KR102366644B1 - 항-표피 성장 인자 수용체 (egfr) 항체 - Google Patents

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Abstract

항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체, 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체, 및 그의 항원 결합성 단편이 제공된다. 또한, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 관련 발현 벡터, 및 숙주 세포가 제공된다. 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체, 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체, 및 그의 항원 결합성 단편의 제조 방법이 제공된다. 또한, 관련 제약 조성물; 및 대상체를 치료하기 위한 그의 사용 방법이 제공된다.

Description

항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 {ANTI-EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) ANTIBODIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 5월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/005,887을 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
표피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB-1 및 HER1로서 공지되기도 함)는 EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 및 Her 4 (ErbB-4)를 포함한, 밀접하게 관련된 4가지 수용체 티로신 키나제의 하위계열인 ErbB 계열 수용체의 특정 세포 표면 수용체이다. EGFR이 리간드 [예컨대, 표피 성장 인자 (EGF), 전환 성장 인자 a (TGF α), HB-EGF, 앰피레굴린(amphiregulin), 베타셀룰린(betacellulin)/BTC, 에피겐/EPGN, 또는 기타]와 결합하면, EGFR의 C-말단 도메인 내에서 몇 가지 티로신 (Y) 잔기 (Y992, Y1045, Y1068, Y1148, 및 Y1173)의 자기인산화 및 수용체 이량체화가 유도된다. 이러한 자기인산화는 MAPK, Akt, 및 JNK 경로를 포함한, 몇 가지 시그널 변환 캐스케이드(cascade)의 하류 활성화를 유발시켜, 세포 이동, 부착 및 세포 증식을 초래한다.
EGFR 또는 계열 구성원의 돌연변이, 증폭 또는 조절불량이 모든 상피암의 약 30%와 관련이 있다. 예를 들어, EGFR 과발현 또는 과활성을 초래하는 돌연변이는 폐암, 항문암, 두경부암, 및 다형성 교모세포종을 포함한 수많은 암과 연관이 있어 왔다. EGFR을 종양유전자로서 확인함에 따라, EGFR에 대항하여 유도된 항암 치료제의 개발에 대한 필요성이 야기되었다. 본 발명은 이러한 필요성과 기타 필요성을 충족시켜 준다.
(1) 아미노산 서열 N/T/Q-YGVH (서열식별번호 (SEQ ID NO): 4)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 Y-N/A/G/D-T/D/N-P/K/E-FTSRF (서열식별번호: 9)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY (서열식별번호: 14)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 I-G/R/S-T/L/P-NIH (서열식별번호: 20)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KY-A/G-SE-S/T-I-S/R (서열식별번호: 24)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPT-T/L/S/A/Y (서열식별번호: 30)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 본 발명에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 서열식별번호: 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (2) 서열식별번호: 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 서열식별번호: 10 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 서열식별번호: 15 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (2) 서열식별번호: 21 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 서열식별번호: 25 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 TYYDYEFAY (서열식별번호: 10)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTT (서열식별번호: 25)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YATEFTSRF (서열식별번호: 7)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YDDKFTSRF (서열식별번호: 6)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IRTNIH (서열식별번호: 16)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 ISTNIH (서열식별번호: 19)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
또한, 아미노산 서열 Y-A/G/D-D/N-K/E-FTSRF (서열식별번호: 31)을 포함하는 CDR-H2를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 아글리코실화(aglycosylated) CDR-H2 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 본 발명에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 N/T/Q-YGVH (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR-H1 및 아미노산 서열 T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY (서열식별번호: 14)을 포함하는 CDR-H3을 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 I-G/R/S-T/L/P-NIH (서열식별번호: 20)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KY-A/G-SE-S/T-I-S/R (서열식별번호: 24)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPT-T/L/S/A/Y (서열식별번호: 30)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 IgG의 Fc 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항원 결합성 단편은 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일-쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 디아보디(diabody), 및 선형 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 치료제와 접합된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 표지와 접합된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 표지는 방사성 동위원소, 형광성 염료, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 상기 항체는 아푸코실화(afucosylated) 항체이다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 세포독성제와 접합된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 세포독성제는 마이탄신(maytansine) 또는 그의 유도체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 마이탄신 또는 그의 유도체는 DM-1이다.
본 발명은 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터가 제공된다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 발현 벡터를 포함하는 세포가 또한 제공된다. 본 발명은 또한, 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 세포를 배양하는 단계; 및 이러한 세포 배양물로부터 상기 항체 또는 그의 항원-결합성 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 생성 방법을 제공한다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 세포는 포유류 세포이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 포유류 세포는 CHO 세포이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 세포는 안정한 포유류 세포주이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 안정한 포유류 세포주는 CHO 세포주이다.
본 발명은 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 환자로부터의 샘플과 접촉시키고; EGFR 단백질과 결합된 항-EGFR 항체를 검출함으로써, 상기 샘플 중의 EGFR 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 면역조직화학 검정 (IHC) 또는 ELISA 검정에 사용된다.
또한, 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 조성물의 유효량을 특정 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에게서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 암을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 용도가 제공된다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 암은 결장직장암, 폐암, 및 두경부암으로부터 선택된다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 대상체에게 항-신생물제, 화학요법제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 추가로 투여한다.
상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 암은 인후암이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 대상체에게 방사선 요법을 추가로 투여한다.
상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 대상체에게 항-신생물제, 화학요법제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 추가로 투여한다.
상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여된 대상체가 KRAS에 대하여 야생형이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여된 대상체가 KRASG13D 돌연변이를 갖는다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여된 대상체가 BRAF에 대하여 야생형이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여된 대상체가 BRAFV600E 돌연변이를 갖는다.
상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여되는 대상체가 에르비툭스(Erbitux) 또는 그의 바이오시밀러(biosimilar)에 대해 저항성이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러의 투여에도 질환이 진행되었다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 (또는 이에 적용된 바와 같은) 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물이 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 치료 불응성이다.
도 1은 CDR-L3/CDR-H3 라이브러리로부터 수득된 항-EGFR Fab 변이체의 EGFR에 대한 결합을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 2는 CDR-L3/CDR-H3 라이브러리로부터 수득된 완전한 길이의 항-EGFR IgG 항체 변이체의 EGFR에 대한 결합을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 3은 HLX05 항체 (즉, 사내에서 생산된 에르비툭스 바이오시밀러 항체) 및 CDR-H2 라이브러리로부터 수득된 항-EGFR 항체 변이체의 EGFR에 대한 오프 레이트(off rate)를 비교하기 위해 수행된 오프 레이트 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 4는 HLX05 항체 (즉, 사내에서 생산된 에르비툭스 바이오시밀러 항체), 에르비툭스® [머크 카게아아(Merck KGaA)로부터 구입함], 항-EGFR 항체 1-26/2-68, 1-26/3-67, #8/#33, #34/#33, 및 리툭시맙(rituximab)의 직접적인 EGFR 결합을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 5는 HLX05, 에르비툭스®, 리툭시맙, 및 항-EGFR 항체 1-26/2-68, 1-26/3-67, #8/#33, 및 #34/#33의 EGFR 결합을 비교하기 위해 수행된 경쟁적 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 6a 및 6b는 HLX05, 에르비툭스® 및 항-EGFR 항체 1-26/2-68, 1-26/3-67, #8/#33, #34/#33 상에서 수행된 글리칸 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7은 HLX05, 에르비툭스®, 및 항-EGFR 항체 1-26/2-68, 1-26/3-67, #8/#33, #34/#33의 FcγIII 결합을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 8a는 HLX05와 항-EGFR 항체 1-26/2-68의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 8b는 HLX05와 항-EGFR 항체 #8/#33의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 8c는 항-EGFR 항체 1-26/2-68과 1-26/3-67의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 8d는 HLX05와 항-EGFR 항체 1-26/3-67의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 8e는 HLX05와 항-EGFR 항체 #34/#33의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 8f는 항-EGFR 항체 #8/#33과 #34/#33의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 8g는 HLX05, 1-26/2-68, 1-26/3-67, #8/#33 및 #34/#33의 ADCC 활성을 비교하기 위해 수행된 분석의 정량화된 결과를 도시한 것이다.
도 9a는 A431 세포 상에서 HLX05와 항-EGFR 항체 1-26/2-68의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 9b는 A431 세포 상에서 HLX05와 항-EGFR 항체 #8/#33의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 9c는 A431 세포 상에서 항-EGFR 항체 1-26/2-68과 1-26/3-67의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 9d는 A431 세포 상에서 HLX05와 항-EGFR 항체 1-26/3-67의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 9e는 A431 세포 상에서 HLX05와 항-EGFR 항체 #34/#33의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 9f는 A431 세포 상에서 항-EGFR 항체 #8/#33과 #34/#33의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 결과를 도시한 것이다. 도 9g는 A431 세포 상에서 HLX05, 1-26/2-68, 1-26/3-67, #8/#33, 및 #34/#33의 항증식 효과를 비교하기 위해 수행된 분석의 정량화된 결과를 도시한 것이다.
도 10은 종양 성장을 억제할 수 있는 에르비툭스®, #34/#33, 1-26/3-67, 및 1-26/2-68의 능력을 측정하는 A431 종양 이종이식편 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 11은 제3일과 제35일 양일에 #34/#33, 1-26/3-67, 1-26/2-68, 및 에르비툭스®의 혈청 수준을 도시한 것이다.
도 12는 종양 성장을 억제할 수 있는 HLX05, 1-26/3-67, 에르비툭스®, 및 위약의 능력을 측정하는 FaDu 종양 이종이식편 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 13은 종양 성장을 억제할 수 있는 1-26/3-67 + 방사선 요법, 에르비툭스® + 방사선 요법 및 위약 + 방사선 요법의 능력을 측정하는 FaDu 종양 이종이식편 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 14a는 DiFi 세포 (KRASWT, BRAFWT)에서의 성장을 억제할 수 있는 HLX07-DM1, HLX07, 및 대조군 항체의 능력을 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 14b는 HCT-116 세포 (KRASG13D)에서의 성장을 억제할 수 있는 HLX07-DM1, HLX07, 및 대조군 항체의 능력을 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 14c는 HT29 세포 (BRAFV600E)에서의 성장을 억제할 수 있는 HLX07-DM1, HLX07, 및 대조군 항체의 능력을 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 15a는 PBMC 이펙터 세포를 수반한 DiFi 세포 (KRASWT)에 대항한 1-26/3-67-FF (즉, "푸코스 무함유"), 1-26/3-67, 및 대조군 항체의 ADCC 활성을 도시한 것이다. 도 15b는 PBMC 이펙터 세포를 수반한 HCT-116 세포 (KRASG13D)에 대항한 1-26/3-67-FF (즉, "푸코스 무함유"), 1-26/3-67, 및 대조군 항체의 ADCC 활성을 도시한 것이다. 도 15c는 PBMC 이펙터 세포를 수반한 HT29 세포 (BRAFV600E)에 대항한 1-26/3-67-FF (즉, "푸코스 무함유"), 1-26/3-67, 및 대조군 항체의 ADCC 활성을 도시한 것이다.
도 16a는 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서 시간 경과에 따른 34/33과 3/67의 혈청 농도를 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한 것이다. 도 16b는 시노몰구스 원숭이에서 시간 경과에 따른 HLX05 (즉, 1-3), 및 에르비툭스® (즉, 4-6)의 혈청 농도를 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한 것이다.
도 17은 안정한 세포주에 의해 생산된, 1-26/3-67 항체의 농도 (mg/ml) 대 시간을 도시한 것이다.
본 발명은 신규 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체를 제공한다. 본 출원인은 놀랍게도, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 전이성 결장직장암 및 두경부암의 치료를 위해 사용되는 것으로 FDA-승인된 항-EGFR 항체인 에르비툭스® [세툭시맙(cetuximab)]와 비교해서 증강된 치료 효능을 나타낸다는 사실을 밝혀내었다. 본원에 기재된 항-EGFR 항체는 또한, 에르비툭스®보다 더 긴 반감기를 나타낸다.
관련 측면에서, 본 발명은 CDR-H2 내에 N-글리코실화 모티프가 결여된 신규 항-EGFR 항체를 제공한다. 특정 항체의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역 내에서의 글리코실화, 예컨대 에르비툭스®의 VH 영역의 Asn 99에서의 N-글리칸은 항원 결합을 방해함으로써 항체의 치료 효능을 저하시킬 수 있다. 더욱이, 이러한 글리코실화는 항체의 배치 내에서 이질성을 유발시킬 수 있고, 이로써 항체의 기능, 면역원성, 또는 안정성이 변경될 수 있다. CDR-H2 내에 글리코실화 모티프가 결여된 항-EGFR 항체의 생산 배치 내에는 더 적은 수의 글리코형태가 존재한다.
또한, 면역접합체, 본원에 기재된 신규 항-EGFR 항체를 코딩하는 핵산, 및 조성물 (예컨대 제약 조성물)이 제공된다. 본 발명은 또한, 특정 샘플 (예컨대 생체내 또는 생체외 샘플) 중의 EGFR을 검출하기 위하여 신규 항-EGFR 항체를 사용하는 방법; 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 상기 항체를 포함하는 조성물; 및 암을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 상기 항체의 용도를 제공한다.
정의
본원에 사용된 바와 같은, "치료" 또는 "치료하는"은 유리하거나 또는 목적하는 결과 (임상 결과 포함)를 수득하기 위한 접근 방식이다. 본 발명의 목적상, 유리하거나 또는 목적하는 임상 결과는 다음 중 한 가지 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다: 질환으로부터 비롯되는 한 가지 이상의 증상을 완화시키고/시키거나, 질환의 정도를 감소시키고/시키거나, 질환을 안정화시키고/시키거나 (예를 들어, 질환의 악화를 방지하거나 또는 지연시키며), 질환의 확산 (예를 들어, 전이)을 방지 또는 지연시키고/시키거나, 질환의 재발을 방지 또는 지연시키고/시키거나, 질환의 진행을 지연 또는 느리게 하고/하거나, 질환 상태를 개선시키고/시키거나, 질환의 차도 (부분적 또는 전체)를 제공하고/하거나, 질환을 치료하기 위해 요구되는 한 가지 이상의 다른 의약의 용량을 감소시키고/시키거나, 질환의 진행을 지연시키고/시키거나, 삶의 질을 증가 또는 개선시키고/시키거나, 체중을 증가시키고/시키거나 생존을 연장시킨다. 또한, "치료"에는 암의 병리학적 결과 (예컨대, 예를 들어, 종양 용적)의 감소가 포괄된다. 본원에 제공된 방법은 이들 치료 측면 중 어느 하나 이상을 고려한다.
용어 "재발", "악화" 또는 "악화된"은 질환이 사라진 것으로 임상적 평가한 후에 특정 암 또는 질환이 복귀되는 것을 지칭한다. 원격 전이 또는 국소 재발의 진단이 악화로서 간주될 수 있다.
용어 "치료 불응성" 또는 "저항성"은 치료에 대해 반응하지 않는 암 또는 질환을 지칭한다.
용어 "아주반트 요법"은 1차 요법, 통상적으로 수술 후에 제공되는 치료를 지칭한다. 암 또는 질환에 대한 아주반트 요법은 면역 요법, 화학요법, 방사선 요법, 또는 호르몬 요법을 포함할 수 있다.
