JP5974012B2 - 突然変異体スムースンド及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2010年10月5日に出願された米国特許出願第61/389,995号の優先権の恩典を主張するものである。
ループ Kabat AbM Chothia 接触
−−− −−−−− −−− −−−−−−− −−
L1 L24〜L34 L24〜L34 L26〜L32 L30〜L36
L2 L50〜L56 L50〜L56 L50〜L52 L46〜L55
L3 L89〜L97 L89〜L97 L91〜L96 L89〜L96
H1 H31〜H35B H26〜H35B H26〜H32 H30〜H35B
(Kabat付番)
H1 H31〜H35 H26〜H35 H26〜H32 H30〜H35
(Chothia付番)
H2 H50〜H65 H50〜H58 H53〜H55 H47〜H58
H3 H95〜H102 H95〜H102 H96〜H101 H93〜H101
本発明の核酸には、単離された突然変異体SMOをコードする配列が含まれる。核酸は、配列番号3の核酸配列と少なくとも80%同一であり、位置518でグルタミン酸(E)以外の任意のアミノ酸をコードする配列を含むように、この配列からの少なくとも1つの突然変異を含有する。いくつかの実施形態では、核酸は、位置518でアラニン(A)又はリジン(K)をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチド1552、1553、及び/又は1554で親野生型SMOからの少なくとも1つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、配列番号3とのパーセント同一性は、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%であるが、但し、位置1552、1553、及び/又は1554に少なくとも1つの突然変異が存在する。本発明はまた、長さが少なくとも20ヌクレオチドである断片中の、上記の突然変異の領域にまたがるほどの核酸の断片も企図している。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド断片は、長さが25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100ヌクレオチドである。断片は、上記の突然変異の領域から完全長の突然変異体SMOをコードする核酸分子にまで及ぶ任意の長さであり得る。単離された突然変異体SMO及びその断片は、例えば、ハイブリダイゼーションのために、本発明の予後判定アッセイ及び診断アッセイのためのプライマー及びプローブを作製するために、並びに組換え系での発現のために(例えば、免疫原として使用するための及び本明細書に記載の本発明のアッセイで使用するための突然変異体SMOタンパク質又はその一部を作製するために)使用することができる。
本発明は、単離された突然変異体SMOタンパク質を提供する。野生型ヒトSMOは、配列番号1に示されている。突然変異ヒトSMOは、配列番号2に示されており、ここで、アミノ酸518は、本出願に関して、グルタミン酸(E)以外の任意のアミノ酸を表す「X」として示されている。いくつかの実施形態では、Xは、アラニン(A)又はリジン(K)である。突然変異体SMO及びその断片は、本明細書に記載の突然変異体SMO核酸を用いて、当技術分野で周知であるように組換え系で産生することができる。そのような核酸を、当技術分野で周知であるような発現ベクターに組み込み、タンパク質の提案される用途に応じて原核細胞又は真核細胞であり得る宿主細胞内にトランスフェクトすることができる。突然変異体SMOの完全長又は断片(この断片は、少なくとも膜貫通ドメイン7のカルボキシ末端部分及び配列番号2のアミノ酸518を含む)を免疫原として用いて、例えば、本発明の抗体を産生するか、又は本発明の抗体を精製することができる。
A.抗突然変異体SMO抗体
一態様では、本発明は、SMO、特に、突然変異体SMOに結合する抗体を提供する。一実施形態では、抗SMO抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗SMO抗体は、抗体断片、例えば、Fab、Fab’−SH、Fv、scFv、又は(Fab’)2断片である。一実施形態では、抗突然変異体SMO抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体である。一実施形態では、抗SMO抗体は精製されている。特定の実施形態では、組成物は、癌の治療のための医薬製剤である。
本発明は、抗体断片を包含する。抗体断片は、酵素消化などの従来の手段によるか、又は組換え技術によって作製することができる。特定の状況下では、完全抗体ではなく、抗体断片を使用することに利点がある。断片のサイズがより小さいために、迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改善がもたらされ得る。特定の抗体断片の総説については、Hudsonら(2003)Nat.Med.9:129−134を参照されたい。
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、その中に導入された、非ヒトである供給源由来の1以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」(移入、import)残基と呼ばれ、これらは通常、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、Winter及び共同研究者らの方法(Jonesら(1986)Nature 321:522−525;Riechmannら(1988)Nature 332:323−327;Verhoeyenら(1988)Science 239:1534−1536)に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって、本質的に実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、その場合、インタクトなヒト可変ドメインには実質的に満たないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかの超可変領域残基、及び場合によってはいくつかのFR残基が齧歯類抗体中の類似部位の残基によって置換されている、ヒト抗体である。
