CN113336847A

CN113336847A - 一种抗pd-1抗体

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Publication number: CN113336847A
Application number: CN202110152509.8A
Authority: CN
Inventors: 董坚; 孙亚如; 杨圣; 聂紫; 李文荣
Original assignee: Shanghai Life Medical Science & Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Life Medical Science & Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN113336847B

Abstract

本发明公开了一种抗PD‑1抗体及其制备方法。具体地，本发明公开了一种PD‑1抗体或其抗原结合片段，其包括如SEQ ID NO:2所示的抗体重链可变区，和SEQ ID NO:4所示的抗体轻链可变区。本发明的抗PD‑1抗体特异性高，亲和力强，可有效阻断PD‑1与PD‑L1的结合，激活免疫细胞；此外本发明的抗体可以制备成分泌型抗体，表达在嵌合抗原受体免疫细胞上，与嵌合抗原受体联合发挥抗肿瘤作用。

Description

一种抗PD-1抗体

技术领域

本发明涉及生物技术和抗体领域，具体的，本发明涉及一种抗PD-1抗体及其制备方法。

背景技术

免疫检查点分子(immune checkpoint)是免疫系统中起抑制作用的调节分子，其对于维持自身耐受、防止自身免疫反应、以及通过控制免疫应答的时间和强度而使组织损伤最小化等至关重要。免疫检查点分子表达于免疫细胞上，将抑制免疫细胞功能，使机体无法产生有效的抗肿瘤免疫应答，肿瘤形成免疫逃逸。与肿瘤相关的免疫检查点分子主要有：PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3等B7家族和CD28家族分子。

蛋白质程序性死亡1(PD-1)是55kDa的I型跨膜蛋白，为Ig基因超家族的一部分，PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达。PD-1有两种配体，PD-L1和PD-L2，与结合PD-1后可以降低T细胞活化。PD-L1在多种人肿瘤中高表达。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致渗入肿瘤的淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少、及癌性细胞的免疫逃避。可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制，而且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时效果累加。通过开发免疫检查点抑制剂来阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，以及显著提高免疫细胞活性来抑制肿瘤。免疫检查点抑制剂作用于病人的免疫系统，激活T细胞，适用于多种不同肿瘤的治疗，成为了肿瘤的通用疗法。

因此，本领域有需要开发识别PD-1的试剂和使用此类试剂的方法。

发明内容

本发明的目的在于一种有效识别PD-1分子的抗PD-1抗体及其在抗肿瘤治疗中的用途。

本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:5所示的CDR1；

如SEQ ID NO.:6所示的CDR2；和

如SEQ ID NO.:7所示的CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述重链可变区具有如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:8所示的CDR1’；

如SEQ ID NO.:9所示的CDR2’；和

如SEQ ID NO.:10所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括本发明第一方面所述的抗体重链可变区，和本发明第二方面所述的抗体轻链可变区；

或者，所述抗体或其抗原结合片段包括具有本发明第一方面所述的抗体重链可变区的重链，和具有本发明第二方面所述的抗体轻链可变区的轻链。

在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区有如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。

本发明的第四方面，提供了一种靶向PD-1的分泌型抗体，所述分泌型抗体包括本发明第一方面所述的抗体重链可变区，和本发明第一方面所述的抗体轻链可变区，并且所述分泌型抗体表达于免疫细胞内，并由所述免疫细胞分泌至细胞外。

在另一优选例中，所述分泌型抗体的重链可变区有如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述免疫细胞表面还可以同时表达有一嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或其组合。

在另一优选例中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体选自下组：CEA、Mesothelin、Claudin18.2、GPC3、NKG2D、MUC1或其组合。

本发明的第五方面，提供了一种多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子编码本发明第三方面所述PD-1抗体或其抗原结合片段、本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的轻链可变区或本发明第四方面所述的靶向PD-1的分泌型抗体。

在另一优选例中，所述的多核苷酸分子编码所述PD-1抗体的重链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸分子编码所述PD-1抗体的轻链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的第六方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第五方面所述的多核苷酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、真核表达载体、原核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为真核表达载体。

