JP5894436B2 - アイソフォーム特異的抗ｈｅｒ４抗体 - Google Patents

アイソフォーム特異的抗ｈｅｒ４抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP5894436B2
JP5894436B2 JP2011537710A JP2011537710A JP5894436B2 JP 5894436 B2 JP5894436 B2 JP 5894436B2 JP 2011537710 A JP2011537710 A JP 2011537710A JP 2011537710 A JP2011537710 A JP 2011537710A JP 5894436 B2 JP5894436 B2 JP 5894436B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
her4
cancer
isoform
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2011537710A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2012509896A (ja
Inventor
マーク エックス． スリウコフスキー，
マーク エックス． スリウコフスキー，
クラウス エレニウス，
クラウス エレニウス，
マイヤ ホールメン，
マイヤ ホールメン，
Original Assignee
ジェネンテック， インコーポレイテッド
ジェネンテック， インコーポレイテッド
ユニバーシティ オブ トゥルク
ユニバーシティ オブ トゥルク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェネンテック， インコーポレイテッド, ジェネンテック， インコーポレイテッド, ユニバーシティ オブ トゥルク, ユニバーシティ オブ トゥルク filed Critical ジェネンテック， インコーポレイテッド
Publication of JP2012509896A publication Critical patent/JP2012509896A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5894436B2 publication Critical patent/JP5894436B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