용어 "유지 요법"은 기존의 치료 효과를 유지하는 데 도움을 주기 위해 제공되는 예정된 재치료를 지칭한다. 유지 요법은 종종, 암에 있어 차도를 유지하는 데 도움을 주기 위해 제공되거나 또는 질환 진행에 상관없이 특이적 요법에 대한 반응을 연장시키기 위해 제공된다.
용어 "침습성 암"은 암이 시작된 조직의 층을 벗어나 정상적인 주변 조직으로 확산된 암을 지칭한다. 침습성 암은 전이성이거나 아닐 수 있다.
용어 "비-침습성 암"은 극히 초기 암이거나 또는 원래 조직을 벗어나 확산되지 않은 암을 지칭한다.
종양학에서의 용어 "질환 진행이 없는 생존"은 암이 성장하지 않는, 치료 동안 및 치료 후의 시간 길이를 지칭한다. 질환 진행이 없는 생존은 환자가 완전 반응 또는 부분 반응을 경험한 시간의 양뿐만 아니라 환자가 안정적 질환을 경험한 시간의 양을 포함한다.
종양학에서 용어 "진행성 질환"은 종양 덩어리 상의 증가 또는 종양에 있어서의 확산에 기인하여, 치료를 시작한 이래로 종양이 20% 초과하여 성장하는 것을 지칭할 수 있다.
"장애"는 항체를 이용한 치료로부터 이득을 얻게 될 것인 임의의 병태이다. 예를 들어, 포유류는 비정상적 EGFR 활성으로 인해 고통받고 있거나 또는 이러한 활성에 대항한 예방을 필요로 한다. 상기 장애는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하는데, 이는 상기 포유류가 해당 장애에 걸리게 하는 병리학적 병태를 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비-제한적 예는 암 (예컨대, 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "종양"은 악성이든지 아니면 양성이든지 간에, 모든 신생물 세포 성장과 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는, 예를 들어 단일 모노클로날 항체 (효능제, 길항제, 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 지닌 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일 쇄 항-항체, 및 항체의 단편 (하기 참조) (이는 천연 폴리펩티드와 특이적으로 결합하고/하거나 본 발명의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 나타내야 한다)을 포괄한다. 한 실시양태에 따르면, 항체는 표적 단백질의 올리고머성 형태, 예를 들어 삼량체성 형태와 결합한다. 또 다른 양태에 따르면, 항체는 특정 단백질과 특이적으로 결합하는데, 이러한 결합은 본 발명의 모노클로날 항체 (예를 들어, 본 발명의 기탁된 항체 등)에 의해 억제될 수 있다. 항체의 "기능적 단편 또는 유사체"는 이와 관련하여 언급되는 항체와 공통의 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 EGFR과 특이적으로 결합할 수 있는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 세포 증식을 유도시킬 수 있는 EGFR의 능력을 방지하거나 또는 실질적으로 저하시킬 수 있다.
"단리된 항체"는 그의 자연 환경의 특정 성분으로 확인되어, 이러한 환경으로부터 분리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질이고, 이는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로리(Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 및 가장 바람직하게 99 중량% 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게 은 염료(silver stain)를 이용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제시킬 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조할 것이다.
기본 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체성 당단백질이다 (IgM 항체는 J 쇄로 부르는 부가의 폴리펩티드와 함께 기본 이종사량체 단위 중 5개로 이루어지므로, 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합되어, J 쇄와 함께 기본 4-쇄 단위 중 2 내지 5개를 포함하는 다가 집합체를 형성할 수 있다). IgG의 경우에는, 상기 4-쇄 단위가 일반적으로, 약 150,000 달톤이다. 각 L 쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라서 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H 쇄 및 L 쇄는 또한, 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각 H 쇄는 N-말단에, 가변 도메인 (VH)에 이어 α 및 γ 쇄 각각에 대해서는 3개의 불변 도메인 (CH)을 갖고 μ 및 ε 이소형에 대해서는 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특별한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL이 함께 쌍을 형성하여, 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 관해서는, 예를 들어 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6].
임의의 척추동물 종으로부터의 L 쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 및 람다로 부르는 2개의 명백하게 별개의 유형 중 하나로 배정될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소형으로 배정될 수 있다. 다음 5가지 부류의 면역글로불린이 있다: α, δ, γ, ε, 및 μ로 각각 지명된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. γ 및 α 부류는 CH 서열과 기능에 있어서의 비교적 작은 차이에 근거하여 하위부류로 추가로 나눠지는데, 예를 들어 인간은 다음 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특별한 항원에 대한 특별한 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 대신, V 영역은 각각 9개 내지 12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 부르는 극도의 가변성의 보다 짧은 영역에 의해 분리된 15 내지 30개 아미노산의 골격 영역 (FR)으로 지칭된 비교적 불변인 연장물로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 이러한 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FR에 의해 아주 근접하게 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체 참여를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비-연속된 항원 결합 부위를 의미하기 위한 것이다. 이들 특별한 영역은 문헌 ([Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]; [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; 및 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)])에 보고되었는데, 여기서 그 정의는 서로에 대항하여 비교한 경우에 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 특정 항체 또는 이식화 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 지칭하기 위해 어느 하나의 정의를 적용하는 것은 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 상기 용어의 범위 내에 있는 것이다. 상기 인용된 참고 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 아미노산 잔기가 비교로서 다음 표 1에 제시되어 있다.
<표 1> CDR 정의
Figure 112016127814969-pct00001
1잔기 넘버링은 카바트 등 (Kabat et al., 상기 참조)의 명명법에 따른다
2잔기 넘버링은 코티아 등 (Chothia et al., 상기 참조)의 명명법에 따른다
3잔기 넘버링은 맥칼룸 등 (MacCallum et al., 상기 참조)의 명명법에 따른다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대항하여 유도된다. 더욱이, 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌 ([Kohler et al. Nature. 256:495 (1975)])에 최초로 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 이용하여 만들 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)], [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]) 및 하기 실시예에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 특정 부분이 특별한 종으로부터 유래되거나 또는 특별한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동인 "키메라" 항체뿐만 아니라 본 발명의 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서의 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합성 서열, 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
"무손상" 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게, 무손상 항체는 한 가지 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 특정 부분, 바람직하게 무손상 항체의 항원 결합성 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디; 선형 항체 (미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng . 8(10): 1057-1062 [1995]] 참조); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"선형 항체"란 표현은 일반적으로, 문헌 ([Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)])에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게 설명하면, 이들 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합성 영역을 형성하는, 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
항체를 파파인 소화시키면, "Fab" 단편으로 부르는 2개의 동일한 항원 결합성 단편과 잔류성 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 이러한 Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (VH) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 각 Fab 단편은 항원 결합성과 관련하여 1가인데, 즉 이는 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신 처리하면, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 거의 상응하고 여전히 항원과 가교 결합할 수 있는 단일의 큰 F(ab')2 단편이 산출된다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함한 CH1 도메인의 카르복시 말단에 부가의 여러 개 잔기를 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 결합된 양 H 쇄의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되는데, 이러한 영역은 또한, 특정 유형의 세포 상에서 발견된 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식된 부분이다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 "아미노산 변형"을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성, 약 85% 이상의 상동성, 약 90% 이상의 상동성, 약 95% 이상의 상동성 또는 약 99% 이상의 상동성을 보유할 것이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 본원에서의 변이체 Fc 영역는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성, 약 85% 이상의 상동성, 약 90% 이상의 상동성, 약 95% 이상의 상동성 또는 약 99% 이상의 상동성을 보유할 것이다.
용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 면역부착인자 (본원의 다른 곳에 있는 정의 참조)를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따르는 잔기 447)을, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 정제 동안 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 (항체 포함)를 포함하는 조성물은 K447 잔기가 모두 제거된 폴리펩티드 집단, K447 잔기가 전혀 제거되지 않은 폴리펩티드 집단, 또는 K447 잔기를 수반한 폴리펩티드와 K447 잔기를 수반하지 않은 폴리펩티드의 혼합물을 갖는 폴리펩티드 집단을 포함할 수 있다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는데, 이는 항체 이소형에 따라서 다양하다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합성 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다. "천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. Fc 서열의 예는, 예를 들어 문헌 ([Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)])에 기재되어 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여해 주는 6개의 초가변 루프 (H 쇄 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 전체 결합 부위보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
"sFv" 또는 "scFv"로서 약칭되기도 한 "단일-쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄가 되도록 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 고찰을 위하여, 문헌 ([Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Borrebaeck 1995, 하기 참조])을 참조할 수 있다.
용어 "디아보디"는 V 도메인의 쇄 내에서의 쌍 형성이 아니라 V 도메인의 쇄 간의 쌍 형성이 달성되어, 2가 단편, 즉 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편이 생성되도록, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5개 내지 10개 잔기)를 이용하여 sFv 단편 (앞의 단락 참조)을 구축함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 항체는 두 항체의 VH 도메인과 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 이종이량체이다. 디아보디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 특정 부분을 포함할 것이다. 추가의 세부 사항에 관해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).
본원에서 확인된 폴리펩티드 및 항체 서열과 관련한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 또는 "상동성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하여 서열들을 정렬한 후에, 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (%)로서 정의된다. % 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 관련 기술분야의 기술 수준 내에 있는 각종 방식으로 달성할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이는 비교되는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데에 필요한 임의의 알고리즘을 포함한다. 그러나, 본원의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. ALIGN-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드(source code)는 미국 저작권국 (미국 워싱턴 D.C. 20559)에 사용자 문서로 출원되었는데, 이는 미국 저작 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우스샌프란시스코)를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터가 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 이는 달라지지 않는다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)와 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자성 변이체 및 교대로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")를 포함하는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (문헌 [M. in Daeron, Annu . Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). 상기 용어는 동종이형, 예컨대 FcγRIIIA 동종이형: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131을 포함한다. FcR은 다음 문헌에서 고찰되었다 ([Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin . Med. 126:330-41 (1995)]). 기타 FcR은 앞으로 확인될 것을 포함하여, 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어는 또한, 모계 IgG를 태아에게 전이시키는 데에 책임이 있는 신생 수용체 FcRn을 포함한다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
용어 "FcRn"은 신생 Fc 수용체 (FcRn)를 지칭한다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고 β2-마이크로글로불린과 비공유적으로 결합된 α-쇄로 이루어진다. 신생 Fc 수용체 FcRn의 여러 기능이 다음 문헌에 고찰된다 (Ghetie and Ward (2000) Annu . Rev. Immunol . 18, 739-766). FcRn은 면역글로불린 IgG를 모계로부터 유아에게 수동 전달하고 혈청 IgG 수준을 조절하는 데 있어서 일정 역할을 한다. FcRn은 재이용 수용체로서 작용하여, 세포 내에서 그리고 세포를 가로질러 무손상 형태의 세포흡수작용된(pinocytosed) IgG와 결합하고 이를 수송할 수 있으며, 이를 디폴트(default) 분해 경로로부터 구제할 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인" ("C1" 또는 "H1" 도메인으로서 지칭되기도 함)은 통상적으로 아미노산 위치 약 118에서부터 아미노산 위치 약 215까지 연장된다 (EU 넘버링 시스템).
"힌지 영역"은 일반적으로, 인간 IgG1의 Glu216에서부터 Pro230까지 연장되는 것으로서 정의된다 [Burton, Molec . Immunol. 22:16l-206 (1985)]. 기타 IgG 이소형의 힌지 영역은, 중쇄 간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 놓아둠으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다.
Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 정상적으로, 힌지 영역에 대해 바로 C-말단에 있는 잔기의 연장물, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로서 정의된다. 기존의 보고서에서는, FcR 결합성이 일반적으로, IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역 내의 아미노산 잔기에 기인하였다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("C2" 또는 "H2" 도메인으로서 지칭되기도 함)은 통상적으로, 아미노산 위치 약 231에서부터 아미노산 위치 약 340까지 연장된다. 이러한 CH2 도메인은 그것이 또 다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 이러한 탄수화물이 도메인-도메인 쌍 형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 것으로 추측되었다 [Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)].
"CH3 도메인" ("C3" 또는 "H3" 도메인으로서 지칭되기도 함)은 Fc 영역에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 연장물을 포함한다 (즉, 항체 서열의 아미노산 잔기 위치 약 341에서부터 C-말단 끝, 전형적으로 IgG의 아미노산 잔기 위치 446 또는 447까지).
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유하고 있다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합성; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역을 결합성 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합해야 하고, 이는 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. C1q는 2개의 세린 프로테아제 C1r 및 C1s와 함께, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다. 인간 C1q는, 예를 들어 퀴델(Quidel) (미국 캘리포니아주 샌디에이고)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "결합성 도메인"은 또 다른 분자와 결합하는 폴리펩티드의 영역을 지칭한다. FcR의 경우, 결합성 도메인은 Fc 영역을 결합시키는 데에 책임이 있는 그의 폴리펩티드 쇄의 특정 부분 (예를 들어, 그의 알파 쇄)을 포함할 수 있다. 한 가지 유용한 결합성 도메인은 FcR 알파 쇄의 세포외 도메인이다.
"변경된" FcR 결합 친화성 또는 ADCC 활성을 갖는 변이체 IgG Fc를 수반한 항체는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교해서 증강되거나 또는 감소되는 FcR 결합 활성 (예를 들어, FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 IgG Fc보다 더 높은 친화도 (예를 들어, 더 낮은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)로 적어도 하나의 FcR과 결합한다. 일부 실시양태에 따르면, 모 폴리펩티드와 비교해서 결합 상의 개선은 약 3배, 바람직하게 약 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200배, 500배 이하, 또는 결합 상의 약 25% 내지 1,000% 개선이다. FcR에 대한 "감소된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 낮은 친화도 (예를 들어, 더 높은 겉보기 Kd 또는 더 높은 IC50 값)로 적어도 하나의 FcR과 결합한다. 모 폴리펩티드와 비교해서 결합 상의 감소는 약 40% 또는 그 초과의 결합 상의 감소일 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정의 세포독성 세포 [예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포] 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)와 결합된 분비된 Ig로 인해, 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포와 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 연속해서 이러한 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키는데, 이는 상기 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 데에 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337, 또는 하기 실시예에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
야생형 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로, 인간 이펙터 세포의 존재하에 "증가된 ADCC를 나타"내거나 또는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 매개하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 검정 내에서 변이체 Fc 영역을 수반한 폴리펩티드의 양과 야생형 Fc 영역을 수반한 폴리펩티드 (또는 모 폴리펩티드)의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 시험관내 또는 생체 내에서 ADCC를 매개하는 데 있어서 실질적으로 더 유효한 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 예를 들어, 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하기 위한 검정 또는 방법을 이용하여 확인될 것이다. 한 실시양태에서, 바람직한 변이체는 야생형 Fc (또는 모 폴리펩티드)보다 ADCC를 매개하는 데 있어서 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25배 내지 약 50배 더 유효하다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포를 용해시키는 것을 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을, 그의 동족 항원과 결합하는 (적당한 하위부류의) 항체와 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 수반한 폴리펩티드 변이체 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 수반한 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허 공보의 내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다 (또한, 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)] 참조).
본원에 개시된 바와 같은 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 실험적으로 결정할 수 있고, 언급된 목적과 관련된 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다.