本発明のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列(複数可)を、上記のような既知のヒト定常ドメイン配列(複数可)と組み合わせることによって構築することができる。或いは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株は、例えば、Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeurら,モノクローナル抗体の産生技術及び応用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications),51−63ページ(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);並びにBoernerら,J.Immunol.,147:86(1991)によって記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方はSMOに対するものであり、もう一方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、SMOの2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を用いて、SMOを発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。これらの抗体は、SMO結合アーム、及び例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体ハプテンなどの、細胞毒性剤に結合するアームを保有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内在化(及び/又は異化)されることができる。本発明の抗体は、3以上の抗原結合部位を有する(IgMクラス以外のものである)多価抗体(例えば、四価抗体)であることができ、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生させることができる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び3以上の抗原結合部位を含むことができる。特定の実施形態では、二量体化ドメインは、Fc領域又はヒンジ領域を含む(又は該領域からなる)。このシナリオでは、抗体は、Fc領域、及びFc領域のアミノ末端側の3以上の抗原結合部位を含む。特定の実施形態では、多価抗体は、3〜約8個の抗原結合部位を含む(又は該抗原結合部位からなる)。1つのそのような実施形態では、多価抗体は、4つの抗原結合部位を含む(又は該抗原結合部位からなる)。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(例えば、2つのポリペプチド鎖)を含み、ここで、ポリペプチド鎖(複数可)は、2以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(複数可)は、VD1−(X1)n−VD2−(X2)n−Fcを含むことができ、ここで、VD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(複数可)は、VH−CH1−柔軟なリンカー−VH−CH1−Fc領域の鎖、又はVH−CH1−VH−CH1−Fc領域の鎖を含むことができる。本明細書中の多価抗体は、少なくとも2つ(例えば、4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むことができる。本明細書中の多価抗体は、例えば、約2〜約8個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここで企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意にCLドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、単一のポリエプチド(polyeptide)鎖である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.,Waltham,MA;例えば、米国特許第6,248,516 B1号を参照)。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾(複数可)が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な変化を導入することによるか、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又は該残基中への挿入、及び/又は該残基の置換が含まれる。最終的なコンストラクトが所望の特徴を保有するという条件で、最終的なコンストラクトに達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行なうことができる。アミノ酸の改変は、対象抗体のアミノ酸配列を作製するときに、その配列中に導入することができる。
(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明の抗体を、当技術分野で公知であり、かつ容易に利用可能なさらなる非タンパク質部分を含むように、さらに修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのどちらか)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造上の利点を有することができる。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分岐状又は非分岐状であってもよい。抗体に付着したポリマーの数は様々に異なっていてもよく、2以上のポリマーが付着している場合、これらは同じ又は異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に用いられるポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、改善されるべき抗体の具体的な特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどを含む検討事項に基づいて決定することができる。
1.特定のハイブリドーマに基づく方法
