CN102725310A - 同等型特异性抗her4抗体 - Google Patents

同等型特异性抗her4抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102725310A
CN102725310A CN2009801546763A CN200980154676A CN102725310A CN 102725310 A CN102725310 A CN 102725310A CN 2009801546763 A CN2009801546763 A CN 2009801546763A CN 200980154676 A CN200980154676 A CN 200980154676A CN 102725310 A CN102725310 A CN 102725310A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
her4
cell
isoforms
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801546763A
Other languages
English (en)
Inventor
马克.X.斯利科斯基
克劳斯.埃伦纽斯
梅杰.霍尔曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Priority to CN201710670250.XA priority Critical patent/CN109608545A/zh
Publication of CN102725310A publication Critical patent/CN102725310A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Abstract

公开了可用于检测和治疗表达HER4 JM-a同等型的癌症的组合物和方法。

Description

同等型特异性抗HER4抗体
相关申请
本申请依据35USC 119(e)要求2008年11月25日提交的美国临时申请No.61/117,903的优先权，通过述及将其公开内容完整收入本文。
发明领域
本发明致力于可用于检测和治疗癌症的抗体和使用那些抗体的方法。
发明背景
ErbB/HER受体形成一个受体酪氨酸激酶亚家族，包括EGFR(也称作ErbB1或HER1)、HER2(c-Neu、ErbB2)、HER3(ErbB3)、和HER4(ErbB4)。ErbB受体被多种EGF样生长因子选择性活化，导致细胞应答，诸如细胞增殖、分化、迁移、或存活。ErbB受体由糖基化胞外域、单次跨膜域、和包括酪氨酸激酶的胞内域组成。配体对受体胞外域的结合触发受体二聚化、随后的激酶域活化、受体自磷酸化、和多种下游信号传导级联(1)。
EGFR和HER2是完善确立的癌基因和癌症药物靶。它们涉及多种上皮和神经恶性肿瘤的发病机制，而且它们的过度活性与较差患者结局有关联(2-4)。靶向治疗剂(包括阻断这些受体的功能的单克隆抗体和小分子量激酶抑制剂二者)在临床试验中显示出对患者存活的治疗效果。Cetuximab(ERBITUXTM，Imclone，Inc.)是一种嵌合单克隆抗体，其阻断配体结合EGFR，导致受体二聚化、自磷酸化和信号传导途径激活降低(5)。Cetuximab当前批准在临床上用于晚期化学不应性结肠直肠癌和头和颈局部或区域晚期鳞状细胞癌。Trastuzumab(HERCEPTINTM，Genentech，Inc.)是一种针对HER2胞外域的人源化单克隆抗体，当前在辅助背景中及对于晚期疾病二者用于治疗过表达ErbB2的乳腺癌(6-9)。
HER4受体拮抗剂显示出可用于控制平滑肌细胞的过度迁移和/或增殖及特别是用于治疗狭窄。参见United States Patent No.7,332,579。
对HER4在癌症中的意义的了解不多。一些观察结果指示HER4受体在多种癌症中下调，或者它的表达与有利预后标志(诸如雌激素受体表达)有关联(10，11)。另一方面，HER4据报告在数种癌症中具有高表达水平，诸如甲状腺(12)、卵巢(13)、和乳腺癌(14)，以及髓母细胞瘤(15)，和室管膜瘤(16)中具有高表达水平。另外，HER4表达水平对临床结局的意义相互矛盾(17)。这些矛盾的数据的似是而非的解释之一是通过可变剪接自单一HER4基因生成四种在结构上和在功能上不同的同等型(isoform)(18，19)。这些同等型具有不同组织分布概况，而且它们在乳腺癌细胞系中促进肿瘤发生的能力不同(26)。
因而，期望提供针对HER4受体特定同等型的治疗剂以更精确地治疗HER4介导的病症。
发明概述
本发明的一个方面提供了分离的特异性结合HER4JM-a同等型的抗HER4抗体。在一个实施方案中，所述抗体与由保藏于ATCC编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的抗HER4抗体单抗1479竞争对JM-a同等型的结合。在另一个实施方案中，所述抗体结合与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479结合的表位相同的表位。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
在另一个实施方案中，所述分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体包含来自由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479，特异性结合HER4 JM-a同等型的片段。在一个实施方案中，所述片段包含单克隆抗体单抗1479的可变区。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是亲和力成熟的。在一个实施方案中，所述分离的抗HER4抗体包含由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479或其人源化形式。
在一些实施方案中，所述分离的抗HER4抗体连接至细胞毒剂。
在一些实施方案中，所述分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体具有比对HER4 JM-a同等型不是特异性的抗HER4抗体要小的心脏毒性。
本发明的另一个方面提供了抑制表达HER4 JM-a同等型的癌细胞增殖的方法，包括使所述癌细胞与治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体接触。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，所述癌细胞是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤(medulloblastoma)细胞。
本发明的另一个方面提供了在其癌症表达HER4 JM-a同等型的患者中治疗癌症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
本发明的另一个方面提供了在患者中治疗癌症的方法，通过选择其癌性细胞表达HER4 JM-a同等型的患者并对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体来进行。在一个实施方案中，抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
本发明的另一个方面提供了在患者中治疗癌症的方法，通过选择其癌性细胞包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域的患者并对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体来进行。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
本发明的另一个方面提供了在具有癌症的患者中降低与癌症疗法有关联的心脏毒性风险的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。在一个实施方案中，所述患者的癌症过表达HER4 JM-a同等型。在一个实施方案中，所述患者的癌症包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域。在一些实施方案中，所述患者的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
本发明的另一个方面提供了在细胞样品中检测脱落HER4胞外域的存在的方法，包括使所述细胞与特异性结合JM-a HER4同等型的抗体接触。
本发明的又一个方面提供了在患者中诊断肿瘤的方法，包括在所述肿瘤中检测脱落HER4胞外域的存在。在一个实施方案中，所述检测方法包括使特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体与自所述肿瘤获得的样品接触。在一个实施方案中，所述方法包括比较所述肿瘤中的脱落HER4胞外域水平与非癌性对照样品中的脱落HER4胞外域水平。
附图简述
图1的示意图显示了可变近膜域HER4同等型JM-a(SEQ ID NO：1)和JM-b(SEQ ID NO：2)。
图2的表描述了某些HER4单克隆抗体的特征。
图3的Western印迹分析描绘了单抗1479和对照抗体sc-283对表达HER4同等型JM-a CYT-2或JM-b CYT-1的COS-7细胞的结合特异性。
图4的Western印迹分析描绘了单抗1479和对照抗体抗EGFR(sc-03)、抗HER2(sc-284)、抗HER3(sc-285)对稳定表达不同ErbB受体的NIH 3T3-7d和NR6细胞的结合特异性。
图5的图显示了单抗1479对表达HER4JM-a CYT-2、HER4JM-b CYT-1、EGFR、HER2、或HER3的NIH 3T3-7d和NR6转染子的结合特异性，如提供细胞酶联免疫吸附测定法(ELISA)(灰色柱)分析的。单抗1479结合与抗EGFR(sc-03)、抗HER2(sc-284)、抗HER3(sc-285)和抗HER4(sc-283)的结合比较(所有对照抗体的结合为白色柱)，1∶1000(左)或1∶100(右)稀释。
图6的Western印迹分析显示了单抗1479对人肾组织溶胞物中的脱落HER4胞外域和对重组HER4胞外域的结合。
图7显示了用重组HER4胞外域和单抗1479进行的体外结合测定法的结果。
图8是测量单抗1479对重组HER4胞外域的结合的酶联免疫吸附测定法(ELISA)的非线性亲和力曲线。
图9是17对正常乳腺(N)/乳腺肿瘤(T)组织样品的Western印迹分析，使用单抗1479来检测胞外域脱落。100kDa HER4胞外域(灰色)和150kDa全长HER4(白色)的表达水平的密度测定量化显示在每条Western道的下面。
图10的图显示了17对匹配的正常和乳腺肿瘤组织中HER4胞外域和全长受体的均值表达，通过密度测定来量化。*，在与匹配的正常组织对照比较时，肿瘤组织内总HER4中作为胞外域存在的分数较大(灰色框；P＜0.05；Wilcoxon信号秩检验(signed-rank test))。
图11A的Western印迹分析显示了单抗1479对NRG-1刺激的MCF-7乳腺癌细胞的HER4酪氨酸磷酸化的影响。所述膜用抗HER4(Abcam)和抗肌动蛋白(作为对照)再印迹。图11B的Western印迹分析显示了单抗1479对表达HER4 JM-a CYT-2的COS-7转染子的100kDa HER4胞外域脱落入培养液的影响。来自相同实验的总细胞溶胞物用抗HER4(Abcam)和抗肌动蛋白通过Western印迹来分析。
图12的Western印迹分析显示了单抗1479对HER4的可切割JM-a同等型的遍在蛋白化的影响。
图13的Western印迹分析显示了单抗1479对HER4表达水平的影响。
图14的图显示了与对照抗体2C4相比，单抗1479对人乳腺癌细胞系T-47D和MCF-7的增殖的影响。
图15的图显示了与对照抗体3g6相比，单抗1479对人乳腺癌细胞系T-47D和MCF-7的不依赖锚定的生长的影响，如通过软琼脂集落形成测定法指明的。
发明详述
定义
除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所述领域普通技术人员的常规理解相同的含义，而且与Singleton et al 1994 Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，2nd Ed.，J.Wiley & Sons，New York，NY；和Janeway et al 2001 Immunobiology：the immune system in health and disease5th Ed.，Garland Publishing，New York一致。
如本文中使用的，除非特别或上下文另外指明，术语“HER4多肽”或“HER4受体”指任何自HER4基因生成的天然或变异多肽，披露于例如European Patent Application No.(EP)599,274；Plowman at al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1746-1750(1993)；和Plowman et al.，Nature，366：473-475(1993)。在一个实施方案中，HER4基因是人HER4基因。术语“HER4”和“ErbB4”在本领域可互换使用。该术语涵盖天然存在的形式、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)、天然存在的等位变体，而且可包括天然存在的翻译后修饰，诸如糖基化和GPI修饰。
术语“野生型”一般指包含天然存在HER4蛋白的氨基酸序列的多肽。
“天然序列多肽”包括与衍生自自然界的对应多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖特定多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)、天然存在的等位变体，而且可包括天然存在的翻译后修饰，诸如糖基化等。
术语“氨基酸序列变体”指具有在一定程度上不同于主要天然序列多肽的氨基酸序列的天然存在多肽。氨基酸序列变体在氨基酸序列内的某些位置拥有替代、删除、和/或插入。
“序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，氨基酸序列变体中同样的残基的百分比。比对的方法和计算机程序是本领域公知的。一种这样的计算机程序是由Genentech公司编写的“Align 2”，其已经于1991年12月10日连同用户文档一起提交给美国版权局(United States Copyright Office，Washington，DC 20559)，且其代码可见于WO2007/001851。
“胞外域”或“ECD”指基本上不含跨膜域和胞质域的多肽。可以理解，为本发明多肽鉴定的任何跨膜域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水结构域的标准鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能的是本文中最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。
本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller et al 2003 Jour.of Immunology170：4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种的抗体。抗体为能够识别和结合特异性抗原的蛋白质(Janeway et al 2001Immunobiology：the immune system in health and disease，5th Ed.，GarlandPublishing，New York)。靶抗原一般具有由多种抗体的CDR识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分即含有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性结合所关注靶标的抗原或其部分，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种，诸如人、鼠或兔。关于不同类的抗体的结构和特性参见Basic &Clinical Immunology，8th edition，Stites and Terr(eds.)，Mcgraw-Hill，Appleton& Lange，Norwalk，CT，1994 at Chapter 6。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链(有两型，称作卡帕和拉姆达)和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
“亲本抗体”可以包含天然的或野生型的序列。亲本抗体可以针对感兴趣的靶抗原，例如生物学重要的多肽。还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US 5091178)的抗体。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或银染色，达到表观同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“抗体片段“包含全长抗体的一部分，该部分通常指所述全长抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(US 5641870，Example 2；Zapata et al 1995Protein Eng.8(10)：1057-1062)；Olafsen et al 2004 Protein Eng.Design & Sel.17(4)：315-323)；由Fab表达文库生成的片段；抗独特型(抗Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意各项的表位结合片段；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式和糖基化差异。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们可以在不受其它抗体污染的情况中合成。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler et al.1975 Nature 256：495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如US4,816,567；US 5,807,715)。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠或猕猴，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，1986 Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，pp.59-103 Academic Press)。抗体也可以使用Clackson et al.1991Nature 352：624-628；Marks et al.1991 J.Mol.Biol.222：581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
可以修饰编码抗体的DNA以生成“嵌合或融合抗体多肽”，例如通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(US 4816567；及Morrison et al.1984 Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851)，或者通过融合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(US 4,816,567；和Morrison et al.1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855)。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的所有两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)所识别的部分(Jones et al 1986 Nature 321：522-525；Riechmann et al 1988 Nature 332：323-329；Presta 1992 Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596；Verhoeyen et al 1988 Science，239：1534-1536；Sims et al 1993 J.Immunol.151：2296；Chothia et al 1987 J.Mol.Biol.，196：901)。其它方法使用自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区(Carter et al 1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta et al 1993 J.Immunol.151：2623)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。可得到能够在免疫后在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。(Jakobovits et al 1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551；Jakobovits et al 1993Nature，362：255-258；Bruggemann et al 1993 Year in Immuno.7：33；US 5545806；US 5569825；US 5591669；US 5545807；及WO 1997/17852)。
在“半胱氨酸改造的”抗体中，任何形式的野生型、鼠亲本单克隆抗体、人或人源化抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸替换。改造的半胱氨酸氨基酸是游离的半胱氨酸，不是链内或链间二硫化物单元的一部分。修饰或“改造”本发明感兴趣抗体的一个或多个氨基酸残基的DNA，使得导入一个或多个半胱氨酸氨基酸密码子并如此在所表达的抗体上有游离的半胱氨酸可供进一步修饰，诸如偶联细胞毒性药物。
“抗原”指抗体能选择性结合的预定多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。细胞的细胞膜可呈现“细胞表面暴露的抗原”。
当对抗原的结合有足够的亲和力和特异性，使得抗体-抗原复合物形成，可用于靶向抗原的表位时，抗体“结合”感兴趣分子靶或抗原。抗原的表位可暴露在细胞的表面上，或可存在于分离的蛋白质上。
术语“特异结合”或“特异性结合”特定分子靶或感兴趣抗原或特定分子靶或感兴趣抗原上的表位对其“特异性的”意味着可测量的不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如过量的未标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制，则指示特异性结合。在一个实施方案中，此类术语指这样的结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。或者，此类术语可由对靶物的Kd为至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更大的分子展现。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。
“抗体-抗原复合物”或“抗体-药物偶联物-抗原复合物”因特异性结合而形成。例如，当抗体特异性结合HER4或HER4同等型时，它通常会优先结合一个或多个在天然HER4或其同等型上找到的表位，而且可以是对其它抗原或蛋白质或其它HER4同等型没有显著结合亲和力(例如非特异性结合亲和力或交叉反应性)的抗体。在此类实施方案中，对非HER4或其它HER4同等型的非特异性结合亲和力或交叉反应性结合的程度会小于10％、5％、2％、或1％，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定的。