本发明的第七方面，提供了一种工程化的细胞，所述的细胞含有本发明第六方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第五方面所述的多核苷酸分子、或表达本发明第三方面所述的PD-1抗体或其抗原结合片段、或表达本发明第四方面所述的靶向PD-1的分泌型抗体。

在另一优选例中，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

在另一优选例中，所述细胞为免疫细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞为T细胞、NK细胞或其组合。

本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第三方面所述PD-1抗体或其抗原结合片段、本发明第四方面所述的靶向PD-1的分泌型抗体、或本发明第七方面所述的工程化的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的第九方面，提供了一种本发明第三方面所述的PD-1抗体或其抗原结合片段、本发明第四方面所述的靶向PD-1的分泌型抗体、本发明第五方面所述的多核苷酸分子、本发明第六方面所述的载体、本发明第七方面所述的工程化的细胞、或本发明第八方面所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自下组：血液肿瘤、淋巴瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述淋巴瘤选自下组：霍奇金淋巴瘤(HL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白细胞(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)以及其他复杂B细胞非霍奇金淋巴瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第三方面所述的PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下，培养包含编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞，并从细胞或培养物中回收抗体或抗原结合片段。

本发明的第十一方面，提供了一种制备本发明第七方面所述的工程化的细胞的方法，包括以下步骤：将本发明第五方面所述的多核苷酸分子或本发明第六方面所述的载体转导入细胞内，从而获得所述工程化的细胞。

在另一优选例中，所述的细胞为免疫细胞。

本发明的第十二方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明第三方面所述的PD-1抗体或其抗原结合片段、本发明第七方面所述的工程化的细胞、或本发明第八方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

本发明的第十三方面，提供了一种免疫检测点抑制剂，所述抑制剂含有本发明第三方面所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.通过FACS检测的二免后小鼠血清与CHO-PD-1细胞的结合情况。

图2.通过FACS检测的三免后小鼠血清与CHO-PD-1细胞的结合情况。

图3.通过FACS检测的筛选结果为阳性的孔。

图4.通过FACS检测的阳性亚克隆检测结果。

图5.PD1-05-4D5-1A9阻断PD-1与PD-L1结合的流式分析结果。

图6.通过流式分析的PD1-05-4D5-1A9抗体亚型结果。

图7.通过流式分析的PD1-05-4D5-1A9重组抗体的表达鉴定结果。

图8.PD1-05-4D5-1A9抗体重链表达载体图谱；其中HV指重链可变区序列。

图9.PD1-05-4D5-1A9抗体轻链表达载体图谱；其中LV指轻链可变区序列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地研发了一种抗PD-1单克隆抗体。实验证明，所述抗PD-1单克隆抗体与PD-1结合的特异性高，亲和力强，可有效阻断PD-1与PD-L1的结合。本发明的抗PD-1单克隆抗体可用作免疫检测点抑制剂激活免疫细胞，提高机体杀伤肿瘤的活力，还可以用于制作治疗癌症/肿瘤的药物组合物。此外，当本发明的抗体被制备成分泌型抗体时，可表达在嵌合抗原受体免疫细胞上，联合嵌合抗原受体发挥抗肿瘤作用，为肿瘤治疗提供了新方法。

术语

为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

免疫检测点

如本文所用，术语“免疫检测点”是免疫系统中起抑制作用的调节分子，尤其是指蛋白质程序性死亡1(PD-1)分子。

本发明的抗体或其抗原结合片段可特异性结合免疫细胞表面表达的PD-1，有效阻断PD-1与其表达在肿瘤细胞表面的配体PD-L1的结合，解除PD-1对免疫细胞的抑制作用，激活免疫细胞。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可以用作免疫检测点抑制剂或用于制备抗肿瘤药物。

抗体

如本文所用，术语“抗体”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

如本文所用，术语“重链可变区”与“HV”可互换使用。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“LV”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