本発明のモノクローナル抗体は、Kohlerら,Nature,256:495(1975)によって最初に記載され、ヒト−ヒトハイブリドーマに関して、例えば、Hongoら,Hybridoma,14(3):253−260(1995)、Harlowら,抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual),(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988);Hammerlingら,モノクローナル抗体及びT細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas)563−681(Elsevier,N.Y.,1981)、並びにNi,Xiandai Mianyixue,26(4):265−268(2006)にさらに記載されている、ハイブリドーマ法を用いて作製することができる。
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを用いて、所望の1つ又は複数の活性を有する抗体をスクリーニングすることによって作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、そのようなライブラリーを所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、種々の方法が当技術分野で公知である。そのような方法は、一般に、Hoogenboomら,分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)178:1−37(O’Brienら編,Human Press,Totowa,NJ,2001)に記載されている。例えば、関心対象の抗体を作製する1つの方法は、Leeら,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073−93に記載されているようなファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
抗体は、組換え方法を用いて産生することもできる。抗突然変異体SMO抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)用又は発現用の複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)容易に単離及びシークエンシングすることができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、通常、限定されないが、以下のうちの1つ又は複数:シグナル配列、複製起点、1以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列が含まれる。
本発明の抗体は、直接的にだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え産生させることができ、この異種ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質又はポリペプチドのN末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセッシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。ネイティブ抗体のシグナル配列を認識及びプロセッシングしない原核宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(サッカロミセス属及びクルイベロミセス属のα因子リーダーを含む)、もしくは酸ホスファターゼリーダー、C.アルビカンスのグルコアミラーゼリーダー、又はWO90/13646号に記載のシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物のシグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。
発現ベクター及びクローニングベクターはどちらも、ベクターが1以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。通常、クローニングベクター中では、この配列は、ベクターが宿主の染色体DNAとは独立して複製することを可能にするものであり、複製起点又は自己複製配列が含まれる。そのような配列は、種々の細菌、酵母、及びウイルスについて周知である。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド起点は酵母に好適であり、様々なウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、又はBPV)は、哺乳動物細胞のクローニングベクターに有用である。通常、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない(SV40起点が典型的に使用され得るが、これは、単にそれが初期プロモーターを含有しているからに過ぎない)。
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、(b)栄養要求性欠損を相補するか、又は(c)例えば、バチルス属のD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含む。原核生物宿主とともに使用するのに好適なプロモーターには、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系、並びにtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが好適である。また、細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするDNAに機能的に連結されたシャイン−ダルガノ(S.D.)配列も含む。
高等真核生物による、本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳動物遺伝子について、多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン)。しかしながら、通常、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。例として、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターを活性化させるためのエンハンサーエレメントに関しては、Yaniv,Nature 297:17−18(1982)も参照されたい。エンハンサーは、抗体をコードする配列の5’又は3’側の位置でベクターに挿入されてもよいが、好ましくはプロモーターから5’側の部位に位置する。
