TW202417508A - 抗trop2/egfr抗體及其用途 - Google Patents

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關雪娃
尚誠彰
沈月雷
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Abstract

本發明涉及抗TROP2/EGFR抗體，及由其所衍生之抗體藥物接合物，其中該抗體特異性結合至至少兩種不同的抗原EGFR及TROP2。

Description

抗TROP2/EGFR抗體及其用途
本申請案主張2022年9月7日所提交之PCT/CN2022/117496及2023年3月23日所提交之PCT/CN2023/083228的優先權。上揭申請案之全文內容以引用方式併入本文。
本發明涉及多特異性抗TROP2/EGFR抗體(例如，雙特異性抗體或其抗原結合片段)，以及由其衍生之抗體藥物接合物。
雙特異性抗體係一種人工蛋白質，其可同時結合至兩種不同類型的抗原或兩種不同的表位(epitope)。此種雙重特異性開闢了廣泛的應用領域，包括將T細胞重新導向至腫瘤細胞、對不同疾病介質之雙重標靶、以及將有效負載(payload)遞送至目標位址。卡妥索單抗(catumaxomab)(抗EpCAM及抗CD3)及博納吐單抗(blinatumomab)(抗CD19及抗CD3)的核准已然成為雙特異性抗體發展的一個重要里程碑。
由於雙特異性抗體具有多種應用，因此需要繼續發展基於雙特異性抗體的各種治療藥物。
本發明涉及抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合至EGFR及TROP2。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段具有相同的輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段具有共同輕鏈。本發明亦涉及衍生自此類抗TROP2/EGFR抗體的抗體藥物接合物。
在一態樣中，本發明提供一種抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其包含：第一抗原結合域，其特異性結合至EGFR；及第二抗原結合域，其特異性結合至TROP2。
在一些實施例中，該第一抗原結合域包含第一重鏈可變區(VH1)及第一輕鏈可變區(VL1)；且該第二抗原結合域包含第二重鏈可變區(VH2)及第二輕鏈可變區(VL2)。在一些實施例中，該第一重鏈可變區(VH1)包含互補決定區(complementarity determining region, CDR) 1、2、及3，其中該VH1 CDR1區包含與所選之VH1 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VH1 CDR2區包含與所選之VH1 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VH1 CDR3區包含與所選之VH1 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列；並且該第一輕鏈可變區(VL1)包含CDR 1、2、及3，其中該VL1 CDR1區包含與所選之VL1 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VL1 CDR2區包含與所選之VL1 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VL1 CDR3區包含與所選之VL1 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，其中該所選之VH1 CDR 1、2、及3胺基酸序列，該所選之VL1 CDR 1、2、及3胺基酸序列係以下中之一者： (1)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 7至9，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (2)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 10至12，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (3)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 16至18，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及 (4)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 19至21，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該第二重鏈可變區(VH2)包含CDR 1、2、及3，其中該VH2 CDR1區包含與所選之VH2 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VH2 CDR2區包含與所選之VH2 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VH2 CDR3區包含與所選之VH2 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列；並且該第二輕鏈可變區(VL2)包含CDR 1、2、及3，其中該VL2 CDR1區包含與所選之VL2 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VL2 CDR2區包含與所選之VL2 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VL2 CDR3區包含與所選之VL2 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，其中該所選之VH2 CDR 1、2、及3胺基酸序列，及該所選之VL2 CDR 1、2、及3胺基酸序列係以下中之一者： (1)該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及 (2)該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 7至9，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 7至9，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 16至18，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 16至18，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
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在一些實施例中，該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 19至21，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 19至21，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
在一些實施例中，該第一重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 23具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第一輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第二重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 25具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，且該第二輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列。
在一些實施例中，該第一重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第一輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第二重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 25具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，且該第二輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列。
在一些實施例中，該VH1包含與所選之VH序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，且該VL1包含與所選之VL序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，其中該所選之VH序列及該所選之VL序列係以下中之一者： (1) 該所選之VH序列係SEQ ID NO: 23，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22；及 (2) 該所選之VH序列係SEQ ID NO: 24，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
在一些實施例中，該VH1包含與所選之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；且該VL1包含與所選之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中該所選之VH序列及該所選之VL序列係以下中之一者： (1) 該所選之VH序列係SEQ ID NO: 23，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22；及 (2) 該所選之VH序列係SEQ ID NO: 24，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
在一些實施例中，該VH2包含與所選之VH序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，且該VL2包含與所選之VL序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，其中該所選之VH序列係SEQ ID NO: 25，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
在一些實施例中，該VH2包含與所選之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；且該VL2包含與所選之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中該所選之VH序列係SEQ ID NO: 25，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
在一些實施例中，該VH1包含SEQ ID NO: 23的序列，且該VL1包含SEQ ID NO: 22的序列。
在一些實施例中，該VH1包含SEQ ID NO: 24的序列，且該VL1包含SEQ ID NO: 22的序列。
在一些實施例中，該VH2包含SEQ ID NO: 25的序列，且該VL2包含SEQ ID NO: 22的序列。
在一些實施例中，該第一抗原結合域特異性結合至人類或猴EGFR；及/或該第二抗原結合域特異性結合至人類或猴TROP2。
在一些實施例中，該第一抗原結合域係人類的或人源化的；及/或該第二抗原結合域係人類的或人源化的。
在一些實施例中，該抗TROP2/EGFR抗體係多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。
在一些實施例中，該第一抗原結合域係單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFv)；及/或該第二抗原結合域係scFv。
在一些實施例中，該第一輕鏈可變區及該第二輕鏈可變區係相同的。
在一態樣中，本發明提供一種抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其與如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段交叉競爭(cross-compete)。
在一態樣中，本發明提供一種核酸，其包含編碼如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
在一態樣中，本發明提供一種載體(vector)，其包含如本文所述之核酸。
在一態樣中，本發明提供一種細胞，其包含如本文所述之載體。在一些實施例中，該細胞係CHO細胞。
在一態樣中，本發明提供一種細胞，其包含如本文所述之核酸。
在一態樣中，本發明提供一種產生抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括： (a)  在足以使如本文所述之細胞產生該抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的條件下培養該細胞；及 (b) 收集該細胞所產生的抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段。
在一態樣中，本發明提供一種抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物(antibody-drug conjugate, ADC)，其包含共價結合至如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的治療劑。在一些實施例中，該治療劑係細胞毒性劑(cytotoxic agent)或細胞生長抑制劑(cytostatic agent)。在一些實施例中，該治療劑係MMAE或MMAF。
在一些實施例中，該治療劑選自： (CPT-1)、 (CPT-2)、 (CPT-3)、或 (CPT-4)。
在一些實施例中，該治療劑係經由連結子(linker)連結至抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該連結子具有以下結構： 。
在一些實施例中，該抗體-藥物接合物具有以下結構： ，或 ， 在一些實施例中，n = 1至8；在一些實施例中，「Ab」代表該抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，藥物對抗體比(drug-to-antibody ratio, DAR)係約4或8。
在一態樣中，本發明提供一種治療患有癌症之對象的方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之組成物，該組成物包含如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，或如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。在一些實施例中，該對象患有表現EGFR及/或TROP2的癌症。
在一些實施例中，該癌症係固態腫瘤、肺癌(lung cancer)[例如非小細胞肺癌、肺腺癌、或肺癌(lung carcinoma)]、胃癌(gastric cancer)[例如胃癌(gastric carcinoma)]、皮膚癌(skin cancer)[例如皮膚癌(skin carcinoma)]、結腸直腸癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胰臟癌、中樞神經系統(central nervous system, CNS)癌、肝癌、鼻咽癌、腦癌、結腸癌、膀胱癌、口腔鱗狀細胞癌、子宮頸癌、或食道癌。
在一些實施例中，該對象係人類。
在一些實施例中，該方法進一步包含向該對象投予抗PD1抗體。
在一些實施例中，該方法進一步包含向該對象投予化學療法。
在一態樣中，本發明提供一種降低腫瘤生長速率的方法，該方法包含使腫瘤細胞與有效量之組成物接觸，該組成物包含如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，或如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
在一態樣中，本發明提供一種殺傷腫瘤細胞的方法，該方法包含使腫瘤細胞與有效量之組成物接觸，該組成物包含如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，或如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
在一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含醫藥上可接受之載劑，及(a)如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，及/或(b)如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
在一態樣中，本發明提供一種抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物(ADC)，其包含共價結合至雙特異性抗體或其抗原結合片段的治療劑，該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含：第一抗原結合域，其特異性結合至EGFR；及第二抗原結合域，其特異性結合至TROP2。在一些實施例中，藥物對抗體比(DAR)係約4。
如本文所用，術語「抗原結合域(antigen-binding domain)」係指一或多個蛋白質域(例如由單一多肽的胺基酸形成，或由二或多個多肽(例如相同或不同的多肽)的胺基酸形成)，其能夠特異性結合至一或多種不同的抗原[例如效應因子抗原(effector antigen)或對照抗原(control antigen)]。在一些實施例中，抗原結合域可以相似於天然存在之抗體的特異性及親和性結合至抗原或表位。在一些實施例中，該抗原結合域可係抗體或其片段。抗原結合域的一示例係由VH-VL二聚體形成的抗原結合域。在一些實施例中，抗原結合域可包括替代支架(scaffold)。在一些實施例中，該抗原結合域係VHH。本文中描述抗原結合域之非限制性示例。抗原結合域之其他示例在本技術領域中係眾所周知。在一些實施例中，抗原結合域可結合至單一抗原(例如效應因子抗原及對照抗原中之一者)。在其他實施例中，抗原結合域可結合至兩種不同抗原(例如效應因子抗原及對照抗原)。
本文所使用之術語「抗體(antibody)」係以其最廣泛之含義為其所指，且包括某些類型的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子包括特異性結合至抗原或表位的一或多種抗原結合域。具體而言，抗體包括例如：完整抗體(例如完整免疫球蛋白)、抗體片段、雙特異性抗體、及多特異性抗體。抗體的一示例係包括兩個重鏈及兩個輕鏈的蛋白質錯合物。本文中描述抗體之其他示例。
如本文所用，術語「多特異性抗體(multispecific antibody)」係包括二或多種不同抗原結合域的抗體，該二或多種不同抗原結合域共同特異性結合二或多種不同表位。該二或多種不同表位可係相同抗原(例如存在於細胞之表面上的單一多肽)上的表位，亦可係不同抗原(例如存在於相同細胞之表面或存在於不同細胞之表面上的不同蛋白質)上的表位。在一些態樣中，多特異性抗體結合兩種不同的表位(即「雙特異性抗體(bispecific antibody)」)。在一些態樣中，多特異性抗體結合三種不同的表位(即「三特異性抗體(trispecific antibody)」)。在一些態樣中，多特異性抗體結合四種不同的表位(即「四特異性抗體(quadspecific antibody)」)。在一些態樣中，多特異性抗體結合五種不同的表位(即「五特異性抗體(quintspecific antibody)」)。每個結合特異性可以任何合適的價態存在。本文中描述多特異性抗體之非限制性示例。
如本文所用，術語「雙特異性抗體(bispecific antibody)」係指結合至兩種不同表位的抗體。該等表位可位於相同抗原上或位於不同抗原上。
如本文所用，術語「共同輕鏈(common light chain)」係指可與二或多種不同重鏈相互作用，形成不同抗原結合位址的輕鏈，其中此等不同抗原結合位址可特異性結合至不同抗原或表位。同理，術語「共同輕鏈可變區(common light chain variable region)」係指可與二或多種不同重鏈可變區相互作用，形成不同抗原結合位址的輕鏈可變區，其中此等不同抗原結合位址可特異性結合至不同抗原或表位。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可具有共同輕鏈。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可具有共同輕鏈可變區。
如本文所用，術語「抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段(anti-TROP2/EGFR antibody or antigen-binding fragment thereof)」係指結合至TROP2及EGFR兩者的抗體或抗原結合片段。
除非另有定義，本文中使用之所有技術及科學術語，其含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解之含義相同。本文中描述用於本發明的方法及材料；此外，亦可使用本技術領域已知的其他合適的方法及材料。材料、方法、及示例僅供說明之用，而非旨在限制本發明。本文中提及之所有刊物、專利申請案、專利、序列、資料庫條目、及其他參考文獻，其等全文內容均以引用方式併入本文。如有衝突，則以本說明書(包括定義)為準。
本發明之其他特徵及優點將於實施方式及圖式，以及申請專利範圍中顯而易見。
雙特異性抗體或其抗原結合片段係一種人工蛋白質，其可同時結合至兩種不同的表位(例如在兩種不同的抗原上)。在一些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段可具有兩個臂(arm)。每個臂可具有一個重鏈可變區及一個輕鏈可變區，其形成抗原結合域(或抗原結合區)。在一些實施例中，雙特異性抗體具有共同輕鏈。
本發明涉及抗TROP2/EGFR抗體(例如雙特異性抗體或其抗原結合片段)，其等特異性結合至EGFR及TROP2；及抗體-藥物接合物，其衍生自此等抗TROP2/EGFR抗體。 抗 TROP2/EGFR 抗體
表皮生長因子受體(EGFR、ErbBI、或HER1)係170 kDa的第1型跨膜醣蛋白質，其係由c-erbBl原致癌基因編碼。表皮生長因子受體係ErbB受體家族的成員，該家族係以下四個密切相關之受體酪胺酸激酶的子家族：EGFR (ErbB-1)、HER2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、及Her4 (ErbB-4)。在許多癌症類型中，影響EGFR表現或活性的突變可能導致癌症。EGFR訊息傳遞藉由配體結合而起始，隨後誘導構形改變、受體與其他ErbB家族成員的同源二聚化(homodimerization)或異源二聚化(heterodimerization)、及受體的反式自磷酸化，從而引發訊息傳遞級聯反應(signal transduction cascade)，最終影響多種細胞功能(包括細胞增生及存活)，EGFR表現或激酶活性的增加與多種人類癌症相關，這使得EGFR成為治療干預(therapeutic intervention)中的一個很具有吸引力的標靶。在非小細胞肺癌中，EGFR基因複製數及蛋白質表現兩者的增加與對EGFR酪胺酸激酶抑制劑IRESSA™ [吉非替尼(gefitinib)]具有良好反應相關。
諸如EGF (表皮生長因子)的配體結合至EGFR後，即會刺激受體二聚化、自磷酸化、受體內部細胞質酪胺酸激酶域的活化、及多種訊息傳遞及反式活化(transactivation)途徑的啟動，該等途徑涉及DNA合成(基因活化)及細胞週期進展或分裂的調節。EGFR訊息傳遞的抑制可能導致一或多種EGFR的抑制。在一些實施例中，EGFR配體包括：EGF、TGFα、肝素結合EGF (HB-EGF)、雙調蛋白(amphiregulin, AR)、及上皮調節素(epiregulin, EPI)。
EGFR之詳細綜述可參見Sabbah, Dima A., Rima Hajjo, and Kamal Sweidan."Review on epidermal growth factor receptor (EGFR) structure, signaling pathways, interactions, and recent updates of EGFR inhibitors."Current topics in medicinal chemistry (2020)；其全文內容以引用方式併入本文。
滋養層細胞表面抗原2 (trophoblast cell-surface antigen 2, TROP2)，亦稱為腫瘤相關鈣訊息傳遞蛋白2 (tumor-associated calcium signal transducer 2, TACSTD2)，係一種藉由TACSTD2基因編碼及表現的細胞表面醣蛋白質。其與上皮黏著分子Epcam具有高度結構序列相似性。TROP2係一種與腫瘤密切相關的蛋白質。其主要藉由調節鈣離子訊息傳遞途徑、週期蛋白表現、及降低纖網蛋白黏著性來促進腫瘤細胞的生長、增生、及轉移。研究發現，TROP2蛋白質高度表現於乳癌、結腸癌、膀胱癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、及卵巢癌中。此類蛋白質可促進腫瘤細胞的增生、侵入、轉移、擴散、及其他過程。此外，在乳癌及其他癌症中，TROP2的高度表現亦被發現與腫瘤之更具侵襲性疾病、及臨床預後不良密切相關。
TROP2係一種細胞內鈣訊息傳遞蛋白，其在許多癌症中具有不同程度的表現。其向細胞傳遞自我更新(self-renewal)、增生、侵入、及存活的訊息。其具有似幹細胞的性質。TROP2在許多正常組織中皆有表現，但在許多癌症中卻有過度表現，且TROP2的過度表現對於預後具有重要意義。目前已提出數種會與TROP2相互作用的配體。TROP2經由不同途徑向細胞傳遞訊息，並藉由數個轉錄因子的複雜網路進行轉錄調節。癌細胞中之TROP2的表現與抗藥性相關。
TROP2及其在癌症中的過度表現之詳細綜述可參見Shvartsur, Anna, and Benjamin Bonavida."TROP2 and its overexpression in cancers: regulation and clinical/therapeutic implications."Genes & cancer 6.3-4 (2015): 84；其全文內容以引用方式併入本文。
在一些實施例中，本文所述之雙特異性抗TROP2/EGFR抗體可經設計為具有IgG1亞型結構，該IgG1亞型結構具有洞中癤(KIH)突變，其可促進異源二聚化且避免兩個重鏈之間的錯誤配對。在一些實施例中，雙特異性抗TROP2/EGFR抗體的胞吞率高於對應之單株抗體或對照雙特異性抗體。
在一些實施例中，本文所述之雙特異性抗TROP2/EGFR抗體可與治療劑接合，形成抗體-藥物接合物(ADC)。在一些實施例中，本文所述之ADC的藥物對抗體比(DAR)係約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、或約4.7。在一些實施例中，本文所述之ADC的DAR係約3.5至約4.5、約3.6至約4.5、約3.7至約4.5、約3.8至約4.5、約3.9至約4.5、約4.0至約4.5、約4.1至約4.5、約4.2至約4.5、約4.3至約4.5、約4.4至約4.5、約3.5至約4.4、約3.6至約4.4、約3.7至約4.4、約3.8至約4.4、約3.9至約4.4、約4.0至約4.4、約4.1至約4.4、約4.2至約4.4、約4.3至約4.4、約3.5至約4.3、約3.6至約4.3、約3.7至約4.3、約3.8至約4.3、約3.9至約4.3、約4.0至約4.3、約4.1至約4.3、約4.2至約4.3、約3.5至約4.2、約3.6至約4.2、約3.7至約4.2、約3.8至約4.2、約3.9至約4.2、約4.0至約4.2、約4.1至約4.2、約3.5至約4.1、約3.6至約4.1、約3.7至約4.1、約3.8至約4.1、約3.9至約4.1、約4.0至約4.1、約3.5至約4.0、約3.6至約4.0、約3.7至約4.0、約3.8至約4.0、約3.9至約4.0、約3.5至約3.9、約3.6至約3.9、約3.7至約3.9、約3.8至約3.9、約3.5至約3.8、約3.6至約3.8、約3.7至約3.8、約3.5至約3.7、約3.6至約3.7、或約3.5至約3.6。在一些實施例中，本文所述之ADC的DAR係約7.5至約8.5、約7.6至約8.5、約7.7至約8.5、約7.8至約8.5、約7.9至約8.5、約8.0至約8.5、約8.1至約8.5、約8.2至約8.5、約8.3至約8.5、約8.4至約8.5、約7.5至約8.4、約7.6至約8.4、約7.7至約8.4、約7.8至約8.4、約7.9至約8.4、約8.0至約8.4、約8.1至約8.4、約8.2至約8.4、約8.3至約8.4、約7.5至約8.3、約7.6至約8.3、約7.7至約8.3、約7.8至約8.3、約7.9至約8.3、約8.0至約8.3、約8.1至約8.3、約8.2至約8.3、約7.5至約8.2、約7.6至約8.2、約7.7至約8.2、約7.8至約8.2、約7.9至約8.2、約8.0至約8.2、約8.1至約8.2、約7.5至約8.1、約7.6至約8.1、約7.7至約8.1、約7.8至約8.1、約7.9至約8.1、約8.0至約8.1、約7.5至約8.0、約7.6至約8.0、約7.7至約8.0、約7.8至約8.0、約7.9至約8.0、約7.5至約7.9、約7.6至約7.9、約7.7至約7.9、約7.8至約7.9、約7.5至約7.8、約7.6至約7.8、約7.7至約7.8、約7.5至約7.7、約7.6至約7.7、或約7.5至約7.6。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC可以小於10 µg/mL、小於3.33 µg/mL、小於1.11 µg/mL、小於0.37 µg/mL、小於0.12 µg/mL、小於0.04 µg/mL、或小於0.01µg/mL的濃度有效抑制體外癌細胞生長。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC可以小於30 mg/kg、25 mg/kg、20 mg/kg、15 mg/kg、10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg、或1 mg/kg的劑量位準在異種移植鼠類模型中抑制體內癌細胞生長(例如肺癌、胃癌、或皮膚癌)。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體具有共同輕鏈。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體包含抗EGFR抗原結合域[例如E-1G11 (「1G11」)、E-6C4 (「6C4」)]或抗TROP2抗原結合域[例如T-6F7 (「6F7」)]。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體具有標靶EGFR的重鏈可變區(例如本文所述之標靶EGFR的VH中之任一者)、標靶TROP2的重鏈可變區(例如本文所述之標靶TROP2的VH中之任一者)、及兩個相同的共同輕鏈可變區。