용어 "치료상 유효량"은 포유류 (환자)에게서 특정 질환 또는 장애를 "치료"하는 데에 유효한, 본원에 개시된 바와 같은 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 본원에 개시된 바와 같은 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 치료상 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이것이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료상 유효량은 성장 억제량이다. 또 다른 실시양태에서, 치료상 유효량은 환자의 생존을 연장시키는 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료상 유효량은 환자의 질환 진행이 없는 생존을 개선시켜 주는 양이다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 "성장 억제량"은 시험관내 또는 생체 내에서, 특정 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "성장 억제량"은 실험적으로 결정할 수 있고 공지된 방법 또는 본원에 제공된 실시예에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 "세포독성 양"은 시험관내 또는 생체 내에서, 특정 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 파괴를 유발시킬 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한, 본 발명의 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 "세포독성 양"은 실험적으로 결정할 수 있고 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 "성장 억제량"은 시험관내 또는 생체 내에서, 특정 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한, 본 발명의 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물의 "성장 억제량"은 실험적으로 결정할 수 있고 공지된 방법 또는 본원에 제공된 실시예에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는" 또는 "약리학상 화합성"이란, 생물학상 또는 달리 바람직하지 못한 것이 아닌 물질을 의미하는데, 예를 들어 이러한 물질은 바람직하지 못한 임의의 유의적 생물학적 효과를 유발시키지 않거나 또는 조성물의 내에 함유된 다른 성분들 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호 작용하지 않으면서, 환자에게 투여되는 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게, 독성학적 및 제조 시험에 요구되는 표준을 충족시키고/시키거나 미국 식품의약국에 의해 제조된 불활성 성분 가이드 상에 포함된다.
용어 "검출하는" 것은 특정 물질의 존재 또는 부재를 결정하거나 또는 특정 물질 (예컨대 EGFR)의 양을 정량화하는 것을 포함하고자 한다. 따라서, 상기 용어는 정성적 및 정량적 결정을 위하여 본 발명의 물질, 조성물 및 방법을 사용하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 검출에 사용된 특별한 기술은 본 발명의 실시에 결정적이지 않다.
예를 들어, 본 발명에 따르는 "검출하는" 것은 EGFR 유전자 생성물, mRNA 분자, 또는 EGFR 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 관찰하고; 표적과 결합된 EGFR 폴리펩티드의 수준 또는 양에 있어서의 변화를 관찰하며; EGFR 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성 상의 변화를 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "검출하는" 것은 야생형 EGFR 수준 (예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드 수준)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출하는 것은 대조군과 비교해서, 10% 내지 90% 사이의 임의의 값의 변화 (증가 또는 감소), 또는 30% 내지 60% 사이의 임의의 값의 변화, 또는 100% 전반에 걸친 변화를 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 검출하는 것은 2배 내지 10배 사이의 임의의 값, 또는 그 초과, 예를 들어 100배의 변화를 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우의 용어 "표지"는 항체와 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체가 검출 가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 또는 효소 표지의 경우에는, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원의 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원의 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시되는 측면을 포함한다 (그리고 설명한다). 예를 들어, "약 X"을 지칭하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 이러한 측면 및 실시양태를 "포함하고", "이루어지고" 및 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함한다.
특허 출원 및 공보를 포함한, 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항-표피 성장 인자 수용체 ( EGFR ) 항체
본 발명은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)와 결합하는 신규 항체의 확인에 근거한다. 이러한 항-EGFR 항체는 각종 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 항체는 비정상적 EGFR 발현 또는 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는 질환 (예를 들어, 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등 포함)을 치료하는 데 있어서 단독으로 사용될 수 있거나 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 또한, 항-EGFR 항체를 환자에게 투여하고 이러한 환자로부터의 특정 샘플 중에서 EGFR 단백질과 결합된 항-EGFR 항체를 검출함으로써 (예를 들어, 생체내 또는 생체 외에서), 또는 항-EGFR 항체를 환자로부터의 샘플과 접촉시키고 EGFR 단백질과 결합된 항-EGFR 항체를 정성적 또는 정량적으로 검출함으로써, 환자 또는 환자 샘플 중에서의 EGFR 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
표피 성장 인자 수용체 또는 "EGFR" (예를 들어, ERBB, ERBB1, HER1, PIG61, mENA, 세포 성장 억제성 단백질 40, 세포 증식-유도성 단백질 61, 및 EC 2.7.10.1로서 공지되기도 함)은 밀접하게 관련된 4가지 수용체 티로신 키나제의 하위계열인 ErbB 계열 수용체의 한 구성원이다. EGFR은 그의 특이적 리간드 [예컨대, 표피 성장 인자 (EGF), TGF α, 헤파린-결합성 EGF-유사 성장 인자, 앰피레굴린, 베타셀룰린 (BTC), 에피겐 (EPGN) 등]의 결합에 의해 활성화되는데, 이때 EGFR은 이량체화와 티로신 자기인산화를 진행한다. 자기인산화로 인해, 예를 들어 포스파티딜 3-키나제 (PI3K), 포스포리파제 (PL) C-g1, Akt, Ras, Raf 및 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 및 세포 증식, 운동성, 부착 및 이동과 연관된 다른 시그널 변환 캐스케이드의 하류 활성화가 초래된다. 이상한 EGFR 발현 또는 EGFR 활성은 많은 암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)과 연관이 있다.
항-EGFR 항체는 충분한 친화도와 특이성으로 EGFR과 결합하는 항체이다. 바람직하게, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 항원-결합성 단편)는 EGFR 활성과 관련된 질환 또는 병태를 표적화하고 이를 간섭하는 데 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 항-EGFR 항체는 통상적으로, 다른 ERBb 계열, 예컨대 Her2/Neu/ErbB2, Her3/ERBb3 또는 Her4/ERBb4와는 결합하지 않을 것이다. 바람직하게, 항-EGFR 항체는 재조합 인간화 항-EGFR 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에 따르면, 항-EGFR 항체는 본원에 개시된 항체 중 어느 하나의 CDR, 가변 중쇄 영역, 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 (또는 그의 항원 결합성 단편)는 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 TYYDYEFAY (서열식별번호: 10)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTT (서열식별번호: 25)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-EGFR 항체의 변이체인데, 이러한 변이체는 서열식별번호: 5, 10, 15, 21, 및/또는 25 중 하나 이상에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서 상기 변이체는 서열식별번호: 5, 10, 15, 21, 및/또는 25 중 하나 이상에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환(들)은 보존적 아미노산 치환(들)이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 항원과 결합할 수 있는 항체의 능력을 실질적으로 저하시키지 않는다. 예를 들어, EGFR 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 이루어질 수 있다. 항-EGFR 항체 변이체의 결합 친화도는 하기 실시예에 기재된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
보존적 치환이 "보존적 치환"이란 표제하에 표 2에 제시된다. 보다 실재적인 변화가 "예시적인 치환"이란 표제하에 표 2에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같다. 아미노산 치환을 관심 항체 내로 도입할 수 있고, 생성물을 대상으로 하여 목적 활성, 예를 들어 보유된/개선된 EGFR 결합성, 저하된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 관하여 스크리닝할 수 있다.
<표 2> 보존적 치환
Figure 112016127814969-pct00002
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 파지 디스플레이 기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에 기재된 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙된 항체이다. 간략하게 설명하면, 하나 이상의 CDR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지 상에 디스플레이시킨 다음, 이를 대상으로 하여 특별한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 관하여 스크리닝하였다. 예를 들어, 항체 친화성을 개선시키기 위한 변경 (예를 들어, 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 고 빈도로 돌연변이를 진행하는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol . Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있는데, 이로써 생성되는 변이체 VH 또는 VL을 대상으로 하여 결합 친화성에 관하여 시험하였다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화성 성숙이, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되었다.
친화성 성숙의 일부 실시양태에서, 각종 방법 (예를 들어, 오류 유발 PCR, 연쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이 유발) 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 다양성을 도입한다. 이어서, 2차 라이브러리가 창출된다. 그 다음, 이러한 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 친화성을 지닌 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝한다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 몇 가지 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4 내지 6개 잔기)를 무작위로 처리시킨, HVR-유도 접근 방식을 포함한다. 항원 결합성에 관여한 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 (또는 그의 항원 결합성 단편)는 아미노산 서열 N/T/Q-YGVH (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 Y-N/A/G/D-T/D/N-P/K/E-FTSRF (서열식별번호: 9)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY (서열식별번호: 14)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 아미노산 서열 I-G/R/S-T/L/P-NIH (서열식별번호: 20)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KY-A/G-SE-S/T-I-S/R (서열식별번호: 24)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPT-T/L/S/A/Y (서열식별번호: 30)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 서열식별번호: 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 10 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 서열식별번호: 15 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 21 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열식별번호: 25 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 본원에 언급된 CDR의 서열이 다음 표 3에 제공된다.
<표 3>
Figure 112016127814969-pct00003
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 (또는 그의 항원 결합성 단편)는 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 TYYDYEFAY (서열식별번호: 10)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTT (서열식별번호: 25)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YATEFTSRF (서열식별번호: 7)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YDDKFTSRF (서열식별번호: 6)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 IRTNIH (서열식별번호: 16)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 아미노산 서열 ISTNIH (서열식별번호: 19)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 서열식별번호: 32 내지 35 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 서열식별번호: 36 내지 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 서열식별번호: 32 내지 39의 아미노산 서열이 다음에 제공된다.
Figure 112016127814969-pct00004
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 서열식별번호: 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 서열식별번호: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 모든 가능한 쌍을 이룬 조합으로 조합하여 수많은 항-EGFR 항체를 생성시킨다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 CDR-H2 내에 N-글리코실화 모티프가 결여된다 ("아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체"). 특정 치료 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 내에서의 글리코실화, 예컨대 에르비툭스®의 VH 영역의 Asn 99에서의 N-글리칸은 항체의 배치 내에서 차이를 유발시킬 수 있고, 이로써 항체의 기능, 면역원성, 또는 안정성이 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체는 아미노산 서열 Y-A/G/D-D/N-K/E-FTSRF (서열식별번호: 31)을 포함하는 CDR-H2를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 N/T/Q-YGVH (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR-H1 및 아미노산 서열 T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY (서열식별번호: 14)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 아미노산 서열 I-G/R/S-T/L/P-NIH (서열식별번호: 20)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KY-A/G-SE-S/T-I-S/R (서열식별번호: 24)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPT-T/L/S/A/Y (서열식별번호: 30)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함한다. 상기 언급된 CDR의 서열이 다음 표 4에 제공된다.
<표 4>
Figure 112016127814969-pct00005
항체 글리코실화를 분석하는 방법은, 예를 들어 크로마토그래피 (예컨대 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 또는 액체 크로마토그래피), 질량 분광 분석법 (예컨대 전자분무 이온화 질량 분광 분석법), 및 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌 ([Jung et al. (2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67]; [Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45]; [Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47]; [Leymarie, et al. (2012) Anal Chem. 84(7):3040-3048]; [Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review. pp 106-110]; 및 [Raju, T. (2013) Methods Mol Biol. 988: 169-180])에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 EGFR의 동족체, 예컨대 Her2/ERBb2, Her3/ERBb3, 또는 Her4/ERBb4에 대한 결합 친화도 보다 EGFR에 대해 더 강력한 결합 친화도를 갖는다. 정상적으로, 항-EGFR 항체는 EGFR과 "특이적으로 결합"하지만 [즉, 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게 약 1 x 10-8 M 이하 및 가장 바람직하게 약 1 x 10-9 M 이하의 결합 친화도 (Kd) 값을 갖는다], ERBb 계열의 구성원에 대한 결합 친화도는 EGFR에 대한 그의 결합 친화도보다 약 50배 이상, 또는 약 500배 이상, 또는 약 1,000배 이상 더 약하다. EGFR과 특이적으로 결합하는 항-EGFR 항체는 상기 정의된 바와 같은 각종 유형의 항체 중 임의의 것일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 비-표적 단백질 (예컨대 Her2/ERBb2, Her3/ERBb3, 또는 Her4/ERBb4)에 대한 항-EGFR 항체의 결합 정도는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 또는 방사성 면역침전 (RIA)에 의해 결정된 바와 같이, EGFR에 대한 상기 항체의 결합성의 약 10% 미만이다. 특이적 결합성은, 예를 들어 대조군 분자 (이는 일반적으로, 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자이다)의 결합성과 비교해서 특정 분자의 결합성을 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합성은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비-표지된 표적과 경쟁함으로써 결정할 수 있다. 이러한 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에, 특이적 결합성이 표시된다. 용어 "특이적 결합성" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 본원에 사용된 바와 같은 특별한 폴리펩티드 또는 특별한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대해 "특이적인" 것은, 예를 들어 약 10-4 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-5 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-6 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-7 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-8 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-9 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-10 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-11 M 이상, 또 다른 한편으론 약 10-12 M 이상, 또는 그 초과의 표적에 대한 Kd를 갖는 분자로써 나타낼 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합성"은 특정 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프와 실질적으로 결합하지 않으면서, 특별한 폴리펩티드 또는 특별한 폴리펩티드 상의 에피토프와 결합하는 결합성을 지칭한다.