（関連出願）
この出願は、その開示を出典明示によりここに援用する２００８年１１月２５日に出願された米国仮出願第６１／１１７９０３号に対して米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する。
本発明は、癌を検出し治療するのに有用な抗体及びその抗体を使用する方法に関する。
ＥｒｂＢ／ＨＥＲレセプターは、ＥＧＦＲ(ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１としても知られている)、ＨＥＲ２(ｃ-Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、及びＨＥＲ４(ＥｒｂＢ４)を含むレセプターチロシンキナーゼのサブファミリーを形成する。ＥｒｂＢレセプターは、細胞性応答、例えば細胞の増殖、分化、遊走、又は生存に至る多くのＥＧＦ-様増殖因子により、選択的に活性化される。ＥｒｂＢレセプターは、グリコシル化された細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、及びチロシンキナーゼ酵素を含む細胞内ドメインからなる。レセプター細胞外ドメインに結合するリガンドが、レセプター二量体化、続くキナーゼドメインの活性化、レセプターの自己リン酸化、及び複数の下流シグナル伝達カスケードを惹起させる(１)。
ＥＧＦＲ及びＨＥＲは、十分に確立された癌遺伝子及び抗癌剤標的である。それらは種々の上皮及び神経の悪性腫瘍の病因に関係しており、それらの活動過剰には芳しくない患者予後(２−４)が伴う。これらのレセプターの機能を遮断するモノクローナル抗体及び小分子量キナーゼインヒビターの双方を含む標的化治療剤は、臨床試験において患者の生存に対して治療的効果を示した。セツキシマブ(アービタックスＴＭ, Imclone, Inc.)は、ＥＧＦＲに結合するリガンドを遮断し、レセプター二量体化、自己リン酸化、及びシグナル伝達経路の活性化の減少に至らしめるキメラモノクローナル抗体である(５)。セツキシマブは、現在、後期化学療法抵抗性の結腸直腸癌、及び局所性又は領域性に進行した頭部頸部の扁平上皮細胞癌における臨床的用途について承認されている。トラスツズマブ(ハーセプチンＴＭ, Genentech, Inc.)は、双方のアジュバント設定と進行した疾患の双方におけるＥｒｂＢ２過剰発現乳癌の治療に現在使用されている、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに対するヒト化モノクローナル抗体である(６−９)。
ＨＥＲ４レセプターアンタゴニストは、平滑筋細胞の過剰の遊走及び／又は増殖の調節、特に狭窄の治療に有用であることが示されている。米国特許第７３３２５７９号を参照。
癌におけるＨＥＲ４の意義は十分には理解されていない。いくつかの観察では、ＨＥＲ４レセプターは種々の癌においてダウンレギュレーションされており、又はその発現が有益な予後マーカー、例えばエストロゲンレセプター発現に関連していることが示されている(１０、１１)。他方、ＨＥＲ４は、いくつかの癌、例えば甲状腺癌(１２)、卵巣癌(１３)、及び乳癌(１４)、並びに髄芽腫(１５)、及び上衣腫(１６)において、高発現レベルを有していることが報告されている。さらに、臨床成績に対するＨＥＲ４発現レベルの意義は矛盾している(１７)。これらの矛盾したデータについてのもっともらしい説明の一つは、４つの構造的及び機能的に異なるアイソフォームが、選択的スプライシングにより単一のＨＥＲ４遺伝子から産生されることである(１８、１９)。これらのアイソフォームは異なる組織分配プロファイルを有し、乳癌細胞株において腫瘍形成を促進させるその能力で異なっている(２６)。
従って、ＨＥＲ４媒介疾患をより正確に治療するためにＨＥＲ４レセプターの特異的なアイソフォームに対する治療剤を提供することが望ましい。
本発明の一態様は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する単離された抗ＨＥＲ４抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生される抗ＨＥＲ４抗体ｍＡｂ１４７９と、ＪＭ-ａアイソフォームへの結合について競合する。他の実施態様では、抗体は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９が結合するエピトープと同じエピトープに結合する。いくつかの実施態様では、抗体は、キメラ、ヒト、又はヒト化抗体である。
他の実施態様では、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する単離された抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９からの断片を含む。一実施態様では、断片は、モノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９の可変領域を含む。いくつかの実施態様では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は親和性成熟している。一実施態様では、単離された抗ＨＥＲ４抗体は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９又はそのヒト型を含む。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＨＥＲ４抗体は細胞傷害剤に結合している。
いくつかの実施態様では、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する単離された抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的ではない抗ＨＥＲ４抗体よりも心毒性が低い。
本発明の他の態様は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を癌細胞と接触させることを含む、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４外部ドメインの脱落を低減する。いくつかの実施態様では、癌細胞は乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫の細胞である。
本発明の他の態様は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌がＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する患者における癌を治療する方法を提供する。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４外部ドメインの脱落を低減する。いくつかの実施態様では、治療される癌は、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である。
本発明の他の態様は、癌細胞がＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する患者を選択し、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を患者に投与することによる、患者における癌を治療する方法を提供する。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４外部ドメインの脱落を低減する。いくつかの実施態様では、治療される癌は、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である。
本発明の他の態様は、癌細胞が同じ組織型の非癌細胞と比較して脱落したＨｅｒ４外部ドメインの増加したレベルを有する患者を選択し、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を患者に投与することによる、患者における癌を治療する方法を提供する。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４外部ドメインの脱落を低減する。いくつかの実施態様では、治療される癌は、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である。
本発明の他の態様は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌患者における癌治療に伴う心毒性リスクを低減する方法を提供する。一実施態様では、患者の癌はＨＥＲ４ＪＭ-ａアイソフォームを過剰発現している。一実施態様では、患者の癌は、同じ組織型の非癌細胞と比較して脱落したＨｅｒ４外部ドメインの増加レベルを有している。いくつかの実施態様では、患者の癌は乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である。
本発明の他の態様は、ＪＭ-ａＨＥＲ４アイソフォームに特異的に結合する抗体と細胞を接触させることを含む、細胞の試料中の脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出する方法を提供する。
本発明のさらなる他の態様は、腫瘍における脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出することを含む、患者における腫瘍を診断する方法を提供する。一実施態様では、検出方法は、腫瘍から得られた試料と、ＨＥＲ４のＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体を接触させることを含む。一実施態様では、本方法は、非癌性コントロール試料における脱落したＨＥＲ４外部のレベルに対して、腫瘍における脱落したＨＥＲ４細胞外ドメインのレベルを比較することを含む。
図１は、オルタナティブ膜近傍ドメインＨＥＲ４アイソフォームであるＪＭ-ａ(配列番号：１)及びＪＭ-ｂ(配列番号：２)を示す図である。 図２は、ある種のＨＥＲ４モノクローナル抗体の特徴を記載した表である。 図３は、ＨＥＲ４アイソフォームＪＭ-ａ ＣＹＴ-２又はＪＭ-ｂ ＣＹＴ-１を発現するＣＯＳ-７細胞に対する、ｍＡｂ１４７９、及びコントロール抗体ｓｃ-２８３の結合特異性を示すウエスタンブロット分析である。 図４は、種々のＥｒｂＢレセプターを安定して発現するＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ及びＮＲ６に対する、ｍＡｂ１４７９、及びコントロール抗体である抗ＥＧＦＲ(ｓｃ-０３)、抗ＨＥＲ２(ｓｃ-２８４)、抗ＨＥＲ３(ｓｃ-２８５)の結合特異性を示すウエスタンブロット分析である。 図５は、細胞酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)(グレーのカラム)により分析した場合の、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２、ＨＥＲ４ ＪＭ-ｂ ＣＹＴ-１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、又はＨＥＲ３を発現するＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ及びＮＲ６形質移入体に対する、ｍＡｂ１４７９の結合特異性を示すグラフである。ｍＡｂ１４７９の結合性を、希釈１：１０００(左)又は１：１００(右)で、抗ＥＧＦＲ(ｓｃ-０３)、抗ＨＥＲ２(ｓｃ-２８４)、抗ＨＥＲ３(ｓｃ-２８５)及び抗ＨＥＲ４(ｓｃ-２８３)の結合性(全てのコントロール抗体の結合性は白いカラム)と比較した。 図６は、ヒト腎臓組織ライセートにおける脱落したＨＥＲ４外部ドメイン、及び組換えＨＥＲ４外部ドメインに対する、ｍＡｂ１４７９の結合性を示すウエスタンブロット分析である。 図７は、組換えＨＥＲ４外部ドメインとｍＡｂ１４７９を用いて実施されたインビトロ結合アッセイの結果を示す。 図８は、組換えＨＥＲ４外部ドメインに結合するｍＡｂ１４７９を測定する酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)の非線形親和性曲線である。 図９は、外部ドメインの脱落を検出するためにｍＡｂ１４７９を使用した、１７対の正常な乳腺(Ｎ)／乳腺腫瘍(Ｔ)組織試料のウエスタンブロット分析である。１００ｋＤａのＨＥＲ４外部ドメイン(グレー)及び１５０ｋＤａの完全長ＨＥＲ４(白)の発現レベルの濃度測定定量を、各ウエスタンレーンの下に示す。 図１０は、濃度測定により定量された１７の適合した正常及び乳腺腫瘍組織対における、ＨＥＲ４外部ドメイン及び完全長レセプターの平均発現度を示すグラフである。＊、外部ドメインとして存在する全ＨＥＲ４のフラクションは、適合した正常な組織コントロールと比較した場合、腫瘍組織内の方が大きい(グレーの四角形；Ｐ＜０．０５；ウィルコクソン符号順位検定)。 図１１Ａは、ＮＲＧ-１刺激ＭＣＦ-７乳癌細胞のＨＥＲ４チロシンリン酸化に対するｍＡｂ１４７９の効果を示すウエスタンブロット分析である。膜は、コントロールとして抗ＨＥＲ４(Abcam)及び抗アクチンで再ブロットされた。 図１１Ｂは、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２を発現するＣＯＳ-７形質転換体の培養培地での、１００ｋＤａのＨＥＲ４外部ドメインの脱落に対するｍＡｂ１４７９の効果を示すウエスタンブロット分析である。同じ実験からの全細胞ライセートを、抗ＨＥＲ４(Abcam)及び抗アクチンを用いたウエスタンブロットにより分析した。 図１２は、ＨＥＲ４の切断可能なＪＭ-ａアイソフォームのユビキチン化に対するｍＡｂ１４７９の効果を示すウエスタンブロット分析である。 図１３は、ＨＥＲ４発現レベルに対するｍＡｂ１４７９の効果を示すウエスタンブロット分析である。 図１４は、コントロール抗体２Ｃ４と比較した場合の、ヒト乳癌細胞株Ｔ-４７Ｄ及びＭＣＦ-７の増殖に対するｍＡｂ１４７９の効果を示すグラフである。 図１５は、軟寒天コロニー形成アッセイにより示された、コントロール抗体３ｇ６と比較した場合の、ヒト乳癌細胞株Ｔ-４７Ｄ及びＭＣＦ-７の足場非依存性増殖に対するｍＡｂ１４７９の効果を示すグラフである。
定義
他に定めない限り、ここで使用される技術及び科学用語は、この発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有しており、Singleton等 1994 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第2版., J. Wiley & Sons, New York, NY；及びJaneway等 2001 Immunobiology: the immune system in health and disease 第5版, Garland Publishing, New Yorkと一致する。
ここで使用される「ＨＥＲ４ポリペプチド」又は「ＨＥＲ４レセプター」なる用語は、特に又は文脈上他の定義が示されない限り、例えば欧州特許出願第(ＥＰ)５９９２７４号；Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)；及びPlowman等, Nature, 366:473-475(1993)に開示されているＨＥＲ４遺伝子から産生される任意の天然又は変異ポリペプチドを意味する。一実施態様では、ＨＥＲ４遺伝子はヒトＨＥＲ４遺伝子である。「ＨＥＲ４」及び「ＥｒｂＢ４」なる用語は、当該分野で交換可能に使用される。本用語は、天然に生じた形態、天然に生じた変異形態(例えば、選択的スプライシング型)、天然に生じた対立遺伝子変異体を含み、天然に生じた翻訳後修飾、例えばグリコシル化及びＧＰＩ修飾を包含する。
「野生型」なる用語は、一般的に、天然に生じたＨＥＲ４タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。
「天然配列ポリペプチド」は、天然由来の対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ポリペプチドは天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって生産できる。「天然配列ポリペプチド」なる用語は、特に、特定のポリペプチドの天然に生じる切断又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じた変異型(例えば、選択的スプライシング型)、及びポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体を包含し、天然に生じる翻訳後修飾、例えばグリコシル化を含みうる。
「アミノ酸配列変異体」なる用語は、主要な天然配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有する天然に生じたポリペプチドを意味する。アミノ酸配列変異体は、アミノ酸配列内の所定の位置に置換、欠失及び／又は挿入を有する。
「配列同一性」は、最大の配列同一性が達成されるように、配列を整列させ、必要ならば間隙を導入した後に、同一であるアミノ酸配列変異体における残基の割合と定義される。アラインメントの方法及びコンピュータプログラムは、当該分野でよく知られている。このようなコンピュータプログラムの一つは、Genentech社が著作し、１９９１年１２月１０日にアメリカ合衆国著作権庁(ワシントンＤＣ 20559)にユーザー文書と共に出願され、そのコードが国際公開第２００７／００１８５１号に見出される「Ａｌｉｇｎ２」である。
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に持たないポリペプチドの形態を意味する。本発明のポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのそのタイプを同定するために当該分野において日常的に使用されている基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれの末端からも約５アミノ酸を越えない場合が多い。
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を包含する(Miller等 2003 Jour. of Immunology 170:4854-4861)。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種由来でありうる。抗体は、特定の抗原を認識し、それに結合することができるタンパク質である(Janeway等 2001 Immunobiology: the immune system in health and disease, 第5版., Garland Publishing, New York)。一般的に、標的抗原は、複数の抗体上のＣＤＲｓにより認識される、エピトープとも称される多くの結合部位を有する。種々のエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。よって、一つの抗原は、一つを越える対応する抗体を有し得る。抗体は、全長免疫グロブリン分子、又は全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち関心ある標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を有する分子が含まれ、そのような標的は、限定されるものではないが、癌細胞、又は自己免疫疾患に関連した自己免疫抗体を産生する細胞を含む。ここで開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ)、クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２)、又はサブクラスのものでありうる。免疫グロブリンは、任意の種、例えばヒト、マウス、又はウサギ由来のものでありうる。抗体の種々のクラスの構造及び特性については、Basic & Clinical Immunology, 第8版, Stites and Terr (編), Mcgraw-Hill, Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994 第6章を参照。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖(カッパ及びラムダと称される２つのタイプがある)及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
「親抗体」は、天然又は野生型配列を含みうる。親抗体は、関心ある標的抗原、すなわち生物学的に重要なポリペプチドに対して産生されうる。非ポリペプチド抗原に対して産生された抗体(例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号)も考慮される。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、抗体は、（１）ローリー法で測定して抗体の９５重量％を越えるまで；（２）スピニングカップシークエネーターを使ったＮ末端又は内在するアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー又は銀染色を用いた還元又は非還元状態の下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより見かけ上均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の少なくとも一成分が存在しないことから、組換え細胞内のインサイツ抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程によって調製されるであろう。
「抗体断片」には、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；ミニボディ(minobodies)(米国特許第５６４１８７０号，実施例２；Zapata等 1995 Protein Eng. 8(10): 1057-1062)；Olafsen等 2004 Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、ＣＤＲ(相補性決定領域)、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原に免疫特異的に結合する上述のいずれかのエピトープ結合断片、単鎖抗体分子；及び抗体断片により形成される多重特異性抗体が含まれる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在し、グリコシル化差異を有しうる天然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の抗体に汚染されないで合成されうる点で有利である。さらに、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等 1975 Nature 256:495に記載のハイブリドーマ法により作製可能であるし、又は組換えＤＮＡ法により作製することもできる(例えば：米国特許第４８１６５６７号；米国特許第５８０７７１５号を参照)。ハイブリドーマ法において、マウス、又は他の適切な宿主動物、例えばハムスターは、免疫化に使用されるタンパク質に対して特異的に結合するであろう抗体を産生するか又は産生可能なリンパ球を生じさせるために、上述したようにして免疫化される。また、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。免疫化後、リンパ球は単離され、ついで適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを使用してメラノーマ細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞が形成される(Goding 1986 Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.59-103Academic Press)。また、抗体は、Clackson等 1991 Nature 352:624-628；Marks等 1991 J. Mol. Biol. 222:581-597に記載の技術を使用し、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖の定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)で、相同マウス配列を置換することにより(米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison等 1984 Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851)、又は非免疫グロブリンポリペプチド(異種ポリペプチド)のコード化配列の全て又は一部と、免疫グロブリンコード化配列とを融合させることにより、「キメラ又は融合抗体ポリペプチド」が産生されるように修飾されうる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインを置換するか、あるいはそれらは、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体をつくるために抗体の一つの抗原結合部位の可変領域を置換することができる。
ここで、抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来、あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison等 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855)。ここで関心あるキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿等)から誘導される可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化(primatized)」抗体を含む。
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト抗体から誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全ての高度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより互いに保持された双方のＨ鎖のカルボキシ-末端部分を有する。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列により決定され、該領域はある種の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)により認識される部分である(Jones等 1986 Nature 321:522-525；Riechmann等 1988 Nature 332:323-329；Presta 1992 Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596；Verhoeyen等 1988 Science 239:1534-1536；Sims等 1993 J. Immunol. 151:2296；Chothia等 1987 J. Mol. Biol. 196:901)。他の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワーク領域を使用する(Carter等 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta等 1993 J. Immunol. 151:2623)。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しており、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。免疫化時に、内在性免疫グロブリン産生の不在下において、ヒト抗体の全レパートリーを産生可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)が利用できる。例えば、キメラ及び生殖細胞株列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合型欠失により、内在性抗体産生の完全な阻害が生じることが記載されている。このような生殖細胞株列変異マウスへのヒト生殖細胞株列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原暴露時にヒト抗体の生産が生じる(Jakobovits等 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551；Jakobovits等 1993 Nature, 362:255-258；Bruggemann等 1993 Year in Immuno. 7:33；米国特許第５５４５８０６号；米国特許第５５６９８２５号；米国特許第５５９１６６９号；米国特許第５５４５８０７号；及び国際公開第１９９７／１７８５２号)。
「システイン操作」抗体は、任意の形態の野生型、マウス親モノクローナル抗体、ヒト又はヒト化抗体の一又は複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置き換えられたものである。操作されたシステインアミノ酸は遊離のシステイン酸であり、鎖内又は鎖間ジスルフィド単位の一部ではない。関心ある抗体の一又は複数のアミノ酸残基をコードするＤＮＡは、システインアミノ酸の一又は複数のコドンが導入され、よって遊離のシステインが、さらなる修飾のために、細胞傷害剤へのこのようなコンジュゲートに、発現した抗体において利用可能であるように、修飾又は「操作」される。
「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる所定のポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に生じるか又は合成の化合物である。細胞の細胞膜は「細胞表面暴露抗原」を提示することができる。
抗体は、抗体-抗原複合体が形成され、抗原のエピトープへのターゲティングに有用であるのに十分な親和性及び特異性を有する抗原に結合する時、関心ある標的分子又は抗原に「結合する」。抗原のエピトープは細胞表面で暴露されるか、又は単離されたタンパク質に存在し得る。
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「に対して特異的」なる用語は、特に、標的分子又は関心ある抗原又は特定の標的分子におけるエピトープ又は関心ある抗原が、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なるように結合していることを意味する。特異的結合は、例えば、一般には結合活性を有さない類似の構造の分子であるコントロール分子の結合性と比較して、分子の結合性を測定することにより、測定可能である。例えば、特異的結合は、例えば過剰の非標識標的のよな、標的に類似したコントロール分子と競合させることによって、測定可能である。この場合、プローブへの標識された標的の結合が、過剰の非標識標的により競合的に阻害されるならば、特異的結合が示される。一実施態様では、このような用語は、分子が、如何なる他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合することを意味する。あるいは、このような用語は、標的に対して、少なくとも約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、又はそれ以上のＫｄを有する分子により記述することができる。
「結合親和性」は、一般的に、分子(例えば抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有相互作用の強度の総計を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体及び抗原)間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数(Ｋｄ)により表すことができる。親和性は、ここに開示されたものを含む当該分野で知られている一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般的に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向にある一方、高親和性抗体は、一般的により素早く抗原に結合し、より長時間、結合を持続している傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当該分野で知られており、そのいずれかを本発明の目的に使用することができる。
「抗体・抗原複合体」又は「抗体・薬剤コンジュゲート・抗原複合体」が特異的結合の結果として形成される。例えば、抗体がＨＥＲ４に特異的に又はＨＥＲ４のアイソフォームに特異的に結合するものである場合、それは、通常、天然ＨＥＲ４又はそのアイソフォームに見出される一又は複数のエピトープに優先的に結合し、他の抗原又はタンパク質又は他のＨＥＲ４のアイソフォームと、十分な結合親和性を有さない抗体(例えば、非特異性結合親和性又は交差反応性)でありうる。このような実施態様では、非ＨＥＲ４、又はＨＥＲ４の他のアイソフォームへの非結合親和性又は交差反応結合性の程度は、蛍光標示式細胞分収(ＦＡＣＳ)分析又は放射性免疫沈降法(ＲＩＡ)により測定して、１０％、５％、２％、又は１％未満である。
「インタクトな抗体」は、ＶＬ及びＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域)に起因するその生物活性を意味する一又は複数の「エフェクター機能」を有しうる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合性；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)；ファゴサイトーシス；及びＢ細胞レセプター及びＢＣＲ等の細胞表面レセプターのダウンレギュレーションが含まれる。
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に相違しているという事実を意味し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原への結合性及び特異性に使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において、高頻度可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域(ＦＲｓ)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つの高頻度可変領域によって連結された、大きくはβシート配置を採る４つのＦＲ領域をそれぞれ含む。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
ここで使用される場合の「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変性であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含む；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。多くの高頻度可変領域の描写が使用され、ここに包含される。カバット相補性決定領域(ＣＤＲｓ)は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等 1991)。Chothiaは代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia及びLesk 1987 J. Mol. Biol. 196:901-917)。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらの高頻度可変領域の各々からの残基を以下に記す。特に示さないならば、タンパク質の整列された配列のカバットデータベースに従ったカバット番号付けが使用されるであろう(Wu 及び Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250；Johnson 及び Wu 2000 Nuc. Acids Res. 28(1):214-218)。高頻度可変領域又は「相補性決定領域」位置は、一般的に次の通りである：アミノ酸２４-３４(ＶＬ ＣＤＲ-Ｌ１)、アミノ酸４９-５６(ＶＬ ＣＤＲ-Ｌ２)、アミノ酸８９-９７(ＶＬ ＣＤＲ-Ｌ３)、アミノ酸２６-３５Ａ(ＶＨ ＣＤＲ-Ｈ１)、アミノ酸４９-６５(ＶＨ ＣＤＲ-Ｈ２)、及びアミノ酸９３-１０２(ＶＨ ＣＤＲ-Ｈ３)。また高頻度可変領域は、「伸展高頻度可変領域」、ＶＬ ＣＤＲ-Ｌ１についてはアミノ酸２４-３６、及びＶＬ ＣＤＲ-Ｌ２についてはアミノ酸４６-５６をさらに含むことができる。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについては上掲のKabat 1991に従い番号付けされる。ここでの目的に対して「改変された高頻度可変領域」は、そこで一又は複数(例えば１から約１６)のアミノ酸置換を含む高頻度可変領域である。ここでの目的に対して「未修飾の高頻度可変領域」は、それが誘導される非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する高頻度可変領域、すなわちそこに一又は複数のアミノ酸置換を欠くものである。
「カバットにおける可変ドメイン残基番号付け」、「カバットにおけるアミノ酸位置番号付け」及びその変形は、上掲のKabat等における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲを短くするか、又はそこに挿入される対応のより少ないか又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物(カバットに従い残基５２ａ)、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基(例えば、カバットに従い残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等)を含む。残基のカバット番号付けは、「標準的な」カバット番号の配列を有する抗体の配列を相同性領域で配列させることにより、与えられた抗体について決定されうる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義するように高頻度可変残基以外の可変ドメイン残基である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最もよく生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat等 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDにおけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはKabat等 1991におけるようなサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループはKabat等におけるようなサブグループＩＩＩである。「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等 1991の可変重サブグループＩＩＩにおけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等 1991の可変軽カッパサブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有さない抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じせしめるその一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の改変を伴うものである。親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリング(Marks等 1992 Bio/Technology 10:779-783)、又はＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発(Barbas等 1994 Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813；Schier等 1995 Gene 169:147-155；Yelton等 1995 J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson等 1995 J. Immunol. 154(7):3310-9；及びHawkins等 1992 J. Mol. Biol. 226:889-896)により、親和性成熟が生成される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強固な非共有結合の一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互作用してＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集合的には、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの高頻度可変領域だけを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性でではあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一の遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として産生された。また、抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別されるタイプの一つが割り当てられる。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に対して望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間にさらに含む(Pluckthun 1994 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315)。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内でＶＬにＶＨが結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する(欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hollinger等 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448)。
「抗体・薬剤コンジュゲート」又は「イムノコンジュゲート」なる用語は、細胞傷害剤、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はその断片)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含む。
「遊離システインアミノ酸」は、親抗体中に操作され、チオール官能基(-ＳＨ)を有し、分子内又は分子間ジスルフィド架橋として対合しないか、そうでなければその一部にはならないシステインアミノ酸残基を意味する。
「チオール反応性値」なる用語は、遊離システインアミノ酸の反応性の定量的特徴である。チオール反応性値は、チオール反応性試薬と反応するシステイン操作抗体における遊離システインアミノ酸の割合であり、最大値１に転換される。例えば、ビオチン-マレイミド試薬等、チオール反応性試薬と１００％収率で反応する、システイン操作抗体上の遊離システインアミノ酸は、チオール反応性値１．０を有するビオチン標識抗体を形成するであろう。チオール反応性試薬と８０％収率で反応する同じか又は異なった親抗体中に操作された他のシステインアミノ酸は、チオール反応性値０．８を有するであろう。チオール反応性試薬との反応に完全に失敗する同じ又は異なった親抗体中に操作された他のシステインアミノ酸は、チオール反応性値０を有する。特定のシステインのチオール反応性値の決定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、又は他の定量分析試験により実施することができる。システイン操作された抗体の捕捉及び比較及びシステイン反応性の定量を可能にするチオール反応性試薬には、ビオチン-ＰＥＯ-マレイミド((＋)-ビオチニル-３-マレイミドプロピオンアミジル-３,６-ジオキサオクタインジアミン、Oda等 2001 Nature Biotechnology 19:379-382, Pierce Biotechnology, Inc.)、ビオチン-ＢＭＣＣ、ＰＥＯ-ヨードアセチルビオチン、ヨードアセチル-ＬＣ-ビオチン、及びビオチン-ＨＰＤＰ(Pierce Biotechnology, Inc.)、及びＮα-(３-マレイミジルプロピオニル)ビオサイチン(MPB, Molecular Probes, Eugene, OR)が含まれる。ビオチン化、二官能性及び多官能性リンカー試薬のための他の商業的供給源には、Molecular Probes, Eugene, OR、及びSigma, St. Louis, MOが含まれる。
抗体又は抗体・薬剤コンジュゲートは、細胞表面抗原と複合体を形成した後に「内部移行」し、細胞表面膜に存在する抗原・抗体複合体又は抗原・抗体・薬剤コンジュゲート複合体が、細胞表面から除去され、生化学反応を介して細胞自体中に導入される。いくつかの可能なポスト-エンドサイトーシス輸送経路は、複合体に係合しうる(Schroeder等 2001 "Recent advances in membrane microdomains: rafts, caveolae, and intracellular cholesterol trafficking." Exp Biol. Med (Maywood) Nov;226(10):873-90), Spooner等2006 "Retrograde transport pathways utilized by viruses and protein toxins" Virol J. 2006; 3: 26を参照)。変性タンパク質に対して調製される抗体はウエスタンブロットにおいて有用であるが、細胞表面エピトープに結合することも、抗原・抗体複合体を形成することも予期されず、よって内部移行しないであろう。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語は、抗体のＦｃ定常領域に結合するレセプターを意味する。さらに、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)に結合するものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を含む(Daeron 1997 Annu. Rev. Immunol. 15:203-234を参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet 1991 Annu. Rev. Immunol 9:457-92；Capel等 1994 Immunomethods 4:25-34；及びde Haas等 1995 J. Lab. Clin. Med. 126:330-41に概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプターＦｃＲｎもまた含む(Guyer等 1976 J. Immumol. 117:587及びKim等 1994 J. Immunol. 24:249)。
「補体依存性細胞傷害性」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、同族抗原と結合した抗体(適切なサブクラスのもの)に結合することにより、開始される(Gazzano-Santoro等1996 J. Immunol. Methods 202:163)。
「抗体依存性細胞媒介性傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet 1991 Annu.Rev.Immunol., 9:457-92の４６４頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号及び米国特許第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:652-656に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数の定常領域レセプター(ＦｃＲ)を発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は、その天然源、例えば血液又はＰＢＭＣから単離することができる。
「治療する」又は「治療」又は「軽減」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味し、その目的は、標的となる病的状況又は疾患の防止又は遅延化(減少)させることである。処置の必要があるものには、既に疾患を患っているもの、並びに疾患になりやすいもの、又は疾患が防止されるものが含まれる。被験者又は哺乳動物は、本発明の方法に従い、治療的有効量の抗体、又はその抗体-薬剤コンジュゲートを受容した後ならば、「癌」に対して成功裏に「処置され」、患者では、一又は複数の次のもの：癌細胞数の低減又は癌細胞の不在；腫瘍サイズの低減；軟部組織又は骨における癌の展伸を含む、周辺器官への癌細胞の浸潤の阻害(ある程度の遅延化又は停止)；腫瘍転移の阻害；腫瘍増殖の阻害；及び／又は特定の癌に関連する一又は複数の徴候のある程度の軽減；罹患率及び死亡率の低減、及び生活の質の問題の改善の観察及び／又は測定可能な程度の低減又は不在を示す。抗体又、又はその抗体・薬剤コンジュゲートが、存在する癌細胞の成長を防止及び／又は殺すことが可能な程度まで、細胞分裂停止及び／又は細胞傷害性であってよい。疾患における成功的処置及び改善を評価するためのパラメーターは、医師にはなじみの常套的手順により、容易に測定可能である。癌治療にとって、有効性は、例えば腫瘍増殖停止時間(ＴＴＰ)及び／又は奏功率(ＲＲ)を評価することによって測定可能である。転移は病期診断テスト、及び骨スキャン、及びカルシウムレベル及び骨への展伸を測定するための他の酵素についてのテストにより測定することができる。また、ＣＴスキャンは、領域内の骨盤及びリンパ節への展伸を探索するために使用することができる。胸部Ｘ線、及び公知の方法による肝臓酵素レベルの測定は、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために使用することができる。疾患をモニターするための他の常套的な方法には、経直腸的超音波検査(ＴＲＵＳ)及び経直腸的針生検(ＴＲＮＢ)が含まれる。
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を記載し又は意味する。「腫瘍」は一又は複数の癌細胞を含み、悪性又は良性にかかわらず、全ての腫瘍細胞の成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌細胞及び腫瘍を意味する。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定な例には、結腸癌、扁平上皮細胞癌(例えば上皮扁平細胞癌)、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌(「ＮＳＣＬＣ」)、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric又はstomach)、例えば胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、髄芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌(kidney又はrenal)、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、頭頸部癌、及びメラノーマが含まれる。
タンパク質を「過剰発現する」癌は、同じ組織タイプの非癌細胞と比較して、その細胞表面でのポリペプチドがかなり高レベルであるものである。このような過剰発現は、遺伝子レベルでの異常性又は変化(例えば、ＤＮＡ変異又は変化)、ｍＲＮＡのスプライス変異、又は特定の遺伝子転写因子、プロモーター又はエンハンサーの活性における変化に起因する可能性のある、転写又は翻訳の増加ににより引き起こされ得る。過剰発現は、細胞表面に存在するレセプタータンパク質のレベルの増加度を評価することによる、診断又は予後アッセイにおいて測定することができる(例えば、免疫組織化学的アッセイ；ＩＨＣを介する)。あるいは又は付加的に、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；国際公開第１９９８／４５４７９号を参照)、サウザンブロット、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、例えば定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ(ｑＲＴ-ＰＣＲ)を介し、細胞におけるレセプター-コード化核酸のレベルを測定することもできる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度異常な細胞増殖に関連した疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
「治療的に有効な量」なる用語は、哺乳動物における疾患又は疾病を治療するのに有効な薬剤の量を意味する。癌の場合、薬剤の治療的に有効な量は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し；腫瘍転移を阻害し；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は癌に伴う徴候の一又は複数をある程度軽減しうる。薬剤が増殖を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させうる程度まで、それは細胞分裂阻害性及び／又は細胞毒性でありうる。「細胞分裂停止」なる用語は、細胞の機能を制限する、例えば細胞成長又は細胞の増殖を制限する効果を意味する。例えば、癌治療では、効能は、無増悪期間(ＴＴＰ)を評価、及び／又は奏功率(ＲＲ)を測定することにより決定することができる。
「標識」なる用語は、抗体に共有的に結合可能であり、(ｉ)検出可能なシグナルを提供し；(ｉｉ)第２の標識と相互作用し、第１又は第２の標識、例えばＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)により提供される検出可能なシグナルを修飾し；(ｉｉｉ)相互作用を安定化させるか、又は抗原もしくはリガンドとの結合親和性を増加させ；(ｉｖ)電荷、疎水性度、形状、又は他の物理的パラメーターにより、移動度、例えば電気泳動移動度、又は細胞-透過性に影響を与え、又は(ｉｖ)キャプチャー部分を提供し、リガンド親和性、抗体／抗原結合、又はイオン錯体形成を調節するように機能する任意の部分を意味する。
ここで使用される場合「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能なＡＤＣの有機又は無機塩を意味する。例示的な塩には、限定されるものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、、塩化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、リン酸、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サルチル酸塩、クエン酸、又は酒石酸塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、他の分子、例えばアセテートイオン、スクシナートイオン、又は他の対イオンの包含物が含まれる。対イオンは化合物における電荷を安定化させるための、有機又は無機部分であってよい。さらに、薬学的に許容可能な塩は、構造中に、一以上の荷電原子を有することができる。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である例では、複数の対イオンを有することができる。よって、薬学的に許容可能な塩は一又は複数の荷電原子及び／又は一又は複数の対イオンを有することができる。
「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、一又は複数の溶媒分子とＡＤＣとの会合を意味する。薬学的に許容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例には、限定されるものではないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが含まれる。
ここで使用される「担体」には、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤で、用いられる用量及び濃度に暴露される細胞又は哺乳動物に無毒であるものが含まれる。多くの場合、薬学的に許容可能な担体は、水性のｐＨ緩衝剤である。生理学的に許容可能な担体の例には、バッファー、例えばホスフェート、シトラート、及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及びプルロニクス(PLURONICS)(登録商標)を含む。
組成物及び方法
ＨＥＲ４アイソフォーム
４つの構造的及び機能的に異なるアイソフォームは、選択的スプライシングにより、単一のＨＥＲ４遺伝子から産生される(１８、１９)。アイソフォームの２つは細胞内細胞質ドメインが異なっている(アイソフォームＣＹＴ-１及びＣＹＴ-２)。ＣＹＴ-１は細胞質ドメイン内に１６のアミノ酸挿入物を有しているが、ＣＹＴ-２は挿入物を有していない(１８)。ＣＹＴ-１アイソフォームはホスホイノシチド３-キナーゼ(ＰＩ３-Ｋ)へのカップリングを媒介できるが、ＣＹＴ-２アイソフォームはできない(２０、２１)。
他の２つのアイソフォーム(ＪＭ-ａ及びＪＭ-ｂ)は、細胞外膜近傍領域への２３又は１３の代替アミノ酸の挿入が異なる(図１)。ＪＭ-ａは膜近傍領域内に２３のアミノ酸(ＮＧＰＴＳＨＤＣＩＹＹＰＷＴＧＨＳＴＬＰＱＨＡ 配列番号：１)を有するアイソフォームであり、ＪＭ-１ｂはこの領域に１３のアミノ酸(ＩＧＳＳＩＥＤＣＩＧＬＭＤ 配列番号：２)を有するアイソフォームである(１７、２３)。
細胞外アイソフォームＪＭ-ａは、腫瘍壊死因子α変換酵素(ＴＡＣＥ)により切断され得るが(２２)、ＪＭ-ｂアイソフォームはプロテイナーゼ耐性である(２３)。ＴＡＣＥによる切断は、γ-セクレターゼ活性を含むＨＥＲ４の第２の切断を惹起する(２４)。その結果、細胞内ドメイン(ＩＣＤ)が細胞膜から放出され、核に転位置し、そこで遺伝子転写の調節において機能しうる(２５-２８)。
ＨＥＲ４アイソフォームは腫瘍形成においてその役割が異なるという仮説と一致して、その非切断性対応物のＪＭ-ｂ ＣＹＴ-２ではなく、切断可能なＨＥＲ４ ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２アイソフォームがリガンド非依存性活性を示し、癌細胞増殖を促進する(２６)。さらに、核における細胞内ＨＥＲ４エピトープの局在化が、細胞表面におけるＨＥＲ４の局在化と比較した場合、より短い生存期間に関連しており(２９)、ＨＥＲ４切断が腫瘍進行を調節しうることが示唆される。これらの同じ切断可能なアイソフォームは、乳癌患者の試料の臨床シリーズにおいて過剰発現することが過去に示されている(１８、２６)。
さらに、ＪＭ-ａ及びＪＭ-ｂアイソフォームは種々の組織分布パターンをまた示し、ＪＭ-ａアイソフォームは心臓組織では不存在である(２３)。
アイソフォーム特異的抗体
本発明の一態様は、ＨＥＲ４のＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、ＪＭ-ａ膜近傍領域を含むインタクトな完全長ＨＥＲ４レセプター並びに可溶性ＨＥＲ４外部ドメインの双方に特異的に結合する。他の実施態様では、抗体は、ＮＧＰＴＳＨＤＣＩＹＹＰＷＴＧＨＳＴＬＰＱＨＡ 配列番号：１を含むアミノ酸配列に特異的に結合する。他の実施態様では、抗体は、アミノ酸配列ＮＧＰＴＳＨＤＣＩＹＹＰＷＴＧＨＳＴＬＰＱＨＡ(配列番号：１)に特異的に結合する。
本発明の他の態様は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する単離された抗ＨＥＲ４抗体を提供するものであり、ここで、該抗体は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるｍＡｂ１４７９モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗体は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるｍＡｂ１４７９モノクローナル抗体から誘導されたヒト化又は親和性成熟抗体である。
本発明の他の態様は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９からの断片を含む抗ＨＥＲ４抗体を提供する。該抗体は、ＨＥＲ４のＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的である。一実施態様では、断片はＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する。一実施態様では、ｍＡｂ１４７９からの断片は、高頻度可変領域の少なくとも一部を含む。一実施態様では、ｍＡｂ１４７９からの断片は、重鎖高頻度可変領域を含む。一実施態様では、ｍＡｂ１４７９からの断片は、軽鎖高頻度可変領域を含む。他の実施態様では、断片はｍＡｂ１４７９の軽及び重鎖高頻度可変領域を含む。一実施態様では、断片は、ＶＨ１、ＶＨ２、又はＶＨ３高頻度可変領域を含む。一実施態様では、断片は、ＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３高頻度可変領域の少なくとも２つを含む。一実施態様では、断片は、ＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３高頻度可変領域の３つ全てを含む。一実施態様では、断片は、ＶＬ１、ＶＬ２、又はＶＬ３高頻度可変領域を含む。一実施態様では、断片は、ＶＬ１、ＶＬ２、及びＶＬ３高頻度可変領域の少なくとも２つを含む。一実施態様では、断片は、ＶＬ１、ＶＬ２、及びＶＬ３高頻度可変領域の３つ全てを含む。一実施態様では、断片は、ＶＨ１、ＶＨ２、又はＶＨ３高頻度可変領域の少なくとも１、２又は３、及びＶＬ１、ＶＬ２、及びＶＬ３高頻度可変領域の少なくとも１、２又は３を含む。一実施態様では、断片は、ＶＨ１、ＶＨ２、又はＶＨ３高頻度可変領域の３つ全てと、ＶＬ１、ＶＬ２、及びＶＬ３高頻度可変領域の３つ全てを含む。
