JP6121903B2 - 抗ngf抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本開示は、NGFと結合しそれを中和できる、結合タンパク質の新規ファミリー、CDRグラフト化抗体、哺乳動物化(例えば、ウシ化(bovanized)、ラクダ化、イヌ化、ウマ化(equinized)、ネコ化(felinized)、ヒト化など)抗体およびその断片を提供する。本開示は、NGFを阻害するための治療手段を提供し、またNGFのレベルの増大と関連している疾患、特に、炎症性障害を治療するための組成物および方法を提供する。
配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18、配列番号22、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号177、配列番号179、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号190、配列番号192、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号206、配列番号207からなる群から選択される配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および
配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号20、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42および配列番号44、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号181、配列番号183、配列番号186、配列番号188、配列番号191、配列番号193、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202からなる群から選択される配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合断片に関する。
用語「アクセプター」および「アクセプター抗体」とは、1つまたは複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%を提供するまたはコードする抗体または核酸配列を指す。用語「アクセプター」とは、定常領域を提供するまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を包含する。この用語はまた、1つまたは複数のフレームワーク領域および定常領域を提供するまたはコードする、抗体アミノ酸または核酸配列を包含する。例えば、用語「アクセプター」は、1つまたは複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%を提供するまたはコードする、ヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指すこともある。このようなアクセプターは、ヒト抗体の1つまたは複数の特定の位置で生じない、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも(least)4個、少なくとも5個または少なくとも10個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および/またはアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能性抗体(例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体または市販の抗体)に由来するまたはそれらから得られる場合がある。
本開示は、NGFを中和する能力を含めた、NGFの生物活性または機能を結合および調節できる、結合タンパク質の新規ファミリー、マウス抗体、CDRグラフト化抗体、哺乳動物化(ウシ化、ラクダ化、イヌ化、ウマ化、ネコ化またはヒト化)抗体およびそれらの断片を提供する。したがって、本開示はまた、NGFを阻害する治療手段を提供し、NGFのレベルの増大と関連している疾患、特に、比較できる正常な対象において観察されたNGFレベルと比較される、NGFのレベルの増大が有害である疾患、状態または障害を治療するための組成物および方法を提供する。
配列番号2と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号4と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号6と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号8と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号10と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号12と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号14と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号16と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号18と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号20と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号22と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号24と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号25と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号26と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号27と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号28と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号29と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号30と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号31と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号32と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号177と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号32と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号33と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号34と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号35と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号36と