“完整抗体”在本文中指包含VL和VH结构域以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一项或多项“效应器功能”，指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)下调。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域(区)中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的且是最常用的(Kabat et al.1991)。Chothia改指结构环的位置(Chothia and Lesk1987 J.Mol.Biol.196：901-917)。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。除非另有说明，会采用依照Kabat蛋白质比对序列数据库的Kabat编号方式(Wu and Kabat1970 J.Exp.Med.132：211-250；Johnson and Wu 2000 Nuc.Acids Res.28(1)：214-218)。高变区或“互补决定区”位置通常如下：氨基酸24-34(VLCDR-L1)，氨基酸49-56(VL CDR-L2)，氨基酸89-97(VL CDR-L3)，氨基酸26-35A(VH CDR-H1)，氨基酸49-65(VH CDR-H2)，和氨基酸93-102(VHCDR-H3)。高变区还可包括“延伸的高变区”：氨基酸24-36(VL CDR-L1)和氨基酸46-56(VL CDR-L2)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等1991，见上文编号的。“改变的高变区”就本文目的而言指其中包含一处或多处(例如1处至约16处)氨基酸替代的高变区。“未修饰的高变区”就本文目的而言指具有与衍生它的非人抗体相同的氨基酸序列的高变区，即其中缺少一处或多处氨基酸替代的高变区。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等1991，见上文中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚型。通常，序列亚型是如Kabat et al.1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，亚型是如Kabat等人1991中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，亚型是如Kabat等人中的亚型III。“VH亚型III共有框架”包含从Kabat等人1991的可变重链亚型III中的氨基酸序列获得的共有序列。“VL亚型I共有框架”包含从Kabat等人1991的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列获得的共有序列。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的抗体相比有所改进的抗体。亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过VH和VL域改组的亲和力成熟(Marks et al.1992Bio/Technology 10：779-783)或CDR和/或框架残基的随机诱变(Barbas et al.1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813；Schier et al.1995 Gene169：147-155；Yelton et al.1995 J.Immunol.155：1994-2004；Jackson et al.1995J.Immunol.154(7)：3310-9；Hawkins et al.1992 J.Mol.Biol.226：889-896)来生成。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个高变区一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在成对Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构(Plückthun，1994，《ThePharmacology of Monoclonal Antibodies》，113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的VH和VL。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(EP 404,097；WO 1993/11161；Hollinger etal.1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。
术语“抗体-药物偶联物”或“免疫偶联物”包含如下的抗体，其偶联有细胞毒剂，诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
“游离半胱氨酸”指已经工程改造入亲本抗体的、具有硫醇官能基的(-SH)、且没有配对或以其它方式成为分子内或分子间二硫桥一部分的半胱氨酸残基。
术语“硫醇反应性值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值指经过半胱氨酸工程改造的抗体中与硫醇反应性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，且换算成最大值1。例如，经过半胱氨酸工程改造的抗体上与硫醇反应性试剂(诸如生物素-马来酰亚胺试剂)以100％产率反应(以形成生物素标记的抗体)的游离半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应性试剂以80％产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇反应性值。特定半胱氨酸的硫醇反应性值的测定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射自显影、或其它定量分析测试来进行。容许捕捉经过半胱氨酸工程改造的抗体及比较和定量半胱氨酸反应性的硫醇反应性试剂包括生物素-PEO-马来酰亚胺((+)-生物素基-3-马来酰亚氨基丙酰氨基-3，6-二
Figure BDA0000076110670000141
辛烷二胺((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3，6-dioxaoctainediamine)，Oda等(2001)Nature Biotechnology 19：379-382，Pierce Biotechnology，Inc.)、生物素-BMCC、PEO-吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和生物素-HPDP(Pierce Biotechnology，Inc.)、及Nα-(3-马来酰亚氨基丙酰基)生物胞素(MPB，Molecular Probes，Eugene，OR)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来源包括Molecular Probes(Eugene，OR)和Sigma(St.Louis，MO)。
当与细胞表面抗原形成复合物后，细胞表面膜上存在的抗原-抗体复合物或抗原-抗体-药物偶联物复合物经生化反应自细胞表面消除并掺入细胞自身中时，抗体或抗体-药物偶联物“内化”。数种可能的胞吞后运输途径可在此后从事于复合物(参见综述Schroeder et al 2001″Recent advances inmembrane microdomains：rafts，caveolae，and intracellular cholesteroltrafficking.″Exp Biol.Med(Maywood)Nov；226(10)：873-90)，Spooner et al2006″Retrograde transport pathways utilized by viruses and protein toxins″VirolJ.2006；3：26)。针对变性的蛋白质制备的抗体可用于Western印迹，但是预期不会结合细胞表面表位或形成抗原-抗体复合物且因此不会内化。
术语“Fc受体”或“FcR”意指能结合抗体Fc恒定区的受体。此外，FcR是能结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的各等位变体和各可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述参见
Figure BDA0000076110670000151
1997 Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。FcR的综述参见Ravetch and Kinet 1991 Annu.Rev.Immunol.9：457-492；Capel et al.1994 Immunomethods 4：25-34；及de Haas et al.1995 J.Lab.Clin.Med.126：330-341)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.1976 J.Immunol.117：587)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的(Gazzano-Santoro et al.1996 J.Immunol.Methods202：163)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet 1991 Annu.Rev.Immunol.9：457-92第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如US 5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al 1998 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：652-656中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种恒定区受体(FcR)并行使效应器功能的白细胞。该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液或PBMC。
“处理”或“治疗”或“缓和”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及倾向于患上病症的受试者或要预防病症的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的抗体或其抗体药物偶联物后，患者在如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者或哺乳动物成功“治疗”了癌症：癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减缓或停止)；肿瘤转移受到抑制；肿瘤生长受到抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。就抗体或其抗体-药物偶联物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是抑制细胞的和/或毒害细胞的。用于评估疾病的成功治疗和改善的参数可以容易地通过内科医师所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展时间(TTP，time to diseaseprogression)和/或测定响应速率(RR，response rate)来测量功效。转移可通过分期测试(staging test)来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可使用CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的淋巴结。分别使用胸腔X射线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞，而且指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前或癌性细胞和组织。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括结肠癌、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺的腺癌和肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、和黑素瘤。
“过表达”多肽的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的该多肽的癌。此类过表达可以是由转录或翻译提高引起的，其继而可以是由遗传水平的异常或变化(例如DNA突变或改变)、mRNA剪接变异、或特定遗传转录因子、启动子或增强子活性改变引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)来确定过表达。或者/另外，可测量细胞中受体编码核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见WO1998/45479)、Southern印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓或阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制肿瘤转移；一定程度地抑制肿瘤生长；和/或一定程度地减轻一种或多种与癌症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。术语“细胞抑制性的”指限制细胞功能的效果，诸如限制细胞生长或细胞增殖。对于例如癌症疗法，功效可以通过评估距疾病进展的时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测量。
术语“标记物”指可共价附着于抗体并发挥如下功能的任何模块：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以改变由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与之结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性；或(v)提供俘获模块，以调控配体亲和力、抗体/抗原结合、或离子络合。
短语“药学可接受盐”在用于本文时指ADC的药学可接受的有机或无机盐。例示性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐或酒石酸盐。药学可接受盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定化合物电荷的任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。
“药学可接受溶剂化物”指一个或多个溶剂分子和ADC的结合。形成药学可接受溶剂化物的溶剂的例子包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
“载体”在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如
Figure BDA0000076110670000181
聚乙二醇(PEG)和
Figure BDA0000076110670000182
组合物和方法
HER4同等型
通过可变剪接自单一HER4基因生成四种在结构上和在功能上不同的同等型(18，19)。两种同等型在细胞内的胞质域中有不同(同等型CYT-1和CYT-2)。CYT-1在胞质域内具有16个氨基酸的插入物，而CYT-2没有插入物(18)。CYT-1同等型能介导偶联至磷酸肌醇(phosphoinositide)3-激酶(PI3-K)，但是CYT-2同等型不能(20，21)。
另两种同等型(JM-a和JM-b)因细胞外的近膜区中23或13个可变氨基酸的插入而不同(图1)。JM-a是在近膜区内有23个氨基酸的同等型(NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA SEQ ID NO：1)，而JM-1b是在此区中有13个氨基酸的同等型(IGSSIEDCIGLMD SEQ ID NO：2)(17，23)。
胞外同等型JM-a能被肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)切割(22)，而JM-b同等型对蛋白酶有抗性(23)。TACE进行的切割触发涉及γ-分泌酶活性的对HER4的第二切割(24)。结果，胞内域(ICD)自细胞膜释放并转运至核，在那里它可发挥调节基因转录的功能(25-28)。
与HER4同等型在肿瘤发生中的作用不同的假说一致，可切割HER4JM-a CYT-2同等型，但非其不可切割对应物JM-b CYT-2，表现出不依赖配体的活性且促进癌细胞生长(26)。另外，与HER4在细胞表面处的定位相比，胞内HER4表位在核中的定位与更短的存活有关联(29)，提示HER4切割能调节肿瘤进展。这些相同的可切割同等型先前显示出在一系列临床乳腺癌患者样品中过表达(18，26)。
另外，JM-a和JM-b同等型还展现出不同的组织分布样式，其中心组织中没有JM-a同等型(23)。
同等型特异性抗体
本发明的一个方面提供了特异性结合HER4 JM-a同等型的抗体。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合包含JM-a近膜区的完整全长HER4受体以及可溶性HER4胞外域二者。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合包含NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合氨基酸序列NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA(SEQ ID NO：1)。
本发明的另一个方面提供了分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体，其中所述抗体是由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单抗1479单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是自由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单抗1479单克隆抗体衍生的人源化或亲和力成熟抗体。
本发明的另一个方面提供了包含来自由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479的片段的抗HER4抗体。所述抗体是对HER4 JM-a同等型特异性的。在一个实施方案中，所述片段特异性结合HER4 JM-a同等型。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段至少包含高变区的一部分。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含重链高变区。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含轻链高变区。在另一个实施方案中，所述片段包含单抗1479的轻链和重链高变区。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、或VH3高变区。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、和VH3高变区中的至少两项。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、和VH3高变区中的所有三项。在一个实施方案中，所述片段包含VL1、VL2、或VL3高变区。在一个实施方案中，所述片段包含VL1、VL2、和VL3高变区中的至少两项。在一个实施方案中，所述片段包含VL1、VL2、和VL3高变区中的所有三项。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、或VH3高变区中的至少一项、两项、或三项和VL1、VL2、和VL3高变区中的至少一项、两项、或三项。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、或VH3高变区中的所有三项和VL1、VL2、和VL3高变区中的所有三项。
在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段至少包含可变区的一部分。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含重链可变区。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含轻链可变区。在另一个实施方案中，所述片段包含单抗1479的轻链和重链可变区。
在一些实施方案中，所述片段包含不显著降低抗体对JM-a同等型的结合特异性的突变。
本发明的另一个方面提供了与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的抗HER4抗体单抗1479竞争对JM-a同等型的结合的抗体。
本发明的又一个方面提供了结合与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479结合的表位相同的表位的抗体。
在一个实施方案中，由单克隆抗体单抗1479结合的表位包含HER4胞外域。在另一个实施方案中，由单克隆抗体单抗1479结合的表位至少包含氨基酸序列NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA(SEQ ID NO：1)的一部分。在另一个实施方案中，由单克隆抗体单抗1479结合的表位包含氨基酸序列NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA(SEQ ID NO：1)。
在一些实施方案中，JM-a同等型特异性抗体是嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体降低HER4酪氨酸磷酸化。遏制受体酪氨酸磷酸化显示出与靶向其它ErbB受体的胞外域的治疗性抗体的抗肿瘤活性有关联(39，48，49)。抗HER4抗体对HER4磷酸化的影响可通过本领域公知方法来测定，本文中实施例1和5描述了其一个例子。简言之，用抗HER4抗体处理表达HER4的细胞，然后用NRG-1刺激。溶解细胞，并用一般抗HER4抗体诸如HFR-1(R&D，Minneapolis，MN)免疫沉淀，在SDS-PAGE凝胶中分开，并使用抗磷酸酪氨酸抗体诸如4G10(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)通过Western印迹来分析。可扫描印迹，并通过扫描密度测定来分析以提供定量分析。在一些实施方案中，包括对照。在一个实施方案中，对照包含在抗HER4抗体处理缺失下经NRG-1刺激的表达HER4的细胞的样品。像经过处理的细胞一样，通过Western印迹来分析该细胞。在一个实施方案中，抗HER4抗体将HER4酪氨酸磷酸化降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％。
在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体降低HER4切割。HER4切割导致100kDa胞外域片段释放。此事件也称作胞外域脱落。抗HER4抗体对HER4切割的影响可通过本领域公知方法来测定，本文中实施例1和5描述了其一个例子。简言之，可通过测定经过抗HER4抗体处理的表达HER4的细胞的细胞培养液中胞外域的存在来检测HER4切割的降低。可通过在测定中包括佛波醇13-肉豆蔻酸酯12-乙酸酯(PMA)来增强切割。在一些实施方案中，包括对照。在一个实施方案中，包括如下的对照，其中测定未经抗HER4抗体处理的表达HER4的细胞的细胞培养液中胞外域的存在。在一个实施方案中，抗HER4抗体将HER4切割降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％。
在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体内化。抗体内化可用于将抗体偶联的毒素投递至表达HER4JM-a同等型的癌性细胞。
在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体促进HER4内化。酪氨酸受体激酶内化与受体下调有关联。在一个实施方案中，抗HER4抗体将细胞表面上HER4的量降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％。抗HER4抗体对HER4内化的影响可通过本领域公知方法来测定，本文中实施例1和6描述了其一个例子。
在一些实施方案中，特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体具有比对HER4 JM-a同等型不是特异性的抗HER4抗体要小的心脏毒性。心脏毒性是与多种受体酪氨酸激酶抑制剂治疗剂有关联的副作用(62，63)。对HER4JM-a同等型特异性的抗体预测在患者中产生比识别JM-b同等型的抗HER4抗体要小的心脏毒性效果，因为JM-a同等型不存在于心组织中(23)。患者中的心脏毒性表现为多种症状，包括心力衰竭、左心室功能紊乱(LVD)、心肌缺血、高血压、静脉血栓栓塞、心动过缓、和QT间期(心电周期中Q波开始和T波结束之间的时间的量度)延长。
化合物的心脏毒性可例如通过使用体外或体内诊断模型来测量。
心脏毒性的体外测定可通过将心细胞暴露于测试化合物并观察细胞外观或细胞凋亡速率的任何变化来进行。细胞外观的有关变化包括线粒体膨胀和降解。细胞凋亡可通过例如末端脱氧核苷酸基转移酶介导的脱氧尿苷5-三磷酸酯缺刻末端标记来监测。另外，细胞的酶或凋亡相关化学品分泌升高指示心脏毒性。此类化学品或酶包括肌钙蛋白/肌原蛋白、利钠肽诸如B型的N端前肽(pro-BNP)、细胞色素C和胱天蛋白酶-9。可用作培养细胞模型的心细胞包括自合适动物模型诸如小鼠或大鼠获得的原代的或培养的成年或新生心室肌细胞(心肌细胞)(62-64)。
心脏毒性的体内测定可例如通过将测试化合物注射入合适的动物模型诸如小鼠或大鼠中并观察测试化合物对模型心组织的结构、线粒体心外观和功能、和/或模型心组织凋亡速率的影响来实施(62)。分离的心模型或Langendorf制备物也可用于测定化合物的心脏毒性(63)。
心脏毒性还可通过临床观察来测量。例如，通过临床诊断组合患者历史和体格检查及诊断测试诸如心电图(EKG)、胸部X射线摄影术、和多门采集扫描(MUGUA)来测量心力衰竭和LVD。心肌缺血通过体格检查、检测心肌坏死、检测EGK变化、和检测心酶上升升高来测定。高血压通过测量患者的血压来测定。那些血压大于或等于140/90mm Hg的患者一般被认为是具有高血压。静脉血栓栓塞通过压缩超声图像检查法、断层摄影血管造影术、磁共振肺血管造影术、或核医学技术来检测。心动过缓一般定义为低于60次每分的心率，而且通过测定心率组合EKG或霍尔特(Holter)监护仪分析来检测。QT间期延长是心的电活动异常，而且可通过EKG分析来测定。一般地，小于或等于440毫秒的QT间期被认为是正常的，而男性大于450毫秒和女性大于470毫秒的QT间期一般被认为是延长的(64)。
抗体片段
本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)，即用高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(参见例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285；Presta等(1993)J.Immunol.151：2623)。
一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
人抗体
本发明的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991).