一実施態様では、ｍＡｂ１４７９からの断片は、可変領域の少なくとも一部を含む。一実施態様では、ｍＡｂ１４７９からの断片は、重鎖可変領域を含む。一実施態様では、ｍＡｂ１４７９からの断片は、軽鎖可変領域を含む。他の実施態様では、断片は、ｍＡｂ１４７９の軽及び重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施態様では、断片は、ＪＭ-ａアイソフォームに対する抗体の結合特異性を有意には低減させない変異を含む。
本発明の他の態様は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生される抗ＨＥＲ４抗体ｍＡｂ１４７９と、ＪＭ-ａアイソフォームへの結合で競合する抗体を提供する。
本発明のさらなる他の態様は、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体を提供する。
一実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９が結合するエピトープは、ＨＥＲ４外部ドメインを含む。他の実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９が結合するエピトープは、アミノ酸配列ＮＧＰＴＳＨＤＣＩＹＹＰＷＴＧＨＳＴＬＰＱＨＡ(配列番号：１)の少なくとも一部を含む。他の実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９が結合するエピトープは、アミノ酸配列ＮＧＰＴＳＨＤＣＩＹＹＰＷＴＧＨＳＴＬＰＱＨＡ(配列番号：１)を含む。
いくつかの実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォーム特異的抗体は、キメラ、ヒト、又はヒト化抗体である。
いくつかの実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的である抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４チロシンリン酸化を低減させる。レセプターチロシンリン酸化の抑制は、他のＥｒｂＢレセプターの細胞外ドメインを標的とする治療用抗体の抗腫瘍活性に関連していることが示されている(３９、４８、４９)。ＨＥＲ４リン酸化に対する抗ＨＥＲ４抗体の効果は、当該分野でよく知られている方法により決定することができ、その一例は、ここでは実施例１及び５に記載されている。簡潔に述べると、ＨＥＲ４を発現する細胞を抗ＨＥＲ４抗体で処理し、ついでＮＲＧ-１で刺激する。細胞を溶解させ、一般的な抗ＨＥＲ４抗体、例えばＨＦＲ-１(R&D, Minneapolis, MN)で免疫沈降させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにおいて分離させ、抗ホスホチロシン抗体、例えば４Ｇ１０(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)を使用するウエスタンブロットにより分析する。ブロットはスキャン可能で、スキャンデンシンメトリーにより分析して、定量分析が達成される。いくつかの実施態様では、コントロールが含められる。一実施態様では、コントロールは、抗ＨＥＲ４抗体での処理をしないで、ＮＲＧ-１で刺激された、ＨＥＲ４を発現する細胞の試料を含む。細胞は、処理された細胞と同様に、ウエスタンブロットにより分析される。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４チロシンリン酸化を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％まで低減させる。
いくつかの実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォームに特異的な抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４切断を低減させる。ＨＥＲ４の切断により、１００ｋＤａの外部ドメイン断片の遊離が生じうる。この事象は外部ドメイン脱落とも称される。ＨＥＲ４切断に対する抗ＨＥＲ４抗体の効果は、当該分野でよく知られている方法により決定することができ、その一例が、ここでは実施例１及び５に記載される。簡潔に述べると、ＨＥＲ４切断の低減は、抗ＨＥＲ４抗体で処理されたＨＥＲ４を発現する細胞の細胞培養培地中における外部ドメインの存在を測定することにより検出可能である。切断は、アッセイ中に、ホルボール１３-ミリスタート１２-アセタート(ＰＭＡ)を含めることによって高めることができる。いくつかの実施態様においては、コントロールが含められる。一実施態様においては、コントロールが含められ、ここで、抗ＨＥＲ４抗体で処理されていないＨＥＲ４発現細胞の細胞培養培地中における外部ドメインの存在が決定される。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４切断を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％まで低減させる。
いくつかの実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的である抗ＨＥＲ４抗体は内部移行する。抗体の内部移行は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する癌細胞に、抗体・コンジュゲート毒素を送達せしめるのに使用することができる。
いくつかの実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的である抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４内部移行を促進させる。チロシンレセプターキナーゼの内部移行は、レセプターのダウンレギュレーションに関連していた。一実施態様では、抗ＨＥＲ４抗体は、細胞表面におけるＨＥＲ４の量を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％まで低減させる。ＨＥＲ４の内部移行に対する抗ＨＥＲ４抗体の効果は、当該分野でよく知られている方法により決定することができ、その一例が、ここでは実施例１及び６に記載されている。
いくつかの実施態様では、ＨＥＲ４のＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的ではない抗ＨＥＲ４抗体よりも心毒性が少ない。心毒性は多くのレセプターチロシンキナーゼインヒビター治療に伴う副作用である(６２、６３)。ＨＥＲ４のＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的である抗体は、ＪＭ-ｂアイソフォームを認識する抗ＨＥＲ４抗体よりも、患者において、心毒性の影響をあまり生じないと予測されており、これは、ＪＭ-ａアイソフォームが心組織中に存在しないからである(２３)。患者における心毒性は、心不全、左心室機能不全(ＬＶＤ)、心筋虚血、高血圧、静脈血栓塞栓症、徐脈、及びＱＴ間隔(心臓の電気周波のＱ波の開始とＴ波の終了の間の時間を測定)延長を含む、多くの徴候により証拠付けられる。
化合物の心毒性は、例えばインビトロ又はインビボ診断モデルを使用することにより、測定することができる。
心毒性のインビトロ測定は、試験化合物に心臓細胞を暴露させ、細胞の外観におけるあらゆる変化、又は細胞のアポトーシス速度を観察することにより、実施することができる。細胞の外観における関連した変化には、ミトコンドリア膨化及び変性が含まれる。細胞アポトーシスは、例えばデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性デオキシウリジン５-トリホスフェートニック末端標識によりモニターすることができる。加えて、細胞によるアポトーシス関連の化学物質又は酵素の分泌増加も心毒性の指標となる。このような化学物質又は酵素には、トロポニン、ナトリウム利尿ペプチド、例えばＢ型のＮ末端プロペプチド(プロ-ＢＮＰ)、チトクロム-Ｃ及びカスパーゼ-９が含まれる。培養された細胞モデルとして使用されうる心臓細胞には、マウス又はラット等の適切な動物モデルから得られる初代又は培養された成人又は新生児の心室筋細胞(心筋細胞)が含まれる(６２-６４)。
心毒性のインビボ測定は、例えばマウス又はラット等の適切な動物モデルに試験化合物を注射し、モデルの心臓組織の構造、心臓のミトコンドリアの外観及び機能、及び／又はモデルの心臓組織のアポトーシス速度に対する試験化合物の効果を観察することにより、実施することができる(６２)。また、単離された心臓モデル、又はランゲンドルフプレップも、化合物の心毒性を測定するのに有用である(６３)。
また、心毒性は臨床的観察により測定することもできる。例えば、心不全及びＬＶＤは、心電図(ＥＫＧ)、胸部Ｘ線写真、及びマルチゲート式獲得スキャン(ＭＵＧＵＡ)等の診断検査を用いた身体検査と患者の病歴とを組合せた臨床的診断により測定される。心筋虚血は、心筋壊死を検出し、ＥＧＫの変化を検出し、心筋酵素における増加上昇を検出する身体検査により測定される。高血圧は、患者の血圧を測定することにより決定される。１４０／９０ｍｍＨｇ以上の血圧を有する患者は、一般的に、高血圧を患っていると考えられる。静脈血栓塞栓症は、圧迫超音波検査、断層撮影血管造影、磁気共鳴肺血管造影、又は核医学技術により検出される。徐脈は、一般的に１分当たり６０脈拍未満の心拍数として定義され、ＥＫＧ又はホルターモニター分析と組合せた心拍数を測定することにより検出される。ＱＴ間隔延長は、心臓の電気活動の異常性であり、ＥＫＧ分析により測定することができる。一般的に、４４０ミリ秒以下のＱＴ間隔は正常であると考えられるが、男性で４５０ミリ秒以上、女性で４７０ミリ秒以上のＱＴ間隔であると、延長していると考えられる。(６４)
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素消化、又は組換え技術により産生可能である。ある状況では、全抗体よりも抗体断片を使用する方が有利な場合もある。より小さいサイズの断片は、急速なクリアランスが可能であり、固形腫瘍への改善されたアクセスに至る可能性がある。ある種の抗体断片の概説については、Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照。
抗体断片を生産するための様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て大腸菌において発現せしめられ、分泌せしめられ得、よって多量のこれらの断片を容易に生産することが可能である。抗体断片は上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的にカップリングさせてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。ある種の実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常ドメインを欠く、インタクトな結合部位を有する唯一の種である；よって、それらはインビボ使用での間の、非特異的結合を低減させるのに適している。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築することができる。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体は単一特異性又は二重特異性でありうる。
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、当該分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からその中に導入される一又は複数のアミノ酸残基を有している場合がある。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に高頻度可変領域配列を置換することにより、Winter及び共同研究者（Jones等 (1986) Nature, 321:522-525；Riechmann等 (1988) Nature, 332:323-327；Verhoeyen等 (1988) Science, 239:1534-1536)の方法に従って本質的に実施できる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基と場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製するのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（best-fit）」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーからスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトＦＲとして受容される。例えば、Sims等 (1993) J. Immunol., 151:2296；Chothia等 (1987) J. Mol. Biol. 196:901を参照。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体のために使用することができる。例えば、Carter等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta等 (1993) J.Immunol, 151:2623を参照。
抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化されることがさらに所望される。この目標を達成するために、一方法では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能で、当業者にはなじみが深い。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を例証し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらのディスプレイの検査により、候補免疫グロブリン配列の機能中で残基の可能な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選び、組み合わせることができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。
ヒト抗体
本発明のヒト抗体は、上に記載したような、既知のヒト定常ドメイン配列と、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列とを組合せることにより、構築することができる。また、本発明のヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えばKozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及び Boerner等, J. Immunol., 147: 86 (1991)に記載されている。
内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)を参照。
また、非ヒト、例えば齧歯類抗体から、ヒト抗体を誘導するために、遺伝子シャッフリングを使用することもでき、ここでヒト抗体は、出発非ヒト抗体に類似した抗体及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法に従えば、ここに記載したようなファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重又は軽鎖可変領域のいずれかが、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの個体群を生じる、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられる。抗原を用いた選択は、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離に至り、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローンにおける、対応の非ヒト鎖の除去時に破壊される抗原結合部位を回復させる、すなわち、エピトープはヒト鎖パートナーの選択を支配(インプリント)する。残った非ヒト鎖を置き換えるために、プロセスが繰り返される場合に、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日に公開された国際公開第９３／０６２１３号を参照)。ＣＤＲグラフトによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術により、非ヒト由来のＦＲ又はＣＤＲ残基を有さない、完全なヒト抗体が提供される。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体はヒト又はヒト化抗体である。ある実施態様では、一方の結合特異性はＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの２つの異なるエピトープに結合可能である。また、二重特異性抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用することもできる。これらの抗体はＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム-結合アームを有し、該アームは、細胞傷害剤、例えばサポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテンと結合する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常なされるが、むしろ煩雑で、産生物収率は低い。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655 (1991)に開示されている。
異なるアプローチに従えば、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、例えばヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。ある種の実施態様では、少なくとも一の融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在する。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不均一な比率が、最適収率を提供する場合の実施態様では、３つのポリペプチド断片の相互割合の調節に、かなりの順応性が提供される。しかしながら、均一な比率で少なくとも２のポリペプチド鎖の発現が高収率でなされる場合、又は比率が特に重要でない場合は、一つの発現ベクターに、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード化配列を挿入することができる。
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物以上に、ヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンにカップリングし、他方はビオチンにカップリングする。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするために(米国特許第４６７６９８０号)、またＨＩＶ感染の治療のために提案されている(国際公開１９９１／００３６０号、国際公開第１９９２／００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野においてよく知られており、多くの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science,229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ'-ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易になった。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の生産を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学カップリングを受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、またヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の細胞溶解活性を惹起する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供する。断片は、あまりに短くて同一鎖上の２つのドメイン間の対形成できないリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照。
二価より多い価数の抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも素早く内部移行(及び／又は異化)することができる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であってよく、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、容易に産生させることができる。多価抗体は、二量体化ドメインと、３又はそれ以上の抗原結合部位を有することができる。ある実施態様では、二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を含む(又はからなる)。この状況において、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に３又はそれ以上の抗原結合部位アミノ末端を含むであろう。ある種の実施態様では、多価抗体は、３から約８の抗原結合部位を含む(又はからなる)。このような一実施態様では、多価抗体は４の抗原結合部位を含む(又はからなる)。多価抗体は少なくとも一のポリペプチド鎖(例えば、２つのポリペプチド鎖)を含み、ここでポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを含み、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の一ポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ-ＣＨ１-可動性リンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を含むことができる。ここで、多価抗体は、少なくとも２(例えば４)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むことができる。ここで多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここで考慮される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合によっては、ＣＬドメインをさらに含む。
単一ドメイン抗体
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、もしくは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む、単一のポリペプチド鎖である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。一実施態様では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに記載された抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を改善することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチドに適切な変化を導入して、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列が作製されるときに、対象となる抗体アミノ酸配列に導入することができる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体のある種の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の群が同定され(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基)、中性の又は負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ-及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化する程度が増加又は減少するように変化させられる。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)が作製又は除去されるように変化させることによって、簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合する炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対するＮ-結合により一般的に結合した、分枝状、二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 (1997) TIBTECH 15:26-32を参照。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、ガラクトース、及びシアル酸、並びにフコースで、二分岐オリゴ糖構造の「幹」におけるＧｌｃＮＡｃに結合しているものが含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある種の改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、実施されうる。
例えば、Ｆｃ領域に(直接又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。このような変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。「脱フコシル化された」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産可能な細胞株の例には、タンパク質のフコシル化におけるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞欠損が含まれる(Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号, Presta, L; 及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号, Adams等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞が含まれる(例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)。
抗体変異体にはさらに二分オリゴ糖が設けられ、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される。そのような抗体変異体は、フコシル化が低減され、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている場合がある。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairet等)；米国特許第６６０２６８４号(Umana等)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana等)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号(Patel等)；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
ある実施態様では、抗体変異体は、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４(残基のＥｕ番号付け)の置換のように、ＡＤＣＣをさらに改善する一又は複数のアミノ酸置換を持つＦｃ領域を含む。このような置換は、上述した変異のいずれかと組合せて生じうる。
ある実施態様では、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能(例えば補体及びＡＤＣＣ)が不必要であるか又は有害である多くの用途に対して望ましい候補とする、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有する。ある実施態様では、抗体のＦｃ活性は、所望の特性のみが維持されるように担保して測定される。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害アッセイは、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために実施することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイは、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く(よって、ＡＤＣＣ活性を欠くと思われる)が、ＦｃＲｎ結合活性は保持していることを確認するために実施することができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ及びＦｃＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的例は、米国特許第５５００３６２号(例えば、Hellstrom, I等 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986))、及びHellstrom, I等, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；同５８２１３３７号 (Bruggemann, M等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。また、非放射アッセイ法を使用することもできる(例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射活性細胞傷害アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びCytoTox 96(登録商標)非放射活性細胞傷害アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照)。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されうる。Ｃ１ｑ結合アッセイも、抗体がＣ１ｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実施することができる。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる(例えば、Gazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. 及びM.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定も、当該分野で既知の方法を使用して実施することができる(例えば、Petkova, S.B等, Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
一又は複数のアミノ酸置換を有する他の抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のために関心ある部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。「例示的置換」と示されたより実質的な変化が表１に提供され、又はアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換は関心ある抗体に導入され、生成物が、例えば所望の活性、例えば改善された抗原結合性、低減した免疫原性、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ等について、スクリーニングされる。
Figure 0005894436
抗体の生物学的性質における修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより、達成されうる。アミノ酸は、その側鎖の性質の類似性に従ってグループ分けすることができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 第2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
(１)非極性：Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｐｒｏ(Ｐ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｒｐ(Ｗ)、Ｍｅｔ(Ｍ)
(２)非荷電極性：Ｇｌｙ(Ｇ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ｃｙｓ(Ｃ)、Ｔｙｒ(Ｙ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)
(３)酸性：Ａｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)
(４)塩基性：Ｌｙｓ(Ｋ)、Ａｒｇ(Ｒ)、Ｈｉｓ(Ｈ)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(２)中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
(６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。また、このような置換された残基は保存的置換部位又は残存する(非保存的)部位に導入することができる。
一タイプの置換変異体は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般的に、さらなる開発のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して修飾(例えば改善)された生物学的特性を有しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便に産生せしめることができる。簡潔に言えば、いくつかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を生成せしめる。このようにして産生された抗体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたファージコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物)の少なくとも一部への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、それらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、スキャンニング突然変異誘発(例えば、アラニンスキャンニング)を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べたものを含む、当該分野で既知の技術に従う置換の候補である。そのような変異体が産生されると、変異体のパネルに、ここに記載するものを含む当該分野で既知の技術を使用するスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ変異体を、さらなる開発のために選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位指向性)突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット突然変異誘発を含む。
本発明の抗体のＦｃ領域に、一又は複数のアミノ酸修飾を導入し、よってＦｃ領域変異体を生じせしめることが所望される場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのものを含む、一又は複数のアミノ酸位置に、アミノ酸修飾(例えば置換)を有するヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域)を含む。
この明細書及び当該分野の教示に従い、いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、例えばＦｃ領域において、野生型の対応抗体と比較して、一又は複数の変更を含み得る。それにもかかわらず、これらの抗体は、それらの野生型の対応物と比較して、治療的有用性に必要とされる実質的に同様の特徴を保持している。例えば、国際公開第９９／５１６４２号に記載されたように、変化した(すなわち、改善又は低減した)Ｃ１ｑ結合性及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を生じるある種の改変をＦｃ領域に作製することができることが、例えば考えられる。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関連して、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号を参照。国際公開第００／４２０７２号(Presta)及び国際公開第２００４／０５６３１２号(Lowman)には、ＦｃＲｓに対する改善された又は低減した結合性を有する抗体変異体が記載されている。これらの特許文献の内容は、特に出典明示によりここに援用される。また、Shields等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照。胎児への母性Ｉｇの移動の原因である(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、半減期が増加し、新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)に対する結合性が改善された抗体は、米国特許第２００５／００１４９３４Ａ１号(Hinton等)に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合性が改善された、一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列、及び増加又は減少したＣ１ｑ結合力を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。それらの特許文献の内容は、特に出典明示によりここに援用される。また、Idusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照。
他の態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を有する抗体を提供し、ここで、該修飾がヘテロ二量体化を容易にし及び／又は促進する。これらの修飾は、第１のＦｃポリペプチドに隆起部を、第２のＦｃポリペプチドにキャビティを導入することを含み、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの複合体化が促進されるように、隆起部はキャビティに配される。これらの修飾を有する抗体を産生する方法は、例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されているように、当該分野で知られている。
さらなる他の態様においては、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂｓ」を作製することが所望される場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は抗体の到達可能な部位で生じる。システインでその残基を置換することにより、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に配され、他の部分、例えばここにさらに記載されるような、薬剤部分又はリンカー-薬剤部分に抗体をコンジュゲートさせるのに使用されうる。ある実施態様では、次の残基のいずれか一又は複数がシステインで置換されうる：軽鎖のＶ２０５(カバット番号付け)；重鎖のＡ１１８(ＥＵ番号付け)；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００(ＥＵ番号付け)。
抗体誘導体
本発明の抗体は、当該分野で知られ、直ぐに利用できる付加的な非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適切な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール類(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性のために、製造においては有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状又は非分枝状でありうる。抗体に結合するポリマーの数は変化し得、１を越えるポリマーが結合されるならば、それらは同じ又は異なる分子でありうる。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、抗体誘導体が定められた条件下で治療に使用されるかどうか等に関わらず、改善される抗体の特定の特性又は機能を含む考慮に基づき、決定することができる。
他の実施態様では、放射線に暴露されることにより選択的に加熱されうる非タンパク質性部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである(Kam等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであり得、限定されるものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度まで、非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれる。
抗体を作製するための所定の方法
ある種のハイブリドーマベースの方法
本発明のモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)に最初に記載され、さらには、例えばHongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988)；Hammerling等, in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)、及び Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)で、ヒト-ヒトハイブリドーマに関するものに記載されているハイブリドーマ法を使用して、作製することができる。さらなる方法には、例えばハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生産に関する、米国特許第７１８９８２６号に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(Trioma technology)は、Vollmers 及び Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)及びVollmers 及び Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
種々の他のハイブリドーマ技術については、例えば米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；米国特許出願公開第２００６／１８３８８７号(完全ヒト抗体)、米国特許出願公開第２００６／０５９５７５号；米国特許出願公開第２００５／２８７１４９号；米国特許出願公開第２００５／１００５４６号；米国特許出願公開第２００５／０２６２２９号；及び米国特許第７０７８４９２号及び同７１５３５０７号を参照。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を生成するための例示的なプロトコルを、以下の通りに記載する。一実施態様では、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム、又はその断片を含むポリペプチド、及びアジュバント、例えばモノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(dicrynomycolate)(ＴＤＭ)(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)を、複数の皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射により、動物内に生じさせる。ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム又はその断片を含むポリペプチドは、当該分野でよく知られている方法、例えば組換え方法を使用して調製することができ、そのいくつかがここにさらに記載される。免疫化された動物からの血清を、抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームについて分析し、場合によっては追加免疫を投与する。抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム抗体を産生する動物からリンパ球を単離する。また、リンパ球はインビトロで免疫化することもできる。
次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986)を参照。骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。例示的な骨髄腫には、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものが含まれる。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、適切な培養培地、例えば融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう(ＨＡＴ培地)。好ましくは、無血清ハイブリドーマ細胞培養法も、例えばEven等, Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)に記載されているように、動物由来血清、例えばウシ胎仔血清の使用を減らすために使用される。
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドは、Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)に記載されている。特に、標準的な培養培地は、ある種のアミノ酸(アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン)、又はタンパク質加水分解画分に富み、アポトーシスは、３から６のアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドにより、有意に抑制することができる。ペプチドはミリモル又はそれ以上の濃度で存在する。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって、測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード分析法によって測定することができる。例えば、Munson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)を参照。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる。例えば、上掲のGodingを参照。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような一般的な免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、又は血清から好適に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための一手順は、米国特許出願公開第２００５／１７６１２２号、及び米国特許第６９１９４３６号に記載されている。本方法には、結合プロセスにおいて、少量の塩、例えば離液性塩を使用すること、好ましくは溶出プロセスにおいて少量の有機溶媒を使用することが含まれる。
所定のライブラリースクリーニング法
本発明の抗体は、所望の活性を有する抗体をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーを使用して、作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当該分野で知られている。このような方法は、一般的にHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brienら編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)に記載されている。例えば、関心ある抗体を産生するための一方法は、Lee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されているような、ファージ抗体ライブラリーの使用を介してなされる。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートクローンに融合した抗体可変領域(Ｆｖ)の種々の断片を示すファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合可能なＦｖ断片を発現するクローンを抗原に吸着させ、よってライブラリーにおける非結合クローンから分離する。ついで、結合クローンを抗原から溶出させ、抗原吸着／溶出の付加的なサイクルにより、さらに濃縮することができる。本発明の抗体のいずれも、適切な抗原スクリーニング手順を設計して関心あるファージクローンを選択し、続いてKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), １−３巻に記載された適切な定常領域(Ｆｃ)配列と、関心あるファージクローンからのＦｖ配列を使用して、完全長抗体クローンを構築することにより、得ることができる。
ある実施態様では、抗体の抗原結合ドメインは、双方が３つの高頻度可変ループ(ＨＶＲ)又は相補性決定領域(ＣＤＲ)を提示する、各々軽鎖(ＶＬ)及び重鎖(ＶＨ)からのものである、約１１０のアミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域から形成される。可変ドメインは、Winter等, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、ＶＨ及びＶＬが、短く可動性のペプチドを介して共有結合している単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として、又はそれぞれ定常ドメインに融合し、非共有的に相互作用するＦａｂ断片として、ファージに機能的に表示されうる。ここで使用される場合、ｓｃＦｖコード化ファージクローン及びＦａｂコード化ファージクローンは、集合的に「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と称される。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えられ得、これが、ついで、Winter等, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているようにして、抗原-結合クローンについて検索されうる。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーを、Griffiths等, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されているように、何らの免疫化をすることなく、広範囲の非自己及びさらには自己抗原に対するヒト抗体の単一の供給源を提供するためにクローニングすることができる。最後に、天然レパートリーは、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されているように、幹細胞から再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を有するＰＣＲプライマーを使用することで合成的に作製することができ、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再編成が達成される。
ある実施態様では、糸状ファージは、マイナーなコートタンパク質ｐＩＩＩに融合することにより、抗体断片をディスプレイするために使用される。抗体断片は、例えばMarks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載されているように、ＶＨ及びＶＬドメインが、可動性ポリペプチドスペーサーにより同じポリペプチド鎖に結合している単鎖Ｆｖ断片として、又は例えばHoogenboom等, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)に記載されているように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合し、他方が、Ｆａｂ-コートタンパク質構造のアセンブリーが、いくつかの野生型コートタンパク質を置き換えることにより、ファージ表面にディスプレイされるようになる細菌性宿主細胞ペリプラズムに分泌されるＦａｂ断片として、ディスプレイされうる。
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集された免疫細胞から得られる。抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームクローンに偏向したライブラリーが所望されるならば、被験者はＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを用いて免疫化されて抗体反応を生じせしめ、ライブラリー構築のために、脾臓細胞及び／又は循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)が回収される。好ましい実施態様では、抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームクローンに偏向したヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム免疫化により、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対してＢ細胞生成ヒト抗体を生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを担持する(機能的内在性抗体生成系を欠く)トランスジェニックマウスにおいて抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム抗体反応を生じせしめることによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製を以下に記載する。
抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム反応性細胞集団についてのさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手順を使用して、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離し、例えばアフィニティークロマトグラフィーを使用する細胞分離、又は蛍光色素標識されたＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームへの細胞の吸着と、続く蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)によって、達成することができる。
あるいは、免疫化されていないドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬを使用することにより、可能な抗体レパートリーのより良好な提示が得られ、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームが抗原性ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を使用する抗体ライブラリーの構築がまた可能となる。インビトロ抗体遺伝子構築を導入するライブラリーでは、幹細胞が被験者から収集され、再編成されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸が得られる。関心ある免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン(luprine)、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント(ＶＨ及びＶＬセグメントを含む)をコードする核酸は、関心ある細胞から回収され、増幅される。再編成されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、リンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、Orlandi等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、再編成されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端を一致させるプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により得ることができ、これによって、発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーが作製される。Ｖ遺伝子は、Orlandi等 (1989) 及び Ward等, Nature, 341: 544-546 (1989)に記載されたように、Ｊ-セグメントの範囲内をベースにする順方向プライマーと、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端で逆方向プライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅させることができる。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、逆方向プライマーは、Jones等, Biotechnol., 9: 88-89 (1991)に記載されているようなリーダーエクソンに、及びSastry等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)に記載されているような定常領域内の順方向プライマーに基づくこともできる。相補性を最大にするために、Orlandi等 (1989) 又は Sastry等 (1989)に記載されているようにして、縮重をプライマーに導入することができる。ある実施態様では、ライブラリーの多様性は、Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)の方法に記載されているようにして、又はOrum等, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)の方法に記載されているようにして、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨ及びＶＬ編成を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的とするＰＣＲプライマーを使用することにより、最大化される。発現ベクター中への増幅されたＤＮＡのクローニングには、Orlandi等 (1989)に記載されているように、一端にタグとして、又はClackson等, Nature, 352: 624-628 (1991)に記載されているように、タグ化プライマーを用いたさらなるＰＣＲ増幅により、希な制限部位をＰＣＲプライマー内に導入することができる。
合成的に再編成されたＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで誘導されうる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの殆どがクローニングされ、配列決定され(Tomlinson等, J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)に報告)、マッピングされている(Matsuda等, Nature Genet., 3: 88-94 (1993)に報告)；これらのクローン化されたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要な立体構造を含む)は、Hoogenboom 及び Winter,J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されているように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを産生せしめるのに使用することができる。また、ＶＨレパートリーは、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)に記載されているように、単一長さの長いＨ３ループに全ての配列多様性を集中させて作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントがクローニングされ、配列決定されており(Williams 及び Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)に報告)、合成軽鎖レパートリーを作製するために使用することができる。ＶＨ及びＶＬ折り畳み、及びＬ３及びＨ３長さの範囲に基づく、合成Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的に多様な抗体をコードするであろう。Ｖ遺伝子コード化ＤＮＡの増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントは、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)の方法に従い、インビトロで再編成させることができる。
抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法で、ＶＨとＶＬ遺伝子のレパートリーを一緒に組合せることにより構築することができる。各々のレパートリーは種々のベクターで作製可能であり、ベクターは、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126 (1993)に記載されているように、インビトロで、又はコンビナトリアル感染、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res.,21: 2265-2266 (1993)に記載されたｌｏｘＰシステムで、組換えられる。インビボ組換えアプローチは、Ｆａｂ断片の２本鎖特性を利用し、大腸菌形質転換効率により課されるライブラリーサイズの限界を克服する。天然ＶＨ及びＶＬのレパートリーは、一方はファージミドに、他方はファージベクターに、別個にクローニングされる。ついで、２つのライブラリーは、各細胞が種々の組合せを含み、ライブラリーサイズが存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ制限されるように、ファージミド含有細胞のファージ感染により組合せられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンに組換えられ、ファージビリオン中に同時包装されるように、インビボ組換えシグナルを含む。これらの巨大なライブラリーにより、良好な親和性(約１０−８ＭのＫｄ−１)の非常に多くの多様な抗体が得られる。
別法では、レパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載されているように、同じベクター中に連続してクローンされるか、又はClackson等, Nature, 352: 624-628 (1991)により記載されているように、ＰＣＲにより一緒に組み立てられ、ついでクローニングされうる。また、ＰＣＲアセンブリを使用して、可動性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと、ＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを結合させ、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)レパートリーを形成する。さらなる他の技術では、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」を使用して、ＰＣＲによりリンパ球内でＶＨ及びＶＬ遺伝子を組合せ、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)に記載されているように、連鎖遺伝子のレパートリーをクローニングする。
未処理ライブラリーにより産生される抗体(天然又は合成のいずれか)は、中程度の親和性(約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１)とすることができるが、親和性成熟は、上掲のWinter等(1994)に記載されているように、二次ライブラリーを構築しそれから再選択することにより、インビトロでまた模倣されうる。例えば、変異は、Hawkins等, J. Mol. Biol., 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)の方法において、エラープローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1: 11-15 (1989)に報告)を使用することにより、インビトロでランダムに導入することができる。さらに、親和性成熟は、選択された個々のＦｖクローンにおいて、例えば関心あるＣＤＲをスパンするランダム配列を担持するプライマーを用いたＰＣＲを使用し、より高い親和性のクローンをスクリーニングして、一又は複数のＣＤＲをランダムに変異させることにより、実施することができる。国際公開第９６０７７５４号(１９９６年３月１４日に公開)には、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域に突然変異誘発を誘導し、軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法が記載されている。他の効果的なアプローチは、免疫化されていないドナーから得られた天然に生じるＶドメイン変異体のレパートリーを用い、ファージディスプレイにより、選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組換え、Marks等, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載されているように、数回の鎖の再シャフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングするものである。この技術により、約１０−９Ｍ又はそれ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の生産が可能となる。
ライブラリーのスクリーニングは、当該分野で知られている種々の技術により達成することができる。例えば、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを使用し、吸着プレートのウェルをコートし、吸着プレートに付着される宿主細胞において発現させるために使用するか、又は細胞選別において、もしくはストレプトアビジン被覆ビーズを用いて捕捉するためにビオチンにコンジュゲートさせるか、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。
ファージライブラリー試料は、吸着剤とファージ粒子の少なくとも一部を結合させるのに適した条件下で、固定化されたＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームと接触させられる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理的条件を模倣する。固相に結合したファージを洗浄し、ついで、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載されているようにして、酸により、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載されているようにして、アルカリにより、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628 (1991)の抗原競合法に類似した手順において抗原競合により、溶出させる。ファージは一回の選択で２０−１０００倍に濃縮することができる。さらに、濃縮されたファージは細菌培養で増殖させ、さらなる選択段階にかけることができる。
選択の効率は、単一ファージ上の複数の抗体断片が、抗体と同時に係合可能であるかどうかに関わらず、洗浄中の解離の動態を含む多くの要因に依存する。素早い解離の動態(及び弱い結合親和性)を持つ抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ、及び固相における抗原の高密度コーティングの使用により保持することができる。高密度であると、多価相互作用を通してファージを安定化させるばかりでなく、解離したファージの再結合にとっても好ましい。ゆっくりとした解離の動態(及び良好な結合親和性)を持つ抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314 (1990) 及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているように、長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイ、及びMarks等, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載されているように、抗原の低密度コーティングの使用により、促進進されうる。
ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対して、わずかに異なる親和性さえ有する種々の親和性のファージ抗体間で選択することができる。しかしながら、選択された抗体のランダム変異(例えば、いくつかの成熟化技術で実施されるような)により、ほとんどは抗原に結合し、少しはより高い親和性を有する多くの変異体が生じると思われる。ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを制限すると、希な高親和性ファージが競合することができる。全ての高親和性変異体を保持するために、ファージを、過剰のビオチン化ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームと共に、しかし、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対して標的となるモル親和性定数よりも低いモル濃度でビオチン化ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームと共にインキュベートすることができる。ついで、高親和性結合ファージは、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズにより捕捉されうる。このような「平衡捕捉」により、低親和性を有する大過剰のファージから、わずかに２倍高い親和性を有する変異体クローンの単離を可能にする感度で、抗体をそれらの結合親和性に従い選択できる。また、固相に結合したファージの洗浄に使用される条件を操作し、解離動態に基づき識別される。
抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームクローンは、活性に基づいて選択することができる。ある実施態様では、本発明は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを天然に発現する生存細胞に結合する抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを提供する。一実施態様では、本発明は、ニューレグリン等、ＨＥＲ４リガンドとＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームとの結合をブロックするが、ニューレグリンと第２のタンパク質との結合をブロックしない、抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム抗体を提供する。このような抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム抗体に相当するＦｖクローンは、(１)上述したようなファージライブラリーから、抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームクローンを単離し、場合によっては、適切な細菌宿主において個体群を増殖させることにより、ファージクローンの単離された個体群を増幅させ；(２)それぞれ所望されるブロック及び非ブロック活性に対して、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム及び第２のタンパク質を選択し；(３)抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームファージクローンを吸着させて、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを固定し；(４)過剰のタンパク質を使用し、第２のタンパク質の結合決定基と重複又は共有するＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム-結合決定基を認識する任意の所望しないクローンを溶出させ；さらに(５)工程(４)後に吸着したままのクローンを溶出させることにより、選択することができる。場合によっては、所望のブロック及び／又は非ブロック特性を有するクローンは、ここに記載の選択手順を一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮することができる。
本発明のファージディスプレイＦｖクローン又はハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、一般的な手順を使用して(例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から、関心ある重鎖及び軽鎖コード化領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより)、容易に単離し配列決定される。ひとたび単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに配され、これが、ついで宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞であって、その他には免疫グロブリンタンパク質を産生しないものに形質移入し、組換え宿主細胞において、所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する文献は、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) 及び Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)を含む。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列と組合せ(例えば、適切なＤＮＡ配列は、上掲のKabat等により得ることができる)、重鎖及び／又は軽鎖の全長又は一部をコードするクローンを形成する。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域は、任意のヒト又は動物種から得ることができることが理解される。「ハイブリッドの」全長重鎖及び／又は軽鎖に対するコード配列を形成するために一動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから誘導され、ついで他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させられたＦｖクローンが、ここで使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから誘導されたＦｖクローンが、ヒト定常領域ＤＮＡに融合させられ、全長又は部分長のヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列が形成される。
また、本発明のハイブリドーマから誘導される抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム抗体をコードするＤＮＡは、例えばハイブリドーマクローンから誘導された相同マウス配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換することにより、修飾することができる(例えば、Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)の方法)。ハイブリドーマ-又はＦｖクローン誘導抗体又は断片をコードするＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を、免疫グロブリンコード化配列に共有結合させることにより、さらに修飾することができる。このようにして、本発明のＦｖクローン又はハイブリッドクローン誘導抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
変異体、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用して産生することもできる。抗ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム抗体の組換え生産では、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般に、限定されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接的に組換え的に生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産されうる。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識され、プロセシング(すなわち、シグナルペプチターゼによる切断)されるものである。天然抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置き換えられる。酵母菌の分泌では、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第 ９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置き換えられうる。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
複製開始点
発現及びクローニングベクターは双方とも一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクター中において、この配列は、染色体ＤＮＡとは独立してベクターの複製を可能にするものであり、複製開始点又は自己複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点の成分は哺乳動物発現ベクターに必要ではない(ＳＶ４０開始点は、それが初期プロモーターを含むためだけから、典型的に使用されうる)。
選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬剤を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されたそれらの細胞は、薬剤耐性が付与されたタンパク質を生成し、よって、選択レジメを生存する。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンが使用される。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ(ＧＳ)、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン-Ｉ及び-ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等、抗体をコードする核酸を取り込む細胞成分を同定することのできるものである。
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を用いて形質転換された細胞は、メトトレキサート(Ｍｔｘ)、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストを含む培養培地において、形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。内在性ＤＨＦＲ活性に欠けるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株(例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-９０９６)を使用することができる。
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳのインヒビターのＬ-メチオニンスルホキシイミン(Ｍｓｘ)を含む培養培地中で形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下、ＧＳ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上述したＤＨＦＲ選択／増幅系と組合せて使用することができる。
あるいは、関心ある抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及び他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド ３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)で形質転換した又は同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)を、例えばアミノグリコシド抗生物質、特にカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８等、選択可能なマーカーに対する選択剤を含む培地において細胞増殖させることによって選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
酵母での使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。ついで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１破壊の存在により、トリプトファンの不在下での増殖による、形質転換の検出に効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２-欠失酵母菌株(ＡＴＣＣ ２０６２２又は３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を担持する既知のプラスミドによって補完される。
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されたベクターは、クルイベロマイシス酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模産生用の発現系は、クルイベロマイシス・ラクチスについて報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイベロマイシスの工業用菌株による成熟した組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定したマルチコピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer等, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、一般的に、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に作用可能に結合したプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが含まれる。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を含むであろう。
真核生物についてもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基対上流に位置してＡＴ-リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から、７０から８０塩基対上流に見出される他の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドとすることができる。多くの真核生物遺伝子の３'末端には、コード化配列の３'末端への、ポリＡ末尾の付加のためのシグナルであってよいＡＡＴＡＡＡ配列である。これら全ての配列は、真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例には、３-ホスホグリセラートキナーゼ、又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘導性プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられる適切なベクターとプロモータは欧州特許第73,657号にさらに記載されている。また、酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、サルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノム、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞株に適合し得る限り制御されうる。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点をさらに含むＳＶ４０制限断片として、簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを使用する哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現する系は、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスからのチミジンキナーゼプロモーターのコントロール下での、マウス細胞におけるヒトβ-インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyes等, Nature 297:598-601 (1982)を参照。また、プロモーターとして、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートを使用することもできる。
エンハンサーエレメント成分
より高等な真核生物によるこの発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントの増強については、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)を参照。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
転写終結成分
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。他の有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びここに開示の発現ベクターを参照。
宿主細胞の選択及び形質転換
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述した原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、特に大腸菌類、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリ・スブチリス(B. subtilis)及びバシリ・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)であるが、他の菌株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３１５３７)、及び大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ２７３２５)も適している。これらの例は限定というよりは、例示的なものである。
全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、例えば治療用抗体が、腫瘍細胞破壊において、それ自体で有効性を示すことにより、細胞傷害剤(例えば毒素)にコンジュゲートする場合、細菌内で産生させることができる。全長抗体は、より長い循環半減期を有する。大腸菌では、より速く、より費用効果のよく産生される。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば最適な発現及び分泌についての翻訳開始領域(ＴＩＲ)及びシグナル配列を記載した、米国特許第５６４８２３７号 (Carter等)、米国特許第５７８９１９９号 (Joly等)、米国特許第５８４０５２３号 (Simmons等)を参照。また、大腸菌における抗体断片の発現を記載した、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。発現後、抗体は、可溶性画分において、大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えばプロテインＡ又はＧカラムを通して精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞において発現する抗体を精製するためのプロセスに類似した形で実施することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。しかしながら、他の多くの属、種及び菌株、例えばシゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)；クルベロミセス・ホスツ(Kluveromyces hosts)、例えばケーラクチス(K. lactis)、ケーフラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ １２４２４)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ １６０４５)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ ２４１７８)、ケーワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ ５６５００)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ ３６９０６)、ケーテルモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許出願公開第 ４０２２２６号)；ピッチャ・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許出願公開第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(欧州特許出願公開第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(occidentalis)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)、及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌及びクロコウジカビも、ここでは一般的に入手可能で有用である。治療用タンパク質の生成のための、酵母及び糸状菌の使用を論議する概説について、例えばGerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)を参照。
ある種の真菌及び酵母菌株が選択され、グリコシル化経路で「ヒト化」され、部分的又は全体的なヒトグリコシル化パターンを有する抗体が生成される。例えば、Li等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)(ピキア・パストリスにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載)；及び上掲のGerngross等を参照。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルスの菌株及び変異体、及び宿主、例えばヨトウガ(イモムシ)、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウショウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコからの対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ-１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株も公に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明では、特にヨウトガ細胞の形質移入用のウイルスとして使用されうる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ(ウキクサ科)、アルファルファ(M. truncatula)及びタバコの植物細胞培養体も、宿主として利用可能である。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同６０４０４９８号、同６４２０５４８号、同７１２５９７８号、及び同６４１７４２９号 (トランスジェニック植物での抗体生産のためのPLANTIBODIESTM技術を記載)を参照。
脊椎動物細胞も宿主として使用可能であり、培養体(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順でなされる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒト胚腎臓細胞(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ 1０)；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４)；バッファロラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５); ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５); マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫(Ｈｅｐ Ｇ２)である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；及び骨髄腫細胞株、例えばＮＳ０及びＳｐ２／０が含まれる。抗体生成に適したある種の哺乳動物宿主細胞の概説について、例えばYazaki 及び Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268を参照。
宿主細胞は、上述した、抗体生成用の発現又はクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを含むように適切に修飾された一般的な栄養培地において培養され、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させる。
宿主細胞の培養
この発明の抗体の生成に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ham等, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnes等, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用可能である。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシンＴＭ剤)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞膜周辺腔で細胞内で産生されるか、あるいは直接培地へ分泌されるかである。第１の工程として、抗体が細胞内で産生される場合、粒子状デブリ、宿主細胞又は溶菌断片のいずれかは、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される、単離された抗体のための手順が記載されている。簡単には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下、約３０分以上かけて解凍される。細胞片は遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、このような発現システムからの上清は、一般的に商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pellicon 限外濾過ユニットを使用して濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えばＰＭＳＦは、タンパク質分解を阻害するために、先の工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は不定汚染物質の増殖を防止するために含めることができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製可能であり、アフィニティークロマトグラフィーは典型的には、好ましい精製工程の一つである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、ヒトγ２、又はヒトγ４の重鎖(Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))をベースにした抗体を精製するのに使用可能である。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３について推奨されている(Guss等, EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合するマトリックスは最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば制御多孔質ガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンにより、アガロースで達成されるよりも、流速がより速くなり、プロセシング時間が短縮される。抗体がＣＨ３ドメインを含有している箇所においては、BAKERBOND ABXＴＭ樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技術、例えばイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(SEPHAROSE)ＴＭにおけるクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィー(例えば、ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程(類)に続き、関心ある抗体と汚染物質とを含む混合物を、約２．５-４．５のｐＨの溶出バッファーを使用する、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、好ましくは低塩分濃度(例えば、約０-０．２５Ｍの塩)にて実施してもよい。
一般的に、研究、試験及び臨床で使用される抗体を調製するための種々の方法が、当該分野で確立され、上述した方法と一致しており、及び／又は関心ある特定の抗体に対して当業者によって適切と思われている。
イムノコンジュゲート
本発明は、また、一又は複数の細胞傷害剤、例えば化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素、その断片)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含むイムノコンジュゲート(「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
イムノコンジュゲートは、細胞傷害剤、すなわち癌の治療において、細胞の成長又は増殖を阻害し又は殺す薬剤の局所送達に使用されている(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu等 (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146；Payne, G. (2003) i 3:207-212；Syrigos 及び Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号)。コンジュゲートしていない薬剤の全身投与により、正常な細胞、並びに除外しようと探索している腫瘍細胞に、許容できないレベルの毒性が付与される箇所に、イムノコンジュゲートでは、腫瘍、及び細胞内のそれらの蓄積部への薬剤部分の標的送達が可能となる(Baldwin等, Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pincheraら編) pp. 475-506。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の双方は、これらの方法で有用であると報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87)。これらの方法に使用されている薬剤には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンが含まれる(Rowland等, (1986) 上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに使用される毒素には、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物性毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン(Mandlerら (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等 (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等 (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許出願公開第１３９１２１３号；Liu等,(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等 (1998)Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムにより、その細胞傷害効果を奏する。幾つかの細胞傷害剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性になるか又は活性が少なくなる傾向がある。
ゼバリンＴＭ(イブリツモマブチウキセタン、Biogen/Idec)は、正常及び悪性のＢリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対して産生されるマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体及びチオウレアリンカー-キレート剤により結合した１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位元素からなる抗体-放射性同位元素コンジュゲートである(Wiseman等 (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等 (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)に対して活性を有しているが、投与により、殆どの患者において、重度の長期にわたる血球減少が生じる。マイロターグＴＭ(ゲムツズマブオゾガマイシン、Wyeth Pharmaceuticals)は、カリケアマイシンに結合したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体-薬剤コンジュゲーであり、注射による急性骨髄性白血病の治療について、２０００年に承認された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同５０７９２３３号；同５５８５０８９号；同５６０６０４０号；同５６９３７６２号；同５７３９１１６号；同５７６７２８５号；同５７７３００１号)。カンツズマブメルタンシン(Immunogen, Inc.)は、メイタンシノイド薬剤部分、ＤＭ１にジスルフィドリンカーＳＰＰを介して結合したｈｕＣ２４２抗体からなる抗体-薬剤コンジュゲートであり、ＣａｎＡｇを発現する癌、例えば結腸、膵臓、胃、及び他の癌の治療のための第ＩＩ相試験に進んでいる。ＭＬＮ-２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、メイタンシノイド薬剤部分、ＤＭ１に結合した抗前立腺特異性膜抗原(ＰＳＭＡ)からなる抗体-薬剤コンジュゲートであり、前立腺腫瘍の潜在的な治療法としての開発下にある。オーリスタチン(auristatin)ペプチド、オーリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルオーリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチンの合成アナログは、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(細胞腫においてルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液液腫瘍においてＣＤ３０に特異的)(Doronina等 (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784)は、治療開発下にある。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体及び化学療法剤又は他の毒素を含む。イムノコンジュゲートの生産に有用な化学療法剤は、ここに記載されている(例えば上述)。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第９３／２１２３２号を参照。様々な放射性ヌクレオチドが放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアナート(トリエン２,６-ジイソシアナート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。
抗体と、一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーロスタチン、トリコテシン、及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートが、ここで考察される。
メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子がコンジュゲートした抗体(全長又は断片)を含む。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂インヒビターである。メイタンシンは、最初、東アフリカの低木であるMaytenus serrataから単離された(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド、例えばメイタンシノール、及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号）。合成のメイタンシノール及びその誘導体及びアナログは、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤部分は、それらが、(ｉ)発酵又は化学的修飾、発酵産物の誘導体化による調製に比較的到達可能であり、(ｉｉ)抗体への非ジスルフィドリンカーを介してのコンジュゲーションに適した官能基での誘導体化が受け入れられ、(ｉｉｉ)血漿中で安定しており、(ｉｖ)多様な腫瘍細胞株に対して効果的であるので、抗体薬剤コンジュゲートにおける魅力的な薬剤部分である。
メイタンシノイドを含むイムノコンジュゲート、それらの作製方法、及びその治療的使用は、例えば、その開示が出典明示により明確にここに援用される米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されている。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)は、ヒト結腸直腸癌に対して産生されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含むイムノコンジュゲートを記載している。コンジュゲートは、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞傷害性であることが見出されており、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗癌活性を示した。Chari等, Cancer Research 52:127-131 (1992)には、メイタンシノイドが、ヒト結腸癌細胞株における抗原に結合するマウス抗体Ａ７に、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に、ジスルフィドリンカーを介してコンジュゲートしているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、細胞当たり、３×１０５のＨＥＲ-２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ-ＢＲ-３においてインビトロで試験される。薬剤コンジュゲートは、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加可能な、遊離のメイタンシノイド剤と同様の度合いの細胞傷害性を達成した。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身性の細胞傷害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物活性も有意に低減させることなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることによって、調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号(その開示は、出典明示により明示的にここに援用される)。抗体分子当たりのコンジュゲートした平均３−４のメイタンシノイド分子は、抗体の機能又は溶解度に負の影響を与えることなく、標的細胞の細胞傷害性を高める効果を示すが、毒素／抗体の一分子でさえ、ネイキッド抗体の使用に対して細胞傷害性を亢進することが予期されている。メイタンシノイドは当該分野でよく知られており、既知の技術で合成可能であり、又は天然源から単離することができる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号及び上述した他の特許及び非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び芳香環又はメイタンシノール分子の他の位置が修飾されたメイタンシノールアナログ、例えば様々なメイタンシノールエステルである。
その開示が出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第５２０８０２０号、又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、Chari等, Cancer Research 52:127-131 (1992)、及び２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６０６０２号に開示されているものを含み、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための、多くの連結基が当該分野で知られている。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／９６０６０２号に開示されている。連結基には、上述した特許に開示されているような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基を含み、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。付加的な連結基がここに開示され、例証されている。
抗体とメイタンシノイドのコンジュゲートは、様々な二官能性のタンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアナート)、及びビス-活性化フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173:723-737 (1978))、及びＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれ、ジスルフィド結合が得られる。
リンカーは、リンカーのタイプに応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合されうる。例えば、エステル結合は、一般的なカップリング技術を使用して、ヒドロキシル基と反応させることにより形成させることができる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ-３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位置、ヒドロキシル基を有するＣ-２０位置で生じうる。好ましい実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ-３位置に形成される。
オーリスタチン及びドラスタチン
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチン(dolostatin)ペプチドアナログ及び誘導体、オーリスタチン(米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号)にコンジュゲートした抗体を含む。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、及び核及び細胞分割に干渉することが示されており(Woyke等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、また抗癌性(米国特許第５６６３１４９号)及び抗真菌活性(Pettitら (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有している。ドラスタチン又はオーリスタチンの薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端を介して、抗体に結合されうる(国際公開第０２／０８８１７２号)。
オーリスタチンの例示的な実施態様には、その開示が出典明示によりここに明示的に援用される"Monomethlvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願の米国特許第１０／９８３３４０号に開示されたＮ末端結合モノメチルオーリスタチン薬剤部分を含む。
典型的には、ペプチドベースの薬剤部分は、２又はそれ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片の間に、ペプチド結合を形成させることによって調製することができる。このようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野でよく知られている液相合成法(E.Schroder及びK. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)に従い調製することができる。オーリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Pettit等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettitら (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R等 Synthesis, 1996, 719-725；及び Pettit等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従い調製することができる。また、その全体が出典明示によりここに援用されるDoronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-78；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８３３４０号(例えば、リンカーに対してコンジュゲートしたＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ等の、モノメチルバリン化合物を調製する方法、及びリンカーが開示されている)を参照のこと。
カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、サブ-ピコモル濃度での二本鎖ＤＮＡを破壊可能である。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全てAmerican Cyanamid Company)を参照。使用可能なカリケアマイシンの構造的アナログには、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode等, Cancer Research 58:2925-2928 (1998)、及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体がコンジュゲート可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡの双方は、細胞内作用部位を有しており、細胞膜を容易に通過できない。よって、抗体媒介性の内部移行を介したこれらの薬剤の細胞取り込みは、その細胞傷害効果を大きく亢進する。
他の細胞傷害剤
抗体にコンジュゲート可能な他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン、及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載された集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤のファミリー、並びにエスペラミシン(米国特許第５８７７２９６号)を含む。
使用されうる酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素)を有する化合物と抗体との間で形成されるイムノコンジュゲートをさらに考慮する。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高度に放射性のある原子を含みうる。様々な放射性同位元素が、放射性コンジュゲート抗体の生産に有用である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出のために使用される場合、それは、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３のようなシンチグラフィー検査のための放射活性原子、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)画像(磁気共鳴画像、ｍｒｉとしても知られている)のためのスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。
放射性-又は他の標識は、既知の方法でコンジュゲートに導入することができる。例えば、ペプチドは、水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用して、化学的アミノ酸合成法により合成することができる。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドにシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合されうる。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Fraker等 (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)は、ヨウ素-１２３を導入するために使用することができる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」 (Chatal,CRC Press 1989)には、他の方法が詳細に記載されている。
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアナート)、及びビス-活性化フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号参照。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチターゼに敏感なリンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー(Chari等, Cancer Research 52:127-131 (1992); 米国特許第５２０８０２０号)を使用することができる。
化合物は、限定しないが、架橋剤：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)ベンゾアート)で、商業的に入手可能なものを用いて調製されるＡＤＣを明示的に考慮する(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからのもの)。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)では、抗体(Ａｂ)は、リンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体当たり約１から約２０の薬剤部分にコンジュゲートされる。式ＩのＡＤＣは、(１)二価のリンカー試薬と抗体の求核基とを反応させ、共有結合を介してＡｂ-Ｌを形成させ、続いて薬剤部分と反応させ；(２)二価のリンカー試薬と薬剤部分の求核基とを反応させ、共有結合を介してＤ-Ｌを形成させ、続いて抗体の求核基と反応させることを含む、当業者に知られている有機化学反応、条件、及び試薬を使用し、いくつかの経路により調製することができる。ＡＤＣを調製するためのさらなる方法を、ここに記載する。
Ａｂ-(Ｌ-Ｄ)ｐ Ｉ
