KR20220089688A - 항-pd-1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 항-PD-1 (Programmed Cell Death Protein 1) 항체, 항원-결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항-PD-1 항체 및 이의 용도
본 개시는 항-PD-1(세포예정사 단백질 1(Programmed Cell Death Protein 1)) 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
항암 항체의 최근 임상 및 상업적 성공은 인간의 항체 기반 치료제에 큰 관심을 불러 일으켰다. PD-1을 표적으로 하는 인간 암 임상 시험은 우수한 성과를 거두어 차세대 암 치료제로 주목 받고 있다.
반려 동물의 수명이 길어지고 동물 병원에서의 진단이 개선됨에 따라 최근 가축(domestic animal)의 암 발병 건수도 급격히 증가하고 있다. 인간뿐만 아니라 가축에 대한 암 치료가 진행되고 있으며 이러한 가축에 대한 수술, 방사선 및 화학 요법이 점점 더 많이 수행되고 있다. 그러나 수의학용 항체 기반 치료제의 개발은 느리다. 수의학에서 차세대 암 치료에 대한 니즈가 있다.
본 개시는 항-PD-1 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 관점에서, 본 개시는 다음을 포함하는 PD-1(Programmed Cell Death Protein 1)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:
상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 여기서 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 VH와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함; 및
CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 여기서 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함,
여기서 상기 선택된 VH CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열 및 선택된 VL CDR, 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나를 포함함:
(1) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3으로 표시되고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 5, 6으로 표시되며;
(2) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 7, 8, 9로 표시되고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 10, 11, 12로 표시되며;
(3) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 13, 14, 15로 표시되고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 16, 17, 18로 표시됨.
일부 구체예에서, 상기 CDR은 Kabat 넘버링이다. 일부 구체예에서, 상기 CDR은 Chothia 넘버링이다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개의 PD-1에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca, 자이언트 판다) 또는 펠리스 카투스(Felis catus, 국내 고양이)의 PD-1에 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 개화 항체(caninized antibody) 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 고양이화 항체(felinized antibody) 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 관점에서, 본 개시는 다음을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 제공한다:
(1) 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VH는 서열번호 52, 53, 54 또는 60으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
(2) 각각 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VL은 서열번호 49, 50, 51 또는 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
(3) 각각 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VH는 서열번호 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
(4) 각각 서열번호 10, 11 및 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VL은 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
(5) 각각 서열번호 13, 14, 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VH는 서열번호 45, 46, 47, 48 또는 58로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
(6) 각각 서열번호 16, 17, 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VL은 서열번호 42, 43, 44 또는 57로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함.
일부 구체예에서, 상기 CDR은 Kabat 넘버링이다. 일부 구체예에서, 상기 CDR은 Chothia 넘버링이다.
일부 구체예에서, VL과 쌍을 이룰 때 상기 VH는 개의 PD-1에 특이적으로 결합하거나, VH와 쌍을 이룰 때 상기 VL은 개의 PD-1에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편은 개화 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편이고, 상기 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편은 개화 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편은 고양이화 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편이고, 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편은 고양이화 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편이다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca, 자이언트 판다) 또는 펠리스 카투스(Felis catus, 국내 고양이)의 PD-1에 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 핵산은 cDNA이다.
일 관점에서, 본 개시는 또한 본원에 기재된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 벡터 및/또는 본원에 기재된 핵산 중 2개를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 PD-1에 함께 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 코딩한다.
또 다른 관점에서, 본 개시는 각 벡터가 본원에 기재된 핵산 중 하나를 포함하는 벡터 쌍을 제공하고, 여기서 상기 벡터 쌍은 함께 PD-1에 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 코딩한다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 벡터 또는 본원에 기재된 벡터 쌍을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 본원에 기재된 핵산 중 하나 이상을 가지거나, 또는 본원에 기재된 핵산 중 2개를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 2개의 핵산은 함께 PD-1에 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 함께 코딩한다.
일 관점에서, 본 개시는 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은
(a) 세포가 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하기에 충분한 조건하에 본원에 기재된 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 세포에 의해 생산된 항체 또는 항원 결합 단편을 수집하는(collecting) 단계를 포함한다.
일 관점에서, 본 개시는 선택된 VH 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 선택된 VL 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 PD-1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 선택된 VH 서열 및 선택된 VL 서열은 다음 중 하나인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(1) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 49, 50, 51 또는 59이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 52, 53, 54, 또는 60임;
(2) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 42, 43, 44 또는 57이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 45, 46, 47, 48 또는 58임;
(3) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 55이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 56임.
일부 구체예에서, 상기 VH는 서열번호 49의 서열을 포함하고 상기 VL이 서열번호 53의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 VH는 서열번호 43의 서열을 포함하고 상기 VL은 서열번호 45의 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개의 PD-1에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca, 자이언트 판다) 또는 펠리스 카투스(Felis catus, 국내 고양이)의 PD-1에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고양이화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 관점에서, 본 개시는 치료제에 공유 결합된 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 치료제는 세포 독성 또는 세포 증식 억제제(cytotoxic or cytostatic agent)이다.
일 관점에서, 본 개시는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 기재된 항체-약물 접합체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 암은 절제불가능한(unresectable) 흑색종 또는 전이성 흑색종이다. 일부 구체예에서, 상기 암은 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 두경부 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck, SCCHN), 두경부암(head and neck cancer), 신 세포 암종(renal cell carcinoma, RCC), 흑색종(melanoma), 방광암(bladder cancer), 위암(gastric cancer), 요로 피암(urothelial cancer), 메르켈 세포 암종(Merkel-cell carcinoma), 삼중 음성 유방암(triple-negative breast cancer, TNBC) 또는 결장 직장 암종(colorectal carcinoma)이다.
일 관점에서 본 개시는 종양 성장 속도를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 종양 세포를 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 기재된 항체-약물 접합체를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 관점에서, 본 개시는 종양 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 종양 세포를 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 기재된 항체-약물 접합체를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 관점에서, 본 개시는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 관점에서, 본 개시는 본원에 기재된 항체 약물 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
적어도 일부 관점 또는 구체예에서, 상기 항체는 개 IgG 항체(예를 들어, 개 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체)이다. 적어도 일부 관점 또는 구체예에서, 상기 항체는 고양이 IgG 항체이다.
적어도 일부 관점 또는 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFV)이다.
본원에 사용된 용어 "암(cancer)"은 자율성장(autonomous growth) 능력을 갖는 세포를 의미한다. 이러한 세포의 예로는 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상 상태(state) 또는 컨디션을 갖는 세포가 포함된다. 이 용어는 암성 성장(cancerous growth), 예를 들어 종양; 조직병리학적 유형 또는 침습 단계에 관계없이, 발암성 과정, 전이성 조직 및 악성으로 변형된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 대부분의 결장암, 신세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포 암종 및 소장암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암종 뿐만 아니라 호흡기, 심혈관, 신장, 생식, 혈액학, 신경계, 간, 위장 및 내분비 시스템의 악성 종양도 포함된다. "자연적으로 발생하는" 암은 암세포를 대상체에 이식함으로써 실험적으로 유도되지 않은 모든 암을 포함하며, 예를 들어, 자발적으로 발생하는 암(spontaneously arising cancer), 환자가 발암 물질(들)에 노출되어 발생하는 암, 트랜스제닉 발암 유전자 삽입 또는 종양 억제 유전자의 넉아웃으로 인한 암, 및 감염(예컨대, 바이러스 감염)으로 인한 암을 포함한다. 용어 "암종(carcinoma)"은 당업계에서 인정되는 것으로 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 의미한다. 이 용어는 또한 암종 및 육종 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는 암 육종을 포함한다. "선암(adenocarcinoma)"은 선 조직(glandular tissue)에서 유래하거나 종양 세포가 인식 가능한 선 구조(glandular structure)를 형성하는 암종을 의미한다. 용어 "육종(sarcoma)"은 중간엽 유래의 악성 종양으로 당업계에서 인식되고 지칭된다. 용어 "조혈 신생물 장애(hematopoietic neoplastic disorder)"는 조혈 기원의 과형성/신생물 세포와 관련된 질병을 포함한다. 조혈 신생물 장애는 골수성, 림프성 또는 적혈구 계통, 또는 이의 전구세포에서 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체(antibody)"는 적어도 하나(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 상보성 결정 영역(CDR)(면역 글로불린 경쇄의 3개의 CDR 중 임의의 것 또는 면역 글로불린 중쇄의 3개의 CDR 중 임의의 것)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자를 의미하고, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체의 비제한적인 예는 예를 들어, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 다중 특이적 항체(예: 이중 특이적 항체), 단일 사슬 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 마우스 항체, 개 항체, 고양이 항체, 개화 항체 및 고양이화 항체 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 개 항체, 고양이 항체, 마우스 항체 또는 인간 항체의 Fc 영역을 함유할 수 있다. 상기 용어, 항체는 또한 유도체, 예컨대, 이중 특이적 항체, 단일 사슬 항체(single-chain antibody), 디아바디(diabody), 선형 항체(linear antibody) 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"은 전장 항체의 일부를 지칭하며, 상기 항체의 일부는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 항원-결합 단편은 적어도 하나의 가변 도메인(예컨대, 중쇄의 가변 도메인 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유한다. 항체 단편의 비제한적인 예는, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다.
본원의 단일 클론 항체는 구체적으로 "키메라(chimeric)" 항체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있는 반면 나머지 쇄(들)는 다른 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있는 항체(면역 글로불린) 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편을 지칭한다. 전형적으로, 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 예컨대 유전 공학에 의해 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 구축된 항체이다. 예를 들어, 마우스 단일 클론 항체의 유전자의 가변 세그먼트는 개 불변 세그먼트에 연결될 수 있다. 도 2는 마우스:개 IgG의 한 구체예의 일반적인 구조의 개략도를 보여준다. 이 구체예에서, 상기 항원 결합 부위는 마우스로부터 유래되는 반면 Fc 부분은 개이다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체(human antibody)"는 인간에 존재하는 내인성 핵산(예를 들어, 재배열된 인간 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자좌(locus))에 의해 코딩되는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "개 항체(canine antibody)"는 개 포유동물(예를 들어, 가축 개)에 존재하는 내인성 핵산(예를 들어, 재배열된 개 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자좌)에 의해 코딩되는 항체를 지칭한다. 항체는 다양한 품종의 개로부터 분리된 천연 항체를 대표하는 아미노산 서열로 구성된 자연 발생 또는 재조합으로 생산된 면역 글로불린일 수 있다. 개 항체는 개 생식선 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 일부 경우에, 개 항체는 개 생식선 면역 글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, "개 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열이 개 프레임워크 서열(framework sequences)에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "고양이 항체(feline antibody)"는 고양이 포유동물(예를 들어, 국내 고양이)에 존재하는 내인성 핵산(예를 들어, 재배열된 고양이 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자좌)에 의해 코딩되는 항체를 지칭한다. 항체는 다양한 품종의 고양이로부터 분리된 천연 항체를 나타내는 아미노산 서열로 구성된 자연 발생 또는 재조합 생산된 면역 글로불린일 수 있다. 고양이 항체는 고양이 생식선 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 본 개시 내용의 고양이 항체는 고양이 생식선 면역 글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, "고양이 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열이 고양이 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "개화된 항체(caninized antibody)"는 개가 아닌(예를 들어, 마우스, 인간) 면역 글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하고 개 면역 글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 비제한적인 예에서, 개화 항체는 수용자의 초가변 영역(hypervariable region) 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스와 같은 비-개(non-canine) 종(공여자 항체)의 초가변 영역 잔기로 대체된 개 면역 글로불린 서열(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 개 면역 글로불린 서열의 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-개 잔기로 대체된다. 또한, 일부 실시예에서, 개화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 만들어진다. 일부 실시예에서, 개화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-개 면역 글로불린 서열에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 개 면역 글로불린 서열이다. 개화 항체는 선택적으로 또한 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 완전한 또는 적어도 일부, 전형적으로 개 면역 글로불린 서열의 부분을 포함할 것이다. 도 2는 마우스 IgG의 종 분화 또는 개화(caninization)를 보여주는 일 실시예를 나타낸다. 일부 실시예에서, 마우스 CDRs은 개 프레임워크에 이식된다. 개화 항체는 당업계에 공지된 분자 생물학 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 항체의 개화를 위한 전략에는 US20160264656 및 US7261890B2에 개시된 전략이 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이는 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "고양이화된 항체(felinized antibody)"는 비-고양이(예를 들어, 마우스, 인간) 면역 글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하고 고양이 면역 글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 비제한적 예에서, 고양이화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스와 같은 비-고양이 종(공여자 항체)의 초가변 영역 잔기로 대체된 고양이 면역 글로불린 서열(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 고양이 면역 글로불린 서열의 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-고양이 잔기로 대체된다. 또한, 일부 실시예에서, 고양이화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 만들어진다. 일부 실시예에서, 고양이화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-고양이 면역 글로불린 서열에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 고양이 면역 글로불린 서열이다. 고양이화 항체는 선택적으로 또한 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 완전한 또는 적어도 일부, 전형적으로 고양이 면역 글로불린 서열의 부분을 포함할 것이다. 고양이화 항체는 당업계에 공지된 분자 생물학 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
본원에서 "모(parent)" 항체는 변이체 항체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 항체(예를 들어, 키메라 항체, 개화 항체 또는 고양이화 항체)이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 개 프레임워크 영역을 갖고, 존재하는 경우 개 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모 항체는 개화 또는 개 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 모 항체는 고양이화 또는 고양이 항체일 수 있다. 일부 다른 예에서, 모 항체는 쥐과(murine) 단일 클론 항체 또는 판다 항체이다.
용어 "개화(caninization)"는 개 포유동물에서 유용한 단백질 치료적 치료를 생성하기 위해 공여자 항체로부터 개 항체 수용체 프레임워크로 비-개 항원 결합 아미노산을 전달하는 방법으로 정의된다.
용어 "고양이화(felinization)"는 고양이 포유동물에서 유용한 단백질 치료적 치료를 생성하기 위해 공여자 항체로부터 고양이 항체 수용체 프레임워크로 비-고양이 항원 결합 아미노산을 전달하는 방법으로 정의된다.
일부 실시예에서, 항체는 하나의 종(예를 들어, 마우스, 인간, 개 또는 고양이)의 면역 글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유할 수 있고 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca)(자이언트 판다)의 면역 글로불린으로부터 유래된 서열을 함유할 수 있다. 비제한적 예에서, 수용자 항체의 초가변(예를 들어, CDR) 영역 잔기는 원하는 특이성, 친화력 및 용량을 갖는 비-판다 항체(예를 들어, 공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼 항체로부터의 것이다. 일부 실시예에서, 면역 글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca)(자이언트 판다)의 면역 글로불린으로부터 유래된 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시예에서, 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프(hypervariable loops, CDRs)는 비-판다(예를 들어, 마우스) 면역 글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 자이언트 판다의 면역 글로불린의 것들이다. 항체는 또한 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 자이언트 판다의 면역 글로불린의 부분을 함유할 수 있다.