例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255(1993)；Bruggermann等，Year inImmunol.7：33(1993)。
基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1日)。与传统的通过CDR嫁接进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对HER4 JM-a同等型，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合HER4 JM-a同等型的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达HER4 JM-a同等型的细胞。这些抗体拥有HER4 JM-a同等型结合臂和结合细胞毒剂(诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991)。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methodsin Enzymology 121：210(1986)。
依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可以与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下(用以稳定邻近的二硫醇和防止分子间二硫键的形成)还原。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了直接从重组细胞培养物生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)三个至大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如，所述多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条(例如四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
单域抗体
在有些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的、双触角的寡糖，其一般通过N-连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297(参见例如Wright等(1997)TIBTECH 15：26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善特性的抗体变体。
例如，提供了有缺乏岩藻糖的碳水化合物结构(直接地或间接地)附着于Fc区的抗体变体。此类变体具有改善的ADCC功能(参见例如美国专利申请号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd))。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；及WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有等分寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一处或多处进一步改善ADCC的氨基酸替代的Fc区，例如Fc区第298、333、和/或334位(EU残基编号方式)处的替代。此类替代可以与任何上文所述变异组合存在。
在某些实施方案中，本发明涵盖了如下抗体变体，其具有一些但非所有效应器功能，这使之成为其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结合(从此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例(还可参见Hellstrom，I.，et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83：7059-7063(1986)；Hellstrom，I et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；5,821,337；Bruggemann，M.et al.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如ACTITM非放射性细胞毒性测定法，其用于流式细胞术(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)；和CytoTox
Figure BDA0000076110670000311
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)95：652-656(1998)中所披露的。还可以进行C1q结合测定法来证实抗体不能结合C1q及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.et al.，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.et al.，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
提供了另一类具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。表1中提供了称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步描述的。可以将氨基酸替代掺入感兴趣抗体，并筛选产物，例如筛选期望的活性，诸如改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC、等等。
表1
  原始残基  例示替代   优选替代
  Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)  Gln；His；Asp，Lys；Arg   Gln
  原始残基  例示替代   优选替代
  Asp(D)  Glu；Asn   Glu
  Cys(C)  Ser；Ala   Ser
  Gln(Q)  Asn；Glu   Asn
  Glu(E)  Asp；Gln   Asp
  Gly(G)  Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸   Leu
  Leu(L)  正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)  Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Tyr
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Val；Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸   Leu
对抗体生物学特性的修饰可通过选择对影响以下方面的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，于Biochemistry，第2版，pp.73-75，WorthPublishers，New York(1975))：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点，或导入剩余(非保守)位点。
一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改变的(例如改进的)生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术而便利地生成。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术(包括本文详述的技术)进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的变体用于进一步的开发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸的位置)包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可包含一处或多处改变(在例如Fc区中)。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
另一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰便于和/或促进异二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中导入隆起(protuberance)和在第二Fc多肽中导入空腔(cavity)，其中所述隆起可位于所述空腔中，从而促进第一与第二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如记载于美国专利No.5,731,168。
又一方面，可能期望创建半胱氨酸改造抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基替代抗体的一个或多个残基。在具体的实施方案中，被替代的残基位于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，由此将反应性硫醇基团定位于抗体的可及位点，并可用于将抗体与其它模块(诸如药物模块或接头-药物模块)偶联，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代一个或多个以下残基：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。
抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三
Figure BDA0000076110670000351
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。
某些生成抗体的方法
某些基于杂交瘤的方法
本发明的单克隆抗体可使用杂交瘤方法来生成，其首先记载于Kohler etal.，Nature，256：495(1975)，并进一步记载于例如Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)，和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括那些记载于例如U.S.Pat.No.7,189,826的，其关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(三元杂交瘤(Trioma)技术)记载于Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology，27(3)：185-91(2005)。
关于各种杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人的抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US2005/026229；和U.S.Pat.Nos.7,078,492和7,153,507。一种使用杂交瘤方法来生成单克隆抗体的例示性方案记载如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射包含HER4 JM-a同等型或其片段的多肽和佐剂诸如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，MT)，在动物中生成抗体。包含HER4 JM-a同等型或其片段的多肽可使用本领域公知方法来制备，诸如重组方法，其中一些在本文中有进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗HER4 JM-a同等型抗体，并任选施用加强免疫。自生成抗HER4 JM-a同等型抗体的动物分离淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。
然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，pp.59-103(Academic Press，1986)。可使用高效融合、支持选定地抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞，诸如那些衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自索尔克(Salk)研究所细胞分发中心，SanDiego，California USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清的使用，诸如胎牛血清，如记载于例如Even et al.，Trends in Biotechnology，24(3)，105-108(2006)。
作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽记载于Franek，Trendsin Monoclonal Antibody Research，111-122(2005)。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白质水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合HER4JM-a同等型的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(参见例如Goding，supra)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。一种用于自杂交瘤细胞分离蛋白质的规程记载于US 2005/176122和U.S.Pat.No.6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，诸如易溶盐，而且优选还在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
某些文库筛选方法
本发明的抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体来生成。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期望的结合特性的抗体的多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom et al.in Methods inMolecular Biology 178：1-37(O’Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2001)。例如，一种生成感兴趣抗体的方法是经由使用噬菌体文库，如记载于Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93。
在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗体克隆。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等，Nucl.AcidsRes.，19：4133-4137(1991)所述。
一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗HER4 JM-a同等型克隆，那么可以给受试者免疫HER4 JM-a同等型以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗HER4 JM-a同等型的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗HER4 JM-a同等型抗体应答，使得HER4 JM-a同等型免疫产生生成针对HER4JM-a同等型的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。
可以如下获得抗HER4 JM-a同等型反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达HER4 JM-a同等型特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用亲和层析进行的细胞分离或者细胞对荧光染料标记的HER4JM-a同等型的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activated cell sorting，FACS)。
或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用HER4 JM-a同等型在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和禽类物种等)获得感兴趣的免疫细胞。
从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等，Nature，341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones等，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)的方法中所述或Orum等，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)所述。
合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992))，并定位(Matsuda等，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等，Gene，128：119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约1012个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd -1为约10-8M)的多样性抗体。
或者，可以将全集序贯克隆入同一载体，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，例如如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述。
未免疫文库(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd -1为约106-107M-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再次选择，如Winter等(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，HER4 JM-a同等型可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的HER4 JM-a同等型。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理学条件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者通过抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass等，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。
有可能在对HER4 JM-a同等型具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技术中所进行的)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制HER4 JM-a同等型，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化HER4 JM-a同等型一起温育，但是生物素化HER4 JM-a同等型的浓度以摩尔计低于HER4 JM-a同等型的目标摩尔亲和常数。然后可以用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
抗HER4 JM-a同等型克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供了结合天然表达HER4 JM-a同等型的活细胞的抗HER4 JM-a同等型抗体。在一个实施方案中，本发明提供了阻断HER4 JM-a同等型与HER4配体诸如神经调节蛋白之间的结合但不阻断神经调节蛋白与第二蛋白质之间的结合的抗HER4 JM-a同等型抗体。对应于此类抗HER4 JM-a同等型抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗HER4 JM-a同等型克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想要阻断和不阻断其活性的第二蛋白质和HER4 JM-a同等型；(3)使抗HER4 JM-a同等型噬菌体克隆吸附至固定化的HER4 JM-a同等型；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识别HER4 JM-a同等型结合决定簇(其与第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion inImmunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗HER4 JM-a同等型抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
载体、宿主细胞、和重组方法
也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生产抗HER4 JM-a同等型抗体，分离编码抗体的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
信号序列构件
本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、谷氨酰胺合酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methioninesulfoximine)(GS的一种抑制剂)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统组合地使用GS选择/扩增系统。
或者，可以通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、或G418的培养基中的细胞生长来选择经编码感兴趣抗体、野生型DHFR基因、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利4,965,199。
适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977).酵母宿主细胞基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991)。
启动子构件
表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、猿猴病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
可以在细菌中生产全长抗体、抗体融合蛋白、和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗性抗体偶联至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如U.S.5,648,237(Carter et.al.)，U.S.5,789,199(Joly etal.)，U.S.5,840,523(Simmons et al.)，其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述参见例如Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)。
可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Li et al.，Nat.Biotech.24：210-215(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.，见上文。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(Lemnaceae)、苜蓿(M.truncatula)、和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978；和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞细胞系，诸如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazaki and Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.255-268。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology10：163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark etal.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
一般而言，用于制备供研究、测试、和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体的。
免疫偶联物
本发明还提供包含偶联有一种或多种细胞毒剂的抗体的免疫偶联物(可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射偶联物)。
免疫偶联物已经在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂(即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物)(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology5：543-549；Wu等(2005)Nature Biotechnology 23(9)：1137-1146；Payne，G.(2003)i 3：207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26：151-172；美国专利No.4,975,278)。免疫偶联物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用未经偶联的药物可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等，Lancet(1986年3月15日)第603-05页；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等，J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler等，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler等，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP1391213；Liu等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lode等，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
Figure BDA0000076110670000521
(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman等，Blood99(12)：4336-42(2002)；Witzig等，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig等，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumab ozogamicin，WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future25(7)：686(2000)；美国专利No.4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab mertansine(ImmunogenInc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZLBiologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的Lewis Y特异)和cAC10(对血液学恶性肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina等，Nature Biotechnol.21(7)：778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。
美登素和美登木素生物碱类
在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的抗体(全长或片段)。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0 425 235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235B1；Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992)；2004年10月9日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的抗体(美国专利No.5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands”，U.S.Ser.No.10/983,340，filed Nov.5，2004，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.