リンカーは、一又は複数のリンカー成分からなりうる。例示的なリンカー成分には、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「ｖａｌ-ｃｉｔ」)、アラニン-フェニルアラニン(「ａｌａ-ｐｈｅ」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル ４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル ４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(「ＳＩＡＢ」)が含まれる。さらなるリンカー成分が当該分野で知られており、そのいくつかはここに記載される。また、その内容の全体が出典明示によりここに援用される２００４年１１月５日に出願された米国特許第１０／９８３３４０号「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」を参照。
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ-ｃｉｔ)、アラニン-フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ-ｐｈｅ)が含まれる。例示的なトリペプチドには：グリシン-バリン-シトルリン(ｇｌｙ-ｖａｌ-ｃｉｔ)及びグリシン-グリシン-グリシン(ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｇｌｙ)が含まれる。アミノ酸リンカー成分に含有されるアミノ酸残基には、天然に生じたもの、並びに微量アミノ酸、及び天然に生じないアミノ酸アナログ、例えばシトルリンが含まれる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼにより酵素的切断されるように設計され、その選択性が最適化される。
抗体上の求核基は、限定されるものではないが、(ｉ)Ｎ末端アミノ基、(ｉｉ)側鎖アミン基、例えばリジン、(ｉｉｉ)側鎖チオール基、システイン、及び(ｉｖ)抗体がグリコシル化されている場合、糖ヒドロキシル又はアミノ基を含む。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は求核性であり、反応して、(ｉ)活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、及びハロホルマート及び酸ハロゲン化物、(ｉｉ)アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(ｉｉｉ)アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成することができる。ある種の抗体は、還元性鎖間ジスルイド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオスレイトール)での処理によるリンカー試薬とのコンジュゲートのために反応性にさせられうる。よって、各システイン架橋は、理論的に２つの反応性チオール求核剤を形成するであろう。付加的な求核基は、アミンをチオールに転換させる２-イミノチオラン(トラウト試薬)を用いたリジンの反応を介して、抗体に導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４、又はそれ以上のシステイン残基を導入(例えば、一又は複数の非天然システインアミノ酸残基を含む変異抗体を調製)することにより、抗体(又はその断片)に導入することができる。
また、抗体薬剤コンジュゲートは、リンカー試薬又は薬剤において、求核置換基と反応可能な求電子部分を導入するために、抗体を修飾することにより産生することができる。グリコシル化抗体の糖類は、例えば、過ヨウ素酸化試薬を用いて酸化させ、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応可能なアルデヒト又はケトン基を形成させることができる。得られたイミンシッフ塩基基は、安定した結合を形成でき、又はホウ化水素試薬により還元されて、安定したアミン結合を形成することができる。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又は過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかと、グリコシル化抗体の炭水化物部分とを反応させることによって、薬剤の適切な基と反応可能なタンパク質において、カルボニル(アルデヒド又はケトン)基が生じる(Hermanson, Bioconjugate Techniques)。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応可能で、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドが産生される(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852)。このようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカー求核剤と反応させることができる。
同様に、薬剤部分の求核基は、限定されるものではないが、反応して、(ｉ)活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルマート及び酸ハロゲン化物、(ｉｉ)アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(ｉｉｉ)アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシラート、及びアリールヒドラジド基を含む。
あるいは、抗体と細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により、作製することができる。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間するか又は互いに隣接した２つのコンジュゲート部分をコードする各領域を含みうる。
また他の実施態様では、抗体は、腫瘍の事前標的に利用される「レセプター」(例えば、ストレプトアビジン)にコンジュゲートすることができ、ここで、抗体-レセプターコンジュゲートが患者に投与され、続いて洗浄剤を使用し、循環から未結合のコンジュゲートが除去され、ついで、細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートした「リガンド」(例えばアビジン)が投与される。
治療的用途
ここに記載の抗体は、前癌性、非転移性、及び癌性腫瘍(例えば、初期段階の癌)を含む癌の治療、又は例えば乳癌のような癌の発病の危険性がある被験者の処置に使用することができる。また、抗体及び抗体断片は非悪性疾患、例えば自己免疫及び神経障害の治療又は予防に使用可能である。
ＪＭ-ａアイソフォームに特異的である抗体は、ＪＭ-ａアイソフォームの発現により特徴付けられる癌又は他の疾患の治療に特に有用であることが見出されている。一実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォームは、同じ細胞型の非癌細胞、又は癌細胞に隣接する非癌細胞よりも高レベルで、癌細胞において発現している。いくつかの実施態様では、ＪＭ-ａアイソフォームは、非癌細胞の発現レベルよりも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％高いレベルで発現している。
ＪＭ-ａアイソフォーム特異的抗体は、脱落したＨＥＲ４外部ドメインの増加レベルにより特徴付けられる、癌又は他の疾患の処置に、特に有用であることが見出されている。実施例に提示されるように、同じ患者から収集された一連の組織学的に正常な乳房組織及び乳癌組織の試料では、可溶性ＨＥＲ４外部ドメインの放出が、適合する正常なコントロール組織と比較した場合、乳癌において有意に増加していることが証明された。さらに、細胞内ＨＥＲ４エピトープの核局在化は、膜性ＨＥＲ４発現と比較した場合、好ましくない臨床成績に関連しており、ＨＥＲ４切断の増加が生存率の低下に関連することが示される(２９)。一実施態様では、癌細胞に存在する脱落したＨＥＲ４外部ドメインのレベルは、同じ細胞型の非癌細胞、又は癌細胞に隣接する非癌細胞よりも高レベルである。いくつかの実施態様では、脱落したＨＥＲ４外部ドメインのレベルは、非癌細胞における脱落したＨＥＲ４外部ドメインのレベルよりも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％高い。
ＪＭ-ａアイソフォームを過剰発現し、及び／又は脱落したＨＥＲ４外部ドメインのレベルが増加した癌の特定の例には、乳癌、卵巣癌、及び髄芽種が含まれる(１５)(６０)。また、ＨＥＲ４変異のレベルが増加した癌は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する抗体で治療することで、好ましく反応することが予期される。このような癌には、肺癌及びメラノーマ(６５)(６６)が含まれる。
本発明のいくつかの態様では、患者は、患者がＪＭ-ａアイソフォームの発現又は過剰発現により特徴付けられる癌又は他の疾患を患っていることの決定に基づいて、ＪＭ-ａアイソフォームに特異的である抗体で治療されるように選択される。次の診断方法の項に詳細に検討されているように、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチドの存在、ＪＭ-ａアイソフォームポリヌクレオチドの存在、又は脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出する方法を含む多くの方法を使用して検出することができる。
診断方法
本発明の他の態様は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの存在を決定する方法を提供する。一実施態様では、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの存在は、ＪＭ-ａアイソフォームの発現を検出することにより測定される。一実施態様では、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチドの存在を検出することにより測定される。一実施態様では、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、ＪＭ-ａアイソフォームポリヌクレオチドの存在を検出することにより測定される。他の実施態様では、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出することによって測定される。
ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチドの発現及び／又は脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出するための様々な方法が使用可能であり、例えば、免疫組織化学分析、免疫沈降、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光標示式細胞分収(ＦＡＣＳ)等が含まれる。例えば、組織又は試料中のＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチド及び／又は脱落したＨＥＲ４外部ドメインの発現を検出する任意の方法は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム、そのＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム結合断片に特異的な抗体、又はＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム特異的抗体の抗原結合領域を有する組換えタンパク質と試料とを接触させ；ついで、試料中におけるＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチド又は脱落したＨＥＲ４外部ドメインを検出することを含む。
本発明の特定の実施態様では、試料におけるＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチドの発現又は脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在は、免疫組織化学及び染色プロトコルを使用して検査される。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価又は検出するための、信頼ある方法であることが示されている。免疫組織化学(「ＩＨＣ」)技術は抗体をプローブに利用し、一般的に発色又は蛍光法により、インサイツで細胞抗原を可視化する。
試料の調製では、哺乳動物(典型的にはヒト患者)からの組織又は細胞試料が使用されうる。試料の例には、限定されるものではないが、組織バイオプシー、血液、肺吸引、痰、リンパ液等が含まれる。試料は、限定されるものではないが、外科的切除、吸引又はバイオプシーを含む、当該分野で知られた様々な手順で得ることができる。組織は新鮮なものでも又は凍結乾燥されてもよい。一実施態様では、試料はパラフィン等に固定され、包埋される。
組織試料は、一般的な方法(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 第3版 (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.)により、固定(すなわち保存)することができる。当業者であれば、試料が、組織学的に染色されるか、又は他の方法で分析されるかといった目的により、固定剤の選択が決定されると理解しているであろう。また、当業者であれば、固定長さが、組織試料の大きさ及び使用した固定剤に依存していることを理解しているであろう。例を挙げると、中性の緩衝ホルマリン、ブアン、又はパラホルムアルデヒドを、試料の固定に使用することができる。
一般的に、試料をまず固定し、ついで、上昇列のアルコールを介して脱水され、浸潤させ、組織試料を切片化可能なように、パラフィン又は他の切片用培地に包埋される。また、組織を切片化し、得られた切片を固定することもできる。例として、組織試料は包埋し、一般的な方法により、パラフィンにおいてプロセシングすることができる(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 上掲を参照)。使用可能なパラフィンの例には、限定されるものではないが、Paraplast、Broloid、及びTissuemayが含まれる。ひとたび組織試料が包埋されると、試料はミクロトーム等により切片化することができる(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 上掲を参照)。この手順の例として、切片は、約３ミクロンから約５ミクロン厚の範囲とすることができる。切片化すると、切片はいくつかの標準的な方法により、スライドに付着させられる。スライド用付着剤の例には、限定されるものではないが、シラン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン等が含まれる。例として、パラフィン包埋切片は、正に帯電したスライド及び／又はポリ-Ｌ-リジンでコーティングされたスライドに付着させることができる。
パラフィンが包埋物質として使用されているならば、組織切片は、一般的に脱パラフィン化され、水に再水和される。組織切片は、いくつかの一般的な標準方法により、脱パラフィン化することができる。例えば、キシレン及び徐々に下降列のアルコールを使用することができる(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 上掲)。また、商業的に入手可能な脱パラフィン用の非有機剤、例えばホモ-Ｄｅ７(CMS, Houston, Texas)が使用可能である。
場合によっては、試料調製後、組織切片はＩＨＣを使用して分析することができる。ＩＨＣは付加的な技術、例えば形態学的染色及び／又は蛍光インサイツハイブリダイゼーションと組合せて実施することができる。２つの一般的なＩＨＣ法、直接及び関節アッセイが利用される。第１のアッセイに従い、標的抗原(例えば、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム)への抗体の結合は、直接測定される。この直接アッセイでは標識された試薬、例えば蛍光タグ又は酵素標識された一次抗体が使用され、さらに抗体が相互作用することなく可視化可能となる。典型的な間接アッセイにおいて、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原に結合し、ついで、標識された二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートしたところで、発色又は蛍光発生基質が添加され、抗原が可視化される。いくつかの二次抗体は一次抗体の種々のエピトープと反応するため、シグナル増幅が生じる。
典型的に免疫組織化学に使用された一次及び／又は二次抗体は、検出可能な部分で標識されているであろう。一般的には次のカテゴリーにグループ分け可能な多くの標識が利用可能である：
(ａ)放射性同位元素、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ。抗体は、Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen等編 Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)に記載の技術を使用し、放射性同位元素で標識することができ、例えばシンチレーション測定を使用し、放射性を測定することができる。
(ｂ)コロイド金粒子
(ｃ)限定されるものではないが、希土類キレート剤(ユーロピウムキレート剤)、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン(Lissamine)、ウンベリフェロン、フィコクリセリン(phycocrytherin)、フィコシアニン、又は商業的に入手可能なフルオロフォア、例えばSPECTRUM ORANGE7 及び SPECTRUM GREEN7、及び／又は上述した任意の一又は複数の誘導体を含む蛍光標識。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示されている技術を使用して、抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は蛍光計を使用して定量することができる。
(ｄ)様々な酵素−基質標識が利用でき、米国特許第４２７５１４９号は、これらの幾つかの概説を提供している。酵素は一般に様々な技術を用いて測定可能な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させうる。蛍光変化を定量する技術を上述する。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定可能な光を放出するか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ)等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素を抗体にコンジュゲートさせる技術は、O'Sullivan等, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone及びH. Van Vunakis編), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
酵素-基質の組合せの例は、例えば以下を含む：
(ｉ)西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素で、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
(ｉｉ)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；及び
(ｉｉｉ)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質（例えば、４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)。
数多くの他の酵素-基質の組合せが当業者には利用可能である。これらの一般的な概説は、米国特許第４２７５１４９号及び第４３１８９８０号を参照のこと。標識は抗体に間接的にコンジュゲートされる場合もある。当業者であれば、これを達成するための様々な技術を知っているであろう。例えば、抗体をビオチンにコンジュゲートさせ、上述した４つの広い範疇の標識の何れかをアビジンにコンジュゲートさせるか、又はその逆が可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な方式で抗体に標識をコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体との標識の間接的なコンジュゲートを達成するために、抗体に小さなハプテンをコンジュゲートさせ、上述の異なるタイプの標識を抗ハプテン抗体にコンジュゲートさせる。よって、抗体との標識の間接的なコンジュゲートを達成できる。
上で検討した試料調製手順の他に、ＩＨＣの前、中又は後に、組織切片をさらに処理することが所望される。例えば、エピトープ回収法、例えばシトラートバッファー中で組織試料を加熱することを実施することができる(例えば、Leong等 Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996))。
任意工程のブロック工程後、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原に結合するように、十分な時間、適切な条件下で、組織切片を一次抗体に暴露させる。これを達成するのに適切な条件は、常套的な実験により決定することができる。試料に対する抗体の結合度合いは、上で検討した検出可能な標識のいずれか一つを使用することにより決定される。好ましくは、酵素標識は、一次抗体に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされる(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)。
このようにして調製された標本を取り付け、カバーガラスを取り付けることができる。ついで、例えば顕微鏡を使用して、スライド評価を決定し、当該分野で常套的に使用される染色強度基準を用いることができる。一例として、染色強度基準は、次のようにして評価されうる：
Figure 0005894436
別の方法では、試料を、抗体-抗原複合体の形成に十分な条件下で、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム特異的抗体と接触させ、ついで該複合体を検出することができる。複合体の存在は、血漿又は血清を含む多様な組織及び試料をアッセイするための多くの方法、例えばウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡ手順により検出可能である。このようなアッセイ形式を使用する広範囲の免疫アッセイ技術が利用可能であり、例えば、米国特許第４０１６０４３号、同４４２４２７９号、及び同４０１８６５３号が参照される。これらには、非競合型のシングルサイト又はツーサイト又は「サンドイッチアッセイ」、並びに伝統的な競合結合アッセイの双方が含まれる。またこれらのアッセイは、標的抗原に対する標識された抗体の直接結合も含まれる。
サンドイッチアッセイは、最も有用で一般的に使用されるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多くの変形が存在し、全てが本発明に包含されることが意図される。簡潔に述べると、典型的なフォワードアッセイでは、未標識抗体が固体基質に固定され、検査される試料が結合分子と接触させられる。適切なインキュベーション時間の後、抗体-抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間、検出可能なシグナルを生成可能なレポーター分子で標識された抗原特異的な第２の抗体を添加し、抗体-抗原-標識抗体の他の複合体を形成させるのに十分な時間インキュベートする。任意の未反応物質を洗い流し、抗原の存在を、レポーター分子によりつくられるシグナルを観察することにより測定する。結果は、可視シグナルの単なる観察により、定性的であるか、又は既知量の抗原を含むコントロール試料と比較することにより定量されうる。
フォワードアッセイについての変形には、試料と標識された抗体の双方を、結合した抗体に同時に添加する同時アッセイが含まれる。容易に明らかになるであろう任意の僅かな変形を含むこれらの技術は当業者によく知られている。典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに対して特異性を有する第１の抗体が、固体表面に共有的又は受動的に結合させられる。固体表面は、典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されているポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又は免疫アッセイの実施に適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは当該分野でよく知られており、一般的に共有的に架橋結合、又は物理的吸着からなり、ポリマー-抗体複合体は、試験試料の調製で洗浄される。ついで、試験される試料のアリコートが、固相複合体に添加され、十分な時間(例えば、２−４０分又は都合がよければ一晩)、適切な条件下(例えば室温から４０℃、特に２５℃から３２℃)でインキュベートされ、抗体に存在する任意のサブユニットの結合を可能にする。インキュベーション時間後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、バイオマーカーの一部に特異的な第２の抗体と共にインキュベートする。分子マーカーへの第２の抗体の結合を示すのに使用されるレポーター分子に、第２の抗体は結合させられる。
代替法は、試料中の標的抗原を固定し、ついでレポーター分子で標識された又は標識されていない特定の抗体へ固定化標的を暴露することを含む。標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体を用いた直接の標識により検出可能でありうる。あるいは、第１の抗体に特異的な第２の標識された抗体を、標的-第１の抗体複合体に暴露し、標的-第１の抗体-第２の抗体の三重複合体を形成させる。複合体はレポーター分子により発っせられるシグナルによって検出される。本明細書で使用される、「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗原-結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルをもたらす分子を意味する。このタイプのアッセイで最も一般的に使用されているレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、放射性核種含有分子(すなわち放射性同位元素)及び化学発光分子のいずれかである。
酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)の場合、酵素は、一般的にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩により、第２の抗体にコンジュゲートされる。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に容易に利用される、広範な様々なコンジュゲート技術が存在する。一般的に使用されている酵素には、とりわけ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、-ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが含まれる。特定の酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色調変化を生じるように選択される。適切な酵素の例には、アリカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが含まれる。また、上述の発色性基質よりも、蛍光生成物を生じる、蛍光発生基質を用いることもできる。全ての場合、酵素標識された抗体は、第１の抗体-分子マーカー複合体に添加され、結合させられ、ついで、過剰の試薬が洗い流される。次に、適切な基質を含む溶液が抗体-抗原-抗体の複合体に添加される。基質が第２の抗体に結合した酵素と反応し、定性的な可視シグナルを付与し、通常は分光光学的にさらに定量され、試料中に存在したバイオマーカーの量が与えられる。あるいは、蛍光化合物、例えばフルオレセイン及びローダミンは、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的にカップリングさせうる。特定の波長の光での照明により活性化されると、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子内に励起状態を誘導し、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色調の光を発光する。ＥＩＡにおけるように、蛍光標識された抗体は、第１の抗体-分子マーカー複合体に結合可能である。未結合の試薬を洗い流した後、残存している三重複合体を適切な光の波長に暴露させる。観察された蛍光が、関心ある分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は、双方とも、当該分野で十分に確立されている。しかしながら、他のレポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光又は生物発光分子をまた用いることができる。
本発明の方法は、組織又は細胞試料においてＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム ｍＲＮＡの存在及び／又は発現を調べるプロトコルをさらに含む。細胞におけるｍＲＮＡを評価するための方法はよく知られており、相補ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識されたリボプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技術)及び種々の核酸増幅アッセイ(例えば、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的な相補プライマーを使用するＲＴ-ＰＣＲ、及び他の増幅型の検出方法、例えば分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等)が含まれる。
哺乳動物からの組織又は細胞試料を、ノーザン、ドットブロット、又はＰＣＲ分析を使用し、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームｍＲＮＡｓについて、簡便にアッセイすることができる。例えばＲＴ-ＰＣＲアッセイ、例えば定量的ＰＣＲアッセイは当該分野でよく知られている。このような方法は、生体試料におけるＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム ｍＲＮＡのレベルを決定することを可能にする一又は複数の工程を含みうる(例えば、アクチンファミリーメンバー等の「ハウスキーピング」遺伝子の比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを同時に検査することによる)。ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームｍＲＮＡの存在を測定するための特定のプロトコルは、Junttila, T.T.等 Clin. Cancer Res. 2003:9:5346-5357 (19)に記載されている。
本発明のこの態様の重要な実施態様は、本発明のポリヌクレオチド又はその任意の特定の部分の特異的な増幅を可能にする、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームプライマー及びプライマー対、及び本発明の核酸分子又はその任意の部分に選択的に又は特異的にハイブリダイズするプローブを含む。プローブは、検出可能なマーカー、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、又は酵素で標識されうる。このようなプローブ及びプライマーを、試料中のＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームポリヌクレオチドの存在を検出するために、またＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームポリペプチドを発現する細胞を検出するための手段として使用することができる。当業者により理解されるように、非常に多くの異なるプライマー及びプローブが、ここに提供される配列に基づいて調製され得、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームｍＲＮＡを効果的に増幅し、クローニングし、及び／又はその存在及び／又はレベルを決定するのに使用されうる。
本発明の任意の方法は、マイクロアレイ技術により、組織又は細胞試料中のｍＲＮＡ、例えばＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームｍＲＮＡを検査し又は検出するプロトコルを含む。核酸マイクロアレイを使用して、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識してｃＤＮＡプローブを産生する。ついで、プローブを、固体支持体に固定された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイは、アレイの各メンバーの配列と位置が知られるように構成される。例えば、ある疾患状態で発現される潜在性を有している選択遺伝子が、固体支持体に整列されうる。特定のアレイメンバーでの標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブが誘導された試料がその遺伝子を発現することを示している。疾患組織のディファレンシャル遺伝子発現解析は、貴重な情報を提供しうる。マイクロアレイ技術は、核酸ハイブリダイゼーション技術及び計算技術を利用し、一回の実験内で何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを評価する(例えば２００１年１０月１１日に公開の国際公開第０１／７５１６６号を参照；(アレイ製造の検討については、例えば、米国特許第５７００６３７号、米国特許第５４４５９３４号、及び米国特許第５８０７５２２号，Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)；Cheung, V.G等, Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)を参照)。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基質上に直接合成されるか又はスポットされる遺伝子断片を含む小型のアレイである。通常、何千もの遺伝子が単一のアレイに表される。典型的なマイクロアレイ実験は、次の工程を含む：１）試料から単離されたＲＮＡからの、蛍光的に標識された標的の調製、２）マイクロアレイに対する標識された標的のハイブリダイゼーション、３）アレイの洗浄、染色、及びスキャンニング、４）スキャンされた画像の分析、及び５）遺伝子発現プロファイルの生成。現在は、２つの主要なタイプのＤＮＡマイクロアレイが使用されている：オリゴヌクレオチド(通常、２５〜７０塩基長)アレイ、及びｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含む遺伝子発現アレイである。アレイの形成において、オリゴヌクレオチドは、予め作製し、表面にスポットするか、又は表面に直接合成されうる(インサイツ)。
Affymetrix GeneChip(登録商標)システムは、ガラス表面上でのオリゴヌクレオチドの直接合成により製造されるアレイを含む商業的に入手可能なマイクロアレイシステムである。オリゴヌクレオチドは、通常２５塩基対であり、半導体ベースのフォトリソグラフィーと固相化学合成技術の組合せにより、ガラスウェハ上に直接合成される。各アレイは４０００００までの種々のオリゴを含み、各オリゴは何百万のコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブは、アレイ上の既知の位置において合成されるので、ハイブリダイゼーションパターン及びシグナル強度は、遺伝子アイデンティティー及び相対発現レベルに関してAffymetrix Microarray Suiteソフトウェアにより解釈されうる。各遺伝子は、一連の種々のオリゴヌクレオチドプローブにより、アレイ上に表される。各プローブ対は、完全にマッチしたオリゴヌクレオチドとミスマッチのオリゴヌクレオチドとからなる。完全にマッチしたプローブは、特定の遺伝子に正確に相補的な配列を有し、よって遺伝子の発現を測定する。ミスマッチプローブは、中心の塩基位置で単一の塩基が置換され、標的遺伝子の転写物の結合が妨害されることにより、完全にマッチしたプローブとは異なる。これは、完全に一致したオリゴについて測定されるシグナルに寄与する非特異的なハイブリダイゼーション及びバックグラウンドを決定するのに役立つ。Microarray Suiteソフトウェアは、ミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を完全にマッチしたプローブのものから引き、各プローブセットに対する絶対的又は特異的強度値を測定する。プローブは、Genbank及び他のヌクレオチドリポジトリからの現在の情報に基づき選択される。配列は、遺伝子の３'末端の独特の領域を認識すると考えられている。GeneChip Hybridization Oven (「ロティスリー(rotisserie)」オーブン)を使用し、一回で、６４アレイまでのハイブリダイゼーションを実施する。流体ステーションは、プローブアレイの洗浄及び染色を実施する。それは完全に自動化されており、各モジュールが一つのプローブアレイを保持する４つのモジュールを含む。各モジュールは、予めプログラムされた流体プロトコルを使用し、Microarray Suiteソフトウェアを介し、独立してコントロールされる。スキャナーは、プローブアレイに結合した標識されたｃＤＮＡにより発せられる蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナーである。Microarray Suiteソフトウェアを具備するコンピュータワークステーションは、流体ステーション及びスキャナーをコントロールする。Microarray Suiteソフトウェアは、プローブアレイのための予めプログラムされたハイブリダイゼーション、洗浄、及び染色プロトコルを使用し、８つまでの流体ステーションを制御することができる。また、ソフトウェアは適切なアルゴリズムを使用し、各遺伝子について、ハイブリダイゼーション強度データを獲得し存在／不在コールに転換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析による実験間の遺伝子発現における変化を検出し、さらなるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムと共に使用することができるテキストファイルにアウトプットをフォーマットする。
また、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、遺伝子欠失又は遺伝子増幅を検査することにより、評価することができる。遺伝子欠失又は増幅は、当該分野で知られている様々なプロトコルの任意のもの、例えばｍＲＮＡの転写を定量するための(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))一般的なサザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット(ＤＮＡ分析)、又は適切な標識プローブを使用するインサイツハイブリダイゼーション(例えばＦＩＳＨ)、又は適切に標識されたプローブを使用する細胞遺伝子学的な方法又は比較ゲノムハイブリダイゼーション(ＣＧＨ)により、測定されうる。例を挙げると、これらの方法は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォーム遺伝子の欠失又は増幅を検出するために用いることができる。
また、組織又は細胞試料におけるＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、機能的又は活性ベースのアッセイにより、検査することができる。例えば、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームが発現していると思われる組織又は細胞試料に対して、腫瘍壊死因子-α-転換酵素(ＴＡＣＥ)を用いた処置の効果を決定することにより、検出することができる。
薬学的製剤
本発明の治療用抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)の薬学的製剤は、典型的には、単位用量の滅菌注射用形態で、非経口投与、すなわち薬学的に許容可能な非経口用ビヒクルと共に、ボーラス、静脈内、腫瘍内注射用に調製される。所望の純度を有する抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、場合によっては薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤又は安定化剤（Remington：The Science and Practice of Pharmacy 第21版 (2005)編. Univ. of the Sciences Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins)と混合される。
許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール等)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また、活性な製薬用成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されうる。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21版(2005), Univ. of the Sciences Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkinsに開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、ＡＤＣを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド類(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセタート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
製剤は、前記投与経路に適したものを含む。製剤は、簡便には、単位投与形態で提供され得、薬学の分野でよく知られている任意の方法により調製されうる。技術及び製剤は、一般的に、Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form. 1版(August 1, 2001) Mark Gibson編, US Informa Healthcare, Marcel Dekker, CRC Press (ISBN-10 1574911201)；Handbook of Pharmaceutical Excipients 5版 (December 14, 2005) Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, 及びSian C. Owen APhA Publications (ISBN-10: 1582120587)に見出される。
このような方法は、一又は複数の補助的成分を構成する担体と活性成分を併せる工程を含む。一般には、製剤は、液体担体又は微細に分割された固体担体と又は双方と、活性成分を、均質にかつ密接に併せ、ついで、必要であるならば、生成物を成形することにより、調製される。
本発明の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合せしめられて活性物質を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガム、及び分散又は湿潤剤、例えば天然に生じるホスファチド（例えばレシチン）、脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。水性懸濁液はまた一又は複数の保存料、例えばエチル又はｎ-プロピルｐ-ヒドロキシ-ベンゾアート、一又は複数の着色剤、一又は複数の香味剤及び一又は複数の甘味料、例えばスクロース又はサッカリンを含みうる。
薬学的組成物は滅菌された注射用調製物の形態、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液でありうる。この懸濁液は上に述べた好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて知られた技術に従って製剤化されうる。滅菌された注射用調製物はまた１,３-ブタンジオール中の溶液として又は凍結乾燥粉末として調製されたもののように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液でありうる。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌固定化油を溶媒又は懸濁媒質として常套的に用いることができる。この目的に対して、合成のモノ-又はジグリセリドを含む任意のブランドの固定油を用いることができる。また、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。
単一の投薬形態をつくるために担体物質と組合せられうる活性成分の量は、治療される宿主と特定の投与態様に応じて変わる。例えば、静脈内注入を意図した水溶液は、約３０ｍＬ／ｈｒの流量で適した体積の注入が生じ得るようにするために、溶液１ミリリットル当たり約３から５００μｇの活性成分を含みうる。
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び意図したレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含みうる水性及び非水性滅菌注射用溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。
タンパク質治療剤の経口投与は腸での加水分解又は変性のために好まれないが、経口投与に適した製剤は、予め決められた量の抗体をそれぞれ含むカプセル、カシェー(cachets)又は錠剤のような離散単位として調製することができる。
製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに包装することができ、使用直前に注射のために滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時混合注射溶液及び懸濁液は過去に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。単位投薬量製剤は、活性成分の、上に列挙されたような毎日の投薬又は毎日の部分用量単位、又はその適切な画分を含むものである。
本発明の組成物は免疫リポソームとしてまた調製されうる。「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配置に類似する二層形成に配される。抗体を含むリポソームは、例えばEpstein等 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688；Hwang等 1980 Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030；米国特許第４４８５０４５号；米国特許第４５４４５４５号；米国特許第５０１３５５６号；国際公開第９７／３８７３１号に記載されている、当該分野で知られている方法により調製される。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって作製することができる。リポソームは、定まった孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが産生されうる。本発明の組成物のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされうる(Martin等 1982 J. Biol. Chem. 257: 286-288)。化学療法剤は、場合によってはリポソーム内に包含される(Gabizon等 1989 J. National Cancer Inst. 81(19)：1484を参照)。
本発明の抗体は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、用量決定され、投与されるであろう。こここで考慮される要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に知られている他の要因が含まれる。抗体は、必要ではないが、場合によっては当該問題の疾患を予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化されうる。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討された他の要因に依存する。これらは、一般に、同じ投薬量で、ここに記載された投与経路で、又はここに記載の用量のおよそ１〜９９％か、又は経験的／臨床的に適切であると決定された任意の用量及び任意の経路により、使用される。
疾患の予防又は治療のために、（単独で又は一又は複数の他の付加的な治療剤との併用で使用される場合）本発明の抗体の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、事前治療、患者の臨床病歴及び抗体に対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。抗体は一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。抗体の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）の一又は複数回の用量で患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量の抗体が投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
上述した治療法のいずれも、抗体に代えて、又は付加して、本発明の免疫コンジュゲートを使用して実施することができる。
併用療法
本発明の抗体は、抗癌性を有する第２の化合物と、併用治療として、薬学的組合せ製剤又は投与レジメンに組合せることができる。薬学的組合せ製剤又は投与レジメンの第２の化合物は、互いに悪影響を及ぼさないように、組合せの抗体に対して相補活性を有しうる。
第２の化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤でありうる。このような分子は、意図する目的に対して有効な量で組合せて、適切に存在する。本発明の抗体を含む薬学的組成物は、治療的有効量の化学療法剤、例えばチューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、ＤＮＡ干渉物質、又はＤＮＡバインダーを含有可能である。
他の治療レジメンは、この発明に従って同定された抗癌剤の投与と組合せることができる。併用療法は同時の又は逐次レジメンとして投与されうる。逐次的に投与される場合、組合せは２又はそれ以上の投与で投与されうる。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の薬学的組成物を使用した同時投与、及びいずれかの順序での連続投与が含まれ、ここで、双方(又は全ての)活性剤がその生物活性を同時に奏する期間がある。
このような併用療法の例には、化学療法剤、例えばエルロチニブ(Tarceva(登録商標)，Genentech/OSI Pharm.)、ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標),Millennium Pharm.)、フルベストラント(FASLODEX(登録商標),AstraZeneca)、スーテント(SU11248,Pfizer)、レトロゾール(FEMARA(登録商標),Novartis)、イマチニブメシル酸塩(GLEEVEC(登録商標)，Novartis)、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４(Novartis)、オキサリプラチン(Eloxatin(登録商標)，Sanofi)、５-ＦＵ(５-フルオロウラシル)、ロイコボリン、ラパマイシン(Sirolimus,RAPAMUNE(登録商標)，Wyeth)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)，GSK572016,Glaxo Smith Kline)、ロナファーニブ(SCH66336)、ソラフェニブ(BAY43-9006,Bayer Labs)、及びゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)，AstraZeneca)、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１(SU5271；Sugen)、アルキル化剤、例えばチオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミン；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む)；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；デュオカルマイシン(合成類似体、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン(ranimnustine)；抗生物質、例えばエネジン抗生物質、カリケアマイシン、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１；ダイネマイシン(dynemicin)、特にダイネマイシンＡ；ビスホスホナート、例えばクロドロナート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダラルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products,Eugene,OR)；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２',２”-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(特にＴ-２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン)；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ）、ABRAXANEＴＭ Cremophor-free、アルブミン、パクリタキセルのナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois）、及びTAXOTERE(登録商標)ドセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France）；クロラムブシル；GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ-Ｉ１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイド類、例えばレチノイン酸；カペシタビン；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体との組合せが含まれる。
このような併用療法には、(ｉ)腫瘍に対するホルモン作用を調節し又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬(ＳＥＲＭ)、例えばタモキシフェン(例えばNOLVADEX(登録商標)；タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びFARESTON・トレミフィン(toremifine)；(ｉｉ)副腎においてエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター、例えば、４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロール酢酸エステル、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニ(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；(ｉｉｉ)抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；(ｉｖ)アロマターゼインヒビター；(ｖ)プロテインキナーゼ阻害剤、例えばＥＧＦＲ経路のインヒビター(ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４)；(ｖｉ)脂質キナーゼインヒビター；(ｖｉｉ)アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えばＰＫＣ-アルファ、Ｒａｌｆ及びＨ-Ｒａｓのような異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；(ｖｉｉｉ)リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えば、ANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビター；(ｉｘ)ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；(ｘ)抗血管新生剤、例えばベバシズマブ(AVASTIN(登録商標)，Genentech)；及び(ｘｉ)上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の使用説明書に従うか、又は当業者により経験的に決定されるようにして使用することができる。また、このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service, (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdに記載されている。
併用療法は、併せて使用される活性成分が化合物を別個に使用して得られた効果の合計よりも大きい場合に「相乗効果」をもたらし、「相乗的」、つまり効果が達成されることが分かる。相乗効果は、活性成分が、（１）同時処方され、併用された単位投薬製剤として同時に投与又は送達され；（２）別個の製剤として交互に又は平行して送達される場合；又は（３）ある種の他のレジメンによって、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別個にシリンジで、異なった注射によって逐次的に投与され又は送達されるときに達成できる。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効用量が逐次的、つまり連続的に投与される一方、併用療法では二又はそれ以上の活性成分の有効用量が併せて投与される。
製造品
本発明の他の実施態様では、上述の疾患の処置に有用な物質を含む製造品又は「キット」が提供される。製造品は容器と該容器上の又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。パッケージ挿入物は、治療用生成物の市販パッケージに慣習的に含まれる使用説明書を意味し得、このような治療用生成物の使用に関する表示、使用法、用量、投与法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスターパック等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。
一実施態様では、製造品は、容器と、容器に収容される抗ＨＥＲ４抗体、又はその抗体-薬剤コンジュゲートの製剤を含む。製造品は、容器に添付されたラベル、又は容器に収容されるパッケージ挿入物をさらに含むことができ、治療的処置又は腫瘍の診断検出についての、問題の組成物の使用を意味する。製剤が保持された容器は、治療剤の保管及び送達に効果的であり、無菌のアクセスポートを具備し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌等の、選択された状態を治療するのに使用される。あるいは、又は付加的に、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３)の容器をさらに含んでもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含みうる。
材料の寄託
次の材料がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０-２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託されている：
材料 ATCC寄託番号 寄託日
Her-4 1H10.1E5 PTA-9655 2008年12月11日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した実施態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
特定の問題又は状況に対し、本発明の教示の適用は、ここに含まれる教示に鑑み、当業者の能力の範囲内であると理解される。本発明の生成物、それらを単離するための代表的なプロセス、使用法、及び製造法を以下に明らかにするが、本発明を限定するものではない。
本出願に引用される全ての特許及び参考文献は、その全体が、出典明示によりここに明示的に援用される。
実施例１−材料及び方法