일부 실시예에서, 항체는 포유동물로부터 수집되거나 세포 배양물(예를 들어, 하이브리도마 세포)에서 생산된다. 일부 실시예에서, 항체는 비-인간 세포(예를 들어, 마우스 또는 햄스터 세포주)에서 생산된다. 일부 실시예에서, 항체는 박테리아 또는 효모 세포에서 생산된다. 일부 실시예에서, 항체는 재배열되지 않거나 재배열된 면역 글로불린 유전자좌(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 면역 글로불린 유전자좌)를 함유하는 트랜스제닉 비-인간 동물(예를 들어, 소, 래트 또는 마우스)에서 생산된다.
본원에 사용된 용어 "단쇄 항체(single-chain antibody)"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 면역 글로불린 가변 도메인(예: 포유동물 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유하는 단일 폴리펩티드를 지칭한다. 단쇄 항체의 비제한적인 예가 본원에 설명되어 있다.
본원에 사용된 용어 "다량체 항체(multimeric antibody)"는 4개 이상(예를 들어, 6개, 8개 또는 10개)의 면역 글로불린 가변 도메인을 포함하는 항체를 의미한다. 일부 실시예에서, 다량체 항체는 하나의 표적 분자(예를 들어, PD-1)를 포유동물 세포(예를 들어, 개 T-세포, , 고양이 T-세포)의 표면상의 하나 이상의 제2 표적 분자(예를 들어, CTLA-4)에 가교할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체(subject)" 및 "환자(patient)"는 명세서 전체에 걸쳐 상호 교환적으로 사용되며 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 인간 또는 비인간을 설명한다. 수의 및 비-수의 적용이 본 발명에 의해 고려된다. 일부 실시예에서, 대상체는 포유동물(예를 들어, 비-인간 포유동물)이다. 대상체는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 흰 족제비, 고양이, 개, 자이언트 판다 및 영장류를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 비인간 영장류(예: 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류(예: 래트, 마우스, 저빌, 햄스터, 흰 족제비, 토끼), 토끼목 포유류(lagomorphs), 돼지(예: 돼지, 미니어처 피그(miniature pig)), 말, 개, 고양이, 소 및 기타 가축, 농장 및 동물원 동물이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체를 언급할 때 "특이적으로 결합하는(specifically binding)" 및 "특이적으로 결합한다(specifically binds)"라는 문구는 항체가 그의 표적 분자(예를 들어, PD-1)와 바람직하게는 다른 분자와 상호 작용한다는 것을 의미하는데, 이는 상호작용이 표적 분자 상의 특정 구조(즉, 항원 결정기(antigenic determinant) 또는 에피토프(epitope))의 존재에 의존하기 때문이다. 즉, 시약은 일반적으로 모든 분자가 아닌 특정 구조를 포함하는 분자를 인식하고 결합한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 표적-특이적 항체로 지칭될 수 있다. 예를 들어, PD-1 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 PD-1-특이적 항체 또는 항-PD-1 항체로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 2개 이상의 아미노산 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "핵산 분자(nucleic acid molecule)" 및 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 임의의 길이의 2개 이상의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 이에 제한되지 않고 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 그 변형을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기술되어 있다. 당업계에 공지된 다른 적절한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 항-dPD-1 항체를 제조하는 예시적인 프로토콜의 첫 번째 부분을 보여주는 흐름도이다.
도 1b는 항-dPD-1 항체를 제조하는 예시적인 프로토콜의 두 번째 부분을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 마우스 가변 영역 및 개 불변 영역을 갖는 마우스:개 키메라 IgG, 또는 개화 가변 영역 및 개 불변 영역을 갖는 개화 IgG의 일반적인 구조의 개략도이다.
도 3은 항-dPD-1 항체가 개 PD-1(dPD-1)과 개 PD-L1(dPD-L1) 사이의 결합을 차단한다는 것을 보여주는 일련의 유세포 분석 그래프이다.
도 4는 인간 PD-1(hPD-1), 마우스 PD-1(mPD-1) 및 마우스-개 키메라 PD-1 (chidPD-1)과 항-dPD-1 항체의 교차 반응을 분석한 유세포 분석 결과를 보여주는 그래프 세트이다. NC는 음성 대조군을 나타낸다.
도 5는 판다 PD-1(pPD-1)과 항-dPD-1 항체의 교차 반응을 분석한 유세포 분석 결과를 나타낸 그래프이다. NC는 음성 대조군을 나타낸다.
도 6은 항-dPD-1 항체와 고양이 PD-1(cPD-1)의 교차 반응을 분석한 유세포 분석 결과를 나타낸 그래프이다. NC는 음성 대조군을 나타낸다.
도 7은 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1B9-mHvKv-dlgG4의 상이한 농도에서 판다 PD-1에 대한 결합 활성을 나타내는 형광 강도의 평균을 나타낸다.
도 8은 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1B9-mHvKv-dlgG4의 상이한 농도에서 개 PD-1에 대한 결합 활성을 나타내는 형광 강도의 평균을 나타낸다.
도 9는 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1D8-mHvKv-dlgG4의 상이한 농도에서 고양이 PD-1에 대한 결합 활성을 나타내는 형광 강도의 평균을 보여준다.
도 10은 키메라 항-dPD-1 항체 1D8-mHvKv-dlgG4와 개 PD-1을 이용한 표면 혈장 공명(SPR) 결과를 나타낸 그래프이다
도 11은 키메라 및 개화 항-dPD-1 항체로 처리된 MC-38 종양 세포를 갖는 개화 PD-1 마우스(B-dPD-1)의 시간 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이다. PS는 생리 식염수를 의미한다.
도 12는 키메라 및 개화 항-dPD-1 항체로 처리된 MC-38 종양 세포를 갖는 개화 PD-1 마우스(B-dPD-1)의 시간에 따른 체중 변화 백분율을 보여주는 그래프이다. PS는 생리 식염수를 의미한다.
도 13은 여러 개화 항-dPD-1 항체로 처리된 MC-38 종양 세포를 갖는 개화 PD-1 마우스(B-dPD-1)에서 시간에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다. PS는 생리 식염수를 의미한다.
도 14는 여러 개화 항-dPD-1 항체로 처리된 MC-38 종양 세포를 갖는 개화 PD-1 마우스(B-dPD-1)에서 시간에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다. PS는 생리 식염수를 의미한다.
도 15는 여러 키메라 항-dPD-1 항체로 처리된 MC-38 종양 세포를 갖는 개화 PD-1 마우스(B-dPD-1)에서 시간에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다. PS는 생리 식염수를 의미한다.
도 16은 마우스 항-dPD-1 항체(13-1B9, 12-4A7, 12-1D8)의 CDR 서열 및 Kabat 넘버링에 의해 정의된 이의 관련된 항-dPD-1 항체의 CDR 서열을 나열한다.
도 17은 마우스 항-dPD-1 항체(13-1B9, 12-4A7, 12-1D8)의 CDR 서열 및 Chothia 넘버링에 의해 정의된 이의 관련된 항-dPD-1 항체의 CDR 서열을 나열한다.
도 18은 인간 PD-1(hPD-1), 개 PD-1(dPD-1), 마우스 PD-1(mPD-1), 원숭이 PD-1(rmPD-1), 키메라 PD-1(chidPD-1), 판다 PD-1(pPD-1), 고양이 PD-1(cPD-1)의 아미노산 서열을 나열한다. .
도 19는 1D8에 기초한 개화 항-dPD-1 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나열한다.
도 20은 1B9에 기초한 개화 항-dPD-1 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나열한다.
도 21은 마우스 항-dPD-1 항체 13-1B9, 12-4A7 및 12-1D8의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나열한다.
도 22는 개 항체 및 고양이 항체의 불변 영역의 아미노산 서열을 나열한다.
본 개시 내용은 PD-1(세포예정사 단백질 1(Programmed Cell Death Protein 1); 또한 CD279로 공지됨)에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편의 예를 제공한다.
PD-1 및 암
면역 체계는 신체의 정상 세포와 "외래(foreign)"로 간주되는 세포를 구분할 수 있으며, 이는 면역 체계가 정상 세포를 그대로 두고 외부 세포를 공격할 수 있도록 한다. 이 메커니즘은 때때로 면역 체크포인트(immune checkpoints)라고 하는 단백질을 포함한다. 면역 체크포인트는 신호(공동 자극 분자)를 높이거나 신호를 낮추는 면역 체계의 분자이다.
체크포인트 억제제는 면역 체계가 정상 조직을 공격하는 것을 방지하여 자가 면역 질환을 예방할 수 있다. 많은 종양 세포도 체크포인트 억제제를 발현한다. 이러한 종양 세포는 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에서 특정 면역 체크포인트 경로를 선택함으로써 면역 감시를 피한다(Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer." Cancer Control 21.1 (2014): 80-89). 많은 면역 체크포인트는 리간드-수용체 상호작용에 의해 시작되기 때문에 리간드 및/또는 수용체에 대한 항체에 의해 쉽게 차단될 수 있다.
PD-1(예정사-1(programmed death-1))은 면역 체크포인트이며 림프절의 항원 특이적 T 세포에서 아포토시스(programmed cell death(세포예정사))를 촉진하는 동시에 조절 T 세포((항-염증성, 억제성 T 세포)에서 아포토시스를 감소시키는 이중 메커니즘을 통해 자가 면역으로부터 보호한다.
PD-1은 주로 T 세포와 일차 B 세포의 표면에서 발현된다. PD-1의 두 리간드(PD-L1 및 PD-L2)는 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)에서 널리 발현된다. PD-1과 그 리간드의 상호 작용은 면역 반응의 부정적인 조절에 중요한 역할을 한다. PD-1과 그 리간드 사이의 결합을 억제하면 종양 세포가 면역계의 사멸 효과에 노출되어 종양 조직을 사멸시키고 암을 치료하는 효과를 달성할 수 있다.
PD-L1은 다양한 암의 신생물 세포(neoplastic cells)에서 발현된다. T 세포에서 PD-1에 결합하여 억제함으로써 PD-L1 발현은 종양 세포가 면역 공격을 회피할 수 있는 주요 메커니즘이다. PD-L1 과발현은 개념적으로 내재적 및 적응적 두 가지 메커니즘 때문일 수 있다. 암세포에서 PD-L1의 내재적 발현은 이러한 신생물 세포의 세포/유전적 이상과 관련이 있다. AKT 및 STAT 경로를 포함하는 세포 신호 전달의 활성화는 PD-L1 발현을 증가시킨다.
일차 종격동 B 세포 림프종에서 MHC 클래스 II 트랜스활성화제(transactivator)(CIITA)와 PD-L1 또는 PD-L2의 유전자 융합이 발생하여 이러한 단백질이 과발현된다. PD-L1 및 PD-L2가 위치한 염색체 9p23-24의 증폭은 고전적인 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma)에서 두 단백질의 증가된 발현을 유도한다. 적응 메커니즘은 종양 미세환경에서 PD-L1 발현의 유도와 관련이 있다. PD-L1은 인터페론 γ에 반응하여 신생물 세포에서 유도될 수 있다. 미세위성 불안정성(microsatellite instability) 결장암에서 PD-L1은 주로 종양의 골수 세포에서 발현되어 세포 독성 T 세포 기능을 억제한다.
항종양 면역을 강화하기 위한 PD-1 봉쇄의 사용은 PD-1 상호 작용을 방지하는 것이 T 세포 고갈을 역전시킨 만성 감염 모델의 관찰에서 비롯되었다. 유사하게, PD-1의 차단은 T-세포 PD-1/종양 세포 PD-L1 또는 T-세포 PD-1/종양 세포 PD-L2 상호 작용을 방지하여 T-세포 매개 항종양 면역을 회복시킨다.
PD-1에 대한 상세한 설명 및 암을 치료하기 위한 항-PD-1 항체의 사용은 예를 들어 Topalian et al. "Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer." New England Journal of Medicine 366.26 (2012): 2443-2454; Hirano, Fumiya, et al. "Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity." Cancer research 65.3 (2005): 1089-1096; Raedler, Lisa A. "Keytruda (pembrolizumab): first PD-1 inhibitor approved for previously treated unresectable or metastatic melanoma." American health & drug benefits 8. Spec Feature (2015): 96; Kwok, Gerry, et al. "Pembrolizumab (Keytruda)." (2016): 2777-2789; US 20170247454; US 9,834,606 B; 및 US 8,728,474에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
본 개시 내용은 종양 성장을 억제하고, 개 동물(예: 개), 고양이 동물(예: 고양이) 및/또는 곰(Ursidae)(예: 자이언트 판다)를 포함한 다양한 포유류의 암 치료를 위해 여러 항-PD-1 항체(예를 들어, 개화 항-dPD-1 항체), 이의 항원 결합 단편, 및 이들 항-PD-1 항체 및 항원 결합 단편을 사용하는 방법을 제공한다.
항체 및 항원 결합 단편
본 개시 내용은 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일반적으로 항체(면역 글로불린이라고도 함)는 두 종류의 폴리펩티드 사슬, 경쇄 및 중쇄로 구성된다. 본 개시 내용의 비제한적 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 4개의 면역 글로불린 사슬 항체일 수 있다. 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA 또는 IgD를 포함하는 임의의 이소형 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 등을 포함하는 하위 이소형일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄(kappa light chain) 또는 람다 경쇄(lambda light chain)일 수 있다.
항체는 경쇄의 두 개의 동일한 카피와 중쇄의 두 개의 동일한 카피를 포함할 수 있다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VH) 및 다중 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 중쇄는 불변 도메인 내에서 이황화 결합을 통해 서로 결합하여 항체의 "줄기(stem)"를 형성한다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VL) 및 하나의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 경쇄는 각각 이황화 결합을 통해 하나의 중쇄에 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 결합되는 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역(FR) 사이에 샌드위치된 3개의 초가변 영역을 포함한다.
상보적 결정 영역(CDRs)으로 알려진 이러한 초가변 영역은 항체의 주요 항원 결합 표면을 포함하는 루프를 형성한다. 4개의 프레임워크 영역은 주로 베타-시트 형태를 채택하고 CDR은 루프를 형성하며, 일부 경우에서 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하게 유지되고 다른 사슬의 CDR과 함께 항원 결합 영역의 형성에 기여한다.
항체의 아미노산 서열을 분석하여 항체의 CDR 영역을 확인하는 방법은 잘 알려져 있으며 CDR의 많은 정의가 일반적으로 사용된다. Kabat 정의는 시퀀스 가변성을 기반으로 하고 Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한다. 이러한 방법 및 정의는 예를 들어 Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan .1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
CDR은 항원의 에피토프를 인식하는데 중요하다. 본원에 사용된 "에피토프(epitope)"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자의 가장 작은 부분이다. 에피토프의 최소 크기는 약 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산일 수 있지만, 에피토프는 항원의 2차 및 3차 구조에 기반한 항원의 3차원 구성에 의존할 수 있기 때문에, 이러한 아미노산은 항원의 1차 구조의 연속적인 선형 서열에 있을 필요는 없다.