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号37と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号38と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号39と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号40と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号41と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号42と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号43と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号44と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号180と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号181と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号182と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号183と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号185と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号186と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号187と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号188と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号189と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号42と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号190と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号188と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号206と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号42と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;
配列番号207と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号188と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域;および
配列番号192と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む重鎖可変領域、および配列番号193と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその抗原結合断片もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片を含む軽鎖可変領域。
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体および非マウス免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体などの抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を製造する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Morrison、Science、229:1202頁(1985年);Oiら、BioTechniques、4:214頁(1986年);Gilliesら、J.Immunol.Methods、125:191−202頁(1989年);米国特許第5,807,715号;同4,816,567号;および同4,816,397号参照のこと。さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒に、適当な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによって「キメラ抗体」(Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:851−855頁(1984年);Neubergerら、Nature、312:604−608頁(1984年);Takedaら、Nature、314:452−454頁(1985年)を製造するために開発された技術が使用され得る。
本開示のCDRグラフト化抗体は、VHおよび/またはVLの1つまたは複数のCDR領域が、本開示のマウス抗体のCDR配列で置換されている非マウス抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含み得る。任意の非マウス抗体由来のフレームワーク配列が、CDRグラフト化のための鋳型として働き得る。しかし、このようなフレームワーク上の直鎖置換は、抗原に対する結合親和性の幾分かの喪失につながる。元のマウス抗体に対して、より相同な非マウス抗体であるほど、マウスCDRを非マウスフレームワークと組み合わせることが、CDRに歪みを導入し、これが親和性を低減し得る可能性が低い。
ヒトへの治療的投与のために、免疫原性を低くさせるために、動物から得たモノクローナル抗体を修飾するプロセス(ヒト化)は、積極的に推し進められてきており、いくつかの刊行物に記載されている(Antibody Engineering:A practical Guide. Carl A.K. Borrebaeck編W.H.Freeman and Company、1992年;および上記で引用された参考文献)。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。既知ヒトIg配列は、インターネット上で利用可能なさまざまなウェブサイト(例えば、NCBIウェブサイト、Antibody Resource、および当業者に公知のもの、ならびにKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Dept. Health (1983年)(参照により本明細書に組み込む)に開示されている。追加の配列を以下の表1Aに示す。免疫原性を低減するまたは結合、親和性、結合速度、解離速度、アビディティー、特異性、半減期もしくは当技術分野で公知の任意のその他の適した抗体の特徴を低減、増強もしくは改変するために、このような移入された配列が使用され得る。