抗ＨＥＲ４抗体
特定のオリゴヌクレオチドを、ＨＥＲ４ ＤＮＡ配列に基づき合成した(３０)。全ての細胞ＲＮＡをＭＤＡ-ＭＢ-４５３細胞から抽出し、ＲＴ ＰＣＲにおいて鋳型として使用し、ヒトＨＥＲ４細胞外ドメイン(ＥＣＤ)コード化配列を生じせしめた。
ｇＤＨＥＲ４ ＥＣＤ融合タンパク質を、単純ヘルペスウイルスＩ型糖タンパク質Ｄのアミノ酸１−５２のコード化配列を、ヒトＨＥＲ４のアミノ酸２６−６４０をコードする配列にライゲーションすることにより、構築した。(６１) ｇＤＨＥＲ４ ＥＣＤ ｃＤＮＡをサイトメガロウイルスベースの発現ベクターｐＲＫ５中に挿入した。標準的なリン酸カルシウム沈降プロトコルを使用して、このコンストラクトにヒト胚腎臓２９３細胞を一過性に形質移入した。
ＣＮＢＲセファロース(Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala Sweden)に、抗ｇＤモノクローナル５Ｂ６をカップリングさせることにより、アフィニティーカラムを調製した。ｇＤＨＥＲ４ ＥＣＤ形質移入２９３細胞からの上清を、ｙｍ３０膜(Amicon, Beverly MA)で２０−４０倍に濃縮し、アフィニティー樹脂に充填した。カラムをＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭの酢酸／５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．４）でレセプターを溶出させた。ＨＥＲ４ ＥＣＤをＰＢＳ中にバッファー交換し、濃縮した。タンパク質濃度をＯＤ２８０により測定した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０、１、２及び３週に、それらの足蹠に、ＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳエマルション(RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT)に約５μｇのＨＥＲ４ ＥＣＤが入ったもので免疫化した。免疫化されたマウスをＥＬＩＳＡにより抗体反応について試験した。最も高い力価を有するマウスに、４週間、ＲＩＢＩにさらに５ｕｇのＨＥＲ４ ＥＣＤが入ったものを投与した。３週間後、膝窩及び鼠径部節からのリンパ球を、Oi及び Herzenberg, 1980の手順により、５０％のポリエチレングリコール４０００(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)を使用し、マウス骨髄腫系Ｘ６３-Ａｇ８．６５３と融合させた。融合細胞を、９６-ウェル組織培養プレートにおいて、ウェル当たり２０００００細胞の密度で配し、ＨＡＴ培地サプリメント(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用するハイブリドーマ選択を、融合の１日後に開始した。開始１０日後、ハイブリドーマ上清について、放射性捕捉アッセイを使用し、ＨＥＲ４特異的抗体の存在をスクリーニングした。安定した抗体産生クローンを限界希釈により得、多量の特異的ｍＡｂｓを腹水中に産生させた。抗体をプロテインＡセファロースカラムで精製し(Fermentech, Inc., Edinburgh, Scotland)、ＰＢＳ中に４℃で滅菌して保存した。
組織
正常なヒトの心臓及び肝臓の凍結切片を、電気ショックで死亡した４才の男児から得た。同じ患者からの組織学的に正常な末梢組織とヒト乳癌を表す１７のスナップ凍結された組織試料対が、親切にも、Dr. Manolo M. Morente, Spanish National Tumour Bank Network, Spanish National Cancer Centre (CNIO), Madrid, Spainから提供された。全ての組織試料の使用は、Institutional Review Boardにより承認されており、インフォームドコンセントは、全ての試験被験者から得られた。
細胞培養
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３(３１)を発現するＣＯＳ-７，ＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ形質移入体及びＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ(Invitrogen, Carlsbad, CA)細胞を、１０％のＦＣＳ(Autogen Bioclear UK Ltd., Wiltshire, UK)、及び１％のＬ-グルタミン-ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Sigma-Aldrich)が補填されたＲＰＭＩ中のＤＭＥＭ、及びＴ-４７Ｄ及びＭＣＦ-７細胞に維持した。
プラスミドコンストラクト
発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ｂＣＹＴ-２、ｐｃＤＮＡ３．１ＩＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２-ＨＡ及びｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ｂＣＹＴ-２-ＨＡ（２６、３２）を使用し、ＣＯＳ-７細胞において、カルボキシ末端赤血球凝集素(ＨＡ)エピトープタグを伴うか又は伴わないでＨＥＲ４アイソフォームを一過性に発現させた。キナーゼデッドＨＥＲ４コンストラクトを産生するために、ＨＥＲ４のキナーゼドメイン内の推定ＡＴＰ結合部位を、部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２において変異させ(Ｋ７５１Ｒ)、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２-Ｋ７５１Ｒを得た。ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＥＣＤ ＨＥＲ４外部ドメインコード化配列を、５'-プライマーＴＴＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＧＣ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＣ(配列番号：３)及び３'-プライマーＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＡＡ ＡＧＴ ＧＧＡ ＡＴＧ(配列番号：４)を使用するＰＣＲにより、全長ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-１から誘導した。５'-プライマーは、ＨＥＲ４配列の開始コドンの前にＫｐｎ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列及びリボソーム結合配列を導入した。３'-プライマーは、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａ(２３)の最後の細胞外アミノ酸Ｈｉｓ６４７の後に、ヘキサヒスタジンコード化配列、新しい停止コドン、及びＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ認識配列を導入した。
形質移入
２４-ウェルプレート(４×１０４)又は６-ウェルプレート(１．５×１０５)に播種された細胞に、製造者のプロトコルに従い、ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬(Roche, Mannheim, Germany)を使用し、０．５−１ｕｇの適切なプラスミドを形質移入させた。
ＨＥＲ４の組換え細胞外ドメインの産生
ｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＥＣＤを形質移入したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、１５０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Roche)を含む培地中で選択し、クローニング後、７５ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢの存在下で維持した。培地から可溶性外部ドメインを回収する前に、細胞を、０．５％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。ＨＩＳ-タグ外部ドメインを、段階的なｐＨ勾配にて、固定化された金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK)により、収集した培養培地から精製した。
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
モノクローナル抗ＨＥＲ４抗体のアイソフォーム特異性を研究するするために、ＣＯＳ-７細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ｂＣＹＴ-２、又はｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、一過性に形質移入させた。２４時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解バッファー(１％のトリトンＸ-１００、１０ｍＭのトリス-ＨＣＬ(ｐＨ７．４)、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｕｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｕｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭのフッ化ナトリウム、及び１０ｍＭのリン酸ナトリウム)に溶解させ、遠心分離した。上清を、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)を伴い又は伴わず、試料バッファー中で５分間、沸騰させるか、そうでなければ９５℃で、先に記載したように、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した(２１)。ＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ形質移入体におけるＥｒｂＢ発現を、次の一次抗体：抗ＥＧＦＲ(ｓｃ-０３)、抗ＨＥＲ２(ｓｃ-２８４)、抗ＨＥＲ３(ｓｃ-２８５)(全てSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CAからのもの)、及びｍＡｂ１４７９を使用し、非還元条件下でウエスタンブロットにより分析した。
乳房組織中のＨＥＲ４タンパク質のウエスタン分析では、凍結した組織ブロックの８０ｕｍ切片を切断し、ホモジナイズし、振揺器において４℃で一晩、溶解用バッファーに溶解させた。５０ｕｇの全タンパク質に等価なライセートのアリコートを、非還元条件下、ウエスタンブロットにより分析した。ＨＥＲ４リン酸化に対するｍＡｂ１４７９の効果を研究するために、ＭＣＦ-７及びＴ-４７Ｄ細胞を、血漿を含有しないＲＰＭＩ中で一晩欠乏させ、１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９を伴うか又は伴わずに１時間処理し、３０分後、５０ｎｇ／ｍｌのニューレグリン-１(ＮＲＧ-１；R&D, Minneapolis, MN)で刺激した。１ｍｇの全タンパク質に等価な細胞ライセートを、抗ＨＥＲ４抗体(ＨＦＲ-１)で免疫沈降させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで分離させ、抗ホスホチロシン抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した(４Ｇ１０；Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)。
ＨＥＲ４のユビキチン化を研究するために、ＣＯＳ-７細胞を、Ｆｌａｇタグ化ユビキチンと共に、全長ＪＭ-ａ ＣＹＴ-１又はＪＭ-ａ ＣＹＴ-２をコードするプラスミドを用いて、一過性に形質移入させ(Katz等 2002)、過去に記載されたようにして、ＨＥＲ４免疫沈降と続く抗Ｆｌａｇウエスタンブロットにより分析した(３２)。細胞は分析前に２ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９を用いて又は用いないで１時間処理した。
免疫蛍光染色
ＣＯＳ-７細胞をカバースリップ上で増殖させ、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２-ＨＡ、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ｂＣＹＴ-２-ＨＡ、又はｐｃＤＮＡ３．１ベクターコントロールを形質移入させた。形質移入の２４時間後、細胞をメタノールで固定し、１：１００の希釈度で、抗ＨＥＲ４(ＨＦＲ-１；Neomarkers, Fremont, CA)又は抗ＨＡ(Roche)で染色し、続いて１：２５０の希釈度で、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス又はAlexa Fluor 568ヤギ抗ラット(双方ともMolecular Probes, Leiden, The Netherlandsからのもの)と共にインキュベートした。カバースリップにVectashieldマウント培地(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)をマウントした。全ての画像はOlympus BX60 (Olympus, Hamburg, Germany)蛍光顕微鏡で得た。
免疫組織化学
凍結切片(５ｕＭ)を、２０ｕｇ／ｍｌの一次抗体ｍＡｂ１４７９、抗ＨＥＲ４(ＨＦＲ−１)、抗ＣＤ４４(Ｈｅｒｍｅｓ-３；Dr. Sirpa Jalkanen, University of Turku, Turku, Finlandから提供を受ける)、又はチキンＴ-細胞抗原を認識する抗体(３ｇ６；Dr. Sirpa Jalkanenから提供を受ける)、及び二次抗体 Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス(１：２００)又はＨＲＰ-コンジュゲートヤギ抗マウス(１：１００；Santa Cruz Biotechnology)を使用して染色した。ペルオキシダーゼ染色では、切片を、製造者の使用説明書に従い、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質で処理し(Vector Laboratories)た後、ヘマトキシリンで染色した。免疫蛍光染色では、切片を２５ｍｇ／ｍｌの１,４-ジアザビシクロ[２.２.２.]オクタン］(Sigma-Aldrich)で処理し、光脱色を防止した。全てのスライドにmowiol (Calbiochem)をマウントし、Olympus BX60蛍光顕微鏡により可視化させた。
インビトロ結合アッセイ
組換えＨＩＳ-タグ化ＨＥＲ４外部ドメイン(２ｕｇ)を、０．５ｕｇのｍＡｂ１４７９又は３ｇ６と共に又はそれを伴わずにインキュベートした。外部ドメインと他のタンパク質との間の複合体形成を、非還元条件下で、抗ペンタＨＩＳ抗体(Molecular Probes)を用いたウエスタンブロットにより可視化した。
ＨＥＲ４切断の分析
ＨＥＲ４切断に対するｍＡｂ１４７９の効果を研究するために、Ｔ-４７Ｄ細胞を血漿なしに２時間欠乏させ、１μｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９で１時間処理し、１００ｎｇ／ｍｌのホルボール１３-ミリステート-１２-アセテート(ＰＭＡ；Sigma-Aldrich)(２３，３３)で切断を刺激した。
培養培地中へのＨＥＲ４外部ドメインの基底の脱落に対するｍＡｂ１４７９の効果を研究するために、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２を一過性に発現するＣＯＳ-７を、１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９又は１４７５を用いて又は用いずに、２４時間処理した。外部ドメイン脱落を、抗ＨＥＲ４抗体 ｍＡｂ １４６４を用いたウエスタンブロットにより、細胞培養皿から直接収集された６０ｕｌの培地試料から分析した。
ＨＥＲ４内部移行
ＣＯＳ-７細胞をカバースリップ上で増殖させ、ｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２、又はキナーゼデッドｐｃＤＮＡ３．１ＨＥＲ４ＪＭ-ａＣＹＴ-２Ｋ７５１Ｒ (３２)及びＲａｂ５ａ-ＧＦＰ(３４)を形質移入させた。形質移入から２４時間後、細胞を５分又は２時間、１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９で処理した。細胞をメタノールで固定し、Alexa Fluor 568ヤギ抗マウスで染色した。カバースリップにVectashieldマウント培地をマウントした。画像はLSM 510 Meta 共焦点顕微鏡(Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)で得た。
ＭＴＳ増殖アッセイ
Ｔ-４７Ｄ及びＭＣＦ-７細胞を一晩欠乏させ、５％のチャコールストリップＦＣＳ、及び１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９又は１０ｕｇ／ｍｌの２Ｃ４(Genentech Inc., South San Francisco, CA)を含むＲＰＭＩにおいて９６-ウェルプレートに播種した(１．５×１０４／ウェル)。生存細胞数を、製造者の使用説明書に従い、CellTiter 96(登録商標)非放射性細胞増殖アッセイ(Promega, Madison, WI)を用い、示された時点で推定した。
足場非依存性増殖アッセイ
２ｍｌのＲＰＭＩ、０．５％のBacto寒天、及び１０％のＦＣＳからなる底層を、６-ウェルプレートに塗布した。底層を固化させた後、１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９を有するか又は有さない、１．２ｍｌのＲＰＭＩ、０．３３％のBacto寒天、及び１０％のＦＣＳ中に３００００細胞／ウェルからなる上層を、頂部に塗布した。全試料を３組調製した。細胞を１４日間、３７℃でインキュベートした。８細胞より大きなコロニーを、顕微鏡下で計数した。
統計的分析
ＭＴＳ及び軟寒天アッセイの異なる時点での統計的分析のために、スチューデントｔ検定を使用した。分析は、５つの独立したＭＴＳ、及び３つの独立した軟寒天実験を含めた。腫瘍対正常組織における全長ＨＥＲ４及びＨＥＲ４外部ドメインの量を、ウィルコクソン符号順位検定を用い、マッチした腫瘍／正常組織対を使用して比較した。
実施例２−ｍＡｂ１４７９はＨＥＲ４のタンパク質分解的切断性ＪＭ-ａアイソフォームを選択的に認識する。
ＨＥＲ４の外部ドメインに対して抗体を分泌する２９のハイブリドーマクローンを、ＨＥＲ４アイソフォームの選択的認識についてスクリーニングした(図２)。モノクローナル抗体のアイソタイピングを、製造者の使用説明書に従い、Zymed (Zymed, So. San Francisco, CA)製のMouse MonoAb ID/SPアイソタイピングキットを使用して実施した。エピトープマッピングをクロスブロッキングＥＬＩＳＡにより実施した。ＨＥＲ４ ｍＡｂｓを、無関係なｍＡｂコントロールと比較して、５０％又はそれ以上他のものとの結合をブロックする能力に基づき、エピトープにグループ分けした。ＨＥＲ４ ｍＡｂｓの特異性を、１μｇ／ｍｌの濃度で、ＥＬＩＳＡプレートでコーティングされたＨＥＲ２(ａａ１−６４５)、ＨＥＲ３(ａａ１−６１７)及びＨＥＲ４(ａａ１−６４０)細胞外ドメイン(Genentech, Inc.)に結合するビオチン化ＨＥＲ４ｍＡｂｓの能力を試験することにより、ＥＬＩＳＡで決定した。
オルタナティブ細胞外膜近傍ドメイン(ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２又はＪＭ-ｂ ＣＹＴ-２)を含むＨＥＲ４アイソフォームを一過性に発現するＣＯＳ-７細胞を分析した。種々の度合いのタンパク質変性を表す３つの条件においてウエスタン分析を実施した(図３)。ＳＤＳ-ＰＡＧＥの前に、図３の１−３レーンの試料を、室温にて、ＤＴＴを含有しない試料用バッファーに溶解させ(非還元)、４−６レーンの試料をＤＴＴを含有しないが、９５℃で５分加熱された試料用バッファーに溶解させ(非還元、９５℃)；７−９レーンの試料を、ＤＴＴを含有し、９５℃で５分加熱された試料用バッファーに溶解させた(還元)。ＨＥＲ４のカルボキシ末端(ｓｃ-２８３及びＨＦＲ-１)又はＨＡ-タグ(抗ＨＡ)に対する抗体を使用し、形質移入効率をコントロールした。
抗体の一つ、ｍＡｂ１４７９は、ウエスタンブロットにおいて、一次抗体として使用される場合、ＪＭ-ａアイソフォームを認識したが、ＪＭ-ｂアイソフォームは認識しなかった(図３)。ＨＥＲ４特異的シグナルは、試料を分析前に沸騰させた場合は低減し、試料を沸騰させ、ＤＴＴを用いた還元条件を施した場合は、完全に消滅した。これは、ｍＡｂ１４７９抗体が天然の立体配置を認識するのみであることを示している。非還元条件下では、ＨＥＲ４は、cＤＮＡから推定される１４４ｋＤの予想サイズに近い(３０)、１５０ｋＤのバンドとして現れ、還元条件下では、１８０ｋＤのバンドとして現れた(図３、底部パネル、レーン１対７を比較せよ)。ＪＭ-ａアイソフォームに対するｍＡｂ１４７９の特異性を、ＨＡ-タグ化ＨＥＲ４アイソフォームを一過性に発現するＣＯＳ-７細胞の免疫蛍光染色により確認した。ｍＡｂ１４７９は、ＪＭ-ａ-形質転換体の表面でのみ、エピトープを再度認識した。
ＥｒｂＢレセプターファミリーメンバーが相同であるので、ｍＡｂ１４７９の他のＥｒｂＢレセプターとの交差反応性を、種々のＥｒｂＢレセプターを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３-７ｄ及びＮＲ６形質転換体を使用するウエスタンブロットにより、評価した(３１)。ｍＡｂ１４７９は、ＨＥＲ４(ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２)に対して、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞からのウエスタン分析においてかすかなバンドを有する強いシグナルを与えた(図４)。図４において、種々のＥｒｂＢレセプターを発現する親(レーン２)又は形質移入した(レーン１及び３)ＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ及びＮＲ６(レーン４)細胞を、一次抗体として抗ＥＧＦＲ(ｓｃ-０３)、抗ＨＥＲ２(ｓｃ-２８４)、抗ＨＥＲ３(ｓｃ-２８５)又はｍＡｂ１４７９を使用するウエスタンブロットにより、分析した。親ＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ及びＮＲ６細胞は内在性ＨＥＲ２を発現し、これが、抗ＨＥＲ２で全ての分析した形質転換体において検出した。
細胞ベースの酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用し、ｍＡｂ１４７９の交差反応をさらにアッセイした。試験された最も低い抗体濃度(１：１０００ １．２５ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９；０．２ｕｇ／ｍｌのｓｃ-２８３)でさえ、ｍＡｂ１４７９、並びにポジティブコントロール抗ＨＥＲ４抗体(ｓｃ-２８３)は、ＨＥＲ４(ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２)を発現するＮＲ６形質転換体に明確に結合した(図５)。しかしながら、試験された最も高濃度(１：１００、１２．５ｕｇ／ｍｌ)でさえ、ｍＡｂ１４７９の結合は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、又はＨＥＲ３、又はＨＥＲ４のＪＭ-ｂ ＣＹＴ-１アイソフォームを発現するＮＩＨ ３Ｔ３-７ｄ細胞に対しては観察されなかったが、コントロール抗体抗ＥＧＦＲ(ｓｃ-０３)、抗ＨＥＲ２(ｓｃ-２８４)、抗ＨＥＲ３(ｓｃ-２８５)、及び抗ＨＥＲ４(ｓｃ-２８３)は、結合が実証された(１：１００、２ｕｇ／ｍｌ)(図５)。これらのデータは、ｍＡｂ１４７９がＨＥＲ４のＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的であることを示している。
実施例３−ｍＡｂ１４７９はＨＥＲ４の脱落した外部ドメインを認識する。
ｍＡｂ１４７９が、インビボでのＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの発現を選択的に分析するために使用可能であるかどうかに対処するために、ヒト腎臓及び心臓の凍結切片を免疫蛍光染色により評価した。ＪＭ-ａ(腎臓)又はＪＭ-ｂ(心臓)アイソフォーム(２３)のいずれかを専ら発現することが示されているので、これらの２つの組織型を選択した。実施例２で検討したインビトロでの特異性に基づいて予想されるように、ｍＡｂ１４７９は、腎臓を特異的に染色したが、心臓組織はしなかった。ＨＥＲ４のカルボキシ末端に対するポジティブコントロール抗体(ＨＦＲ-１)は双方の組織を染色し、ニワトリＴ細胞タンパク質に対するネガティブコントロール抗体(３ｇ６)を使用した場合は、免疫染色は観察されなかった。膜アンカーＣＤ４４タンパク質に対する抗体を使用し、細胞膜コンパートメントを可視化した。ｍＡｂ１４７９について観察された染色パターンは、ＨＦＲ-１について観察されたものとは異なっていた。これは、それらが認識する種々のエピトープにより説明できるが、糸球体細胞の核内でのＨＥＲ４ ＩＣＤの局在化によって示唆されるように、ＨＥＲ４分子が切断され、その外部ドメインが腎臓組織中に脱落するという事実のためである可能性が高い。また、インビボでの腎臓組織中におけるＨＥＲ４切断に支持されて、腎臓組織可溶化物のウエスタン分析により、ｍＡｂ１４７９が２つの主なバンドを認識したことが示された(図６)。一つは、非還元条件下で全長ＥｒｂＢのサイズに相当する１５０ｋＤで移動し(図６のレーン１対図３のレーン１を比較せよ)、他方は、組換えＨＥＲ４外部ドメインのサイズに対応する１００ｋＤでより顕著なものである(図６のレーン１対２)。約２００ｋＤａで移動する第３のバンドは、組換え外部ドメインでのレーン中の弱いバンドにサイズが類似しており、外部ドメイン二量体を表す。
ｍＡｂ１４７９がＨＥＲ４の可溶性外部ドメインを認識することができることを、より直接的に証明するために、組換えＨＥＲ４外部ドメインとｍＡｂ１４７９を用い、インビトロ結合アッセイを実施した。外部ドメインと抗体を一緒にインキュベートした場合、それらは２５０ｋＤａの複合体を形成し、これをウエスタン分析で検出した(図７)。このアッセイでは、ＨＩＳ-タグ化-ＨＥＲ４外部ドメイン(２ｇ)を、０．５ｕｇのｍＡｂ１４７９又はネガティブコントロール抗体３ｇ６と共に１５分間インキュベートし、タンパク質複合体の形成を、抗ＨＩＳ抗体を使用する非還元条件下で、ウエスタン分析により可視化した。図７において、遊離の外部ドメインが１００ｋＤａのサイズで、遊離の抗体が１５０ｋＤａで、及び外部ドメインが抗体に結合することにより形成された複合体が２５０ｋＤａで移動していることが分かる。
また、ニューレグリン-１は単独で、組換えＨＥＲ４外部ドメインに結合することが証明されており、実験に使用された組換え外部ドメインが機能的であったことが確認された。さらに、マイクロウェル-プレート-固定化ＨＩＳ-タグ化ＨＥＲ４外部ドメイン(１００ｎｇ)を用いたＥＬＩＳＡにより、ｍＡｂ１４７９(０．１９５から１００ｎＭの範囲の濃度)との相互作用に対して０．８５ｎＭ＋／−０．０７７のＫｄ値が得られた(図８)。これらの観察により、ｍＡｂ１４７９が比較的高い親和性でＨＥＲ４外部ドメインに結合することが証明された。
実施例４−ＨＥＲ４外部ドメイン脱落はインビボにおいて乳癌により亢進される。
切断型ＪＭ-ａアイソフォーム、並びにＨＥＲ４を切断可能なＴＡＣＥ酵素は、インビボで乳癌組織中において過剰発現され(２９)、カルボキシ末端ＨＥＲ４エピトープは、組織化学的に正常な乳腺上皮よりも乳癌組織において、より頻繁に核に局在化している(３５)。さらに、ＨＥＲ４免疫反応性の核局在化は、細胞表面免疫反応性と比較した場合、好ましくない生存率に関連している(２９)。これらの知見は、ＨＥＲ４切断及び外部ドメイン脱落が、正常な乳房組織と比較して、乳癌において亢進され、切断が生物学的に重要であることを意味している。組織学的に正常な乳房組織の乳癌への形質転換が、ＨＥＲ４外部ドメインの脱落の亢進に関連しているかどうかを試験するために、１７のマッチした正常な乳房／乳癌の組織対を、ｍＡｂ１４７９を用いてウエスタンブロットにより分析した(図９)。試料対は、癌組織及び組織学的に正常な隣接する組織の双方が入手できた乳癌患者からの凍結組織材料から構成された。非還元条件下で生成されたウエスタンデータは、全長ＨＥＲ４を表す１５０ｋＤのシグナルと、可溶性外部ドメインを表す１００ｋＤのシグナルの強度についてのスコア化した。腫瘍試料の１７のうち９(５３％)が、適合した正常組織対と比較した場合に、全ＨＥＲ４発現が増加していたことが示された。唯一の腫瘍試料(１／１７；６％)は、検出可能なＨＥＲ４がない正常な乳房組織の６つの試料(６／１７；３５％)と反対に、比較される検出可能なＨＥＲ４発現がなかった。また、癌対正常組織における亢進されたＨＥＲ４タンパク質レベルの同様の知見が、同じ試料対を使用するｍＡｂ１４７９での免疫組織化学によっても得られた。
興味深いことに、ＨＥＲ４外部ドメインに対する信号は、ＨＥＲ４ポジティブ腫瘍試料の１２(１２／１６；７５％)で観察されたが、２つのＨＥＲ４ポジティブの正常な乳房組織試料(２／１１；１８％)においてのみであった。１５０ｋＤの全長レセプター及び１００ｋＤの外部ドメインに対するウエスタンシグナルを濃度測定により定量した場合、腫瘍組織は、正常組織と比較して、有意に多くのＨＥＲ４外部ドメインを発現していた(Ｐ＝０．０１５)(図１０)。しかしながら、全長ＨＥＲ４の発現における差は、統計的有意には達しなかった(Ｐ＝０．３３)。また、検出された１００ｋＤの外部ドメインの量は、同じ試料において、ＨＥＲ４の全量(１００ｋＤ＋１５０ｋＤ)と相関しなかった(Ｐ＝０．１５)。これらのデータは、癌組織における外部ドメインの量のアップレギュレーションが、作製されるより多くのタンパク質の単純な結果ではないことを示唆している。さらに、正常及び癌組織において類似した全長ＨＥＲ４レベルを示す２人の患者(患者＃１及び＃３)において、双方が、腫瘍試料においてのみ可溶性外部ドメインの存在を示した。総合すれば、これらのデータは、ＨＥＲ４外部ドメインの脱落が、乳癌進行中に亢進され、ｍＡｂ１４７９を使用して、ヒト腫瘍組織により脱落させられたＨＥＲ４外部ドメインを検出することができることを示している。
実施例５−ｍＡｂ１４７９はＨＥＲ４のリン酸化及び切断を抑制する
ＨＥＲ４機能に結合するｍＡｂ１４７９の結果を分析するために、ＨＥＲ４リン酸化を、自然にＪＭ-ａアイソフォームを発現するＭＣＦ-７乳癌細胞において測定した(２６)。ＭＣＦ-７細胞を、０、１、又は１０ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９細胞を用い、１、２、又は３時間刺激し、その後５０ｎｇ／ｍｌのニューレグリン-１(ＮＲＧ-１)で１５分刺激し、ＨＥＲ４のｐＴｙｒ１２８４に対するホスホ-特異性抗体を使用して、ＨＥＲ４チロシンリン酸化について分析した。抗ＨＥＲ４(Abcam)及び抗アクチンを用いて、膜を再ブロットした。ｍＡｂ１４７９は、ＮＲＧ-１により刺激される、ＨＥＲ４のリン酸化を有意に抑制した(図１１Ａ)。
また、ＨＥＲ４の活性化により、ＨＥＲ４切断が調節され(３６)、基底、及びボルボール １３-ミリスタート １２-アセタート(ＰＭＡ)-刺激性ＨＥＲ４切断の双方における、ｍＡｂの効果を評価した。ＨＥＲ４ ＪＭ-ａ ＣＹＴ-２を発現するＣＯＳ-７形質移入体の培養培地への、１００ｋＤａのＨＥＲ４外部ドメインの脱落は、１ｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９又はコントロール抗体ｍＡｂ １４７５を用いて、２４時間細胞を刺激させた後、抗ＨＥＲ４抗体を用いたウエスタンブロットにより分析される。同じ実験からの全細胞溶解物を、抗ＨＥＲ４(Abcam)及び抗アクチンを用いたウエスタンブロットにより分析した(図１１Ｂ)。
ｍＡｂ１４７９を用いた処理により、未処理の細胞、又は種々のＨＥＲ４エピトープを認識するｍＡｂ１４７５で処理された細胞と比較して、ＣＯＳ-７形質移入体の培地に脱落した可溶性で１１０ｋＤａのＨＥＲ４外部ドメインの量がかなり低減した(図１１Ｂ)。これらのデータは、ｍＡｂ１４７９が、チロシンのリン酸化と、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの切断をブロックすることが示されている。
実施例６−ｍＡｂ１４７９はＨＥＲ４に依存するがＨＥＲ４キナーゼ活性とは独立の機序によって効果的に内部移行する
抗ＨＥＲ２抗体による腫瘍増殖の阻害は、エンドサイトーシスを誘発するｍＡｂの内因的能力に関連していることが示されている(３７)。ｍＡｂ１４７９は、ＨＥＲ４を発現する細胞の培養培地から迅速に枯渇することが観察されているが、ベクターコントロール細胞の培地からはそうではない。これが、ｍＡｂのＨＥＲ４媒介性内部移行によるものであったかどうかに取り組むために、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａを一過性に発現するＣＯＳ-７細胞をｍＡｂ１４７９で処理し、共焦点顕微鏡で分析し、抗体の小細胞局在化を可視化させた。インキュベーションの５分後、ｍＡｂ１４７９は主として細胞表面で検出された。しかしながら、２時間の間に、抗体はサイトゾルに内部移行し、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)-タグ化Ｒａｂ５、細胞内小胞体のマーカーと共に部分的に同時局在化した。ＪＭ-ｂアイソフォームを発現する細胞において、ｍＡｂ１４７９の細胞質局在化は観察されなかった。ＨＥＲ４発現に依存性であるが、キナーゼデッドＨＥＲ４ ＪＭ-ａコンストラクト(Ｋ７５１Ｒ)を一過性に発現するＣＯＳ-７細胞を分析した場合、ｍＡｂ１４７９が効果的に内部移行したので、ｍＡｂ１４７９の内部移行はＨＥＲ４キナーゼ活性を必要としなかった。
また、ｍＡｂ１４７９はＨＥＲ４の切断型ＪＭ-ａアイソフォームのユビキチン化を高め、ｍＡｂ１４７９が、図１２に示すように、分解性小胞中へのＥｒＢ４エンドサイトーシスを活発に刺激する場合があることが示された。図１２のアッセイを、Ｆｌａｇ-タグ化ユビキチンと共に、ＪＭ-ａ ＣＹＴ-１又はＪＭ-ａ ＣＹＴ-２を一過性に発現するＣＯＳ-７細胞を使用して実施した。２ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９を用い、０、１０、３０、又は１２０分間細胞を処理し、ＨＦＲ-１を用いた抗ＨＥＲ４免疫沈降により、ＨＥＲ４ユビキチン化について分析し、続いて、抗Ｆｌａｇ抗体を用いてウエスタンブロットした。ＨＥＲ４タンパク質の充填を、抗ＨＥＲ４(Abcam)抗体を用いた再ブロットにより制御した。
セツキシマブは、ＥＧＦＲのダウンレギュレーションを容易にすることにより、腫瘍増殖を抑制することが示唆されている(３８)。ＨＥＲ４を発現する細胞中へのｍＡｂ１４７９の効果的な内部移行が、ＨＥＲ４ダウンレギュレーションの刺激に関連しているかどうかに取り組むために、内在性ＨＥＲ４を中程度のレベルで発現しているＭＣＦ-７細胞を、１μｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９の存在下、７２時間まで培養し、全長ＨＥＲ４の全レベルをウエスタンブロットにより分析した(図１３)。定常状態のＨＥＲ４タンパク質の発現レベルを、抗ＨＥＲ４(Abcam)抗体を用いたウエスタンブロットにより分析し、充填を抗アクチンを用いてコントロールした。ｍＡｂ１４７９は用いた処理により、ＨＥＲ４の定常状態のレベルが有意に低減したるが、コントロール抗体３ｇ６(１ｕｇ／ｍｌ)ではそうではなかった。効果は、２時間の時点で既に見られ、実験の７２時間の期間、持続した。
実施例７−ｍＡｂ１４７９は乳癌細胞の増殖及びコロニー形成を抑制する
乳癌細胞の増殖に対するｍＡｂ１４７９の効果を研究するために、生存細胞の量を測定するＭＴＳアッセイを、ヒト乳癌細胞株を用いて実施した。ｍＡｂ１４７９は、Ｔ-４７Ｄ(Ｐ＝０．００１４)及びＭＣＦ-７(Ｐ＝０．０４７)細胞の増殖を有意に抑制した(図１４)。このアッセイにおいて、示された時間の間、細胞株を、１ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ１４７９、又はポジティブコントロール抗体２Ｃ４(Genentech)で処理した。生存細胞の数をＭＴＳ分析により推定した。抗体は、７日の時点での生存細胞数を有意に低減させた(＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定、５組の独立した実験を３回実施した)。ｍＡｂ１４７９で見られる効果は、他のＨＥＲレセプターとのＨＥＲ２ヘテロ二量体化をブロックする、抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４(Genentech)と比較した場合、同様か又はそれ以上であった(３９)。
ｍＡｂ１４７９は、軟寒天コロニー形成アッセイにおいて、Ｔ-４７Ｄ(Ｐ＜０．００１)及びＭＣＦ-７(Ｐ＝０．０４３)の双方の足場非依存性増殖を有意に抑制した(図１５)。１４日の時点で、×２０視野当たり８細胞のサイズを超えるコロニーを、３回実施した実験当たり１０顕微鏡視野から算出した。ｍＡｂ１４７９処置は、コントロール抗体３ｇ６と比較した場合、１４日の時点で、コロニーの数を有意に低減させた(＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定、３つの独立した実験を３回実施した）。平均及び標準偏差を図１５に示す。
文献
１．Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2(2):127-37。
２．Hynes NE, Lane HA. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer 2005;5(5):341-54。
３．Mendelsohn J, Baselga J. The EGF receptor family as targets for cancer therapy. Oncogene 2000;19(56):6550-65。
４．Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785):177-82。
５．Graham J, Muhsin M, Kirkpatrick P. Cetuximab. Nat Rev Drug Discov 2004;3(7):549-50。
６．Sarup JC, Johnson RM, King KL, et al. Characterization of an anti-p185HER2 monoclonal antibody that stimulates receptor function and inhibits tumor cell growth. Growth Regul 1991;1(2):72-82。
７．Austin CD, De Maziere AM, Pisacane PI等 Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Mol Biol Cell 2004;15(12):5268-82。
８．Molina MA, Codony-Servat J, Albanell J, Rojo F, Arribas J, Baselga J. Trastuzumab (herceptin), a humanized anti-Her2 receptor monoclonal antibody, inhibits basal and activated Her2 ectodomain cleavage in breast cancer cells. Cancer Res 2001;61(12):4744-9。
９．Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med 2000;6(4):443-6。
１０．Srinivasan R, Poulsom R, Hurst HC, Gullick WJ. Expression of the c-erbB-4/HER4 protein and mRNA in normal human fetal and adult tissues and in a survey of nine solid tumour types. J Pathol 1998;185(3):236-45。
１１．Witton CJ, Reeves JR, Going JJ, Cooke TG, Bartlett JM. Expression of the HER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer. J Pathol 2003;200(3):290-7。
１２．Haugen DR, Akslen LA, Varhaug JE, Lillehaug JR. Expression of c-erbB-3 and c-erbB-4 proteins in papillary thyroid carcinomas. Cancer Res 1996;56(6):1184-8。
１３．Furger C, Fiddes RJ, Quinn DI, Bova RJ, Daly RJ, Sutherland RL. Granulosa cell tumors express HER4 and are sensitive to the cytotoxic action of heregulin-beta2/PE40. Cancer Res 1998;58(9):1773-8。
１４．Srinivasan R, Benton E, McCormick F, Thomas H, Gullick WJ. Expression of the c-erbB-3/HER-3 and c-erbB-4/HER-4 growth factor receptors and their ligands, neuregulin-1 alpha, neuregulin-1 beta, and betacellulin, in normal endometrium and endometrial cancer. Clin Cancer Res 1999;5(10):2877-83。
１５．Gilbertson RJ, Perry RH, Kelly PJ, Pearson AD, Lunec J. Prognostic significance of HER2 and HER4 coexpression in childhood medulloblastoma. Cancer Res 1997;57(15):3272-80。
１６．Gilbertson RJ, Bentley L, Hernan R, et al. ERBB receptor signaling promotes ependymoma cell proliferation and represents a potential novel therapeutic target for this disease. Clin Cancer Res 2002;8(10):3054-64。
１７．Gullick WJ. c-erbB-4/HER4: friend or foe? J Pathol 2003;200(3):279-81。
１８．Junttila TT, Sundvall M, Maatta JA, Elenius K. ErbB4 and its isoforms: selective regulation of growth factor responses by naturally occurring receptor variants. Trends Cardiovasc Med 2000;10(7):304-10。
１９．Junttila TT, Laato M, Vahlberg T, et al. Identification of patients with transitional cell carcinoma of the bladder overexpressing ErbB2, ErbB3, or specific ErbB4 isoforms: real-time reverse transcription-PCR analysis in estimation of ErbB receptor status from cancer patients. Clin Cancer Res 2003;9(14):5346-57。
２０．Elenius K, Choi CJ, Paul S, Santiestevan E, Nishi E, Klagsbrun M. Characterization of a naturally occurring ErbB4 isoform that does not bind or activate phosphatidyl inositol 3-kinase. Oncogene 1999;18(16):2607-15。
２１．Kainulainen V, Sundvall M, Maatta JA, Santiestevan E, Klagsbrun M, Elenius K. A natural ErbB4 isoform that does not activate phosphoinositide 3-kinase mediates proliferation but not survival or chemotaxis. J Biol Chem 2000;275(12):8641-9。
２２．Rio C, Buxbaum JD, Peschon JJ, Corfas G. Tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme is required for cleavage of erbB4/HER4. J Biol Chem 2000;275(14):10379-87。
２３．Elenius K, Corfas G, Paul S, et al. A novel juxtamembrane domain isoform of HER4/ErbB4. Isoform-specific tissue distribution and differential processing in response to phorbol ester. J Biol Chem 1997;272(42):26761-8。
２４．Lee HJ, Jung KM, Huang YZ, et al. Presenilin-dependent gamma-secretase-like intramembrane cleavage of ErbB4. J Biol Chem 2002;277(8):6318-23。
２５． Komuro A, Nagai M, Navin NE, Sudol M. WW domain-containing protein YAP associates with ErbB-4 and acts as a co-transcriptional activator for the carboxyl-terminal fragment of ErbB-4 that translocates to the nucleus. J Biol Chem 2003;278(35):33334-41。
２６．Maatta JA, Sundvall M, Junttila TT, et al. Proteolytic cleavage and phosphorylation of a tumor-associated ErbB4 isoform promote ligand-independent survival and cancer cell growth. Mol Biol Cell 2006;17(1):67-79。
２７．Ni CY, Murphy MP, Golde TE, Carpenter G. gamma -Secretase cleavage and nuclear localization of ErbB-4 receptor tyrosine kinase. Science 2001;294(5549):2179-81。
２８．Schlessinger J, Lemmon MA. Nuclear signaling by receptor tyrosine kinases: the first robin of spring. Cell 2006;127(1):45-8。
２９．Junttila TT, Sundvall M, Lundin M等 Cleavable ErbB4 isoform in estrogen receptor-regulated growth of breast cancer cells. Cancer Res 2005;65(4):1384-93。
３０．Plowman GD, Culouscou JM, Whitney GS等 Ligand-specific activation of HER4/p180HER4, a fourth member of the epidermal growth factor receptor family. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90(5):1746-50。
３１．Zhang K, Sun J, Liu N, et al. Transformation of NIH 3T3 cells by HER3 or HER4 receptors requires the presence of HER1 or HER2. J Biol Chem 1996;271(7):3884-90。
３２．Sundvall M, Peri L, Maatta JA, et al. Differential nuclear localization and kinase activity of alternative ErbB4 intracellular domains. Oncogene 2007。
３３．Vecchi M, Baulida J, Carpenter G. Selective cleavage of the heregulin receptor ErbB-4 by protein kinase C activation. J Biol Chem 1996;271(31):18989-95。
３４．Gomes AQ, Ali BR, Ramalho JS, et al. Membrane targeting of Rab GTPases is influenced by the prenylation motif. Mol Biol Cell 2003;14(5):1882-99。
３５．Srinivasan R, Gillett CE, Barnes DM, Gullick WJ. Nuclear expression of the c-erbB-4/HER-4 growth factor receptor in invasive breast cancers. Cancer Res 2000;60(6):1483-7。
３６．Cheng QC, Tikhomirov O, Zhou W, Carpenter G. Ectodomain cleavage of ErbB-4: characterization of the cleavage site and m80 fragment. J Biol Chem 2003;278(40):38421-7。
３７．Hurwitz E, Stancovski I, Sela M, Yarden Y. Suppression and promotion of tumor growth by monoclonal antibodies to ErbB-2 differentially correlate with cellular uptake. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92(8):3353-7。
３８．Sunada H, Magun BE, Mendelsohn J, MacLeod CL. Monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor is internalized without stimulating receptor phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A 1986;83(11):3825-9。
３９．Franklin MC, Carey KD, Vajdos FF, Leahy DJ, de Vos AM, Sliwkowski MX. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex. Cancer Cell 2004;5(4):317-28。
４０．Barnes NL, Khavari S, Boland GP, Cramer A, Knox WF, Bundred NJ. Absence of HER4 expression predicts recurrence of ductal carcinoma in situ of the breast. Clin Cancer Res 2005;11(6):2163-8。
４１．Suo Z, Risberg B, Kalsson MG等 EGFR family expression in breast carcinomas. c-erbB-2 and c-erbB-4 receptors have different effects on survival. J Pathol 2002;196(1):17-25。
４２．Bieche I, Onody P, Tozlu S, Driouch K, Vidaud M, Lidereau R. Prognostic value of ERBB family mRNA expression in breast carcinomas. Int J Cancer 2003;106(5):758-65。
４３．Lodge AJ, Anderson JJ, Gullick WJ, Haugk B, Leonard RC, Angus B. Type 1 growth factor receptor expression in node positive breast cancer: adverse prognostic significance of c-erbB-4. J Clin Pathol 2003;56(4):300-4。
４４．Muraoka-Cook RS, Sandahl M, Husted C等 The intracellular domain of ErbB4 induces differentiation of mammary epithelial cells. Mol Biol Cell 2006;17(9):4118-29。
４５．Stern DF. ErbBs in mammary development. Exp Cell Res 2003;284(1):89-98。
４６．Tang CK, Concepcion XZ, Milan M, Gong X, Montgomery E, Lippman ME. Ribozyme-mediated down-regulation of ErbB-4 in estrogen receptor-positive breast cancer cells inhibits proliferation both in vitro and in vivo. Cancer Res 1999;59(20):5315-22。
４７．Zhu Y, Sullivan LL, Nair SS等 Coregulation of Estrogen Receptor by ErbB4/HER4 Establishes a Growth-Promoting Autocrine Signal in Breast Tumor Cells. Cancer Res 2006;66(16):7991-8。
４８．Prewett M, Rothman M, Waksal H, Feldman M, Bander NH, Hicklin DJ. Mouse-human chimeric anti-epidermal growth factor receptor antibody C225 inhibits the growth of human renal cell carcinoma xenografts in nude mice. Clin Cancer Res 1998;4(12):2957-66。
４９．Agus DB, Akita RW, Fox WD等 Targeting ligand-activated ErbB2 signaling inhibits breast and prostate tumor growth. Cancer Cell 2002;2(2):127-37。
５０．Cho HS, Mason K, Ramyar KX, et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature 2003;421(6924):756-60。
５１．Baulida J, Kraus MH, Alimandi M, Di Fiore PP, Carpenter G. All ErbB receptors other than the epidermal growth factor receptor are endocytosis impaired. J Biol Chem 1996;271(9):5251-7。
５２．Liu Y, Tao YM, Woo RS, Xiong WC, Mei L. Stimulated ErbB4 internalization is necessary for neuregulin signaling in neurons. Biochem Biophys Res Commun 2007;354(2):505-10。
５３．Cuello M, Ettenberg SA, Clark AS等 Down-regulation of the erbB-2 receptor by trastuzumab (herceptin) enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated apoptosis in breast and ovarian cancer cell lines that overexpress erbB-2. Cancer Res 2001;61(12):4892-900。
５４．Klapper LN, Waterman H, Sela M, Yarden Y. Tumor-inhibitory antibodies to HER-2/ErbB-2 may act by recruiting c-Cbl and enhancing ubiquitination of HER-2. Cancer Res 2000;60(13):3384-8。
５５．Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. Nat Rev Cancer 2001;1(2):118-29。
５６．Gilmore JL, Riese DJ, 2nd. secErbB4-26/549 antagonizes ligand-induced HER4 tyrosine phosphorylation. Oncol Res 2004;14(11-12):589-602。
５７．Bao J, Wolpowitz D, Role LW, Talmage DA. Back signaling by the Nrg-1 intracellular domain. J Cell Biol 2003;161(6):1133-41。
５８．Iivanainen E, Paatero I, Heikkinen SM等 Intra- and extracellular signaling by endothelial neuregulin-1. Exp Cell Res 2007。
５９．Borrell-Pages M, Rojo F, Albanell J, Baselga J, Arribas J. TACE is required for the activation of the EGFR by TGF-alpha in tumors. Embo J 2003;22(5):1114-24。
６０．Gilmour LM, Macleod KG, McCaig A, Gullick WJ, Smyth JF, Langdon SP. Expression of erbB-4/HER-4 growth factor receptor isoforms in ovarian cancer. Cancer Res 2001;61(5):2169-76。
６１．Paborsky LR等, Mammalian Cell Transient Expression of Tissue Factor for Production of Antigen. Protein Eng. 1990;3(6):547-53。
６２．Chu, T. F.等, Cardiotoxicity associated with tyrosine kinase inhibitor sunitinib. Lancet 2007; 370 (9604):2011-2019。
６３．Force, T.及びKerkela, R., Cardiotoxicity of the new cancer therapeutics - mechanisms of, and approaches to, the problem. Drug Discov Today 2008:13(17-18):778-784。
６４．Yeh, E.T.H.及びBickford, C.L., Cardiovascular Complications of Cancer Therapy. J. Am. Coll. Cardio. 2009:53(24): 2231-2247。
６５．Ding, L.等, Somatic Mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature 2008:455:1069-1075。
６６．Prickett, T. D.等, Analysis of the tyrosine kinome in melanoma reveals recurrent mutations in ERBB4. Nature Genetics 2009:41:1127 - 1132 (2009)。