1G11抗原結合域的CDR序列包括重鏈可變域的CDR(SEQ ID NO: 7至9)及輕鏈可變域的CDR(SEQ ID NO: 1至3)，其係如Kabat編號所定義。CDR亦可由Chothia系統定義。在Chothia編號下，重鏈可變域的CDR序列係記載於SEQ ID NO: 16至18，且輕鏈可變域的CDR序列係記載於SEQ ID NO: 1至3。1G11的人類輕鏈可變區及人類重鏈可變區分別示於SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 23。
6C4抗原結合域的CDR序列包括重鏈可變域的CDR (SEQ ID NO: 10至12)及輕鏈可變域的CDR (SEQ ID NO: 1至3)，其係如Kabat編號所定義。在Chothia編號下，重鏈可變域的CDR序列係記載於SEQ ID NO: 19至21，輕鏈可變域的CDR係記載於SEQ ID NO: 1至3。6C4的人類輕鏈可變區及人類重鏈可變區分別示於SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 24。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體可含有一個、兩個、或三個選自SEQ ID NO: 7至9、SEQ ID NO: 10至12、SEQ ID NO: 16至18、及SEQ ID NO: 19至21之群組的重鏈可變區CDR；及/或一個、兩個、或三個選自SEQ ID NO: 1至3之群組的輕鏈可變區CDR。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可具有：重鏈可變區(VH)，其包含互補決定區(CDR) 1、2、3，其中CDR1區包含與所選之VH CDR1胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，CDR2區包含與所選之VH CDR2胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，及CDR3區包含與所選之VH CDR3胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成；及輕鏈可變區(VL)，其包含CDR 1、2、3，其中CDR1區包含與所選之VL CDR1胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，CDR2區包含與所選之VL CDR2胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，及CDR3區包含與所選之VL CDR3胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成。所選之VH CDR 1、2、3胺基酸序列及所選之VL CDR 1、2、3胺基酸序列示於 圖 4至 圖 6中。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有重鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 7；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 8；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 9。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有重鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 10；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 11；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 12。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有重鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 16；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 17；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 18。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有重鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 19；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 20；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 21。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有輕鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 1；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 2；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 3。
插入、缺失、及取代可位於CDR序列內，或位於CDR序列之一個或兩個末端。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體含有：重鏈可變區(VH)，其包含與所選之VH序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成；及輕鏈可變區(VL)，其包含與所選之VL序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成。在一些實施例中，所選之VH序列係SEQ ID NO: 23或24，且所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
6F7抗原結合域的CDR序列包括重鏈可變域的CDR (SEQ ID NO: 4至6)及輕鏈可變域的CDR (SEQ ID NO: 1至3)，其係如Kabat編號所定義。CDR亦可由Chothia系統定義。在Chothia編號下，重鏈可變域的CDR序列係記載於SEQ ID NO: 13至15，且輕鏈可變域的CDR序列係記載於SEQ ID NO: 1至3。6F7的人類輕鏈可變區及人類重鏈可變區分別示於SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 25。
此外，在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段亦可含有一個、兩個、或三個選自SEQ ID NO: 4至6及SEQ ID NO: 13至15之群組的重鏈可變區CDR；及/或一個、兩個、或三個選自SEQ ID NO: 1至3之群組的輕鏈可變區CDR。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可具有：重鏈可變區(VH)，其包含互補決定區(CDR) 1、2、3，其中CDR1區包含與所選之VH CDR1胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，CDR2區包含與所選之VH CDR2胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，及CDR3區包含與所選之VH CDR3胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成；及輕鏈可變區(VL)，其包含CDR 1、2、3，其中CDR1區包含與所選之VL CDR1胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，CDR2區包含與所選之VL CDR2胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成，及CDR3區包含與所選之VL CDR3胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成。所選之VH CDR 1、2、3胺基酸序列及所選之VL CDR 1、2、3胺基酸序列示於 圖 4 及圖 6(Kabat CDR)以及 圖 5 及圖 6(Chothia CDR)中。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有重鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 4；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 5；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 6。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有重鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 13；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 14；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 15。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可含有輕鏈可變域，其含有以下中之一個、兩個、或三個CDR：具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 1；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 2；具有零個、一個、或兩個胺基酸插入、缺失、或取代的SEQ ID NO: 3。
插入、缺失、及取代可位於CDR序列內，或位於CDR序列之一個或兩個末端。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體含有：重鏈可變區(VH)，其包含與所選之VH序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成；及輕鏈可變區(VL)，其包含與所選之VL序列具有至少80%、85%、90%、或95%相同性的胺基酸序列或由其所組成。在一些實施例中，所選之VH序列係SEQ ID NO: 25，且所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可具有與如本文所述之任何VH序列的CDR相同的3個VH CDR。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段可具有與如本文所述之任何VL序列的CDR相同的3個VL CDR。
本發明內容亦提供核酸，其包含編碼抗TROP2/EGFR抗體的多核苷酸。抗TROP2/EGFR抗體中的免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈包含如 圖 4、 圖 5、 或圖 6中所示的CDR，或具有如 圖 7中所示的序列。當多肽與對應的多肽(例如對應的重鏈可變區或對應的輕鏈可變區)配對時，則經配對的多肽結合至TROP2及/或EGFR。
抗TROP2/EGFR抗體亦可係抗TROP2/EGFR抗體或抗體片段的抗TROP2/EGFR抗體變異體(包括衍生物及接合物)。本文所提供之其他抗TROP2/EGFR抗體係多株、單株、多特異性(多聚體，例如雙特異性)、人類抗體、嵌合抗體(例如人類-鼠類嵌合體)、單鏈抗體、細胞內製造抗體(即胞內抗體(intrabodies))、及其抗原結合片段。抗TROP2/EGFR抗體可係任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2)、或亞類別。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段係IgG(例如IgG1)抗體或其抗原結合片段。
只要抗TROP2/EGFR抗體的片段保留對TROP2及EGFR兩者所需之親和性及特異性，其等即適用於所提供之方法。因此，抗TROP2/EGFR抗體的片段將保留結合至TROP2及EGFR的能力。 抗體及其抗原結合片段
在一些實施例中，多特異性抗TROP2/EGFR抗體(例如雙特異性抗體)包括衍生自抗EGFR抗體的抗原結合域及衍生自抗TROP2抗體的抗原結合域。此等抗TROP2/EGFR抗體及其抗原結合片段可具有多種形式。
一般而言，抗體(又稱為免疫球蛋白)可由兩類別之多肽鏈組成：輕鏈及重鏈。本發明之非限制性抗TROP2/EGFR抗體可係的完整的四免疫球蛋白鏈抗體，其包含兩個重鏈及兩個輕鏈。抗TROP2/EGFR抗體的重鏈可係任何同型(包括IgM、IgG、IgE、IgA、或IgD)或亞同型(包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等)。輕鏈可係κ輕鏈或λ輕鏈。
高度可變區(hypervariable region)(稱為互補決定區(CDR))形成環，其包含抗體的主要抗原結合表面。四個構架區(framework region)主要呈β折片構形(beta-sheet conformation)，且CDR形成連接β折片構形的環，且在某些情況下形成β折片構形的一部分。每個鏈中的CDR均由構架區保持緊密相鄰，並與另一個鏈的CDR促成抗原結合域的形成。
藉由分析抗體的胺基酸序列來辨識抗體的CDR區的方法係眾所周知，且常用多種CDR的定義。Kabat定義係基於序列可變性，而Chothia定義係基於結構環區的位置。此等方法及定義描述於例如Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001.422-439；Abhinandan, et al."Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839；Wu, T.T. and Kabat, E.A.(1970) J. Exp.Med.132: 211-250；Martin et al., Methods Enzymol.203:121-53 (1991)；Morea et al., Biophys Chem.68(1-3):9-16 (Oct. 1997)；Morea et al., J Mol Biol.275(2):269-94 (Jan. 1998)；Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989)；Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)；其等之全文內容以引用方式併入本文。
CDR對於識別抗原表位至關重要。如本文所用，「表位(epitope)」係能夠被抗體的抗原結合域特異性結合之標靶分子的最小部分。表位的最小大小可係約三個、四個、五個、六個、或七個胺基酸，但此等胺基酸不必係抗原之一級結構的連續線性序列，因為表位可能取決於抗原的三維組態，該三維組態係基於抗原的二級及三級結構。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係完整的免疫球蛋白分子(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亞類別(IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4)高度保守，但在其等之恆定區，尤其係其等之樞紐及上CH2域中存在差異。IgG亞類別的序列及差異在本技術領域係眾所周知，且描述於例如Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions."Frontiers in immunology 5 (2014)；Irani, et al."Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases."Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182；Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation.Elsevier, 2016；其等之全文內容以引用方式併入本文。
抗TROP2/EGFR抗體亦可係衍生自任何物種(例如人類、囓齒類、小鼠、大鼠、駱駝科)的免疫球蛋白分子。抗原結合域或抗原結合片段係抗體的一部分，其保留完整抗體的特異性結合活性，即能夠與完整抗體之標靶分子上的表位特異性結合之抗體的任何部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、以及此等片段的變異體。因此，在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可包含例如：scFv、Fv、Fd、dAb、雙特異性抗體、雙特異性scFv、雙抗體(diabody)、線性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體、以及包括結合域的任何多肽，該結合域係抗體結合域或與之同源。抗原結合域的非限制性示例包括例如：完整抗體的重鏈及/或輕鏈CDR、完整抗體的重鏈及/或輕鏈可變區、完整抗體的全長重鏈或輕鏈、或來自完整抗體之重鏈或輕鏈的單獨CDR。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體中的scFv具有兩個重鏈可變域及兩個輕鏈可變域。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR scFv具有兩個抗原結合區(抗原結合區：A及B)，且此兩個抗原結合區可以不同的親和性結合各自的標靶抗原。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可包含一個、兩個、或三個選自 圖 4 至圖 5的重鏈可變區CDR。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可包含一個、兩個、或三個選自 圖 6的輕鏈可變區CDR。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體可接合至治療劑。包含抗體或其抗原結合片段的抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物可共價或非共價結合至治療劑。在一些實施例中，治療劑係細胞毒性劑或細胞生長抑制劑(例如單甲基澳瑞他汀E (monomethyl auristatin E)、單甲基澳瑞他汀F、細胞鬆弛素B、短桿菌素D、溴化乙錠、吐根素、絲裂黴素、伊妥普賽(etoposide)、坦尼坡賽(tenoposide)、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙鹼、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素、二羥基炭疽菌素、美登素(maytansinoids)(諸如DM-1及DM-4)、二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌黴素D、1-脫氫睪固酮、葡萄糖皮質素、普羅卡因、四卡因、利多卡因、心得安(propranolol)、嘌呤黴素、表柔比星(epirubicin)、及環磷醯胺及類似物)。在一些實施例中，治療劑係MMAE或MMAF。在一些實施例中，治療劑係經由連結子(例如VC連結子)接合。用於ADC之連結子之詳細綜述可參見例如Su, Z. et al."Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry."Acta Pharmaceutica Sinica B (2021)，其全文內容以引用方式併入本文。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係雙特異性抗體。雙特異性抗體可藉由工程改造一對抗體分子之間的界面，從而最大限度地提高自重組細胞培養中所回收之異源二聚體的百分比而加以製造。例如，界面可含有抗體恆定域之CH3域的至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子界面的一或多個小胺基酸支鏈被較大的支鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替代。藉由使用較小的胺基酸支鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替代較大的胺基酸支鏈，在第二抗體分子的界面上形成與大支鏈大小相同或相似的補償性「空腔」。如此提供一種使異源二聚體的產量高於其他不需要之最終產物(諸如同源二聚體)的機制。此方法描述於例如WO 96/27011中，其全文內容以引用方式併入本文。
本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段中之任一者皆可接合至穩定分子(例如增加抗體或其抗原結合片段在對象中或在溶液中之半衰期的分子)。穩定分子的非限制性示例包括：聚合物(例如聚乙二醇)或蛋白質(例如血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白)。穩定分子的接合可增加抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段的體外(例如在組織培養中或作為醫藥組成物儲存時)或體內(例如在人類體內)的半衰期或延長其體外或體內生物活性。
抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段亦可具有各種形式。雙特異性抗體或其抗原結合片段的許多不同形式在本技術領域係眾所周知，且描述於例如Suurs, et al."A review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges," Pharmacology & therapeutics (2019)，其全文內容以引用方式併入本文。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係BiTe、(scFv) 2、奈米抗體、奈米抗體-HSA、DART、TandAb、sc雙抗體、sc雙抗體-CH3、scFv-CH-CL-scFv、HSAbody、sc雙抗體-HAS、或串接-scFv。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係VHH-scAb、VHH-Fab、雙scFab、F(ab') 2、雙抗體、crossMab、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、洞中癤共同輕鏈、洞中癤組合體(assembly)、電荷對、Fab臂交換(Fab-arm exchange)、SEEDbody、LUZ-Y、Fcab、κλ-body、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、雙抗體-CH3、三重體(triple body)、微型抗體(miniantibody)、微型體(minibody)、TriBi微型體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、F(ab') 2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙抗體-Fc、雙抗體-Fc、串接scFv-Fc、胞內抗體(Intrabody)、塢與鎖(dock and lock)、lmmTAC、IgG-IgG接合物、Cov-X-Body、或scFv1-PEG-scFv2。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體可係TrioMab。在TrioMab中，兩個重鏈來自不同物種，其中不同序列限制重鏈-輕鏈配對。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體具有兩個不同重鏈及一個共同輕鏈。重鏈的異源二聚化可係基於洞中癤或一些其他重鏈配對技術。
在一些實施例中，CrossMAb技術可用於產生雙特異性抗TROP2/EGFR抗體。CrossMAb技術可用於在雙特異性異二聚IgG抗體中強制執行正確的輕鏈關聯，此技術允許產生各種雙特異性抗體形式(包括雙(1+1)、三(2+1)、及四(2+2)價雙特異性抗體)，以及基於非Fc串接抗原結合片段(Fab)的抗體。此等形式可使用域交叉衍生自任何現有的抗體對，無需辨識共同輕鏈、轉譯後處理/體外化學組合、或引入一組強制執行正確輕鏈關聯的突變。此方法描述於Klein et al., "The use of CrossMAb technology for the generation of bi-and multi-specific antibodies."MAbs.Vol. 8.No. 6.Taylor & Francis, 2016，其全文內容以引用方式併入本文。在一些實施例中，重鏈中的CH1及輕鏈中的CL域被交換。
抗TROP2/EGFR抗體可係Duobody。IgG4抗體中天然存在的Fab交換機制在IgG1抗體中以受控的方式被模仿，此種機制稱為受控Fab交換。此種形式可確保重鏈與輕鏈之間具有特定配對。
在雙可變域抗體(DVD-Ig)中，每個N端皆加入了額外的VH及可變輕鏈(VL)域，以實現雙特異性標靶。此種形式類似於IgG-scFv，但所加入之結合域單獨結合至其等各自的N端，而非scFv結合至每個重鏈N端。
在scFv-IgG中，兩個scFv連接至重鏈(CH3)的C端。scFv-IgG形式具有兩個不同的二價結合位址，並因此亦稱為四價。scFv-IgG中不存在重鏈及輕鏈配對問題。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體可具有IgG-IgG形式。兩個完整的IgG抗體藉由化學連結重鏈的C端而接合。
抗TROP2/EGFR抗體亦可具有Fab-scFv-Fc形式。在Fab-scFv-Fc形式中，係組合有輕鏈、重鏈、及含有Fc區及scFv的第三鏈。其可確保高效的製造及純化。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體可係TF。三個Fab片段藉由雙硫橋連結。兩個片段標靶腫瘤相關抗原(TAA)，且一個片段標靶半抗原。TF形式不具有Fc區。
ADAPTIR具有兩個scFv，其等結合至Fc區的每一側。其放棄完整的IgG作為其構築體的基礎，但保留了Fc區以延長半衰期且促進純化。
雙親和性重新標靶(dual affinity retargeting, DART)具有兩個肽鏈連接相反的片段，因此VLA與VHB及VLB與VHA連接，且其等之C端以硫鍵將其等融合為一。在DART中，硫鍵相較於BiTE更能改善穩定性。
在DART-Fc中，Fc區係附接於DART結構上。其可藉由組合三個鏈而產生，其中兩個鏈經由係雙硫鍵連接，如同DART。一個鏈包含一半的Fc區，其將與僅表現Fc區的第三個鏈發生二聚化。加入Fc區會提高半衰期，使有效濃度維持更長時間，避免持續進行靜脈注射(IV)。
在四價DART中，係組合有四個肽鏈。基本上，會產生兩個DART分子，其等具有一半的Fc區，且將發生二聚化。此種形式具有對兩個標靶進行雙價結合的能力，因此其係四價分子。
串接雙抗體(tandem diabody, TandAb)包含兩個雙抗體。每個雙抗體由一個VHA及VLB片段以及一個VHA及VLB片段所組成，其等之間係共價關聯。兩個雙價抗體係以肽鏈連結。其相較於由兩個scFv所組成之雙抗體更能改善穩定性。其具有兩個二價結合位址。