イヌへの治療的投与のために、免疫原性を低くさせるために、動物から得たモノクローナル抗体を修飾するプロセス(イヌ化)は、US7,261,890 B2 2007年)に記載されている。イヌIgG1のアミノ酸配列は、GenBank(AF354264)において提供されている。イヌIgMおよびイヌIgA重鎖両方の可変領域のアミノ酸配列の決定(Wassermanら、Biochem.、16、3160(1977年)、イヌIgAからのκ軽鎖のアミノ酸配列の決定(Wassermanら、Immunochem.、15、303(1978年))、イヌμ鎖の完全アミノ酸配列(McCumberら、Mol.Immunol.、16、565頁(1979年))が開示されており、単一イヌIgG−Aγ鎖cDNAおよび4つのイヌIgG−Aγ鎖タンパク質配列が開示された(Tangら、Vet.Immunology Immunopathology、80、259(2001年))。ヒト、マウス、ブタおよびウシIgGの保存された領域から設計された縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるイヌ脾臓cDNAライブラリーのPCR増幅が記載されている。イヌ免疫グロブリン可変ドメイン、イヌ化抗体およびそれらを製造し、使用する方法が、米国特許出願第2004/0181039号および米国特許第7,261,890号;同6,504,013号;同5,852,183号;同5,5225,539号に開示されている。
本明細書において記載された結合タンパク質は、インビボまたはインビトロでサンプル中(例えば、血清、血漿、組織、生検などの生体サンプル中)のNGFの存在を検出するための方法において使用され得る。インビトロ法は、例えば、疾患または障害、例えば、NGF関連障害を診断するために使用され得る。本方法は、(i)サンプルまたは対照サンプルを、本明細書において記載された抗NGF抗体またはその断片と接触させるステップ、および(ii)抗NGF抗体またはその断片と、サンプルまたは対照サンプル間の複合体の形成を検出するステップを含み、ここで、対照サンプルに対する、サンプルにおける複合体の形成における統計上有意な変化が、サンプル中のNGFの存在を示す。
本開示の抗体および抗体部分は、インビトロおよびインビボの両方でNGF活性を実質的に中和できるということが認められる。したがって、本開示のこのような抗体および抗体部分はまた、例えば、本開示の抗体が交差反応するNGFを含有する細胞培養物中で、本開示の抗体が交差反応するNGFを有する哺乳動物対象において、NGF活性を実質的に阻害するために使用され得る。したがって、本開示は、NGFを、本開示の抗体または抗体部分と接触させ、その結果、NGF活性が実質的に阻害されるステップを含む、NGF活性を阻害する方法を提供する。例えば、NGFを含有する、または含有すると疑われる細胞培養物において、培養物においてNGF活性を阻害するために本開示の抗体または抗体部分が培養培地に添加され得る。
本開示の抗体および抗体部分は、対象への投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。一般に、医薬組成物は、少なくとも1種の本開示の抗体または抗体部分および薬学的に許容される担体を含む。このような組成物は、例えば、哺乳動物に、組成物の有効量を投与することによって、NGFのレベルの上昇を伴う疾患または障害について、哺乳動物を治療するための方法において使用され得る。医薬組成物は、抗体または抗体部分の治療上有効な量を含み得る。本明細書において記載された医薬組成物は、障害またはその1つもしくは複数の症状を診断、検出またはモニタリングするため、障害またはその1つもしくは複数の症状を予防、治療、管理し、または寛解させるため、および/または研究のために使用され得る。本明細書において、語句「NGFのレベルの上昇」とは、確立されたまたは予め決定されたNGFのベースラインレベル、例えば、前記対象についてこれまでに確立されたレベルまたは対象の群から平均化されたレベルなどよりも大きいまたは高い、哺乳動物などの対象におけるNGFのレベルを指す。
マウス抗NGF mAbを作製するために、雌のA/Jマウスを、CFA中、25μgのヒトβNGF(R&D Systemsカタログ番号256−GF/CF)を用いて皮下に免疫処置した。動物に、IFA中、25μgのヒトβNGFを用いて3週間毎に追加免疫した。融合の4日前に、マウスに、滅菌生理食塩水中、10μgのヒトβNGFを用いて静脈内に追加免疫した。免疫処置したマウスから得た脾臓細胞を、標準技術を使用してSP2/0−Ag14骨髄腫細胞と、5:1比の脾臓対SP2/0細胞で融合した。融合の7から10日後、肉眼で見えるコロニーが観察された時点で、上清を、ビオチニル化ヒトまたはラットβNGFとの結合について捕捉ELISA形式で調べた。ELISA陽性ウェルは24ウェルプレートに拡大し、ビオチン化ラットβNGFとの結合について調べた。ヒトおよびラットNGFの両方について試験陽性のハイブリドーマ細胞株から得られた上清を、バイオアッセイ形式で評価した。対象とする細胞株を、限界希釈によってクローニングし、NGF特異的マウスモノクローナル抗体を単離した。
ハイブリドーマ上清中に抗NGF mAbが存在するかどうかを調べるために、ELISAプレートを、ヤギ抗マウスIgG Fc(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号115−005−164)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。プレートを200μlの2%乳でブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。プレートを上記のとおりに洗浄した。ハイブリドーマ上清を、PBSで5倍、25倍、125倍および1625倍希釈し、次いで、プレートウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。陽性対照は、βNGF免疫処置マウスから単離した粗血清とし(PBSで1:500希釈した)、陰性対照は、NGF以外の抗原で免疫処置したマウスに由来するハイブリドーマ上清とした。プレートを洗浄し、次いで、50ng/mlのビオチン化ヒトまたはラットβNGF50μlを添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄した。ストレプトアビジン−HRP(Thermo、カタログ番号21126)コンジュゲートを10,000で希釈し、プレートに添加した。プレートを、室温で30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、TMB基質(Invitrogen、カタログ番号00−2023)を添加した。反応を2NのH2SO4(VWR、カタログ番号BDH3500−1)を使用して停止させた。450nMの吸光度を、Spectromax 2Eプレートリーダー(Molecular Devices)で読み取った;これらの吸光度読み取り値を、表1および2に示す。数値は、マウス抗NGF抗体のビオチン化ヒトまたはラットβNGFとの結合を示す。このデータは、いくつかのハイブリドーマ上清が、抗NGF抗体を含有していたことを示す。