항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)은 종양 세포에 대항한 치료 항체의 작용 기전이다. ADCC는 면역 시스템의 이펙터 세포가 능동적으로 표적 세포 (예를 들어, 암세포)를 용해시킴으로써 표적 세포의 막-표면 항원이 특이적 항체 (예를 들어, 예컨대 본원에 기재된 항-EGFR 항체)에 의해 결합된, 세포-매개된 면역 방어이다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체는, 예를 들어 본 실시예에 기재된 검정에 의해 입증되는 바와 같이, 에르비툭스®와 유사한 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체의 ADCC 이펙터 기능 활성은 에르비툭스®의 ADCC 이펙터 기능 활성의 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 100% 이상, 또는 100% 초과 (예를 들어, 약 105%, 약 106%, 약 107%, 약 108%, 약 109%, 약 110%, 약 111%, 약 112%, 약 113%, 약 114%, 약 115%, 약 116%, 약 117%, 약 118%, 약 119%, 약 120%, 약 121%, 약 122%, 약 123%, 약 124%, 약 125%, 또는 약 130%) (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 에르비툭스®와 유사한, FcγRIIIa에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 실시양태에서, FcγRIIIa에 대한 결합성은 본 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA에 의해 입증된다. 예를 들어, FcγRIIIa에 대한 항-EGFR의 결합 친화도는 FcγRIIIa에 대한 에르비툭스® (세툭시맙)의 결합 친화도보다 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 초과 (예를 들어, 약 105%, 약 106%, 약 107%, 약 108%, 약 109%, 약 110%, 약 111%, 약 112%, 약 113%, 약 114%, 약 115%, 약 116%, 약 117%, 약 118%, 약 119%, 약 120%, 약 121%, 약 122%, 약 123%, 약 124%, 약 125%, 또는 약 125% 초과)하여 더 높다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 Kd 약 0.1 pM 내지 200 pM (0.2 nM), 예를 들어, 약 0.1 pM, 약 0.25 pM, 약 0.5 pM, 약 0.75 pM, 약 1 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 20 pM, 약 30 pM, 약 40 pM, 약 50 pM, 약 60 pM, 약 70 pM, 약 80 pM, 약 90 pM, 약 100 pM, 약 110 pM, 약 120 pM, 약 130 pM, 약 140 pM, 약 150 pM, 약 160 pM, 약 170 pM, 약 180 pM, 약 190 pM, 또는 약 190 pM 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)로 인간 EGFR과 결합한다. 특정 실시양태에서 EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합 친화도는 EGFR에 대한 에르비툭스® (세툭시맙)의 결합 친화도보다 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 100% 초과 (예를 들어, 약 105%, 약 110%, 약 120%, 또는 약 130%)하여 더 높다. 특정 실시양태에서, EGFR에 대한 항-EGFR의 결합 친화도는 EGFR에 대한 에르비툭스® (세툭시맙)의 결합 친화도보다 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3배, 약 3.25배, 약 3.5배, 약 3.75배, 약 4배, 약 4.25배, 약 4.5배, 약 4.75배, 또는 약 4.75배 초과하여 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 더 높다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체는 에르비툭스®와 비교해서 연장된 생체내 반감기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체의 생체내 반감기는 에르비툭스®의 생체내 반감기보다 더 짧지 않다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체는 에르비툭스® (세툭시맙) 또는 그의 바이오시밀러와 유사한 약동학적 특성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체는 에르비툭스® (세툭시맙) 또는 그의 바이오시밀러의 혈청 농도-시간 프로파일의 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 95% 초과 (예컨대 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과) (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)인 AUC (곡선 아래 면적)를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 상기 항체는 인간 IgG, 예를 들어 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 Fc 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 서열은, 종종 Fc 수용체 (FcR)에 대한 그의 결합과 관련된, 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능이 결여되도록 변경시켰거나 또는 달리 변화시켰다. 이펙터 기능을 변경시킬 수 있는, Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이의 많은 예가 있다. 예를 들어, WO 00/42072 및 문헌 ([Shields et al. J Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)])에는 FcR에 대한 개선되거나 또는 저하된 결합성을 지닌 항체 변이체가 기재되어 있다. 이들 공보의 내용이 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 항체는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일-쇄 Fv (scFv), Fv 단편; 디아보디 및 선형 항체의 형태일 수 있다. 또한, 항체는 EGFR과 결합할 뿐만 아니라 하나 이상의 다른 표적과 결합하여 그들의 기능을 억제하는 다중특이적 항체일 수 있다. 항체는 치료제 (예를 들어, 세포독성제, 방사성 동위원소 및 화학요법제)와 접합될 수 있거나 또는 영상화에 의해 생체 내에서 또는 환자 샘플 중에서 EGFR을 검출하기 위한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소, 형광성 염료 및 효소)와 접합될 수 있다. 다른 변형은 독소를 본원에 제공된 항-EGFR 항체와 접합시키는 것을 포함한다.
항-EGFR 항체를 코딩하는 핵산 분자, 본원에 기재된 CDR 및/또는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 세포가 또한 고려된다. 이들 항체는 본원에 기재된 요법에 사용할 수 있고, 이를 이용하여 환자 샘플 중에서 [예를 들어, FACS, 면역조직화학 (IHC), ELISA 검정을 통하여] 또는 환자 중에서 EGFR 단백질을 검출할 수 있다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 예를 들어 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있거나, 또는 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 햄스터, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물을 전형적으로 면역제로 면역시켜, 이러한 면역제와 특이적으로 결합하게 될 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도시킨다. 또 다른 한편으론, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다.
면역제는 전형적으로, 폴리펩티드 또는 관심 단백질의 융합 단백질 또는 이러한 단백질을 포함하는 조성물을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요망되는 경우에는 말초혈 림프구 ("PBL")를 사용하거나, 또는 비-인간 포유류 공급원이 요망되는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]. 불멸화 세포주는 통상적으로, 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주를 이용한다. 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에는, 하이브리도마에 대한 배양 배지가 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지시키는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합시켜 주고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 안정한 고 수준의 항체 발현을 뒷받침해주며, HAT 배지와 같은 배지에 대해 감수성인 세포주이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어 소크 연구소 세포 배양 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 및 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매너서스)으로부터 수득할 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주가 또한, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63]).
이어서, 하이브리도마 세포를 배양하는 배양 배지를 대상으로 하여, 상기 폴리펩티드에 대항하여 유도된 모노클로날 항체의 존재에 관하여 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법, 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem ., 107:220 (1980)]의 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 과정에 의해 클론을 서브클로닝시킨 다음, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [Goding, 상기 참조]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘벡코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또 다른 한편으론, 하이브리도마 세포를 포유류 내에서 복수(ascite)로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를, 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예컨대 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수로부터 단리 또는 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 또한, 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 방법에 의해 만들 수 있다. 본원에 제공된 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열 분석할 수 있다. 본원에 제공된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예컨대 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (이는 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는다) 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 획득할 수 있다. DNA는 또한, 예를 들어 상동 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 상기 코딩 서열로 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., 상기 참조]), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 본원에 제공된 항체의 불변 도메인 대신 사용할 수 있거나, 또는 본원에 제공된 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용하여 키메라 2가 항체를 창출시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항-EGFR 항체는 안정한 포유류 세포주에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항-EGFR 항체는 약 2.0 그램/리터, 약 2.5 그램/리터, 약 3.0 그램/리터, 약 3.5 그램/리터, 약 4.0 그램/리터, 약 4.5 그램/리터, 약 5.0 그램/리터, 약 5.5 그램/리터, 약 6 그램/리터, 약 6.5 그램/리터, 약 7.0 그램/리터, 또는 약 7.0 그램/리터 초과의 역가 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)로 안정한 포유류 세포주로부터 발현된다. 특정 실시양태에서, 그로부터 본 발명에 의해 제공된 항-EGFR 항체가 발현되는 안정한 포유류 세포주는 CHO 세포주이다.
특정 실시양태에서, 항체는 1가 항체이다. 1가 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린 경쇄와 변형된 중쇄를 재조합 발현시키는 것을 포함한다. 중쇄는 일반적으로, Fc 영역 내의 임의의 지점에서 말단절단시켜 중쇄 가교결합을 방지시킨다. 또 다른 한편으론, 관련 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 치환시키거나 또는 결실시켜 가교결합을 방지시킨다.
시험관내 방법이 또한, 1가 항체를 제조하는 데 적합하다. 항체를 소화시켜 그의 단편, 특히 Fab 단편을 생성시키는 것은 관련 기술분야에 공지된 기술 (이에 제한되지 않는다)을 이용하여 달성할 수 있다.
인간 및 인간화 항체
항체는 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 인간화 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 전형적으로 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 그의 단편 [예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 기타 항원 결합성 하위서열]이다. 인간화 항체는, 수용자의 CDR로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR (공여자 항체)로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 인간화 항체는 또한, 수용자 항체에서 발견되지 않거나 또는 유입된 CDR 또는 골격 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있는데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 바람직하게, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 특정 부분을 포함할 것이다 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).
일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 한 실시양태에 따르면, 인간화는 본질적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [Winter and co-workers (Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239:1534-1536 (1988))]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 덜한 것을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 일부 CDR 잔기와 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실로 인해, 내인성 항체 생성이 완전히 억제되는 것으로 보고되었다. 이러한 생식세포 계열 돌연변이체 마우스 내로 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전이시키면, 항원 시험감염시 인간 항체가 생성될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al. PNAS USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al. Year in Immunol ., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669; 5,545,807; 및 WO 97/17852 참조). 또 다른 한편으론, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자 자리를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시킨 마우스 내로 도입함으로써 만들 수 있다. 시험감염시, 인간 항체 생성이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 국면에서 인간에게 관찰된 것과 근접하게 유사하다. 이러한 접근 방식은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016, 및 문헌 ([Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)]; [Fishwild et al. Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)])에 기재되어 있다.
또 다른 한편으론, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술의 한 실시양태에 따르면, 항체 V 도메인 서열을 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자 내로 동일 프레임 내에서 클로닝시키고, 파지 입자의 표면 상에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 하기 실시예 섹션에 기재된 바와 같은, 또는 예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 고찰된 바와 같은 각종 포맷으로 수행할 수 있다. V-유전자 절편의 몇 가지 공급원을 파지 디스플레이를 위해 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역시키지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원 (자기 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로, 문헌 ([Marks et al., J. Mol . Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)])에 기재된 기술에 따라서 단리할 수 있다 (또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905 참조).
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).
인간 항체는 또한, 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한, 관련 기술분야에 공지된 각종 기술을 이용하여 생성시킬 수 있다 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581 (1991)]). 다음 문헌의 기술이 또한, 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용 가능하다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)]).
다중특이적 항체
다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게 인간 또는 인간화 항체이다 (예를 들어, 이중특이적 항체는 적어도 2개의 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다). 예를 들어, 결합 특이성 중 하나는 a5~1 단백질에 대한 것일 수 있고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것일 수 있다. 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 다른 항원은 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 예를 들어, 이러한 세포-표면 단백질은 자연 킬러 (NK) 세포 수용체일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체는 EGFR과, 예를 들어 제2 세포 표면 수용체 둘 다와 결합할 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 데 적합한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 공동-발현시키는 것에 근거하는데, 상기 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 [쿠아드로마(quadroma)]는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중에서 1개 만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 통상적으로, 친화 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 과정이 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO, 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이러한 융합은 바람직하게, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합물 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생성하기 위한 추가의 세부 사항에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조할 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 이용하여 이중특이적 항체를 생성시켰다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체를 생성시키기 위해 활용할 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공하였다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍 형성시킴으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)] 참조).
2 원자가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
이종접합체 항체
이종접합체 항체는 2개의 공유적으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역 시스템 세포가 불필요한 세포를 표적으로 하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하기 위한 것으로 제안되었다 (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). 상기 항체는 가교결합제가 관련되는 것을 포함한, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 디술피드-교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.
이펙터 기능 조작
예를 들어, 암을 치료하는 데 있어서 본원에 제공된 항체의 유효성을 증강시키도록, 이펙터 기능과 관련하여 상기 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내로 도입함으로써, 이러한 영역에서 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 (문헌 [Caron et al., J. Exp . Med ., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shapes, J. Immunol ., 148:2918-2922 (1992)] 참조). 증강된 항종양 활성을 지닌 동종이량체성 항체는 또한, 문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종이관능성 가교결합제를 이용하여 제조할 수 있다. 또 다른 한편으론, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있는데, 이로써 증강된 보체 용해와 ADCC 능력을 가질 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989)] 참조).
FcR 결합성을 개선시키기 위해 Fc 영역 서열 내에 돌연변이 또는 변경을 만들 수 있다 (예를 들어, FcγR, FcRn). 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 ADCC, CDC, 및 천연 IgG 또는 모 항체와 비교해서 개선된 FcRn 결합성으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 변경된 이펙터 기능을 갖는다. 몇 가지 유용한 특이적 돌연변이의 예가, 예를 들어 문헌 ([Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604]; [Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490]; 및 WO 00/42072)에 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, Fc 수용체 돌연변이는 Fc 영역의 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환인데, 여기서 Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체 돌연변이는 D265A 치환이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체 돌연변이는 N297A 치환이다. 부가의 적합한 돌연변이가 미국 특허 번호 7,332,581에 제시된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체는 아푸코실화된다 (즉, "아푸코실화 항-EGFR 항체" 또는 "비-푸코실화 항-EGFR 항체"). "아푸코실화 항체" 또는 "비-푸코실화 항체"는 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖는 Asn297에서 Fc 영역 내의 변경된 패턴의 글리코실화를 수반한 IgG1 또는 IgG3 이소형의 항체를 지칭한다. 코어 푸코실화된 이분지 복합체 올리고사카라이드 글리코실화가 2개 이하의 Gal 잔기로 종결되기 때문에, 인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 Asn297에서 일어난다. 이들 구조는 말단 Gal 잔기의 양에 따라서, GO, G1 (a1,6 또는 a1,3) 또는 G2 글리칸 잔기로서 지명된다 (Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화가, 예를 들어 문헌 [Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207]에 기재되어 있다. 비-글리코변형된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체는 통상적으로, 85% 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 그의 글리코실화 패턴 내에 푸코스를 전혀 갖고 있지 않다. 특정 항체 내의 전형적인 글리코실화 잔기 위치가 EU 넘버링 시스템에 따라서 위치 297에 있는 아스파라긴 ("Asn297")인 것으로 통상 공지되어 있다.
따라서, 특정 실시양태에서 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는, 이러한 항체가 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖거나 또는 그의 글리코실화 패턴 내에 푸코스를 전혀 갖지 않도록 변경시켰거나 또는 달리 변화시킨 Fc 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라서 위치 297에 변경을 갖는 Fc 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 저푸코실화 또는 아푸코실화 글리칸을 생산할 수 있는 숙주 세포에 의해 생성된다. 아푸코실화 항체를 생산할 수 있는 안정한 포유류 숙주 세포주가 정립되었고, 이는 예를 들어, 문헌 ([Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng . 87, 614-622]; [Mori et al. (2004) Biotechnol Bioeng. 88, 901-908]; [Kanda et al (2006) Biotechnol Bioeng. 94, 680-688]; [Kanda (2007) J Biotechnol . 130, 300-310]; [Imai-Nishiya (2007) BMC Biotechnol 7, 84]; [Yamane-Ohnuki and Satoh (2009) mAbs 1, 230-236])에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 b(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III 활성을 발현하도록 조작된 글리코변형된 숙주 세포에서 발현된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거시킨 글리코변형된 숙주 세포에서 발현된다. 글리코변형된 숙주 세포의 생성에 관한 세부 사항에 대해서는, 예를 들어 US 6,946,292를 참조할 수 있다. 항체 푸코실화의 양은, 예를 들어 발효 조건 (예를 들어, 발효 시간)에 의해 또는 상이한 푸코실화 양을 수반한 적어도 2개의 항체를 조합함으로써 미리 결정할 수 있다. 상기 아푸코실화 항체 및 각각의 글리코조작 방법이 WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, 문헌 [Umana et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180], WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739에 기재되어 있다. 이들 글리코조작된 항체는 증가된 ADCC를 갖는다. 본 발명에 따르는 아푸코실화 항체를 산출시키는 기타 글리코조작 방법이, 예를 들어 문헌 ([Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160]; [Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem, 278 (2003) 3466-3473]; WO 03/055993 또는 US 2005/0249722)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 시험관내 기술을 이용하여 생성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 화학적으로 합성된다 (예를 들어, 단구 화학주성 단백질 3 (MCP-3)의 비-푸코실화 형태의 화학적 합성이 기재되어 있는 문헌 [Yamamoto et al. (2008) JACS 130, 501-510] 참조). 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 IgG 상의 푸코스 잔기를 제거하기 위한 푸코시다제를 이용함으로써 생성된다 (예를 들어, 문헌 [Yazawa et al. (1986)_Biochem Biophys Res Commun. 136, 563-569] 참조).