scFv-scFv-毒素包括毒素及具有穩定連結子的兩個scFv。其可用於特定有效負載的遞送。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係雙特異性抗體。在一些實施例中，本發明的雙特異性抗體係設計為1+1(對每個標靶係單價)，且具有IgG1亞型結構。其可降低對EGFR及TROP2表現位準低之細胞的親留性(avidity)，並增加對共表現EGFR及TROP2之細胞的親留性，以實現增強的標靶功能。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段具有：與SEQ ID NO: 26具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同性的輕鏈恆定區；及與SEQ ID NOs: 27及28中之任一者具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同性的重鏈恆定區。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體包括KIH突變。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體包括：第一抗原結合域，其特異性結合至EGFR；及第二抗原結合域，其特異性結合至TROP2。在一些實施例中，第一抗原結合域包括重鏈，其包括一或多個癤(knob)突變(癤重鏈)，且第二抗原結合域包括重鏈，其包括一或多個洞突變(洞重鏈)。在一些實施例中，第一抗原結合域包括重鏈，其包括一或多個洞(hole)突變(洞重鏈)，且第二抗原結合域包括重鏈，其包括一或多個癤突變(癤重鏈)。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體包括癤重鏈，其包含與SEQ ID NO: 27具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同性的恆定區。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體包括洞重鏈，其包含與SEQ ID NO: 28具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同性的恆定區。 抗體及 ADC 特徵
抗TROP2/EGFR抗體可包括抗EGFR抗原結合域及如本文所述之任何抗TROP2抗原結合域。
本發明提供抗TROP2/EGFR抗體及其可特異性結合至EGFR的抗原結合片段。此等抗TROP2/EGFR抗體可係致效劑或拮抗劑。抗TROP2/EGFR抗體或其本文所述之抗原結合片段可結合至EGFR，且阻斷EGFR與EGF之間的結合，及/或EGFR與TGFα之間的結合。藉由阻斷EGFR與EGF之間的結合，及/或EGFR與TGFα之間的結合，抗TROP2/EGFR抗體即可抑制EGFR關聯的訊息傳遞途徑，從而治療癌症(例如NSCLC)。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可引發CMC或ADCC。
抗體對抗原的親和性可使用一般技術來測量，包括例如酵素免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、放射免疫測定法(radioimmunoassay, RIA)、及表面電漿子共振(surface plasmon resonance, SPR)。親和性可推導自動力學速率常數的商(KD = koff/kon)。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可以小於0.1 s -1、小於0.01 s -1、小於0.001 s -1、小於0.0001 s -1、或小於0.00001 s -1的解離速率(koff)結合至EGFR (例如人類EGFR、猴EGFR、小鼠EGFR、及/或嵌合EGFR)。在一些實施例中，解離速率(koff)大於0.01s -1、大於0.001 s -1、大於0.0001 s -1、大於0.00001 s -1、或大於0.000001 s -1。
在一些實施例中，動力學結合速率(kon)大於1 × 10 2/Ms、大於1 × 10 3/Ms、大於1 × 10 4/Ms、大於1 × 10 5/Ms、或大於1 × 10 6/Ms。在一些實施例中，動力學結合速率(kon)小於1 × 10 5/Ms、小於1 × 10 6/Ms、或小於1 × 10 7/Ms。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可以小於1 × 10 -6M、小於1 × 10 -7M、小於1 × 10 -8M、小於1 × 10 -9M、或小於1 × 10 -10M的KD結合至EGFR(例如人類EGFR、猴EGFR、小鼠EGFR、及/或嵌合EGFR)。在一些實施例中，KD小於50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、或1 nM。在一些實施例中，KD大於1 × 10 -7M、大於1 × 10 -8M、大於1 × 10 -9M、或大於1 × 10 -10M。
抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段亦可包含可特異性結合至TROP2的抗原結合域。本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可阻斷TROP2與其配體(例如密連蛋白-1、密連蛋白-7、週期蛋白D1、及IGF-1)之間的結合。在一些實施例中，藉由結合TROP2，抗TROP2/EGFR抗體亦可抑制TROP2關聯的訊息傳遞途徑，從而抑制細胞增生、分化、及/或轉移。因此，在一些實施例中，如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體係TROP2致效劑。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係TROP2拮抗劑。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可以小於0.1 s -1、小於0.01 s -1、小於0.001 s -1、小於0.0001 s -1、或小於0.00001 s -1的解離速率(koff)結合至TROP2(例如人類TROP2、猴TROP2、小鼠TROP2、及/或嵌合TROP2)。在一些實施例中，解離速率(koff)大於0.01s -1、大於0.001 s -1、大於0.0001 s -1、大於0.00001 s -1、或大於0.000001 s -1。
在一些實施例中，動力學結合速率(kon)大於1 × 10 2/Ms、大於1 × 10 3/Ms、大於1 × 10 4/Ms、大於1 × 10 5/Ms、或大於1 × 10 6/Ms。在一些實施例中，動力學結合速率(kon)小於1 × 10 5/Ms、小於1 × 10 6/Ms、或小於1 × 10 7/Ms。
親和性可推導自動力學速率常數的商(KD = koff/kon)。在一些實施例中，KD小於1 × 10 -6M、小於1 × 10 -7M、小於1 × 10 -8M、小於1 × 10 -9M、或小於1 × 10 -10M。在一些實施例中，KD小於50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、或1 nM。在一些實施例中，KD大於1 × 10 -7M、大於1 × 10 -8M、大於1 × 10 -9M、或大於1 × 10 -10M。
因為抗TROP2/EGFR抗體(例如雙特異性抗體)結合至TROP2及EGFR兩者，因此對於表現TROP2及EGFR兩者的細胞而言，抗體對此等細胞具有更高的結合親和性。親留性可用於測量抗體與此等細胞的結合親和性。親留性係單獨非共價結合相互作用之多重親和性的累積強度。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或ADC可以小於3 nM、小於2.5 nM、小於2 nM、小於1.9 nM、小於1.8 nM、小於1.7 nM、小於1.6 nM、或小於1.5 nM的EC50值結合至表現TROP2及/或EGFR的細胞(例如A431細胞或人類肺癌HCC827細胞)。
亦可確定熱穩定性。如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可具有大於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、或95℃的Tm。由於IgG可說係多域蛋白質，因此熔化曲線有時會顯示兩個轉變，即第一變性溫度Tm D1，及第二變性溫度Tm D2。此兩個峰的出現通常分別表明Fc域(Tm D1)及Fab域(Tm D2)發生變性。當存在兩個峰時，Tm通常指Tm D2。因此，在一些實施例中，如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段具有大於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、或95℃的Tm D1。在一些實施例中，如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段具有大於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、或95℃的Tm D2。在一些實施例中，Tm、Tm D1、Tm D2小於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、或95℃。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可結合至人類EGFR或猴EGFR。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段不可結合至人類EGFR或猴EGFR。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可結合至人類TROP2或猴TROP2。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段不可結合至人類TROP2或猴TROP2。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體、抗原結合片段、或ADC具有大於30%、40%、50%、60%、70%、72.5%、75%、77.5%、80%、82.5%、85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的純度，其係例如藉由HPLC所測量。在一些實施例中，純度小於30%、40%、50%、60%、70%、72.5%、75%、77.5%、80%、82.5%、85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%，其係例如藉由HPLC所測量。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體、抗原結合片段、或ADC具有大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或200%的腫瘤生長抑制率或百分比(TGI%)。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體、抗原結合片段、或ADC具有小於60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、或150%的腫瘤生長抑制百分比。TGI (%)可例如於治療開始之3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、或41天後確定。如本文所用，腫瘤生長抑制率或百分比(TGI%)係使用下式計算： TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100% Ti係治療組在第i天的平均腫瘤體積。T0係治療組在第0天的平均腫瘤體積。Vi係對照組在第i天的平均腫瘤體積。V0係對照組在第0天的平均腫瘤體積。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體、抗原結合片段、或ADC具有功能性Fc區。在一些實施例中，功能性Fc區的效應因子(effector)功能係抗體依賴性的細胞媒介之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)。在一些實施例中，功能性Fc區的效應因子功能係吞噬作用。在一些實施例中，功能性Fc區的效應因子功能係ADCC及吞噬作用。在一些實施例中，Fc區係人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、或人類IgG4。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體、抗原結合片段、或ADC不具有功能性Fc區。例如，抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段係Fab、Fab'、F(ab') 2、及Fv片段。在一些實施例中，如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段具有無效應因子功能的Fc區。在一些實施例中，Fc係人類IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc不具有功能性Fc區。例如，Fc區具有LALA突變(EU編號中之L234A及L235A突變)，或LALA-PG突變(EU編號中之L234A、L235A、P329G突變)。
Fc區亦可進行一些其他修飾。例如，可將半胱胺酸殘基引入Fc區，從而可在此區形成鏈間雙硫鍵。由此產生的同源二聚體融合蛋白質在體外及/或體內的半衰期可增加。
在一些實施例中，IgG4具有S228P突變(EU編號)。S228P突變會防止體內及體外IgG4 Fab臂交換。
在一些實施例中，所提供之Fc區具有缺乏(直接或間接)附接至Fc區之岩藻醣的碳水化合物結構。例如，此類Fc區組成物中之岩藻醣的量可係從1%至80%、從1%至65%、從5%至65%、或從20%至40%。例如，岩藻醣的量係藉由計算位於Asn297之糖鏈內岩藻醣的平均量相對於附接至Asn297之所有糖結構(例如錯合物、混成物(hybrid)、及高甘露糖結構)的總和來確定，其係藉由MALDI-TOF質譜測定法所測量，如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中約位置297(Fc區殘基的Eu編號；或Kabat編號中的位置314)的天冬醯胺酸(asparagine)殘基；然而，由於Fc區序列中的微小序列變化，Asn297亦可位於位置297的上游或下游約±3個胺基酸，即位置294與300之間。此類岩藻醣化作用(fucosylation)變異體可能具有改善的ADCC功能。在一些實施例中，為了減少多醣異質性，可進一步工程改造Fc區以使用丙胺酸替代位置297的天冬醯胺酸(N297A)。
在一些實施例中，藉由基於蛋白質A的親和性層析法及/或粒徑排阻(size-exclusive)層析法純化後，HPLC-SEC的主峰佔本文所述之蛋白質錯合物的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、100%。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC具有其小於5 µg/mL、小於4.5 µg/mL、小於4 µg/mL、小於3.5 µg/mL、小於3 µg/mL、小於2.5 µg/mL、小於2 µg/mL、小於1.5 µg/mL、小於1 µg/mL、小於0.9 µg/mL、小於0.8 µg/mL、小於0.7 µg/mL、小於0.6 µg/mL、小於0.5 µg/mL、小於0.4 µg/mL、小於0.3 µg/mL、小於0.2 µg/mL、小於0.1 µg/mL、小於0.05 µg/mL、小於0.025 µg/mL、小於0.0125 µg/mL、小於0.005 µg/mL、或小於0.0025 µg/mL的體外殺傷癌細胞(例如人類上皮樣(epidermoid)癌細胞株A431、人類乳癌細胞株MCF-7、人類肺癌細胞株NCI-H226或NCI-H520)的IC50。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC具有小於15 µg/mL、小於10 µg/mL、小於5 µg/mL、小於1 µg/mL、小於0.9 µg/mL、小於0.8 µg/mL、小於0.7 µg/mL、小於0.6 µg/mL、或小於0.5 µg/mL的體外殺傷癌細胞(例如HCC827細胞、NCI-H292細胞、A431細胞、或Panc 02.03細胞)的IC50。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或ADC相較於本文所述之對應單株抗體及/或對照雙特異性抗體具有更高的胞吞率。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或ADC相較於西妥昔單抗類似物具有更高的胞吞率。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或ADC相較於DS-1062類似物及/或戈沙妥組單抗類似物具有更高的胞吞率。在一些實施例中，本文所述之雙特異性抗TROP2/EGFR抗體或ADC相較於阿米凡他單抗(amivantamab)類似物具有更高的胞吞率。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC相較於同型對照ADC(例如ISO-CPT2)具有更高的胞吞率。
在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC以1至20 mg/kg(例如約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、或約10 mg/kg)投予，且在投予之15分鐘、2小時、6小時、1天、3天、5天、7天、10天、14天、或21天後進行檢測時，其具有至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、或至少13天的半衰期。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC相較於同型對照ADC(例如ISO-ADC)具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、或至少140%的半衰期。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC具有小於25 mL/天/kg、24 mL/天/kg、23 mL/天/kg、22 mL/天/kg、21 mL/天/kg、20 mL/天/kg、19 mL/天/kg、18 mL/天/kg、17 mL/天/kg、16 mL/天/kg、15 mL/天/kg、14 mL/天/kg、13 mL/天/kg、12 mL/天/kg、11 mL/天/kg、或10 mL/天/kg的清除率(clearance rate)。在一些實施例中，本文所述之抗TROP2/EGFR ADC的PK特性(PK profile)係基於所投予之抗TROP2/EGFR ADC的血清濃度或衍生自抗TROP2/EGFR ADC的總抗體來確定。
在一些實施例中，在將抗TROP2/EGFR ADC加入至血漿(例如人類、猴、或大鼠血漿)中至少1天、2天、6天、8天、11天、14天、18天、或21天後，衍生自所投予之本文所述之抗TROP2/EGFR ADC的游離治療劑(例如MMAE或CPTx)的比率小於10%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、或小於1%。在一些實施例中，ADC的終末濃度(terminal concentration)係約10至500 µg/mL(例如100 µg/mL)。 抗體藥物接合物 (ADC)
本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段可與治療劑(藥物)接合。治療劑可共價或非共價結合至抗TROP2/EGFR抗體。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係抗TROP2/EGFR雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體具有共同輕鏈。
在一些實施例中，治療劑係細胞毒性劑或細胞生長抑制劑[例如單甲基澳瑞他汀E (monomethyl auristatin E)、單甲基澳瑞他汀F、細胞鬆弛素B、短桿菌素D、溴化乙錠、吐根素、絲裂黴素、伊妥普賽(etoposide)、坦尼坡賽(tenoposide)、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙鹼、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素、二羥基炭疽菌素、美登素(maytansinoids)(諸如DM-1及DM-4)、二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌黴素D、1-脫氫睪固酮、葡萄糖皮質素、普羅卡因、四卡因、利多卡因、心得安(propranolol)、嘌呤黴素、表柔比星(epirubicin)、及環磷醯胺及類似物]。有用的細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、或免疫調節劑的類別包括例如：抗微管蛋白劑、DNA小溝結合物、DNA複製抑制劑、及烷化劑。
在一些實施例中，治療劑可包括但不限於：細胞毒性試劑(諸如化學治療劑、免疫治療劑等)、抗病毒劑、或抗微生物劑。在一些實施例中，待接合的治療劑可選自但不限於：MMAE (單甲基澳瑞他汀E)、MMAD (單甲基澳瑞他汀D)、或MMAF (單甲基澳瑞他汀F)。
下文更詳細地描述特定官能基團及化學術語的定義。鑒於本發明之目的，化學元素係根據CAS版之Handbook of Chemistry and Physics, 75 thEdition封面內頁的元素週期表所辨識，且特定官能基團的一般定義係如其中所述。此外，有機化學的一般原理以及特定之官能部分(moiety)及反應性描述於Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999；Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5 thEdition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001；Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989；Carruthers, Some Modem Methods of Organic Synthesis, 3 rdEdition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987。
除非另有明確說明，否則本文所引用之所有範圍均包括端值。當列出一值的範圍時，其旨在涵蓋該範圍內每個值及子範圍。例如，「C 1-6」旨在涵蓋C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 1-6、C 1-5、C 1-4、C 1-3、C 1-2、C 2-6、C 2-5、C 2-4、C 2-3、C 3-6、C 3-5、C 3-4、C 4-6、C 4-5、及C 5-6。
本發明的化合物或任何描繪及描述化合物之化學式可具有一或多個掌性(不對稱)中心。本發明涵蓋化合物或任何描繪及描述化合物之化學式的所有立體異構形式。本發明之化合物或任何描繪及描述化合物之化學式中所存在的不對稱中心皆可相互獨立具有(R)或(S)組態。當掌性碳的鍵在結構式中係描繪為直線時，或者當提及之化合物名稱中不具有掌性碳的(R)或(S)掌性符號時，應理解每個此類掌性碳的(R)及(S)組態，及因此每個鏡像異構物或非鏡像異構物及其混合物，皆包含於化學式或名稱中。
本發明包括所有可能的鏡像異構物及非鏡像異構物，以及所有比率之二或多種立體異構物的混合物，例如鏡像異構物及/或非鏡像異構物的混合物。因此，本發明之標的的鏡像異構物可係單一鏡像(enantiomerically pure)形式(包含左旋及右旋鏡像異構體)、外消旋物形式、以及所有比率之兩種鏡像異構物的混合物形式。就順式/反式異構性而言，本發明包括順式形式及反式形式兩者，以及所有比率之此等形式的混合物。如有需要，可藉由習知方法分離混合物來製備單獨立體異構物，例如藉由層析法或結晶法、藉由使用立體化學均勻之合成起始材料、或藉由立體選擇性合成。可選地，可在立體異構物分離之前進行衍生化。立體異構物之混合物的分離可在化合物合成過程中的中間步驟中進行，亦可在最終外消旋產物上進行。絕對立體化學可藉由結晶產物或結晶中間產物的X光結晶學來確定，該結晶產物或結晶中間產物如有需要，係使用含有已知組態之立體中心的試劑來衍生化。替代地，絕對立體化學可藉由振動圓二色性(Vibrational Circular Dichroism, VCD)光譜學分析來確定。
除非另有說明，本文描繪的結構還意指包括僅在一或多種同位素濃化(isotopically enriched)原子的存在上存在差異的化合物，換言之，係一或多種原子由具有相同原子序之原子替代的化合物，但其中原子質量或質量數不同於自然界中主要存在之原子質量或質量數。此類化合物稱為「同位素變異體(isotopic variant)」。本發明旨在包括化合物或任何描繪及描述化合物之化學式之所有醫藥上可接受的同位素變異體。適合包括於本發明之化合物中同位素的示例包括但不限於以下元素之同位素：氫，例如 2H(即D)及 3H；碳，例如 11C、 13C、及 14C；氯，例如 36Cl；氟，例如 18F；碘，例如 123I及 125I；氮，例如 13N及 15N；氧，例如 15O、 17O、及 18O；磷，例如 32P；及硫，例如 35S。本發明之化合物或任何描繪及描述化合物之化學式的某些同位素變異體，例如併入放射性同位素者，可能有助於藥物及/或基質的組織分布研究。特別係，具有所描繪結構的化合物，其不同之處僅在於使用較重的同位素來替代[諸如藉由氘( 2H，或D)替代氫]，此等化合物可具有某些治療優勢，例如導致代謝穩定性更佳、體內半衰期增加、或劑量需求減少，並因此可用於某些特定環境。本發明之化合物或任何描繪及描述化合物之化學式的同位素變異體通常可以藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的技術，或藉由與所附實例中所描述之類似的方法加以製備，並使用適當之同位素標記試劑來替代習知採用的非標記試劑進行合成。
本文提供的化合物係參考通式及特定化合物進行描述。此外，本發明的化合物可以多種不同的形式或衍生物存在，其等全部皆屬本發明之範圍內。此等包括例如：醫藥上可接受之鹽、互變異構物、立體異構物、外消旋混合物、位置異構物(regioisomer)、前驅藥、溶劑合物形式、不同晶體形式或同質異晶物(polymorph)、及活性代謝物等。
如本文所用，術語「醫藥上可接受之鹽(pharmaceutically acceptable salt)」，除非另有說明，否則其包括保留特定化合物之游離酸/鹼形式的生物有效性，且非指生物學上或其他方面非所欲之鹽。醫藥上可接受之鹽可包括與無機鹼或酸及有機鹼或酸形成的鹽。在本發明之化合物含有一或多個酸性或鹼性基團的情況下，本發明亦包含與其等化合物對應之醫藥上可接受之鹽。因此，含有酸性基團(諸如羧基團)之本發明之化合物可以鹽形式存在，且可根據本發明加以使用，例如作為鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、鋁鹽、或作為銨鹽。此類鹽的更多非限制性示例包括：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋇鹽、或與氨或有機胺(諸如乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、哌啶、N-甲基麩醯胺酸、或胺基酸)形成的鹽。此等鹽例如可藉由使具有酸性基團的化合物與合適的鹼(例如氫氧化鋰、氫氧化鈉、丙醇鈉、氫氧化鉀、乙醇鈉、氫氧化鎂、氫氧化鈣、或氫氧化鋇)反應而輕易獲得。本發明之化合物的其他鹼鹽包括但不限於：銅(I)、銅(II)、鐵(II)、鐵(III)、錳(II)、及鋅鹽。本發明之含有一或多個鹼性基團(例如可質子化的基團)的化合物可以鹽形式存在，且可根據本發明以其等與無機酸或有機酸之附加鹽的形式加以使用。合適之酸的示例包括：氯化氫、溴化氫、碘化氫、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸(naphthalenedisulfonic acid)、磺基乙酸、三氟乙酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、碳酸、甲酸、丙酸、三甲基乙酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸(fumaric acid)、丙二酸、馬來酸(maleic acid)、蘋果酸、撲酸(embonic acid)、杏仁酸(mandelic acid)、胺磺酸(sulfaminic acid)、苯基丙酸、葡萄糖酸、抗壞血酸、異菸鹼酸、檸檬酸、己二酸、牛膽酸、戊二酸、硬脂酸、麩胺酸、或天冬胺酸(aspartic acid)，以及所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他酸。所形成的鹽包括但不限於：鹽酸鹽、氯化物、氫溴酸鹽、溴化物、碘化物、硫酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、磺基乙酸鹽、三氟甲磺酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、撲酸鹽(embonate)、杏仁酸鹽、富馬酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、戊二酸鹽、硬脂酸鹽、天冬胺酸鹽、及麩胺酸鹽。此外，由本發明之化合物形成之鹽的化學計量可係一的整數倍或非整數倍。
