항체를 비롯한 다양한 유전적 및 생화학적 도구를 사용한 실험에 의해, 비록 2종의 노치 수용체, 노치1 및 노치4가 혈관신생에서 Dll4에 대한 수용체로서 관련이 있지만, Dll4가 노치 혈관신생 신호전달에 수반되는 핵심 노치 리간드로서 확립되었다.
본 발명자들은 먼저 노치1의 선택적 억제가 시험관내에서 내피세포 발아에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 인간 피부 섬유모세포와 함께 공동배양하여 내강-유사 구조를 갖는 발아를 생성시켰다. 종전의 작업에서와 같이, 본 발명자들은 γ-세크레타제 억제제인 DBZ를 이용한 광범위한-노치 억제, 뿐만 아니라 Dll4의 선택적인 항체 차단이 내피 세포 발아의 개수 및 길이를 모두 증가시키는 것을 확인하였다. 중요하게, 항-NRR1을 이용한 노치1 신호전달의 선택적 차단은 유사한 표현형을 생성시켰다 (도 13a 및 13b).
생체내에서 항-NRR1이 혈관신생에 영향을 미치는지 여부를 판단하기 위해, 본 발명자들은 마우스 신생아에서 망막 혈관계 발생을 기초로 하는 모델을 사용하였다. 항-NRR1의 전신적 전달은 처리된 신생아 마우스에서 망막 혈관계의 발생을 상당히 방해하였다 (도 13c). 대조군 항-돼지풀 항체로 처리된 것과 비교하여, 항-NRR1 처리는 빽빽하고, 조밀하고, 외견상 뒤얽힌 혈관 네트워크를 생성하였다 (도 13c, 패널 I 및 III을 각각 패널 II 및 IV와 비교). 이는 내피세포의 축적을 증가시켰고, Ki67 증식 마커로 표지하여 평가한 바와 같이, 증가된 증식과 상관관계가 있었다 (도 13c, 패널 V 및 VI를 비교). 증가된 혈관 밀도, 내피세포 축적, 및 증가된 증식을 비롯한 이러한 관찰은 이와 동일한 신생아 모델을 사용하여 Dll4 또는 γ-세크레타제를 억제한 이후에 관찰되는 것과 모두 밀접하게 유사하였고 (데이터는 나타내지 않음), 종양 혈관계 분석 (도 13d 및 13e) 및 마우스 각막 포켓 검정 (데이터는 나타내지 않음)을 비롯한 다른 연구로부터의 결과와 일치하였다. 본 발명자들의 결과는 항-NRR1이 강력한 생물학적 활성을 보유할 뿐만 아니라, 노치4 또는 노치1 및 노치4의 조합과 대조적으로 노치1를 단독으로 억제하는 것은 포유동물의 혈관신생을 상당히 방해하는데 충분하다는 것을 보여준다.
7. 노치1의 선택적 항체 차단은 전임상 모델에서 종양의 성장을 억제한다
항-NRR1을 이용한 선택적인 노치1 차단이 종양 성장을 억제하는데 충분한지 여부를 판단하기 위해, 본 발명자들은 전임상 종양 모델을 사용하여 항-NRR1, 항-VEGF 또는 항-돼지풀 항체 처리 이후의 확립된 종양의 성장을 비교하였다. Calu6 및 HM7 모델 둘 모두에서, 항-NRR1로 처리된 그룹은 초기 투여후 3 내지 4일째에 처음 검사한 시점에서도 대조군 그룹에 비해 종양 크기가 현저하게 감소되었다 (도 13a-c). Calu6 모델에서, 항-NRR1 그룹은 대략 250 mm3에서 100 mm3 미만으로 종양 크기의 감소를 나타내었고, 이는 항-VEGF 그룹에서 관찰된 감소와 유사하였으며; 이와 대조적으로, 항-돼지풀 대조군 그룹에서의 종양은 400 mm3를 초과한 크기로 성장하였다 (도 14a). 본 발명자들은 적극적으로 성장하는 HM7 모델을 이용하여 유사한 결과를 관찰하였는데; 항-NRR1 처리는 종양 크기를 12 내지 13일에 걸쳐 그대로 유지시키거나 (도 14b) 또는 거의 그대로 유지시켰고 (도 14c), 이는 대조군 그룹에서 관찰되는 6일째 성장 (250 mm3에서 900 mm3을 초과)과 비교하여 상당히 달랐다 (도 14b 및 5c). 본 발명자들은, 비록 10 및 20 mg/kg 그룹이 2.5 및 5 mg/kg 그룹에 비해 보다 강력한 억제 경향을 나타내었지만, 20 mg/kg 내지 2.5 mg/kg의 항-NRR1 용량 농도 범위를 이용하여 종양 성장의 유사한 억제를 관찰하였다 (도 14c).