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는, 예를 들어 본 실시예에 기재된 검정에 의해 입증된 바와 같이, 에르비툭스®와 비교해서 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체의 ADCC 이펙터 기능 활성은 에르비툭스®의 ADCC 이펙터 기능 활성의 약 140% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 약 180% 이상, 약 190% 이상, 약 190% 이상, 약 200% 이상, 약 210% 이상, 약 220% 이상, 약 230% 이상, 약 240% 이상, 약 250% 이상, 약 260% 이상, 약 270% 이상, 약 280% 이상, 약 290% 이상 또는 약 300% 이상 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체의 ADCC 이펙터 기능 활성은 에르비툭스®의 ADCC 이펙터 기능 활성의 약 300% 초과 [에르비툭스®의 ADCC 이펙터 기능 활성의 약 350% 이상, 약 360% 이상, 약 370% 이상, 약 380% 이상, 약 390% 이상, 약 400% 이상, 약 410% 이상, 약 420% 이상, 약 430% 이상, 약 440% 이상, 약 450% 이상, 약 460% 이상, 약 470% 이상, 약 480% 이상, 약 490% 이상, 약 500% 이상, 약 510% 이상, 약 520% 이상, 약 530% 이상, 약 540% 이상, 약 550% 이상, 약 560% 이상, 약 570% 이상, 약 580% 이상, 약 590% 이상 또는 약 6,000% 이상 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 포함]이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 야생형 KRAS를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 KRAS 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS 유전자의 코돈 12 내에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS 유전자의 엑손 2 내의 코돈 13에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 KRASG13D 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS 유전자의 코돈 61에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS 유전자의 코돈 117에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS 유전자의 코돈 146에서의 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 야생형 BRAF를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 BRAF 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 BRAF 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 600에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 BRAFV600E 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 BRAF 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 G466에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 BRAF 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 G469에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 BRAF 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 L597에서의 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 야생형 PTEN을 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 PTEN 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 엑손 3에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 엑손 4에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 엑손 5에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 엑손 6에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 엑손 7에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 엑손 8에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 PTEN 돌연변이는 PTEN 유전자의 코돈 233에서의 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 야생형 NRAS를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 NRAS 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 NRAS 돌연변이는 NRAS 유전자의 코돈 12에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 NRAS 돌연변이는 NRAS 유전자의 코돈 13에서의 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 상기 NRAS 돌연변이는 NRAS 유전자의 코돈 61에서의 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 야생형 PIK3CA를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 아푸코실화 항-EGFR 항체는 PIK3CA 돌연변이를 갖는 대상체에서 에르비툭스® 보다 개선된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 PIK3CA 돌연변이는 PIK3CA 유전자의 엑손 20에서의 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 아푸코실화 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 저항성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 아푸코실화 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러의 투여에도 질환이 진행되었다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 아푸코실화 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 치료 불응성이다.
면역접합체
본 발명은 또한, 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체)와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합성 활성 단편, 외독소 A 쇄 [슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨], 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 각종 방사성핵종이 방사성접합된 항체를 생성하는 데 이용 가능하다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 이러한 면역접합체를 생성시키는 데에 유용한 것으로 예시되는 화학요법제는 본원의 다른 곳에 기재된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (예컨대 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체, 아푸코실화 항-EGFR 항체, 또는 아푸코실화되기도 하는 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체)는 마이탄신, 마이탄시노이드, 또는 칼리케아미신과 접합된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (예컨대 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체 및/또는 아푸코실화 항-EGFR 항체)는 마이탄시노이드 DM1과 접합된다.
각종 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예컨대 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스디아조늄 유도체 [예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예컨대 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 접합체를 만든다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사성뉴클레오티드를 항체와 접합시키는 것으로 예시되는 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비-표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)와 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 제거제 (clearing agent)를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환시 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)와 접합되는 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
공유적 변형
항-EGFR 항체 및 그의 단편의 공유적 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 가지 유형의 공유적 변형은 특정 폴리펩티드의 표적화 아미노산 잔기를, 이러한 폴리펩티드의 선별된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 이용하여 유도체화하는 것은, 예를 들어 항체를 정제하는 방법에 사용하기 위하여 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 상기 폴리펩티드를 가교결합시키고, 그 반대의 경우에도 유용하다. 흔히 사용되는 가교결합제는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종이관능성 이미도에스테르 [디숙신이미딜 에스테르, 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜-프로피오네이트) 포함], 이관능성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)-디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제를 포함한다.
기타 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화하는 것; 프롤린 및 리신을 히드록실화하는 것; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기를 인산화하는 것; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기를 메틸화하는 것 (문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민을 아세틸화하는 것; 및 임의의 C-말단 카르복실기를 아미드화하는 것을 포함한다.
폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유적 변형은 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로, 상기 폴리펩티드를 각종 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시키는 것을 포함한다.
키메라 분자
본 발명의 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)는 또한 유리한 경우, 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합된 폴리펩티드 [예를 들어, 면역부착인자 또는 펩티보디(peptibody)]를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 키메라 분자는, 예를 들어 인간 면역결핍증 바이러스 TAT 단백질의 단백질 형질도입 도메인을 이용하여, 폴리펩티드를 각종 조직에 전달하고 보다 특히 뇌 혈액 장벽을 가로질러 전달하도록 표적화되는 단백질 형질도입 도메인과 상기 폴리펩티드의 융합을 포함한다 (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72).
또 다른 실시양태에서, 상기 키메라 분자는 항-태그 항체와 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 상기 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로, 상기 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대항한 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공하면, 이러한 에피토프 태그와 결합하는 항-태그 항체 또는 또 다른 유형의 친화 매트릭스를 이용하여 친화 정제함으로써 상기 폴리펩티드가 용이하게 정제될 수 있게 된다. 각종 태그 폴리펩티드 및 그의 각각의 항체는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (폴리-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-His-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol . Cell. Biol ., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])를 포함한다. 기타 태그 폴리펩티드는 플래그(Flag)-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology , 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); α-투불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol . Chem ., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:6393-6397 (1990)])를 포함한다.
대체 실시양태에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특별한 영역과 상기 폴리펩티드의 융합을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자 (예를 들어, "면역부착인자")의 경우에는, 이러한 융합이 IgG 분자의 Fc 영역과 이루어질 수 있었다. 본 발명의 Ig 융합물은 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신 인간의 대략 잔기 94-243, 잔기 33-53 또는 잔기 33-52를 포함하거나 또는 이들 잔기만을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합물은 힌지, CH2 및 CH3, 또는 IgG1 분자의 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합물의 생성에 관해서는 또한, 미국 특허 번호 5,428,130 (1995년 6월 27일에 허여됨)을 참조할 수 있다.
면역리포솜
본원에 개시된 항체는 또한, 면역리포솜으로서 제제화할 수 있다. 이러한 항체를 함유하는 리포솜은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 ([Epstein et al., PNAS USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., PNAS USA, 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545)에 기재된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증강된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜, 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 산출시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을, 디술피드-교환 반응을 통하여 문헌 ([Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)])에 기재된 바와 같이 리포솜과 접합시킬 수 있다. 항-신생물제, 성장 억제제, 또는 화학요법제 (예컨대 독소루비신)가 또한, 리포솜 내에 임의로 함유된다 (문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조).
항-표피 성장 인자 수용체 ( EGFR ) 항체를 이용한 치료
본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물을 대상체 (예를 들어, 포유류, 예컨대 인간)에게 투여하여, 비정상적 EGFR 활성과 관련된 질환 및 장애, 예를 들어 암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)을 치료할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 대상체에게서 암 (예컨대 두경부암, 폐암, 또는 결장직장암)을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 대상체에게서 암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)을 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 대상체에게서 암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)을 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 포유류 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 래트, 마우스, 암소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 임상 환자, 임상 시험 자원자, 실험용 동물 등이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)이 있는 것으로 의심되거나 또는 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 의심되거나, 또는 암 또는 비정상적 EGFR 발현 또는 활성을 갖는 임의의 다른 질환이 있는 것으로 진단된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 KRAS에 대하여 야생형이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 KRASG13D 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 BRAF에 대하여 야생형이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 BRAFV600E 돌연변이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 저항성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러의 투여에도 질환이 진행되었다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EGFR 항체가 투여되는 대상체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 치료 불응성이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 야생형 KRAS를 갖는 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 KRASG13D 돌연변이를 갖는 암 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 야생형 BRAF를 갖는 암 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 BRAFV600E 돌연변이를 갖는 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 저항성인 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러의 투여에도 질환이 진행되었던 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 DM1-접합된 항-EGFR 항체는 에르비툭스 또는 그의 바이오시밀러에 대해 치료 불응성인 대상체에게 투여된다.
암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등) 또는 비정상적 EGFR 활성을 나타내는 임의의 다른 질환에 대한 많은 진단 방법, 및 이들 질환의 임상적 서술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 면역조직화학, PCR, 형광성 계내 혼성화 (FISH)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비정상적 EGFR 활성 또는 발현의 진단 방법에 관한 부가의 세부 사항은, 예를 들어 문헌 ([Gupta et al. (2009) Mod Pathol . 22(1):128-133]; [Lopez-Rios et al. (2013) J Clin Pathol . 66(5):381-385]; [Ellison et al. (2013) J Clin Pathol 66(2):79-89]; 및 [Guha et al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782])에 기재되어 있다.
투여는, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물은 비정상적 EGFR 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제2, 제3 또는 제4 작용제 (예를 들어, 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 화학요법제 포함)와 조합하여 투여된다. 이러한 작용제는, 예를 들어 도세탁셀, 제피티닙, FOLFIRI (이리노테칸, 5-플루오로우라실, 및 류코보린), 이리노테칸, 시스플라틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 베바시주맙 (항-VEGF 항체), FOLFOX-4 (주입용 플루오로우라실, 류코보린, 및 옥살리플라틴, 아파티닙, 젬시타빈, 카페시타빈, 페메트렉세드, 티반티닙, 에베롤리무스, CpG-ODN, 라파마이신, 레날리도미드, 베무라페닙, 엔도스타틴, 라파티닙, PX-866, 임프림(Imprime) PGG, 및 이를로티니븜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)는 부가의 작용제와 접합된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물은 한 가지 이상의 부가 요법, 예컨대 방사선 요법, 수술, 화학요법, 및/또는 표적화 요법과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물은 방사선 요법과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물과 방사선 요법의 조합은 두경부암을 치료하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물과 방사선 요법의 조합은 인후암을 치료하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물과 방사선 요법의 조합은 결장직장암을 치료하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물과 방사선 요법의 조합은 폐암을 치료하는 데 사용된다.
관련 분야의 전문 기술을 가진 의사에게 친숙한, 치료하고자 하는 적응증 및 투여와 관련된 요인에 따라서, 본원에 제공된 항체는 독성과 부작용을 최소화하면서 상기 적응증을 치료하는 데 효능이 있는 투여량으로 투여될 것이다. 암 (예컨대 두경부암, 인후암, 결장직장암, 폐암 등)을 치료하는 경우, 전형적인 용량은, 예를 들어 0.001 내지 1,000 ㎍의 범위일 수 있지만; 이러한 예시적인 범위 아래 또는 위의 용량이 본 발명의 범위 내에 있다. 1일 용량은 약 0.1 ㎍/총 체중 kg 내지 약 100 mg/kg (예를 들어, 약 5 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 500 ㎍/kg, 약 1 mg/kg, 약 50 mg/kg, 또는 전술된 값 중 임의의 2개로써 규정된 범위), 바람직하게 약 0.3 ㎍/총 체중 kg 내지 약 10 mg/kg (예를 들어, 약 0.5 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg, 약 50 ㎍/kg, 약 150 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 750 ㎍/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 전술된 값 중 임의의 2개로써 규정된 범위), 보다 바람직하게 약 1 ㎍/총 체중 kg 내지 1 mg/kg (예를 들어, 약 3 ㎍/kg, 약 15 ㎍/kg, 약 75 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg, 또는 전술된 값 중 임의의 2개로써 규정된 범위), 및 보다 더 바람직하게 1일 약 0.5 내지 10 mg/체중 kg [예를 들어, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 9 mg/kg, 또는 전술된 값 중 임의의 2개로써 규정된 범위 (전술된 값 사이의 임의의 범위 포함)]일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 치료 또는 예방 효능은 치료받은 환자를 주기적으로 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복해서 투여하는 경우에는, 그 병태에 따라서, 질환 증상의 목적하는 억제가 나타날 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있고, 이는 본 발명의 범위 내에 있다. 목적하는 투여량은 조성물의 단일 거환 투여에 의해, 조성물의 다중 거환 투여에 의해, 또는 조성물의 연속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
항-EGFR 항체를 포함하는 제약 조성물은 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 매일 보다는 덜 자주 투여할 수 있는데, 예를 들어 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 지속 방출 제형, 예컨대 특정 기간에 걸쳐 사용하기 위하여 조성물을 서서히 방출시키고 조성물이 덜 자주 투여될 수 있게, 예컨대 1개월 1회, 2 내지 6개월마다 1회, 1년 1회, 또는 심지어 단일 투여될 수 있게 해주는 이식제로 투여될 수 있다. 지속 방출 용기 (예컨대 펠릿, 나노입자, 마이크로입자, 나노구, 미소구 등)를 주사에 의해 투여할 수 있다.
항체 (또는 그의 항원 결합성 단편)는 단일 1일 용량으로 투여할 수 있거나, 또는 총 1일 용량을 1일 2회, 3회 또는 4회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 매일 보다는 덜 자주 투여할 수 있는데, 예를 들어 1주 6회, 1주 5회, 1주 4회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여할 수 있다. 상기 조성물은 또한, 지속 방출 제형, 예컨대 특정 기간에 걸쳐 사용하기 위하여 조성물을 서서히 방출시키고 조성물이 덜 자주 투여될 수 있게, 예컨대 1개월 1회, 2 내지 6개월마다 1회, 1년 1회, 또는 심지어 단일 투여될 수 있게 해주는 이식제로 투여될 수 있다. 지속 방출 용기 (예컨대 펠릿, 나노입자, 마이크로입자, 나노구, 미소구 등)를 주사에 의해 투여할 수 있거나 또는 수술에 의해 각종 위치에 체내 이식될 수 있다.
암 치료는, 예를 들어 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 병세 진행까지의 시간, 생존 지속 기간, 질환 진행이 없는 생존, 전반적인 반응 속도, 반응 지속 기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 요법의 효능을 결정하기 위한 접근 방식을 이용할 수 있는데, 예를 들어 방사선 영상화를 통하여 반응을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료 효능은 다음 방정식을 이용하여 계산된 종양 성장 억제 비율 (%) (% TGI)로서 측정된다: 100-(T/C x 100) (여기서, T는 처리된 종양의 평균 상대적 종양 용적이고, C는 처리되지 않은 종양의 평균 상대적 종양 용적이다). 특정 실시양태에서, % TGI는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 또는 95% 초과이다. 특정 실시양태에서 항-EGFR의 % TGI는 에르비툭스®의 % TGI와 동일하거나 이보다 더 큰데, 예컨대 에르비툭스®의 % TGI보다 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.6배, 약 2.7배 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함), 또는 약 2.7배 초과하여 더 크다.
제약 제형
항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)는 투여에 적합하도록 적합한 담체 또는 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 상기 항체의 적합한 제형은, 목적하는 순도를 갖는 항체 (또는 그의 단편)를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제의 형태로 수득한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이는 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저 분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 예시되는 항체 제형은 W098/56418 (본원에 명확히 참조로 포함된다)에 기재되어 있다. 피하 투여를 위해 적응시킨 동결건조된 제형이 W097/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형은 적합한 희석제와 재구성되어 고 단백질 농도가 되도록 할 수 있고, 이와 같이 재구성된 제형을, 본원에서 치료하고자 하는 포유류에게 피하 투여할 수 있다.
본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대해 필요한 바와 같은 2가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 2가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 항-신생물제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 화학요법제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재하는 것이 적합하다. 상기 기타 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 좌우된다. 이들은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 동일한 투여량 및 투여 경로, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다. 활성 성분을 또한, 예를 들어 액적형성(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)], 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
리포펙틴 또는 리포솜을 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물을 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합성 도메인과 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 근거하여, 표적 단백질 서열과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성할 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., PNAS USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조).