真核生物宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、又は他の多細胞生物からの有核細胞)で使用される発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、一般的に、真核生物又はウイルスのDNA又はcDNAの5’及び場合によっては3’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026号及びその中に開示されている発現ベクターを参照されたい。
本明細書中のベクター中のDNAをクローニングするか、又は発現させるための好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、又は高等真核生物の細胞である。この目的のための好適な原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌、セラチア属、例えば、霊菌、及びシゲラ属、並びにバチルス属、例えば、枯草菌及びB.リケニフォルミス(例えば、1989年4月12日に公開されたDD266,710号に開示されているB.リケニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば、緑膿菌、及びストレプトミセス属が含まれる。1つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌294(ATCC31,446)であるが、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31,537)、及び大腸菌W3110(ATCC27,325)などの他の株が好適である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。
本発明の抗体を産生させるために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムのF10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI−1640(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Hamら,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnesら,Anal.Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号;第4,657,866号;第4,927,762号;第4,560,655号;もしくは第5,122,469号;WO90/03430号;WO87/00195号;又は米国再発行特許第30,985号に記載の培地のうちのいずれかを、宿主細胞用の培養培地として用いることができる。これらの培地のうちのいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び/又は他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩)、バッファー(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCIN(商標)薬)、微量元素(通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される)、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補助物質を当業者に知られる適切な濃度で含めることもできる。例えば、温度、pHなどの培養条件は、発現用に選択される宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム空間で産生されるか、又は培地中に直接分泌されることができる。抗体が細胞内で産生される場合、最初の工程として、宿主細胞又は溶解断片のどちらかの微粒子残屑を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。Carterら,Bio/Technology 10:163−167(1992)は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡潔に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の存在下で、約30分間かけて解凍する。細胞残屑を遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、通常、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いてまず濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を前述の工程のうちのいずれかに含めてタンパク質分解を阻害することができ、また、抗生物質を含めて外来性汚染菌の成長を防止することができる。
本発明はまた、化学療法剤、薬物、成長阻害因子、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、或いは放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)などの、1以上の細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲート(「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ADC」と互換的に呼ばれる)を提供する。
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、1以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた抗体(完全長又は断片)を含む。