ハイブリドーマ上清において抗NGF mAbが、NGFがTrkA受容体と結合するのを遮断するかどうかを調べるために、ELISAプレートを、PBS中、2μg/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号109−005−008)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで3回洗浄した。プレートを200μl/ウェルのPBS中2%乳を用い、室温で1時間ブロッキングした。プレートを上記のとおりに3回洗浄した。PBS/0.1% BSA中、1μg/ml(50μl/ウェル)のラットTrkA/Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号1056−TK)を添加し、次いで、室温で1時間インキュベートした。ビオチン化ヒトNGFを力価測定し、1倍、5倍および25倍希釈した抗NGF抗体上清または0.08、0.4、2もしくは10μg/mlに希釈した精製抗NGF mAbとともに、プレートシェーカー上で室温で1時間プレインキュベートした。陰性対照は、無関係のコンディショニングされた上清とした。陽性対照は、NGFで免疫処置されたマウスから得た血清とした。プレートを洗浄し、次いで、50μlの各ビオチン化NGF/Ab混合物を、適当なウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄した。50μlのストレプトアビジン−HRP(Thermo、カタログ番号21126)を10,000希釈で添加した。プレートを室温で30分間インキュベートした。プレートを洗浄した。50μlのTMB(Invitrogen、カタログ番号00−2023)を添加し、2NのH2SO4(VWR、カタログ番号BDH3500−1)を使用して反応を停止させた。450nmの吸光度を、Spectromax 2Eプレートリーダー(Molecular Devices)で読み取り、吸光度読み取り値を、表3に示す。数値は、ビオチン化ヒトβNGFのラットTrkA/Fcキメラとの結合を示す。このデータは、いくつかのハイブリドーマ上清が抗NGF受容体遮断抗体を含有していたことを示す。
ハイブリドーマ上清において抗NGF mAbが、NGFがTrkAと結合するのを遮断した結果として下流シグナル伝達を遮断したかどうかを調べるために、Neuroscreen−1細胞(Thermo Fisher Scientific)を、10%ウマ血清、5%FBS、100ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンおよび10mMのHEPESを補給したRPMI培地中、コラーゲンIでコーティングしたフラスコ上で、37℃で、95%空気および5%CO2の加湿雰囲気中で増殖させた。ERKリン酸化アッセイのために、5×104個細胞を、コラーゲンI(Becton Dickinson)でコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに播種した。次いで、細胞を、24時間血清を欠乏させ、その後刺激した。130pMのヒトβNGF(R&D Systemsカタログ番号256−GF/CF)を、希釈したハイブリドーマ上清中に混合し(10倍、100倍、500倍または1,000倍の最終上清希釈(倍)を達成する)、混合物を37℃で15分間プレインキュベートし、その後細胞に添加した。希釈したハイブリドーマ上清各々を4連で試験した。5分刺激した後、培地を除去し、SureFire(商標)AlphaScreen細胞溶解(PerkinElmer)で置換した。次いで、細胞溶解物を、製造業者の使用説明書に従って処理し、EnVisionプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して蛍光シグナルを定量化した;蛍光データを表4に要約する。数値は、ヒトβNGFの存在下でのTrkAシグナル伝達によるERKリン酸化を示し、最大シグナルに対するシグナルのパーセンテージとして表されている。最大シグナルは、βNGFのみの存在下(ハイブリドーマ上清なし)でERKリン酸化を示す細胞からの100%の応答として定義される。このデータは、いくつかのハイブリドーマ上清が、中和抗NGF抗体を含有していたことを示す。
ハイブリドーマ上清において抗NGF mAbが、NGFがTrkAと結合するのを遮断した結果として下流シグナル伝達を遮断するかどうかを調べるために、NGF受容体TrkAおよびβ−ガラクトシダーゼの相補断片と融合しているコアクチベータータンパク質 SHC1を安定に発現するPathHunter U2OS安定細胞株をDiscoveRxから購入した。細胞を10% FBS、100ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、500μg/mlのジェネティシンG418および250μg/mlのハイグロマイシンを補給したMEM培地中、37℃で、95%空気および5% CO2の加湿雰囲気中で増殖させた。アッセイの16時間前に、2×104個細胞を、40μlの、0.5%ウマ血清を補給したMEM培地中、96ウェル半容積ブラックプレートの各ウェルに播種した。440pMのヒトβNGF(R and D Systemsカタログ番号256−GF/CF)を、希釈したハイブリドーマ上清中に混合し(10倍、100倍、500倍または1,000倍の最終上清希釈を達成する)、混合物を37℃で15分間プレインキュベートし、その後、細胞に添加した。細胞プレートを室温で5分間インキュベートし、その後、ウェルあたり10μlのNGF/抗体混合物を用いて刺激した。室温で3時間細胞誘導した後、製造業者の使用説明書に従って各ウェルに25μlのPathHunter検出試薬を添加した。1時間後に、TopCountプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して化学発光シグナルを検出した;化学発光シグナルデータは、表5に示されている。数値は、ヒトβNGFの存在下でのTrkAシグナル伝達によるβ−ガラクトシダーゼ生成を示し、最大シグナルに対するシグナルのパーセンテージとして表されている。最大シグナルは、βNGFのみの存在下(ハイブリドーマ上清なし)でのβ−ガラクトシダーゼ生成の存在下で示す細胞からの100%の応答として定義される。このデータは、いくつかのハイブリドーマ上清が、中和抗NGF抗体を含有していたことを示す。
ハイブリドーマ細胞株を、標準限界希釈技術を使用してサブクローニングした。細胞を、50、5または0.5個細胞/mLの濃度に希釈した。200μLの希釈された細胞懸濁液を、96ウェル組織培養プレートにプレーティングした。プレートを、5% CO2および約90%の相対湿度を用いて37℃でインキュベートした。7日目に肉眼で見えるコロニーについて増殖を視覚的に調べた。コロニー増殖が目に見える場合には、ウェルから得た上清を抗体製造についてスクリーニングした。表6は、サブクローン同定命名法および俗称を示す。このデータは、いくつかの抗NGF抗体が、細胞のクローン集団から単離され得ることを示す。
サブクローニングされたハイブリドーマ細胞株を、5%低IgGウシ胎仔血清(Invitrogenカタログ番号16250−078)を用いてハイブリドーマSFM(Invitrogenカタログ番号12045)に拡大した。上清を回収し、遠心分離し、濾過して細胞細片を除去し、濃縮した。抗体を、Pierce結合バッファーA(Thermo、カタログ番号21001)と1の比で混合した。抗体を組換えプロテインAセファロース(GE Healthcare、カタログ番号17−1279−04)クロマトグラフィーカラムにロードし、Pierce溶出バッファー(Thermo、カタログ番号21004)を使用して溶出し、2MのTris pH7.5を使用して中和し、次いで、PBSに透析した。この作業によって、特性決定研究のための抗NGF mAbの単離が可能になった。