分泌型抗体

如本文所用，术语“分泌型抗体”是指在免疫细胞表达的PD-1抗体，此抗体不固定在细胞膜，能够从免疫细胞释放到细胞外从而到达体内的其他部位。

本发明提供了一种靶向PD-1的分泌型抗体，所述分泌型抗体包括如SEQ ID NO.：2所示的抗体重链可变区，和如SEQ ID NO.：4所示的抗体轻链可变区，并且所述分泌型抗体表达于免疫细胞内。所述免疫细胞的表面可以同时表达有一嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括(但不限于)：CEA、Mesothelin、Claudin 18.2、GPC3、NKG2D、MUC1等。

多核苷酸分子和载体

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.：1和3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.：1和3所示的编码区序列有差别的多核苷酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.：2和4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(多核苷酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、T细胞、NK细胞的动物细胞等。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，包含本发明第三方面所述的抗体、本发明第四方面所述的分泌型抗体或本发明第七方面所述的工程化的细胞，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)、嵌合抗原受体、或嵌合抗原受体T细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的抗体特异性高，亲和力强，并且可以大量制备，单克隆抗体质量容易控制。

(2)本发明的抗体可以用作免疫检测点抑制剂激活免疫细胞，提高机体杀伤肿瘤的活力，可以用于制作单克隆抗体药物，双抗药物或多功能抗体。

(3)本发明的抗体可以用于制备诊断免疫细胞活力的试剂

(4)本发明的抗体可以制备成分泌型，表达在嵌合抗原受体免疫细胞上，联合嵌合抗原受体发挥抗肿瘤作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

抗PD-1抗体制备

本实施例的主要技术方案如下：

1.对小鼠实施三次DNA免疫+1次细胞冲击免疫，间隔两周。其中，DNA是指人PD-1DNA，所用细胞为CHO-PD-1(即表达PD-1的CHO细胞)。

2.使用CHO-PD-1(表达PD-1的CHO细胞)细胞进行FACS筛选。

按照以下实验步骤进行：

1.免疫小鼠

按照表1的方案对实验小鼠进行免疫：

表1免疫小鼠的时间方案

小鼠ID	一免	二免	三免	冲击免疫
					PD1-A-01	2019/6/25	2019/7/9		2019/7/23
PD1-A-02	2019/6/25	2019/7/9
					PD1-A-03	2019/6/25	2019/7/9
PD1-A-04	2019/6/25	2019/7/9	2019/7/23
					PD1-A-05	2019/6/25	2019/7/9	2019/7/23	2019/9/13
PD1-A-06	2019/6/25	2019/7/9	2019/7/23
					PD1-A-07	2019/6/25	2019/7/9
PD1-A-08	2019/6/25	2019/7/9	2019/7/23
					PD1-A-09	2019/6/25	2019/7/9	2019/7/23
PD1-A-10	2019/6/25	2019/7/9	2019/7/23	2019/8/19
					PD1-A-11	2019/9/16	2019/9/30	2019/10/14
PD1-A-12	2019/9/16	2019/9/30	2019/10/14
					PD1-A-13	2019/9/16	2019/9/30	2019/10/14
PD1-A-14	2019/9/16	2019/9/30	2019/10/14
					PD1-A-15	2019/9/16	2019/9/30	2019/10/14

其中：一免：每只小鼠免疫注射60μg DNA(肌肉注射)；二免：每只小鼠免疫注射60μg DNA；三免：每只小鼠免疫注射60μg DNA；冲击免疫：使用1×10⁷个CHO-PD-1细胞尾静脉注射冲击免疫。

2.血清检测

(1)FACS检测二免血清

二免后的小鼠血清通过FACS检测其与CHO-PD-1的结合情况。

实验材料：CHO-PD-1+小鼠二免血清+羊抗鼠IgGFc-FITC。

分装适量的CHO-PD-1细胞于1.5ml EP管内，离心后重悬于50μl 1:100稀释的小鼠血清，4℃静置15分钟，离心后重悬于50μl由PBS 1:500稀释的羊抗鼠IgG Fc-FITC，4℃静置15分钟，离心置换上清之后重悬于200μl PBS，进行FACS流式分析。