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン、又はドロスタチン(dolostatin)ペプチド類似体及び誘導体のアウリスタチンにコンジュゲートされた抗体を含む(米国特許第5635483号;第5780588)。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、並びに核分裂及び細胞分裂を妨害し(Woykeら(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580−3584)、抗癌活性(US5663149号)及び抗真菌活性(Pettitら(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961−2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端を介して抗体に付着させることができる(WO02/088172号)。
他の実施形態では、免疫コンジュゲートは、1以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満の濃度で二本鎖DNAの切断を生じさせることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、第5,877,296号(全て、American Cyanamid Companyのもの)を参照されたい。使用し得るカリケアマイシンの構造類似体には、限定されないが、γ1I、α2I、α3I、N−アセチル−γ1I、PSAG、及びθI1が含まれる(Hinmanら,Cancer Research 53:3336−3342(1993)、Lodeら,Cancer Research 58:2925−2928(1998)、及びAmerican Cyanamidの前述の米国特許)。抗体をコンジュゲートさせることができる別の抗腫瘍薬は、抗葉酸剤であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAはどちらも細胞内作用部位を有しており、形質膜を容易には横断しない。したがって、抗体媒介性の内在化を介したこれらの薬剤の細胞取込みは、その細胞毒性効果を大いに増強する。
抗体にコンジュゲートさせることができる他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、及び5−フルオロウラシル、LL−E33288複合体と総称される、米国特許第5,053,394号、第5,770,710号に記載の薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシン(米国特許第5,877,296号)が含まれる。
抗体薬物コンジュゲート(ADC)中で、抗体(Ab)は、リンカー(L)を介して、1以上の薬物部分(D)、例えば、抗体1つ当たり約1〜約20個の薬物部分(p=1〜約20)にコンジュゲートされている。下に示す式のADCは、(1)共有結合を介して、Ab−Lを形成させるための、抗体の求核基と二価リンカー試薬との反応と、それに続く、薬物部分Dとの反応、及び(2)共有結合を介して、D−Lを形成させるための、薬物部分の求核基と二価リンカー試薬との反応と、それに続く、抗体の求核基との反応を含む、当業者に公知の有機化学の反応、条件、及び試薬を用いて、いくつかの経路によって調製することができる。ADCを調製するためのさらなる方法が本明細書に記載されている。
Ab−(L−D)p
A.抗体を用いた突然変異体SMOの診断方法及び検出方法
一態様では、本発明の抗体は、生体試料中の突然変異体SMOの存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態では、生体試料は、細胞又は組織、例えば、腫瘍組織を含む。
一態様では、本明細書に記載の核酸プローブは、生体試料中の突然変異体SMO核酸の存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態では、生体試料は、細胞又は組織、例えば、腫瘍組織を含む。
突然変異体SMOは、限定されないが、腫瘍試料又は突然変異体SMOを含むことが疑われる組織の組織学的調製物の腫瘍試料インビトロ免疫組織化学的染色などの、突然変異体SMO検出抗体と細胞試料の表面との結合を含む、当技術分野で公知の細胞に基づくアッセイで検出することができる。Hhシグナル伝達が起こるかどうかを(例えば、経路成分の活性化、Gliの発現などを測定することによって)決定するために、組織試料をGDC−0449及びヘッジホッグと接触させる機能的アッセイがある。GDC−0449を用いて混乱させることができる、Hhシグナル伝達経路を用いる任意の機能的アッセイを本発明の方法で用いて、突然変異体SMOの存在を決定することができる。
本発明は、突然変異体SMOに結合する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。任意の特定の作動様式に拘泥するものではないが、GDC−0449が野生型SMOに結合して、突然変異体SMOには結合しないのと同じように、突然変異体SMOの阻害剤として作用する化合物であれば、第6膜貫通ドメイン(TM6)のカルボキシ末端部分内の同じ領域中で突然変異体SMOに結合するであろうと考えられる。したがって、突然変異体SMOタンパク質のこの領域を発現させ、化合物のライブラリーを用いる結合アッセイを当技術分野で公知の任意の手段によって実行することができる。また、GDC−0449の潜在的な接触点に基づくモデリング手法を用いて、GDC−0449のバリエーションによって表されるより小さい化合物ライブラリーを使用し、その後、突然変異体SMOとGDC−0449のバリエーションの類似の接触点をモデリングすることもできる。そのようなモデリングプログラム及びアルゴリズムは、当技術分野で公知である任意のものであってもよい。野生型と突然変異体SMOの両方の阻害剤となる、突然変異体SMO及び野生型SMOに結合する化合物を同定することができる。或いは、突然変異体SMOには結合するが、野生型SMoには結合せず、それゆえ、突然変異体SMOのみに対する阻害剤となる化合物を発見することができる。
本発明は、GDC−0449などの化学療法化合物に対して耐性であるヘッジホッグシグナル伝達依存性腫瘍を有する患者を、突然変異体SMOに結合する化合物で治療する方法を提供する。