イヌNGFのコーディング領域を、配列番号45および配列番号46のプライマーまたは配列番号47および配列番号48のプライマーを使用してイヌユニバーサルcDNA(Biochain Institute、カタログ番号4734565)から増幅し、哺乳動物または細菌発現ベクターに、それぞれクローニングした。PCR反応は、製造業者(Novagen、KOD Hot Start Master Mix、カタログ番号 71842−3)によって推奨されるように設定した。PCR産物を、KpnI/XbaI制限部位でpTT6ベクター(Abbott)とライゲーションすることによって、哺乳動物クローンをC末端6−His融合タンパク質(配列番号208)として作製した。鋳型として哺乳動物クローンを使用し、NdeI/XhoI制限部位でpET15B(Novagen)とライゲーションすることによって、プロ−NGF配列を有する細菌クローンを作製した。単離されたイヌNGFのDNA配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号49および配列番号50として列挙されている。この作業によって、精製のためのイヌNGFタンパク質の発現が可能になった。
細菌発現ベクター中のイヌNGFクローンを、2Lのバッフルなしフラスコにおいて、Rosetta2(DE3)大腸菌宿主(EMD Biosciences)中、overnight express auto inducing Terrific Broth(Novagen)中で37℃で一晩増殖させた。細胞を遠沈させ、細胞ペーストを、100mLのリソナーゼ(lysonase)を含む溶解バッファー(25mM Tris、300mM NaCl、10%グリセロール、0.1% Triton X 100 pH8.0)に再懸濁し、氷上で2分間超音波処理した。サンプルを15000RPMで遠心分離し、50mLの25mM Tris、6M GdHCl pH8.0中でペレットを可溶化した。サンプルを15000rpmで30分間遠心分離し、上清を10mlのIMAC樹脂上にロードした。
10mlのGE−Ni FFカラムを調製した。バッファーA:25mM Tris、6M GdHCl pH8.0、バッファーB:A+500mMイミダゾール。樹脂を平衡化し、再循環を用いてロードし、一晩、4℃で完全結合を可能にした(約10回の通過)。カラムをバッファーAで洗浄した。40mlのバッファーAと、それに続く、30mlのバッファーAを用いてバッチ溶出を実施した。5mlの画分を集め、プールした。
プールした画分を、50mM DTTを添加することによって還元し、EDTAを10mMまで添加し、室温で1時間インキュベートした。6M HClをpH4.0まで添加することによってサンプルを酸性化し、6M GdHCl pH5.0中で透析して過剰のDTTを除去した。還元/酸性化されたサンプルを、1Lの100mM Tris、1M アルギニン、5mM EDTA、5mM GSH、1mM GSSG(配列番号209) pH9.5中、4℃で4時間希釈することによって再折りたたみを実施した。再折りたたみされたタンパク質を、25mM Tris、200mM NaCl、10%グリセロールpH8.0に対して透析した。濾過によって沈殿を清澄化した。清澄化されたサンプルを濃縮し、10Kメンブレンを使用して25mM Tris、200mM NaCl、10%グリセロールpH8.0中にダイアフィルトレーションを行った。
再折りたたみされたプロ−NGFを、5mlのNi−IMAC上にロードした。バッファーA:25mM Tris、300mM NaCl、10%グリセロールpH8.0。バッファーB:A+500 mMイミダゾール。カラムをバッファーAで洗浄した。8mlの画分を集めた。直線勾配0−100%バッファーBを用いて溶出を実施した。5mlの画分を集めた。各画分のサンプルを、非還元性NuPage SLB(Invitrogen)と混合し、分析のために4−12% NuPAGE Novex Bis−Tris Midiゲル上で分離した。タンパク質を含有する画分をプールし、20mM リン酸Na、50mM NaCl、10%グリセロールpH7.4に対して透析した。
プロ−βNGFを、再懸濁バッファー中のトリプシンと混合し、氷上で30分間インキュベートした。固定された阻害剤を添加し、15分間インキュベートし、次いで、濾過した。
サンプルを、5mlのSPセファロース高性能クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare)上にロードした。バッファーA:20mM リン酸Na、50mM NaCl、10%グリセロールpH7.4。バッファーB:A+1M NaCl。カラムを、バッファーAで洗浄した。溶出は、直線勾配0−100%バッファーBを用いて実施した。5mlの画分を集めた。画分を、分析のために4−12% Criterion XT Bis−Tris Midiゲル上で分離した。タンパク質を含有する画分をプールし、PBS pH7.4中で透析し、濃縮した。
A.イヌNGF直接結合ELISA
精製マウス抗NGF mAbが、イヌβNGFと結合するかどうかを調べるために、ELISAプレートを、50μl/ウェルのイヌNGF(Abbott Laboratories)を、PBS中、1μg/mlで用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、PBS+Tweenバッファーを用いて3回洗浄した。プレートを、200μl/ウェルのPBS中の2%乳を用いて室温で1時間ブロッキングした。プレートを上記のとおりに3回洗浄した。精製抗体を0.4、2または10μg/mlに希釈した。各濃度の精製抗体50μlを、プレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄した。5000倍希釈したヤギ抗マウスIgG Fc−HRP(Thermo、カタログ番号 31439)50μlを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。50μlのTMB(Invitrogen、カタログ番号00−2023)を添加し、2NのH2SO4(VWR、カタログ番号BDH3500−1)を使用して反応を停止させた。450nmの吸光度を、Spectromax 2Eプレートリーダー(Molecular Devices)で読み取った。結果を表7に示しており、数値は、マウス抗NGF抗体のイヌβNGFとの結合を示す。
TF−1は、ヒトTrkAを発現し、組換えβNGFに応じて増殖するヒト赤血白血病細胞株である。精製抗NGF mAbが、NGF誘導性増殖を遮断するかどうかを調べるために、TF−1細胞(ATCC番号CRL−2003)を、組換えヒトGM−CSFを2ng/mL(R&D Systems、カタログ番号215−GM)およびウシ胎仔血清(FBS、Hyclone、カタログ番号SH 30070.03)を含有するRPMI(Gibco、カタログ番号11875−093)培地中、37℃および5% CO2で維持した。GM−CSFおよびFBSは、アッセイの24時間前に除去した。アッセイの1日目に、各抗NGF mAbを力価測定し(33.3nMから1.7fMの範囲の濃度)、RPMI+4% FBS中の、固定濃度の組換えイヌNGF(70pM)および、TF−1細胞(2.5×104個細胞/ウェル)に72時間添加した。細胞増殖は、Cell Titer−glo(Promega、カタログ番号G7571)を使用して測定した。イヌNGF誘導性TF−1細胞増殖に対する各抗NGF mAbのIC50値を表8に示しており、データは、70pMのイヌNGFの存在下では、ほとんどの抗NGF抗体が、nM未満の効力を示し、一部が50pM未満の効力を示すことを示す。
精製マウス抗NGF mAbが、イヌNGF誘発性細胞応答を遮断するかどうかを調べるために、実施例2のC、およびD節に記載されるように、SureFire細胞pERK(各試験ウェルにおいて128pMのイヌβNGFを使用する)およびPathHunterアッセイ(各試験ウェルにおいて441pMのイヌNGFを使用する)において力価測定することによって精製抗体を特性決定した。イヌβNGF誘導性細胞応答に対する各抗NGF mAbのIC50が、表9に要約され、データは、128pMのイヌNGFの存在下で、すべての抗NGF抗体がnM未満の効力を示し、一部が50pM未満の効力を示すことを示す(pERKアッセイ)。また、441pMのイヌNGFの存在下で、すべての抗NGF抗体は、nM未満の効力を示し、一部は150pM未満の効力を示す(PathHunterアッセイ)。