本發明之含有鹼性含氮基團的化合物可使用諸如：C 1-4烷基鹵化物(例如甲基、乙基、異丙基、及三級-丁基之氯化物、溴化物、及碘化物)；二C 1-4烷基硫酸酯(例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、及硫酸二戊酯)；C 10-18烷基鹵化物(例如癸基、十二基、月桂基、肉豆蔻基、及硬脂基之氯化物、溴化物、及碘化物)；及芳基C 1-4烷基鹵化物(例如氯化苯及苯乙基溴(phenethyl bromide))的試劑進行四級胺化。
若本發明之化合物在分子中同時含有酸性及鹼性基團，則除所提及之鹽形式之外，本發明亦包括內鹽或甜菜鹼(兩性離子)。對應的鹽可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的習知方法獲得，例如藉由將此類化合物與有機酸/鹼或無機酸/鹼在溶劑或分散劑中接觸，或藉由與其他鹽進行陰離子交換或陽離子交換。本發明亦包括本發明之化合物的所有由於低生理相容性而不適合直接用於醫藥，但可用作例如化學反應之中間產物或用於製備醫藥上可接受之鹽的鹽。更合適之鹽的綜述參見Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, 2002)。
本發明之化合物或任何描繪及描述化合物之化學式，及其醫藥上可接受之鹽可以非溶劑合物及溶劑合物形式存在。如本文所用，術語「溶劑合物(solvate)」係指包含式(I)化合物、或其醫藥上可接受之鹽、及一或多種醫藥上可接受之溶劑分子的分子錯合物。例如，當溶劑係水時，則採用術語「水合物(hydrate)」。
根據本發明之醫藥上可接受之溶劑合物可包括結晶溶劑可被同位素取代者，例如D 2O、d 6-丙酮、d 6-DMSO。 連結子 ( 連結劑化合物 )
在一些實施例中，治療劑係經由連結子(或連結劑化合物)接合。如本文所用，術語「連結子(linker)」或「連結劑化合物(linking agent compound)」係指可將配體(例如本文所述之抗體或其抗原結合片段)與治療劑(例如本文所述之治療劑中之任一者)連接的化合物，其(例如藉由耦合反應)分別與配體化合物及治療劑化合物的基團反應，以形成配體-藥物接合物。
在一些實施例中，本文所述之連結子係具有下式的化合物： 式(I)， 或其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物、立體異構物或同位素變異體，其中Q表示接合部分，其能夠經由選自由羰基、硫醚、醯胺、雙硫、及腙鍵所組成之群組的鍵與配體耦合；L表示連結子部分，其能夠將Q連接至治療劑。 在一些實施例中，接合部分(式(I)中的Q)具有以下結構： 。
在一些實施例中，連結子部分(式(I)中的L)具有下式： ， 其中L 1係由3至8個胺基酸殘基所組成的多肽殘基，該等胺基酸殘基包含至少一個具有支鏈羧基的胺基酸殘基，例如麩胺酸殘基或天冬胺酸殘基，其中「-COOH」表示位於多肽殘基C端之胺基酸殘基的羧基團； L 2不存在，或其係附接至多肽殘基L 1之胺基酸殘基上支鏈羧基團的單牙、雙牙、或三牙親水基團，且L 2具有-NHC(R L2a)(R L2b)(R L2c)的結構，其中R L2a、R L2b、及R L2c各自獨立地選自由H、-(CH 2O)(CH 2CH 2O) m(CH 2) pC(O)OH、及-(CH 2O) (CH 2CH 2O) m(CH 2) pC(O)NHR L2d所組成之群組，R L2d係H或可選地經1至6個羥基取代的C 1-6烷基，每個m獨立地係0至10的整數，較佳地係0至4(例如0、1、2、3、或4)，特佳地m係0，且每個p獨立地係1至4的整數(例如1、2、3、或4)；及 表示共價附接至接合部分Q之多肽殘基的N端側。
在一些實施例中，多肽殘基L 1係 NH-Glu-Val-Ala- COOH。在一些實施例中，親水基團L 2具有以下結構： ， CPT-L其中「*」表示共價附接至多肽殘基L 1的位址，例如 NH-Glu-Val-Ala- COOH中Glu殘基的支鏈。
在一些實施例中，本文所述之連結子係具有以下結構的化合物： 。
在一些實施例中，連結子係VC連結子。用於ADC之連結子之詳細綜述可參見例如Su, Z. et al."Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry."Acta Pharmaceutica Sinica B (2021)，其全文內容以引用方式併入本文。 治療劑
在一些實施例中，與本文所述之抗體或其抗原結合片段接合的治療劑係如下文所討論。
在一些實施例中，本文所述之治療劑係細胞毒性劑。在一些實施例中，細胞毒性劑係喜樹鹼化合物、其類似物或衍生物。在一些較佳實施例中，喜樹鹼化合物係具有以下結構的化合物： ， 其中X選自由-CH2-、O、及S所組成之群組；Y選自由H、D、及F所組成之群組。
在一些實施例中，治療劑係(S)-4-胺基-9-乙基-9-羥基-1,9,12,15-四氫-13H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]噻喃并[4,3,2-de]喹啉-10,13(2H)-二酮(CPT-1)。CPT-1的結構如下所示： 。 CPT-1
在一些實施例中，治療劑係(S)-4-胺基-9-乙基-9-羥基-1,9,12,15-四氫-13H-吡喃并[4,3,2-de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(2H)-二酮(CPT-2)。CPT-2的結構如下所示： 。 CPT-2
在一些實施例中，治療劑係CPT3。CPT-3的結構如下所示： 。 CPT-3
在一些實施例中，治療劑係(S)-4-胺基-9-乙基-5-氟基-9-羥基-1,9,12,15-四氫-13H-吡喃并[4,3,2-de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(2H)-二酮(CPT-4)。CPT-4的結構如下所示： 。 CPT-4
在一些實施例中，治療劑係澳瑞他汀，諸如澳瑞他汀E [本技術領域亦稱為海兔毒素-10 (dolastatin-10)的衍生物]或其衍生物。澳瑞他汀可係例如澳瑞他汀E與酮酸之間形成的酯。例如，澳瑞他汀E可與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應分別產生AEB及AEVB。其他典型的澳瑞他汀包括AFP、MMAF、及MMAE。示例性澳瑞他汀的合成及結構描述於美國專利申請案第2003-0083263公開號；國際專利第WO 04/010957公開號；國際專利第WO 02/088172公開號；及美國專利第7,498,298；6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；及4,486,414號，其等全文內容均以引用方式併入本文。
研究表明，澳瑞他汀可干擾微管動力學，以及核分裂及細胞分裂，且具有抗癌活性。澳瑞他汀結合微管蛋白，且可對癌細胞產生細胞毒性或細胞生長抑制效應。本技術領域已知多種不同測定法可用於確定澳瑞他汀或所得之抗體-藥物接合物是否對所需之細胞產生細胞生長抑制或細胞毒性效應。
在一些實施例中，治療劑係化學治療劑。化學治療劑的示例包括：烷化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide, CYTOXAN™)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)、及三羥甲基密胺(trimethylolomelamine)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard))；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素d(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸鹽(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡二內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；蘑菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK7；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2',2',2'-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；紫杉烷，例如紫杉醇(paclitaxel. TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, 普林斯頓(Princeton), N.J.)及多西他賽(doxetaxel. TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(etoposide，VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞賓(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶(topoisomerase)抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；及上述中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如：抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)、及托瑞米芬(toremifene, Fareston)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、及戈舍瑞林(goserelin)；及以上中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑之詳細描述可參見例如US20180193477A1，其全文內容以引用方式併入本文入。 連結子 - 治療劑化合物
在一些實施例中，連結子(例如本文所述之連結子中之任一者)及治療劑(例如本文所述之治療劑中之任一者)可連結以形成「連結子-治療劑」化合物。
在一些實施例中，連結子-治療劑化合物具有以下結構： 。
在一些實施例中，連結子-治療劑化合物具有以下結構： 。
在一些實施例中，抗體(「Ab」)(例如本文所述之抗體或其抗原結合片段中之任一者)可連結至連結子-治療劑化合物(例如本文所述之連結子-治療劑化合物中之任一者)以產生抗體-藥物接合物。在一些實施例中，抗體-藥物接合物具有以下結構： ， 其中n = 1至8。在一些實施例中，n = 1至8。在一些實施例中，n係約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8。在一些實施例中，n係約1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至8、4至7、4至6、4至5、5至8、5至7、5至6、6至8、6至7、或7至8。在一些實施例中，n係一的整數倍或非整數倍。
在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係經由可裂解連結子[例如SPBD連結子或馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧羰基(maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl, VC)連結子]與藥物耦合。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體係經由不可裂解連結子(例如使用SMCC或磺基-SMCC形成的MCC連結子)與藥物耦合。所屬技術領域中具有通常知識者考量相關因素(諸如抗TROP2/EGFR抗體的附接位址、藥物的任何結構限制、及藥物的疏水性)可輕易地為給定ADC選擇合適的連結子(參見例如Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer之綜述)。在某些實施例中，已描述多種特定的連結子-毒素組合，且可與本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段一起使用來製備ADC。示例包括但不限於：具有澳瑞他汀(諸如MMAE及MMAF)、喜樹鹼(諸如SN-38)、倍癌黴素(duocarmycins)、及PBD二聚體的基於肽之可裂解連結子；具有澳瑞他汀MMAF及MMAE的基於MC之不可裂解連結子；具有卡奇黴素及多柔比星的基於腙之酸性不穩定連結子；具有美登素(諸如DM1及DM4)的基於雙硫鍵之連結子；及具有美登素DM1的基於雙-馬來醯亞胺-三氧伸乙基乙二醇(BMPEO)之連結子。一些此類治療劑及連結子描述於例如Peters & Brown, (2015) Biosci.Rep. e00225; Dosio et al., (2014) Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 9:35-65；美國專利申請案第US 2015/0374847及US20180193477A1公開號；其等全文內容均以引用方式併入本文。
根據所需之藥物及所選擇之連結子，所屬技術領域中具有通常知識者可選擇合適的方法將其等耦合在一起。例如，一些習知耦合方法(諸如胺耦合方法)可用於形成所需之藥物-連結子錯合物，其仍含有用於經由共價連接與抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段接合的反應基團。在一些實施例中，藥物-馬來醯亞胺錯合物(即馬來醯亞胺連結藥物)可用於本發明中帶有反應基團的有效負載。在ADC製備中能夠結合至硫醇基團的最常見反應基團即係馬來醯亞胺。此外，有機溴化物、碘化物亦經常使用。
抗TROP2/EGFR ADC可採用所屬技術領域中具有通常知識者已知的有機化學反應、條件、及試劑，藉由本技術領域已知的數種途徑之一來製備[參見例如Bioconjugate Techniques (G. T. Hermanson, 2013, Academic Press)]。例如，接合可藉由以下方式加以實現：(1)抗體的親核基團或親電子基團與二價連結子試劑反應，以經由共價鍵形成抗體-連結子中間產物Ab-L，接著與活化的藥物部分D反應；或(2)藥物部分的親核基團或親電子基團與連結試劑反應，以經由共價鍵形成藥物-連結子中間產物D-L，接著與抗體的親核基團或親電子基團反應。接合方法(1)及(2)可用於多種抗體、藥物部分及連結子，以製備本文所述之抗TROP2/EGFR ADC。各種製備的連結子、連結子化合物、及毒素係可經市售途徑取得，或可使用標準合成有機化學技術來製備。此等方法描述於例如March's Advanced Organic Chemistry (Smith & March, 2006, Sixth Ed., Wiley); Toki et al., (2002) J. Org.Chem.67:1866-1872；Frisch et al., (1997) Bioconj.Chem.7:180-186; Bioconjugate Techniques (G. T. Hermanson, 2013, Academic Press)；US20210379193A1及US20180193477A1，其等全文內容均以引用方式併入本文。另外，多種適合與所選之抗TROP2/EGFR抗體或抗原結合片段反應的預形成的藥物-連結子亦可經市售途徑取得，例如，包含DM1、DM4、MMAE、MMAF、或倍癌黴素SA的連結子-毒素可購自Creative BioLabs (Shirley, N.Y.)。
製備抗TROP2/EGFR ADC之方法的數個具體示例係本技術領域已知且描述於美國專利第8,624,003號[鍋法(pot method)]、美國專利第8,163,888號(一步法)、及美國專利第5,208,020號(兩步法)、及US20180193477A1，其等全文內容均以引用方式併入本文。其他方法係本技術領域已知且包括描述於Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer的方法。
藥物承載量(drug loading)係由ADC之分子中每個抗體的藥物部分數量表示。對於一些抗體-藥物接合物而言，藥物承載量可能受到抗體上之附接位址數量的限制。例如，當附接物係半胱胺酸硫醇(cysteine thiol)時，如本文所述之某些示例性實施例中，每個抗體之藥物承載量的範圍可係從0至8個藥物部分。在某些實施例中，較高的藥物承載量，例如p≥5，可能導致某些抗體-藥物接合物的聚集、不溶性、毒性、或喪失細胞滲透性。在某些實施例中，抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物之平均藥物承載量的範圍係從1至約8、從約2至約6、或從約3至約5。事實上，研究已表明，對於某些抗體-藥物接合物而言，每個抗體之藥物部分的最佳比係約4。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR ADC組成物的DAR係約或至少1、2、3、4、5、6、7、或8。在一些實施例中，抗TROP2/EGFR ADC組成物中的平均DAR係約1至約2、約2至約3、約3至約4、約3至約5、約4至約5、約5至約6、約6至約7、或約7至約8。
在一些實施例中，所提供之抗TROP2/EGFR抗體變異體具有缺乏(直接或間接)附接至Fc區之岩藻醣的碳水化合物結構。例如，此類抗體中之岩藻醣的量可係從1%至80%、從1%至65%、從5%至65%、或從20%至40%。例如，岩藻醣的量係藉由計算位於Asn297之糖鏈內岩藻醣的平均量相對於附接至Asn297之所有糖結構(例如錯合物、混成物(hybrid)、及高甘露糖結構)的總和來確定，其係藉由MALDI-TOF質譜測定法所測量，如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中約位置297(Fc區殘基的Eu編號；或Kabat編號中的位置314)的天冬醯胺酸殘基；然而，由於抗體中的微小序列變化，Asn297亦可位於位置297的上游或下游約±3個胺基酸，即位置294與300之間。此類岩藻醣化作用變異體可能具有改善的ADCC功能。在一些實施例中，為了減少多醣異質性，可進一步工程改造抗TROP2/EGFR抗體的Fc區以使用丙胺酸替代位置297的天冬醯胺酸(N297A)。
在一些實施例中，為了藉由避免Fab臂交換來促進生產效率，故進一步工程改造抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的Fc區以使用脯胺酸替代IgG4之位置228(EU編號)的絲胺酸(S228P)。有關S228突變之詳細描述參見例如Silva et al."The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation."Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015): 5462-5469，其全文內容以引用方式併入本文。
在一些實施例中，本文所述之方法係設計用於製造雙特異性抗TROP2/EGFR抗體。雙特異性抗TROP2/EGFR抗體可藉由工程改造一對抗體分子之間的界面，從而最大限度地提高自重組細胞培養中所回收之異源二聚體的百分比而加以製造。例如，界面可含有抗體恆定域之CH3域的至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子界面的一或多個小胺基酸支鏈被較大的支鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替代。藉由使用較小的胺基酸支鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替代較大的胺基酸支鏈，在第二抗體分子的界面上形成與大支鏈大小相同或相似的補償性「空腔」。如此提供一種使異源二聚體的產量高於其他不需要之最終產物(諸如同源二聚體)的機制。此方法描述於例如WO 96/27011中，其全文內容以引用方式併入本文。
在一些實施例中，可使用洞中癤(KIH)技術，其涉及工程改造CH3域以在每個重鏈中產生「癤」或「洞」以促進異源二聚化。KIH技術描述於例如Xu, Yiren, et al."Production of bispecific antibodies in 'knobs-into-holes' using a cell-free expression system."MAbs.Vol. 7.No. 1.Taylor & Francis, 2015，其全文內容以引用方式併入本文。在一些實施例中，一個重鏈具有T366W及/或S354C(癤)取代(EU編號)，且另一個重鏈具有Y349C、T366S、L368A、及/或Y407V(洞)取代(EU編號)。在一些實施例中，一個重鏈具有以下取代中之一或多者：Y349C及T366W(EU編號)。另一個重鏈可具有以下取代中之一或多者：E356C、T366S、L368A、及Y407V(EU編號)。此外，亦可在兩個經取代之IgG的樞紐區引入取代(-ppcpScp--＞-ppcpPcp-)。 重組載體
本發明亦提供：重組載體(例如表現載體)，其包括本文所揭示之分離多核苷酸(例如編碼本文所揭示之多肽的多核苷酸)；將重組載體引入其中的宿主細胞(即，使宿主細胞含有多核苷酸及/或包含多核苷酸的載體)；及藉由重組技術產生抗TROP2/EGFR抗體多肽或其片段。
如本文所用，「載體(vector)」係當將載體引入宿主細胞時，能夠將一或多種所關注之多核苷酸遞送至宿主細胞的任何構築體。「表現載體(expression vector)」能夠在已引入表現載體的宿主細胞中遞送一或多種所關注之多核苷酸及將其表現為經編碼之多肽。因此，在表現載體中，所關注之多核苷酸藉由與載體內或位於宿主細胞基因組中的所關注之多核苷酸之整合位址(integration site)處或附近或側翼(flanking)之調節元件(regulatory elements)(諸如啟動子、增強子、及/或多腺苷酸尾(poly-A tail))可操作地連結，從而定位在載體中以用於表現，從而使所關注之多核苷酸在引入表現載體的宿主細胞中轉譯。
載體可藉由本技術領域已知的方法引入宿主細胞，例如電穿孔、化學轉染(例如DEAE-葡聚糖)、轉化、轉染、及感染及/或轉導(例如使用重組病毒)。因此，載體的非限制性示例包括：病毒載體(其可用於產生重組病毒)、裸DNA或RNA、質體、黏質體、噬菌體載體、及陽離子縮合劑關聯之DNA或RNA表現載體。
在一些實施例中，使用病毒表現系統(例如牛痘或其他痘病毒、反轉錄病毒、或腺病毒)引入本文所揭示之多核苷酸(例如編碼本文所揭示之多肽的多核苷酸)，其可涉及使用非致病型(缺陷型)、複製勝任型(replication competent)病毒，或可使用複製缺陷型(replication defective)病毒。在後者的情況下，病毒繁殖通常僅發生在互補的病毒包裝細胞中。合適的系統揭示於例如Fisher-Hoch et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner et al., 1989, Ann.N.Y.Acad Sci.569:86-103；Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21；美國專利第4,603,112、4,769,330、及5,017,487號；WO 89/01973；美國專利第4,777,127號；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988；Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434；Kolls et al., 1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91:215-219；Kass-Eisler et al., 1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:11498-11502；Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848；及Guzman et al., 1993, Cir.Res., 73:1202-1207。將DNA併入此類表現系統的技術係所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知。DNA亦可係「裸露的(naked)」，其描述於例如Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749；及Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692。藉由將DNA塗覆至可有效轉運至細胞中的可生物降解的珠(bead)上，即可增加裸DNA的吸收。
為有利於表現，可將包含本文所揭示之編碼多肽之多核苷酸的DNA插入物(DNA insert)可操作地連結至適當的啟動子(例如異源啟動子)，諸如噬菌體λ PL啟動子、大腸桿菌( E. coli) lac、trp、及tac啟動子、SV40早發型及晚發型啟動子、及反轉錄病毒LTR之啟動子等。其他合適的啟動子係所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知。表現構築體可進一步含有用於轉錄起始、終止的位址、及在轉錄區中用於轉譯的核糖體結合位址。藉由構築體表現之成熟轉錄物的編碼部分可包括位於待轉譯多肽之開頭的轉譯起始位址，及位於末端之適當位置的終止密碼子(UAA、UGA、或UAG)。
如上所述，表現載體可包括至少一個可選擇標記(marker)。此類標記包括用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)或新黴素抗性基因，及用於在大腸桿菌及其他細菌中培養的四環素或胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因。適當宿主的代表性示例包括但不限於：細菌細胞，諸如大腸桿菌、鏈黴菌(Streptomyces)、及鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)細胞；真菌細胞，諸如酵母細胞；昆蟲細胞，諸如果蠅S2及夜蛾(Spodoptera) Sf9細胞；動物細胞，諸如CHO、COS、鮑斯黑素瘤(Bowes melanoma)、及HK 293細胞；以及植物細胞。適用於本文所述之宿主細胞的培養基及條件在本技術領域係眾所周知。
用於細菌的非限制性載體包括：pQE70、pQE60、及pQE-9 (可購自Qiagen)；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (可購自Stratagene)；及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (可購自Pharmacia)。非限制性真核載體包括：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、及pSG (可購自Stratagene)；及pSVK3、pBPV、pMSG、及pSVL (可購自Pharmacia)。其他合適的載體對於所屬技術領域中具有通常知識者而言係顯而易見的。
適合使用的非限制性細菌啟動子包括：大腸桿菌lacI及lacZ啟動子、T3及T7啟動子、gpt啟動子、λ PR及PL啟動子、及trp啟動子。合適的真核啟動子包括：CMV立即早發型啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早發型及晚發型SV40啟動子、反轉錄病毒LTR之啟動子(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)之啟動子)、及金屬硫蛋白啟動子(諸如鼠類金屬硫蛋白-I啟動子)。
在釀酒酵母中，可使用多種含有組成型或可誘導型啟動子[諸如α因子、醇氧化酶(alcohol oxidase)、及PGH]的載體。詳細綜述參見Ausubel et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y；及Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997)。
將構築體引入宿主細胞可藉由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖媒介之轉染、陽離子脂質媒介之轉染、電穿孔、轉導、感染、或其他方法來實現。許多標準實驗室手冊中皆有描述此類方法，例如Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)，其全文內容以引用方式併入本文。
高等真核生物對編碼本發明之抗TROP2/EGFR抗體的DNA的轉錄可藉由將增強子序列插入載體來增加。增強子係DNA的順式作用元件(cis-acting element)，通常約係從10至300 bp，其作用係提高給定宿主細胞類型中啟動子的轉錄活性。增強子的示例包括：位於複製起點遲側(late side)、在鹼基對100至270之SV40增強子；細胞巨大病毒早發型啟動子增強子；位於複製起點遲側之多瘤病毒增強子；及腺病毒增強子。
為了將經轉譯的蛋白質分泌至內質網的腔(lumen)、週漿間隙(periplasmic space)、或細胞外環境中，可在表現的多肽中併入適當的分泌訊息。訊息對於多肽可係內源性的，或該等訊息可係異源訊息。