Calu6 또는 HM7 종양 모델의 항-혈관신생제에 대한 반응이 널리 보고되어 있기 때문에, 본 발명자들은 이들 모델을 연구하였다. 항-NRR1이 Calu6 모델에서 혈관신생을 방해하는지 여부를 직접 시험하기 위해, 본 발명자들은 3 그룹의 처리 그룹에서 마우스로부터의 대표적인 종양 절편의 혈관계를 조사하였다. 내피세포 마커인 CD31의 염색을 DAPI를 이용하여 DNA의 염색에 대해 표준화하여, 본 발명자들은 항-NRR1이 다른 그룹에 비해 CD31 염색을 현저하게 증가시킴을 확인하였다 (도 14d). 이러한 증가는 통계적으로 현저하였고 (p < 0.01), 다중 영상에 걸쳐 일관되게 관찰되었다 (도 14e). 대조적으로, 그리고 예상한 바와 같이, 항-VEGF는 CD31 염색을 감소시켰다 (도 14d 및 14e). 즉, 노치1의 선택적 차단으로부터의 결과는 Dll4의 선택적 차단에 대해 보고된 결과를 반영하였고, 유사하게 종양 CD31 염색을 증가시켰을 뿐만 아니라 종양 혈관계의 기능을 저조화하였다. 종합하면, 이러한 결과들은 Calu6 및 HM7 모델에서 항-NRR1에 의해 발휘되는 항-종양 효과가 주로 종양 혈관신생에 있어서의 방해가 반영된 것임을 제시한다.
8. 노치1 및 노치2 둘 모두의 항체 억제는 장내 세포 운명에 효과를 나타내었다
다중 노치 수용체를 억제하는 광범위한-노치 억제제인 감마-세크레타제 억제제 (GSI)는 체중을 감소시키고 장내 배상 세포를 화생시키는데, 이는 세포 운명을 판단하는데 있어서 장샘 전구세포의 증식을 유지시키고 분비 세포 운명으로의 분화를 금하는 것에 의한 노치의 소정의 역할이 반영된 것이다. (문헌 [van Es et al., Nature 435:959-963 (2005)]을 참조). 또한, 조건부 노치 넉아웃 마우스를 이용한 유전학적 연구는 양 노치1 및 노치2의 방해가 장내 배상 세포의 화생을 유발하는데 요구됨을 제시한다. (문헌 [Riccio et al., EMBO Rep. 9:377-383 (2008)] 참조). 본 발명자들은 항-NRR1 및 항-NRR2를 사용하여 노치1 또는 노치2, 또는 둘 모두의 체중 손실 및 장내 세포 분화에 대한 선택적 억제 효과를 판단하였다.