Figure BDA0000076110670000561
and K.Lübke，The Peptides，volume 1，pp 76-136，1965，Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 5,635,483；US 5,780,588；Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.，et al.Synthesis，1996，719-725；Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，美国流水号No.10/983,340，2004年11月5日提交，将其完整收入本文作为参考(披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法)。
加利车霉素
在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。
其它细胞毒剂
可与抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用于掺入碘-123。《MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第67-498页。
抗体-药物偶联物的制备
在抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。
Ab-(L-D)p    I
接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基(″MC″)、马来酰亚胺丙酰基(″MP″)、缬氨酸-瓜氨酸(″val-cit″)、丙氨酸-苯丙氨酸(″ala-phe″)、对氨基苄氧羰基(″PAB″)、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SPP″)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SMCC′)、和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SIAB″)。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，美国流水号No.10/983,340，2004年11月5日提交，将其完整内容收入本文作为参考。
在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。
还可通过修饰抗体来生成抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan & Stroh，Bioconjugate Chem.3：138-146(1992)；US 5362852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。
同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。
治疗用途
本文所述抗体可用于治疗癌症，包括癌变前、非转移、和癌性肿瘤(例如早期癌症)，或用于治疗处于癌症(例如乳腺癌)形成风险的受试者。所述抗体和抗体片段还可用于治疗或预防非恶性疾病，诸如自身免疫性和神经学病症。
对JM-a同等型特异性的抗体特别可用于治疗以表达JM-a同等型为特征的癌症或其它病症。在一个实施方案中，JM-a同等型在癌细胞中的表达水平高于在相同细胞类型的非癌性细胞中的或在邻近癌性细胞的非癌性细胞中的。在一些实施方案中，JM-a同等型的表达水平比非癌性细胞中的表达水平高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。
对JM-a同等型特异性的抗体特别可用于治疗以脱落HER4胞外域水平升高为特征的癌症或其它病症。如实施例中呈现的，自同一患者收集的一系列组织学正常乳腺组织和乳腺癌组织样品证明了乳腺癌中的可溶性HER4胞外域释放与匹配的正常对照组织相比显著升高。另外，与膜HER4表达相比，胞内HER4表位的核定位与不利临床后果有关联，指示增强的HER4切割与较差的存活有关联(29)。在一个实施方案中，癌细胞中存在的脱落HER4胞外域水平比相同细胞类型的非癌性细胞中的或邻近癌性细胞的非癌性细胞中的水平要高。在一些实施方案中，脱落HER4胞外域水平比非癌性细胞中的脱落HER4胞外域水平高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。
过表达JM-a同等型和/或脱落HER4胞外域水平升高的癌症的具体例子包括乳腺癌、卵巢癌、和髓母细胞瘤(15)(60)。HER4突变水平升高的癌症也预期有利地响应对HER4 JM-a同等型特异性的抗体的治疗。此类癌症包括肺癌和黑素瘤(65)(66)。
在本发明的一些方面，基于确定患者具有以表达或过表达JM-a同等型为特征的癌症或其它病症来为对JM-a同等型特异性的抗体的治疗选择患者。如下文诊断方法部分详细讨论的，HER4 JM-a同等型表达可使用多种方法来检测，包括检测JM-a同等型多肽的存在、JM-a同等型多核苷酸的存在、或脱落HER4胞外域的存在的方法。
诊断方法
本发明的另一个方面提供了测定HER4 JM-a同等型的存在的方法。在一个实施方案中，HER4 JM-a同等型的存在是通过检测JM-a同等型的表达来测定的。在一个实施方案中，HER4 JM-a同等型的表达是通过检测JM-a同等型多肽的存在来测定的。在一个实施方案中，HER4 JM-a同等型的表达是通过检测JM-a同等型多核苷酸的存在来测定的。在另一个实施方案中，HER4JM-a同等型的表达是通过检测脱落HER4胞外域的存在来测定的。
可采用多种方法来检测HER4 JM-a同等型多肽的表达和/或脱落HER4胞外域的存在，而且包括例如免疫组织化学分析、免疫沉淀、Western印迹分析、分子结合分析、ELISA、ELIFA、荧光活化细胞分选(FACS)等等。例如，一种在组织或样品中检测HER4 JM-a同等型多肽的表达和/或脱落HER4胞外域的任选方法包括使该样品与对HER4 JM-a同等型特异性的抗体、其HER4JM-a同等型结合片段或含有HER4 JM-a同等型特异性抗体之抗原结合区的重组蛋白接触，然后检测该样品中HER4 JM-a同等型多肽或脱落HER4胞外域的结合。
在本发明的具体实施方案中，使用免疫组织化学和染色方案来检验样品中HER4 JM-a同等型多肽的表达或脱落HER4胞外域的存在。组织切片的免疫组织化学染色显示为一种在样品中评估或检测蛋白质的存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体来原位探查和显现细胞抗原，一般通过发色或荧光方法。
对于样品制备，可以使用来自哺乳动物(典型的是人类患者)的组织或细胞样品。样品的例子包括但不限于组织活检、血液、肺吸出物、痰或唾液、淋巴液等。可以通过本领域已知的多种规程来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。
可以通过常规方法来固定(即保存)组织样品(参见例如“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，”第3版(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP)编，The Blakston Division McGraw-HillBook Company，New York；The Armed Forces Institute of Pathology AdvancedLaboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel编，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.)。本领域技术人员将领会，固定剂的选择由样品是用于组织学染色还是其它分析的目的来决定。本领域技术人员还将领会，固定时长取决于组织样品的大小和所使用的固定剂。例如，可以使用中性缓冲的福尔马林、Bouin氏液或低聚甲醛来固定样品。
一般而言，将样品首先固定，然后通过酒精递增系列脱水，用石蜡或其它切片介质渗透和包埋使得该组织样品可以切片。或者，可以将组织进行切片并将所得切片固定。例如，可以通过常规方法学将组织样品在石蜡中包埋和加工(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology″，见上文)。可以使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast、Broloid、和Tissuemay。一旦将组织样品包埋，就可以用切片机等等将样品切片(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the ArmedForces Institute of Pathology”，见上文)。对于此规程，例如，切片的厚度范围可以是约3微米至约5微米。一旦切片，就可以通过数种标准方法将切片附着至载玻片。载玻片粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚L-赖氨酸等等。例如，可以将石蜡包埋的切片附着于带正电荷的载玻片和/或聚L-赖氨酸包被的载玻片。
若使用石蜡作为包埋材料，则一般将组织切片脱石蜡和复水。可以通过数种常规标准方法学将组织切片脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和酒精逐渐递减系列(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the ArmedForces Institute of Pathology”，见上文)。或者，可以使用商品化的脱石蜡用非有机试剂，诸如Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。
任选地，在样品制备后，可以使用IHC来分析组织切片。IHC可以联合别的技术进行，诸如形态学染色和/或荧光原位杂交。可利用IHC的两种常用方法，即直接和间接测定法。依照第一种测定法，直接测定抗体对靶抗原(例如HER4 JM-a同等型)的结合。此直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的一抗，其可以在没有进一步抗体相互作用的情况下显现。在一种典型的间接测定法中，未偶联的一抗结合至抗原，然后经过标记的二抗结合至一抗。若二抗偶联有酶标记物，则添加显色或荧光底物以提供抗原显现。因为数个二抗可以与一抗上的不同表位起反应，所以发生了信号放大。
用于免疫组织化学的一抗和/或二抗通常用可检测模块标记。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：
(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可使用CurrentProtocols in Immunology，卷1和2，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.1991中记载的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。
(b)胶体金颗粒。
(c)荧光标记物，包括但不限于稀士螯合物(铕螯合物)、德州红、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或商品化荧光团诸如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任一种或多种的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology，见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。
(d)可利用各种酶-底物标记物且美国专利第4,275,149号中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O′Sullivan等，Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，于：Methods inEnzym.，J.Langone和H.Van Vunakis编，Academic Press，New York，73：147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢，其中过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物(例如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述四大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。
在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行加热(参见例如Leong等，Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。
在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选的是，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化显色底物诸如3，3′-二氨基联苯胺色原体(chromogen)的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是家兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗家兔抗体)。
可以将如此制备的标本放置好并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。例如，染色强度标准可以如下评估：
表2
  染色样式   得分
  在细胞中没有观察到染色。   0
  在超过10％的细胞中检测到微弱/刚刚可察觉的染色。   1+
  在超过10％的细胞中观察到弱至中等的染色。   2+
  在超过10％的细胞中观察到中等至强的染色。   3+
在备选方法中，可以在足以使抗体-抗原复合物形成的条件下使样品接触HER4 JM-a同等型特异性抗体，然后检测所述复合物。可以以多种方式来检测复合物的存在，诸如通过Western印迹和ELISA规程，其用于测定极其广泛的组织和样品，包括血浆或血清。可利用多种使用此类测定法的免疫测定技术，参见例如美国专利第4,016,043号；第4,424,279号和第4,018,653号。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“三明治/夹心式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法也包括经标记抗体对靶抗原的直接结合。
三明治测定法是最有用且常用的测定法之一。三明治测定技术有许多变化形式，本发明意图涵盖所有这些变化形式。简言之，在一种典型的正向测定法(forward assay)中，将未标记的抗体固定化在固体基片上，使待测试的样品接触所结合的分子。温育足以容许抗体-抗原复合物形成的合适长度的一段时间后，添加对抗原特异性的、用能够生成可检测信号的报道分子标记的第二抗体并温育足以使另一复合物即抗体-抗原-经标记抗体形成的一段时间。洗去任何未反应的物质，并通过由报道分子生成的信号的观察结果来测定抗原的存在。结果可以是定性的，即通过可见信号的简单观察，或者可以量化，即通过与包含已知量的抗原的对照样品比较。
正向测定法的变化形式包括同时测定法，其中将样品和经标记抗体二者同时添加至所结合的抗体。这些技术是本领域技术人员所熟知的，包括任何显而易见的微小变化。在一种典型的正向三明治测定法中，将具有针对生物标志物的特异性的第一抗体或是共价的或是被动的结合至固体表面。所述固体表面典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。所述固体支持物可以是管、珠、微孔板的盘、或适于实施免疫测定法的任何其它表面的形式。结合过程是本领域众所周知的，一般由交联、共价结合或物理吸附组成，清洗聚合物-抗体复合物，为测试样品做好准备。将待测样品的等分试样添加至固相复合物，并在合适条件(例如室温至40℃，诸如25℃和32℃之间，含两端值)下温育足够时间(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)以容许抗体中存在的任何亚单位结合。温育期后，将抗体亚单位固相清洗并干燥并与对生物标志物的一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物结合的报道分子。
一种备选方法涉及将样品中的靶抗原固定化，然后将固定化的靶物暴露于未标记的或用报道分子标记的特异性抗体。根据靶物的量和报道分子信号的强度，所结合的靶物可以是通过用抗体直接标记而可检测的。或者，将经标记的、对第一抗体特异性的第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合物以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合物。该复合物通过报道分子发射的信号来检测。“报道分子”在用于本说明书时指通过其化学本质提供分析上可鉴定的信号从而容许检测抗原所结合抗体的分子。这类测定法中最常用的报道分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫测定法的情况中，有酶偶联至第二抗体，一般通过戊二醛或高碘酸盐或酯的手段。然而，正如易于领会的，有极其多种不同偶联技术可供技术人员使用。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。与特定酶一起使用的底物一般根据在被相应的酶水解后生成可检测的颜色变化来选择。合适的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也有可能采用荧光底物，其生成荧光产物而非上文所述显色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合物，容许结合，然后洗去过量的试剂。然后将含有适宜底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合物。底物与第二抗体所连接的酶起反应，给出定性可视信号，其可以进一步量化，通常通过分光光度法，以给出样品中存在的生物标志物量的指示。或者，可以将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)化学偶联至抗体而不改变其结合能力。在被特定波长的光照射而激活后，荧光团标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发状态，接着以光学显微镜在视觉上可检测的特征性颜色发光。在EIA中，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志物复合物。洗去未结合的试剂后，将剩余的三元复合物然后暴露于适宜波长的光。所观察到的荧光指示存在感兴趣的分子标志物。免疫荧光和EIA技术都是本领域已完善建立的。然而，也可以采用其它报道分子，诸如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。
本发明的方法进一步包括在组织或细胞样品中检验HER4 JM-a同等型mRNA的存在和/或表达的方案。用于评估细胞中的mRNA的方法是公知的，而且包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经标记核酸探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(诸如使用对HER4 JM-a同等型特异性的互补引物的RT-PCR，及其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。
可以使用Northern、点印迹或PCR分析对来自哺乳动物的组织或细胞样品方便地测定HER4 JM-a同等型mRNA。例如，RT-PCR测定法诸如定量PCR测定法是本领域公知的。此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中HER4 JM-a同等型mRNA的水平(例如通过同时检验“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。用于测定HER4 JM-a同等型mRNA的存在的具体方案记载于Junttila，T.T.，et al，Clin.Cancer Res.2003：9：5346-5357(19)。
本发明的这个方面的材料实施方案包括HER4 JM-a同等型引物和引物对，所述引物和引物对容许特异性扩增本发明的多核苷酸或其任何特定部分，而所述探针选择性或特异性杂交本发明的核酸分子或其任何部分。探针可以用可检测标记物标记，诸如例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此类探针和引物可用于检测样品中HER4 JM-a同等型多核苷酸的存在，及用作检测表达HER4 JM-a同等型多肽的细胞的手段。正如本领域技术人员会理解的，可以基于本文中所提供的序列制备多种不同引物和探针并有效用于扩增、克隆和/或测定HER4 JM-a同等型mRNA的存在和/或水平。