多肽(例如抗TROP2/EGFR抗體)可以經修飾的形式表現，諸如融合蛋白質(例如GST-融合蛋白質)或具有組胺酸標記(histidine-tag)，且不僅可包括分泌訊息，亦可包括其他異源功能區。例如，可將額外的胺基酸(特別係帶電胺基酸)區加入至多肽的N端，以在純化期間或隨後的處理及儲存期間改善在宿主細胞中的穩定性及持續性。另外，可將肽部分加入至多肽中以促進純化。此類區可在多肽的最終製備之前移除。在多肽中加入肽部分以引起分泌或排泄、從而改善穩定性及促進純化等，皆係本技術領域眾所周知的常規技術。
本發明亦提供與如本文所述之任何核苷酸序列具有至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同性的核酸序列，及與如本文所述之任何胺基酸序列具有至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同性的胺基酸序列。
本發明亦提供與如本文所述之任何核苷酸序列具有至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的核酸序列，及與如本文所述之任何胺基酸序列具有至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明涉及編碼本文所述之任何肽的核苷酸序列，或由如本文所述之任何核苷酸序列編碼的任何胺基酸序列。在一些實施例中，核酸序列小於10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600個核苷酸。在一些實施例中，胺基酸序列小於5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、或400個胺基酸殘基。
在一些實施例中，胺基酸序列(i)包含胺基酸序列；或(ii)由胺基酸序列組成，其中胺基酸序列係如本文所述之序列中之任一者。
在一些實施例中，核酸序列(i)包含核酸序列；或(ii)由核酸序列組成，其中核酸序列係如本文所述之序列中之任一者。
為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的相同性百分比，因此出於最佳比較目的將序列對齊[例如可在第一胺基酸/核酸序列及第二胺基酸/核酸序列中之一或兩者中引入缺口(gap)以進行最佳對齊，且出於比較目的可忽略非同源序列]。接著比較位於對應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的一位置被與第二序列中對應位置的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置係相同(如本文所用，胺基酸或核酸的「相同性(identity)」均等於胺基酸或核酸的「同源性(homology)」)。兩個序列之間的相同性百分比係由序列所共享之同一位置的數量而決定，並考慮對兩個序列進行最佳對齊所需引入之缺口數，及每個缺口的長度。例如，可使用Blossum 62得分矩陣(Blossum 62 scoring matrix)來完成序列的比較及兩個序列之間相同性百分比的確定，其中缺口罰分係12、缺口延伸罰分係4、及框移缺口罰分(frameshift gap penalty)係5。
亦可確定序列同源性(例如胺基酸序列同源性或核酸同源性)的百分比。確定序列同源性之百分比的方法在本技術領域中係眾所周知。在一些實施例中，具有相似物理化學性質(同源性百分比)的保守胺基酸殘基(例如白胺酸及異白胺酸)可用於測量序列相似性。具有相似物理化學性質的胺基酸殘基家族已在本技術領域中定義。此等家族包括例如：具有鹼性支鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性支鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電的極性支鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性支鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支化支鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、及芳香族支鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。在許多情況下，同源性百分比係高於相同性百分比。
本發明提供編碼如本文所述之多肽中之任一者的一或多種核酸。在一些實施例中，核酸(例如cDNA)包括編碼如本文所述之重鏈之多肽的多核苷酸。在一些實施例中，核酸包括編碼如本文所述之輕鏈之多肽的多核苷酸。在一些實施例中，核酸包括編碼如本文所述之scFv多肽的多核苷酸。
在一些實施例中，載體可具有如本文所述之核酸中之兩者，其中載體編碼一起結合至EGFR的VL區及VH區。在一些實施例中，提供一對載體，其中每個載體包含如本文所述之核酸中之一者，其中該對載體一起編碼一起結合至EGFR的VL區及VH區。
在一些實施例中，載體包括如本文所述之核酸中之兩者，其中載體編碼一起結合至TROP2的VL區及VH區。在一些實施例中，提供一對載體，其中每個載體包含如本文所述之核酸中之一者，其中該對載體一起編碼一起結合至TROP2的VL區及VH區。 治療之方法
本文所述之方法包括用於治療癌症關聯之病症的方法。一般而言，此等方法包括向需要或已確定需要此類治療之對象投予治療有效量之如本文所述之抗TROP2/EGFR抗體或抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
如本文所用，「治療(treat)」係指改善(ameliorate)癌症關聯之病症的至少一種症狀。癌症通常會導致死亡，因此，治療可導致預期壽命(life expectancy)增加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年)。投予治療有效量之本文所述之試劑以用於治療癌症關聯之病症，將導致癌細胞的數量減少及/或症狀緩解。
如本文所用，術語「癌症(cancer)」係指具有自主生長能力的細胞，即以快速增生之細胞生長為特徵的異常狀態或狀況。此術語意指包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移組織或惡性轉化的細胞、組織、或器官，無論組織病理學類型或侵襲階段如何。如本文所用，術語「腫瘤(tumor)」係指癌細胞，例如癌細胞群。可使用本文所述之方法治療或診斷的癌症包括：各種器官系統(例如影響肺、乳房、甲狀腺、淋巴、胃腸、及生殖泌尿道)的惡性腫瘤；及包括惡性腫瘤(諸如大多數結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌及/或睾丸腫瘤、肺之非小細胞癌、小腸之癌症、及食道之癌症)的腺癌。在一些實施例中，本文所述之試劑係設計為用於治療或診斷對象的癌。術語「癌(carcinoma)」係本技術領域公認且係指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤，其包括呼吸系統癌、腸胃系統癌、生殖泌尿系統癌、睾丸癌、乳癌、前列腺癌、內分泌系統癌、及黑色素瘤。在一些實施例中，癌症係腎癌或黑色素瘤。示例性的癌包括自子宮頸、肺、前列腺、乳房、頭頸、結腸、及卵巢之組織形成的癌。此術語亦包括癌肉瘤，其例如包括由癌組織及肉瘤組織組成的惡性腫瘤。「腺癌(adenocarcinoma)」係指衍生自腺性組織的癌，或其中腫瘤細胞形成可識別之腺性結構的癌。術語「肉瘤(sarcoma)」係本技術領域公認且係指間質衍生的惡性腫瘤。
在一些實施例中，癌症係化學療法抗性癌症。
在一態樣中，本發明亦提供用於治療對象之癌症的方法、降低對象之腫瘤體積隨時間增加之速率的方法、降低發展轉移之風險的方法、或降低對象發展其他轉移之風險的方法。在一些實施例中，治療可停止、減緩、延緩、或抑制癌症的進展。在一些實施例中，治療可導致對象之癌症之一或多種症狀的數量、嚴重程度、及/或持續時間減少。
在一態樣中，本發明的特徵在於包括向有需要之對象投予治療有效量之本文所揭示之抗TROP2/EGFR抗體或抗TROP2/EGFR抗體藥物接合物，該對象例如患有、或經辨識或經診斷為患有癌症，例如固態腫瘤、肺癌(lung cancer)(例如非小細胞肺癌、肺腺癌、或肺癌(lung carcinoma))、胃癌(gastric cancer)[例如胃癌(gastric carcinoma)]、皮膚癌(skin cancer)[例如皮膚癌(skin carcinoma)]、結腸直腸癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胰臟癌、CNS癌、肝癌、鼻咽癌、腦癌、結腸癌、膀胱癌、口腔鱗狀細胞癌、子宮頸癌、或食道癌。
如本文所用，術語「對象(subject)」及「患者(patient)」於本說明書全文內容中可互換使用，且係描述根據本發明之方法提供治療之動物(人類或非人類)。本發明考量了獸醫及非獸醫之應用。人類患者可係成年人或青少年(例如18歲以下的人類)。除了人類之外，患者亦包括但不限於：小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、雪貂、貓、狗、及靈長類。包括例如：非人類靈長類(例如猴、黑猩猩、大猩猩等)、囓齒類(例如大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、雪貂、兔)、兔形類(lagomorph)、豬類(例如豬、小型豬)、馬類(equine)、犬類(canine)、貓類(feline)、牛類(bovine)、及其他家養、農場、及動物園動物。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物及方法可用於治療處於癌症風險中的患者。患有癌症的患者可使用本技術領域已知之各種方法加以辨識。
如本文所用，「有效量(effective amount)」係指足以產生有益或所需之結果的量或劑量，該等結果包括停止、減緩、延緩、或抑制疾病(例如癌症)的進展。有效量將根據例如待投予抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合片段、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物、編碼抗TROP2/EGFR抗體之多核苷酸、包含多核苷酸之載體、及/或其組成物之對象的年齡及體重、症狀的嚴重程度及投予途徑等因素而變化，並因此可基於個體情況確定投予。
有效量可在一或多次投予中投予。例如，抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物的有效量係足以改善、停止、穩定、逆轉、抑制、減緩及/或延遲患者之自體免疫疾病或癌症之進展的量，或係足以在體外改善、停止、穩定、逆轉、減緩、及/或延遲細胞[例如生檢(biopsied)細胞、本文所述之癌細胞中之任一者、或細胞株(例如癌細胞株)]增生的量。如本技術領域所理解者，抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物的有效量可變化，其所取決之因素包括但不限於：患者病史；及其他因素，諸如所使用藥劑的類型(及/或劑量)。
投予本文所揭示之抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、編碼抗TROP2/EGFR抗體之多核苷酸、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物、及/或組成物的有效量及時程可根據經驗確定，且做出如此確定係屬於本技術領域之範疇。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，必須投予的劑量將根據例如：將接受本文所揭示之抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、編碼抗TROP2/EGFR抗體之多核苷酸、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物、及/或組成物的哺乳動物；投予途徑；所使用之本文所揭示之藥劑或組成物的特定類型；及向哺乳動物投予的其他藥物而變化。
有效量之抗TROP2/EGFR抗體或抗TROP2/EGFR ADC的典型每日劑量係0.01 mg/kg至100 mg/kg。在一些實施例中，劑量可小於100 mg/kg、30 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、0.5 mg/kg、或0.1 mg/kg。在一些實施例中，劑量可大於10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、0.5 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、或0.01 mg/kg。在一些實施例中，劑量係約或至少10 mg/kg、9 mg/kg、8 mg/kg、7 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、0.9 mg/kg、0.8 mg/kg、0.7 mg/kg、0.6 mg/kg、0.5 mg/kg、0.4 mg/kg、0.3 mg/kg、0.2 mg/kg、或0.1 mg/kg。
在本文所述之方法中之任一者中，可向對象投予至少一種抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物、或醫藥組成物(例如包含抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、或抗TROP2/EGFR ADC中之任一者)、及可選地至少一種其他治療劑(例如每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每天一次、每天兩次、或每天三次)。
在一些實施例中，可在投予至少一種抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物、或醫藥組成物(例如包含抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、或抗TROP2/EGFR ADC中之任一者)之前或之後向對象投予一或多種其他治療劑。在一些實施例中，向對象投予一或多種其他治療劑及至少一種抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、或抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物，從而使對象體內之一或多種其他治療劑與至少一種抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR ADC的生物活性週期重疊。
在一些實施例中，可在延長的時間週期內(例如在至少1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年、或5年的時間週期內)向對象投予至少一種抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物、或醫藥組成物(例如包含抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、或抗TROP2/EGFR ADC中之任一者)。熟練的醫療專業人員可使用本文所述之方法中之任一者來確定治療週期的長度，以診斷或追蹤治療的有效性(例如觀察至少一種癌症的症狀)。如本文所述，熟練的醫療專業人員亦可基於對治療有效性的評估(例如使用本文所述及本技術領域已知方法中之任一者)，改變向對象投予之抗TROP2/EGFR抗體、或抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物(及/或一或多種其他治療劑)的種類(identity)及數量(例如增加或減少)，亦可調整(例如增加或減少)向對象投予之至少一種抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合抗體片段、或抗TROP2/EGFR ADC(及/或一或多種其他治療劑)的劑量或頻率。
在一些實施例中，可向對象投予一或多種其他治療劑。其他治療劑可包含一或多種抑制劑，其選自由B-Raf之抑制劑、EGFR抑制劑、MEK之抑制劑、ERK之抑制劑、K-Ras之抑制劑、c-Met之抑制劑、TROP2之抑制劑、退行性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)之抑制劑、磷脂酸肌醇3-激酶(PI3K)之抑制劑、Akt之抑制劑、mTOR之抑制劑、PI3K/mTOR雙抑制劑、布魯東氏酪胺酸激酶(Bruton's tyrosine kinase, BTK)之抑制劑、及異檸檬酸去氫酶1 (isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)及/或異檸檬酸去氫酶2 (IDH2)之抑制劑所組成之群組。在一些實施例中，其他治療劑係吲哚胺2,3-二氧酶-1) (IDO1)之抑制劑(例如埃帕司他(epacadostat))。
在一些實施例中，其他治療劑可包含一或多種抑制劑，其選自由HER3之抑制劑、LSD1之抑制劑、MDM2之抑制劑、BCL2之抑制劑、CHK1之抑制劑、經活化之刺蝟蛋白訊息傳遞途徑之抑制劑，及選擇性降解雌激素受體之藥劑所組成之群組。
在一些實施例中，其他治療劑可包含一或多種治療劑，其選自由曲貝替定(Trabectedin)、白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、翠巴拉尼(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕泊昔布(Palbociclib)、依維莫司(everolimus)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、IFL、瑞戈非尼(regorafenib)、雷歐利辛(Reolysin)、愛寧達(Alimta)、色瑞替尼(Zykadia)、紓癌特(Sutent)、坦羅莫司(temsirolimus)、阿西替尼(axitinib)、依維莫司(everolimus)、索拉非尼(sorafenib)、維曲特(Votrient)、帕唑帕尼(Pazopanib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、長春氟寧(Vinflunine)、Hsp90抑制劑、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、長春花鹼、沙利度胺(Thalomid)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺、來那度胺(lenalidomide)、氮胞嘧啶苷(azacytidine)、來那度胺(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomid)、胺柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)、及恩紮他因(enzastaurin)所組成之群組。
在一些實施例中，其他治療劑可包含一或多種治療劑，其選自由佐劑、TLR致效劑、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS致效劑、標靶CX3CL1之治療、標靶CXCL9之治療、標靶CXCL10之治療、標靶CCL5之治療、LFA-1致效劑、ICAM1致效劑、及選擇素(Selectin)致效劑所組成之群組。
在一些實施例中，向對象投予卡鉑、白蛋白結合型紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞(pemetrexed)、吉西他濱、FOLFOX、或FOLFIRI。
在一些實施例中，其他治療劑係抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA4抗體、抗CD40抗體、抗OX40抗體、抗4-1BB抗體、抗TIM3抗體、或抗GITR抗體。 醫藥組成物及投予途徑
本文還提供了醫藥組成物，其含有至少一種(例如一種、兩種、三種、或四種)本文所述之抗TROP2/EGFR抗體(例如雙特異性抗體)、抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。醫藥組成物可以本技術領域已知之任何方法配製。
醫藥組成物係配製為相容於所預期之投予途徑(例如靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內)。組成物可包含：無菌稀釋劑(例如無菌水或鹽水)、不揮發油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、或其他合成溶劑；抗菌劑或抗真菌劑(諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)；抗氧化劑(諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸)；緩衝劑(諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽)；及等張劑(isotonic agent)(諸如糖(例如右旋糖)、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)；或鹽(例如氯化鈉)；或其任何組合。脂質體(liposomal)懸浮液亦可用作醫藥上可接受之載劑(參見例如美國專利第4,522,811號)。組成物的製劑(preparations)可配製並封裝於安瓿、拋棄式注射器、或多劑量小瓶中。當需要時(例如在可注射配方中)，可藉由例如使用塗層(諸如卵燐脂)或界面活性劑來維持適當的流動性。抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR ADC的吸收可藉由包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸酯鋁(aluminum monostearate)及明膠)來延長。替代地，可藉由植入物及微膠囊化遞送系統來實現控制釋放，其等可包括可生物降解、生物相容性聚合物(例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、原酸酯聚合體、及聚乳酸；Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc.)。
含有本文所述之抗TROP2/EGFR抗體、抗TROP2/EGFR抗原結合片段、抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物中之任一者之一或多種的組成物可配製為以劑量單位的形式(即含有預定量之活性化合物的物理性離散單位(physically discrete unit)，以便於投予及劑量均勻性)用於腸胃外(例如靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內)投予。
組成物的毒性及治療功效可藉由標準製藥程序在細胞培養或實驗動物(例如猴)中確定。可確定LD50(族群之50%的致死劑量)及ED50(族群之50%的治療有效劑量)：治療指數係LD50:ED50的比率。展現出高治療指數的藥劑係較佳者。當藥劑展現出非所欲之副作用時，應注意盡量減少潛在的損害(即減少不必要的副作用)。毒性及治療功效可藉由其他標準製藥程序來確定。
從細胞培養測定法及動物研究獲得的資料可用於配製任何給定藥劑的適當劑量，以用於對象(例如人類)。抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR ADC的治療有效量係治療對象(例如經辨識為患有癌症的人類對象)，或經辨識為處於發展疾病之風險的對象(例如先前已發展為癌症但現在已治癒的對象)之疾病(例如殺傷癌細胞)、降低對象(例如人類)之疾病的一或多種症狀的嚴重程度、頻率、及/或持續時間的量。本文所述之抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR ADC中之任一者的有效性及用劑可由醫療照護專業人員或獸醫專業人員使用本技術領域已知之方法，及藉由觀察對象(例如人類)之疾病的一或多種症狀來確定。某些因素可能影響有效治療對象所需之劑量及時間(例如疾病或病症的嚴重程度、先前的治療、對象的整體健康狀況及/或年齡、及其他疾病的存在)。
示例性劑量包括每千克對象體重之毫克或微克量的本文所述之抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR ADC中之任一者(例如約1µg/kg至約500 mg/kg；約100 µg/kg至約500 mg/kg；約100 µg/kg至約50 mg/kg；約10 µg/kg至約5 mg/kg；約10 µg/kg至約0.5 mg/kg；或約0.1 mg/kg至約0.5 mg/kg)。在一些實施例中，劑量位準係介於5至30 mg/kg之間、5至25 mg/kg之間、5至20 mg/kg之間、5至15 mg/kg之間、5至10 mg/kg之間、10至30 mg/kg之間、10至25 mg/kg之間、10至20 mg/kg之間、10至15 mg/kg之間、15至30 mg/kg之間、15至25 mg/kg之間、15至20 mg/kg之間、20至30 mg/kg之間、20至25 mg/kg之間，或25至30 mg/kg之間。在一些實施例中，劑量位準係約5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg、21 mg/kg、22 mg/kg、23 mg/kg、24 mg/kg、25 mg/kg、26 mg/kg、27 mg/kg、28 mg/kg、29 mg/kg、或30 mg/kg。在一些實施例中，本文所述之劑量位準不會對對象誘導嚴重的毒性作用。儘管此等劑量涵蓋寬廣的範圍，惟所屬技術領域中具有通常知識者將理解治療劑之效力各有變化，且有效量可藉由本技術領域已知之方法確定。一般而言，首先係投予相對低之劑量，且主治醫療照護專業人員或獸醫專業人員(在治療應用的情況下)或研究人員(當仍處於開發階段時)可隨後逐漸增加劑量，直至獲得適當的反應。此外，應當理解，任何特定對象的具體劑量位準將取決於多種因素，包括：所採用之具體化合物的活性，對象的年齡、體重、整體健康狀況、性別、及飲食，治療劑的投予時間、投予途徑、排泄速率、及體內半衰期。
醫藥組成物可與投予指示一起包括於容器、包裝、或分配器中。本發明亦提供製造用於如本文所述之各種用途之抗TROP2/EGFR抗體、其抗TROP2/EGFR抗原結合片段、或抗TROP2/EGFR ADC的方法。 實例
以下實例中進一步描述本發明，此等實例並不限制申請專利範圍中所述之本發明的範圍。 實例 1. 抗 TROP2/EGFR 雙特異性抗體之製備及分析
本文提供標靶TROP2及EGFR的雙特異性抗原結合分子。下文中，將此等抗原結合分子稱為抗TROP2/EGFR雙特異性抗體。 抗 TROP2/EGFR 雙特異性抗體之製備
抗TROP2/EGFR雙特異性抗體可具有抗TROP2抗原結合域(T-6F7，VH：SEQ ID NO: 25，VL：SEQ ID NO: 22)及抗EGFR抗原結合域(E-1G11，VH：SEQ ID NO: 23，VL：SEQ ID NO: 22；或E-6C4，VH：SEQ ID NO: 24，VL：SEQ ID NO: 22)。此等抗原結合域可配對以形成雙特異性抗體。構築了編碼抗TROP2/EGFR抗體之輕鏈及重鏈的載體。使用三種載體共轉導CHO-S細胞，包括編碼抗TROP2結合臂的重鏈之第一載體、編碼抗EGFR結合臂之重鏈的第二載體、及編碼共同輕鏈的第三載體。培養14天後，收集細胞上清液並藉由蛋白質A親和性層析法進行純化。
可使用多種方法來減少兩個重鏈之間錯誤配對的機會。例如，在抗TROP2臂重鏈及抗EGFR臂重鏈的Fc區中引入洞中癤突變。所得之示例性雙特異性抗體包括T-6F7-E-1G11及T-6F7-E-6C4。為了驗證雙特異性抗體的結合親和性，亦產生了抗TROP2或抗EGFR對照雙特異性抗體，其中對照雙特異性抗體的一個臂會識別TROP2或EGFR，而另一臂會識別CD28。使用相似的方法產生此等對照雙特異性抗體，例如藉由將RenLite™小鼠免疫化(immunizing)來獲得VH序列。示例性對照雙特異性抗體係命名為T-6F7-CD28、CD28-T-6F7、CD28-E-1G11、CD28-E-6C4、E-1G11-CD28、及E-6C4-CD28。
所有雙特異性抗體均引入了洞中癤突變。例如，在T-6F7-E-1G11中，T-6F7的重鏈恆定區包括癤突變，且E-1G11的重鏈恆定區包括洞突變。在T-6F7-CD28中，T-6F7的重鏈恆定區包括癤突變，且CD28的重鏈恆定區包括洞突變。示例性抗體結構如圖1所示，其中標靶1及標靶2可分別係TROP2及EGFR；分別係EGFR及TROP2；分別係TROP2及CD28；分別係CD28及TROP2；分別係EGFR及CD28；或分別係CD28及EGFR。
恆定區亦可包括一或多種突變。例如，當SI突變(EU編號：S239D及I332E突變)引入T-6F7的Fc區時，則所得之抗體係命名為T-6F7-SI。
輕鏈恆定區、具有癤突變之重鏈恆定區、及具有洞突變之重鏈恆定區的序列分別如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、及SEQ ID NO:28所示。 標靶 TROP2 及 / 或 EGFR 之抗體之內化作用 (internalization)
將抗TROP2抗體、抗EGFR抗體、抗TROP2/EGFR雙特異性抗體、或抗TROP2/CD28雙特異性抗體分別與pHAb-山羊抗人類IgG二級抗體一起加入至NCI-H292細胞(ATCC，目錄編號：CRL-1848)，並培養1小時。將細胞離心並使用FACS緩衝液洗滌。使用流式細胞儀測量平均螢光強度(mean fluorescence intensity, MFI)。計算抗體的胞吞率。使用人類IgG1蛋白質(hIgG1)作為同型對照(ISO)。結果如下表所示。 表 1.