일부 실시예에서, 항체는 온전한 면역 글로불린 분자(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA)이다. IgG 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)는 고도로 보존되어 있으며, 특히 힌지와 상부 CH2 도메인에서 불변 영역이 다르다. IgG 서브클래스의 서열 및 차이점은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
항체는 또한 임의의 종(예: 인간, 설치류, 마우스, 낙타류, 개, 고양이 또는 자이언트 판다)에서 유래된 면역 글로불린 분자일 수 있다. 본원에 개시된 항체는 또한, 다른 폴리펩티드에 융합된 면역 글로불린 결합 도메인을 포함하는 다중 클론, 단일 클론, 단일 특이적, 다특이적 항체 및 키메라 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "항원 결합 도메인(antigen binding domain)" 또는 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 일부, 즉 온전한 항체의 표적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분이다 분자. 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 및 이들 단편의 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 scFv, Fv, Fd, dAb, 이중 특이적 항체, 이중 특이적 scFv, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체, 및 항체 결합 도메인이거나 이에 상동인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비제한적인 예는 예를 들어, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개별 CDR를 포함한다.
일부 실시예에서, 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 CD3-제타 막 횡단-및 엔도도메인(endodomain)에 융합된 본원에 기재된 바와 같은 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 융합체이다. 일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 또한, 다양한 공동 자극 단백질 수용체(예를 들어, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 효능을 증가시키기 위해 다중 신호 전달 도메인, 예를 들어 CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 포함한다. 따라서, 일 관전에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포)를 추가로 제공한다.
일부 실시예에서, scFV는 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
항-PD-1 항체 및 항원 결합 단편
본 개시 내용은 PD-1(예를 들어, 개 PD-1)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단편은 PD-1에 결합할 수 있고 PD-1 신호 전달 경로를 촉진하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 개시 내용은 예를 들어, 마우스 항-PD-1 항체 13-1B9 ("1B9"), 12-4A7 ("4A7") 및 12-1D8 ("1D8"), 이의 키메라 항체 및 이의 개화 항체(예를 들어, 표 1에 제시된 항체)를 제공한다.
1B9 및 1B9 유래 항체(예: 개화 항체 및 고양이화 항체)에 대한 CDR 서열은 Kabat 번호 지정에 정의된 대로 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 1-3 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 4-6을 포함한다. CDR은 Chothia 시스템으로도 정의할 수 있다. Chothia 넘버링 하에서, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 19-21에 제시되고 경쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 22-24에 제시되어 있다.
유사하게, 4A7 및 4A7 유래 항체에 대한 CDR 서열은 Kabat 넘버링에 의해 정의된 바와 같이 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 7-9 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 10-12를 포함한다. Chothia 넘버링 하에서, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 25-27에 제시되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 28-30에 제시되어 있다.
1D8 및 1D8 유래 항체에 대한 CDR 서열은 Kabat 넘버링에 의해 정의된 바와 같이 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 13-15, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 16-18을 포함한다. Chothia 넘버링 하에서 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 31-33에 제시되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 34-36에 제시되어 있다.
개화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열도 제공된다. 마우스 항체를 개화하는 다른 방법이 있기 때문에(예를 들어, 서열은 다른 아미노산 치환으로 변형될 수 있음), 항체의 중쇄 및 경쇄는 개화 서열의 하나 이상의 버전을 가질 수 있다. 개화 1B9 항체의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 서열번호 49-51에 제시되어 있다. 개화 1B9 항체의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 서열번호 52-54에 제시되어 있다. 이들 중쇄 가변 영역 서열(서열번호 49-51) 중 임의의 것은 이러한 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 52-54) 중 임의의 것과 쌍을 이룰 수 있다.
유사하게, 개화 1D8 항체의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 서열번호 42-44에 제시되어 있다. 개화 1D8 항체의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 서열번호 45-48에 제시되어 있다. 이들 중쇄 가변 영역 서열(서열번호 42-44) 중 임의의 것은 이러한 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 45-48) 중 임의의 것과 쌍을 이룰 수 있다.
개화 백분율(caninization percentage)은 국제 면역 유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System, IMGT) 데이터베이스의 개 항체 서열과 비교하여 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열의 동일성 백분율을 의미한다. 최고 히트(top hit)는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열이 다른 종보다 특정 종에 더 가깝다는 것을 의미한다. 일부 실시예에서, 개화 백분율은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%를 초과한다. 높은 개화 비율은 종종 다양한 장점을 가지고 있다. 예를 들어, 개에서 더 안전하고 더 효과적이며, 더 잘 견디고/견디거나 부작용이 더 적을 수 있다.
또한, 일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열번호 1-3, 서열번호 7-9, 서열번호 13-15, 서열번호 19-21, 서열번호 25-27, 및 서열번호 31-33의 군에서 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 가변 영역 CDR; 및/또는 서열번호 4-6, 서열번호 10-12, 서열번호 16-18, 서열번호 22-24, 서열번호 28-30, 및 서열번호 34-36의 군에서 선택된 1, 2, 또는 3개의 경쇄 가변 영역 CDR을 함유할 수 있다.
일부 실시예에서, 항체는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 가질 수 있으며, 여기서 CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성되고, CDR2 영역은 선택된 VH CDR2와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성되며, CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열, 및 CDR 1, 2, 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 그로 구성되고, 여기서 CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성되고, CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열 및 선택된 VL CDR, 1, 2, 3 아미노산 서열은 도 16(Kabat CDR) 및 도 17(Chothis CDR)에 도시되어 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 1; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 2; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 3의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 7; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 8; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 9의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 13; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 14; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 15의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 19; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 20; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 21의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 25; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 26; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 27의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 31; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 32; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 33의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 4; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 5; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 6의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 10; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 11; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 12의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 16; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 17; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 18의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 22; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 23; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 24의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 28; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 29; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 30의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 34; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 35; 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환이 있는 서열번호 36의 CDRs 1, 2 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
삽입, 결실 및 치환은 CDR 서열 내에, 또는 CDR 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 있을 수 있다.
본 개시 내용은 또한 PD-1(예를 들어, 개 PD-1)에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 선택된 VH 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH) 및 선택된 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 49, 50, 51 또는 59이고, 선택된 VL 서열은 서열번호 52, 53, 54 또는 60이다. 일부 실시예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 42, 43, 44 또는 57이고 선택된 VL 서열은 서열번호 45, 46, 47, 48, 또는 58이다. 일부 실시예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 55이고, 선택된 VL 서열은 VL 서열은 서열번호 56이다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위한 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있거나 또는 비상동성 서열은 비교 목적으로 무시할 수 있다.) 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 80%이고, 일부 실시예에서 적어도 90%, 95% 또는 100%이다. 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 본 개시의 목적을 위해, 2개의 서열 간의 서열의 비교 및 동일성 백분율의 결정은 갭 패널티(gap penalty) 12, 갭 확장 패널티(gap extend penalty) 4 및 프레임시프트(frameshift) 갭 패널티 5를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 달성될 수 있다.
본 개시는 또한 면역 글로불린 중쇄 또는 면역 글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 제공한다. 면역 글로불린 중쇄 또는 면역 글로불린 경쇄는 도 16 또는 도 17에 나타낸 바와 같은 CDR을 포함하거나 도 19 내지 도 21에 도시된 바와 같은 서열을 갖는다. 폴리펩티드가 상응하는 폴리펩티드(예를 들어, 상응하는 중쇄 가변 영역 또는 상응하는 경쇄 가변 영역)와 쌍을 이루는 경우, 쌍을 이루는 폴리펩티드는 PD-1(예를 들어, 개 PD-1)에 결합한다.
항-PD-1 항체 및 항원 결합 단편은 또한 항체 또는 항체 단편 및 다중 특이적(예를 들어, 이중 특이적) 항체 또는 항체 단편의 항체 변이체(유도체 및 접합체 포함)일 수 있다. 본원에서 제공되는 추가 항체는 다중 클론, 단일 클론, 다중 특이적(다합체, 예를 들어, 이중 특이적), 인간 항체, 개 항체, 고양이 항체, 판다 항체, 키메라 항체(예: 인간-마우스 키메라, 개-마우스 키메라), 단일 사슬 항체, 세포내 생성 항체(즉, 체내) 및 이의 항원 결합 단편이다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편(예를 들어, 개, 고양이 또는 판다 항체)이다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체는 개 또는 개화 IgG 항체(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다. 예를 들어, 항체는 CL, CH1, CH2 및/또는 CH3을 포함하는 개 IgG 불변 영역을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 고양이 또는 고양이화된 IgG 항체이다. 예를 들어, 항체는 CL, CH1, CH2 및/또는 CH3을 포함하는 고양이 IgG 불변 영역을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 판다 IgG 항체이다. 일부 경우에는 판다 IgG 항체의 불변 영역(예: CL, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 가질 수 있다.
항체 단편은 전장 항체의 원하는 친화성 및 특이성을 유지하는 한 제공된 방법에 사용하기에 적합하다. 따라서, PD-1에 결합하는 항체 단편은 PD-1에 결합하는 능력을 유지할 것이다. Fv 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 이 영역은 밀접하게 결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성되며, 이는 예를 들어 scFv에서 자연적으로 공유될 수 있다. 이 구성에서 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호 작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 정의한다. 종합적으로, 6개의 CDRs 또는 이의 서브세트는 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도 일반적으로 전체 결합 부위보다 낮은 친화성에 있지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
단일 사슬 Fv 또는 (scFv) 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인(또는 영역)을 포함하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다.
Fab 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이의 힌지 시스테인에 의해 그들의 카르복시 말단 근처에 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
디아바디는 두 개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편이다. 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH 및 VL)에서 VL에 연결된 VH를 포함한다. 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬에 있는 두 도메인 사이의 페어링을 허용함으로써 도메인은 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루고 두 개의 항원 결합 부위를 생성한다.
선형 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤(tandem) Fd 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체는 이중 특이적이거나 단일 특이적일 수 있다.
본 개시의 항체 및 항체 단편은 원하는 이펙터 기능 또는 혈청 반감기를 제공하도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다.
항체의 다량체화(multimerization)는 항체의 천연 응집을 통해 또는 당업계에 공지된 화학적 또는 재조합 연결 기술을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제(예: 정제된 IgG1 분자)의 일부 비율은 항체 동종이량체 및 기타 고차 항체 다량체를 포함하는 단백질 응집체를 자발적으로 형성한다.
대안적으로, 항체 동종이량체는 당업계에 공지된 화학적 연결 기술을 통해 형성될 수 있다. 예를 들어, SMCC (숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산-1- 카복실레이트) 및 SATA (N-숙신이미딜 S-아세틸티오-아세테이트)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 이종이작용성(heterobifunctional) 가교제를 사용하여 항체 다량체를 형성할 수 있다. 항체 동종이량체의 형성을 위한 예시적인 프로토콜은 Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7509-7514, 1997)에 기재되어 있다. 항체 동종이량체는 펩신으로 분해하여 Fab'2 동종이량체로 전환될 수 있다. 항체 동종이량체를 형성하는 또 다른 방법은 Zhao et al. (J. Immunol. 25:396-404, 2002)에 설명된 자가친화성 T15 펩티드를 사용하는 것이다.
일부 실시예에서, 다중 특이적 항체는 이중 특이적 항체이다. 이중 특이적 항체는 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면(interface)을 가공하여 재조합 세포 배양에서 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화함으로써 만들 수 있다. 예를 들어, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이 방법에서, 첫 번째 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예: 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavities)"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다. 이 방법은 예를 들어 WO 96/27011에 설명되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 포함된다.
이중 특이적 항체는 가교 또는 "이종 접합(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종 접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 연결되고 다른 하나는 비오틴에 연결될 수 있다. 이종 접합체 항체는 편리한 가교 방법을 사용하여 만들 수도 있다. 적합한 가교제 및 가교 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 미국특허 제 4,676,980호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 포함된다.
항체 단편으로부터 이중 특이적 항체를 생성하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 사용하여 이중 특이적 항체를 제조할 수 있다. Brennan et al. (Science 229:81, 1985)는 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 온전한 항체가 단백질 분해로 절단되는 절차를 설명한다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산 나트륨(sodium arsenite)의 존재하에 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab' TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab' 티올로 재전환되고, 등 몰량의 다른 Fab' TNB 유도체와 혼합되어 이중 특이적 항체를 형성한다.
본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편은 안정화 분자(예를 들어, 대상체 또는 용액에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 반감기를 증가시키는 분자)에 접합될 수 있다. 안정화 분자의 비제한적인 예는 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 단백질(예를 들어, 개 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민)을 포함한다. 안정화 분자의 접합은 반감기를 증가시키거나 항체 또는 항원 결합 단편의 생물학적 활성을 시험관 내(예를 들어, 조직 배양에서 또는 약제학적 조성물로 저장될 때) 또는 생체 내에서 연장할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 치료제에 접합될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체는 치료제에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 치료제는 세포 독성제 또는 세포 증식 억제제(예를 들어, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신, 메이탄시노이드, 예컨대 DM-1 및 DM-4, 디오네(dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 에피루비신, 사이클로포스파미드 및 유사체)이다.
항체 특성
본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1과 PD-L1 사이의 결합 및/또는 PD-1과 PD-L2 사이의 결합을 차단할 수 있다.
일부 실시예에서, PD-1에 결합함으로써 항체는 PD-1 신호 전달 경로를 억제하고 면역 반응을 상향 조절할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-1 길항제(antagonist)이다. 일부 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-1 효능제(agonist)이다. 일부 실시예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 개 PD-1과 개 PD-L1, 고양이 PD-1과 고양이 PD-L1, 및/또는 판다 PD-1과 판다 PD-L1 사이의 결합을 차단할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 반응, 활성 또는 T 세포(예를 들어, CD8+ 및/또는 CD4+ 세포)의 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 T 세포의 활성 또는 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 감소시킬 수 있다.
일부 구현에서, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 PD-1(예를 들어, 개 PD-1, 고양이 PD-1, 판다 PD-1, 원숭이 PD-1, 마우스 PD-1, 및/또는 키메라 PD-1)에 0.1 s-1 미만, 0.01 s-1 미만, 0.001 s-1 미만, 0.0001 s-1 미만, 또는 0.00001 s-1 미만의 해리 속도(dissociation rate, koff)로 특이적으로 결합한다. 일부 실시예에서, 해리 속도(koff)는 0.01 s-1 초과, 0.001 s-1 초과, 0.0001 s-1 초과, 0.00001 s-1 초과, 또는 0.000001 s-1 초과이다.