활성 성분을, 예를 들어 액적형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 (Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 참조)에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 상기 항체 (또는 그의 단편)를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)], 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일에 걸쳐 분자의 방출을 가능케 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다. 피막화된 항체가 체내에 장시간 동안 잔존할 경우, 이들은 37℃ 하에 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 기전에 따라서, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써, 안정화를 달성시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 제형은 본원에 기재된 항-EGFR 항체를 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 2 mg/ml 초과, 약 3 mg/ml 초과, 약 4 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 6 mg/ml 초과, 약 7 mg/ml 초과, 약 8 mg/ml 초과, 약 9 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 11 mg/ml 초과, 약 12 mg/ml 초과, 약 13 mg/ml 초과, 약 14 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 16 mg/ml 초과, 약 17 mg/ml 초과, 약 18 mg/ml 초과, 약 19 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 약 21 mg/ml 초과, 약 22 mg/ml 초과, 약 23 mg/ml 초과, 약 24 mg/ml 초과, 약 25 mg/ml 초과, 약 26 mg/ml 초과, 약 27 mg/ml 초과, 약 28 mg/ml 초과, 약 29 mg/ml 초과, 또는 약 30 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 시트레이트, NaCl, 아세테이트, 숙시네이트, 글리신, 폴리소르베이트 80 [트윈(Tween) 80], 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 완충제에서 제제화된다 [예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로 제제화된다]. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 약 100 mM 내지 약 150 mM 글리신을 포함하는 완충제에서 제제화된다 [예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로 제제화된다]. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 약 50 mM 내지 약 100 mM NaCl을 포함하는 완충제에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 약 10 mM 내지 약 50 mM 아세테이트를 포함하는 완충제에서 제제화된다 [예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로 제제화된다]. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 약 10 mM 내지 약 50 mM 숙시네이트를 포함하는 완충제에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 약 0.005% 내지 약 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제에서 제제화된다 [예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로 제제화된다]. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 약 5.1 내지 5.6의 pH를 갖는 완충제에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제에서 제제화되는데, 여기서 제형은 pH 5.5이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 EFGR 항체 [예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도 하에 있다]를 포함하는 제형 [예컨대, 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제를 포함하는 제형 (여기서, 이러한 제형은 pH 5.5이다)]은 실온 (예컨대, 약 20 내지 25℃)에서 약 0.5주, 1.0주, 1.5주, 2.0주, 2.5주, 3.5주, 4.0주, 4.5주, 또는 5.0주 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 동안 안정적이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 EFGR 항체 [예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도 하에 있다]를 포함하는 제형 [예컨대, 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제를 포함하는 제형 (여기서, 이러한 제형은 pH 5.5이다)]은 가속 조건 (예컨대, 약 37℃에서의 저장) 하에 약 0.5주, 1.0주, 1.5주, 2.0주, 2.5주, 3.5주, 4.0주, 4.5주, 또는 5.0주 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 동안 안정적이다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 물리적 및 화학적 불안정성에 상응하는 잠재적 단편화 및 응집을 검출하는 단백질 안정성 연구에 사용되는 것으로 널리 공지되어 있고 광범위하게 사용되는 방법이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 고 분자량 종과 비교해서, 37℃에서 1주 후에 고 분자량 종 (HMWS)에 있어서 약 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 고 분자량 종과 비교해서, 37℃에서 2주 후에 고 분자량 종에 있어서 약 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 고 분자량 종과 비교해서, 37℃에서 4주 후에 고 분자량 종에 있어서 약 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3.0%, 2.9%, 2.8%, 2.7%, 2.6%, 2.5%, 2.4%, 2.2%, 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 증가를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 저 분자량 종과 비교해서, 37℃에서 1주 후에 저 분자량 종 (LMWS)에 있어서 약 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 저 분자량 종과 비교해서, 37℃에서 2주 후에 저 분자량 종에 있어서 약 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 저 분자량 종과 비교해서, 37℃에서 4주 후에 저 분자량 종에 있어서 약 2.4%, 2.2%, 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 증가를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 단량체와 비교해서, 37℃에서 1주 후에 단량체에 있어서 약 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 또는 3.5% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 감소를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 단량체와 비교해서, 37℃에서 2주 후에 단량체에 있어서 약 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 또는 3.5% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 감소를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형은 SEC를 이용하여 측정된 바와 같이, 초기 % 단량체와 비교해서, 37℃에서 2주 후에 단량체에 있어서 약 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 또는 3.5% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 감소를 나타낸다.
양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)는 단백질 분해 현상, 예컨대 탈아미드화 또는 산화를 검출하는 것으로 널리 공지되어 있고 광범위하게 사용되는 도구이다 (Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603). 산성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 먼저 용출되는 변이체인 반면, 염기성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 나중에 용출되는 변이체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 산성 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 1주 후에 총 단백질의 약 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 산성 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 2주 후에 총 단백질의 약 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 또는 18% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 산성 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 2주 후에 총 단백질의 약 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 또는 27% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 염기성 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 1주 후에 총 단백질의 약 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 염기성 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 2주 후에 총 단백질의 약 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 염기성 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 4주 후에 총 단백질의 약 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46% 이하 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 주요 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 1주 후에 총 단백질의 약 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46% 이상 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 주요 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 2주 후에 총 단백질의 약 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46% 이상 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-EFGR 항체 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 25 mg/ml를 포함하는 제형의 주요 피크 분획은 CEX를 이용하여 측정된 바와 같이, 37℃에서 4주 후에 총 단백질의 약 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46% 이상 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 예를 들어, 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
항-표피 성장 인자 수용체 항체를 이용한 진단 및 영상화 방법
EGFR 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 표지된 항-EGFR 항체, 그의 단편, 및 그의 유도체 및 유사체는 EGFR의 발현, 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 및/또는 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)는 계내, 생체내, 생체외, 및 시험관내 진단 검정 또는 영상화 검정에 사용될 수 있다. EGFR 폴리펩티드의 발현을 검출하는 방법은 (a) 본 발명의 하나 이상의 항체를 이용하여 특정 개체의 세포 (예를 들어, 조직) 또는 체액 내에서의 상기 폴리펩티드의 발현을 검정하는 단계 및 (b) 이러한 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 상기 검정된 유전자 발현 수준이 표준 발현 수준과 비교해서 증가되거나 또는 감소되는 것이 이상한 발현을 암시하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 부가의 실시양태는 특정 동물 (예를 들어, 포유류, 예컨대 인간)에서의 EGFR의 발현 또는 이상한 발현과 연관된 질환 또는 장애를 진단하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 포유류에서 EGFR 분자를 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 진단은 (a) 유효량의 표지된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)를 포유류에게 투여하는 단계; (b) 투여 후, EGFR 분자가 발현되는 대상체 내의 특정 부위에 상기 표지된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)가 우선적으로 집중될 수 있도록 해주는 시간 간격 동안 (및 결합되지 않은 표지된 분자가 제거되어 배경 수준으로 되는 시간 간격 동안) 기다리는 단계; (c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 상기 대상체에게서 표지된 분자를 검출하는 단계 (여기서, 표지된 분자가 배경 수준 위로 검출되는 것은 대상체가 EGFR의 발현 또는 이상한 발현과 연관된 특별한 질환 또는 장애가 있다는 것을 표시한다)를 포함한다. 배경 수준은 검출된 표지된 분자의 양을, 특별한 시스템에 대하여 기존에 결정된 표준 값과 비교하는 것을 포함한 각종 방법에 의해 결정할 수 있다.
본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 이용하여 특정 생물학적 샘플 중의 단백질 수준을 검정하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jalkanen, et al., J. Cell. Biol . 101:976-985 (1985)]; [Jalkanen, et al., J. Cell. Biol . 105:3087-3096 (1987)] 참조). 단백질 유전자 발현을 검출하는 데 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역검정, 예컨대 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 및 방사성 면역검정 (RIA)을 포함한다. 적합한 항체 검정 표지는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 효소 표지, 예컨대 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소, 예컨대 요오드 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중 수소 (3H), 인듐 (115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc, 99mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 크세논 (133Xe), 불소 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; 루미놀; 및 형광성 표지, 예컨대 플루오레스세인 및 로다민, 및 바이오틴을 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 기술을 본원에 제공된 표지된 항체 (또는 그의 단편)에 적용할 수 있다. 이러한 기술은 이관능성 접합제를 사용하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; 및 5,808,003 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 한편으론, 또는 부가적으로, 예를 들어 EGFR-코딩 핵산 또는 그의 보체에 상응하는 핵산 기반 프로브를 이용하는 형광성 계내 혼성화 (FISH; 1998년 10월에 공개된 W098/45479 참조), 서던 블롯팅, 노던 블롯팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통하여, 세포 내에서 EGFR 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을 측정할 수 있다. 또한, 예를 들어 항체-기반 검정을 이용하여, 생물학적 유체, 예컨대 혈청 중의 유출된 항원을 측정함으로써 EGFR 과발현을 연구할 수 있다 (또한, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,933,294 (1990년 6월 12일에 허여됨); W091/05264 (1991년 4월 18일에 공개됨); 미국 특허 번호 5,401,638 (1995년 3월 28일에 허여됨); 및 문헌 [Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)] 참조). 상기 검정 이외에도, 각종 생체내 및 생체외 검정이 전문 시술자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 포유류의 체내의 세포를, 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지시킨 항체에 노출시킬 수 있고; 예를 들어, 이러한 항체에 이미 노출시킨 포유류로부터 취한 샘플 (예를 들어, 생검 또는 기타 생물학적 샘플)을 분석하거나 또는 방사성 활성에 관하여 외부 스캐닝함으로써, EFGR에 대한 항체의 결합을 평가할 수 있다.
제조품 및 키트
본원에 제공된 또 다른 실시양태는 암, 예컨대 두경부암, 폐암, 또는 결장직장암 (예를 들어 종양)을 치료하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 이러한 제조품은 용기; 및 이러한 용기 위에 있거나 또는 이와 회합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 각종 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 상기 병태를 치료하는 데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 특별한 병태를 치료하는 데 사용된다는 것을 표시한다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 항체 조성물을 환자에게 투여하는 것에 관한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 조합 요법을 포함하는 제조품 및 키트가 또한 고려된다.
패키지 삽입물은 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 치료 제품의 사용과 관련한 경고에 관한 정보를 함유하고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭한다. 한 실시양태에서, 패키지 삽입물은 상기 조성물이 암 (예컨대 두경부암, 폐암, 또는 결장직장암)을 치료하는 데 사용된다는 것을 표시한다.
부가적으로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
각종 목적에 유용한, 예를 들어 환자에게서 EGFR을 단리하거나 또는 검출하는 데 유용한 키트가, 임의로 제조품과 조합하여 또한 제공된다. EGFR의 단리 및 정제를 위해서는, 상기 키트가 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)와 커플링된, 본원에 제공된 항-EGFR 항체 (또는 그의 단편)를 함유할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 EGFR을 검출 및 정량화하기 위한 항체 (또는 그의 단편)를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품과 같이, 키트는 용기; 및 이러한 용기 위에 있거나 또는 이와 회합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 예를 들어, 용기는 본원에 제공된 적어도 하나의 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물을 보유하고 있다. 예를 들어, 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 함유하는 부가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물의 설명뿐만 아니라 의도한 시험관내 또는 진단 사용에 관한 설명서를 제공할 수 있다.
실시예
실시예 1. 글리코실화 및 아글리코실화 CDR -H2 항-표피 성장 인자 항체의 생성 및 친화성 성숙
생식세포 계열 중쇄 가변 영역 VH3.48 및 생식세포 계열 경쇄 가변 영역 VK3.11을 이용하여, 인간화 항-EGFR 항체 348311을 생성하였다. 이어서, 348311을 시험관내 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 실험에 사용하여, 개선된 결합 성능을 나타내는 클론을 생성하였다. 먼저, PCR을 통하여 CDR-L3/CDR-H3 핵산 라이브러리를 생성시키고, 이를 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝한 다음, 이. 콜라이 (E. coli) 내로 형질전환시켜 파지의 라이브러리를 생산하였다. 패닝 2회전 후, 284 Fab 클론을 ELISA를 통하여 스크리닝하였고, 7개 클론 (즉, 1-15, 1-16, 1-26, 1-86, 2-48, 1-13, 및 3-66)이 348311과 동등하거나 이보다 더 우수한 결합 성능을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 1). 다음 경쇄/중쇄 조합을 포함하는 완전한 길이의 IgG 클론을 이용하여 추가의 ELISA를 수행하였다: 348311/348311 (LC/HC), 1-15/348311 (LC/HC), 1-26/348311 (LC/HC), 1-86/348311 (LC/HC), 2-48/348311 (LC/HC), 348311/1-26 (LC/HC), 1-15/1-26 (LC/HC), 1-26/1-26 (LC/HC), 1-86/1-26 (LC/HC), 및 2-48/1-26 (LC/HC). HLX05 (즉, 사내에서 생산된 에르비툭스® 바이오시밀러 항체)를 또한 시험하였다. 1-26의 중쇄를 포함하는 클론은 348311의 중쇄를 포함하는 클론보다 더 우수한 EGFR에 대한 결합 성능을 나타냈다 (도 2 참조).
1-26 중쇄를 선택하고, 이를 글리코실화 부위의 결실을 위한 CDR-H2 라이브러리를 생성하기 위한 기준으로서 사용하였다. PCR을 통하여 CDR-H2 핵산 라이브러리를 생성시키고, 이를 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝한 다음, 이. 콜라이 내로 형질전환시켜 파지의 라이브러리를 생산하였다. 패닝 2회전 후, 2개의 클론, 즉 2-68 및 3-67을 ELISA를 통하여 스크리닝하였는데, 개선된 결합 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 사내에서 생산된 EGFR 항원, 및 다음 경쇄/중쇄 조합을 포함하는 항-EGFR 항체 클론으로 코팅된 웰에서 이탈 속도 ELISA를 수행하였다: 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), 1-26/1-26 (LC/HC) 및 348311/1-26 (LC/HC). 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), 및 348311/1-26 (LC/HC)을 포함하는 클론은 이탈 속도 ELISA에서 HLX05보다 더 높은 EGFR-결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 3).
클론 3-67을 CDR-L1/CDR-L2/CDR-H1 라이브러리를 생성시키기 위한 기준으로서 사용하였다. PCR을 통하여 CDR-L1/CDR-L2/CDR-H1 핵산 라이브러리를 생성시키고, 이를 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝한 다음, 이. 콜라이 내로 형질전환시켜 파지의 라이브러리를 생산하였다. 패닝 2회전 후, 클론 #8, #31, #33, 및 #34를 ELISA를 통하여 스크리닝하였는데, 에르비툭스®와 유사한 친화도로 EGFR과 결합하는 것으로 밝혀졌다.