항-NRR1로 처리된 마우스는 항체 투여 과정 동안 전체 체중의 약한 감소를 나타내었다. 항-NRR1 및 항-NRR2를 직접적으로 비교한 제1 실험에서, 본 발명자들은 항-NRR2 뿐만 아니라 항-gD 및 항-LTβR-Fc 대조군 그룹에서 관찰된 체중 증가와는 대조적으로 항-NRR1이 총 체중을 5％ 감소시킴을 확인하였다 (도 15a). 제2 실험에서, 항-NRR1 또는 항-NRR2를 사용한 노치1 또는 노치2 각각의 선택적 억제는 체중에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 상기 실험의 결과를 도 24a에 도시하였고, 이때 마우스는 화살표로 표시된 날짜에 항-NRR1 (네모), 항-NRR2 (세모), 또는 대조군 항체 ("α-gD", 다이아몬드)로 5 mg/kg 투여되었다. 그러나, 항-NRR1 및 항-NRR2 둘 모두로 처리된 마우스 (도 24a에서 "X")에서는 초기 7일째에 그의 출발 체중의 거의 20％가 손실되었다.
본 발명자들은 항-NRR1 단독 처리로 인한 미묘한 체중 감소, 또는 항-NRR1 및 항-NRR2 둘 모두의 처리로 인한 보다 상당한 체중 감소가 장내 세포 운명 결정에 있어서의 변화를 반영하는 것인지 여부를 조사하였다. 항-NRR1 또는 대조군으로서 항-gD 또는 DBZ를 마우스에 투여한 후, 다양한 조직화학 염색을 이용하여 대장 절편 (도 19) 및 소장 절편을 2 일째 (도 20) 및 7 일째 (도 15b) 분석하였다. DBZ는 앞서 GSI에 대해 기재한 것과 동일한 효과를 가졌고 (도 15b, DBZ 칼럼): Hes1 발현의 억제는 전구 세포 증식에서의 감소 (Ki-67 염색에 의해 보여짐) 및 배상 세포 집단의 상당한 확장 (뮤신의 알시안 블루 염색에 의해 보여짐)과 상관관계가 있었다. 또한, 리소자임 염색은 DBZ가 제2 분비 세포 집단인 파네트 세포의 개수 및/또는 활성을 증가시킴을 제안하였고 (도 15b), 그러한 제안은 파네트 세포 과립에 대한 아주르 A-에오신 B 염색에 의해 더욱 지지되었다 (데이터는 나타내지 않음). 항-NRR1은 10 mg/kg에서 DBZ에 의해 유도되는 것과 구별되지 않는 장내 변화를 유도하였다 (도 15a, DBZ 30 μmol/kg과 α-NRR1 10 mg/kg을 비교). 이러한 장내 변화는 항-NRR1의 농도에 좌우되어, 현저한 세포 운명의 변화는 10 mg/kg 및 2.0 mg/kg를 이용하였을때 관찰되었지만, 만약 존재한다면 0.4 mg/kg을 이용하였을때 약간의 주지할 만한 변화가 관찰되었다. 대장은 DBZ 및 항-NRR1 처리시 유사하게 반응하였고: 양 처리는 모두 노치 신호전달을 현저하게 감소시키고 (도 19, Hes1 염색), 전구 세포 증식을 차단하였으며 (도 19, Ki-67), 배상 세포 개수를 증가시켰다 (도 19, 알시안 블루 및 H&E). 내장 세포 운명의 변화는 본 연구의 2일째인 초기 시점에는 단지 약하게 검출가능한 정도였다 (도 20; Ki-67 및 알시안 블루 염색에서 관찰되는, DBZ 및 항-NRR1 둘 모두에 의해 초래된 약하지만 검출가능한 변화에 주목한다).
노치2 신호전달의 억제가 장내 세포 운명 결정에 유사한 영향을 미칠 수 있는지 여부를 판단하기 위해, 본 발명자들은 대장 (데이터는 나타내지 않음) 및 소장 (도 15c, 알시안 블루 및 Ki-67 염색으로 보여짐, 도 24b, 알시안 블루 염색으로 보여짐)에 대한 항-NRR1 및 항-NRR2의 효과를 직접적으로 비교하였다. 항-NRR1이 배상 세포 화생을 유발함과 동시에 샘 전구세포에서 Ki-67 발현을 감소시키는 반면, 항-NRR2는 어떤 검출가능한 효과도 유발하지 않았다 (도 15c 및 24b, 항-NRR2 및 항-gD 대조군을 비교). 항-NRR1 및 항-NRR2이 각각 노치1 및 노치2 신호전달의 강력하고 특이적인 억제제로서 기능하기 때문에, 생체내 (도 11) 및 시험관내 (도 9, 10 및 21) 둘 모두에서의 이러한 결과는 노치2가 아닌 노치1의 선택적 억제가 장내 세포 운명 결정을 변화시키는데 충분함을 제시한다.