일부 실시예에서, 운동 결합율(kinetic association rates, kon)은 1 x 102/Ms 초과, 1 x 103/Ms 초과, 1 x 104/Ms 초과, 1 x 105/Ms 초과, 또는 1 x 106/Ms이다. 일부 실시예에서, 운동 결합율(kon)은 1 x 105/Ms 미만, 1 x 106/Ms 미만, 또는 1 x 107/Ms 미만이다.
친화도는 운동 속도 상수(KD=koff/kon)의 몫에서 추론할 수 있다. 일부 실시예에서, KD는 1 x 10-6 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-10 M 미만이다. 일부 실시예에서, KD는 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1nM 미만이다. 일부 실시예에서, KD는 1 x 10-7 M 초과, 1 x 10-8 M 초과, 1 x 10-9 M 초과, 1 x 10-10 M 초과, 1 x 10-11 M 초과, 또는 1 x 10-12 M 초과이다. 일부 실시예에서, 항체는 약 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 또는 0.1 nM 이하의 KD로 개 PD-1에 결합한다.
항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는 일반적인 기술에는 예를 들어 ELISA, RIA 및 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)이 포함된다. 일부 실시예에서, 항체는 개 PD-1 (서열번호 41), 고양이 PD-1 (서열번호 62), 판다 PD-1 (서열번호 31), 인간 PD-1 (서열번호 37), 원숭이 PD-1 (예를 들어, 붉은 털 원숭이 PD-1, 서열번호 39), 키메라 PD-1 (서열번호 40), 및/또는 마우스 PD-1 (서열번호 38)에 결합한다. 일부 실시예에서, 항체는 개 PD-1 (서열번호 41), 고양이 PD-1 (서열번호 62), 판다 PD-1 (서열번호 31), 인간 PD-1 (서열번호 37), 원숭이 PD-1 (예를 들어, 붉은 털 원숭이 PD-1, 서열번호 39), 키메라 PD-1 (서열번호 40), 및/또는 마우스 PD-1 (서열번호 38)에 결합하지 않는다.
일부 실시예에서, 개 PD-1, 고양이 PD-1 또는 판다 PD-1과의 결합 활성에 대한 EC50은 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 미만이다. 일부 실시예에서, 개 PD-1, 고양이 PD-1 또는 판다 PD-1과의 결합 활성에 대한 EC50은 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 초과이다. 본원에서 사용된 용어 "EC50"은 최대 유효 반응의 절반을 유도하기 위한 농도를 의미한다. EC50 농도에서 약제(예: 약물, 항체 또는 독성 물질)는 지정된 노출 시간 후 기준선과 최대 값 사이의 중간에 반응을 유도한다. 결합 활성에 대한 "EC50"은 기준선과 최대 결합 활성 사이의 중간에 결합 활성을 제공하는 약제(예를 들어, 약물, 항체 또는 독성제)의 농도를 의미한다.
일부 실시예에서, 열 안정성이 결정된다. 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 ℃보다 큰 Tm을 가질 수 있다.
IgG는 다중 도메인 단백질로 설명될 수 있으므로 용융 곡선은 때때로 첫 번째 변성 온도 Tm D1 및 두 번째 변성 온도 Tm D2를 갖는 두 가지 전이를 보여준다. 이 두 피크의 존재는 종종 각각 Fc 도메인 (Tm D1) 및 Fab 도메인 (Tm D2)의 변성을 나타낸다. 두 개의 피크가 있을 때 Tm은 일반적으로 Tm D2를 나타낸다. 따라서, 일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 ℃보다 큰 Tm D1을 갖는다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 ℃보다 큰 Tm D2를 갖는다.
일부 실시예에서, Tm, Tm D1, Tm D2는 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 ℃미만이다.
일부 실시예에서, 항체는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200% 초과인 종양 성장 억제 백분율(tumor growth inhibition percentage, TGI%)을 갖는다. 일부 실시예에서, 항체는 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200% 미만인 종양 성장 억제 백분율을 갖는다. TGI%는 예를 들어 치료 시작 후 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일에, 또는 치료 시작 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 후 결정될 수 있다. 본원에 사용된 종양 성장 억제 백분율(TGI%)은 다음 공식을 사용하여 계산된다.
TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]Х100
Ti는 i일에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. T0는 0일에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. Vi는 i일에 대조군의 평균 종양 부피이다. V0은 0일에 대조군의 평균 종양 부피이다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-1 길항제이다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-1을 발현하는 표적 세포에서 PD-1 신호 전달을 감소시킨다.
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 CD4+ 이펙터 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 CD4+ 이펙터 T 세포에 의한 감마 인터페론 생산을 증가시킴으로써 (예를 들어, 증식 및/또는 항체 또는 항원 결합 단편으로 처리하기 전 사이토카인 생산과 비교하여) CD4+ 이펙터 T 세포 기능을 증강시킨다. 일부 실시예에서, 사이토카인은 감마 인터페론이다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편으로 처리하기 전 종양 내(침윤) CD4+ T 세포의 수와 비교하여, 종양 내(침윤) CD4+ 이펙터 T 세포의 수(예를 들어, CD4+ 이펙터 T 세포의 총 수, 또는 예를 들어 CD45+ 세포에서 CD4+ 세포의 백분율)를 증가시킨다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편으로 처리하기 전 종양 내(침윤) CD4+ T 세포의 수와 비교하여, 감마 인터페론을 발현하는 종양 내(침윤) CD4+ 이펙터 T 세포의 수를 증가시킨다(예를 들어, CD4+ 세포를 발현하는 총 감마 인터페론, 또는 예를 들어 총 CD4+ 세포에서 CD4+ 세포를 발현하는 감마 인터페론의 백분율).
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 처리하기 전 종양 내(침윤) CD8+ T 세포의 수와 비교하여, 종양 내(침윤) CD8+ 이펙터 T 세포의 수(예를 들어, CD8+ 이펙터 T 세포의 총 수, 또는 예를 들어 CD45+ 세포에서 CD8+ 세포의 백분율)를 증가시킨다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-개 PD-1 항체)로 치료하기 전에 감마 인터페론을 발현하는 종양 내(침윤) CD8+ T 세포의 수와 비교하여, 감마 인터페론을 발현하는 종양 내(침윤) CD8+ 이펙터 T 세포의 수를 증가시킨다(예를 들어, 총 CD8+ 세포에서 감마 인터페론을 발현하는 CD8+ 세포의 백분율).
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 기억 T 세포 증식을 증가시키고/증가시키거나 기억 세포에 의한 사이토카인(예를 들어, 감마 인터페론) 생산을 증가시킴으로써 기억 T 세포 기능을 향상시킨다.
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 이펙터 T 세포 기능의 Treg 억제를 감소시킴으로써 Treg 기능을 억제한다(예를 들어, 이펙터 T 세포 증식 및/또는 이펙터 T 세포 사이토카인 분비). 일부 실시예에서, 이펙터 T 세포는 CD4+ 이펙터 T 세포이다. 일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 종양 내(침윤) Treg의 수(예를 들어, Treg의 총 수 또는 예를 들어, CD4+ 세포에서 Fox3p+ 세포의 백분율)를 감소시킨다.
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항-PD-1 항체를 고갈시킨다(예를 들어, 개 PD-1을 발현하는 세포를 고갈시킨다). 일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 시험관 내에서 PD-1(예를 들어, 개 PD-1)을 발현하는 세포를 고갈시킨다. 일부 실시예에서, PD-1 발현 세포는 CD4+ 이펙터 T 세포 또는 Treg 세포이다. 일부 실시예에서, 고갈은 ADCC 및/또는 식균 작용에 의한 것이다.
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 기능적 Fc 영역을 갖는다. 일부 실시예에서, 기능적 Fc 영역의 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)이다. 일부 실시예에서, 기능적 Fc 영역의 이펙터 기능은 식균 작용이다. 일부 실시예에서, 기능적 Fc 영역의 이펙터 기능은 ADCC 및 식균 작용이다. 일부 실시예에서, Fc 영역은 개 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 것이다.
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-1- 발현 세포(예를 들어, Treg)에서 아포토시스를 유도하지 않는다.
일부 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 기능적 Fc 영역을 갖지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편이다.
항-PD-1 항체의 제조방법
PD-1의 단리된 단편(예: 개 PD-1, 고양이 PD-1 또는 판다 PD-1)은 다중 클론 및 단일 클론 항체 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 다중 클론 항체는 항원 펩티드 또는 단백질의 다중 주사(예: 피하 또는 복강 주사)에 의해 동물에서 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 적어도 하나의 아쥬반트와 함께 주사된다. 일부 실시예에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 면역될 종에서 면역원성인 약제에 접합될 수 있다. 동물에게 항원성 펩티드 또는 단백질을 1회 이상 (예: 2회, 3회 또는 4회) 주사할 수 있다.
전장 폴리펩티드 또는 단백질이 사용될 수 있거나, 대안적으로 그의 항원성 펩티드 단편이 면역원으로 사용될 수 있다. 단백질의 항원성 펩티드는 PD-1의 아미노산 서열의 적어도 8개(예를 들어, 적어도 10, 15, 20 또는 30개)의 아미노산 잔기를 포함하고 펩티드에 대해 생성된 항체가 단백질과 특정 면역 복합체를 형성하도록 단백질의 에피토프를 포함한다. 전술한 바와 같이, 개 PD-1의 전장 서열은 당업계에 공지되어 있다(서열번호 41).
면역원은 일반적으로 적합한 대상(예: 마우스 또는 트랜스제닉 동물)을 면역화하여 항체를 제조하는데 사용된다. 적절한 면역원성 제제는 예를 들어 재조합적으로 발현되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드(예를 들어, 개 PD-1의 단편)를 함유할 수 있다. 상기 제제는 프로인트(Freund's) 완전 또는 불완전 아쥬반트와 같은 아쥬반트 또는 유사한 면역 자극제를 추가로 포함할 수 있다.
다중 클론 항체는 적합한 대상체를 면역원으로서 PD-1 폴리펩티드 또는 그의 항원성 펩티드(예를 들어, PD-1의 일부)로 면역화함으로써 상기 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 대상체에서 항체 역가는 고정화된 PD-1 폴리펩티드 또는 펩티드를 사용하는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 원하는 경우, 항체 분자는 포유동물로부터 (예를 들어, 혈액으로부터) 분리되고 IgG 분획을 얻기 위해 단백질 G 크로마토그래피의 단백질 A와 같은 잘 알려진 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 면역화 후 적절한 시간에, 예를 들어 특정 항체 역가가 가장 높을 때, 항체 생산 세포는 대상체로부터 얻을 수 있으며, Kohler et al.에 의해 원래 설명된 하이브리도마 기술 (Nature 256:495-497, 1975), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) 또는 트리오마(trioma) 기술과 같은 표준 기술을 이용하여 단일 클론 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마 생산 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로 Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY 참조). 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들어 표준 ELISA 분석을 사용하여 관심 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출된다.
본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 본원에 기재된 개, 고양이, 개화, 고양이화 또는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA에 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는 예를 들어 항체 또는 항원 결합 도메인의 항원 결합 부위를 구성하는 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 이러한 변이체의 집단에서, 일부 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 단백질, 예를 들어 PD-1에 대해 증가된 친화성을 가질 것이다. 결실, 삽입 및/또는 조합의 임의의 조합이 표적에 대한 결합 친화도가 증가된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 도달하도록 만들어질 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편에 도입된 아미노산 변화는 또한 항체 또는 항원 결합 단편에 새로운 번역 후 변형을 변경하거나 도입할 수 있는데, 예를 들어 글리코실화 부위의 수를 변경(예: 증가 또는 감소), 글리코실화 부위의 타입을 변경(예: 세포에 존재하는 효소에 의해 다른 당이 부착되도록 아미노산 서열 변경), 또는 새로운 글리코 실화 부위 도입할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 포유동물을 포함하는 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 천연 항체의 비제한적인 예는 인간, 개 또는 고양이 항체를 생산하도록 유전적으로 조작된 트랜스제닉 설치류 포함하여, 인간, 개, 고양이, 판다, 영장류, 예를 들어 원숭이와 원숭이, 소, 돼지, 말, 양, 낙타류(예: 낙타와 라마), 닭, 염소 및 설치류(예를 들어, 쥐, 마우스, 햄스터 및 토끼)로부터 유래된 항체를 포함한다,
본 개시는 또한 본원에 기재된 항체를 발현하는 세포 및 세포주를 추가로 제공한다. 대표적인 숙주 세포는 예를 들어 박테리아, 효모, 포유류 및 인간 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 및 COS 세포를 포함한다. 이종 구성체를 숙주 세포로 형질전환한 후 안정한 세포주를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대표적인 비포유동물 숙주 세포는 곤충 세포를 포함한다(Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10 (2-3):103-112). 항체는 또한 트랜스제닉 동물(Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13 (6): 625-629) 및 트랜스제닉 식물(Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60 (3): 433-45)에서 생산될 수 있다.
일반적으로, 개, 개화, 고양이, 고양이화 또는 키메라 항-PD-1 항체의 아미노산 서열 변이체는 원래 항체의 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 서열과 함께 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가진 아미노산 서열을 가질 것이다.
원래 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 일반적으로 개, 개화, 고양이, 고양이화 또는 키메라 항-PD-1 항체 또는 단편 내에 존재하는 서열과 동일한 후보 서열 내에 존재하는 아미노산 잔기의 백분율이며, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하고, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다.
항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 추가 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역에 도입되어 이 영역에서 사슬 간 이황화 결합이 형성될 수 있다. 따라서 생성된 동종이량체 항체는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 증가된 반감기를 가질 수 있다. 시험관 내 및/또는 생체 내에서 증가된 반감기를 갖는 동종이량체 항체는 또한 예를 들어 Wolff et al. (ancer Res. 53:2560-2565, 1993)에 기재된 바와 같이 이종이기능성 가교 결합제(heterobifunctional cross-linkers)를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있다(예를 들어, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989 참조).
일부 실시예에서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 공유 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 공유 변형은 화학적 또는 효소적 합성, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 다른 유형의 공유 변형은 항체 또는 단편의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입한다.
일부 실시예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어, WO 2008/077546에 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당 구조(예: 복합, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)의 합과 관련하여 Asn297에서 당 사슬 내 푸코스의 평균 양을 계산하여 결정되고, 예를 들어, Asn297은 Fc 영역(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링, 또는 Kabat 넘버링에서 314번 위치)에서 약 297번 위치에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하고; 그러나 Asn297은 또한 항체의 사소한 서열 변이로 인해 297번 위치의 상류 또는 하류, 즉 294번 위치와 300번 위치 사이에 약 ±3개의 아미노산이 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 글리칸 이질성을 감소시키기 위해, 항체의 Fc 영역을 추가로 조작하여 297번 위치에서 아스파라긴을 알라닌(N297A)으로 대체할 수 있다.