抗體 NCI-H292
MFI 陽性族群
ISO 6400 0.76%
陰性對照 5999 0.88%
戈沙妥組單抗-SI類似物 86359 97.8%
西妥昔單抗類似物 17019 93.5%
T-6F7 35991 92.9%
E-1G11 13298 63.9%
E-6C4 12320 51.4%
T-6F7-CD28 6847 1.38%
E-6C4-CD28 9320 7.76%
E-1G11-CD28 9430 9.45%
T-6F7-E-6C4 41197 98.3%
T-6F7-E-1G11 27875 98.5%
西妥昔單抗(Cetuximab)係一種標靶EGFR的嵌合單株IgG1抗體，最初係由ImClone Systems開發，並作為單藥療法(monotherapy)於2003年由Merck KGaA於瑞士首次以Erbitux TM上市，且與伊立替康(irinotecan)組合用於治療伊立替康難治性轉移性結腸直腸癌。西妥昔單抗類似物的重鏈及輕鏈序列分別如SEQ ID NO: 29及SEQ ID NO: 30所示。
戈沙妥組單抗(Sacituzumab)-SI類似物係一種人源化抗TROP2單株IgG1抗體，其恆定區具有SI突變。戈沙妥組單抗-SI類似物的重鏈及輕鏈序列分別如SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32所示。
結果顯示，雙特異性抗體T-6F7-E-6C4及T-6F7-E-1G11相較於對應之單株抗體T-6F7、E-6C4、或E-1G11顯示出更高的胞吞率。此外，對照雙特異性抗體T-6F7-CD28、E-6C4-CD28、及E-1G11-CD28相較於對應之雙特異性抗體或單株抗體顯示出更低的胞吞率。 抗體之純度分析
藉由非還原性SDS-PAGE(十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)及SEC-HPLC(粒徑排阻層析法-高效液相層析法)對經純化的抗TROP2/EGFR雙特異性抗體進行分析。
使用4至12%丙烯醯胺凝膠進行非還原性SDS-PAGE。蛋白質樣本之製備如下。首先，將2.4µL蛋白質樣本與6µL Tris-Glycine SDS樣本緩衝液(2×)(Invitrogen，目錄編號：LC2676)及3.6µL蒸餾水混合。接著將混合物煮沸持續2分鐘，並在裝載前立即離心。將每個樣本4µg裝載至凝膠上。
在SEC-HPLC方法中，係使用PBS(pH 7.2至7.4，0.01M)將抗體樣本稀釋至1mg/mL，及使用Agilent 1290層析法系統(連接Xbridge™ Protein BEH SEC管柱(200Å, Waters Corporation))。使用以下參數：流動相：25mmol/L磷酸鹽緩衝液(PB) + 300mmol/L NaCl，pH 6.8；流動速率：1.8mL/min；管柱溫度：25℃；檢測波長：280nm；注射體積：10mL；樣本盤溫度：約4℃；執行時間：7分鐘。結果概述於下表中。 表 2. 非還原性 SDS-PAGE 及 SEC-HPLC 分析結果
樣本 理論分子量(KD) 檢測分子量(KD) SDS-PAGE 結果 經純化之蛋白質表現位準(µg/mL) SEC-HPLC 主峰(%)
T-6F7-SI ~150KD ~180KD 合格 481.27 98.11%
E-6C4 ~150KD ~180KD 合格 129.23 95.64%
E-1G11 ~150KD ~180KD 合格 349.62 100%
CD28-T-6F7 ~150KD ~180-245KD 合格 231.00 81.17%
CD28-E-6C4 ~150KD ~180KD 合格 230.54 74.52%
E-1G11-CD28 ~150KD ~180KD 合格 512.88 88.09%
T-6F7-E-6C4 ~150KD ~180KD 合格 156.15 97.49%
T-6F7-E-1G11 ~150KD ~180KD 合格 522.31 97.99%
抗 TROP2/EGFR 雙特異性抗體之結合親和性
使用Biacore™ (Biacore, Inc., Piscataway NJ)藉由表面電漿子共振(SPR)驗證抗TROP2/EGFR雙特異性抗體與人類TROP2、人類EGFR、猴TROP2、及猴EGFR的結合親和性。8K生物感測器配備有預先固定的蛋白質A感測器晶片。
具體而言，使用1× HBS-EP+緩衝液(pH 7.4)將hTROP2-His (ACROBiosystems Inc.，目錄編號：TR2-H5223)、hEGFR-His (ACROBiosystems Inc.，目錄編號：EGR-H5222)、fasTROP2-His (ACROBiosystems Inc.，目錄編號：TR2-R52H3)、及fasEGFR-His (ACROBiosystems Inc.，目錄編號：EGR-C52H1)稀釋至200 nM。將經純化之抗體以10mL/min持續約50秒注射至Biacore™ 8K生物感測器，以達到所需之蛋白質密度[例如約350反應單位(response unit, Ru)]，接著以30 mL/min持續180秒注射濃度200 nM的稀釋抗原蛋白質。監視解離持續400秒。在每次滴定的最後一次注射後，使用甘胺酸溶液(pH 1.5)以30 mL/min持續30秒將晶片再生。
使用Biacore™ 8K Evaluation Software 3.0將資料整體擬合至1:1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model) (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110)，從而同時獲得動力學結合速率(kon)及解離速率(koff)。親和性係推導自動力學速率常數的商(KD = koff/kon)。
如所屬技術領域中具有通常知識者所理解，對每種受試抗體進行相同的方法，並對參數(例如抗體濃度)適當調整。受試抗體的結果概述於下表中。 表 3. 親和性測試結果
分析物 1 溶液 kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) 結果
T-6F7-E-6C4 hTROP2-His 1.08E+05 3.43E-04 3.18E-09 陽性
fasTROP2-His 1.12E+05 8.49E-04 7.62E-09 陽性
hEGFR-His 4.85E+05 4.13E-02 8.52E-08 陽性
fasEGFR-His 1.19E+05 6.95E-03 5.86E-08 陽性
T-6F7-E-1G11 hTROP2-His 1.09E+05 5.69E-04 5.24E-09 陽性
fasTROP2-His 9.49E+04 1.18E-03 1.24E-08 陽性
hEGFR-His 3.64E+04 1.50E-03 4.11E-08 陽性
fasEGFR-His 3.62E+04 1.42E-03 3.93E-08 陽性
結果顯示，抗TROP2/EGFR雙特異性抗體T-6F7-E-6C4及T-6F7-E-1G11與人類TROP2、猴TROP2、人類EGFR、及猴EGFR皆具有良好的結合親和性。 抗 TROP2/EGFR 雙特異性抗體之穩定性
使用緩衝液(3 mg/mL組胺酸、80 mg/mL蔗糖、及0.2 mg/mL Tween™ 80)在pH 6.0將抗TROP2/EGFR雙特異性抗體T-6F7-E-6C4及T-6F7-E-1G11稀釋至5 mg/mL。將經稀釋之抗體置於密封的埃彭道夫管(Eppendorf tube)中4±3℃ (以下簡稱4℃)保存7天，或40±3℃ (以下簡稱40℃)保存7天，並評估其等之熱穩定性。替代地，亦在低pH條件下培養雙特異性抗體。具體而言，將抗體在pH 3.5之1 mol/L乙酸中培養0小時或6小時，以確定其在酸性條件下的穩定性。
經過上述處理後，進行以下測試：(1)觀察溶液外觀及是否有可見的不溶物；(2)以粒徑排阻超高效液相層析法(SEC-UPLC)檢測抗體之純度的變化(以主峰面積佔所有峰面積之總和的百分比表示(純度，%)；(3)使用疏水性交互作用層析法(Hydrophobic Interaction Chromatography)-高效液相層析法(HIC-HPLC)檢測抗體之表觀疏水性的變化(以主峰的滯留時間(HIC, min)表示)；(4)在非還原性條件下，藉由毛細管電泳-十二基硫酸鈉(CE-SDS)法(CE-SDS(NR))檢測抗體之純度的變化(以主峰面積佔所有峰面積之總和的百分比表示(純度，%)；(5)藉由毛細管等電聚焦(Capillary Isoelectric Focusing, Cief)法檢測抗體中的電荷變異體(以主要組分、酸性組分、鹼性組分的百分比表示)。
在SEC-UPLC實驗中，係使用純化水將抗體樣本稀釋至1mg/mL，及使用Agilent 1290層析法系統(連接Xbridge™ Protein BEH SEC管柱(200Å, Waters Corporation))。使用以下參數：流動相：100mmol/L磷酸鹽緩衝液(「PB」) (pH 7.4) + 0.2 mol/L NaCl + 10%乙腈；流動速率：1.8 mL/min；管柱溫度：25℃；檢測波長：280 nm；注射體積：10 mL；樣本盤溫度：約6℃；執行時間：7分鐘。
在HIC-HPLC實驗中，係使用Agilent 1260層析法系統[連接ProPac™ HIC-10管柱(4.6 × 250 mm, Thermo Scientific)]，且使用流動相A將樣本稀釋至0.5 mg/mL。使用以下參數：流動相A：1.0 M PB，10%乙腈，pH 6.5；流動相B：0.1M PB，10%乙腈，pH 6.5；流動速率：0.8mL/min；梯度：0min 100% A、2 min 100% A、32 min 100% B、34 min 100% B、35 min 100% A、及45 min 100% A；管柱溫度：30℃；檢測波長：280 nm；注射體積：10 mL；樣本盤溫度：約6℃；執行時間：45分鐘。
在Cief實驗中，使用Maurice Cief Method Development Kit (Protein Simple，目錄編號：PS-MDK01-C)進行樣本製備。具體而言，將40 µg蛋白質樣本與套組中的以下試劑混合：1 mL Maurice Cief Pi Marker-4.05、1 mL Maurice Cief Pi Marker-9.99、35 mL 1%甲基纖維素溶液、2 mL Maurice Cief 500mM精胺酸、4 mL兩性電解質(Pharmalyte pH範圍3至10)、及水(加入使最終體積係100mL)。在Maurice分析儀(Protein Simple, Santa Clara, CA)上，使用Maurice Cief盒(Maurice Cief Cartridges)(PS-MC02-C)產生成像毛細管等電聚焦光譜。樣本經聚焦持續總共10分鐘。使用儀器上安裝的分析軟體對280 nm下經聚焦蛋白質的吸光度進行積分。
在CE-SDS(NR)實驗中，使用Maurice (Protein simple, Maurice TM)及Maurice CE-SDS Size Application Kit(Protein simple，目錄編號：PS-MAK02-S)。將54 mL樣本緩衝液、6 mL抗體樣本、2.4 mL 25×內標準品、3 mL 250nM碘乙醯胺(SIGMA，目錄編號：16125)加入微量離心管(microcentrifuge tube)中，隨後以3000 rpm離心持續1分鐘，並在70℃水浴中加熱持續10分鐘。接著將樣本冷卻至室溫，隨後以10000 rpm離心持續3分鐘。接著將上清液樣本製劑轉移至96孔盤(96-well plate)並在Maurice中進行測試。使用以下參數：注射電壓：4.6 kV；注射時間：20秒；分離電壓：5.75 kV；及分離時間：40分鐘。
抗TROP2/EGFR雙特異性抗體的詳細結果如下表所示。結果顯示，T-6F7-E-6C4及T-6F7-E-1G11相較於其他受試抗體具有更佳之穩定性及物理化學性質。 表 4.
抗體 處理 SEC 純度(%) HIC (min) CE-SDS (NR) Cief
純度(%) HL (%) HH (%) HHL (%) 未知 (%) 酸性峰(%) 主峰(%) 鹼性峰(%)
T-6F7-E-6C4 0天 95.25 12.65 94.3 — — 1 4.7 25.5 63.8 10
4℃， 7天 97.76 12.63 94.0 — — 1.1 4.8 25.5 65.4 9.1
40℃， 7天 97.63 12.66 96.7 — — 1.4 1.9 32.0 58.8 9.0
Ph3.5， 0小時 100 12.66 94.9 — — 5.1 — 22.8 69.0 3.1
Ph3.5， 6小時 100 12.73 100 — — — — 40.3 51.8 6.5
T-6F7-E-1G11 0天 97.63 11.10 92.2 2.0 0.7 0.9 4.3 26 69.4 4.6
4℃， 7天 97.45 11.07 92.4 1.8 0.7 0.9 4.2 24.4 70.9 4.7
40℃， 7天 97.36 11.04 91.4 1.8 0.6 1.2 5.0 28.1 65.5 5.7
Ph3.5， 0小時 100 11.08 96.1 2.0 0.8 — 1.2 23 63.6 12.5
Ph3.5， 6小時 100 10.85 97.2 2.1 0.7 — — 26.9 59.1 12.5
實例 2. 抗體藥物接合物
在蛋白質A純化後，將雙特異性抗體T-6F7-E-6C4及T-6F7-E-1G11透析並藉由超過濾(ultrafiltration)在PBS緩衝液中濃縮。藉由UV吸收確定濃度。此等抗體用於後續的抗體藥物耦合反應。 抗體與藥物分子之耦合
經純化之抗體經由馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧羰基(VC)連結子與MMAE(單甲基澳瑞他汀E)或MMAF(單甲基澳瑞他汀F)耦合。
就抗體-藥物接合物的名稱而言，當抗體係與MMAE耦合時，則直接在抗體名稱後面增加「ADC」。例如，若具有IgG1恆定區的T-6F7-E-6C4與MMAE耦合，則將其命名為T-6F7-E-6C4-ADC。相似地，若具有IgG1恆定區的西妥昔單抗類似物與MMAE耦合，則將其命名為西妥昔單抗類似物-ADC。若具有IgG1恆定區之MRG003的抗體部分類似物與MMAE耦合，則將其命名為MRG003-ADC。若恆定區含有SI突變，則在名稱中增加「SI」，從而得到諸如戈沙妥組單抗-SI類似物-ADC、DS-1062-SI類似物(DXd)、及DS-1062-SI類似物(MMAE)之名稱。
使用HIC-HPLC檢測抗體與藥物分子的耦合。在HIC-HPLC實驗中，係使用Agilent 1260層析法系統(連接ProPac™ HIC-10管柱(4.6 × 250 mm, Thermo Scientific))，且使用流動相A將樣本稀釋至0.5 mg/mL。使用以下參數：流動相A：0.9 M硫酸銨，0.1M磷酸鹽緩衝液(PB)，10%乙腈，pH 6.5；流動相B：0.1 M PB，10%乙腈，pH 6.5；流動速率：0.8mL/min；梯度：0 min 100% A、2min 100% A、32 min 100% B、34 min 100% B、35 min 100% A、及45 min 100% A；管柱溫度：30℃；檢測波長：280 nm；注射體積：10 mL；樣本盤溫度：約6℃；執行時間：45分鐘。
將人類IgG1與MMAE耦合形成同型ADC (ISO-ADC)作為同型對照。HIC-HPLC檢測結果顯示ADC的藥物對抗體比(DAR)係約4。 體外殺傷活性
使用不同濃度之經純化之抗體(10 µg/mL、3.333 µg/mL、1.111 µg/mL、0.370 µg/mL、0.123 µg/mL、0.041 µg/mL、0.014 µg/mL、及0.005 µg/mL)及對應之ADC處理在細胞培養盤中培養的人類上皮樣癌細胞株A431 (ATCC，目錄編號：CRL-1555)、人類乳癌細胞株MCF-7、人類肺癌細胞株NCI-H226或NCI-H292 (5 × 10 3個)，並在IncuCyte (Sartorius AG, IncuCyte ®S3)中培養3天後，檢測殺傷活性。結果如下表所示。
DS-1062 (達博妥單抗德魯替康(Datopotamab deruxtecan))係一種標靶TROP2的抗體藥物接合物，其含有藥物德魯替康(DXd)。在DS-1062恆定區引入SI突變(EU編號：S239D及I332E突變)，得到DS-1062-SI類似物(DXd)。本發明人進一步使用MMAE替代藥物DXd，得到DS-1062-SI類似物(MMAE)。DS-1062-SI類似物(DXd或MMAE)的重鏈及輕鏈序列分別如SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 34所示。 表 5.
ADC IC50 (µg/mL)
A431 MCF-7 NCI-H292 NCI-H226
ISO-ADC 1.7630 不適用 4.0820 不適用
DS-1062-SI類似物(DXd) 0.7576 不適用 — 不適用
T-6F7-E-1G11-ADC 0.0369 0.3117 0.0974 1.2820
T-6F7-E-6C4-ADC 0.0022 1.0060 0.0728 0.3130
(「不適用」表示無體外殺傷活性；「—」表示未測試)
上述結果顯示，T-6F7-E-1G11-ADC及T-6F7-E-6C4-ADC具有良好的體外殺傷活性。
在另一實驗中，使用不同濃度的抗體或ADC (10 µg/mL、3.333 µg/mL、1.111 µg/mL、0.370 µg/mL、0.123 µg/mL、0.041 µg/mL、0.014 µg/mL、0.004 µg/mL、及0.0015 µg/mL)處理在細胞培養盤中培養的胰臟癌Pan.02.03細胞(TROP2 +EGFR +)、人類胰臟腺癌BxPC-3細胞(TROP2 +EGFR +)、人類肺癌NCI-H292細胞(TROP2 +EGFR +)，並在培養72小時後，使用PrestoBlue™ Cell Viability Reagent檢測殺傷活性。結果如下表所示。
戈沙妥組單抗戈維替康(Sacituzumab govitecan，購自Immunomedics, Inc)係一種人源化抗TROP2單株抗體-藥物接合物。 表 6.
群組 ADC IC50 (µg/mL)
Panc 02.03 BxPC-3 NCI-H292
G1 ISO-ADC 7.9810 3.4390 3.2020
G2 戈沙妥組單抗戈維替康 0.2689 5.3110 0.1910
G3 T-6F7-SI-ADC 0.0290 0.0332 0.0458
G4 E-6C4-ADC 0.0139 0.0484 0.0552
G5 T-6F7-E-6C4-ADC 0.0182 0.0205 0.0368
(「不適用」表示無體外殺傷活性；「—」表示未測試)
結果顯示，T-6F7-E-6C4-ADC (G5)對數種細胞株顯示出與其親代TROP2或EGFR ADC (G3、G4)相當的腫瘤殺傷功效。
在另一實驗中，將0.1 µg/mL T-6F7-E-6C4-ADC加入至以下3組細胞中：第1組：BxPC-3細胞+ NCI-H520細胞；第2組：BxPC-3細胞；及第3組：NCI-H520細胞(TROP2 -EGFR -)，以測試腫瘤殺傷功效。在對照組中則不加入T-6F7-E-6C4-ADC。在37℃、5% CO 2中共培養72小時後，使用死亡及存活染料(eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™780, eBioscience，目錄編號：65-0865-14)對細胞團塊(cell pellet)染色，以進行流式細胞術分析。結果如 圖 9A所示，其中顯示T-6F7-E-6C4-ADC對TROP2-EGFR雙陽性BxPC-3細胞展現出強烈的腫瘤殺傷活性，但對TROP2-EGFR雙陰性NCI-H520細胞則未展現出腫瘤殺傷活性。然而，在第1組中，當BxPC-3細胞及NCI-H520細胞共培養時( 圖 9A 至圖 9B)，T-6F7-E-6C4-ADC對NCI-H520細胞展現出強烈的腫瘤殺傷活性，表明T-6F7-E-6C4-ADC表現出明顯的體外旁觀者殺傷效應(bystander killing effect)。 實例 3. A431 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在上皮樣癌模型中測試了抗體或ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約5×10 6個A431細胞皮下注射至B-NDG小鼠(百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司，目錄編號：B-CM-002)中。當小鼠之腫瘤體積達到約300 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著向小鼠注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、ADC、或抗體。詳細如下表所示。
測量腫瘤之長軸及短軸的長度，且腫瘤的體積係計算為0.5 × (長軸) × (短軸) 2。使用以下公式計算腫瘤生長抑制(TGI)：TGI (%) = [1 - (Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100%。Ti係治療組在第i天的平均腫瘤體積。T0係治療組在第0天的平均腫瘤體積。Vi係對照組在第i天的平均腫瘤體積。V0係對照組在第0天的平均腫瘤體積。進行T測試以進行統計分析。TGI高於60%表明腫瘤生長受到明顯抑制。P ＜ 0.05係表明顯著差異的閾值。 表 7.
群組 小鼠數量 抗體/ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 5 ISO-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 5 戈沙妥組單抗-SI類似物-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G4 5 西妥昔單抗類似物-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G5 5 T-6F7-E-1G11-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G6 5 T-6F7-E-6C4-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G7 5 DS-1062-SI類似物(DXd) 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G8 5 T-6F7-E-1G11 10mg/kg i.p. 每週二次 4
G9 5 T-6F7-E-6C4 10mg/kg i.p. 每週二次 4
每週亦測量小鼠的體重兩次。分組當天(第0天)，各組的平均體重範圍係20.7 g至22.1 g。實驗結束時(第21天)，各組的平均體重範圍係20.4 g至22.9 g。因此，各組的平均體重變化範圍係98.5%至107.9%。結果顯示，小鼠對於受試抗體耐受性良好，且無明顯毒性。
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組14天後(第14天)、及實驗結束時(第21天)的腫瘤體積；小鼠的存活率；TGI (%)；及治療組與對照組之間體重及腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 8.
群組 腫瘤體積(mm 3) 存活 TGI (%) P 值
第0 天 第14 天 第21 天 體重 腫瘤體積
G1 298±9 1398±187 2169±244 5/5 不適用 不適用 不適用
G2 299±11 1402±217 2139±340 5/5 1.6 0.633 0.944
G3 299±15 931±225 1665±444 5/5 27.0 1.000 0.349
G4 299±22 922±96 1775±270 5/5 21.1 0.562 0.311
G5 299±17 394±100 715±240 5/5 77.8 0.308 0.003
G6 299±19 262±22 299±60 5/5 100 0.698 7.3E-05
G7 299±8 1057±162 1795±352 5/5 20.0 0.694 0.407
G8 298±25 626±87 933±174 5/5 66.1 0.191 0.003
G9 299±32 541±59 721±85 5/5 77.5 0.359 0.001
經抗體、ADC、或PBS治療之不同群組小鼠的腫瘤體積如 圖 2所示。相較於使用PBS或ISO-ADC治療的對照組(G1至G2)，治療組(G3至G9)顯示出更佳的腫瘤抑制效應。
此外，相較於戈沙妥組單抗-SI類似物-ADC、西妥昔單抗類似物-ADC或DS-1062-SI類似物(DXd)，抗TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC(G5至G6)及抗TROP2/EGFR雙特異性抗體(G8至G9)顯示出更佳的腫瘤抑制效應。 實例 4. Panc 02.03 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在胰臟腺癌異種移植模型中測試了ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約2×10 6個胰臟腺癌上皮Panc 02.03(ATCC，目錄編號：CRL-2553)細胞皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約200mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS或ADC。投予頻率係每週一次(共投予1次)。詳細如下表所示。 表 9.
群組 小鼠數量 ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 1
G2 5 ISO-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G3 5 DS-1062-SI類似物(MMAE) 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G4 5 西妥昔單抗類似物-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G5 5 T-6F7-E-1G11-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G6 5 T-6F7-E-1G11-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G7 5 T-6F7-E-6C4-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G8 5 T-6F7-E-6C4-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
在實驗期間，各群組小鼠之體重差異甚小。
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組23天後(第23天)、及實驗結束時(第40天)的腫瘤體積；小鼠的存活率；TGI (%)；及治療組與對照組之間體重及腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 10.
群組 腫瘤體積(mm 3) 存活 TGI (%) P 值
第0 天 第23 天 第40 天 體重 腫瘤體積
G1 192±7 1209±67 2747±202 5/5 不適用 不適用 不適用
G2 192±12 569±40 1664±165 5/5 42.4 0.600 0.003
G3 192±8 396±60 1339±208 5/5 55.1 0.827 0.001
G4 192±11 247±13 832±33 5/5 75.0 0.983 1.4E-05
G5 192±8 674±120 2058±298 5/5 27.0 0.683 0.092
G6 192±12 194±15 574±69 5/5 85.1 0.494 3.7E-05
G7 192±11 623±72 1809±313 5/5 36.7 0.328 0.036
G8 192±11 225±15 643±45 5/5 82.3 0.736 7.4E-06
使用ADC治療之群組中的腫瘤大小如 圖 3所示。治療組顯示出不同的腫瘤抑制效應。整體而言，相較於對照[ISO-ADC、西妥昔單抗類似物-ADC、及DS-1062-SI類似物(MMAE)]，抗TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC (T-6F7-E-1G11-ADC及T-6F7-E-6C4-ADC)在10 mg/kg之劑量下顯示出更佳的抗腫瘤活性。抗TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC (T-6F7-E-1G11-ADC及T-6F7-E-6C4-ADC)顯示出劑量依存性(dose-dependent)之抗腫瘤活性。 實例 5. 胰臟腺癌 PDX 模型中之抗腫瘤活性
在胰臟腺癌異種移植模型中測試了ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將來自胰臟腺癌患者的腫瘤片段皮下接種至B-NDG小鼠體內。當小鼠之腫瘤體積達到約250至300 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS或ADC。詳細如下表所示。 表 11.
群組 小鼠數量 ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 5 ISO-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 5 西妥昔單抗類似物-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G4 5 戈沙妥組單抗戈維替康 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G5 5 T-6F7-E-1G11-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G6 5 T-6F7-E-6C4-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G7 5 T-6F7-SI-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
在實驗期間，各群組小鼠之體重幾乎無差異。
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組31天後(第31天)、及實驗結束時(第41天)的腫瘤體積；小鼠的存活率；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 12.