本发明的任选方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中mRNA(诸如HER4 JM-a同等型mRNA)的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将所述探针杂交至在固体支持物上固定化的核酸阵列。所述该阵列配置成阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将有可能在某些疾病状态中表达的基因选集在固体支持物上形成阵列。经标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在单一实验中评估数以千计基因的mRNA表达序型(expression profile)(参见例如2001年10月11日公布的WO 01/75166；参见例如美国专利5,700,637；5,445,934；和5,807,522；Lockart，Nature Biotechnology，14：1675-1680(1996)；Cheung，V.G.et al.，Nature Genetics 21(Suppl)：15-19(1999)，关于阵列制作的讨论)。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段或是在玻璃或其它基质上直接合成或是点到玻璃或其它基质上。单一阵列中通常呈现数以千计的基因。一个典型的微阵列实验涉及以下步骤：1)自分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物；2)将经标记的靶物杂交至微阵列；3)清洗，染色，和扫描阵列；4)分析扫描图像；并5)生成基因表达序型。当前使用两种主要类型的DNA微阵列：包含自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列和寡核苷酸(通常25-70聚物)阵列。在形成阵列时，寡核苷酸可以是预制并点到表面上的，或者是直接在表面上合成的(原位)。
Affymetrix
Figure BDA0000076110670000681
系统是包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列的商品化微阵列系统。探针/基因阵列：寡核苷酸(通常25聚物)通过组合基于半导体的光刻和固相化学合成技术直接合成到玻璃晶片上。每个阵列包含多至400,000种不同寡聚物，每种寡聚物以数以百万计拷贝存在。因为寡核苷酸探针是在阵列上已知位置合成的，所以杂交样式和信号强度可以通过Affymetrix Microarray Suite软件解读成基因身份和相对表达水平。每种基因通过一系列不同寡核苷酸探针呈现在阵列上。每个探针对由完全匹配寡核苷酸和错配寡核苷酸组成。完全匹配探针具有与特定基因精确互补的序列，因而测量该基因的表达。错配探针因中央碱基位置的单一碱基替代而不同于完全匹配探针，从而扰乱了靶基因转录物的结合。这有助于测定有助于对完全匹配寡聚物测得的信号的背景和非特异性杂交。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配探针的杂交强度中扣除，以确定每个探针集的绝对或特异强度。探针的选择基于Genbank和其它核苷酸库的当前信息。认为其序列识别基因3’末端的独特区域。使用基因芯片杂交炉(“电转烤炉”)来进行多至64个阵列的同时杂交。射流站实施探针阵列的清洗和染色。它是完全自动化的，包括四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由Microarray Suite软件使用预编程射流方案独立控制。扫描仪是共焦激光荧光扫描仪，其测量由结合至探针阵列的经标记cRNA发射的荧光强度。安装有Microarray Suite软件的计算机工作站控制射流站和扫描仪。Microarray Suite软件可以控制多至八个射流站，使用探针阵列的预编程的杂交、清洗、和染色方案。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜的算法将其转变成每种基因的有/无呼叫(presence/absence call)。最后，该软件通过比较分析来检测各实验间基因表达的变化，并将输出格式化为.txt文件，其可以与其它软件程序一起用于进一步的数据分析。
样品中HER4 JM-a同等型的表达还可以通过检验基因删除或基因扩增来评估。基因删除或扩增可以通过本领域已知的任一种或多种方案来测量，例如常规Southern印迹、Northern印迹(用以量化mRNA转录)(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交(例如FISH)，其中使用适当标记的探针、细胞发生法(cytogenetic method)或比较性基因组杂交(CGH)，其中使用适当标记的探针。例如，这些方法可用于检测HER4 JM-a同等型基因的删除或扩增。
组织或细胞样品中HER4 JM-a同等型的表达还可以通过基于功能或活性的测定法来检验。例如，HER4 JM-a同等型的表达可通过测定肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)处理对怀疑表达HER4 JM-a同等型的组织或细胞样品的影响来检测。
药物配制剂
本发明的治疗性抗体-药物偶联物(ADC)通常与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成单位剂量无菌可注射形式的药物配制剂供肠胃外施用，即快速灌注(bolus)、静脉内注射、肿瘤内注射。任选将具有所需纯度的抗体-药物偶联物(ADC)与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington：The Science and Practice of Pharmacy 21st edition(2005)ed.Univ.of the Sciences Philadelphia，Lippincott Williams & Wilkins)成冻干剂型或水溶液形式。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性药物成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington：TheScience and Practice of Pharmacy 21st edition(2005)ed.Univ.of the SciencesPhiladelphia，Lippincott Williams & Wilkins。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有ADC的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
制剂包括某些适合于上述给药途径的制剂。可以便利地将制剂制成单位剂型(unit dosage form)并且可以通过制药领域众所周知的任意方法制备。药物制备的各种技术和配制一般见于Pharmaceutical Preformulation andFormulation：A Practical Guide from Candidate Drug Selection to CommercialDosage Form.1st edition(August 1，2001)Ed Mark Gibson，US InformaHealthcare，Marcel Dekker，CRC Press(ISBN-10 1574911201)；Handbook ofPharmaceutical Excipients 5th edition(December 14，2005)Raymond C.Rowe，Paul J.Sheskey，and 
Figure BDA0000076110670000711
C.Owen APhA Publications(ISBN-10：1582120587)。
这类方法包括使活性组分与构成一种或多种辅助组分的载体混合(association)的步骤。一般而言，通过均匀和紧密混合活性组分与液体载体或细粉固体载体或它们两者，且然后，如果必要，使产物成形来制备产品。
本发明的含水混悬液含有活性物质与适合于制备含水混悬液的赋形剂的混合。这类赋形剂包括：悬浮剂，诸如羧甲基纤维素钠、交联羧甲纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；和分散剂或湿润剂，诸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、烯化氧与脂肪酸(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)的缩合产物、环氧乙烷与长链脂族醇(例如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇)的缩合产物、环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。含水混悬液还可以含有一种或多种防腐剂，诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种矫味剂；和一种或多种增甜剂，诸如蔗糖或糖精。
药物组合物可以为无菌可注射制剂形式，诸如无菌可注射含水或油混悬液。可以按照本领域公知的方法，使用上述那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制混悬液。无菌可注射制剂还可以为在无毒性非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，诸如在1，3-丁-二醇中的溶液或制备成冻干粉。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，可以便利地将无菌非挥发油(fixed oil)用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以使用任意温和的固定油(bland fixed oil)，包括合成的单酸甘油酯或二脂酰甘油酯类。此外，诸如油酸这类脂肪酸同样可以用于制备可注射制剂。
可以与载体物质合并而产生单剂型(single dosage form)的活性组分的量将根据所治疗宿主和特定给药方式的不同而改变。例如，指定用于静脉内输注的水溶液可以含有约3-500μg的活性组分/毫升溶液，以便可以以约30mL/小时的速率输注适当的体积。
适合于非肠道给药的制剂包括：含水和非水无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予所述制剂与预接受者的血液等渗的溶质；和含水和非水无菌混悬液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
尽管因在肠中水解或变性而不赞成使用蛋白质治疗剂的口服给药，但是可以将适合于口服给药的制剂制备成分散单位，诸如含有预定量抗体的胶囊、扁囊剂或片剂。
可以将制剂包装在单位制剂(unit dose)或多剂(multi-dose)容器内，例如密封的安瓿和小瓶内，并且可以将其在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，在使用前仅需要即刻添加无菌液体载体，例如水以便注射。由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射的溶液和混悬液。单位剂型为那些含有如上所述每日剂量或单位每日亚剂量(unit daily sub-dose)或其合适量一部分的活性组分的剂型。
本发明的组合物还可配制成免疫脂质体。脂质体是由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物递送药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688；Hwang等1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030；美国专利No.4,485,045；4,544,545；5,013,556；WO 1997/38731中所述。可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成脂质体。可以将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可以将本发明组合物的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联(Martin等1982 J.Biol.Chem.257：286-288)。任选在脂质体中包含化疗剂(Gabizon等1989 J.National Cancer Inst.81(19)：1484)。
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型和上文讨论的其它因素。这些通常是以与本文所用相同剂量和施用路径使用，或是本文所述剂量的大约1-99％，或是凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径。
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适宜剂量(在单独使用或联合一种或多种其它别的药剂时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将抗体施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量可以是约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，通常持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。如此，可对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂抗体)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周一剂约2mg/kg的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
理解的是，任何上述治疗方法可使用本发明的免疫偶联物代替或联合抗体来进行。
联合疗法
可以将本发明的抗体与第二种具有抗癌特性的化合物以药物组合配制剂的形式联合应用或作为联合疗法的给药方案联合应用。所述药物组合配制剂或给药方案中的第二种化合物可具有对组合中的抗体的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。
所述第二种化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对指定目的有效的量适当地联合存在。含有本发明抗体的药物组合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA插入剂、或DNA结合剂。
可以将其它治疗方案与依照本发明所鉴定的抗癌药联合施用。联合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用所述组合。联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。
此类组合疗法的实例包括与下述化疗剂的组合：Erlotinib(Genentech/OSI Pharm.)、Bortezomib(
Figure BDA0000076110670000742
Millenium Pharm.)、氟维司群(Fulvestrant)(
Figure BDA0000076110670000743
Astrazeneca)、Sutent(SU11248，Pfizer)、来曲唑(Letrozole)(
Figure BDA0000076110670000744
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Imatinibmesylate)(Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(Oxaliplatin)(
Figure BDA0000076110670000746
Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil))、亚叶酸(Leucovorin)、雷帕霉素(Rapamycin)(Sirolimus，
Figure BDA0000076110670000747
Wyeth)、Lapatinib(
Figure BDA0000076110670000748
GSK572016，GlaxoSmithKline)、Lonafarnib(SCH66336)、Sorafenib(BAY43-9006，Bayer Labs.)、和Gefitinib(
Figure BDA0000076110670000749
Astrazeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)；烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和
Figure BDA00000761106700007410
环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)、加利车霉素(calicheamicin)，加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、
Figure BDA0000076110670000751
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0000076110670000761
多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(
Figure BDA0000076110670000762
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白、纳米颗粒剂型帕利他赛(paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
Figure BDA0000076110670000763
多西他塞(doxetaxel)(
Figure BDA0000076110670000764
-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；
Figure BDA0000076110670000765
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
Figure BDA0000076110670000766
长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
此类组合疗法还包括：(i)起调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药，诸如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
Figure BDA0000076110670000771
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；(ii)抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure BDA0000076110670000773
醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、
Figure BDA0000076110670000774
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
Figure BDA0000076110670000775
伏罗唑(vorozole)、
Figure BDA0000076110670000776
来曲唑(letrozole)和
Figure BDA0000076110670000777
阿那曲唑(anastrozole)；(iii)抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)芳香酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂，诸如例如EGFR途径(EGFR、HER2、HER3、和HER4)的抑制剂；(vi)脂质激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；(viii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA0000076110670000778
核酶)和HER2表达抑制剂；(ix)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如
Figure BDA0000076110670000779
疫苗、疫苗和
Figure BDA00000761106700007711
疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA00000761106700007714
rmRH；(x)抗血管发生剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)(Genentech)；及(xi)任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗的制备和剂量给药方案还记载于Chemotherapy Service，(1992)Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，Md。
联合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或以组合的单位剂量配制剂(unit dosage formulation)形式同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在联合疗法中，一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。