일부 실시예에서, Fab-arm 교환을 피함으로써 생산 효율을 촉진하기 위해, 항체의 Fc 영역을 추가로 조작하여 IgG4의 228번 위치(EU 넘버링)에서 세린을 프롤린(S228P)으로 대체하였다. S228 돌연변이에 관한 자세한 설명은 예를 들어 Silva et al. "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation." Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015): 5462-5469에 기재되어 있고, 이는 전체가 참고로 포함된다.
항체의 종 분화(speciation)
항-약물 항체(anti-drug antibodies, ADA)의 생성은 단일 클론 항체를 포함한 바이오 치료 단백질의 효능 손실과 관련이 있을 수 있다. 문헌에 대한 포괄적인 평가는 단일 클론 항체의 종 분화가 mAb가 면역원성이 되는 경향을 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 본원에 제공된 마우스 항 PD-1 단일 클론 항체에 대한 ADA 형성과 관련된 위험을 완화하기 위해 종 분화 전략(예: 개화 또는 고양이화)을 사용할 수 있다. 이 전략은 CDR 이식에 가장 적합한 개 또는 고양이 생식 계열 항체 서열을 식별하는데 기반할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 사용 가능한 모든 개 생식 계열 서열에 대한 광범위한 분석 후, 마우스 mAb에 대한 상동성을 기반으로 생식계 후보를 선택할 수 있으며, 마우스 전구 mAb의 CDR을 사용하여 천연 개 또는 고양이 CDR을 대체할 수 있다. 목표는 완전한 개 또는 고양이 프레임워크를 사용하여 높은 친화성과 세포 기반 활성을 유지하여 생체 내에서 면역원성의 잠재력을 최소화하는 것이다. 개화 또는 고양이화 mAb는 웨스턴 블롯팅을 통해 개 또는 고양이 PD-1에 결합하는 능력에 대해 발현되고 특성화된다.
개화 또는 고양이화 항체는 개 또는 고양이 생식 계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된 (또는 유래된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는) 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 일부 경우에, 개화 또는 고양이화 항체는 예를 들어 CDR에서 개 또는 고양이 생식선 면역 글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
개화 또는 고양이화 항체는 일반적으로 다른 종(예를 들어, 마우스)에서 유래된 항체의 CDR로 이식된 개 또는 고양이 프레임워크(FR)를 갖는다. 따라서, 개화 또는 고양이화 항체는 개 또는 고양이 포유동물 이외의 공급원으로부터 그것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 아미노산 잔기는 종종 "수입(import)" 잔기라고 하며, 일반적으로 "수입" 가변 도메인에서 가져온다. 개화 또는 고양이화는 본질적으로 예를 들어 개 또는 고양이 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 Singer, et al. "Generation of a canine anti-EGFR (ErbB-1) antibody for passive immunotherapy in dog cancer patients." Molecular cancer therapeutics (2014); Maekawa, et al. "A canine chimeric monoclonal antibody targeting PD-L1 and its clinical efficacy in canine oral malignant melanoma or undifferentiated sarcoma." Scientific reports 7.1 (2017): 8951; US20170158756A1에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 따라서, "개화" 항체는 온전한 개 V 도메인보다 실질적으로 적은 비-개 종의 상응하는 서열로 대체된 키메라 항체이고, "고양이화" 항체는 온전한 고양이 V 도메인보다 실질적으로 적은 비-고양이 종의 해당 서열로 대체된 키메라 항체이다. 실제로, 이들 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 일부 FR 잔기가 개 또는 고양이 항체의 유사한 부위의 잔기로 치환된 마우스 항체이다.
프레임워크 잔기는 초가변 또는 CDR 잔기 이외의 항체 가변 영역의 잔기이다. 프레임워크 잔기는 본원에 기재된 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 유사한 개 또는 고양이 프레임워크와 같은 자연 발생 개 또는 고양이 항체로부터 유래될 수 있다. 개별 서열 간의 합의를 나타내는 인공 프레임워크 서열도 사용할 수 있다. 개화 또는 고양이화를 위한 프레임워크 영역을 선택할 때, 개나 고양이에서 널리 표시되는 서열이 인구가 적은 서열보다 선호될 수 있다. 프레임워크 수용체 서열의 추가 돌연변이는 항원 접촉 부위에 관여하는 것으로 여겨지는 뮤린 잔기 및/또는 항원 결합 부위의 구조적 완전성에 관여하는 잔기를 복원하거나 항체 발현을 개선하기 위해 만들어질 수 있다. VH 및 VL에서 프레임워크 영역의 잔기가 적어도 부분적으로 개 또는 고양이 항체 서열로부터 유래될 때, 가변 영역은 또한 개화 또는 고양이화(예: 개화 또는 고양이화 경쇄 또는 중쇄 가변 영역)로 기재된다.
CDR의 이식은 수용자 항체(예를 들어, 개화 항체 또는 원하는 프레임워크 잔기를 포함하는 다른 항체)의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체(예를 들어, 비-개 항체)의 CDR로 대체함으로써 수행된다. 수용자 항체는 후보 수용자 항체와 공여자 항체 사이의 프레임워크 잔기의 유사성을 기반으로 선택될 수 있다. 동일한 방법을 사용하여아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca)(자이언트 판다)의 항체에 CDR을 이식할 수 있다.
개 및 고양이 IgG의 불변 영역에 대한 서열은 당업계에 공지되어 있다. 서열번호 63은 개 면역 글로불린 감마 중쇄 A (IgG1) 불변 영역(GenBank 수탁번호 AAL35301.1)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 64는 개 면역 글로불린 감마 중쇄 B (IgG2) 불변 영역(GenBank 수탁번호 AAL35302.1)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 68은 개 면역 글로불린 감마 중쇄 C (IgG3) 불변 영역(GenBank 수탁번호 AAL35303.1)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 69는 개 면역 글로불린 감마 중쇄 D (IgG4) 불변 영역(GenBank 수탁번호 AAL35304.1)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 65는 개 카파 사슬에 대한 아미노산 서열을 나타낸다(GenBank 수탁번호 XP_532962.3). 서열번호 70 및 71은 개 IgG 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 66은 고양이 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다(GenBank: BAA32229.1). 서열번호 67은 고양이 카파 사슬 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다(GenBank: AAF09245.1).
항원에 대한 높은 특이성 및 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 항체를 개화하거나 고양이화하는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 개화 또는 고양이화 항체는 모(parental) 및 개화 또는 고양이화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 개화 또는 고양이화 제품의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역 글로불린 모델이 일반적으로 이용 가능하며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 이러한 디스플레이를 검사하면 후보 면역 글로불린 서열의 기능에 있어 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 면역 글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 및 수입 서열로부터 선택되고 조합되어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성이 달성될 수 있다.
일부 경우에, 가변 영역에서 선택된 잔기의 복귀 돌연변이(back mutation)를 사용하여 CDR의 제시를 향상시킨다. 항체의 비-천연 서열에 대한 대상체에서 면역원성 반응을 최소화하는 동시에 효능을 유지하기에 충분히 항체의 항원 결합 영역을 보존하는 항체를 설계하는 것은 도전적인 것으로 입증되었다. 본원에 사용된 용어 "복귀 돌연변이(back mutation)"는 개 또는 고양이 항체의 체세포 돌연변이 아미노산의 일부 또는 전부가 상동 생식선 항체 서열의 상응하는 생식선 잔기로 대체되는 과정을 의미한다. 개 또는 고양이 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 가장 높은 상동성을 갖는 서열을 확인하기 위해 생식 계열 서열과 별도로 정렬된다. 개 또는 고양이 항체의 차이는 이러한 상이한 아미노산을 코딩하는 정의된 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시킴으로써 생식 계열 서열로 복귀된다. 따라서 복귀 돌연변이 후보로 확인된 각 아미노산의 역할은 항원 결합에서 직접 또는 간접적인 역할에 대해 조사되어야 하며, 항체의 바람직한 특성에 영향을 미치는 돌연변이 후에 발견된 아미노산은 최종 항체에 포함되지 않아야 한다. 예를 들어, 선택적 돌연변이 유발 접근법에 의해 확인된 활성 강화 아미노산은 복귀 돌연변이의 대상이 되지 않을 것이다. 복귀 돌연변이를 겪는 아미노산의 수를 최소화하기 위해, 두 번째 생식선 서열이 항체의 서열과 동일하고 동일 선상에 있는 한, 가장 가까운 생식선 서열과 다르지만 두 번째 생식선 서열의 상응하는 아미노산과 동일한 것으로 밝혀진 아미노산 위치는 남아있을 수 있다. 선택된 표적 프레임워크 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 복귀 돌연변이는 친화성을 회복 및/또는 개선하기 위해 필요할 수 있다.
재조합 벡터
본 개시 내용은 또한 본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, 발현 벡터), 재조합 벡터가 도입된 숙주 세포(즉, 숙주 세포가 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하도록) 및 재조합 기술에 의한 재조합 항체 폴리펩티드 또는 이의 단편의 제조를 제공한다.
본원에 사용된 "벡터(vector)"는 벡터가 숙주 세포에 도입될 때 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 숙주 세포에 전달할 수 있는 임의의 구축물이다. "발현 벡터(expression vector)"는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에서 코딩된 폴리펩티드로서 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 전달하고 발현할 수 있다. 따라서, 발현 벡터에서, 관심 폴리뉴클레오티드는
관심 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터와 함께 도입된 숙주 세포에서 번역되도록 벡터 내에서, 또는 관심 폴리뉴클레오티드의 통합 부위 또는 그 근처 또는 측면에 있는 숙주 세포의 게놈에서 프로모터, 인핸서 및/또는 폴리-A 테일(poly-A tail)과 같은 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 벡터에서 발현을 위해 위치한다.
벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 전기 천공, 화학적 형질 감염(예를 들어, DEAE-덱스트란), 형질 전환, 형질 감염 및 감염 및/또는 형질 도입(예를 들어, 재조합 바이러스 사용)에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 따라서, 벡터의 비제한적인 예는 바이러스 벡터 (재조합 바이러스를 생성하는 데 사용될 수 있음), 네이키드 DNA 또는 RNA, 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터 및 양이온성 축합제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)는 바이러스 발현 시스템(예를 들어, 백시니아(vaccinia) 또는 기타 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입되며, 이는 비-병원성(결함), 복제 능력이 있는 바이러스, 또는 복제 결함이 있는 바이러스를 사용할 수 있다. 후자의 경우 바이러스 증식은 일반적으로 보완 바이러스 패키징 세포(complementing virus packaging cells)에서만 발생할 것이다. 적합한 시스템은 예를 들어 Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21; U.S. Pat. Nos. 4,603,112, 4,769,330, and 5,017,487; WO 89/01973; U.S. Pat. No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73:1202-1207에 개시되어 있다. DNA를 이러한 발현 시스템에 도입하는 기술은 당업자에게 잘 알려져있다. DNA는 또한 예를 들어, Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749 및 Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692에 기재된 바와 같이 "네이키드(naked)"일 수 있다. 네이키드 DNA의 업테이크는 세포 내로 효율적으로 운반되는 생분해성 비드에 DNA를 코팅하여 증가시킬 수 있다.
발현을 위해, 본원에 개시된 항체-인코딩 또는 폴리펩티드-인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 삽입물은 적절한 프로모터(예를 들어, 이종 프로모터), 예컨대 파지 람다 PL 프로모터, E. coli lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로 바이러스 LTR의 프로모터 등에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 당업자에게 알려져 있다. 발현 구축물은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사된 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 구조물에 의해 발현되는 성숙 전사체의 코딩 부분은 시작에서 시작하는 번역 및 번역될 폴리펩티드의 끝에 적절하게 위치하는 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.
표시된 바와 같이, 발현 벡터는 적어도 하나의 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 마커는 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원 효소 또는 네오마이신 내성과 E. coli 및 기타 박테리아에서 배양하기 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 EE. coli, Streptomyces, 및 Salmonella typhimurium 세포와 같은 박테리아 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, Bowes 흑색종 및 HK 293 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 기재된 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
박테리아에서 사용하기 위한 비제한적 벡터에는 Qiagen에서 입수할 수 있는 pQE70, pQE60 및 pQE-9; Stratagene에서 입수할 수 있는 pBS 벡터, 파지스크립트(Phagescript) 벡터, 블루스크립트(Bluescript) 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 Pharmacia로부터 입수 가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 비제한적인 진핵 벡터는 Stratagene에서 입수할 수 있는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 Pharmacia에서 입수할 수 있는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL를 포함한다. 다른 적절한 벡터는 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
사용하기에 적합한 비제한적인 박테리아 프로모터는 E. coli lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적합한 진핵 프로모터에는 CMV 즉시 초기 프로모터(CMV immediate early promoter), HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들어 Rous 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV)의 프로모터, 및 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터(예: 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터)가 포함된다.
효모 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에는 알파 인자, 알코올 산화 효소, PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 많은 벡터가 사용될 수 있다. Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997)를 참고.
숙주 세포에 구축물의 도입은 인산 칼슘 형질 감염, DEAE-덱스트란 매개 형질 감염, 양이온성 지질 매개 형질 감염, 전기 천공, 형질 도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 방법은 Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)과 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 설명되어 있으며, 이는 전체가 여기에 참조로 포함된다.
고등 진핵 생물에 의한 본 개시 내용의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 주어진 숙주 세포 유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 역할을 하는 일반적으로 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소(cis-acting elements)이다. 인핸서의 예로는 염기쌍 100 ~ 270에서 복제 기점의 후반에 위치한 SV40 인핸서, 거대 세포 바이러스(cytomegalovirus) 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
번역된 단백질을 소포체의 내강, 주변 세포질 공간 또는 세포 외 환경으로 분비하기 위해, 적절한 분비 신호가 발현된 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 내인성이거나 이종 신호일 수 있다.
폴리펩티드(예를 들어, 항체)는 융합 단백질 (예를 들어, GST-융합) 또는 히스티딘-태그와 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 신호뿐만 아니라 추가적인 이종 기능 영역도 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산 영역, 특히 하전된 아미노산이 폴리펩티드의 N- 말단에 추가되어 숙주 세포에서, 정제 동안 또는 후속 취급 및 저장 동안 안정성 및 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티는 정제를 용이하게 하기 위해 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 분비 또는 배설을 일으키고, 안정성을 개선하고 정제를 촉진하기 위해 폴리펩티드에 펩티드 모이어티를 첨가하는 것은 특히 당업계에서 익숙한 일련의 기술이다.
치료 방법
본 개시 내용의 항체 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다양한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 일 관점에서, 본 개시 내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법, 시간이 지남에 따라 대상체에서 종양의 부피 증가 속도를 감소시키는 방법, 전이 발생 위험을 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 추가 전이가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 치료는 암의 진행을 중단, 지체, 지연 또는 억제할 수 있다. 일부 실시예에서, 치료는 대상체에서 암의 하나 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시킬 수 있다.