本発明の抗体は、例えば、インビトロ、エクスビボ、及びインビボの治療方法で使用することができる。一態様では、本発明は、インビボ又はインビトロのどちらかで、癌を治療し、望まない細胞増殖を阻害し、癌の転移を阻害し、かつ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、抗体と突然変異体SMOとの結合が許容される条件下で、細胞を本発明の抗体に曝露することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、細胞は、骨髄性白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、腎細胞癌細胞、及び膠芽腫細胞である。一実施形態では、本発明の抗体は、突然変異体SMOの活性を阻害するために使用することができ、この方法は、突然変異体SMOの活性が阻害されるように、突然変異体SMOを本発明の抗体に曝露することを含む。
アミノ酸位置518でのスムースンドの突然変異に起因するGDC−0449耐性腫瘍を治療するために使用し得る小分子化合物には、以下のものがある。
新規のHh経路阻害剤GDC−0449による広範な転移性疾患を有する髄芽腫患者の治療が、治療に対する劇的かつ迅速な応答をもたらすことが最近実証された(Charles M.Rudinら(2009)N.Engl.J.Med.361:1173−1178)。GDC−0449は、PTCH1の喪失後に活性化されるようになるGタンパク質共役様受容体のスムースンド(SMO)を標的とする(Charles M.Rudinら(2009)N.Engl.J.Med.361:1173−1178;Molckovsky,A.及びL.L.Siu(2008)J.Hematol.Oncol.1:20)。
試薬及びコンストラクト。KAAD−シクロパミンは、Toronto Research Chemicals Inc.から購入した(カタログ番号K171000)。GDC−0449は、Genentechで作製された(A.Molckovsky及びL.L.Siu(2008)J.Hematol.Oncol.1:20)。Hh阻害剤は全て、100%DMSO(Sigma)中の30mMのストックとして−20℃で保存した。ヒトSMO、ヒトPTCH1(転写物変異体1b、GenBank NM_000264.3)、及びeGFPをpRK5(BD Biosciences)にクローニングし、CMVプロモーターから発現させた。点突然変異を、Stratagene製のQuikChange II Site−Directed Mutagenesis Kit(カタログ番号200524)を用いて導入し、野生型及び突然変異体ヒトSMOのカルボキシ末端にFLAGタグを、Invitrogen製のPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(カタログ番号11304−011)を用いるPCRによって導入した。(Muroneら(1999)Curr Biol.9:76−84)は、以前にHhルシフェラーゼレポーターGli−BSを記載しており、ウミシイタケトランスフェクション対照プラスミド(pRL−TK)は、Promega製である(カタログ番号E2241)。全てのコンストラクトをシークエンシングによって確認した。
E518はGDC−0449によるSMO阻害に重要である。本発明者らは、SMOのシグナリング活性を劇的に変化させることなく、GDC−0449結合、及び腫瘍成長を抑制するその能力を妨げる、このタンパク質中の保存されたアスパラギン酸残基の2つの突然変異を以前に報告した(Yauch R.Lら(2009)Science 326:572−574)。本発明者らは、アラニンスキャン突然変異生成手法を用いて、GDC−0449結合に極めて重要なSMO中のさらなる残基を同定した(図1A)。GDC−0449が、GPCRのそのリガンドへの結合によく似た様式でSMOに結合することを考慮して、本発明者らは、そのような相互作用に重要であることが知られている領域を突然変異させた(Rosenbaum D.M.ら(2009)Nature 459:356−363)。これらには、膜貫通ヘリックス(TM)3、TM5、TM6、及びTM7、並びに細胞外ループ中の隣接アミノ酸が含まれる。SMOの第3細胞外ループ全体は、その開始点にD473を含むので、それも本発明者らのスクリーニングに含まれた。本発明者らは、薬物結合の喪失を一次読み出しとして用いて、合計102個のSMO突然変異体を解析した(データは示さない)。GDC−0449結合に欠陥があることが分かった21個の新しいSMO突然変異体の大半は、不活性であり、かつ/又は細胞表面で発現されなかった。SMO−E518Aは、1μMのGDC−0449の存在にもかかわらず、顕著なシグナリング活性を示し、GDC−0449に対して部分的に耐性であることが分かった(図1B;データは示さない)。次に、本発明者らは、この位置の電荷を反転させ、かつ単一ヌクレオチド変化によって達成することができるより大きなアミノ酸置換を導入した。このSMO−E518K突然変異体は、SMO−WTと同程度の活性を有し、さらに、最大1μMまで、GDC−0449に対して完全に耐性である(データは示さない;図1B)。したがって、本発明者らは、E518を、GDC−0449に対する耐性を付与することができるSMO中の新規の突然変異部位候補として同定した。
化学的に多様なHPIのスクリーニングにより、いくつかのSMOE518Kアンタゴニストが同定された。SMO突然変異体阻害剤をGDC−0449耐性腫瘍の潜在的な治療剤として同定するために、本発明者らは、野生型タンパク質に対する強力な活性を有する53個のアンタゴニストのパネル(代表的な化合物を図2Aに示す)をスクリーニングした(図2B)。これらの化合物は、高スループットスクリーニング(自前のものと他者によるものの両方)で同定されたか、又は従来的な医薬品化学の方法を用いて、スクリーニングヒットのヒットからリードへの最適化(hit−to−lead optimization)によって作製された。C3H10T1/2細胞に、野生型又は突然変異体SMO発現ベクターをGli−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトとともにコトランスフェクトし(Murone M.ら(1999)Curr.Biol.9(2):76−84)、経路の活性化を1μMの化合物の存在下又は非存在下で測定した。興味深いことに、ベンズイミダゾールHhAntag(Romer J.T.ら(2004)Cancer Cell、6:229−240)は、GDC−0449とのいくつかの構造的類似性にもかかわらず、全てのSMO対立遺伝子に対して本質的に等しい効力を有し、これら2つの化合物間の構造活性相関(SAR)の微妙な違いを示した。化合物1によって例示されるように(A、B、及びC環の命名法については、図2A参照)、GDC−0449の様々なC環アミド誘導体は、SMOD473Hに対して弱い効力を示した。