또한, 장내 세포 운명 결정에 대한 노치1 및 노치2 둘 모두의 억제 효과를 조사하였다. 도 22는 변경된 장내 세포 분화에 대한 항-NRR1 및 항-NRR2의 상승 효과를 보여준다. 암컷 Balb/c 마우스에 5 mg/kg 항-NRR1, 5 mg/kg 항-NRR2 또는 5 mg/kg 항-NRR1 플러스 5 mg/kg 항-NRR2를 0, 4, 7 및 11 일째에 투여하였다. 장을 회수하고 H&E로 염색하여 샘 형태를 밝혀내었다. 항-NRR1 또는 항-NRR2 단독으로 처리된 마우스의 경우에는, 장을 12 일째에 회수하고; 항체 둘 모두로 함께 처리된 마우스의 경우에는, 장을 6 일째에 회수하였는데, 이는 이 그룹의 마우스의 체중이 급속도로 감소되기 때문이다. 장 분석 결과 항체 조합이 항-NRR1을 단독으로 처리한 이후에 관찰되는 것에 비해 보다 심각한 표현형을 야기하는 것으로 나타났고, 이는 노치1 및 노치2가 포유동물 장에서 함께 그리고 부분적으로는 과다하게 기능함을 제시한다. 추가의 실험으로 이러한 관찰을 확인하였다. 도 24b에 나타낸 바와 같이, 항-NRR1 및 항-NRR2로 처리한 마우스로부터의 장은 심각한 배상 세포 화생을 나타내었다. 항-NRR1 단독으로 처리하는 것은 일부 배상 세포 화생을 유도하는데 충분하였지만, 항-NRR1 단독의 효과는 항-NRR1 및 항-NRR2 둘 모두를 조합한 효과에 비해 약했다.
종합하면, 상기 결과는 노치2가 아닌 노치1의 강력한 억제가 부분적인 표현형을 밝히는데 충분하지만, 노치1 및 노치2가 장 세포 분화에서 과다하게 기능함을 보여준다. 본 발명자들은 이러한 부분적 표현형을 검출하는 본 발명자들의 능력이 앞선 유전적 연구에서 보고되어 있지 않고, 불완전할 수 있는 조건부 유전자 넉아웃 이후에 달성될 수 있는 것보다 항-NRR1이 샘 세포 전반에 걸친 노치1 신호전달을 보다 획일적이고 강력하게 억제하는 것을 반영한다고 가정한다. 중요하게는, 일반적인 노치 억제의 특징인 배상 세포 화생을 현저하게 감소시키거나 회피시킴으로써, 본원에서 보고된 노치1- 및 노치2-특이적 항체 억제제는 GSI와 같은 현존하는 광범위한-노치 억제제 보다 명백한 해결책으로 대두된다.
9. 항-NRR1 장 표현형의 회복
도 23은 덱사메타손이 적어도 부분적으로 항-NRR1에 의해 초래된 장 표현형을 회복시킴을 보여준다. 항체를 다음과 같이 암컷 NCR. 누드 마우스 (그룹 당 3마리)에 복강내로 (IP) 투여하였다:
그룹 A) 비히클 조합, MCT, 하루 1회, 항-gD 대조군 항체 4 mg/kg, 매 4일째 (도면에 나타내지 않음);
그룹 B) 덱사메타손, 90 mg/kg, 매일 (도면에 나타내지 않음);
그룹 C) 항-NRR1, 4 mg/kg, 매 4일째;
그룹 D) 덱사메타손, 90 mg/kg, 매일, 및 항-NRR1, 4 mg/kg, 매 4일째.