일 관점에서, 본 개시 내용은 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암을 갖거나 갖는 것으로 확인 또는 진단된 대상체), 예를 들어, 유방암(예: 삼중 음성 유방암), 유암종 암(carcinoid cancer), 자궁 경부암, 자궁 내막 암, 신경아교종, 두경부암, 간암, 폐암, 소세포 폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 결장직장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도 암 또는 혈액암을 가진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 암은 절제 불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 소세포 폐암(small cell lung cancer, SCLC), 방광암 또는 전이성 호르몬 불응성 전립선 암이다. 일부 실시예에서, 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 실시예에서, 암은 두경부 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck, SCCHN), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma, RCC), 삼중 음성 유방암(triple-negative breast cancer, TNBC) 또는 결장 직장 암종이다. 일부 실시예에서, 대상체는 호지킨 림프종을 갖는다. 일부 실시예에서, 대상체는 삼중 음성 유방암(TNBC), 위암, 요로 피암(urothelial cancer), 메르켈 세포 암종(Merkel-cell carcinoma) 또는 두경부암을 갖는다.
일부 실시예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 암에 걸릴 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 암 환자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 확인할 수 있다.
본원에서 사용되는 "유효량(effective amount)"은 질병, 예를 들어 암의 진행을 중단, 지체, 지연 또는 억제하는 것을 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양 또는 투여량을 의미한다. 유효량은 항체, 항원 결합 단편, 항체-인코딩 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및/또는 이의 조성물이 투여될 대상체의 연령 및 체중, 중증도 및 투여 경로에 따라 달라질 것이며 투여는 개별적으로 결정될 수 있다.
유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 예를 들어, 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편은 환자에서 암의 진행을 개선, 중지, 안정화, 반전, 억제, 지체 및/또는 지연시키기에 충분한 양이거나 또는 시험관 내에서 세포 (예를 들어, 생검된 세포, 본원에 기재된 임의의 암 세포, 또는 세포주 (예를 들어, 암 세포주))의 증식을 개선, 중지, 안정화, 역전, 지체 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량은 특히 환자 이력뿐만 아니라 사용된 항체의 유형 (및/또는 투여량)과 같은 다른 인자에 따라 달라질 수 있다.
본원에 개시된 항체, 항체-인코딩 폴리뉴클레오티드 및/또는 조성물을 투여하기 위한 유효량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 그러한 결정을 내리는 것은 당해 분야의 기술 내에 있다. 당업자는 투여되어야 하는 투여량이 예를 들어 본원에 개시된 항체, 항체-인코딩 폴리뉴클레오티드 및/또는 조성물을 수용할 포유동물, 투여 경로, 특정 유형의 항체, 항체 코딩 폴리 뉴클레오티드, 항원 결합 단편, 및/또는 본원에 사용된 조성물 및 포유동물에 투여되는 기타 약물에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 적절한 용량을 선택하는 지침은 항체 및 항원 결합 단편의 치료적 용도에 관한 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어 Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357.
유효량의 항체의 일반적인 일일 복용량은 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg이다. 일부 실시예에서, 투여량은 100 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3mg/kg, 2mg/kg, 1mg/kg, 0.5mg/kg 또는 0.1mg/kg이다. 일부 실시예에서, 투여량은 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.05 mg/kg 또는 0.01 mg/kg 초과이다. 일부 실시예에서, 투여량은 약 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.2 mg/kg 또는 0.1 mg/kg이다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 하나 이상의 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체, 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물) 및 임의로, 하나 이상의 추가 치료제는 적어도 일주일에 한 번 (예를 들어, 일주일에 한 번, 일주일에 두 번, 일주일에 세 번, 일주일에 네 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번 또는 하루에 세 번) 대상에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 상이한 항체 및/또는 항원 결합 단편이 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 단편 및 적어도 하나의 추가 치료제는 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편 및 하나 이상의 추가 치료제는 2개의 상이한 조성물(예를 들어, 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 액체 조성물 및 하나 이상의 추가 치료제를 함유하는 고체 경구 조성물)로 투여된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 환약, 정제 또는 캡슐로 투여된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 서방성 경구 제형으로 투여된다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 하나 이상의 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체, 항원 결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물)을 투여하기 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제 및 하나 이상의 항체, 항원 결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체, 항원 결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물)은 하나 이상의 추가 치료제 및 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편)의 생리 활성 기간에 중첩이 있도록 대상체에 투여된다.
일부 실시예에서, 대상체는 연장된 기간(예: 최소 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년)에 걸쳐 적어도 하나의 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 제약 조성물)을 투여받을 수 있다. 숙련된 의료 전문가는 치료의 유효성을 진단하거나 추적하기 위해 (예를 들어, 암의 적어도 하나의 증상의 관찰) 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 숙련된 의료 전문가는 또한 대상체에게 투여되는 항체 또는 항원 결합 항체 단편(및/또는 하나 이상의 추가 치료제)의 실체 및 수를 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)할 수 있고 또한 치료의 효과의 평가를 기초로 하여(예를 들어, 본원에 기술되고 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여) 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 항체 단편(및/또는 하나 이상의 추가 치료제)의 대상체에 대한 투여량 또는 투여 빈도를 조정(예를 들어, 증가 또는 감소)할 수 있다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 추가 치료제는 B-Raf의 억제제, EGFR 억제제, MEK의 억제제, ERK의 억제제, K-Ras의 억제제, c-Met의 억제제, 역형성 림프종 키나제(anaplastic lymphoma kinase, ALK) 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 억제제, Akt의 억제제, mTOR의 억제제, 이중 PI3K/mTOR 억제제, 브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase, BTK)의 억제제 및 아이소시트르산탈수소효소(Isocitrate dehydrogenase) 1 (IDH1) 및/또는 아이소시트르산탈수소효소 2 (IDH2)의 억제제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 추가 치료제는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1 (indoleamine 2,3-dioxygenase-1, IDO1)(예를 들어, 에파카도스타트(epacadostat))의 억제제이다.
일부 실시예에서, 추가 치료제는 HER3의 억제제, LSD1의 억제제, MDM2의 억제제, BCL2의 억제제, CHK1의 억제제, 활성화된 고슴도치 신호 경로(activated hedgehog signaling pathway)의 억제제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 억제제, 및 에스트로겐 수용체를 선택적으로 분해하는 작용제를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 추가 치료제는 트라벡틴(Trabectedin), 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 트레바나닙(Trebananib), 파조파닙(Pazopanib), 세디라닙(Cediranib), 팔보시클립(Palbociclib), 에베로리무스(everolimus), 플루오로피리미딘(fluoropyrimidine), IFL, 레고라페닙(egorafenib), 레올리신(Reolysin), 알림타(Alimta), 지카디아(Zykadia), 수니티닙(Sutent), 템시롤리무스(temsirolimus), 악시티닙(axitinib), 에베로리무스, 소라페닙, 보트리엔트(Votrient), 파조파닙(Pazopanib), IMA-901, AGS-003, 카보잔티닙(cabozantinib), 빈플루닌(Vinflunine), Hsp90 억제제, Ad-GM-CSF, 테마졸로미드(Temazolomide), IL-2, IFNa, 빈블라스틴(vinblastine), 탈로미드(Thalomid), 다카바진(dacarbazine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) , 레날리도마이드(lenalidomide), 아자시티딘(azacytidine), 레날리도마이드(lenalidomide), 보르테조밉(bortezomid), 암루비신(amrubicine), 카르필조밉(carfilzomib), 프랄라트렉 세이트(pralatrexate) 및 엔자스타우린(enzastaurin)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 추가 치료제는 아쥬반트, TLR 작용제, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 알파, IL-1, HMGB1, IL-10 길항제, IL-4 길항제, IL-13 길항제, IL-17 길항제, HVEM 길항제, ICOS 효능제, CX3CL1을 표적으로 하는 치료제, CXCL9를 표적으로 하는 치료제, CXCL10을 표적으로하는 치료제, CCL5를 표적으로 하는 치료제, LFA-1 효능제, ICAM1 효능제 및 셀렉틴(Selectin) 효능제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. .
일부 실시예에서, 카보플라틴, 납-파클리탁셀, 파클리탁셀, 시스플라틴, 페메트렉시드, 젬시타빈, FOLFOX 또는 FOLFIRI가 대상체에게 투여된다.
일부 실시예에서, 추가 치료제는 항-OX40 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체 또는 항-GITR 항체이다.
항-PD-1 항체를 변형 및 사용하는 방법은 예를 들어 US20170247454, US 20170081409 A1, US 20170044259 A1 및 US 20160159905 A1에 설명되어 있다. 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
약제학적 조성물 및 투여 경로
또한 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)를 함유하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편 중 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개)은 임의의 조합으로 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 의도된 투여 경로(예를 들어, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 피내, 피하 또는 복강 내)에 적합하도록 제형화된다. 조성물은 멸균 희석제(예: 멸균수 또는 식염수), 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 항균제 또는 항진균제, 아스코르브산 또는 중아 황산나트륨과 같은 항산화제, 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 당(예: 덱스트로스)과 같은 등장제, 폴리알코올(예: 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염 (예: 염화나트륨), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 리포좀 현탁액은 또한 약제학적으로 허용되는 담체로 사용될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제4,522,811호 참조). 조성물의 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알로 제형화되고 밀봉될 수 있다. 필요한 경우 (예를 들어, 주사 가능한 제형에서와 같이), 예를 들어 레시틴 또는 계면활성제와 같은 코팅을 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제(예: 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 포함함으로써 연장될 수 있다. 대안적으로, 제어 방출은 생분해성, 생체적합성 중합체(예: 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리 무수물, 폴리 글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리 락트산; Alza Corporation 및 Nova Pharmaceutical, Inc.)를 포함할 수 있는 임플란트 및 마이크로 캡슐화된 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나 이상을 함유하는 조성물은 투여 단위 형태(즉, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 물리적으로 분리된 단위)로 비경구(예를 들어, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 피내, 피하 또는 복강 내) 투여용으로 제형화될 수 있다.
조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물(예: 원숭이)에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치사량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 치료 지수는 LD50:ED50의 비율이다. 높은 치료 지수를 나타내는 제제가 선호된다. 약제가 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 경우 잠재적인 손상을 최소화하도록 주의해야 한다(즉, 원치 않는 부작용 감소). 독성 및 치료 효능은 다른 표준 의약품 절차에 의해 결정될 수 있다.
세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 대상체(예: 개, 고양이 또는 판다)에 사용하기 위해 주어진 약제의 적절한 용량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항체 단편)의 치료학적 유효량은 대상체(예: 암에 걸린 것으로 확인된 대상체) 또는 질병에 걸릴 위험이 있는 것으로 확인된 대상체(예: 이전에 암이 발병했지만 지금은 치료된 대상체)에서 대상체의 질환을 치료(예: 암세포를 죽임), 대상체(예를 들어, 개, 고양이 또는 판다)에서 질병의 하나 이상의 증상의 심각도, 빈도 및/또는 지속 기간을 감소시키는 양일 될 것이다. 본원에 기술된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편의 유효성 및 투여량은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 건강 관리 전문가 또는 수의사에 의할 뿐만 아니라 대상체(예: 개, 고양이 또는 판다에서 질병의 하나 이상의 증상의 관찰에 의해 결정될 수 있다. 특정 인자는 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다(예: 질병 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 기타 질병의 존재).
예시적인 용량은 대상체의 체중 킬로그램 당 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편의 밀리그램 또는 마이크로 그램 양(예를 들어, 약 1 μg/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 μg/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 μg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 10 μg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 10 μg/kg 내지 약 0.5 mg/kg; 또는 약 1 μg/kg 내지 약 50 μg/kg)을 포함한다. 이러한 용량은 광범위한 범위를 포함하지만, 당업자는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 치료제의 효능이 변하고 유효량은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 일반적으로 처음에는 상대적으로 낮은 용량을 투여하고, 담당 의료 전문가 또는 수의사 (치료적용의 경우) 또는 연구자(개발 단계에서 계속 작업중인 경우)는 적절한 반응이 나타날 때까지 이후에 점차적으로 용량을 늘릴 수 있다. 또한, 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 생체 내 항체 또는 항체 단편의 반감기를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 본 개시 내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 다양한 용도를 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
실시예
본 발명이 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1. 마우스 항-dPD-1 항체 생성
개의 PD-1 (dPD-1; 서열번호 41)에 대한 마우스 항체를 생성하기 위해, 6-8 주령 암컷 BALB/c 마우스에 개 PD-1로 면역화시켰다. 항-dPD-1 항체는 하기 기술되고 도 1A 및 1B에 도시된 방법에 의해 수집되었다.
마우스 면역화(Immunization of mice)
6-8 주령 암컷 BALB/c 마우스는 100 ㎍/ml 농도의 20 ㎍/마우스로 His-태그된 개의 PD-1 단백질로 면역화되었다. His 태깅된 개의 PD-1 단백질을 아쥬반트로 유화시키고 마우스 등 쪽의 4개 위치에 주입하였다. 첫 번째 피하 (s.c.) 주사의 경우, 희석된 항원을 동량의 Complete Freund’s Adjuvant (CFA)로 유화시켰다. 다음 피하 주사에서 상기 단백질은 동량의 Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA)로 유화시켰다. 세 번째 주사 또는 추가 면역화(booster immunization) 3일 후, 혈액 (혈청)을 수집하고 ELISA를 사용하여 항체 역가를 분석하였다.
또 다른 실험에서, 개 PD-1을 코딩하는 발현 플라스미드를 마우스에 주사함으로써 6-8 주령 암컷 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 항원을 암호화하는 플라스미드를 1000 ㎍/ul 농도로 유전자 총을 사용하여 마우스 당 60㎍ 마우스의 경골 전방 근육 (근육 내 주사, i.m. 주사)에 주사하였다. 두 번의 주사 사이에 최소 14일 동안 최소 4번의 주사가 수행되었다. 마지막 면역화 7일 후 혈액(혈청)을 수집하고 혈청을 ELISA로 항체 역가에 대해 테스트하였다.
면역화를 강화하기 위한 절차는 또한 이전 면역화 (플라스미드를 주입하거나 단백질을 주입함으로써) 적어도 14일 후에 수행되었다. 표면에 PD-1 항원을 발현하는 CHO 세포를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥 주사하였다. 비장은 주사 후 4일 후에 수집되었다.
SP2/0 세포와 비장 세포의 융합
비장 조직을 분쇄하였다. 비장 세포는 먼저 CD3ε Microbeads 및 Anti-Mouse IgM Microbeads에 의해 선택된 다음 SP2/0 세포와 융합되었다. 이어서 세포를 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT) 배지와 함께 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다.