Claims (30)

  1. ＮＧＰＴＳＨＤＣＩＹＹＰＷＴＧＨＳＴＬＰＱＨＡのアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも一部に結合する、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合し、ＨＥＲ４ ＪＭ-ｂアイソフォームに結合しない、単離された抗ＨＥＲ４抗体。
  2. 請求項１に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
  3. キメラ、ヒト、又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
  4. ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する単離された抗ＨＥＲ４抗体であって、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９からのＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３高頻度可変領域の全て、及び、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３高頻度可変領域の全てを含む断片を含む抗体。
  5. ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに特異的に結合する、受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９からの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の単離された抗ＨＥＲ４抗体。
  6. 抗体がヒト化抗体である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 抗体が親和性成熟している、請求項３〜６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 受託番号ＰＴＡ-９６５５を有するＡＴＣＣ寄託ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体ｍＡｂ１４７９又はそのヒト化抗体を含む、単離された抗ＨＥＲ４抗体。
  9. 抗体が細胞傷害剤に結合している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 抗体は、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームに対して特異的ではない抗ＨＥＲ４抗体よりも心毒性が少ない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
  11. ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する癌細胞の増殖を阻害する薬剤において、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された抗ＨＥＲ４抗体の有効量を含む、薬剤。
  12. 抗ＨＥＲ４抗体がＨＥＲ４外部ドメイン脱落を低減する、請求項１１に記載の薬剤。
  13. 癌がＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する患者における癌を治療するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を含有する、医薬。
  14. 抗ＨＥＲ４抗体がＨＥＲ４外部ドメイン脱落を低減する、請求項１３に記載の医薬。
  15. 癌が、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である、請求項１３又は１４に記載の医薬。
  16. 癌細胞の試料中のＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの存在を検出する方法において、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体に細胞を接触させることを含む方法。
  17. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を患者から単離した試料と接触させることを含む、癌におけるＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームの存在を検出する方法。
  18. 抗ＨＥＲ４抗体がＨＥＲ４外部ドメインの脱落を低減する、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 癌が、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 癌細胞が同じ組織型の非癌細胞と比較して脱落したＨｅｒ４外部ドメインレベルが増加した患者において、癌を治療するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗Ｈｅｒ４抗体の治療的有効量を含有する、医薬。
  21. 抗ＨＥＲ４抗体がＨＥＲ４外部ドメインの脱落を低減する、請求項２０に記載の医薬。
  22. 癌が、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である、請求項２０又は２１に記載の医薬。
  23. 癌患者における癌治療に関連した心毒性リスクを低減するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ４抗体の治療的有効量を含有する、医薬。
  24. 癌がＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを過剰発現している、請求項２３に記載の医薬。
  25. 癌が、同じ組織型の非癌細胞と比較して増加した脱落したＨｅｒ４外部ドメインレベルを有している、請求項２３又は２４に記載の医薬。
  26. 癌が、乳癌、卵巣癌、又は髄芽腫である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の医薬。
  27. 細胞の試料中の脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出する方法において、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体に細胞を接触させることを含む方法。
  28. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を患者から単離した試料と接触させることを含む、腫瘍における脱落したＨＥＲ４外部ドメインの存在を検出する方法。
  29. 腫瘍における脱落したＨＥＲ４細胞外ドメインのレベルを、非癌性コントロール試料における脱落したＨＥＲ４外部ドメインのレベルと比較することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＨＥＲ４ ＪＭ-ａアイソフォームを発現する癌の診断キット。
JP2011537710A 2008-11-25 2009-11-24 アイソフォーム特異的抗ｈｅｒ４抗体 Active JP5894436B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11790308P 2008-11-25 2008-11-25
US61/117,903 2008-11-25
PCT/US2009/065712 WO2010068437A1 (en) 2008-11-25 2009-11-24 Isoform specific anti-her4 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2012509896A JP2012509896A (ja) 2012-04-26
JP5894436B2 true JP5894436B2 (ja) 2016-03-30