A.抗NGF抗体に対する質量分光光度法(MS)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析
1M DTTを使用してマウス抗NGF mAbを還元し、6224TOF質量分析計およびVydac C4、IMMx150mmカラム(カタログ番号214TP5115、the Nest Group)を50μl/分の流速で使用する1200 HPLC(Agilenl technologies)でHPLC/MSを使用して分析した。バッファーA:99.9% HPLC水+0.1% FA+0.01% TFAおよびバッファーB:99.9% ACN+0.1% FA+0.01% TFA。LC平衡およびサンプル脱塩は、5%バッファーBを使用して7分間実施した。分離勾配は、30%から50%のバッファーBを使用して10分間実施し、洗浄ステップは、95%バッファーBで10分間実施した。TOF獲得パラメータは、350Cのガス温度および750VのOCT/RFとした。質量範囲は、600−3200m/zとし、特定化された速度は、1.03スペクトル/sとした。定性分析ソフトウェア(Agilent)を使用して、抗体分子量をデコンボリューションした。
抗NGF mAbのアイソタイプを、Zymed Mouse MonoAb−IDキット(Invitrogenカタログ番号90−6550ロット番号1407589)を使用して決定した。アイソタイプ決定の結果を、表10に要約する。このデータは、マウスIgG1/k、IgG2a/kおよびIgG2b/kマウス抗体が、NGFと結合し、中和できることを示す。
生体分子タンパク質相互作用分析を使用して、精製抗NGFハイブリドーマ抗体および組換えイヌβNGF間の相互作用の結合速度論を評価した。抗体は、アミンカップリング手順を製造業者の使用説明書(Biacore)に従って使用してCM5チップに直接的に固定された、ヤギ抗マウスIgG FC(10000RU)表面を使用して捕捉した。1μg/mlの濃度の抗体5μlというサンプルの大きさが、10μl/分で捕捉された。抗原として組換えイヌNGFを使用した。マウス抗体に対して、イヌNGFを75μl/分で注入した(濃度範囲:5−0.039nM)。会合速度を3.3分間モニタリングし、解離速度を10分間モニタリングした。イヌNGFのアリコートはまた、参照反応CM表面中に同時に注入して、任意の非特異的結合バックグラウンドを記録した。結合速度の機器感度は、1×107とし、その結果、1×107より速い任意の結合速度は正確に測定されない可能性があり、解離速度の機器感度は、1×10−6とし、その結果、1×10−6より遅い解離速度は正確に測定されない可能性がある。したがって、1×107より速い結合速度は、>1×107として記録され、1×10−6より遅い解離速度は、<1×10−6として記録されている。生体分子タンパク質相互作用分析結果を、表11に要約する。このデータは、単離マウス抗NGF mAbが、速い結合速度(7×106超から)および遅い解離速度(1×10−3未満から)を有することを示す。マウス抗NGF mAbのKD全体は、約300pMから0.1pMの範囲であり、これは、精製抗NGFハイブリドーマ抗体の組換えイヌβNGFとの効率的な結合を示す。
表11に示された6種のサブクローニングされたハイブリドーマmAbのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を同定するために、Qiagen RNeasyキット(Qiagen、カタログ番号74104)を用いて個々のハイブリドーマ培養物からRNAを抽出した。RNAを逆転写し、Qiagen One−Step RT−PCRキット(Qiagen、カタログ番号210212)を使用してcDNA抗体配列を増幅した。フォワードプライマーを縮重させ、可変領域とアニールするよう設計した(重鎖プライマー:1HA、1HB、1HC、1HD、1HE、1HF;および軽鎖プライマー:1LA、1LB、1LC、1LD、1LE、1LF、1LG)(EMD4 Biosciencesカタログ番号69896)。リバースプライマーもまた、縮重させ、γ(重鎖)およびκ(軽鎖)定常領域に対して作製した。およそ400−450塩基対のPCR産物を、ゲル単離し、Qiagen Gel Extractionキット(Qiagen、カタログ番号28706)を用いて精製した。
各抗NGF抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を、InsightII(Accelrys、San Diego、CA)中に移入した。各配列をBLASTの鋳型として使用し、Protein Data Bank(www.rcsb.org)から、同一性において最も近いX線結晶構造を見い出した。同一性パーセントおよびすべてのCDRループの正確な長さを対応させることの両方に基づいて、重鎖および軽鎖各々について1つの構造を選択した。各鋳型および各クエリー配列の配列をアラインし、標準相同性モデリング技術を使用して、各鎖の相同性モデルを構築した。次いで、DISCOVERプログラム(Accelrys、San Diego、CA)において、50サイクルのCVFF力場を使用する拘束された(すべての重原子について500Kcal/オングストローム)共役勾配最小化の間、モデル化された両鎖の複合体を最小化した。
イヌIg重鎖およびλ軽鎖抗体可変ドメインアミノ酸配列を同定するために、RNEasyキット(Qiagen番号74104)を使用して、雑種イヌ末梢血単核球(PBMC)からRNAを単離した。イヌPBMC mRNAをスーパースクリプトIII逆転写酵素(Invitrogenカタログ番号18080−093)を用いて逆転写(RT)し、5’RACEシステム(Rapid Amplification of cDNA Ends)(Invitrogen番号18374−058)を使用してcDNAを増幅した。RTおよびPCRプライマー(RK323、RK324、RK122、LG010、LG011、LG012)は、Methods for Using Canine Immunogloblin Variable Domains and Caninized Antibodiesと題された特許公開番号US7,261,890B2に記載されている。イヌIgG逆転写と、それに続くRK326およびAbridgedアンカープライマー(AAP)(Invitrogen)を用いるネステッドPCRのために、プライマーRK323およびRK324を使用した。イヌλ軽鎖RT PCRと、それに続くLG010およびLG012およびAAPを用いるネステッドPCRのために、LG011を使用した。
マウス抗NGF抗体からイヌ化抗体配列を作製するために、各マウス重鎖可変鎖抗体遺伝子配列を、ベクターNTIソフトウェアを使用して36種のイヌIg生殖系列重鎖可変鎖配列に対して別個にアラインした。11種のイヌIg生殖系列重鎖可変鎖配列は、その開示が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,261,890 B2号、(Methods for Using Canine Immunoglobulin Variable Domains and Caninized Antibodies)に由来するものであり、25種のイヌIg生殖系列重鎖可変鎖配列は、表12(イヌ PBMC RNAから導かれたイヌ重鎖可変ドメイン配列)に由来するものであった。各マウス軽鎖可変鎖遺伝子配列を、ベクターNTIソフトウェアを使用して、68種の生殖系列軽鎖可変鎖配列(米国特許第7,261,890 B2号に由来する)に対して別個にアラインした。元のマウス配列に対して最高の全体相同性を有するイヌ可変ドメイン配列を、各重鎖および軽鎖配列のために選択して、フレームワーク配列を提供した。イヌ可変ドメインCDR配列をマウスCDR配列(サブクローニングされた抗NGF抗体ハイブリドーマmAbから導かれた)で置換することによって、完全CDRグラフト化抗体のコンピュータによる構築を達成した。各配列中の残基を同定するために、列挙された配列各々の第1のアミノ酸を、1と定義し、カバット(Kabat)番号付けシステムを使用して、すべての残りの残基を、その後に引き続いて番号付けした。