群組 腫瘤體積(mm 3) 存活 TGI (%) P 值
第0 天 第31 天 第41 天
G1 252±14 2272±231 2555±262 3/6 不適用 不適用
G2 252±17 1529±145 2375±265 6/6 7.8 0.685
G3 252±18 192±17 697±61 6/6 80.7 2.8E-05
G4 252±16 2084±302 2214±464 3/6 14.8 0.557
G5 253±17 173±80 422±72 6/6 92.7 1.5E-05
G6 253±15 78±27 268±83 6/6 99.3 1.2E-05
G7 252±15 290±57 675±92 6/6 81.7 5.7E-05
所有治療組(G3至G7)的腫瘤體積均小於對照組(G1及G2)。治療組具有不同的腫瘤抑制效應。TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC在3 mg/kg(G5至G6)之劑量位準下，顯示出持續而有效的腫瘤抑制效應。T-6F7-E-6C4-ADC (G6)具有最高的TGI (99.3%)。所有受試TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC (G5至G6)的TGI值均高於對照(西妥昔單抗類似物-ADC或戈沙妥組單抗戈維替康)。 實例 6. 患者衍生之肺癌異種移植模型中之抗腫瘤活性
在肺癌異種移植模型中測試了ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將來自肺癌患者的腫瘤片段皮下接種至B-NDG小鼠體內。當小鼠之腫瘤體積達到約250至300 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS、ADC、或抗體。投予頻率係每週一次(共投予2次)。詳細如下表所示。 表 13.
群組 小鼠數量 ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 5 ISO-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 5 戈沙妥組單抗戈維替康 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G4 5 西妥昔單抗類似物-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
G5 5 T-6F7-E-6C4-ADC 3mg/kg i.v. 每週一次 2
在實驗期間，各群組小鼠之體重幾乎無差異。
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組13天後(第13天)、及實驗結束時(第20天)的腫瘤體積；小鼠的存活率；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 14.
群組 腫瘤體積(mm 3) 存活 TGI (%) P 值
第0 天 第13 天 第20 天 體重 腫瘤體積
G1 301±17 1146±95 1624±222 4/5 不適用 不適用 不適用
G2 301±23 750±117 1542±111 5/5 6.2 0.694 0.737
G3 301±24 857±131 1553±262 5/5 5.4 0.223 0.848
G4 301±23 898±173 1380±190 5/5 18.4 0.808 0.430
G5 301±25 400±42 801±83 5/5 62.2 0.372 0.007
治療組具有不同的腫瘤抑制效應。TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC在3mg/kg (G5)之劑量位準下的TGI值高於陽性對照ISO-ADC、西妥昔單抗類似物-ADC、及戈沙妥組單抗戈維替康。 實例 7. NCI-H292 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在肺癌異種移植模型中測試了抗體或ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約5 × 10 6個NCI-H292細胞皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約200mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS、抗體、或ADC。詳細如下表所示。
西妥昔單抗係一種標靶EGFR之嵌合單株IgG1抗體(購自Merck)。 表 15.
群組 小鼠數量 抗體/ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 6 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 6 ISO-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 6 西妥昔單抗 10 mg/kg i.v. 每週二次 4
G4 6 MRG003-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G5 6 T-6F7-E-6C4-ADC 1 mg/kg i.v. 每週一次 2
G6 6 T-6F7-E-6C4-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G7 6 T-6F7-E-6C4-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G8 6 T-6F7-SI-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G9 6 E-6C4-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
MRG003係一種抗體-藥物接合物，由標靶EGFR的全人源(fully human) IgG1單株抗體接合至單甲基澳瑞他汀E (MMAE)所組成，用於治療固態腫瘤，其目前於上海美雅珂處於早期臨床開發階段。MRG003抗體的重鏈及輕鏈序列分別如SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36所示。
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組18天後(第18天)、及實驗結束時(第35天)的腫瘤體積；小鼠的存活率；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 16.
群組 腫瘤體積(mm 3) 存活 第35 天 無腫瘤 TGI (%) P 值 ( 腫瘤體積)
第0 天 第18 天 第35 天
G1 199±7 1105±15 1930±183 3/6 0 不適用 不適用
G2 199±11 720±162 1680±383 5/6 0 14.4 0.653
G3 199±10 26±11 352±79 6/6 1 91.1 3.07E-05
G4 199±9 0 208±40 6/6 0 99.5 3.82E-06
G5 199±10 495±39 1115±93 4/6 0 47.1 0.008
G6 199±11 156±27 575±53 6/6 0 78.3 3.01E-05
G7 199±9 0 0 6/6 6 111.5 8.52E-07
G8 198±9 344±17 842±82 6/6 0 62.8 3.56E-04
G9 199±7 277±19 844±50 6/6 0 62.7 1.11E-04
使用抗體或ADC治療之群組中的腫瘤大小如 圖 10所示。相較於對照(西妥昔單抗及MRG003-ADC)，抗TROP2/EGFR雙特異性抗體ADC T-6F7-E-6C4-ADC (G5至G7)在10 mg/kg之劑量位準下顯示出更佳的抗腫瘤活性，且在3 mg/kg之劑量位準下獲得相較於對應親代ADC (T-6F7-SI-ADC及E-6C4-ADC)更佳的腫瘤抑制效應。此外，T-6F7-E-6C4-ADC顯示出劑量依存性抗腫瘤活性。具體而言，T-6F7-E-6C4-ADC (G7)在所有6隻小鼠中均顯示出持續的抗腫瘤活性，此等小鼠在分組後第35天均無腫瘤。 實例 8. NUGC-4 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在胃癌異種移植模型中測試了抗體或ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約5 × 10 6個NUGC-4細胞皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約200 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS、抗體、或ADC。詳細如下表所示。 表 17.
群組 小鼠數量 抗體/ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 6 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 6 ISO-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 6 戈沙妥組單抗戈維替康 10 mg/kg i.v. 每週二次 4
G4 6 西妥昔單抗 10 mg/kg i.v. 每週二次 4
G5 6 MRG003-ADC 1 mg/kg i.v. 每週一次 2
G6 6 MRG003-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G7 6 T-6F7-E-6C4-ADC 1 mg/kg i.v. 每週一次 2
G8 6 T-6F7-E-6C4-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G9 6 T-6F7-E-6C4-ADC 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組13天後(第13天)、及實驗結束時(第27天)的腫瘤體積；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 18.
群組 腫瘤體積(mm 3) TGI (%) P 值 ( 腫瘤體積)
第0 天 第13 天 第27 天
G1 193±12 868±57 1985±183 不適用 不適用
G2 193±14 575±65 1737±149 13.9 0.316
G3 192±19 521±57 1566±143 23.4 0.101
G4 193±12 807±70 2323±250 -18.8 0.301
G5 194±17 844±143 2122±264 -7.6 0.679
G6 193±10 338±54 1328±139 36.7 0.017
G7 193±18 610±68 1482±163 28.1 0.067
G8 193±14 171±48 680±169 72.9 3.77E-04
G9 193±11 27±6 11±3 110.2 7.79E-07
使用抗體或ADC治療之群組中的腫瘤大小如 圖 11所示。相較於對照西妥昔單抗(G4)、戈沙妥組單抗戈維替康(G3)、及MRG003-ADC (G5、G6)，ADC T-6F7-E-6C4-ADC(G7、G8、G9)顯示出更佳的抗腫瘤活性。此外，T-6F7-E-6C4-ADC顯示出劑量依存性抗腫瘤活性。 實例 9. 藥物動力學特性及血漿穩定性
在B-hFcRn小鼠(百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司，目錄編號：110001)中確定抗EGFR/TROP2雙特異性抗體ADC的藥物動力學清除率。具體而言，將小鼠分為四組(每組6隻小鼠)，並藉由靜脈注射投予ISO-ADC (G1，3 mg/kg；G2，10 mg/kg)或T-6F7-E-6C4-ADC (G3，3 mg/kg；G4，10 mg/kg)。在投予前及投予之15分鐘、1天、3天、7天、10天、14天、及21天後收集血液樣本。
藉由夾心式(sandwich) ELISA確定血清中總抗體及ADC的位準。簡而言之，將山羊抗人類IgG (H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc.，目錄編號：109-005-088)或抗MMAE mIgG (ACRO Biosystems Inc.，目錄編號：MME-M5252)稀釋至最終濃度2000 ng/mL、以100 µL/孔加入至96孔盤(ELISA盤)中、並接著於2至8℃培養過夜。培養後，使用PBS-T緩衝液(補充有Tween™ 20的PBS)將盤洗滌4次。未結合抗體的區域使用2% BSA (牛血清白蛋白)於37℃阻隔2小時。隨後，使用PBS-T緩衝液將盤洗滌4次。洗滌後，每個孔加入100 µL阻隔緩衝液(blocking buffer)(2% BSA)。將孔密封並於37℃培養1小時。使用洗盤機將盤洗滌後，將過氧化酶AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗人類IgG(Fcγ片段特異性)(Jackson ImmunoResearch Inc.，目錄編號：109-036-098)以100 µL/孔加入至盤的每個孔，37℃培育1小時，以確定血清中總抗體的濃度。替代地，加入G-h-IgG κ L-HRP (Abcam，目錄編號：ab202549)，以確定血清中ADC的濃度。將盤洗滌，將四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine, TMB)溶液以100 µL/孔加入至96孔盤中作為受質。於室溫避光培養後，每個孔加入100 µL終止溶液(stop solution)(Beyotime，目錄編號：P0215)。在450 nm及630 nm下測量盤的發光訊息，以計算濃度。使用藉由每個測試產物所製備之校正樣本的吸光度值及對應濃度來產生具有四個參數(即T 1/2、C max、AUC 0-21 天、及CL)的標準曲線。標準曲線用於計算每個血清樣本的總抗體或ADC濃度。使用經計算之每個時間點的樣本濃度來產生藥物濃度-時間曲線。使用Phoenix™ WinNolin 8.3來計算藥物動力學參數。
結果如下表及 圖 12A 至 12B所示，其中顯示T-6F7-E-6C4-ADC展現出與同型對照相似的半衰期。 表 19.
群組 ADC 劑量(mg/kg) LBA T 1/2( 天) C max(µg/mL) AUC 0-21 天 ( 天*µg/mL) CL (mL/ 天/kg)
G1 ISO-ADC 3 ADC 5.069 70.435 128.429 22.86
抗體 11.365 71.15 253.356 9.333
G2 ISO-ADC 10 ADC 5.088 218.129 444.176 22.089
抗體 10.335 221.353 812.886 10.042
G3 T-6F7-E-6C4-ADC 3 ADC 5.053 69.081 139.525 21.051
抗體 13.318 67.243 246.488 9.182
G4 T-6F7-E-6C4-ADC 10 ADC 4.818 252.129 461.152 21.28
抗體 10.581 230.834 821.148 10.032
T 1/2：終末半衰期(Terminal Half Life)； C max：最大濃度； AUC 0-21 天：0至21天血液濃度-時間曲線下面積 CL：清除率
在另一實驗中，確定了T-6F7-E-6C4-ADC在人類血漿、猴(食蟹獼猴)血漿、及大鼠(SD大鼠)血漿中的血漿穩定性。具體而言，將T-6F7-E-6C4-ADC分別加入至人類、食蟹獼猴、及SD大鼠的血漿中，直至100µg/mL之終末濃度。在對照組中，使用具有0.5% BSA的PBS替代血漿。在加入T-6F7-E-6C4-ADC的0天、1天、2天、6天、8天、11天、14天後確定游離MMAE及ADC的含量，並記算游離MMAE及ADC的比率。結果如 圖 13所示。
結果顯示，14天後，在人類血漿、猴血漿、及大鼠血漿中，游離MMAE佔總MMAE的百分比均小於2%，表明T-6F7-E-6C4-ADC在人類、猴、及大鼠血漿中相對穩定。 實例 10. 抗體藥物接合物 抗體與藥物分子之耦合
經純化之抗體經由CPT-L連接子與CPT-1、CPT-2、CPT-3、或CPT-4耦合。就抗體-藥物接合物的名稱而言，CPTx (x = 1、2、3、或4)係直接增加於抗體名稱之後。例如，當T-6F7-E-6C4耦合至CPT-1時，則將其命名為T-6F7-E-6C4-CPT1。或例如，當T-6F7-E-6C4耦合至CPT-2時，則將其命名為T-6F7-E-6C4-CPT2。藉由此方法獲得的示例性ADC包括：T-6F7-E-6C4-CPT1及T-6F7-E-6C4-CPT2。
使用質譜測定法(Mass Spectrometry, MS)檢測抗體與藥物分子的耦合。將人類IgG1分子耦合至CPT-2形成同型CPT2 (ISO-CPT2)作為同型對照。MS檢測結果顯示ADC的藥物對抗體比(DAR)係約4或8。就ADC名稱而言，若T-6F7-E-6C4-CPT2的DAR係約4，則將ADC命名為T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)。若T-6F7-E-6C4-CPT2的DAR係約8，則將ADC命名為T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)。 體外殺傷活性
使用不同濃度之經純化之抗體或ADC處理在細胞培養盤中培養的HCC827細胞、NCI-H292細胞、A431細胞、或Panc 02.03細胞，並在培養7天後，使用CellCounting-Lite 2.0 Kit Luminescent Cell Viability Assay (Vazyme Biotech Co.,Ltd.，目錄編號：DD1101-02)檢測殺傷活性。結果如下表所示。 表 20.
ADC IC50 (nM)
HCC827 NCI-H292 A431 Panc 02.03
T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8) 0.0598 0.6129 0.5048 14.12
CPT2 1.6890 0.7275 1.3750 0.9806
戈沙妥組單抗戈維替康 0.3963 — — 0.6639
西妥昔單抗 5.1250 — — 不適用
(「不適用」表示無體外殺傷活性；「—」表示未測試)
上述結果顯示，T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)對於HCC827細胞、NCI-H292細胞、A431細胞、及Panc 02.03細胞具有良好的體外殺傷活性。 抗 TROP2/EGFR 雙特異性抗體及 ADC 之內化作用
使用抗TROP2/EGFR雙特異性抗體及ADC(如下表所示)處理在細胞培養盤中培養的A431細胞或NCI-H292細胞，並使用IncuCyte (Sartorius AG, IncuCyte ®S3)在培養後24小時期間監視內化作用活性，每小時擷取一次影像。結果如 圖 14A 至圖 14B所示，其顯示T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4)、T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)、及T-6F7-E-6C4的胞吞活性相較於戈沙妥組單抗戈維替康及西妥昔單抗更佳。 表 21.
群組 抗體 /ADC
G1 T-6F7-E-6C4
G2 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4)
G3 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)
G4 ISO-CPT2(DAR8)
G5 戈沙妥組單抗戈維替康
G6 西妥昔單抗
抗 TROP2/EGFR 雙特異性抗體及 ADC 的結合活性
本實驗係進行以測試抗TROP2/EGFR雙特異性抗體及ADC與腫瘤細胞株的結合活性。
具體而言，將A431細胞或人類肺癌HCC827細胞(ATCC，目錄編號：CRL-2868)分別以2 × 10 5個細胞/孔的密度轉移至96孔盤。將經連續稀釋之抗TROP2/EGFR雙特異性抗體或ADC(最高濃度：130nM，以2倍連續稀釋共9個梯度)加入至96孔盤中，並於4℃培養25至30分鐘。接著，在流式細胞術分析前，將細胞與Alexa Fluor ®647接合之AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗人類IgG(Fcγ片段特異性)二級抗體(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.，目錄編號：109-606-170)於4℃避光培養25至30分鐘。結果如下表所示，表明T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4)、T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)、及T-6F7-E-6C4可以高親和性結合至A431細胞及HCC827細胞。 表 22.
抗體 /ADC EC50 (nM)
A431 HCC827
T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 1.914 1.582
T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 2.074 1.493
T-6F7-E-6C4 2.504 1.987
實例 11. 患者衍生之乳癌異種移植模型中之抗腫瘤活性
將乳癌患者衍生之腫瘤組織片段(2mm × 2mm × 2mm)接種至B-NDG小鼠的右側腹。對患者衍生之乳房腫瘤片段進行免疫螢光染色，並經由HALO 3.2版分析影像。結果顯示，腫瘤片段中EGFR陽性細胞及TROP2陽性細胞分別係96.92%及49.87%。當小鼠之腫瘤體積達到約200至300mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由i.v.投予向小鼠注射PBS或ADC。用劑時程、途徑、及頻率的細節如下表所示。 表 23.
群組 小鼠數量 ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 1
G2 5 T-6F7-E-6C4-ADC 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G3 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G4 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
G5 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G6 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G7 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
G8 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 10mg/kg i.v. 每週一次 1
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組17天後(第17天)、及分組35天後(第35天)的腫瘤體積；TGI (%)；第35天之無腫瘤小鼠的比率；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 24.
群組 腫瘤體積(mm 3) 無腫瘤 ( 第35 天) TGI (%) ( 第35 天) P 值 ( 第35 天)
第0 天 第17 天 第35 天
G1 205±20 899±132 1684±345 0/5 不適用 不適用
G2 204±31 144±41 629±226 0/5 71.2 0.036
G3 205±29 152±54 450±193 0/5 83.4 0.014
G4 205±26 122±24 370±88 0/5 88.8 0.003
G5 205±33 43±9 126±45 0/5 105.3 0.001
G6 205±28 111±36 332±152 0/5 91.4 0.006
G7 204±30 29±6 37±15 2/5 111.3 0.001
G8 203±33 56±25 48±17 1/5 110.4 0.001
使用PBS或ADC治療之群組中的腫瘤大小如 圖 15所示。結果顯示，具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2均展現出良好的腫瘤抑制效應，且呈現劑量依存性。此外，具有DAR4之T-6F7-E-6C4-CPT2在3mg/kg的劑量下，展現出相較於T-6F7-E-6C4-ADC更佳的腫瘤抑制效應。 實例 12. 患者衍生之胰臟癌異種移植模型中之抗腫瘤活性
將胰臟癌患者衍生之腫瘤組織片段(2mm × 2mm × 2mm)接種至B-NDG小鼠的右側腹。免疫螢光染色結果顯示，胰臟腫瘤片段中EGFR陽性細胞及TROP2陽性細胞分別係71.08%及89.09%。當小鼠之腫瘤體積達到約200至300 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由i.v.投予向小鼠注射PBS或ADC。詳細如下表所示。 表 25.
群組 小鼠數量 ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 1
G2 5 ISO-CPT2(DAR4) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
G3 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 1 mg/kg i.v. 每週一次 1
G4 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G5 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
G6 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 1 mg/kg i.v. 每週一次 1
G7 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G8 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組14天後(第14天)、及分組32天後(第32天)的腫瘤體積；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 26.
群組 腫瘤體積(mm 3) TGI (%)( 第32 天) P 值 ( 第32 天)
第0 天 第14 天 第32 天
G1 233±14 730±84 1676±310 不適用 不適用
G2 233±19 454±41 1315±163 25.0 0.294
G3 233±14 606±109 1545±146 9.1 0.721
G4 233±22 281±67 1066±292 42.3 0.225
G5 233±23 181±22 807±137 60.3 0.024
G6 233±30 531±71 1592±235 5.9 0.833
G7 233±19 226±42 1111±128 39.2 0.093
G8 233±27 67±26 378±142 89.9 0.005
結果顯示，具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2均展現出腫瘤抑制效應，且呈現劑量依存性。 實例 13. SKOV-3 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在卵巢腺癌異種移植模型中測試了ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約5 × 10 6個SKOV-3細胞(ATCC，目錄編號：HTB-77)皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約300 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS或ADC。詳細如下表所示。 表 27.
群組 小鼠數量 ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 6 mg/kg i.v. 每週一次 2
G4 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G5 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G6 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 6 mg/kg i.v. 每週一次 2
G7 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組17天後(第17天)、及分組35天後(第35天)的腫瘤體積；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 28.
群組 腫瘤體積(mm 3) TGI (%) ( 第35 天) P 值 ( 第35 天)
第0 天 第17 天 第35 天
G1 263±17 1112±79 2813±243 不適用 不適用
G2 263±11 652±59 1410±208 55.0 0.002
G3 263±13 523±38 919±92 74.3 8.494E-05
G4 263±12 372±21 686±93 83.4 3.747E-05
G5 263±9 528±18 858±95 76.7 6.959E-05
G6 264±13 421±49 749±34 81.0 3.033E-05
G7 263±10 219±24 247±25 100.6 5.877E-06
使用PBS或ADC治療之群組中的腫瘤大小如 圖 16所示。結果顯示，具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2均在卵巢腺癌模型中展現出腫瘤抑制效應，且呈現劑量依存性，且T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)展現出相較於T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4)更佳的腫瘤抑制效應。 實例 14. A431 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在上皮樣癌異種移植模型中測試了ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約1 × 10 6個A431細胞皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約200mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS、抗體、或ADC。詳細如下表所示。 表 29.
群組 小鼠數量 抗體/ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 2
G2 5 ISO-CPT2(DAR4) 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G3 5 ISO-CPT2(DAR8) 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G4 5 戈沙妥組單抗戈維替康 10 mg/kg i.v. 每週二次 4
G5 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G6 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 6 mg/kg i.v. 每週一次 2
G7 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
G8 5 西妥昔單抗 10 mg/kg i.v. 每週二次 4
G9 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 3 mg/kg i.v. 每週一次 2
G10 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 6 mg/kg i.v. 每週一次 2
G11 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 10 mg/kg i.v. 每週一次 2
每週測量兩次體重。在實驗期間，所有群組之小鼠的體重均有所增加，且群組間之體重無顯著差異，表明小鼠對於受試ADC耐受性良好，且無明顯毒性。
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組17天後(第17天)、及分組31天後(第31天)的腫瘤體積；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 30.