结果如图1所示。结果显示，小鼠PD1-A-01，05，08，10可进行冲击免疫融合。

(2)FACS检测三免血清

三免后的小鼠血清通过FACS检测其与CHO-PD-1的结合情况。

实验材料：CHO-PD-1+小鼠三免血清+羊抗鼠IgGFc-FITC。

结果如图2所示。结果显示，小鼠PD1-A-11，13，14，15可进行冲击免疫融合。

3.融合

在冲击免疫4天后，将小鼠的B淋巴细胞分别与骨髓瘤细胞进行融合，得到对应的杂交瘤细胞。

4.融合后筛选

(1)初筛：每只小鼠各铺种5块96孔板(12*8个孔，1-12对应行号，A-H对应列号，如表1)，分别编号为1、2、3、4、5，进行HAT筛选。表2显示了HAT初筛结果。

表2 HAT初筛结果：

小鼠ID	初筛阳性
		PD1-A-01	无
PD1-A-10	无
		PD1-A-05	1E7,2B11,3D12,4A3,4A6,4A9,4C3,4D5,5A5,5C8

(2)FACS检测筛选

使用FACS检测进一步筛选初筛结果为阳性的孔。结果如图3所示。结果显示，PD1-05-1E7,2B11,3D12,4A3,4A6,4A9,4C3,4D5,5A5,5C8均为阳性。对上述阳性孔进行亚克隆。

5.亚克隆建株

经FACS检测，阳性亚克隆汇总于下表3：

表3阳性亚克隆汇总结果

亚克隆检测结果如图4所示。

实施例2

阳性亚克隆抗体的阻断效果检测

按照以下步骤检测阳性亚克隆阻断PD-1与PD-L1结合的效果：

(1)分装CHO-PD-1细胞于1.5mL EP管中。

(2)4000rpm离心5min，弃上清。

(3)实验组使用50μL杂交瘤上清重悬细胞，对照组使用50μL PBS重悬细胞，4℃静置15min。

(4)使用50μL浓度为50μg/mL，5μg/mL，0.5μg/mL的PD-L1-hFc溶液分别与上述细胞悬液混匀，4℃静置15min。

(5)4000rpm离心5min，弃上清。

(6)取50μL 1:250稀释的Goat anti-mouseIgG-FITC和1:500稀释的Goat anti-human IgG Dylight650二抗混合液重悬上述细胞沉淀，4℃静置15min。

(7)4000rpm离心5min，弃上清。

(8)300μL PBS重悬细胞，流式分析。

流式分析结果如图5所示。结果显示亚克隆PD1-05-4D5-1A9具有阻断PD-1与PD-L1结合的作用。另外，从上述结果可以看出Goat anti-mouseIgG-FITC与hFc具有交叉反应，hFc浓度越高交叉反应越明显，但此交叉反应不影响阻断反应的检测。

实施例3

重组PD-1抗体的构建

首先，对实施例2中确定的亚克隆PD1-05-4D5-1A9进行抗体序列和亚型分析。

实验步骤如下:

(1)分装CHO-PD-1细胞于1.5mL EP管中。

(2)4000rpm离心5min，弃上清。

(3)取50μL杂交瘤上清重悬细胞，4℃静置15min。

(4)4000rpm离心5min，弃上清。

(5)取50μL 1:200稀释的Goat anti-mouseIgG1-FITC，Goat anti-mouseIgG2a-FITC和Goat anti-mouseIgG2b-FITC重悬上述细胞，4℃静置15min。

(6)4000rpm离心5min，弃上清。

(7)300μL PBS重悬细胞，流式分析。

流式分析结果如图6所示。结果显示：PD1-05-4D5-1A9抗体亚型为IgG2a。

使用毛细管电泳的Sanger法进行抗体基因测序。

关于PD1-05-4D5-1A9抗体的详情汇总于下表4：

表4 PD1-05-4D5-1A9抗体的亚型及基因序列

亚克隆号	亚型	重链基因	轻链基因
				PD1-05-4D5-1A9	IgG2a	IGHV5-9-2	IGKV5-43

IGHV5-9-2：序列如SEQ ID NO.:1(DNA)以及SEQ ID NO.:2(氨基酸)所示。

IGKV5-43：序列如SEQ ID NO.:3(DNA)以及SEQ ID NO.:4(氨基酸)所示。

重组抗体的表达验证：

将编码PD1-05-4D5-1A9抗体的重链可变区和轻链可变区核苷酸序列分别克隆到pCAG真核表达载体中，得到分别表达抗体重链可变区(图8)和轻链可变区(图9)的重组表达载体。