イヌ化IgG1κ抗体の重鎖フレームワークアミノ酸(すなわち、非CDRアミノ酸)は、8.0未満の算出された等電点をもたらす。軽鎖フレームワークアミノ酸は、軽鎖がκである場合には、6.5未満の算出された等電点をもたらす。イヌ化抗体の等電点は、全体、すなわち、組み合わされた重鎖および軽鎖として、フレームワークアミノ酸のために、軽鎖がκである場合には、8.0未満である。それに比べて、ヒトIgG1重鎖のフレームワークアミノ酸は、通常、8.0を超える等電点をもたらす。ヒトκ軽鎖のフレームワークアミノ酸は、通常、6.5を超える等電点をもたらす。ヒトIgG1/k抗体全体のフレームワークアミノ酸は、通常、8.0を超える等電点をもたらす。
各マウス重鎖可変および軽鎖可変鎖抗体遺伝子配列(表14に示されるような)を、ベクターNTIソフトウェアを使用して44種のヒト免疫グロブリン生殖系列重鎖可変鎖または46種の生殖系列軽鎖可変鎖配列(当業者に周知である、NCBI Ig Blastウェブサイトに由来する)に対して別個にアラインした。CDRグラフト化目的で、元のマウス配列に対して最高の全体相同性を有するヒト可変ドメイン配列を、各重鎖および軽鎖抗体配列のために選択して、フレームワーク(FW)1、2および3配列を提供した。適したヒト重鎖可変および軽鎖FW4領域(「連結」領域としても知られる)の同定を、NCBIデータベースにおいて、各マウス重鎖および軽鎖FW4領域を、重鎖を連結する6種のヒト免疫グロブリン生殖系列および軽鎖配列を連結する5種の生殖系列と別個にアラインすることによって達成した。ヒト可変ドメインCDR配列(NCBIウェブサイトに由来する)をマウスCDR配列(マウス抗体に由来する)で置換し、各3’末端にFW4領域(NCBIウェブサイトに由来する)を付加することによって、完全CDRグラフト化可変ドメインのコンピュータによる構築を達成した。復帰突然変異の同定によって、さらなるヒト化も達成され得る。全長ヒトIgは、各CDRグラフト化mAbの可変ドメインを、インフレームのヒトIgG定常ドメインとともに発現させることによって製造され得る。製造されたヒトIgフレームワークにグラフトされたマウス抗NGF mAb CDR(CDRグラフト化抗NGF Ab)が表15に列挙されている。
従来の分子生物学技術を使用して、イヌIgG1定常領域(Marie−Paule Lefranc (Universite Montepellier 2 and CNRS)によって作成された、免疫遺伝学および免疫情報学におけるグローバルリファレンスである、IMGT(登録商標)、the International ImMunoGeneTics information systemから得られた)をコードするcDNA断片を、合成し、マウス抗NGFモノクローナル抗体PR−1254972、PR−1254973、PR−1254977、PR−1254981、PR−1254982に由来する重鎖可変ドメインの各々の3’末端にライゲーションした。これらの同一抗NGF mAbについて、米国特許第5,852,183A号、(配列番号54)から得られたイヌκ定常領域をコードするcDNA断片を、合成し、軽鎖可変ドメインの各々の3’末端にライゲーションした。完全イヌIgG重鎖定常ドメインヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号51および配列番号52として、それぞれ示されている。完全イヌκ軽鎖定常ドメインヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号53および配列番号54として、それぞれ示されている。完全重鎖および軽鎖キメラcDNAを、pHybE発現プラスミド中にライゲーションした;これらのキメラmAbの配列は、以下の表15A中にある。
選択された重鎖および軽鎖マウス/イヌキメラ抗体およびイヌ化抗体プラスミドを、懸濁液中の293−6e細胞に同時トランスフェクトし、7−8日間増殖させた。細胞上清を回収し、遠心分離し、濾過した。各発現された抗体について、上清を等容積のPierce結合バッファーと混合し、製造業者の使用説明書(GE Healthcare番号17−1279−04)に従ってプロテインAセファロース親和性クロマトグラフィーを実施した。いくつかの供給源によれば、イヌIgGは、プロテインAと中程度に十分に直接的に結合するが(GE Healthcare Antibody Purification Handbook package insert;Scott,M.A.ら、Vet Immunol−Immunopatho、59:205頁、1997年;Warr,G.WおよびHart,IR.、Am J Vet Res、40:922頁、1979年;Thermo Scientific Pierce Antibody production and Purification Technical Handbook)、モノクローナルイヌmAbは、プロテインAと定量的に結合せず、したがって、プロテインA精製方法論に修飾を行わずに、上清から精製することができない。
精製マウス/イヌキメラ抗体およびイヌ化抗体を、Biacore T100機器を使用してイヌNGFとの親和性について分析した。ヤギ抗イヌIgG(Southern Biotech)を、アミンカップリング手順を製造業者の使用説明書(Biacore)に従って使用して5000−10000RUでCM5チップ上に固定化した。イヌNGFを、マウス/イヌキメラ抗体に対して50−0.156nMまたはイヌ化抗体に対して10−0.156nMの濃度範囲で、50μL/分で注入した。会合速度を5分間モニタリングし、解離速度を10−20分間モニタリングした。50−75μLの10mMグリシンpH1.5を50−100μL/分の流速で使用してチップ表面を再生した。データは、Biaevaluation T100ソフトウェアバージョン2.0.2、ソフトウェア、GE Healthcare Life Sciences (Piscataway、NJ)を使用して分析した。マウス/イヌキメラ抗体について確立されている全体親和性パラメータが、表18に要約されており、イヌ化抗体については、表19に要約されている。このデータは、単離マウス/イヌキメラ抗NGF mAbは、急速な結合速度(2×106超から)および遅い解離速度(3×10−3未満から)を有することを示す。マウス/イヌ抗NGF mAbの全体KDは、約1300pMから1.6pMに及ぶ。このデータはまた、単離イヌ化キメラ抗NGF mAbが、急速な結合速度(6×106超から)および遅い解離速度(2×10−4未満から)を有することを示す。イヌ化抗NGF mAbの全体KDは、約42pMから1.2pMに及ぶ。
精製マウス/イヌキメラ抗体およびイヌ化抗体を、アッセイにおいて70pMイヌNGFを使用するTF−1細胞増殖効力アッセイ(先に記載された)を使用して特性決定した。要約された効力データが、表20および21にある。データは、70pMのイヌNGFの存在下で、マウス/イヌキメラ抗NGF抗体のすべてが、nM未満の効力を示し、すべてが50pM未満の効力を示すことを示す。データは、70pMのイヌNGFの存在下で、イヌ化抗NGF抗体の一部が、70pMイヌNGFに対して中和効力を有さないことを示す。一部のイヌ化mAbは、nM未満の効力を有し、一部は、20pM未満の効力を有する。