群組 腫瘤體積(mm 3) TGI (%)( 第31 天) P 值 ( 第31 天)
第0 天 第17 天 第31 天
G1 197±10 1204±66 2079±191 不適用 不適用
G2 197±11 946±123 1684±258 21.0 0.253
G3 196±3 634±69 1439±168 34.0 0.036
G4 197±6 682±71 1554±144 27.9 0.059
G5 197±4 601±54 1446±175 33.6 0.040
G6 197±7 209±23 657±79 75.5 1.247E-04
G7 196±5 135±13 189±29 100.4 9.814E-06
G8 197±10 373±23 806±59 67.6 2.145E-04
G9 196±4 282±31 1166±139 48.5 0.005
G10 197±4 155±17 277±35 95.7 1.451E-05
G11 197±5 103±6 67±7 106.9 5.681E-06
使用PBS、抗體、或ADC治療之群組中的腫瘤大小如 圖 17所示。結果顯示，具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2均相較於戈沙妥組單抗戈維替康或西妥昔單抗展現出更佳的腫瘤抑制效應，且呈現劑量依存性。實驗進一步持續至分組49天後(第49天)，而6 mg/kg或10 mg/kg之具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2仍然顯示出腫瘤抑制效應。 實例 15. NCI-H292 異種移植模型中之抗腫瘤活性
在肺癌異種移植模型中測試了抗體或ADC對體內腫瘤生長的效應。具體而言，將約5 × 10 6個NCI-H292細胞皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約300 mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組。接著藉由靜脈內(i.v.)投予向小鼠注射PBS、抗體、或ADC。詳細如下表所示。 表 31.
群組 小鼠數量 抗體/ADC 劑量 途徑 頻率 總投予次數
G1 5 PBS - i.v. 每週一次 1
G2 5 ISO-CPT2(DAR4) 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G3 5 ISO-CPT2(DAR8) 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G4 5 戈沙妥組單抗戈維替康 10 mg/kg i.v. 每週二次 2
G5 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G6 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
G7 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4) 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
G8 5 西妥昔單抗 10 mg/kg i.v. 每週二次 2
G9 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 3 mg/kg i.v. 每週一次 1
G10 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 6 mg/kg i.v. 每週一次 1
G11 5 T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) 10 mg/kg i.v. 每週一次 1
下表概述本實驗之結果，包括分組當天(第0天)、分組21天後(第21天)、及實驗結束時(第39天)的腫瘤體積；小鼠的存活率；TGI (%)；及治療組與對照組之間腫瘤體積的統計差異(P值)。 表 32.
群組 腫瘤體積(mm 3) TGI (%)( 第39 天) P 值( 第39 天)
第0 天 第21 天 第39 天
G1 297±7 1227±99 2172±243 不適用 不適用
G2 297±6 880±68 1723±237 23.9 0.222
G3 297±7 361±38 1051±93 59.8 0.003
G4 297±11 428±51 893±62 68.2 0.001
G5 297±9 692±109 1231±83 50.2 0.006
G6 297±9 177±34 812±54 72.5 0.001
G7 297±7 24±4 351±52 97.1 8.164E-05
G8 297±11 592±24 1390±99 41.7 0.018
G9 297±10 499±40 1051±34 59.8 0.002
G10 297±8 52±3 417±61 93.6 1.126E-04
G11 297±8 22±6 254±25 102.3 2.242E-04
結果顯示，具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2在肺癌模型中均展現出良好的腫瘤抑制效應，且呈現劑量依存性。此外，具有DAR4及DAR8之T-6F7-E-6C4-CPT2在10mg/kg的劑量位準下，均展現出良好的腫瘤抑制效應，其TGI高於戈沙妥組單抗戈維替康或西妥昔單抗。 實例 16. 患者衍生之異種移植模型中之抗腫瘤活性
在頭頸鱗狀細胞癌模型、食道癌模型、結腸直腸癌模型、或胃癌模型中測試了T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)對腫瘤生長的效應。具體而言，將患者衍生之腫瘤組織片段(2mm × 2mm × 2mm)接種至BALB/c裸鼠(nude mice)。當小鼠之腫瘤體積達到約100至200mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組(每組3隻小鼠)。接著，向小鼠注射鹽水(G1，對照)或6mg/kg T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) (G2)(共注射1次)。
對不同患者衍生之腫瘤組織進行免疫組織化學(immunohistochemistry IHC)染色，且下表顯示患者衍生之腫瘤組織中EGFR或TROP2表現位準的組織化學得分(H得分)。下 表 33亦概述不同患者衍生之異種移植模型的TGI (%)。 表 33.
PDX 模型 H 得分 分組後天數 TGI (%)
EGFR TROP2
食道癌PDX 217.11 205.27 第21天 113.59
頭頸鱗狀細胞癌PDX / / 第27天 117.34
結腸直腸癌PDX1 173.83 212.69 第25天 94.41
結腸直腸癌PDX2 231.38 39.98 第21天 45.74
胃癌PDX1 109.65 34.06 第27天 111.93
胃癌PDX2 248.67 278.37 第27天 131.44
使用鹽水或T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)治療之群組中的腫瘤大小如 圖 18A 至 18F所示，其中顯示T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)在頭頸鱗狀細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、及胃癌中展現出良好的腫瘤生長抑制效應。 實例 17. 藥物動力學特性及血漿穩定性
在B-NDG小鼠中確定了抗EGFR/TROP2雙特異性ADC的藥物動力學清除率。具體而言，將約1 × 10 6個A431細胞皮下注射至B-NDG小鼠中。當小鼠之腫瘤體積達到約300mm 3時，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為不同群組(每組3隻小鼠)，接著藉由靜脈注射投予PBS (G2)、T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4)(G3至G10，10mg/kg)、或T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)(G11至G18，10mg/kg)(共投予1次)。使用G1群組作為空白對照。分別於投予之15分鐘、2小時、6小時、1天、3天、5天、7天、14天後收集G3至G10、G11至G18群組中小鼠的血液樣本及腫瘤組織樣本。於投予之1小時前收集G1群組中小鼠的血液樣本及腫瘤組織樣本，並於投予之14天後收集G2群組中小鼠的血液樣本及腫瘤組織樣本。使用此等經收集之樣本，藉由夾心式ELISA檢測血清及腫瘤組織中的總抗體位準，及藉由MS(質譜測定法)檢測游離有效負載。
藉由夾心式ELISA確定總抗體的位準。簡而言之，將山羊抗人類IgG (H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc.，目錄編號：109-005-088)稀釋至最終濃度2000 ng/mL、以100 µL/孔加入至96孔盤(ELISA盤)中、並接著於2至8℃培養過夜。培養後，使用PBS-T緩衝液(補充有Tween™ 20的PBS)將盤洗滌4次。未結合抗體的區域使用2% BSA (牛血清白蛋白)於37℃阻隔2小時。隨後，使用PBS-T緩衝液將盤洗滌4次。洗滌後，每個孔加入100 µL阻隔緩衝液(blocking buffer)(2% BSA)。將孔密封並於37℃培養1小時。使用洗盤機將盤洗滌後，將過氧化酶AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗人類IgG (Fcγ片段特異性)(Jackson ImmunoResearch Inc.，目錄編號：109-036-098)以100 µL/孔加入至盤的每個孔，37℃培育1小時，以確定總抗體及有效負載CPT2的濃度。將盤洗滌，將四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine, TMB)溶液以100 µL/孔加入至96孔盤中作為受質。於室溫避光培養後，每個孔加入100 µL終止溶液(stop solution)(Beyotime，目錄編號：P0215)。在450 nm及630 nm下測量盤的發光訊息，以計算濃度。使用藉由每個測試產物所製備之校正樣本的吸光度值及對應濃度來產生具有四個參數(即T 1/2、C max、AUC 0-21 天、及CL)的標準曲線。標準曲線用於計算每個血清樣本的抗體或ADC濃度。使用經計算之每個時間點的樣本濃度來產生藥物濃度-時間曲線。使用Phoenix™ WinNolin 8.3來計算藥物動力學參數。
結果如下表及 圖 19A 至 19D所示，其中顯示T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR4)及T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)展現出預期的PK行為。 表 34.
ADC 劑量(mg/kg) LBA C max(ng/mL) AUC 0- 最後 ( 小時*ng/mL) CL (mL/ 小時/kg)
T-6F7- E-6C4-CPT2 (DAR4) 10 血清CPT2 0.25 21.33 2839.57
血清抗體 1206.14 42589.25 0
腫瘤組織CPT2 3.96 357.1 237.47
腫瘤組織抗體 22267.93 2136100.75 4.66
T-6F7- E-6C4-CPT2 (DAR8) 10 血清CPT2 0.54 33.18 不適用
血清抗體 181302.67 7350021.62 1.36
腫瘤組織CPT2 7.68 522.32 366.82
腫瘤組織抗體 25055.33 2168750.96 4.56
C max：最大濃度； AUC 0- 最後：時間零點(Time Zero)至最後可量化濃度曲線下面積 CL：清除率
在另一實驗中，確定了T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)及T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)在人類血漿、猴(食蟹獼猴)血漿、及大鼠(SD大鼠)血漿中的血漿穩定性。具體而言，將T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)或T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)分別加入至人類、猴、或大鼠血漿中，直至100µg/mL之終末濃度。在對照組中，使用具有0.5% BSA的PBS替代血漿。在加入ADC的0天、1天、2天、6天、8天、11天、14天後確定游離有效負載CPT2及ADC的含量，並記算游離CPT2對總ADC的比。結果如 圖 20A 至 20B所示，其中表明T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)及T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)在人類、猴、及大鼠血漿中相對穩定，其中游離CPT2的釋放率最高不超過2.0%。 實例 18. 毒物學評估
在初步實驗中，為了研究安全性及毒物動力學(toxicokinetics, TK)特性，藉由三次靜脈注射向食蟹獼猴(cynomolgus monkeys)投予T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)，每次間隔3週(第1天、第22天、及第43天)。劑量配方如下表所示。接著，在第50天犧牲動物，以進行大體及組織病理學檢查。評估死亡率/瀕死率(moribundity)、一般觀察、體重、食物消耗、臨床病理學(血液學、血液凝固、血清化學、及尿液分析)、及大體損傷(gross lesions)。亦收集血液樣本以進行TK分析，並計算主要的TK參數，例如有效負載、總抗體、及ADC的Tmax、Cmax、及AUC (0-t)。結果發現，T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8)具有良好的安全特性。 表 35.
ADC 群組 劑量 (mg/kg)
第 1 天 第 22 天 第 43 天
T-6F7-E-6C4-CPT2(DAR8) G1 5 20 20
G2 10 10 10
G3 30 30 30
其他實施例
應理解，儘管本發明已結合其實施方式進行說明，惟上述說明旨在闡述本發明而非對其範圍加以限制，本發明之範圍係由所附申請專利範圍予以界定。其他態樣、優點、及修改皆屬所附申請專利範圍內。
無
圖1係雙特異性抗TROP2/EGFR抗體的示意圖，其具有使用共同輕鏈的洞中癤(knobs-into-holes)結構。
圖2顯示經注射A431細胞，並使用磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffer saline, PBS)、ADC、或抗體治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖3顯示經注射Panc 02.03細胞，並使用PBS或ADC治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖4列出抗TROP2/EGFR抗體中之抗EGFR抗原結合域(E-1G11及E-6C4)及抗TROP2抗原結合域(T-6F7)的重鏈可變區CDR序列，其係如Kabat編號所定義。
圖5列出抗TROP2/EGFR抗體中之抗EGFR抗原結合域(E-1G11及E-6C4)及抗TROP2抗原結合域(T-6F7)的重鏈可變區CDR序列，其係如Chothia編號所定義。
圖6列出共同輕鏈的CDR序列，其係如Kabat及Chothia編號所定義。
圖7列出本發明所探討之抗TROP2/EGFR抗體重鏈及輕鏈可變區序列。
圖8列出本發明所探討之其他胺基酸序列。
圖9A顯示T-6F7-E-6C4-ADC對於BxPC-3細胞+NCI-H520細胞、BxPC-3細胞、或NCI-H520細胞的殺傷功效。
圖9B顯示經共培養72小時後，T-6F7-E-6C4-ADC (0.1 µg/mL)對於BxPC-3細胞+NCI-H520細胞的殺傷功效。
圖10顯示經注射NCI-H292細胞，並使用PBS、抗體、或ADC治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖11顯示經注射NUGC-4細胞，並使用PBS、抗體、或ADC治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖12A及圖12B顯示向B-hFcRn小鼠投予ISO-ADC (圖12A)或T-6F7-E-6C4-ADC (圖12B)後，ADC及總抗體的血清濃度。
圖13顯示向人類、食蟹獼猴(Macaca fascicularis)、或史-道二氏大鼠(Sprague Dawley rat, SD rat)之血漿中加入T-6F7-E-6C4-ADC的0天、1天、2天、6天、8天、11天、及14天後，其等血漿中游離MMAE對ADC的比。
圖14A及圖14B顯示抗TROP2/EGFR雙特異性抗體及ADC在A431細胞(圖14A)或NCI-H292細胞(圖14B)中的胞吞(endocytosis)活性。使用ISO-CPT2 (DAR8)作為同型對照。使用戈沙妥組單抗戈維替康(sacituzumab govitecan)及西妥昔單抗(cetuximab)作為對照。
圖15顯示經注射患者衍生之乳房腫瘤片段，並使用PBS或ADC治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖16顯示經注射SKOV-3細胞，並使用PBS或ADC治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖17顯示經注射A431細胞，並使用PBS、抗體、或ADC治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。
圖18A顯示經注射頭頸鱗狀細胞癌患者衍生之腫瘤片段，並使用T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。使用鹽水作為對照。
圖18B顯示經注射食道癌患者衍生之腫瘤片段，並使用T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。使用鹽水作為對照。
圖18C及圖18D顯示經注射結腸直腸癌患者衍生之腫瘤片段，並使用T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。使用鹽水作為對照。
圖18E及圖18F顯示經注射胃癌患者衍生之腫瘤片段，並使用T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)治療之不同群組之B-NDG小鼠的平均腫瘤體積。使用鹽水作為對照。
圖19A及圖19B顯示向B-NDG小鼠投予T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)或T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)後，總抗體(圖19A)及CPT2 (圖19B)的血清濃度。
圖19C及圖19D顯示向B-NDG小鼠投予T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)或T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)後，總抗體(圖19C)及CPT2 (圖19D)的腫瘤組織濃度。
圖20A及圖20B顯示向人類、食蟹獼猴、或SD大鼠之血漿中加入T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR4)(圖20A)或T-6F7-E-6C4-CPT2 (DAR8)(圖20B)的0天、1天、2天、6天、8天、11天、及14天後，其等血漿中游離CPT2對總ADC的比。
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Claims (44)

  1. 一種抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其包含：第一抗原結合域，其特異性結合至EGFR；及第二抗原結合域，其特異性結合至TROP2。
  2. 如請求項1之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合域包含第一重鏈可變區(VH1)及第一輕鏈可變區(VL1)；且該第二抗原結合域包含第二重鏈可變區(VH2)及第二輕鏈可變區(VL2)。
  3. 如請求項2之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中 該第一重鏈可變區(VH1)包含互補決定區(complementarity determining region, CDR) 1、2、及3，其中該VH1 CDR1區包含與所選之VH1 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VH1 CDR2區包含與所選之VH1 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VH1 CDR3區包含與所選之VH1 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列；並且 該第一輕鏈可變區(VL1)包含CDR 1、2、及3，其中該VL1 CDR1區包含與所選之VL1 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VL1 CDR2區包含與所選之VL1 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VL1 CDR3區包含與所選之VL1 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列， 其中該所選之VH1 CDR 1、2、及3胺基酸序列，該所選之VL1 CDR 1、2、及3胺基酸序列係以下中之一者： (1)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 7至9，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (2)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 10至12，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (3)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 16至18，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及 (4)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 19至21，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
  4. 如請求項2或3之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中 該第二重鏈可變區(VH2)包含CDR 1、2、及3，其中該VH2 CDR1區包含與所選之VH2 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VH2 CDR2區包含與所選之VH2 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VH2 CDR3區包含與所選之VH2 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列；並且 該第二輕鏈可變區(VL2)包含CDR 1、2、及3，其中該VL2 CDR1區包含與所選之VL2 CDR1胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，該VL2 CDR2區包含與所選之VL2 CDR2胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列，且該VL2 CDR3區包含與所選之VL2 CDR3胺基酸序列具有至少80%相同性的胺基酸序列， 其中該所選之VH2 CDR 1、2、及3胺基酸序列，及該所選之VL2 CDR 1、2、及3胺基酸序列係以下中之一者： (1)該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及 (2)該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
  5. 如請求項2至4中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中 (1)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 7至9，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (2)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 7至9，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (3)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 16至18，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (4)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 16至18，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (5)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 10至12，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (6)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 10至12，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3； (7)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 19至21，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 4至6，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3；或 (8)該所選之VH1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 19至21，且該所選之VL1 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3，及該所選之VH2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 13至15，且該所選之VL2 CDR 1、2、3胺基酸序列分別記載於SEQ ID NO: 1至3。
  6. 如請求項2至5中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 23具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第一輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第二重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 25具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，且該第二輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列。
  7. 如請求項2至5中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第一輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，該第二重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 25具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列，且該第二輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同性的序列。
  8. 如請求項2至7中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含與所選之VH序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，且該VL1包含與所選之VL序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，其中該所選之VH序列及該所選之VL序列係以下中之一者： (1)    該所選之VH序列係SEQ ID NO: 23，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22；及 (2)    該所選之VH序列係SEQ ID NO: 24，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
  9. 如請求項2至8中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含與所選之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；且該VL1包含與所選之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中該所選之VH序列及該所選之VL序列係以下中之一者： (1)    該所選之VH序列係SEQ ID NO: 23，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22；及 (2)    該所選之VH序列係SEQ ID NO: 24，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
  10. 如請求項2至9中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH2包含與所選之VH序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，且該VL2包含與所選之VL序列具有至少90%相同性的胺基酸序列，其中該所選之VH序列係SEQ ID NO: 25，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
  11. 如請求項2至10中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH2包含與所選之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；且該VL2包含與所選之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中該所選之VH序列係SEQ ID NO: 25，且該所選之VL序列係SEQ ID NO: 22。
  12. 如請求項2至11中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含SEQ ID NO: 23的序列，且該VL1包含SEQ ID NO: 22的序列。
  13. 如請求項2至12中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含SEQ ID NO: 24的序列，且該VL1包含SEQ ID NO: 22的序列。
  14. 如請求項2至13中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該VH2包含SEQ ID NO: 25的序列，且該VL2包含SEQ ID NO: 22的序列。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合域特異性結合至人類或猴EGFR；及/或該第二抗原結合域特異性結合至人類或猴TROP2。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合域係人類的或人源化的；及/或該第二抗原結合域係人類的或人源化的。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。
  18. 如請求項1至17中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合域係單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFv)；及/或該第二抗原結合域係scFv。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其中該第一輕鏈可變區及該第二輕鏈可變區係相同的。
  20. 一種抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至19中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段交叉競爭(cross-compete)。
  21. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至20中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
  22. 一種載體，其包含如請求項21之核酸。
  23. 一種細胞，其包含如請求項22之載體。
  24. 如請求項23之細胞，其中該細胞係CHO細胞。
  25. 一種細胞，其包含如請求項21之核酸。
  26. 一種產生抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括： (a) 在足以使如請求項23至25中任一項之細胞產生抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的條件下培養該細胞；及 (b) 收集該細胞所產生的抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段。
  27. 一種抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物(antibody-drug conjugate, ADC)，其包含共價結合至如請求項1至20中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段的治療劑。
  28. 如請求項27之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物，其中該治療劑係細胞毒性劑(cytotoxic agent)或細胞生長抑制劑(cytostatic agent)。
  29. 如請求項27或28之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物，其中該治療劑係MMAE或MMAF。
  30. 如請求項27之抗體-藥物接合物，其中該治療劑選自： (CPT-1)、 (CPT-2)、 (CPT-3)、或 (CPT-4)。
  31. 如請求項27或30之抗體-藥物接合物，其中該治療劑係經由連結子(linker)連結至該抗體或其抗原結合片段，或抗原結合蛋白質構築體。
  32. 如請求項31之抗體-藥物接合物，其中該連結子具有以下結構： 。
  33. 如請求項27及30至32中任一項之抗體-藥物接合物，其中該抗體-藥物接合物具有以下結構： ，或 其中n = 1至8；其中「Ab」代表該抗體或其抗原結合片段，或抗原結合蛋白質構築體。
  34. 一種治療患有癌症之對象的方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之組成物，該組成物包含如請求項1至20中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，或如請求項27至33中任一項之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
  35. 如請求項34之方法，其中該對象患有表現EGFR及/或TROP2的癌症。
  36. 如請求項34或35之方法，其中該癌症係固態腫瘤、肺癌(lung cancer)[例如非小細胞肺癌、肺腺癌、或肺癌(lung carcinoma)]、胃癌(gastric cancer)[例如胃癌(gastric carcinoma)]、皮膚癌(skin cancer)[例如皮膚癌(skin carcinoma)]、結腸直腸癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胰臟癌、中樞神經系統(central nervous system, CNS)癌、肝癌、鼻咽癌、腦癌、結腸癌、膀胱癌、口腔鱗狀細胞癌、子宮頸癌、或食道癌。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其中該對象係人類。
  38. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該對象投予抗PD1抗體。
  39. 如請求項34至38中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該對象投予化學療法。
  40. 一種降低腫瘤生長速率的方法，該方法包含使腫瘤細胞與有效量之組成物接觸，該組成物包含如請求項1至20中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，或如請求項27至33中任一項之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
  41. 一種殺傷腫瘤細胞的方法，該方法包含使腫瘤細胞與有效量之組成物接觸，該組成物包含如請求項1至20中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，或如請求項27至33中任一項之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
  42. 一種醫藥組成物，其包含醫藥上可接受之載劑，及 (a)如請求項1至20中任一項之抗TROP2/EGFR抗體或其抗原結合片段，及/或 (b)如請求項27至33中任一項之抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物。
  43. 一種抗TROP2/EGFR抗體-藥物接合物(ADC)，其包含共價結合至雙特異性抗體或其抗原結合片段的治療劑，該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含：第一抗原結合域，其特異性結合至EGFR；及第二抗原結合域，其特異性結合至TROP2。
  44. 如請求項27至33及43中任一項之抗TROP2/EGFR ADC，其中藥物對抗體比(drug-to-antibody ratio, DAR)係約4或8。
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