클론 1-26, 2-68, 3-67, #8, #31, #33, 및 #34의 중쇄 및 경쇄를 셔플링하여 부가의 항-EGFR 항체 변이체를 생성시켰는데, 이를 또한 ELISA에서 시험하였다. 직접 결합 ELISA에서 추가로 분석하기 위하여, 다음 선도 항체를 선택하였다: 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), #8/#33 (LC/HC), 및 #34/#33 (LC/HC). 간략하게 설명하면, 각 클론, HLX05, 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함), 및 리툭시맙 (즉, 항-CD20 항체)의 일련의 희석물을 미량역가 디쉬의 웰에서 염소 항-fd 항체로 포획하였다. 각 웰에서 포획된 항체의 양을, 항-인간 카파-HRP-접합된 2차 항체를 이용하여 정량화하였다. 이러한 HRP-접합된 2차 항체를 상기 웰에 가하고, 인큐베이션한 후, 과량의 2차 항체를 세척 제거하였다. TMB를 상기 웰에 가하고, 인큐베이션한 후, 반응을 중단한 다음, 450 nm 하에서의 흡광도 상의 증가를 모니터링함으로써 HRP 활성을 측정하였다. EGFR-AP 융합 단백질을 웰에 부가함으로써 EGFR 결합성을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, pNPP를 웰에 가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 405 nm 하에서의 흡광도 상의 증가를 모니터링함으로써 AP 활성을 측정하였다. 항체 농도를 AP 활성의 함수로서 플롯하였다 (도 4). 도 4에 도시된 바와 같이, 클론 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC)이 HLX05 및 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함)와 유사한, EGFR에 대한 결합 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
클론 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC); #8/#33 (LC/HC), #34/#33 (LC/HC), HLX05, 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함), 및 리툭시맙을 대상으로 하여, 바이오티닐화 HLX05와의 EGFR 결합을 알아보기 위하여 경쟁적 ELISA에서 시험하였다. 간략하게 설명하면, 각 항체의 샘플을 바이오티닐화 HLX05와 미리 혼합하였다. 이어서, 알칼리성 포스파타제-접합된 EGFR을 상기 미리 혼합된 용액에 가하고, 실온에서 1시간 동안 미리 인큐베이션하였다. 그 다음, 이러한 미리 인큐베이션한 혼합물을, 아비딘으로 코팅된 미량역가 웰에 가하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 모든 웰을 PBST로 세척하고, pNPP를 각 웰에 가하였다. 37℃에서 제2 인큐베이션한 후, 반응을 중단하였다. 405 nm 하에서의 흡광도 상의 증가를 모니터링함으로써 알칼리성 포스파타제 활성을 측정하였다. 시험된 모든 클론은 HLX05 또는 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함)보다 더 높은 경쟁 능력을 나타내었다 (도 5). 이러한 결과는 또한, 시험된 모든 클론이 에르비툭스®와 동일한 EGFR의 에피토프와 결합한다는 것을 검증시켜 준다.
클론 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC); #8/#33 (LC/HC), 및 #34/#33 (LC/HC)은 각각, 글리코실화 부위를 제거하도록 조작한 CDR-H2를 포함한다. 전체 IgG 클론 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC); #8/#33 (LC/HC), 및 #34/#33 (LC/HC), 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함), 및 HLX05의 글리코실화 프로파일을, HPLC를 통하여 분석하였다. G0F 및 G1F가 시험된 클론 중 대부분의 유형의 글리칸을 차지하는 반면, G0는 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함)와 HLX05 둘 다 상에서 검출되었다 (도 6). 1-26/3-67 (LC/HC), 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함), 및 HLX05의 Fab 단편 및 Fc 단편 상에서 부가의 글리칸 분석을 수행하였다. G0F 및 G1F가 1-26/3-67의 Fc 상에서 검출되었지만, 1-26/3-67의 Fab 상에서 글리칸이 전혀 검출되지 않았다. 이와는 달리, 미량의 G2F 뿐만 아니라 G0F 및 G1F가 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함)와 HLX05 둘 다로부터의 Fc 단편 상에서 검출되었다. G2F+2*Gal 및 G2F+Gal+SA(NeuAc)가 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함)의 Fab 단편 상에서 검출되었고, G2F+2*SA(NeuAC) 및 G2F+Gal+SA(NeuAc)가 HLX05의 Fab 단편 상에서 검출되었다 (도 6).
SPR을 사내에서 생산된 HLX05, 348311/2-68 (LC/HC), 1-26/2-68 (LC/HC), 348311/3-67 (LC/HC), 및 1-26/3-67 (LC/HC) 상에서 수행하였다. 그 결과가 다음 표 5에 제시되어 있다.
<표 5>
Figure 112016127814969-pct00006
클론 1-26/2-68은 6.49 x 10-11의 Kd를 갖는 것으로서, 즉 EGFR에 대한 친화도가 HLX05의 2배인 것으로 측정되었다. 1-26/3-67은 1.09 x 10-10의 Kd를 갖는 것으로서, 즉 EGFR에 대한 친화도가 HLX05의 1.2배인 것으로 측정되었다.
1-26 경쇄와 2-68 또는 3-67 중쇄를 포함하는 IgG 클론은 EGFR에 대한 친화도가 HLX05 보다 2배 내지 3배 더 높은 것으로 입증되었다 (하기 표 6 참조).
<표 6>
Figure 112016127814969-pct00007
친화성 성숙을 통하여 생성된 항-EGFR 항체 클론의 FcγRIIIA 결합성을, ELISA를 통하여 검정하였다. 간략하게 설명하면, 미량역가 웰을 FcγRIIIA로 코팅하고 BSA로 차단시켰다. 다음 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 부가하였다: 사내에서 생산된 HLX05, 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), #8/#33 (LC/HC), #34/#33 (LC/HC), 및 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함). 1시간 인큐베이션한 후, 항-인간 카파 경쇄-HRP 접합된 항체를 각 웰에 가하였다. TMB 기질을 상기 웰에 가하고, 7분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 중단시킨 후, 450 nm 하에서의 흡광도 상의 증가를 모니터링함으로써 HRP 활성을 측정하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 각각의 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/ HC), #8/#33 (LC/HC), #34/#33 (LC/HC)은 에르비툭스® (머크 카게아아로부터 구입함) 및 HLX05와 유사한 친화도로 FcγRIIIa와 결합한다.
친화성 성숙을 통하여 생성된 항체 클론의 ADCC 활성을 사내에서 생산된 HLX05의 ADCC 활성과 비교하였다. 검정을 문헌 [Suzuki et al. (2007) "A Nonfucosylated Anti-HER2 Antibody Augments Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in Breast Cancer Patients." Clin Cancer Res 13, 1875-1882]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시험된 모든 클론은 사내에서 생산된 HLX05와 유사한 ADCC 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. #34/#33 (LC/HC)은 약간 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 8a-g).
인간 A431 유표피 암종 세포에 대한 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), #8/#33 (LC/HC), #34/#33 (LC/ HC), 및 HLX05의 항증식 효과를 MTT 검정에서 비교하였다. MTT 비색 검정은 증식 및 세포독성 연구에서 생존 세포수를 결정하는 것으로 정립된 방법이다. 이러한 검정은 미토콘드리아 효소에 의해 가용성 블루 포르마잔 생성물을 형성하기 위한 황색 테트라졸륨 염 (MTT)의 절단에 근거하고, 이로써 생성된 포르마잔의 양은 MTT 노출 동안 존재하는 살아있는 세포 (죽은 세포가 아니다)의 수에 정비례한다 (문헌 [Mosmann (1983) J Immunol Methods 1983, 65:55-63] 참조). 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), #8/#33 (LC/HC), #34/#33 (LC/HC) 또는 HLX05를 증가 농도로 상기 세포에 가하였다. 인큐베이션한 후, MTT 시약을 세포에 가하였다. 이로써 생성된 MTT-생성물을, 570 nm 하에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 다음 식을 이용하여 세포 생존능력을 결정하였다:
생존능력 % = (샘플의 광학 밀도/대조군의 광학 밀도) X 100
시험된 임의의 세포주 상에서 증식의 50% 억제를 나타내는 농도로서 IC50 값을 계산하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 1-26/2-68 (LC/HC), 1-26/3-67 (LC/HC), #8/#33 (LC/HC), 및 #34/#33 (LC/HC)은 HLX05와 비교해서 개선된 항증식 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
인간 A431 유표피 암종 종양 이종이식편을 보유하고 있는 마우스를 이용하여, 본원에 기재된 항-EGFR 항체의 치료 효능을 검정하였다. 간략하게 설명하면, 인간 A431 상피 암종 세포 (접종물 = 2x106개 세포)를 수컷 BALB/c 누드 마우스 체내로 이식하였다. 마우스를 5개 군으로 무작위 분류하였다. 각 군을 하기 표 7에 기재된 투여 요법 중 하나로 처리하였다:
<표 7>
Figure 112016127814969-pct00008
치료를 시작한 지 35일 후, 에르비툭스®로 처리된 마우스 내의 종양은 위약이 투여된 마우스 내의 종양보다 약 26% 더 작았다. 1-26/2-68로 처리된 마우스 내의 종양은 위약이 투여된 마우스 내의 종양보다 약 31% 더 작았다 (p<0.05). #8/#33 또는 #34/#33으로 처리된 마우스 내의 종양은 위약이 투여된 마우스 내의 종양보다 약 50% 더 작았고 (p<0.01), 에르비툭스®가 투여된 마우스 내의 종양보다 대략 50% 더 작았다 (p<0.05) (도 10 및 하기 표 8 참조).
<표 8>
Figure 112016127814969-pct00009
1TV : 종양 용적 (mm3)
2RTV : 초기와 비교한 종양 용적
3TV/CV% : 처리군 용적/대조군 용적
4TGI% : 종양 성장 억제율 = 1-(T35-T0)/(C35-C0)%
5p 값 : < 0.05 = * <0.01= ** <0.001=***
혈청 샘플을 제3일 및 제35일에 각 마우스로부터 취하여, 이들 두 시점에서의 #34/#33, 1-26/3-67, 1-26/2-68, 또는 에르비툭스®의 혈청 농도를 결정하였다. 간략하게 설명하면, 미량역가 디쉬의 웰을, 8배 희석시킨 EGFR-AP로 코팅하였다. 혈청 샘플을 5,000배 희석시키고, 이를 상기 웰에 가하였다. 각 웰에서 포획된 항체의 양을, 염소-항-인간 IgG-Fc-HRP-접합된 2차 항체를 이용하여 정량화하였다. 이 실험을 이중으로 수행하였고, 그 결과가 도 11에 도시되어 있다. #34/#33, 1-26/3-67, 1-26/2-68의 혈청 수준은 제3일과 제35일 둘 다에 에르비툭스®의 혈청 수준보다 더 높았다.
실시예 2. FaDu 하인두 편평 세포 암종 종양 이종이식편 검정
인간 FaDu 하인두 편평 세포 암종 종양 이종이식편을 보유하고 있는 마우스를 이용하여, 본원에 기재된 항-EGFR 항체의 치료 효능을 검정하였다. 간략하게 설명하면, 인간 FaDu 하인두 편평 세포 암종 세포 (접종물 = 2x106개 세포)를 암컷 BALB/c 누드 마우스 체내에 피하 이식하였다. 마우스를 각각 7마리 마우스를 함유하는 4개 군으로 무작위 분류하였다. 각 군을 하기 표 9에 기재된 투여 요법 중 하나로 처리하였다:
<표 9>
Figure 112016127814969-pct00010
치료를 시작한 지 17일 후, 에르비툭스®로 처리된 마우스 내의 종양은 위약이 투여된 마우스 내의 종양보다 약 38% 더 작았다. HLX05로 처리된 마우스 내의 종양은 위약이 투여된 마우스 내의 종양보다 약 29% 더 작았다 (p<0.05). 1-26/3-67로 처리된 마우스 내의 종양은 위약이 투여된 마우스 내의 종양보다 약 51% 더 작았다 (p<0.01) (도 12 및 하기 표 10 참조).
<표 10>
Figure 112016127814969-pct00011
또 다른 세트의 실험에서는, NOD-SCID 마우스에게 항체 치료 + 방사선 요법 (XRT)을 제공하였다. 간략하게 설명하면, 인간 FaDu 하인두 편평 세포 암종 세포 (접종물 = 1x106개 세포)를 수컷 NOD-SCID 마우스 체내에 피하 이식하였다. 마우스를 3개 군으로 무작위 분류하였다. 각 군을 하기 표 11에 기재된 투여 요법 중 하나로 처리하였다:
<표 11>
Figure 112016127814969-pct00012
치료한 지 5일 후, 에르비툭스와 XRT 조합 치료가 제공된 마우스 내의 종양은 XRT 단독이 제공된 마우스 내의 종양보다 91% 더 작았다. HLX07과 XRT 조합 치료가 제공된 마우스 내의 종양은 XRT 단독이 제공된 마우스 내의 종양보다 105% 더 작았다 (도 13 및 하기 표 12 참조). (RT = 방사선 요법)
<표 12>
Figure 112016127814969-pct00013
실시예 3. 항-표피 성장 인자 항체-약물 접합체
DM1 (N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)마이탄신)은 유사분열 정지를 유도시키는 것으로 밝혀진 미세소관 어셈블리의 강력한 억제제이다 (예를 들어, 문헌 [Chan (2008) Acc Chem Res 41, 98-107]; [Oroudjev et al. (2010) Mol Cancer Ther 9, 2700-2713]; 및 [Remillard et al.(1975) Science 189, 1002-1005] 참조). HLX07-DM1 접합체를 제조하였고, 항암제로서의 그의 효능을 다음에 기재되는 바와 같이 평가하였다.
PD10 탈염 칼럼을 이용하여 HLX07을 PBS, pH 6.5 내로 제제화하였다. 동일한 완충제를 이용하여 HLX07의 최종 농도를 7.5 mg/mL로 조정하였다. 별도의 튜브에서, DM1 및 SMCC를 10 mM DMF 용액으로서 제조하였다. 등 용적의 DM1 용액과 SMCC 용액을 혼합하고, 실온에서 30분 동안 반응을 완료시켰다. 이어서, DM1-SMCC를 4.5 대 1 몰 비로 HLX07 용액에 부가하였다. 상기 혼합된 용액을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PD10 칼럼을 이용하여, 과량의 작은 반응물을 제거하였다. A252로부터 적당히 교정하면서, A280을 이용하여 항체-약물 접합체의 농도를 결정하였다. A280/A252 비를 이용하여 상기 약물-대-항체 비를 결정하였다.
EGFR-양성 인간 결장암 세포의 억제를 매개할 수 있는 HLX07-DM1의 능력은 DiFi (KRASWT 및 BRAFWT), HCT-116 (KRASG13D), 및 HT-29 (BRAFV600E) 세포주를 이용하는 일련의 시험관내 실험에서 측정하였다. 모든 연구에서, 각 세포주로부터의 세포를, 37℃에서 3일 동안 증가 농도의 HLX07-DM, HLX07, 또는 대조군 항체 (항-CD20) (일련의 3배)와 함께 인큐베이션하였다. MTT 검정을 이용하여 성장 억제를 측정하였다. 활성 대사를 나타내는 생존 세포는 MTT [즉, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, 황색 염료]를 565 nm 하의 흡광도를 이용하여 자주 색상의 포르마잔 생성물로 전환시킨다. 도 14a에 도시된 바와 같이, HLX07-DM1과 HLX07의 성장 억제 효과는 EGFR 야생형 DiFi 인간 직장 암종 세포에서 유사하였다. 그러나, HLX07-DM1 만은 KRAS 돌연변이된 HCT-116 (도 14b) 및 BRAF 돌연변이된 HT-29 세포 (도 14c)에 대한 항증식 효과를 나타내었다.