制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述病症的物质的制品或“试剂盒”。所述的制品包含容器和在容器上或与其相连的标签或包装说明书。包装插页可以指通常包括在治疗用产品商品化包装中的说明书，它包含有关此类治疗用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告信息。合适的容器包括：例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包等，所述容器可以由各种材料，诸如玻璃或塑料形成。
在一个实施方案中，所述制品包括容器和装在该容器内的抗HER4抗体或其抗体-药物偶联物的配制剂。所述制品可进一步任选地包含贴在容器上的标签或包括在容器内的包装插页，其指出所述组合物用于肿瘤的治疗性处理或诊断性检测的用途。装有所述配制剂的容器有效存储和投递治疗剂，并且可以具有无菌存取口(例如容器可以为静脉用溶液袋或具有可刺入皮下注射针头的塞的小瓶)。标签或包装插页表示所述配制剂用于治疗选择的疾病，诸如癌症。或者或另外，所述制品可以进一步含有第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和使用者角度而言需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
材料保藏
以下材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)(ATCC)：
材料                  ATCC保藏号      保藏日
Her-4 1H10.1E5        PTA-9655        2008年12月11日
此保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存保藏的存活培养物30年。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且保证了依据35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特别要提及886OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。
本申请的受让人已同意，若保藏材料的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的另一份材料更换。所保藏材料的可获得性并不解释为对违反任何政府机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明并不限于所保藏构建物的范围，因为所保藏实施方案意图仅仅例示本发明的某些方面，而且功能上相当的任何构建物都在本发明的范围内。本文中的材料保藏并非承认本文中所包含的书面说明不足以能够实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，也不能解释为将权利要求的范围限制于它们所描述的具体例示。实际上，根据上面的描述，除了本文所显示和描述的，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
可以理解的是，根据本文中包含的教导，本发明的教导对特定问题或情形的应用会在本领域普通技术人员的能力之内。下文给出了本发明的产品的例子及它们的分离、使用、和制造的代表性工艺，但是不应解释为限制本发明。
在此通过述及明确收录本说明书中引用的所有专利和参考文献全文。
实施例
实施例1-材料和方法
抗HER4抗体。
根据HER4 DNA序列(30)来合成特定寡核苷酸。自MDA-MB-453细胞提取总细胞RNA并用作RT-PCR中的模板来生成人HER4胞外域(ECD)编码序列。
通过将1型单纯疱疹病毒糖蛋白D氨基酸1-52的编码序列连接至编码人HER4氨基酸26-640的序列来构建gDHER4ECD融合蛋白(61)。将gDHER4ECD cDNA插入基于巨细胞病毒的表达载体pRK5中。使用标准磷酸钙沉淀方案将此构建物瞬时转染入人胚肾293细胞中。
通过将抗gD单克隆5B6偶联至CNBR Sepharose(Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala Sweden)来制备亲和柱。将来自经gDHER4ECD转染的293细胞的上清液在ym30膜(Amicon，Beverly MA)上浓缩20-40倍并加载到亲和树脂上。用PBS清洗柱，并用100mM乙酸/500mM NaCl pH 2.4洗脱受体。将HER4 ECD缓冲液交换入PBS中并浓缩。通过OD280来测定蛋白质浓度。
将Balb/c小鼠在第0、1、2和3周在它们的后足垫中用RIBI MPL+TDM+CWS乳液(RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，MT)中的大约5ugHER4 ECD免疫。对经过免疫的小鼠通过ELISA测试抗体应答。将具有最高滴度的小鼠在第4周期间再给予RIBI中的5ug HER4 ECD。3天后，将来自腘和腹股沟淋巴结的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤系X63-Ag8.653通过Oi和Herzenberg，1980的规程使用50％聚乙二醇4000(Boehringer MannheimCorporation，Indianapolis，IN)融合。将融合的细胞以200,000个细胞每孔的密度放置在96孔组织培养板中，并在融合后1天开始使用HAT培养基补充(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的杂交瘤选择。第10天开始，对杂交瘤上清液使用放射性捕捉测定法筛选HER4特异性抗体的存在。通过有限稀释获得稳定抗体生成克隆，并在腹水中生成大量特异性单抗。在蛋白A-Sepharose柱(Fermentech，Inc.，Edinburgh，Scotland)上纯化抗体，并在PBS中无菌保存于4℃。
组织。
正常人心和肾的冷冻切片得自一名死于电击的4岁男孩。17对代表来自同一患者的人乳腺癌和组织学正常周围组织的快速冷冻组织样品由西班牙马德里西班牙国家癌症中心(CNIO)西班牙国家肿瘤库网络的Manolo M.Morente博士馈赠。所有组织样品的的使用获得了伦理审查委员会的批准，而且自所有研究受试者获得了知情同意书。
细胞培养。
表达EGFR、HER2或HER3(31)的COS-7、NIH 3T3-7d转染子和HEK293EBNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)细胞在DMEM中维持，而T-47D和MCF-7细胞在RPMI中维持，补充有10％FCS(Autogen Bioclear UK Ltd.，Wiltshire，UK)和1％L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液(Sigma-Aldrich)。
质粒构建物。
使用表达质粒pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2、pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2、pcDNA3.1IHER4JM-aCYT-2-HA和pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2-HA(26，32)在COS-7细胞中瞬时表达有或无羧基末端血凝素(HA)表位标签的HER4同等型。为了生成无激酶活性的HER4构建物，将pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2中的HER4的激酶域内的推定ATP结合位点使用定点诱变试剂盒(Stratagene)突变(K751R)以生成pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2-K751R。为了生成pcDNA3.1HER4ECD，使用5’-引物TTG GTA CCG CAC CAT GAA GCC GGCGAC AGG AC(SEQ ID NO：3)和3’-引物T TAT CTC GAG TTA GTG ATGGTG ATG GTG ATG TTG TGG TAA AGT GGA ATG(SEQ ID NO：4)通过PCR自全长pcDNA3.1HER4JM-aCYT-1(26)衍生HER4胞外域编码序列。5’-引物在HER4序列的起始密码子之前导入Kpn I限制性内切核酸酶识别序列和核糖体结合序列。3’-引物在HER4 JM-a的最后一个胞外氨基酸His647(23)之后导入六组氨酸编码序列、新的终止密码子和Xho I内切核酸酶识别序列。
转染。
使用FuGENE 6转染试剂(Roche，Mannheim，Germany)依照制造商的方案用0.5-1ug适宜质粒转染在24孔板(4x104)或6孔板(1.5x105)上铺板的细胞。
重组HER4胞外域的生成。
在含有150ug/ml潮霉素B(Roche)的培养基中选择经pcDNA3.1HER4ECD转染的HEK293EBNA细胞，并在克隆之后在75ug/ml潮霉素B存在下维持。自培养基回收可溶性胞外域之前，在含有0.5％FCS的的DMEM中培养细胞。通过固定化金属螯合亲和层析(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)通过逐步pH梯度自收集的培养液纯化带HIS标签的胞外域。
免疫沉淀和Western印迹分析。
为了研究单克隆抗HER4抗体的同等型特异性，用pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2、pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2、或pcDNA3.1载体瞬时转染COS-7细胞。24小时后，将细胞用冰冷的PBS清洗，在溶胞缓冲液(1％Triton X-100，10mM Tris-HCL(pH 7.4)，1mM EDTA，2mM苯甲磺酰氯，10ug/ml抑肽酶，10ug/ml亮肽素，1mM正钒酸钠，10mM氟化钠，和10mM磷酸钠)中溶胞，并离心。将上清液在有或无二硫苏糖醇(DTT)的样品缓冲液中于95℃煮沸5分钟或不这样处理，并通过SDS-PAGE和Western印迹来分析，如先前所述(21)。使用下述一抗通过Western印迹在非还原性条件下分析NIH 3T3-7d转染子中的ErbB表达：抗EGFR(sc-03)，抗HER2(sc-284)，抗HER3(sc-285)(都来自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，和单抗1479。
为了乳腺组织中HER4蛋白的Western分析，切出冷冻组织块的80um切片，匀浆，并在摇床上在溶胞缓冲液中于4℃溶胞过夜。通过Western印迹在非还原性条件下分析与50ug总蛋白质相当的溶胞物等分试样。
为了研究单抗1479对HER4磷酸化的影响，将MCF-7和T-47D细胞在没有血清的RPMI中饥饿过夜，用1ug/ml单抗1479处理1小时或不这样处理，之后用50ng/ml神经调节蛋白-1(NRG-1；R&D，Minneapolis，MN)刺激30分钟。用抗HER4抗体(HFR-1)免疫沉淀与1mg总蛋白质相当的细胞溶胞物，在SDS-PAGE凝胶中分开，并使用抗磷酸酪氨酸抗体(4G10；UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)通过Western印迹来分析。
为了研究HER4遍在蛋白化，用编码全长JM-a CYT-1或JM-a CYT-2的质粒连同带Flag标签的遍在蛋白质(Katz et al.2002)瞬时转染COS-7细胞，并通过HER4免疫沉淀继以抗Flag Western印迹来分析，如先前所述(32)。在分析之前，将细胞用2ug/ml单抗1479处理1小时或不这样处理。
免疫荧光染色。
在盖玻片上培养COS-7细胞，并用pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2-HA、pcDNA3.1HER4JM-bCYT-2-HA、或pcDNA3.1载体对照转染。转染后24小时，用甲醇固定细胞，用1∶100稀释的抗HER4(HFR-1；Neomarkers，Fremont，CA)或抗HA(Roche)染色，接着与1∶250稀释的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠或AlexaFluor 568山羊抗大鼠(都来自Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)一起温育。用Vectashield封固介质(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)封固盖玻片。所有图像用Olympus BX60(Olympus，Hamburg，Germany)荧光显微镜获得。
免疫组织化学。
使用20ug/ml一抗单抗1479、抗HER4(HFR-1)、抗CD44(Hermes-3；由芬兰土尔库的土尔库大学的Sirpa Jalkanen博士馈赠)、或一种识别鸡T细胞抗原的抗体(3g6；由Sirpa Jalkanen博士馈赠)，及二抗Alexa Fluor 488山羊抗小鼠(1∶200)或HRP偶联山羊抗小鼠(1∶100；Santa Cruz Biotechnology)对冷冻切片(5uM)染色。为了过氧化物酶染色，用DAB过氧化物酶底物(Vector Laboratories)依照制造商的指令处理切片，接着用苏木精染色。为了免疫荧光染色，用25mg/ml 1，4-二氮双环[2.2.2.]辛烷(Sigma-Aldrich)处理切片以防止光漂白。用mowiol(Calbiochem)封固所有载玻片并用OlympusBX60荧光显微镜显现。
体外结合测定法。
将重组带HIS标签的HER4胞外域(2ug)在有或无0.5ug单抗1479或3g6下温育。在非还原性条件下用抗五HIS抗体(Molecular Probes)通过Western印迹显现胞外域和其它蛋白质之间的复合物形成。
对HER4切割的分析。
为了研究单抗1479对HER4切割的影响，将T-47D细胞在无血清下饥饿2小时，并用1μg/ml单抗1479处理1小时，之后用100ng/ml佛波醇13-肉豆蔻酸酯12-乙酸酯(PMA；Sigma-Aldrich)(23，33)刺激切割。
为了研究单抗1479对基础HER4胞外域脱落入培养液中的影响，将瞬时表达HER4 JM-a CYT-2的COS-7用1ug/ml单抗1479或1475处理24小时或不这样处理。用抗HER4抗体单抗1464通过Western印迹对60ul自细胞培养皿直接收集的培养液样品分析胞外域脱落。
HER4内化。
在盖玻片上培养COS-7细胞，并用pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2或无激酶活性的pcDNA3.1HER4JM-aCYT-2K751R(32)和Rab5a-GFP(34)转染。转染后24小时，将细胞用1ug/ml单抗1479处理5分钟或2小时。用甲醇固定细胞，并用Alexa Fluor 568山羊抗小鼠染色。用Vectashield封固介质封固盖玻片。用LSM 510 Meta共焦显微镜(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)获得图像。
MTS增殖测定法。
将T-47D和MCF-7细胞饥饿过夜，并在含有5％经活性炭精制的FCS和1ug/ml单抗1479或10ug/ml 2C4(Genentech Inc.，South San Francisco，CA)的RPMI中在96孔板上分配(1.5x104/孔)。在所示时间点用CellTiter
Figure BDA0000076110670000841
非放射性细胞增殖测定法(Promega，Madison，WI)遵循制造商的指令评估存活细胞数目。
不依赖锚定的生长测定法。
将由2ml RPMI，0.5％Bacto琼脂，和10％FCS组成的底层应用到6孔板上。底层凝固后，在上面应用由有或无1ug/ml单抗1479的1.2ml RPMI，0.33％Bacto琼脂，和10％FCS中的30,000个细胞/孔组成的顶层。所有样品准备一式三份。将细胞于37℃温育14天。在显微镜下对大于8个细胞的集落计数。
统计分析。
使用Student氏t检验来进行MTS和软琼脂测定法不同时间点的统计分析。分析包括五项独立的MTS和三项独立的软琼脂实验。用Wilcoxon符号秩检验使用匹配的肿瘤/正常组织对比较肿瘤对正常组织中全长HER4和HER4胞外域的数量。
实施例2-单抗1479选择性识别HER4的可蛋白水解切割的JM-a同等型。
对29个分泌针对HER4胞外域的抗体的杂交瘤克隆筛选对HER4同等型的选择性识别(图2)。单克隆抗体的同种型测定使用来自Zymed(Zymed，So.San Francisco，CA)的小鼠单抗ID/SP同种型测定试剂盒依照制造商的指令进行。表位作图通过交叉阻断ELISA来实施。将HER4单抗基于它们与无关单抗对照相比将另一HER4单抗的结合阻断50％或更多的能力来对表位分组。在ELISA中通过测试生物素化HER4单抗识别ELISA板上以1μg/ml的浓度包被的HER2(aa 1-645)、HER3(aa 1-617)和HER4(aa 1-640)胞外域(Genentech，Inc.)的能力来测定HER4单抗的特异性。
分析了瞬时表达具有可变胞外近膜域(JM-a CYT-2或JM-b CYT-2)的HER4同等型的COS-7细胞。Western分析在三种条件中进行，代表不同程度的蛋白质变性(图3)。在SDS-PAGE之前，图3第1-3道中的样品在没有DTT的样品缓冲液中于室温溶解(非还原)；第4-6道中的样品在没有DTT的样品缓冲液中溶解但于95℃加热5分钟(非还原，95℃)；而第7-9道中的样品在含有DTT的样品缓冲液中溶解并于95℃加热5分钟(还原)。使用针对HER4的羧基末端(sc-283和HFR-1)或针对HA-tag(抗HA)的抗体作为转染效率的对照。
在Western印迹中，用作一抗时，抗体之一，即单抗1479识别JM-a同等型，但非JM-b同等型(图3)。HER4-特异性信号当样品在分析前煮沸时强度减弱，而且当样品煮沸并经历DTT还原性条件时完全消除。这指示单抗1479抗体只识别天然构象。在非还原性条件下，HER4表现为150kD的条带，接近自cDNA推导的144kD的预期大小(30)，而在还原性条件下为180kD的条带(比较图3底部小图第1对7道)。单抗1479对JM-a同等型的特异性通过瞬时表达带HA标签的HER4同等型的COS-7细胞的免疫荧光染色得到了证实。单抗1479再次唯独识别JM-a转染子表面上的表位。
因为ErbB受体家族成员是同源的，所以使用稳定表达不同ErbB受体的NIH 3T3-7d和NR6转染子通过Western印迹评估了单抗1479与其它ErbB受体的交叉反应性(31)。单抗1479对HER4(JM-a CYT-2)给出强信号，在来自过表达EGFR的细胞的Western分析中有微弱的条带(图4)。在图4中，使用抗EGFR(sc-03)、抗HER2(sc-284)、抗HER3(sc-285)或单抗1479作为一抗通过Western印迹分析了亲本(第2道)或经过转染的(第1和3道)表达不同ErbB受体的NIH 3T3-7d和NR6(第4道)细胞。亲本NIH 3T3-7d和NR6细胞表达内源HER2，这用抗HER2在所有分析的转染子中都检测到了。
使用基于细胞的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来进一步测定单抗1479的交叉反应性。单抗1479以及阳性对照抗HER4抗体(sc-283)清楚地结合表达HER4(JM-a CYT-2)的NR6转染子，甚至在测试的最低抗体浓度(1∶1000，1.25ug/ml单抗1479；0.2ug/ml sc-283)(图5)时也如此。然而，对表达EGFR、HER2、或HER3或HER4的JM-b CYT-1同等型的NIH 3T3-7d细胞没有观察到单抗1479的结合，甚至在测试的最高抗体浓度(1∶100，12.5ug/ml)时也如此，而对照抗体抗EGFR(sc-03)、抗HER2(sc-284)、抗HER3(sc-285)、和抗HER4(sc-283)表现出结合(1∶100，2ug/ml)(图5)。这些数据指示单抗1479是对HER4的JM-a同等型特异性的。
实施例3-单抗1479识别HER4的脱落胞外域。
为了解决单抗1479是否可用于在体内选择性分析HER4 JM-a同等型表达，通过免疫荧光染色来评估人肾和心的冷冻切片。选择这两种组织类型是因为它们显示出专门表达JM-a(肾)或JM-b(心)同等型任一(23)。正如基于实施例2中讨论的体外特异性所预期的，单抗1479特异性染色肾但不染色心组织。针对HER4羧基末端的阳性对照抗体(HFR-1)染色两种组织，而且在使用针对鸡T细胞蛋白的阴性对照抗体(3g6)时没有观察到免疫染色。使用针对膜锚定的CD44蛋白的抗体来显现细胞膜隔室。对单抗1479观察到的染色样式与对HFR-1观察到的不同。这可通过它们识别的不同表位来解释，但是更有可能的是在肾组织中HER4分子遭到切割且其胞外域脱落的事实，正如HER4 ICD在肾小球细胞的核中的定位所提示的。同样支持体内肾组织中的HER4切割的是，对肾组织溶胞物的Western分析证明了单抗1479识别两条主带(图6)。一条在与非还原性条件下全长ErbB的大小对应的150kD处(比较图6第1道对图3第1道)，而更突出的另一条在与重组HER4胞外域的大小对应的100kD处迁移(图6第1道对第2道)。在约200kDa处迁移的第三条带在大小上与有重组胞外域的道中的弱带相似，而且代表胞外域二聚体。