하이브리도마의 1 차 스크리닝
96-웰 플레이트에서 하이브리도마 상청액의 1 차 스크리닝은 표준 절차에 따라 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)를 사용하여 수행되었다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 스크리닝 전에 96-웰 플레이트 (웰당 2x104 세포)에 첨가했다. 50㎕의 상청액 및 인간 Fc-태킹된 개의 PD-L1 단백질을 사용하였다. 실험에 사용된 항체는 1) 플루오레세인(PE)-접합된 AffiniPure F(ab)2 단편 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 단편 특이적, 및 2) 플루오레세인(FITC)-접합된 AffiniPure F(ab)2 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적인 것이었다.
서브-클로닝
lonePix2를 사용하여 서브-클로닝을 수행하였다. 요컨대, 1 차 스크리닝 중에 확인된 양성 웰을 반고체 배지로 옮기고 IgG 양성 클론을 확인하고 테스트하였다. FITC 항-마우스 IgG Fc 항체가 사용되었다.
복수액 항체(Ascites fluid antibodies)
1×106개의 양성 하이브리도마 세포를 B-NDG® 마우스 (Beijing Biocytogen, Beijing, China)에 복강 내 주사하였다. 단클론 항체는 마우스의 복강 내에서 하이브리도마 세포를 성장시켜 생산되었다. 하이브리도마 세포는 증식하여 생쥐의 복부에서 복수액을 생성하였다. 액체에는 나중에 사용하기 위해 수확할 수 있는 고농도의 항체가 포함되어 있다.
항체 정제
복수액의 항체는 GE AKTA 단백질 크로마토그래피 (GE Healthcare, Chicago, Illinois, United States)를 사용하여 정제되었다. 13-1B9("1B9"), 12-4A7("4A7") 및 12-1D8("1D8")은 상기 기술된 방법에 의해 생성된 마우스 항체 중 하나였다.
항체의 VH, VL 및 CDR 영역을 결정하였다. 1B9의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 1-6 (Kabat 넘버링) 또는 서열번호 19-24 (Chothia 넘버링)에 표시된다.
4A7의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 7-12 (Kabat 넘버링) 또는 서열번호 25-30 (Chothia 넘버링)에 표시된다.
1D8의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 13-18 (Kabat 넘버링) 또는 서열번호 31-36 (Chothia 넘버링)에 표시된다.
키메라 항체
1B9, 4A7 및 1D8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 기반으로 1B9-mHvKv-dIgG4, 4A7-mHvKv-IgG4 및 1D8-mHvKv-IgG4를 포함하는 키메라 항-dPD-1 항체가 생성되었다. 이러한 키메라 항체는 개 IgG4 항체의 불변 도메인 (예를 들어, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인 포함)과 함께 상응하는 마우스 항-dPD-1 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 가지고 있다. 개 IgG4 중쇄의 불변 도메인에 대한 서열은 서열번호 69에 표시된다. 개 IgG 경쇄의 불변 도메인에 대한 서열은 서열번호 70에 표시된다.
실시예 2. 마우스 항체의 개화(caninization)
개화의 시작점은 마우스 항체 (예: 1B9 및 1D8)였다. 이들 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열을 결정하였다.
상이한 변형 또는 치환을 포함하는 1B9에 대한 3개의 개화 중쇄 가변 영역 변이체(서열번호 49-51) 및 3개의 개화 경쇄 가변 영역 변이체(서열번호 52-54)가 구축되었다.
상이한 변형 또는 치환을 포함하는 1B8에 대한 3개의 개화 중쇄 가변 영역 변이체(서열번호 42-44) 및 3개의 개화 경쇄 가변 영역 변이체(서열번호 45-48)가 구축되었다.
이들 개화 중쇄 가변 영역 변이체는 동일한 마우스 항체에 기초한 임의의 경쇄 가변 영역 변이체와 조합될 수 있다. 예를 들어, 1B9-H1(서열번호 49)은 동일한 마우스 항체 1B9 (예: 1B9-K3 (서열번호 54))를 기반으로 하는 임의의 개화 경쇄 가변 영역 변이체와 조합될 수 있으며, 상기 항체는 그에 따라 라벨링된다 (예: 1B9-H1K3).
개화 항체는 개의 IgG 항체 불변 도메인 (예를 들어, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인 포함)을 가질 수 있다. 예를 들어, 1B9-H1K1-IgG4는 마우스 항체 1B9를 기반으로 하며 개화 중쇄 가변 도메인 H1(서열번호 49) 및 개화 경쇄 가변 도메인 K1(서열번호 52)을 갖는다.
키메라 항-PD-1 항체 및 개화 항-PD-1 항체의 명칭과 서열은 아래 표에 요약되어 있다.
유형 항체명 VH 서열번호 VL 서열번호 불변영역
1B9 기반 키메라 항체 1B9-mHvKv-IgG4 59 60 Canine IgG4
1B9 기반 개화 항체 1B9-H1K1-IgG4 49 52 Canine IgG4
1B9-H1K2-IgG4 49 53 Canine IgG4
1B9-H1K3-IgG4 49 54 Canine IgG4
1B9-H2K1-IgG4 50 52 Canine IgG4
1B9-H2K2-IgG4 50 53 Canine IgG4
1B9-H2K3-IgG4 50 54 Canine IgG4
1B9-H3K1-IgG4 51 52 Canine IgG4
1B9-H3K2-IgG4 51 53 Canine IgG4
1B9-H3K3-IgG4 51 54 Canine IgG4
4A7 기반 키메라 항체 4A7-mHvKv-IgG4 55 56 Canine IgG4
1D8 기반 키메라 항체 1D8-mHvKv-IgG4 57 58 Canine IgG4
1D8 기반 개화 항체 1D8-H1K1-IgG4 42 45 Canine IgG4
1D8-H1K2-IgG4 42 46 Canine IgG4
1D8-H1K3-IgG4 42 47 Canine IgG4
1D8-H1K4-IgG4 42 48 Canine IgG4
1D8-H2K1-IgG4 43 45 Canine IgG4
1D8-H2K2-IgG4 43 46 Canine IgG4
1D8-H2K3-IgG4 43 47 Canine IgG4
1D8-H2K4-IgG4 43 48 Canine IgG4
1D8-H3K1-IgG4 44 45 Canine IgG4
1D8-H3K2-IgG4 44 46 Canine IgG4
1D8-H3K3-IgG4 44 47 Canine IgG4
1D8-H3K4-IgG4 44 48 Canine IgG4
실시예 3. 마우스 항-dPD-1 항체의 시험관 내 테스트: 개 PD-1(dPD-1) 및 개 PD-L1(dPD-L1)의 결합 차단
항-dPD-1 항체가 dPD-1과 이의 리간드 dPD-L1 사이의 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 차단 분석을 수행하였다.
200μL의 개 PD-L1 단백질(Fc Tag) (250μg/mL) (Sino Biological, Beijing; Cat# 70110-D02H)을 1.94μL의 EZ-Link® Sulfo-NHS-LC-Biotin (10mM)과 혼합하였다. 이후 혼합물을 PD MiniTrap G-10 컬럼으로 탈염하고 향후 사용하기 위해 -20 ℃에서 보관하였다.
항-dPD-1 키메라 항체를 마우스 복수액으로부터 수집하고 크로마토그래피로 정제하였다. 개 PD-1로 일시적으로 형질감염된 25μl CHO 세포를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 정제된 항체를 원하는 최종 농도로 적정하고, 4℃에서 웰당 25μl로 각 웰에 첨가한 후 30 분 동안 인큐베이션 하였다.
바이오틴(Bitoin) 표지된 dPD-L1을 각 웰에 첨가하였다(각 웰에서 최종 농도는 5μg/ml). 상기 세포, Bitoin 표지된 dPD-L1 및 상기 항체를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다.
인산 완충 식염수 (PBS)로 2회(1200rpm, 5분) 세척한 후, 50μl의 PE 표지 Streptavidin (Streptavidin-PE)을 1:100으로 희석하여 각 웰에 넣고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, PBS 세척하였다 (1200 rpm, 5분). 20 ㎕의 PBS를 첨가하였다. PE에 대한 신호는 유세포 분석 (Intellicyt)에 의해 검출되었다.
도 3에 도시된 바와 같이, 키메라 항-dPD-1 항체 4A7-mHvKv-dlgG4, 1D8-mHvKv-dlgG4, 1B9-mHvKv-dlgG4의 농도가 감소하면 PE에 대한 신호가 증가하여(x 축), 개 PD-1과 개 PD-L1 사이의 결합이 3개의 항-dPD-1 항체에 의해 차단되었음을 시사한다.
실시예 4. 인간, 마우스 및 개-마우스 키메라 PD-1, 판다 PD-1 및 고양이 PD-1에 대한 항-dPD-1 항체의 교차 반응성
각 실험에서 CHO 세포는 인간 PD- 1(hPD-1, 서열번호 37), 마우스 PD-1 (mPD-1, 서열번호 38), 키메라(마우스 및 개) PD-1 (chidPD-1, 서열번호 40) 또는 판다 PD-1 (pPD-1, 서열번호 61)로 형질감염되었다.
25 μl CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 25μl의 정제된 항-dPD-1 키메라 항체 (10μg/ml) (4A7-mHvKv-dlgG4, 1D8-mHvKv-dlgG4 또는 1B9-mHvKv-dlgG4)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30분간 인큐베이션 하였다.
PBS (1200 rmp, 5분)로 2회 세척한 후 FITC 표지된 항-개 IgG Fc 항체 (anti-dIgG Fc-FITC)를 각 웰에 1:100 희석하여 첨가하고 4℃에서 30분간 인큐베이션한 후, PBS 세척하였다 (1200 rmp, 5분). FITC에 대한 신호는 유세포 분석에 의해 결정되었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 4A7-mHvKv-dlgG4, 1D8-mHvKv-dlgG4 및 1B9-mHvKv-dlgG4는 인간 PD-1 또는 마우스 PD-1과 교차 반응하지 않았지만 chidPD-1과 강한 결합 활성을 가졌다. 판다 PD-1과 관련하여, 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1D8-mHvKv-dlgG4는 pPD-1과 약간의 교차 반응을 보였고, 1B9-mHvKv-dlgG4는 pPD-1과 강한 결합 활성을 가졌다 (도 5). 도 4 및 도 5에서 NC는 음성 대조군을 나타낸다.
CHO 세포를 고양이 PD-1 (cPD-1, 서열번호 62) 및 EGFP를 발현하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 25μl의 정제된 항-dPD-1 키메라 항체 (10μg/ml)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. PBS(1200 rmp, 5분)로 2회 세척한 후 Alexa Fluor 647 표지된 항-개 IgG Fc 항체 (항-dIgG Fc-647)를 각 웰에 1:500 희석액으로 첨가하고 4℃에서 30분 후 PBS 세척하였다(1200 rmp, 5분). GFP 및 FITC에 대한 신호는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 결과는 1B9-mHvKv-dlgG4가 고양이 PD-1에 결합하지 않았음을 보여준다. 그러나 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1D8-mHvKv-dlgG4는 고양이 PD-1과 일부 결합 활성을 가졌다 (도 6).
실시예 5. 판다 PD-1, 개 PD-1 및 고양이 PD-1에 대한 결합 활성에 대한 EC50
각 실험에서 CHO 세포는 판다 PD-1, 개 PD-1 또는 고양이 PD-1로 형질감염되었다.
25 μl CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 농도가 다른 25μl의 정제된 항-dPD-1 키메라 항체를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30 분 동안 배양하였다.
PBS(1200 rmp, 5분)로 2회 세척한 후 Alexa Fluor 647 표지된 항-개 IgG Fc 항체 (항-dIgG Fc-647) 50μl를 1:1000 희석으로 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션한 후, PBS 세척하였다 (1200 rmp, 5분). 그 후 30 ㎕의 PBS를 첨가하였다. Alexa Fluor 647에 대한 신호는 유세포 분석에 의해 결정되었으며, 형광 강도 (MFI)의 평균 곡선을 사용하여 EC50을 결정하였다.
도 7에서, CHO 세포를 판다 PD-1로 형질감염시켰다. 도 7은 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1B9-mHvKv-dlgG4의 상이한 농도에서의 MFI를 보여준다. EC50이 결정되었다. 그 결과는 1B9-mHvKv-dlgG4가 판다 PD-1과 강한 결합 활성을 가지고 있음을 보여준다.
항체 판다 PD-1의 EC50 (nM)
4A7-mHvKv-dIgG4 385.5
1B9-mHvKv-dIgG4 2.866
도 8에서, CHO 세포를 개 PD-1로 형질감염시켰다. 도 8은 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1B9-mHvKv-dlgG4의 상이한 농도에서의 MFI를 보여준다. EC50이 결정되었다. 결과는 두 항체가 개 PD-1과 강한 결합 활성을 가지고 있음을 보여준다.
항체 개 PD-1의 EC50 (nM)
4A7-mHvKv-dIgG4 4.81
1B9-mHvKv-dIgG4 4.52
도 9에서, CHO 세포를 고양이 PD-1 및 EGFP를 발현하는 발현 벡터로 형질 감염시켰다. 농도가 다른 25μl의 정제된 항-dPD-1 키메라 항체를 각 웰에 첨가하였다. PBS (1200 rmp, 5분)로 2회 세척한 후 Alexa Fluor 647 표지된 항-개 IgG Fc 항체 (anti-dIgG Fc-647) 50μl를 1:500 희석으로 각 웰에 첨가한 다음, 4℃에서 30분 인큐베이션 하고, PBS 세척하였다(1200 rmp, 5분). 그 후 30㎕의 PBS를 첨가하였다. 도 9는 4A7-mHvKv-dlgG4 및 1D8-mHvKv-dlgG4의 상이한 농도에서의 MFI를 보여준다. EC50도 데이터에서 결정되었다. 그 결과는 두 항체가 고양이 PD-1과 강한 결합 활성을 가지고 있으며 4A7-mHvKv-dIgG4에 대한 EC50이 1D8-mHvKv-dlgG4보다 우수하다는 것을 보여준다.
항체 고양이 PD-1의 EC50 (nM)
4A7-mHvKv-dIgG4 1.528
1D8- mHvKv-dlgG4 7.291
실시예 6. 항-dPD-1 항체의 결합 친화성
항-dPD-1 항체의 결합 친화도는 Biacore (Biacore, INC, Piscataway N.J.)를 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 측정되었다.