将10μg轻重链表达载体使用磷酸钙方法共转进入10cm培养皿中的293T细胞，三天后收集上清,在CHO-PD-1细胞中进行FACS验证。

FACS验证实验包括以下步骤：

(1)分装CHO-PD-1细胞于1.5mL EP管中。

(2)4000rpm离心5min，弃上清。

(3)取50μL293T细胞转染上清重悬细胞，4℃静置15min。

(4)4000rpm离心5min，弃上清。

(5)取50μL 1:200稀释的Goat anti-mouseIgGFc-FITC重悬上述细胞，4℃静置15min。

(6)4000rpm离心5min，弃上清。

(7)300μL PBS重悬细胞，流式分析。

流式分析结果如图7所示。结果显示，轻重链表达载体转染在293T细胞中，然后分泌在293T细胞上清中的PD1-05-4D5-1A9重组抗体能够有效识别CHO-PD-1细胞中的PD-1抗原，结果表明此抗体能够在体内通过识别生理状态下的PD-1抗原，阻断PD-1和PD-L1的结合而活化免疫细胞。

PD1-05-4D5-1A9抗体的DNA序列和氨基酸序列如下表所示：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海莱馥医疗科技有限公司

<120> 一种抗PD-1抗体

<130> P2020-1724

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 411

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

atgaacttgg ggctcagctt gattgtcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60

gtgaacctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatggcatgt cttgggttcg ccagactccg 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtggtggcg gtagtaacat atactatcca 240

gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg cccagaacaa cctatactta 300

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccttttatt tctgtgcaag acaacgggac 360

gtggactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 411

<210> 2

<211> 137

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn

85 90 95

Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Arg Asp Val Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 3

<211> 381

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

atggttttca cacctcagat acttggactt atgctttttt ggatttcagc ctccagaggt 60

gatattctac taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 120

ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 180

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 240

aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacac tgtggagact 300

gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag actaacagct ggccgctcac gttcggtgct 360

gggaccaagc tggagctgaa a 381

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Thr Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn

100 105 110

Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Gln Arg Asp Val Asp Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Leu Thr

1 5

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:5所示的CDR1；

如SEQ ID NO.:6所示的CDR2；和

如SEQ ID NO.:7所示的CDR3。

2.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

如SEQ ID NO.:8所示的CDR1’；

如SEQ ID NO.:9所示的CDR2’；和

如SEQ ID NO.:10所示的CDR3’。

3.一种PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括如权利要求1所述的抗体重链可变区，和如权利要求2所述的抗体轻链可变区；

或者，所述抗体或其抗原结合片段包括具有权利要求1所述的抗体重链可变区的重链，和具有权利要求2所述的抗体轻链可变区的轻链。

4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQID NO.:4所示的氨基酸序列。

5.一种靶向PD-1的分泌型抗体，其特征在于，所述分泌型抗体包括如权利要求1所述的抗体重链可变区，和如权利要求2所述的抗体轻链可变区，并且所述分泌型抗体表达于免疫细胞内，并由所述免疫细胞分泌至细胞外。

6.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述的多核苷酸分子编码如权利要求3或4所述PD-1抗体或其抗原结合片段、如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的轻链可变区或如权利要求5所述的靶向PD-1的分泌型抗体。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求6所述的多核苷酸分子。

8.一种工程化的细胞，其特征在于，所述的免疫细胞含有如权利要求7所述的载体、或染色体中整合有外源的如权利要求6所述的多核苷酸分子、或表达如权利要求3或4所述的PD-1抗体或其抗原结合片段、或表达如权利要求5所述的靶向PD-1的分泌型抗体。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求3或4所述PD-1抗体、权利要求5所述的靶向PD-1的分泌型抗体、或权利要求8所述的工程化的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

10.一种如权利要求3或4所述的PD-1抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的靶向PD-1的分泌型抗体、权利要求6所述的多核苷酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的工程化的细胞、或权利要求9所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。