비히클은 앞서 유해 임상 효과를 초래하지 않는 것으로 밝혀진 물 중의 0.5％ (w/v) 히드록시프로필메틸셀룰로스 (메토셀 E4M) 및 0.1％ (w/v) 트윈 80 (MCT)이었다.
장을 9 일째에 회수하고, 항-Ki67 (증식 마커) 및 알시안 블루 (뮤신에 대한 것)로 염색하였다. 본 실험에 의해 덱사메타손 플러스 항-NRR1 조합에 의해 처리된 마우스가 항-NRR1 단독 처리된 마우스에 비해 보다 약한 장 표현형을 나타냄이 밝혀졌고, 따라서 덱사메타손이 분화에 있어서 항-NRR1-유도된 변화로부터 장을 보호하는 것으로 제시된다.
10. 항-NRR2는 흑색종 세포주의 성장을 억제한다
흑색종 세포주의 성장에 대한 항-NRR1 및 항-NRR2의 효과를 조사하였다. 인간 흑색종 세포주 SK23 및 LOX-IMVI를 Jagged-1 리간드로 코팅되지 않거나 (-jag-1) 또는 코팅된 (+jag-1) 96 웰 플레이트 (R&D 시스템스, 미네소타주 미네아폴리스 소재) 내의 2％ FBS를 함유하는 배지에 저밀도로 (SK23의 경우 4000 세포/웰, LOX-IMVI의 경우 2500 세포/웰) 플레이팅하였다. 항-NRR1 (20 mg/ml), 항-NRR2 (20 mg/ml), 또는 감마-세크레타제 억제제 (GSI) DAPT (5 μM)를 배양물에 첨가하고, 그 이후 격일로 재첨가하였다. 동 부피의 DMSO는 비히클 대조군으로서 제공된 반면, 동 농도의 항-gD HuB6 파지 항체는 이소형 대조군 항체로서 제공되었다. 플레이팅 후 6 일째에 세포 적정 글로 검정 (프로메가, 위스콘신주 매디슨 소재)을 수행하였다. 결과를 도 25a 및 25b에 나타낸다 (항-NRR1 및 항-NRR2를 "항-N1" 및 "항-N2"이라 칭함). 도 25a 및 25b에서, 세포 생존율 (y-축)은 DMSO 비히클, -jag-1 대조군 웰로부터의 값에 대해 상대적으로 표현하였다. 흑색종 세포주는 둘 모두 GSI 처리 (특히 Jag1 리간드의 존재하에서의) 및 항-NRR2 처리에 대한 반응에서 생존율의 감소를 나타내었지만, 항-NRR1 처리에서는 그렇지 않았다.