히스티딘 태깅된 개 PD-1 단백질 (dPD-1-His)을 3.34 μg/ml의 최종 농도로 희석하고 Amine Coupling Kit (GE Healthcare; Cat# BR100050)를 사용하여 CM5 칩에 고정하여 원하는 단백질 밀도(약 90 응답 단위(response units, RU))을 얻었다. 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 또는 0.625 nM 농도의 항-dPD-1 항체를 120~240초 동안 30 μL/min으로 주입하였다. 해리는 600초 동안 모니터링되었다. 칩은 글리신 (pH 1.5, 30μL/min, 16초)으로 각 적정을 마지막으로 주입한 후 재생성되었다. 1D8-mHvKv-dlgG4에 대한 결과가 일 예로 도 10에 도시되어 있다. 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 3.0 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델 ( (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110)에 적용하여 동역학적 결합 속도 (association rate, kon) 및 해리 속도 (dissociation rate, koff)를 동시에 얻었다. 친화도는 운동 속도 상수 (KD = koff/kon)의 식에서 추론되었다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 매개 변수 (예를 들어, 항체 농도)에 대한 적절한 조정을 갖는 동일한 방법이 각각의 시험된 항체에 대해 수행되었다. 시험된 항체에 대한 결과는 아래 표에 요약되어 있다.
항-dPD-1 항체 결합 속도
kon (1/Ms) 		해리 속도
koff (1/s) 		친화도
KD (M)
1D8-H1K1-dIgG4 6.75E+05 3.09E-03 4.57E-09
1D8-H1K2-dIgG4 5.50E+05 2.48E-03 4.50E-09
1D8-H2K1-dIgG4 6.50E+05 3.48E-03 5.36E-09
1D8-H2K2-dIgG4 6.04E+05 2.62E-03 4.34E-09
1D8-mHVKV-dIgG4 1.44E+06 1.35E-04 9.40E-11
1B9-H1K1-IgG4 4.24E+05 4.54E-04 1.07E-09
1B9-H1K2-IgG4 4.75E+05 4.90E-04 1.03E-09
1B9-H2K1-IgG4 5.91E+05 4.54E-04 7.68E-10
1B9-H2K2-IgG4 5.77E+05 4.30E-04 7.45E-10
1B9-mHVKV-dIgG4 1.010E+06 1.260E-04 1.250E-10
4A7-mHVKV-dIgG4 5.25E+05 1.52E-04 2.90E-10
실시예 7. 키메라 및 개화 항-dPD-1 항체의 생체 내 테스트
항-dPD-1 항체를 생체 내에서 테스트하고 개에서 이러한 항체의 효과를 예측하기 위해 개화 PD-1 마우스 모델이 생성되었다. 개화 PD-1 마우스 모델은 키메라 PD-1 단백질 (서열번호 40)을 발현하도록 조작되었으며, 여기서 마우스 PD-1 단백질의 세포 외 영역의 일부가 상응하는 개 PD-1 세포 외 영역으로 대체되었다. 개화 마우스 모델은 개와 마우스 PD-1을 발현하는 일반 마우스의 임상 결과 간의 차이를 현저히 감소시킴으로써 임상 환경에서 새로운 치료(therapeutic treatment)를 테스트하기 위한 새로운 도구를 제공한다.
결장 암종(colon carcinoma) 모델에서 항-dPD-1 항체가 생체 내 종양 성장에 미치는 영향에 대해 테스트되었다. MC-38 암 종양 세포 (결장 선암 세포)를 마우스에 피하 주사하였다. 마우스의 종양이 150±50mm3의 부피에 도달하면 마우스를 종양의 부피에 따라 무작위로 다른 그룹에 배치하였다 (각 그룹에 5 마리의 마우스).
그 후 마우스에 생리 식염수(PS) 및 항-dPD-1 항체를 아래 표에 나타낸 바와 같이 복강 내 투여에 의해 주사하였다. 항체는 매주 둘째 날과 다섯째 날에 투여되었다. 대부분의 그룹은 총 6 회 투여하였다. G12는 총 2 회만 투여하였다.
그룹 마우스 수 항체 투여량
（mg/kg） 		루트 빈도 총 투여
G1 4 PS (control) - i.p. Day 2,5/wk 6
G2 4 1B9-H1K1-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G3 4 1B9-H1K2-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G4 4 1B9-H2K1-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G5 4 1B9-H2K2-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G6 4 1D8-H1K1-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G7 4 1D8-H1K2-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G8 4 1D8-H2K1-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G9 4 1D8-H2K2-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G10 4 1D8-mHvKv-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G11 4 1B9-mHvKv-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 6
G12 4 4A7-mHvKv-dIgG4 3mg/kg i.p. Day 2,5/wk 2
주입된 부피는 3mg/kg에서 마우스의 무게를 기준으로 계산되었다. 종양의 장축과 단축의 길이를 측정하고 종양의 부피를 0.5×(장축)×(단축)2로 계산하였다. 마우스의 체중은 또한 주입 전, 마우스가 다른 그룹에 배치되었을 때(첫 번째 항체 주입 전), 치료 기간 동안 일주일에 두 번, 그리고 안락사 전에 측정되었다.
종양 성장 억제 백분율 (TGI%)은 다음 공식을 사용하여 계산되었다: TGI(%) = [1- (Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100. Ti는 i일에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. T0는 0일에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. Vi는 i일에 대조군의 평균 종양 부피이다. V0은 0일에 대조군의 평균 종양 부피이다.
통계 분석을 위해 T-테스트를 수행하였다. 60%보다 높은 TGI%는 종양 성장의 강력한 억제를 나타낸다. P <0.05는 유의한 차이를 나타내는 임계값이다.
전체 처리기간 동안 마우스의 체중을 모니터링 하였다. 다른 그룹의 마우스의 체중은 모두 증가하였다(도 11 및 도 12). 그룹 간에 뚜렷한 체중 차이는 관찰되지 않았다. 해당 결과는 테스트된 항체가 잘 용인되고 (tolerated) 마우스에 독성이 없음을 보여주었다.
항-dPD-1 항체로 치료된 대부분의 그룹에서 종양 크기는 대조군에 비해 더 적은 정도로 증가하였다(도 13-15). 24일(그룹화 후 24일)의 TGI%도 아래 표와 같이 계산되었다.
종양 부피(mm3) 생존 TGI% P value
Day
0		 Day
10		 Day
17		 Day
24		 체중 종양 부피
대조군 G1 137
±16		 903
±225		 1605
±537		 2956
±932		 4/4 n.a. n.a. n.a.
처리군 G2 142
±16		 315
±79		 527
±98		 952
±230		 4/4 71.3% 0.170 0.082
G3 121
±9		 185
±27		 354
±69		 558
±138		 4/4 84.5% 0.042 0.044
G4 130
±20		 258
±80		 326
±100		 735
±284		 4/4 78.6% 0.005 0.063
G5 119±14 296
±67		 304
±110		 940
±583		 4/4 70.9% 0.042 0.116
G6 131±22 796
±111		 1085
±207		 2687
±663		 4/4 9.3% 0.452 0.822
G7 146±9 350
±172		 667
±415		 1431
±954		 4/4 54.4% 0.088 0.297
G8 134±21 278
±62		 371
±149		 723
±255		 4/4 79.1% 0.004 0.060
G9 140±16 278
±57		 405
±138		 970
±440		 4/4 70.5% 0.118 0.102
G10 124±18 213
±37		 290
±63		 505
±146		 4/4 86.5% 0.002 0.041
G11 134±20 284
±68		 383
±93		 766
±253		 4/4 77.6% 0.027 0.064
G12 141±14 184
±6		 314
±69		 990
±358		 4/4 69.9% 0.012 0.096
위의 결과는 모든 항-dPD-1 항체가 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있음을 보여준다. 이 중 G3(1B9-H1K2-dIgG4)와 G10(1D8-mHvKv-dIgG4)이 가장 높은 종양 성장 억제율(TGI%)을 나타냈다. 또한, G12에서 동물은 4A7-mHvKv-dIgG4를 2회만 투여받았으며 종양 억제 효과는 여전히 현저하였다.
다른 구체예
본 발명이 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 제한하지 않음을 이해하여야 한다. 다른 관점(aspect), 장점(advantage) 및 변형(modification)이 다음의 청구범위 내에있다.
SEQUENCE LISTING <110> Beijing Biocytogen Co., Ltd <120> ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 1 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Ser Phe Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Arg Val Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Gln Phe Gly Phe Ser Trp Leu Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Gln Gln Tyr Tyr Ser Asn Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Asn Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Thr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 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Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Ile Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Val Ser Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys 210 215 220 Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Ala 225 230 235 240 Lys Glu Cys Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro Gly 245 250 255 Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 290 295 300 Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala 355 360 365 His Gln Pro Asn Val Tyr 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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 His Cys Val Thr Gly Val Trp Pro Arg His Tyr Tyr Gly Met Asp His 115 120 125 Trp Gly Asn Gly Thr Ser Leu Phe Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser 145 150 155 160 Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val 210 215 220 Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu 225 230 235 240 Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg 260 265 270 Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val 290 295 300 His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly 325 330 335 Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile 340 345 350 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val 355 360 365 Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val 370 375 380 Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val 385 390 395 400 Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr 405 410 415 Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys 435 440 445 Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu 450 455 460 Ser His Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 70 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 70 Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp 1 5 10 15 Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln 35 40 45 Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser 65 70 75 80 His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp 100 105 110 <210> 71 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 71 Thr Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln 1 5 10 15 Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln Asp 35 40 45 Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His 65 70 75 80 Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp 100 105 <210> 72 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 72 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Phe Trp Met Asn Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Ala Gly Leu 50 55 60 Asp Trp Ile Gly Arg Val Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Ile Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Thr Gln Phe Gly Phe Ser Trp Leu Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 145 150 155 160 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His 210 215 220 Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr 225 230 235 240 Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp 385 390 395 400 Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala 405 410 415 Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 73 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 73 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala 20 25 30 Gly Ser Ala Gly Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe 130 135 140 Gln Pro Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val 165 170 175 Asp Gly Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser 195 200 205 Thr Glu Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys 210 215 220 Ser Leu Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln 225 230 235 240 Arg Val Asp

Claims (43)

  1. 다음을 포함하는 PD-1 (Programmed Cell Death Protein 1)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    상보성 결정 영역 (CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH),
    여기서 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 VH와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함; 및
    CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL),
    여기서 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함,
    여기서 상기 선택된 VH CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열 및 선택된 VL CDR, 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나를 포함함:
    (1) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3으로 표시되고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 5, 6으로 표시되며;
    (2) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 7, 8, 9로 표시되고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 10, 11, 12로 표시되며;
    (3) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 13, 14, 15로 표시되고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 16, 17, 18로 표시됨.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VH는 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CDR 1, 2, 3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 VH는 각각 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 10, 11 및 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CDR 1, 2, 3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 VH는 각각 서열번호 13, 14 및 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CDR 1, 2, 3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개의 PD-1(canine PD-1)에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca, 자이언트 판다) 또는 펠리스 카투스(Felis catus, 국내 고양이)의 PD-1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 개화 항체(caninized antibody) 또는 이의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 다음을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산:
    (1) 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VH는 서열번호 52, 53, 54 또는 60으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
    (2) 각각 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VL은 서열번호 49, 50, 51 또는 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
    (3) 각각 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VH는 서열번호 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
    (4) 각각 서열번호 10, 11 및 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VL은 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
    (5) 각각 서열번호 13, 14, 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VH는 서열번호 45, 46, 47, 48 또는 58로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함;
    (6) 각각 서열번호 16, 17, 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 여기서 상기 VL은 서열번호 42, 43, 44 또는 57로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이룰 때 PD-1에 결합함.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산.
  10. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산.
  11. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산.
  12. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 10, 11 및 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산.
  13. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 13, 14 및 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산.
  14. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VL과 쌍을 이룰 때 상기 VH는 개의 PD-1에 특이적으로 결합하거나, VH와 쌍을 이룰 때 상기 VL은 개의 PD-1에 특이적으로 결합하는, 핵산.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편은 개화(caninized) 면역 글로불린 중쇄 또는 이의 단편이고, 상기 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편은 개화(caninized) 면역 글로불린 경쇄 또는 이의 단편인, 핵산.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca, 자이언트 판다) 또는 펠리스 카투스(Felis catus, 국내 고양이)의 PD-1에 결합하는, 핵산.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 cDNA인, 핵산.
  19. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산 중 하나 이상을 포함하는 벡터.
  20. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산 중 2개의 핵산을 포함하는 벡터로, 상기 벡터는 PD-1에 함께 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 코딩하는 벡터.
  21. 각 벡터가 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산 중 하나를 포함하는 벡터 쌍(a pair of vectors)으로, 상기 벡터 쌍은 함께 PD-1에 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 함께 코딩하는 벡터 쌍.
  22. 제19항 또는 제20항의 벡터, 또는 제21항의 벡터 쌍을 포함하는 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인, 세포.
  24. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산 중 하나 이상을 포함하는 세포.
  25. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산 중 2개를 포함하는 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 2개의 핵산은 함께 PD-1에 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 함께 코딩하는, 세포.
  27. 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법:
    (a) 세포가 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하기에 충분한 조건하에 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 세포에 의해 생산된 항체 또는 항원 결합 단편을 수집하는(collecting) 단계.
  28. 선택된 VH 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 선택된 VL 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 PD-1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 선택된 VH 서열 및 선택된 VL 서열은 다음 중 하나인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (1) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 49, 50, 51 또는 59이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 52, 53, 54, 또는 60임;
    (2) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 42, 43, 44 또는 57이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 45, 46, 47, 48 또는 58임;
    (3) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 55이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 56임.
  29. 제28항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 49의 서열을 포함하고 상기 VL은 서열번호 53의 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 제28항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 43의 서열을 포함하고 상기 VL은 서열번호 45의 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개의 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 개화(caninized) 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 아일루로포다 멜라놀루카(Ailuropoda melanoleuca, 자이언트 판다) 또는 펠리스 카투스(Felis catus, 국내 고양이)의 PD-1에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 치료제에 공유 결합된 제1항 내지 제7항 및 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 치료제는 세포 독성 또는 세포 증식 억제제(cytotoxic or cytostatic agent)인 항체 약물 접합체.
  36. 제1항 내지 제7항 및 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제34항 또는 제35항의 항체-약물 접합체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 대상체는 고형 종양을 가지는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 암은 절제 불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종인, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 암이 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 두경부 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck, SCCHN), 두경부암(head and neck cancer), 신 세포 암종(renal cell carcinoma, RCC), 흑색종(melanoma), 방광암(bladder cancer), 위암(gastric cancer), 요로 피암(urothelial cancer), 메르켈 세포 암종(Merkel-cell carcinoma), 삼중 음성 유방암 (triple-negative breast cancer, TNBC) 또는 결장 직장 암종(colorectal carcinoma)인, 방법.
  40. 종양 세포를 제1항 내지 제7항 및 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제34항 또는 제35항의 항체-약물 접합체를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 성장 속도를 감소시키는 방법.
  41. 종양 세포를 제1항 내지 제7항 및 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제34항 또는 제35항의 항체-약물 접합체를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 세포를 사멸시키는 방법.
  42. 제1항 내지 제7항 및 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 약제학적 조성물.
  43. 제34항 또는 제35항의 항체 약물 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
KR1020217018233A 2018-11-19 2019-11-20 항-pd-1 항체 및 이의 용도 KR20220089688A (ko)

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