Family

ID=42021645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011537710A Active JP5894436B2 (ja) 2008-11-25 2009-11-24 アイソフォーム特異的抗ｈｅｒ４抗体

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20110293614A1 (ja)
EP (1) EP2365987B1 (ja)
JP (1) JP5894436B2 (ja)
KR (1) KR101789338B1 (ja)
CN (2) CN109608545A (ja)
AU (1) AU2009324939B2 (ja)
BR (1) BRPI0916092A2 (ja)
CA (1) CA2744512C (ja)
DK (1) DK2365987T3 (ja)
ES (1) ES2528929T3 (ja)
IL (1) IL212900A0 (ja)
MX (1) MX2011005382A (ja)
PL (1) PL2365987T3 (ja)
SI (1) SI2365987T1 (ja)
WO (1) WO2010068437A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009324939B2 (en) 2008-11-25 2015-07-09 Genentech, Inc. Isoform specific anti-HER4 antibodies
US10083108B1 (en) * 2017-12-18 2018-09-25 Clover Network, Inc. Automated stack-based computerized application crawler
CN112753956A (zh) * 2021-01-20 2021-05-07 重庆周师兄餐饮文化有限公司 一种腰片的加工方法
CN113999228B (zh) * 2021-11-08 2022-11-04 南京卓康医药科技有限公司 一种他达拉非的合成方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5811098A (en) * 1992-11-24 1998-09-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to HER4, human receptor tyrosine kinase
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69740038D1 (ja) 1996-07-12 2010-12-16 Genentech Inc
US6121415A (en) 1997-07-09 2000-09-19 Genentech, Inc. ErbB4 receptor-specific neuregolin related ligands and uses therefor
AU9805398A (en) * 1997-10-15 1999-05-03 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
AU2009324939B2 (en) 2008-11-25 2015-07-09 Genentech, Inc. Isoform specific anti-HER4 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009324939B2 (en) 2015-07-09
IL212900A0 (en) 2011-07-31
KR101789338B1 (ko) 2017-10-23
WO2010068437A1 (en) 2010-06-17
ES2528929T3 (es) 2015-02-13
KR20110098756A (ko) 2011-09-01
AU2009324939A1 (en) 2010-06-17
CA2744512A1 (en) 2010-06-17
US20160075798A1 (en) 2016-03-17
DK2365987T3 (en) 2015-01-12
MX2011005382A (es) 2011-07-20
CN102725310A (zh) 2012-10-10
BRPI0916092A2 (pt) 2015-11-17
US20110293614A1 (en) 2011-12-01
JP2012509896A (ja) 2012-04-26
EP2365987B1 (en) 2014-11-12
PL2365987T3 (pl) 2015-04-30
SI2365987T1 (sl) 2015-03-31
CN109608545A (zh) 2019-04-12
US9963517B2 (en) 2018-05-08
EP2365987A1 (en) 2011-09-21
CA2744512C (en) 2018-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107108740B (zh) 抗fgfr2/3抗体及其使用方法
JP5955828B2 (ja) 抗ｖｅｇｆ抗体
KR101830024B1 (ko) 항-ｆｇｆｒ３ 항체 및 그의 사용 방법
RU2426744C2 (ru) Антитела к ox40l и способы их применения
US20120195831A1 (en) Generation, characterization and uses thereof of anti-her3 antibodies
US20110286916A1 (en) Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use
JP2017538442A5 (ja)
JP2009539384A (ja) 抗ｄｌｌ４抗体および抗ｄｌｌ４抗体使用の方法
KR20110061600A (ko) 항-노치2 항체 및 사용 방법
US20220288203A1 (en) Anti-podocalyxin antibodies and methods of using the same
JP2014504850A (ja) 抗ｈｅｒ３抗体の製造、特徴づけ及びその用途
US9963517B2 (en) Isoform specific anti-HER4 antibodies
US20220267452A1 (en) Anti-mutation type fgfr3 antibody and use therefor
US20110171231A1 (en) ANTI-PlGF ANTIBODIES AND METHODS USING SAME

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20121121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140204

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140327

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140403

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140603

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140610

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140701

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140708

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140804

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150303

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150703

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20150907

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20151027

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160121

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160216

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160226

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5894436

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250