対照的に、HhAntagの多くのC環アミド誘導体は効力を保持し(データは示さない)、HhAntagに見られるベンズイミダゾールA環が、このSMO突然変異体の阻害において、GDC−0449に見られる2−ピリジルA環よりも優れていることが実証された。他のA環置換を見ると、キナゾリン(化合物2によって表される)が不活性であることが分かった一方で、ビス−アミド化合物3は、GDC−0449と同一のC環を有するにもかかわらず、測定可能な活性を示した。このビス−アミドの一般的なクラスは、化合物4及び5によって例示される、最適な置換パターンが見出されれば、SMO−D473Hに対する改善された効力を示した。C環はSMO−D473Hの阻害に明白に寄与するが、本発明者らのSAR観察結果は、A環の置換が最も劇的に効力を改善することができることを示唆している。具体的には、ベンズイミダゾールHhAntag及びビス−アミド化合物3〜5に見られるように、SMO−D473Hに結合するとき、水素結合受容体単独と比べて、水素結合供与体と水素結合受容体の両方を有するA環が好ましい。逆に、化合物1がこの突然変異体に対する強い効力を示すので、SMO−E518Kの効率的な阻害は、GDC−0449のC環を置換することによって達成することができる。さらに、SMO−E518Kが、天然植物アルカロイドのシクロパミンに対して完全に耐性であるが、ヒラジノイミン(hyrazinoimine)のSANT−1に対して感受性である(Chen J.Kら(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:14071−14076)のに対し、SMO−D473Hは、両方の化合物に対して部分的に耐性であり、これら2つのGDC−0449耐性突然変異体の阻害のための要件が異なるという研究結果が裏付けられている。本発明者らは、HhAntagを、マウスのHhシグナリングを遮断するツール化合物として、ルーチンに使用しているが、この阻害剤は、ヒト肝細胞によって迅速に代謝されるため、治療剤としては好適ではない(SEG、未発表の観察結果)。本発明者らの目的は、獲得されたGDC−0449耐性を臨床で克服することができるSMOアンタゴニストを同定することであったので、本発明者らは、ビス−アミドクラスの阻害剤にその取り組みを集中させた。この群由来の14の薬物候補のうちの3つだけが、マウスにおける良好な薬物動態特性を示した(データは示さない)。
一側面において、本発明は以下の発明を包含する。
(発明1)
配列番号1と少なくとも95%同一であり、アミノ酸518でグルタミン酸以外のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、突然変異体SMOタンパク質をコードする単離された核酸分子。
(発明2)
前記突然変異体SMOタンパク質が、アミノ酸518でアラニン(A)又はリジン(K)を含む配列番号2のアミノ酸配列を含む、発明1に記載の単離された核酸配列。
(発明3)
アミノ酸518をコードする配列が異なるアミノ酸をコードするように変化させる突然変異を含む、配列番号3の親核酸配列を含む、発明1に記載の単離された核酸配列。
(発明4)
アミノ酸518をコードする配列中に突然変異を取り込んでいる突然変異SMOタンパク質又はその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、核酸プローブ。
(発明5)
前記突然変異SMO又は前記その断片をコードする前記核酸に相補的である、発明4に記載のプローブ。
(発明6)
約10〜約50ヌクレオチドの長さを有する、発明4に記載のプローブ。
(発明7)
検出可能な標識をさらに含む、発明4に記載のプローブ。
(発明8)
配列番号2と少なくとも95%同一であり、アミノ酸518でグルタミン酸以外のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、単離された突然変異体SMOタンパク質。
(発明9)
アミノ酸518でグルタミン酸以外のアミノ酸を含む配列番号2のアミノ酸配列を含む、発明8に記載の単離された突然変異体SMOタンパク質。
(発明10)
前記アミノ酸配列が、アミノ酸518でアラニン(A)又はリジン(K)を含む、発明8又は9に記載の単離された突然変異体SMOタンパク質。
(発明11)
発明8又は9に記載の突然変異体SMOタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体のエピトープが、位置518でグルタミン酸を有する野生型SMOと結合しない、抗体。
(発明12)
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、又はこれらの抗原結合断片である、発明11に記載の抗体。
(発明13)
細胞毒性剤にコンジュゲートされている、発明11に記載の抗体。
(発明14)
SMO活性を阻害する、発明11に記載の抗体。
(発明15)
試料中の突然変異SMO遺伝子を検出する方法であって、前記試料から、突然変異を含むことが疑われるSMOの膜貫通ドメイン7のカルボキシ末端又はその断片に対応する核酸を増幅すること、及び増幅された核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型SMO遺伝子又はその断片の電気泳動移動度と比較することを含む、方法。
(発明16)
前記電気泳動移動度がポリアクリルアミドゲル上で決定される、発明15に記載の方法。
(発明17)
試料中の少なくとも1つのSMO突然変異を同定する方法であって、前記試料由来の核酸を、アミノ酸518をコードする配列をグルタミン酸以外のアミノ酸に変化させる突然変異を取り込んでいる突然変異SMOタンパク質又はその断片をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させること、及び前記ハイブリダイゼーションを検出することを含む、方法。
(発明18)
前記プローブが検出可能に標識されている、発明17に記載の方法。
(発明19)
前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、発明17に記載の方法。
(発明20)
前記試料中の前記核酸のSMO遺伝子又はその断片を増幅し、前記プローブと接触させる、発明17に記載の方法。
(発明21)
GDC−0449による治療に対して耐性であるヒト対象の腫瘍を同定する方法であって、前記腫瘍の試料中の突然変異SMO遺伝子又は突然変異SMOタンパク質の存在を決定することを含み、ここで、前記突然変異がアミノ酸518をコードするSMO遺伝子中に位置しており、前記突然変異SMO遺伝子又は突然変異SMOタンパク質の存在により、前記腫瘍がGDC−0449による治療に対して耐性であることが示される、方法。