为了更直接地证明单抗1479能识别HER4的可溶性胞外域，用重组HER4胞外域和单抗1479进行了体外结合测定法。当胞外域和抗体一起温育时，它们形成在Western分析中检测到的250kDa的复合物(图7)。在此测定法中，将带HIS标签的重组HER4胞外域(2g)与0.5ug单抗1479或阴性对照抗体3g6一起温育15分钟，并使用抗HIS抗体在非还原性条件下通过Western分析来显现蛋白质复合物的形成。在图7中，看到以100kDa的大小迁移的游离胞外域，150kDa处的游离抗体和250kDa处由胞外域结合抗体形成的复合物。
单独的神经调节蛋白-1也表现出结合重组HER4胞外域，证实了用于实验的重组胞外域是有功能性的。此外，用微孔板固定化的带HIS标签的HER4胞外域(100ng)进行的ELISA对与单抗1479(浓度范围0.195至100nM)的相互作用给出0.85nM+/-0.077的Kd值(图8)。这些观察结果证明了单抗1479以相对较高的亲和力结合HER4胞外域。
实施例4-HER4胞外域脱落在体内在乳腺癌中增强。
可切割JM-a同等型以及能够切割HER4的TACE酶在体内在乳腺肿瘤组织中过表达(29)，而且羧基末端HER4表位在乳腺癌组织中比在组织学正常乳腺上皮中要更频繁地定位至核(35)。此外，HER4免疫反应性的核定位在与细胞表面免疫反应性相比时与不利存活有关联(29)。这些发现暗示HER4切割和胞外域脱落在乳腺癌中与正常乳腺组织相比增强，而且切割具有生物学意义。为了调查组织学正常乳腺组织转化成乳腺癌是否与增强的HER4胞外域脱落有关联，用单抗1479通过Western印迹分析了17对匹配的正常乳腺/乳腺癌组织(图9)。样品对由来自乳腺癌患者(自其可获得癌症组织和组织学正常邻近组织二者)的冷冻组织材料组成。将在非还原性条件下生成的Western数据为代表全长HER4的150kD信号和代表可溶性胞外域的100kD信号的强度打分。17份肿瘤样品中有9份(53％)与匹配的正常组织对相比时表现出升高的总HER4表达。只有1份肿瘤样品(1/17；6％)没有可检测的HER4表达，相反，6份正常乳腺组织样品(6/17；35％)没有可检测的HER4。使用相同样品对用单抗1479通过免疫组织化学也获得了癌症对正常组织中增强的HER4蛋白表达的相似发现。
有趣的是，在12份(12/16；75％)HER4阳性肿瘤样品中中，但是只在2份HER4阳性正常乳腺组织样品(2/11；18％)中观察到HER4胞外域的信号。当通过密度测定对150kD全长受体和100kD胞外域的Western信号量化时，肿瘤组织表达与正常组织相比显著更多的HER4胞外域(P＝0.015)(图10)。然而，全长HER4表达的差异没有达到统计学显著性(P＝0.33)。检测到的100kD胞外域的量也与同一样品中HER4的总量(100kD+150kD)无关(P＝0.15)。这些数据提示癌症组织中胞外域数量的上调不是生成更多蛋白质的简单后果。此外，在两名在正常和癌症组织中表现出相似全长HER4水平的患者(1号和3号患者)中，两人都只在肿瘤样品中表现出可溶性胞外域的存在。总之，这些数据指示HER4胞外域的脱落在乳腺癌进展期间增强，而且单抗1479可用于检测人肿瘤组织脱落的HER4胞外域。
实施例5-单抗1479遏制HER4磷酸化和切割。
为了分析单抗1479结合对HER4功能的后果，测量天然表达JM-a同等型的MCF-7乳腺癌细胞(26)中的HER4磷酸化。将MCF-7细胞用0、1、或10ug/ml单抗1479刺激1、2、或3小时，之后用50ng/ml神经调节蛋白-1(NRG-1)刺激15分钟，并使用针对HER4 pTyr1284的磷酸特异性抗体分析HER4酪氨酸磷酸化。将膜用抗HER4(Abcam)和抗肌动蛋白再印迹。单抗1479显著遏制NRG-1刺激的HER4磷酸化(图11A)。
由于HER4活化可能还调节HER4切割(36)，评估了单抗对基础和佛波醇13-肉豆蔻酸酯12-乙酸酯(PMA)刺激的HER4切割的影响。用1g/ml单抗1479或对照抗体单抗1475刺激细胞24小时后，用抗HER4抗体单抗1464通过Western印迹分析100kDa HER4胞外域脱落入表达HER4 JM-a CYT-2的COS-7转染子的培养液中。用抗HER4(Abcam)和抗肌动蛋白(图11B)通过Western印迹分析来自同一实验的总细胞溶胞物。
与未处理或用识别不同HER4表位的单抗1475处理的细胞相比，用单抗1479处理显著降低脱落入COS-7转染子的培养液中的可溶性110kDa HER4胞外域的量(图11B)。这些数据指示单抗1479阻断HER4JM-a同等型的酪氨酸磷酸化和切割。
实施例6-单抗1479通过依赖HER4但不依赖HER4激酶活性的机制被有效内化。
抗HER2抗体对肿瘤生长的抑制显示出与单抗诱导胞吞的内在能力有关联(37)。观察到单抗1479变得自表达HER4的细胞的培养液被快速消减，但载体对照细胞的培养液不然。为了解决这是否是由于HER4介导的单抗内化，用单抗1479处理瞬时表达HER4 JM-a的COS-7细胞，并通过共焦显微术来分析以显现抗体的亚细胞定位。温育5分钟后，主要在细胞表面上检测到单抗1479。然而，在2小时里，抗体被内化至胞质溶胶且与带绿色荧光蛋白(GFP)标签的Rab5(一种早期细胞内囊泡标志物)部分共定位。在表达JM-b同等型的细胞中没有观察到单抗1479的胞质定位。虽然依赖于HER4表达，单抗1479的内化不需要HER4激酶活性，因为在分析瞬时表达无激酶活性的HER4JM-a构建物(K751R)的COS-7细胞时单抗1479也被有效内化。
单抗1479还增强HER4的可切割JM-a同等型的遍在蛋白化，指示单抗1479可积极刺激ErB4胞吞入降解囊泡，如图12所示。图12的测定法是使用瞬时表达JM-a CYT-1或JM-a CYT-2连同带Flag标签的遍在蛋白质的COS-7细胞实施的。将细胞用2ug/ml单抗1479处理0、10、30、或120分钟，并用HFR-1通过抗HER4免疫沉淀接着用抗Flag抗体通过Western印迹分析HER4遍在蛋白化。加载HER4蛋白以用抗HER4(Abcam)抗体再印迹为对照。
有人提出Cetuximab通过促进EGFR下调来遏制肿瘤生长(38)。为了解决单抗1479有效内化入表达HER4的细胞是否与刺激HER4下调有关联，将表达中等水平内源HER4的MCF-7细胞在1μg/ml单抗1479存在下培养至72小时，并通过Western印迹来分析全长HER4的总水平(图13)。用抗HER4(Abcam)抗体通过Western印迹来分析稳态HER4蛋白表达水平，而且加载以抗肌动蛋白为对照。用单抗1479处理显著降低HER4稳态水平，但对照抗体3g6(1ug/ml)不然。早在2小时时间点就看到了影响，而且该影响在实验的72小时持续。
实施例7-单抗1479遏制乳腺癌细胞的增殖和集落形式。
为了研究单抗1479对乳腺癌细胞生长的影响，用人乳腺癌细胞系进行测量存活细胞的量的MTS测定法。单抗1479显著遏制T-47D(P＝0.0014)和MCF-7(P＝0.047)细胞的增殖(图14)。在此测定法中，将细胞系用1μg/ml单抗1479或阳性对照抗体2C4(Genentech)处理所示时间段。通过MTS测定法来评估存活细胞的数目。抗体在7天时间点显著降低存活细胞的数目(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；Student氏t检验，一式三份进行的五项独立实验)。与阻断HER2与其它HER受体异二聚化的抗HER2抗体2C4(Genentech)(39)相比，对单抗1479看到的影响与其相似或更强。
单抗1479在软琼脂集落形成测定法中显著遏制T-47D(P＜0.001)和MCF-7(P＝0.043)细胞二者不依赖锚定的生长(图15)。自10个显微镜视野每项进行三次的实验计算14天时间点时大小超过8个细胞每个x 20视野的集落。与对照抗体3g6相比，单抗1479处理显著减少14天时间点时的集落数目(**P＜0.01；***P＜0.001；Student氏t检验，一式三份进行的三项独立实验)。均值和标准偏差显示于图15。
参考文献
1.Yarden Y，Sliwkowski MX.Untangling the ErbB signalling network.Nat Rev Mol Cell Biol2001；2(2)：127-37.
2.Hynes NE，Lane HA.ERBB receptors and cancer：the complexity of targeted inhibitors.Nat RevCancer 2005；5(5)：341-54.
3.Mendelsohn J，Baselga J.The EGF receptor family as targets for cancer therapy.Oncogene2000；19(56)：6550-65.
4.Slamon DJ，Clark GM，Wong SG，Levin WJ，Ullrich A，McGuire WL.Human breast cancer：correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene.Science1987；235(4785)：177-82.
5.Graham J，Muhsin M，Kirkpatrick P.Cetuximab.Nat Rev Drug Discov 2004；3(7)：549-50.
6.Sarup JC，Johnson RM，King KL，et al.Characterization of an anti-p185 HER2 monoclonalantibody that stimulates receptor function and inhibits tumor cell growth.Growth Regul 1991；1(2)：72-82.
7.Austin CD，De Maziere AM，Pisacane PI，et al.Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site ofaction of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin.Mol Biol Cell 2004；15(12)：5268-82.
8.Molina MA，Codony-Servat J，Albanell J，Rojo F，Arribas J，Baselga J.Trastuzumab(herceptin)，ahumanized anti-Her2 receptor monoclonal antibody，inhibits basal and activated Her2 ectodomaincleavage in breast cancer cells.Cancer Res 2001；61(12)：4744-9.
9.Clynes RA，Towers TL，Presta LG，Ravetch JV.Inhibitory Fc receptors modulate in vivocytoxicity against tumor targets.Nat Med 2000；6(4)：443-6.
10.Srinivasan R，Poulsom R，Hurst HC，Gullick WJ.Expression of the c-erbB-4/HER4 protein andmRNA in normal human fetal and adult tissues and in a survey of nine solid tumour types.J Pathol1998；185(3)：236-45.
11.Witton CJ，Reeves JR，Going JJ，Cooke TG，Bartlett JM.Expression of the HER1-4 family ofreceptor tyrosine kinases in breast cancer.J Pathol 2003；200(3)：290-7.
12.Haugen DR，Akslen LA，Varhaug JE，Lillehaug JR.Expression of c-erbB-3 and c-erbB-4 proteinsin papillary thyroid carcinomas.Cancer Res 1996；56(6)：1184-8.
13.Furger C，Fiddes RJ，Quinn DI，Bova RJ，Daly RJ，Sutherland RL.Granulosa cell tumors expressHER4 and are sensitive to the cytotoxic action of heregulin-beta2/PE40.Cancer Res 1998；58(9)：1773-8.
14.Srinivasan R，Benton E，McCormick F，Thomas H，Gullick WJ.Expression of the c-erbB-3/HER-3and c-erbB-4/HER-4 growth factor receptors and their ligands，neuregulin-l alpha，neuregulin-l beta，and betacellulin，in normal endometrium and endometrial cancer.Clin Cancer Res 1999；5(10)：2877-83.
15.Gilbertson RJ，Perry RH，Kelly PJ，Pearson AD，Lunec J.Prognostic significance of HER2 andHER4 coexpression in childhood medulloblastoma.Cancer Res 1997；57(15)：3272-80.
16.Gilbertson RJ，Bentley L，Hernan R，et al.ERBB receptor signaling promotes ependymoma cellproliferation and represents a potential novel therapeutic target for this disease.Clin Cancer Res2002；8(10)：3054-64.
17.Gullick WJ.c-erbB-4/HER4：friend or foe？J Pathol 2003；200(3)：279-81.
18.Junttila TT，Sundvall M，Maatta JA，Elenius K.ErbB4 and its isoforms：selective regulation ofgrowth factor responses by naturally occurring receptor variants.Trends Cardiovasc Med2000；10(7)：304-10.
19.Junttila TT，Laato M，Vahlberg T，et al.Identification of patients with transitional cell carcinoma ofthe bladder overexpressing ErbB2，ErbB3，or specific ErbB4 isoforms：real-time reverse
transcription-PCR analysis in estimation of ErbB receptor status from cancer patients.Clin Cancer Res2003；9(14)：5346-57.
20.Elenius K，Choi CJ，Paul S，Santiestevan E，Nishi E，Klagsbrun M.Characterization of a naturallyoccurring ErbB4 isoform that does not bind or activate phosphatidyl inositol 3-kinase.Oncogene1999；18(16)：2607-15.
21.Kainulainen V，Sundvall M，Maatta JA，Santiestevan E，Klagsbrun M，Elenius K.A natural ErbB4isoform that does not activate phosphoinositide 3-kinase mediates proliferation but not survival orchemotaxis.J Biol Chem 2000；275(12)：8641-9.
22.Rio C，Buxbaum JD，Peschon JJ，Corfas G.Tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme isrequired for cleavage of erbB4/HER4.J Biol Chem 2000；275(14)：10379-87.
23.Elenius K，Corfas G，Paul S，et al.A novel juxtamembrane domain isoform of HER4/ErbB4.Isoform-specific tissue distribution and differential processing in response to phorbol ester.J Biol Chem1997；272(42)：26761-8.
24.Lee HJ，Jung KM，Huang YZ，et al.Presenilin-dependent gamma-secretase-like intramembranecleavage of ErbB4.J Biol Chem 2002；277(8)：6318-23.
25.Komuro A，Nagai M，Navin NE，Sudol M.WW domain-containing protein YAP associates withErbB-4 and acts as a co-transcriptional activator for the carboxyl-terminal fragment of ErbB-4 thattranslocates to the nucleus.J Biol Chem 2003；278(35)：33334-41.
26.
Figure BDA0000076110670000911
JA，Sundvall M，Junttila TT，et al.Proteolytic cleavage and phosphorylation of atumor-associated ErbB4 isoform promote ligand-independent survival and cancer cell growth.Mol BiolCell 2006；17(1)：67-79.
27.Ni CY，Murphy MP，Golde TE，Carpenter G.gamma-Secretase cleavage and nuclear localizationof ErbB-4 receptor tyrosine kinase.Science 2001；294(5549)：2179-81.
28.Schlessinger J，Lemmon MA.Nuclear signaling by receptor tyrosine kinases：the first robin ofspring.Cell 2006；127(1)：45-8.
29.Junttila TT，Sundvall M，Lundin M，et al.Cleavable ErbB4 isoform in estrogen receptor-regulatedgrowth of breast cancer cells.Cancer Res 2005；65(4)：1384-93.
30.Plowman GD，Culouscou JM，Whitney GS，et al.Ligand-specific activation of HER4/p180HER4，a fourth member of the epidermal growth factor receptor family.Proc Natl Acad Sci U S A1993；90(5)：1746-50.
31.Zhang K，Sun J，Liu N，et al.Transformation of NIH 3T3 cells by HER3 or HER4 receptorsrequires the presence of HER1 or HER2.J Biol Chem 1996；271(7)：3884-90.
32.Sundvall M，Peri L，Maatta JA，et al.Differential nuclear localization and kinase activity ofalternative ErbB4 intracellular domains.Oncogene 2007.
33.Vecchi M，Baulida J，Carpenter G.Selective cleavage of the heregulin receptor ErbB-4 by proteinkinase C activation.J Biol Chem 1996；271(31)：18989-95.
34.Gomes AQ，Ali BR，Ramalho JS，et al.Membrane targeting of Rab GTPases is influenced by theprenylation motif.Mol Biol Cell 2003；14(5)：1882-99.
35.Srinivasan R，Gillett CE，Barnes DM，Gullick WJ.Nuclear expression of the c-erbB-4/HER-4growth factor receptor in invasive breast cancers.Cancer Res 2000；60(6)：1483-7.
36.Cheng QC，Tikhomirov O，Zhou W，Carpenter G.Ectodomain cleavage of ErbB-4：characterization of the cleavage site and m80 fragment.J Biol Chem 2003；278(40)：3842 1-7.