2種のイヌ化抗NGF抗体の保存溶液(73.2イヌIgG1/kおよび82.4イヌIgG1/k)を入手した。[これらは実施例13で製造したイヌ化Ab?]抗体を5mg/ml未満の濃度で、リン酸バッファー生理食塩水(PBS)で製剤した(PBSは、それだけには限らないが、以下の成分:pH7.4の15mMリン酸バッファーおよび150mM塩化ナトリウムを含有する)。
PBSにおける高濃度でのイヌ化抗体の溶解度を、抗体をAmicon30K分子量カットオフ遠心分離スピンフィルターを用いて濃縮することによって評価した。最終濃度は、UV吸光度によって決定した。
PBSを用いて1mg/mlに希釈した後の、PBS中の73.2イヌIgG1/kおよび82.4イヌIgG1/kの凍結解凍(FT)安定性の評価を実施した。両抗体とも−80℃で少なくとも4時間凍結した。次いで、それらを30℃の水浴中解凍した(これが1凍結解凍サイクルを構成する)。サイズ排除HPLC(SEC)によって4凍結解凍サイクルについて安定性を評価した。凍結解凍分析を表24に要約する。
10mg/mLの濃度および5から8のpH範囲内ならびに低(約7.5mM)および高(>約150mM)イオン強度で製剤された場合の73.2イヌIgG1/kおよび82.4イヌIgG1/kの安定性を評価した。以下のバッファーおよび塩濃度において抗体の安定性をモニタリングすることによってこれらの条件での安定性を評価した:(A)15mM酢酸pH5;(B)15mM酢酸pH5+150mM NaCl;(C)15mMヒスチジンpH6+150mM NaCl;(D)15mMリン酸pH7.4;(E)PBS pH7.4;(F)15mM Tris pH7.5;(G)15mM Tris pH8.0。抗菌薬としてナトリウムアジド(0.02%)をすべてのバッファーに添加した。
雑種イヌにおいて、4.5mg/kg(静脈内または皮下)の単回用量後に73.2イヌIgG1/kおよび82.4イヌIgG1/kの血清レベルを分析した。注射後、672時間にわたって静脈血の13サンプルを採取した。血液サンプルを凝固させ、抗体定量化のために血清を回収した。
非コンパートメント分析によってWinNonlinソフトウェア(Pharsight Corporation、Mountain View、CA)を使用して、各動物について、静脈内(IV)および皮下(SC)両投薬経路の薬物動態パラメータを算出した。その他の算出、例えば、平均、標準偏差(SD)および皮下バイオアベイラビリティパーセント(F:%)を、マイクロソフトエクセルソフトウェア(Microsoft Corporation Redmond、WA)を使用して実施した。データを、表31および32に示す。
細胞上清(またはその他の液体)中のイヌ抗体を定量化するために、高結合EIAプレート(Costar番号9018)を、PBS中、4μg/mlのポリクローナルヤギ抗イヌIgG抗体(Rockland番号604−1102)でコーティングした。PBS中、2%の脱脂乳でブロッキングした後、プレートにイヌモノクローナル抗体を添加し、プレートをPBSおよび0.05%Tween−20で洗浄した。0.1μg/mlの、HRPタグをつけたヤギ抗イヌIgG抗体(Rockland番号604−1302)を用いて、結合しているイヌmAbを検出した。プレートをPBSおよび0.05%Tween−20で洗浄した。TMB基質(Neogen番号308177)の添加によってイヌmAbを検出し、1NのHClを用いて反応を停止した。450nMでの吸収によって結合しているイヌ抗体を定量化し、抗体の総量をμg/サンプル液体1mLで推定した。
Claims (15)
- a)配列番号79のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号80のアミノ酸配列からなるCDR2および配列番号81のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖、ならびに
b)配列番号82のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号83のアミノ酸配列からなるCDR2および配列番号84のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖、
を含む、抗NGF抗体。 - IgM定常ドメイン、IgG4定常ドメイン、IgG1定常ドメイン、IgE定常ドメイン、IgG2定常ドメイン、IgG3定常ドメインおよびIgA定常ドメインからなる群から選択される重鎖ヒト免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- IgM定常ドメイン、IgG4定常ドメイン、IgG1定常ドメイン、IgE定常ドメイン、IgG2定常ドメイン、IgG3定常ドメインおよびIgA定常ドメインからなる群から選択される重鎖イヌ免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖ネコ免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖ウマ免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号52および配列番号54からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する定常領域を含む、請求項1に記載の抗体。
- 免疫グロブリン分子、ジスルフィド結合されたFv、モノクローナル抗体、scFv、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、CDRグラフト化抗体、ダイアボディー、ヒト化抗体、イヌ化mAb、イヌmAb、ネコmAb、ネコ化mAb、ウマmAb、ウマ化mAb、多重特異性抗体、Fab、二重特異性抗体、DVD−Ig、Fab’、二特異性抗体、F(ab’)2およびFvからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- NGFの生物学的機能を調節できる、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体をコードする単離核酸。
- 請求項1に記載の抗体および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物または診断用組成物。
- 抗体の治療上有効な量を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1種の防腐剤を含み、防腐剤が、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノールまたは塩化ベンザルコニウムである、請求項10に記載の医薬組成物。
- 組成物のpHが、7.0から8.0の間である、請求項10に記載の医薬組成物。
- 静脈内にまたは皮下に投薬された場合に、8.0日から15.0日の半減期を有する、請求項10に記載の医薬組成物。
- 非ヒト対象に、治療上有効な量の請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む、NGF活性が有害である障害を患っている非ヒト対象においてNGF活性を低減する方法。
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