실시예 4. 아푸코실화 항-표피 성장 인자 항체
푸코스 무함유 HLX07 (즉, HLX07-FF)의 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 활성을 평가하기 위하여, 이펙터 세포로서 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC, 및 표적 세포로서 KRAS에 대하여 야생형인 인간 직장 암종 세포주인 DiFi를 이용하여, ADCC 검정을 수행하였다. 인간 PBMC를, 히스토파크(Histopaque®)-1077 [시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)]을 이용하여 건강한 공여자의 전혈로부터 신선하게 제조하고, 이를 RPMI 배지 (L-글루타민, 25 mM HEPES, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640)에서 5x106개 세포/mL의 밀도로 현탁시켰다. 상기 DiFi 표적 세포를 RPMI 배지에 현탁시키고, 96-웰 U-바닥 미량역가 판에 1x104개 세포/웰로 플레이팅하였다. HLX07-FF, HLX07, 및 대조군 항체 (항-CD20)의 일련의 희석물을 1.5 pg/ml 내지 3.3 ng/mL의 각종 농도 하에 개개의 웰에 가하였다. 이어서, PBMC를 상기 웰에 가하여, 25:1의 이펙터 세포:표적 세포 비를 달성하고, 상기 판을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 이러한 판을 원심분리시키고, 상등액을 대상으로 하여 락테이트 데히드로게나제 활성에 관하여 검정하였다. 490 nm 하에서의 상기 상등액의 흡광도를 기록하여, 시토스캔(Cytoscan™)-LDH 세포독성 검정 키트 [G-바이오사이언스(Bioscience)]를 이용하여 락테이트 데히드로게나제의 방출을 결정하였다. 시험된 세포주 상에서 ADCC의 50% 유도를 나타내는 농도로서의 EC50 값을 계산하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, HLX07-FF는 1.69 ng/ml에서 50% 유도를 나타냈는데, 이는 50% 유도를 나타내는 데 필요한 HLX07의 농도 (즉, 4.388 ng/ml)보다 60% 더 낮은 농도이다.
KRAS 돌연변이는 전이성 결장암에서 에르비툭스에 대한 저항성을 나타내는 것으로 예상되는 바이오마커이다 (문헌 ["Class Labeling Changes to anti-EGFR monoclonal antibodies, cetuximab (Erbitux) and panitumumab (Vecitibix): KRAS Mutations." U.S. Food and Drug Administration 2010-01-11] 참조). KRAS-돌연변이된 세포에서 HLX07-FF 및 HLX07의 ADDC 활성을 비교하기 위하여, HCT-116, 즉 KRASG13D 돌연변이를 갖는 인간 결장 암종 세포주를 표적 세포로서 사용하여 상기 언급된 검정을 반복하였다. 이러한 검정은 30:1 이펙터 세포:표적 세포 비를 이용하여 수행하였다. HLX07-FF, HLX07, 및 대조군 항체 (항-CD20)의 일련의 희석물을, 일련으로 3배 희석시킨 후 0.1 ㎍/ml 내지 5.1 pg/ml의 각종 농도로 개개의 웰에 부가하였다. 도 15b에 도시된 바와 같이, HLX07-FF는 비-푸코실화 HLX07보다 HCT-116 세포에서 4.8배 더 높은 ADCC 활성을 명확하게 보여주었다.
BRAF 돌연변이는 전이성 결장암에서 에르비툭스에 대한 저항성을 나타내는 것으로 예상되는 바이오마커이다 (문헌 [Di Nicolitano et al. (2008) J. Clin Oncol. 26, 5705-5712] 참조). BRAF-돌연변이된 세포에서 HLX07-FF 및 HLX07의 ADDC 활성을 비교하기 위하여, HT29, 즉 BRAFV600E 돌연변이를 갖는 인간 결장직장 선암종 세포주를 표적 세포로서 사용하여 상기 언급된 검정을 상기 언급된 바와 같이 반복하였다. 이러한 검정은 30:1 이펙터 세포:표적 세포 비를 이용하여 수행하였다. HLX07-FF, HLX07, 및 대조군 항체 (항-CD20)의 일련의 희석물을, 일련으로 3배 희석시킨 후 0.1 ㎍/ml 내지 5.1 pg/ml의 각종 농도로 개개의 웰에 부가하였다. 도 15c에 도시된 바와 같이, HLX07-FF는 푸코실화 HLX07보다 HT29 세포에서 4.7배 더 높은 ADCC 활성을 명확하게 보여주었다.
실시예 5. 항-표피 성장 인자 항체의 약동학적 프로파일
2마리의 시노몰구스 원숭이 (1마리는 수컷이고 다른 1마리는 암컷이다)에게 항체 (즉, 33/34-#1, 33/34-#2, 3/67-#3, 및 3/67-#4)를 24 mg/kg으로 정맥내 주사하였다. 각종 주입 후 시점에서 ELISA 방법에 의해 항-EGFR 항체의 혈청 농도를 측정하였다. 상기 항체를 이용하여 두 번째 세트의 시노몰구스 원숭이에서 상기 실험을 반복하였다. 도 16a에서의 혈청 농도-시간 프로파일에 나타낸 바와 같이, 항체 3/67이 항체 34/33보다 대략 100시간 더 길게 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 검출될 수 있다. 도 16b는 시노몰구스 원숭이에서 HLX05 (1-3) 및 에르비툭스® (즉, 4-6)의 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한 것이다.
실시예 6. 안정한 세포주로부터의 항-표피 성장 인자 항체의 생성
HLX07 1-26/3-67 상부 서브클론을, 정립된 DASGIP 바이오반응기 플랫폼에 연결시킴으로써 스크리닝하였다. 공급-배치식 영양 공급 스케줄, 부티레이트 부가 및 저온 인큐베이션 조건 (pH를 7로 제어함)을 이용하여, 서브클론 1-26/3-67-45-9는 제17일 정도에 4.9 g/L에 도달하였다 (도 17 참조).
실시예 7. 항-표피 성장 인자 항체의 안정성
5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 및 25 mg/ml를 함유하는 HLX07 항체 제형에 가속 저장 조건 (즉, 37℃)을 4주 이하 동안 적용한 안정성 연구를 수행하였다. 0주, 1주, 2주, 및 4주 시점에 각 제형으로부터 샘플을 취하고, 이를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)를 통하여 분석하였다. SEC는 항체 응집체 (즉, 고 분자량 종, 또는 HMWS), 단량체, 및 단편 (즉, 저 분자량 종, 또는 LMWS)을 검출하기 위해 광범위하게 사용되고 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)는 단백질 분해 현상, 예컨대 탈아미드화 또는 산화를 검출하는 것으로 널리 공지되어 있고 광범위하게 사용되는 도구이다 (Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603). 분해 생성물은 전형적으로, 주요 종과 비교해서 산성 또는 염기성 종으로서 지칭된다. 산성 종은 보다 낮은 겉보기 pI를 나타내는 변이체이고, 염기성 종은 보다 높은 겉보기 pI를 나타내는 변이체이다. 산성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 먼저 용출되는 변이체인 반면, 염기성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 나중에 용출되는 변이체이다. 가속 조건하에 저장된 제형으로부터 취한 샘플을 SEC 및 CEX 분석한 결과가 하기 표 13에 제공된다:
<표 13>
Figure 112016127814969-pct00014
전술된 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.
실시양태의 목록
본 발명에 의해 제공된 실시양태는 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다:
1. (1) 아미노산 서열 N/T/Q-YGVH (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 Y-N/A/G/D-T/D/N-P/K/E-FTSRF (서열식별번호: 9)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY (서열식별번호: 14)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 I-G/R/S-T/L/P-NIH (서열식별번호: 20)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KY-A/G-SE-S/T-I-S/R (서열식별번호: 24)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPT-T/L/S/A/Y (서열식별번호: 30)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
2. (1) 서열식별번호: 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (2) 서열식별번호: 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 서열식별번호: 10 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 서열식별번호: 15 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (2) 서열식별번호: 21 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 서열식별번호: 25 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 1의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
3. (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 TYYDYEFAY (서열식별번호: 10)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTT (서열식별번호: 25)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
4. (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
5. (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
6. (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YATEFTSRF (서열식별번호: 7)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
7. (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YDDKFTSRF (서열식별번호: 6)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
8. (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IRTNIH (서열식별번호: 16)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
9. (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 ISTNIH (서열식별번호: 19)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 실시양태 2의 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
10. 아미노산 서열 Y-A/G/D-D/N-K/E-FTSRF (서열식별번호: 31)을 포함하는 CDR-H2를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 아글리코실화 CDR-H2 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
11. 중쇄 가변 도메인이 아미노산 서열 N/T/Q-YGVH (서열식별번호: 4)을 포함하는 CDR-H1 및 아미노산 서열 T/D-Y/L-YDY-E/N-FAY (서열식별번호: 14)을 포함하는 CDR-H3을 추가로 포함하는, 실시양태 10의 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
12. 아미노산 서열 I-G/R/S-T/L/P-NIH (서열식별번호: 20)을 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 KY-A/G-SE-S/T-I-S/R (서열식별번호: 24)을 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 NWPT-T/L/S/A/Y (서열식별번호: 30)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 10 또는 실시양태 11의 아글리코실화 CDR-H2 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
13. 인간 IgG의 Fc 서열을 포함하는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
14. 항원 결합성 단편이 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일-쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 디아보디, 및 선형 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체의 항원 결합성 단편.
15. 다중특이적 항체인, 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나의 항-EGFR 항체.
16. 아푸코실화 항체인, 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 따르는 항체.
17. 치료제와 접합된, 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
18. 표지와 접합된, 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
19. 표지가 방사성 동위원소, 형광성 염료, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 18에 따르는 항체.
20. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 코딩하는, 단리된 핵산 분자.
21. 실시양태 20의 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터.
22. 실시양태 21의 발현 벡터를 포함하는 세포.
23. 실시양태 22의 세포를 배양하는 단계; 및 이러한 세포 배양물로부터 항체를 수거하는 단계를 포함하는, 항체의 생성 방법.
24. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
25. 실시양태 1 내지 16 및 18 내지 19 중 어느 하나에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 환자로부터의 샘플과 접촉시키고; EGFR 단백질과 결합된 항-EGFR 항체를 검출함으로써, 상기 환자로부터의 샘플 중의 EGFR 단백질을 검출하는 방법.
26. 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 면역조직화학 검정 (IHC) 또는 ELISA 검정에 사용되는, 실시양태 25에 따르는 방법.
27. 실시양태 24의 조성물의 유효량을 특정 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상체에게서 암을 치료하는 방법.
28. 암이 인후암, 결장직장암, 폐암, 및 두경부암으로부터 선택되는, 실시양태 27의 방법.
29. 대상체에게 항-신생물제, 화학요법제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 추가로 투여하는, 실시양태 27의 방법.
30. 대상체에게 방사선 요법을 추가로 투여하는, 실시양태 27의 방법.
SEQUENCE LISTING <110> JIANG, Wei-Dong LIN, Pei-Hua <120> ANTI-EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) ANTIBODIES <130> 719902000140 <140> PCT/US15/33402 <141> 2015-05-29 <150> US 62/005,887 <151> 2014-05-30 <160> 39 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gln Tyr Gly Val His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Thr Tyr Gly Val His 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Asn, Gln, or Thr <400> 4 Xaa Tyr Gly Val His 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Phe 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Tyr Asp Asp Lys Phe Thr Ser Arg Phe 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Tyr Ala Thr Glu Phe Thr Ser Arg Phe 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Tyr Gly Asn Glu Phe Thr Ser Arg Phe 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Asn, Ala, Gly, or Asp <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Thr, Asp, or Asn <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Pro, Lys, or Glu <400> 9 Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Thr Ser Arg Phe 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Thr Tyr Tyr Asp Tyr Asn Phe Ala Tyr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Thr Leu Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Thr or Asp <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Tyr or Leu <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Glu or Asn <400> 14 Xaa Xaa Tyr Asp Tyr Xaa Phe Ala Tyr 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Ile Arg Thr Asn Ile His 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Ile Gly Leu Asn Ile His 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Ile Gly Pro Asn Ile His 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Ile Ser Thr Asn Ile His 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Gly, Arg, or Ser <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Thr, Leu, or Pro <400> 20 Ile Xaa Xaa Asn Ile His 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Lys Tyr Gly Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Lys Tyr Ala Ser Glu Thr Ile Arg 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = Ser or Arg <400> 24 Lys Tyr Xaa Ser Glu Xaa Ile Xaa 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Asn Trp Pro Thr Leu 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Asn Trp Pro Thr Ser 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Asn Trp Pro Thr Ala 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Asn Trp Pro Thr Tyr 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Thr, Leu, Ser, Ala, or Tyr <400> 30 Asn Trp Pro Thr Xaa 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Ala, Gly, or Asp <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Asp or Asn <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Lys or Glu <400> 31 Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Thr Ser Arg Phe 1 5 <210> 32 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 33 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Gly Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 34 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Gly Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 35 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 36 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Gly Asn Glu Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Gly Asn Glu Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Thr Glu Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 39 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120

Claims (30)

  1. a) (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열;
    b) (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열;
    c) (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YATEFTSRF (서열식별번호: 7)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열;
    d) (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YDDKFTSRF (서열식별번호: 6)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열;
    e) (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IRTNIH (서열식별번호: 16)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열; 또는
    f) (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)을 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 ISTNIH (서열식별번호: 19)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열
    을 포함하는, 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YNTPFTSRF (서열식별번호: 5)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YATEFTSRF (서열식별번호: 7)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  5. 제1항에 있어서, 항체가 (1) 아미노산 서열 NYGVH (서열식별번호: 1)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YDDKFTSRF (서열식별번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IGTNIH (서열식별번호: 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYASESIS (서열식별번호: 21)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 IRTNIH (서열식별번호: 16)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  7. 제1항에 있어서, 항체가 (1) 아미노산 서열 TYGVH (서열식별번호: 3)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 YGNEFTSRF (서열식별번호: 8)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 DYYDYEFAY (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열; 및 (1) 아미노산 서열 ISTNIH (서열식별번호: 19)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 KYGSESIS (서열식별번호: 22)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 NWPTS (서열식별번호: 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  8. 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  9. 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  10. 서열식별번호: 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  11. 서열식별번호: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  12. 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG의 Fc 서열을 포함하는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합성 단편이 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일-쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 디아보디, 및 선형 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-EGFR 항체의 항원 결합성 단편.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체인 항-EGFR 항체.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 아푸코실화 항체인 항체.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 표지와 접합된 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  18. 제17항에 있어서, 표지가 방사성 동위원소, 형광성 염료 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 코딩하는, 단리된 핵산 분자.
  20. 제19항의 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터.
  21. 제20항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  22. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 환자로부터의 샘플과 접촉시키고; EGFR 단백질과 결합된 항-EGFR 항체를 검출함으로써, 상기 환자로부터의 샘플 중의 EGFR 단백질을 검출하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 면역조직화학 검정 (IHC) 또는 ELISA 검정에 사용되는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 제22항의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 암이 인후암, 결장직장암, 폐암 및 두경부암으로부터 선택되는 것인 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 대상체가 항-신생물제, 화학요법제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제 또는 방사선 요법을 추가로 투여받는 것인 조성물.
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