37.Hurwitz E，Stancovski I，Sela M，Yarden Y.Suppression and promotion of tumor growth bymonoclonal antibodies to ErbB-2 differentially correlate with cellular uptake.Proc Natl Acad Sci U S A1995；92(8)：3353-7.
38.Sunada H，Magun BE，Mendelsohn J，MacLeod CL.Monoclonal antibody against epidermalgrowth factor receptoris internalized without stimulating receptor phosphorylation.Proc Natl Acad Sci US A 1986；83(11)：3825-9.
39.Franklin MC，Carey KD，Vajdos FF，Leahy DJ，de Vos AM，Sliwkowski MX.Insights into ErbBsignaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex.Cancer Cell 2004；5(4)：317-28.
40.Barnes NL，Khavari S，Boland GP，Cramer A，Knox WF，Bundred NJ.Absence of HER4expression predicts recurrence of ductal carcinoma in situ of the breast.Clin Cancer Res2005；11(6)：2163-8.
41.Suo Z，Risberg B，Kalsson MG，et a1.EGFR family expression in breast carcinomas.c-erbB-2 andc-erbB-4 receptors have different effects on survival.J Pathol 2002；196(1)：17-25.
42.Bieche I，Onody P，Tozlu S，Driouch K，Vidaud M，Lidereau R.Prognostic value of ERBB familymRNA expression in breast carcinomas.Int J Cancer 2003；106(5)：758-65.
43.Lodge AJ，Anderson JJ，Gullick WJ，Haugk B，Leonard RC，Angus B.Type 1 growth factorreceptor expression in node positive breast cancer：adverse prognostic significance of c-erbB-4.J ClinPathol 2003；56(4)：300-4.
44.Muraoka-Cook RS，Sandahl M，Husted C，et al.The intracellular domain of ErbB4 inducesdifferentiation of mammary epithelial cells.Mol Biol Cell 2006；17(9)：4118-29.
45.Stern DF.ErbBs in mammary development.Exp Cell Res 2003；284(1)：89-98.
46.Tang CK，Concepcion XZ，Milan M，Gong X，Montgomery E，Lippman ME.Ribozyme-mediateddown-regulation of ErbB-4 in estrogen receptor-positive breast cancer cells inhibits proliferation both invitro and in vivo.Cancer Res 1999；59(20)：5315-22.
47.Zhu Y，Sullivan LL，Nair SS，et al.Coregulation of Estrogen Receptor by ErbB4/HER4 Establishesa Growth-Promoting Autocrine Signal in Breast Tumor Cells.Cancer Res 2006；66(16)：7991-8.
48.Prewett M，Rothman M，Waksal H，Feldman M，Bander NH，Hicklin DJ.Mouse-human chimericanti-epidermal growth factor receptor antibody C225 inhibits the growth of human renal cell carcinomaxenografts in nude mice.Clin Cancer Res 1998；4(12)：2957-66.
49.Agus DB，Akita RW，Fox WD，et al.Targeting ligand-activated ErbB2 signaling inhibits breastand prostate tumor growth.Cancer Cell 2002；2(2)：127-37.
50.Cho HS，Mason K，Ramyar KX，et al.Structure of the extracellular region of HER2 alone and incomplex with the Herceptin Fab.Nature 2003；421(6924)：756-60.
51.Baulida J，Kraus MH，Alimandi M，Di Fiore PP，Carpenter G.All ErbB receptors other than theepidermal growth factor receptor are endocytosis impaired.J Biol Chem 1996；271(9)：5251-7.
52.Liu Y，Tao YM，Woo RS，Xiong WC，Mei L.Stimulated ErbB4 internalization is necessary forneuregulin signaling in neurons.Biochem Biophys Res Commun 2007；354(2)：505-10.
53.Cuello M，Ettenberg SA，Clark AS，et al.Down-regulation of the erbB-2 receptor by trastuzumab(herceptin)enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated apoptosis inbreast and ovarian cancer cell lines that overexpress erbB-2.Cancer Res 2001；61(12)：4892-900.
54.Klapper LN，Waterman H，Sela M，Yarden Y.Tumor-inhibitory antibodies to HER-2/ErbB-2 mayact by recruiting c-Cbl and enhancing ubiquitination of HER-2.Cancer Res 2000；60(13)：3384-8.
55.Carter P.Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies.Nat Rev Cancer2001；1(2)：118-29.
56.Gilmore JL，Riese DJ，2nd.secErbB4-26/549 antagonizes ligand-induced HER4 tyrosinephosphorylation.Oncol Res 2004；14(11-12)：589-602.
57.Bao J，Wolpowitz D，Role LW，Talmage DA.Back signaling by the Nrg-1 intracellular domain.JCell Biol 2003；161(6)：1133-41.
58.Iivanainen E，Paatero I，Heikkinen SM，et al.Intra-and extracellular signaling by endothelialneuregulin-1.Exp Cell Res 2007.
59.Borrell-Pages M，Rojo F，Albanell J，Baselga J，Arribas J.TACE is required for the activation ofthe EGFR by TGF-alpha in tumors.Embo J 2003；22(5)：1114-24.
60.Gilmour LM，Macleod KG，McCaig A，Gullick WJ，Smyth JF，Langdon SP.Expression oferbB-4/HER-4 growth factor receptor isoforms in ovarian cancer.Cancer Res 2001；61(5)：2169-76.
61.Paborsky LR，et al.，Mammalian Cell Transient Expression of Tissue Factor for Production ofAntigen.Protein Eng.1990；3(6)：547-53.
62.Chu，T.F.，et al.，Cardiotoxicity associated with tyrosine kinase inhibitor sunitinib.Lancet 2007；370(9604)：2011-2019.
63.Force，T.and Kerkela，R.，Cardiotoxicity of the new cancer therapeutics-mechanisms of，andapproaches to，the problem.Drug Discov Today 2008：13(17-18)：778-784.
64.Yeh，E.T.H.，and Bickford，C.L.，Cardiovascular Complications of Cancer Therapy.J.Am.Coll.Cardio.2009：53(24)：2231-2247.
65.Ding，L.，et al，Somatic Mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.Nature2008：455：1069-1075.
66.Prickett，T.D.，et al.，Analysis of the tyrosine kinome in melanoma reveals recurrent mutations inERBB4.Nature Genetics 2009：41：1127-1132(2009).

Claims (35)

1.一种分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的抗HER4抗体单抗1479竞争对JM-a同等型的结合。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479结合的表位相同的表位。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
5.一种分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体，其中所述抗体包括来自由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479、特异性结合HER4 JM-a同等型的片段。
6.权利要求5的抗体，其中所述片段包含单克隆抗体单抗1479的可变区。
7.权利要求5或6的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
8.权利要求5-7任一项的抗体，其中所述抗体是亲和力成熟的。
9.一种分离的抗HER4抗体，其包含由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479或其人源化形式。
10.权利要求1-9任一项的抗体，其中所述抗体连接至细胞毒剂。
11.权利要求1-9任一项的抗体，其中所述抗体具有比对HER4 JM-a同等型不是特异性的抗HER4抗体要小的心脏毒性。
12.一种抑制表达HER4 JM-a同等型的癌细胞增殖的方法，包括使所述癌细胞与治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体接触。
13.权利要求12的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1-11任一项的分离的抗HER4抗体。
14.权利要求12或13的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
15.一种在其癌症表达HER4 JM-a同等型的患者中治疗癌症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1-11任一项的分离的抗HER4抗体。
17.权利要求15或16的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
19.一种在患者中治疗癌症的方法，包括下述步骤：
a.选择其癌性细胞表达HER4 JM-a同等型的患者；并
b.对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
20.权利要求19的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1-11任一项的分离的抗HER4抗体。
21.权利要求19或20的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
23.一种在患者中治疗癌症的方法，包括下述步骤：
a.选择其癌性细胞包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域的患者；并
b.对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1-11任一项的分离的抗HER4抗体。
25.权利要求23或24的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
26.权利要求23-25任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
27.一种在具有癌症的患者中降低与癌症疗法有关联的心脏毒性的风险的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1-11任一项的分离的抗HER4抗体。
29.权利要求27或28的方法，其中所述癌症过表达HER4 JM-a同等型。
30.权利要求27-29任一项的方法，其中所述癌症包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域。
31.权利要求27-30任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
32.一种在细胞样品中检测脱落HER4胞外域的存在的方法，包括使所述细胞与特异性结合JM-a HER4同等型的抗体接触。
33.一种在患者中诊断肿瘤的方法，包括在所述肿瘤中检测脱落HER4胞外域的存在。
34.权利要求33的方法，其中所述检测包括使特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体与自所述肿瘤获得的样品接触。
35.权利要求34的方法，进一步包括比较所述肿瘤中的脱落HER4胞外域水平与非癌性对照样品中的脱落HER4胞外域水平。
CN2009801546763A 2008-11-25 2009-11-24 同等型特异性抗her4抗体 Pending CN102725310A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710670250.XA CN109608545A (zh) 2008-11-25 2009-11-24 同等型特异性抗her4抗体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11790308P 2008-11-25 2008-11-25
PCT/US2009/065712 WO2010068437A1 (en) 2008-11-25 2009-11-24 Isoform specific anti-her4 antibodies

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710670250.XA Division CN109608545A (zh) 2008-11-25 2009-11-24 同等型特异性抗her4抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102725310A true CN102725310A (zh) 2012-10-10

Family

ID=42021645

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710670250.XA Pending CN109608545A (zh) 2008-11-25 2009-11-24 同等型特异性抗her4抗体
CN2009801546763A Pending CN102725310A (zh) 2008-11-25 2009-11-24 同等型特异性抗her4抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710670250.XA Pending CN109608545A (zh) 2008-11-25 2009-11-24 同等型特异性抗her4抗体

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20110293614A1 (zh)
EP (1) EP2365987B1 (zh)
JP (1) JP5894436B2 (zh)
KR (1) KR101789338B1 (zh)
CN (2) CN109608545A (zh)
AU (1) AU2009324939B2 (zh)
BR (1) BRPI0916092A2 (zh)
CA (1) CA2744512C (zh)
DK (1) DK2365987T3 (zh)
ES (1) ES2528929T3 (zh)
IL (1) IL212900A0 (zh)
MX (1) MX2011005382A (zh)
PL (1) PL2365987T3 (zh)
SI (1) SI2365987T1 (zh)
WO (1) WO2010068437A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999228A (zh) * 2021-11-08 2022-02-01 南京卓康医药科技有限公司 一种他达拉非的合成方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101789338B1 (ko) 2008-11-25 2017-10-23 제넨테크, 인크. 이소형 특이적 항-ｈｅｒ４ 항체
US10083108B1 (en) * 2017-12-18 2018-09-25 Clover Network, Inc. Automated stack-based computerized application crawler
CN112753956A (zh) * 2021-01-20 2021-05-07 重庆周师兄餐饮文化有限公司 一种腰片的加工方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999019488A1 (en) * 1997-10-15 1999-04-22 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5811098A (en) * 1992-11-24 1998-09-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to HER4, human receptor tyrosine kinase
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
NZ333325A (en) 1996-07-12 2000-06-23 Genentech Inc Recombinant chimeric heteromultimer adhesins comprising extracellular domains of ErbB receptors
US6121415A (en) 1997-07-09 2000-09-19 Genentech, Inc. ErbB4 receptor-specific neuregolin related ligands and uses therefor
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
KR101789338B1 (ko) 2008-11-25 2017-10-23 제넨테크, 인크. 이소형 특이적 항-ｈｅｒ４ 항체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999019488A1 (en) * 1997-10-15 1999-04-22 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLLMEN M ET AL: "Suppression of breast cancer cell growth by a monoclonal antibody targeting cleavable ErbB4 isoforms", 《ONCOGENE》 *
JUNTTILA TT ET AL: "Identification of patients with transitional cell carcinoma of the bladder overexpressing ErbB2, ErbB3, or specific ErbB4 isoforms: real-time reverse transcription-PCR analysis in estimation of ErbB receptor status from cancer patients", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
SUNDVALL M ET AL: "Role of ErbB4 in breast cancer", 《JOURNAL OF MAMMARY GLAND BIOLOGY AND NEOPLASIA》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999228A (zh) * 2021-11-08 2022-02-01 南京卓康医药科技有限公司 一种他达拉非的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK2365987T3 (en) 2015-01-12
EP2365987A1 (en) 2011-09-21
US20110293614A1 (en) 2011-12-01
AU2009324939B2 (en) 2015-07-09
KR101789338B1 (ko) 2017-10-23
JP2012509896A (ja) 2012-04-26
JP5894436B2 (ja) 2016-03-30
EP2365987B1 (en) 2014-11-12
BRPI0916092A2 (pt) 2015-11-17
PL2365987T3 (pl) 2015-04-30
SI2365987T1 (sl) 2015-03-31
CA2744512C (en) 2018-05-15
CN109608545A (zh) 2019-04-12
KR20110098756A (ko) 2011-09-01
ES2528929T3 (es) 2015-02-13
AU2009324939A1 (en) 2010-06-17
IL212900A0 (en) 2011-07-31
CA2744512A1 (en) 2010-06-17
US20160075798A1 (en) 2016-03-17
MX2011005382A (es) 2011-07-20
US9963517B2 (en) 2018-05-08
WO2010068437A1 (en) 2010-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5209505B2 (ja) 抗ｆｇｆ１９抗体およびその使用方法
CN102378767B (zh) 抗-fgfr3抗体及其使用方法
US20180208677A1 (en) Klotho beta
JP5955828B2 (ja) 抗ｖｅｇｆ抗体
TWI429453B (zh) 抗tat419抗體及其用途
CN107108740A (zh) 抗fgfr2/3抗体及其使用方法
CN101437852A (zh) 抗tat226抗体和免疫偶联物
CN102170909A (zh) 抗-notch2抗体和使用方法
CN101410413A (zh) 抗ephrinb2抗体及其使用方法
TW201124531A (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
TW201446798A (zh) 抗ｅｇｆｌ７抗體、包含其之組合物、編碼其之多核苷酸及其製造及使用方法
US9963517B2 (en) Isoform specific anti-HER4 antibodies
AU2014203654B2 (en) Klotho-beta for use in treating cancer, liver disorders, gallstones, wasting syndrome and obesity-related diseases
CN101443359A (zh) Egfl7抗体及其使用方法
TW200813088A (en) Antibodies to EGFL7 and methods for their use

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1173157

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20121010

RJ01 Rejection of invention patent application after publication