(発明22)
GDC−0449による治療に対して感受性がない腫瘍を有する前記対象を、前記突然変異SMOに結合する化合物で治療することをさらに含む、発明21に記載の方法。
(発明23)
前記突然変異の存在又は不在を核酸試料の検査によって実施する、発明21に記載の方法。
(発明24)
前記突然変異の存在又は不在をタンパク質試料の検査によって実施する、発明21に記載の方法。
(発明25)
アミノ酸518で突然変異が取り込まれている突然変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、前記突然変異体SMOを試験化合物と接触させること、及び前記化合物と前記突然変異体SMOとの結合を検出することを含み、前記試験化合物と突然変異体SMOとの結合により、前記試験化合物が突然変異体SMOの阻害剤であることが示される、方法。
(発明26)
アミノ酸518で突然変異が取り込まれている突然変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、前記突然変異体SMOを発現する細胞を試験化合物と接触させること、及び前記細胞内のGliの活性を検出することを含み、Gli活性の存在により、前記試験化合物が突然変異体SMOの阻害剤でないことが示される、方法。
(発明27)
位置518でグルタミン酸以外のアミノ酸を生じさせる突然変異を有する突然変異体SMOタンパク質に特異的に結合する化合物を、癌治療を必要としている患者に投与することによって癌を治療する方法。
(発明28)
前記化合物が、位置518でグルタミン酸以外のアミノ酸を有する突然変異体SMOに特異的に結合する抗体である、発明27に記載の方法。
(発明29)
前記化合物が、式I、II、及び/又はIIIの化合物である、発明27に記載の方法。
SMO阻害剤に対する耐性の獲得を遅延させるか又は予防する方法であって、
(a)式I、式II、及び式IIIの構造式を有する化合物からなる群から選択されるSMO阻害剤、並びに
(b)PI3K阻害剤
を、それを必要としている患者に投与することを含む、方法。
Claims (8)
- 配列番号2と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号2の518番目のアミノ酸の位置で、アラニン(A)又はリジン(K)を有する、単離された突然変異体SMOタンパク質であり、前記突然変異体SMOタンパク質は、SMO活性を維持し、且つGDC−0449に対して少なくとも部分的に耐性を有する、該タンパク質。
- 請求項1に記載の単離された突然変異体SMOタンパク質であって、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号2の518番目のアミノ酸の位置で、アラニン(A)又はリジン(K)を有する、該タンパク質。
- 請求項1又は2に記載の単離された突然変異体SMOタンパク質であって、前記アミノ酸配列が、配列番号2の518番目のアミノ酸の位置で、アラニン(A)を有する、該タンパク質。
- 請求項1又は2に記載の単離された突然変異体SMOタンパク質であって、前記アミノ酸配列が、配列番号2の518番目のアミノ酸の位置で、リジン(K)を有する、該タンパク質。
- 配列番号2と少なくとも95%同一であり、配列番号2の518番目のアミノ酸の位置で、アラニン(A)又はリジン(K)を有するアミノ酸配列を含む、突然変異体SMOタンパク質をコードする単離された核酸分子であり、前記突然変異体SMOタンパク質は、SMO活性を維持し、且つGDC−0449に対して少なくとも部分的に耐性を有する、該核酸分子。
- 試料中の突然変異SMO遺伝子を検出する方法であって、
前記突然変異SMO遺伝子は突然変異したSMOタンパク質をコードし、
前記突然変異したSMOタンパク質は、SMO活性を維持し、且つGDC−0449に対して少なくとも部分的に耐性を有し、
前記突然変異したSMOタンパク質は、配列番号2の518番目のアミノ酸の位置で、アラニン(A)又はリジン(K)を有しており、前記突然変異したSMOタンパク質は、配列番号2と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み、
前記方法は:
SMOの膜貫通ドメイン7の少なくとも一部をコードするSMO遺伝子の一部に対応する核酸を前記試料からrtPCRシークエンシングすることであって、ここで、前記SMOの膜貫通ドメイン7の少なくとも一部は、配列番号2の518番目のアミノ酸に対応するアミノ酸を含み、前記核酸は少なくとも20ヌクレオチドの長さを有する、該rtPCRシークエンシングすること;及び、
前記シークエンシングしたSMO遺伝子を野生型のSMO遺伝子又はこれらの断片と比較することを含み、前記野生型のSMO遺伝子又はこれらの断片は配列番号2の518番目のアミノ酸をコードする野生型のSMO遺伝子の一部に対応する核酸を含む、方法。 - GDC−0449による治療に対して耐性であるヒト対象の腫瘍を同定する方法であって、前記腫瘍の試料中の突然変異SMO遺伝子又は突然変異SMOタンパク質の存在を決定することを含み、ここで、突然変異SMOタンパク質は、請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異体SMOタンパク質であり、前記突然変異SMO遺伝子は、請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異体SMOタンパク質をコードし、前記突然変異SMO遺伝子又は突然変異SMOタンパク質の存在により、前記腫瘍がGDC−0449による治療に対して耐性であることが示される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物についてスクリーニングする方法であって、
a)前記突然変異体SMOを試験化合物と接触させること、及び前記化合物と前記突然変異体SMOとの結合を検出することを含み、前記試験化合物と突然変異体SMOとの結合により、前記試験化合物が突然変異体SMOの阻害剤であることが示される、並びに/又は
b)前記突然変異体SMOを発現する細胞を試験化合物と接触させること、及び前記細胞内のGliの活性を検出することを含み、Gli活性の存在により、前記試験化合物が突然変異体SMOの阻害剤でないことを示す、
方法。
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