11. 항-NRR2는 미만성 거대 B-세포 림프종의 시험관내 성장을 억제한다
미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)은 비-호지킨 림프종의 가장 흔한 유형이다. DLBCL 환자로부터의 암 세포의 최근 연구는 환자의 대략 8％가 노치2에서 PEST 도메인 돌연변이를 보유하는 것으로 나타났고, 그러한 돌연변이는 리간드 활성화에 이어 노치2 신호전달을 연장시키는 것으로 예측된다. (문헌 [Lee et al., Cancer Sci. 100:920-926, 2009] 참조). 그러나, DLBCL 세포가 어떻게 노치2 억제에 대해 반응하는지에 대해서는 알려진 바 없다. 따라서, 본 발명자들은 5 종의 DLBCL 세포주에 대한 항-NRR2의 효과를 조사하였다. 도 26의 우측에 열거한 DLBCL 세포주를 384 웰 플레트의 웰 내에서 3 일 동안 복제 성장시켰다. 세포 배양물은 표시된 농도의 항-NRR2 (도 26 및 27에서 "항-노치2"라 지칭함)를 함유하였고, 이는 10 μg/ml에서 출발한 3배 연속 희석물에 상응한다. 세포 적정 글로 검정 (프로메가)을 이용하여 성장을 평가하고, 이소형 대조군 항체로 처리한 것과 비교하여 세포 생존율을 백분율로서 플롯팅하였다. 도 26에서의 데이터 포인트는 표시된 항체 농도에서 각 세포주에 대한 개별 웰로부터 수득한 평균값을 나타낸다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 세포주 중 하나인 "DB"의 성장은 항-NRR2에 의한 처리에 의해 강력하게 억제되었다. 도 27은 시간의 경과에 따른 DB 세포의 성장을 보여준다. DB 세포주를 12-웰 플레이트의 웰에서 성장시키고, 배양물을 DMSO, 감마-세크레타제 억제제 DAPT, 항-gD 이소형 대조군 항체 또는 항-NRR2로 표시된 농도로 처리하였다. 접종 및 배양물을 처리한 후 2, 3 및 5 일째에 생존 세포를 계수하여 성장을 평가하였다 (Vi-CELL, 베크만 코울터(Beckman Coulter), 캘리포니아주 풀러턴 소재). 값은 세개의 독립적인 배양물로부터의 측정치의 평균 플러스/마이너스 표준 편차를 나타낸다. 도 27은 항-NRR2이 시험관내에서 DB DLBCL 세포주의 성장을 억제함을 보여준다.
전술된 발명이 명료한 이해를 위해 예시 및 예를 통하여 보다 상세히 기재되긴 하였지만, 이러한 설명과 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 기술은 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
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Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 1 5 10 <210> 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Claims (31)

  1. 노치2 NRR에 결합하여 노치2 활성을 억제하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 노치2 이외의 노치 패밀리 구성원에는 현저하게 결합하지 않는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 마우스 노치2 NRR 및 인간 노치2 NRR에 결합하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 10 nM 이하의 Kd로 노치2 NRR에 결합하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 3의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) 서열 10의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 14의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 항체.
  6. 제5항에 있어서, 서열 1 내지 2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열 6 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열 11 내지 13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열 15 내지 18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  7. 제6항에 있어서, HVR-H1이 서열 1의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1이 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2가 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3이 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  8. 제6항에 있어서, HVR-H1이 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2가 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3이 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  9. 제6항에 있어서, HVR-H1이 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2가 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3이 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  10. 제6항에 있어서, HVR-H1이 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1이 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2가 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3이 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  11. 제5항에 있어서, 인간 VH 수용자 2 프레임워크 및 인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크로부터 선택된 하나 이상의 프레임워크를 추가로 포함하는 항체.
  12. 제1항에 있어서, 서열 20 내지 21로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 22 내지 25로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  13. 제12항에 있어서, 서열 20의 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 22의 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  14. 제13항에 있어서, 중쇄 가변 도메인이 서열 20의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  15. 제12항에 있어서, 서열 21의 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 23 내지 25로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  16. 제15항에 있어서, 중쇄 가변 도메인이 서열 21의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열 23 내지 25로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  17. 제1항에 있어서, 항체 D, 항체 D-1, 항체 D-2 또는 항체 D-3으로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 노치2의 LNR-A 도메인 및 HD-C 도메인에 결합하는 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편인 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인 항체.
  21. 노치2를 발현하는 세포를 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 노치2 활성을 억제하는 방법.
  22. 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애의 치료 방법.
  23. B-세포 악성종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, B-세포 악성종양의 치료 방법.
  24. 흑색종의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 흑색종의 치료 방법.
  25. 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애 치료용 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  26. B-세포 악성종양 치료용 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  27. 흑색종 치료용 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체.
  29. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 노치2의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 장애의 치료에 사용하기 위한 항체.
  30. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포 악성종양의 치료에 사용하기 위한 항체.
  31. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 흑색종의 치료에 사용하기 위한 항체.

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