TWI781934B - 抗-tim-3抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示案提供特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且拮抗TIM-3功能之抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組合物、編碼此等抗體之核酸、製造此等抗體之表現載體及宿主細胞，以及使用此等抗體來治療受試者之方法。

Description

抗-TIM-3抗體及其使用方法
本揭示案係關於特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體及其使用方法。
蛋白質T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3(TIM-3)為免疫球蛋白(Ig)超家族中之I型膜蛋白。它具有細胞外Ig可變樣(IgV)域、細胞外黏蛋白樣域、及具有六個保守酪胺酸殘基之細胞質域(Monney等人(2002)Nature 415：536-41)。TIM-3在活化的T-輔助1型(Th1)及CD8+ T(Tc1)淋巴細胞、一些巨噬細胞(Monney等人(2002)Nature 415：536-41)、活化的自然殺傷(NK)細胞(Ndhlovu等人(2012)Blood 119(16)：3734-43)及產生IL-17之Th17細胞(Nakae等人(2007)J Leukoc Biol 81：1258-68)中表現。
研究證明TIM-3可用來抑制T細胞、骨髓細胞及NK細胞介導之反應並且促進免疫耐受性。舉例而言，與結合至並中和TIM-3配位體之免疫球蛋白域融合的 TIM-3 IgV肽造成免疫接種小鼠中Th1細胞之過度增殖及.Th1細胞因子釋放(Sabatos等人(2003)Nat Immunol 4：1102-10)。事實上，活體內投與抗-TIM-3抗體提高實驗自體免疫性腦脊髓炎(亦即，多發性硬化之動物模型)的病理嚴重性(Monney等人(2002)Nature 415：536-41)。此外，TIM-3表現在癌症患者之CD8+ T細胞中上調。舉例而言，在患有晚期黑素瘤之患者中大約30%的NY-ESO-1-特異性CD8+ T細胞顯示TIM-3表現之上調(Fourcade等人(2010)J Exp Med 207：2175-86)。
鑒於人類TIM-3在調節免疫反應中之明顯作用，經設計來拮抗TIM-3傳訊之治療劑在治療涉及TIM-3-介導的免疫抑制之疾病上有極大前景。
本揭示案提供抗體，該等抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且拮抗TIM-3功能，例如，TIM-3-介導的免疫抑制。亦提供包含此等抗體之醫藥組合物、編碼此等抗體之核酸、製造此等抗體之表現載體及宿主細胞、以及使用此等抗體治療受試者之方法。本文所揭示之抗體尤其適用於增強響應於抗原(例如，腫瘤抗原或感染性疾病抗原)的T細胞活化及/或減弱Treg-介導的免疫抑制，且因此用於治療受試者之癌症或者治療或預防受試者之感染性疾病。
因此，在一態樣中，本揭示案提供一種抗體 或分離抗體，該抗體或分離抗體包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中：(a)CDRH1包含X1X2X3X4X5S(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列，其中X1為R、S、A、G、K、M或T，X2為Q、S、A、G、R或T，X3為N、Y、G或Q，X4為A或Q，且X5為W、M、A、S或T；(b)CDRH2包含WVSAISGSGGSTY(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列；(c)CDRH3包含AKGGDYGGNYFD(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)CDRL1包含X1ASQSVX2SSYLA(SEQ ID NO：52)之胺基酸序列，其中X1為R或G，且X2不存在或為S；(e)CDRL2包含X1ASX2RAT(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列，其中X1為D或G，且X2為N、S或T；並且(f)CDRL3包含QQYGSSPX1T(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列，其中X1為L或I。
在另一態樣中，本揭示案提供特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中：(a)CDRH1包含X1X2X3X4X5S(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列，其中X1為R、S、A、G、K、M或T，X2為Q、S、A、G、R或T，X3為N、Y、G或Q，X4為A或Q，且X5為W、M、A、S或T；(b)CDRH2包含WVSAISGSGGSTY(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列；(c)CDRH3包含AKGGDYGGNYFD(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)CDRL1包含X1ASQSVX2SSYLA(SEQ ID NO：52)之胺基酸序列，其中X1為R或G，且X2不存在或為S；(e)CDRL2包含X1ASX2RAT(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列，其中X1為D或G，且X2為N、S或T；並且 (f)CDRL3包含QQYGSSPX1T(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列，其中X1為L或I。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體或分離抗體包括具有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區以及具有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中該抗體在結合至表現人類TIM-3之細胞後內化，並且其中CDRH3包含AKGGDYGGNYFD(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含具有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區以及具有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中該抗體在結合至表現人類TIM-3之細胞後內化，並且其中CDRH3包含AKGGDYGGNYFD(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列。
在某些實施例中：(a)CDRH1包含X1X2X3X4X5S(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列，其中X1為R、S、A、G、K、M或T，X2為Q、S、A、G、R或T，X3為N、Y、G或Q，X4為A或Q，且X5為W、M、A、S或T； (b)CDRH2包含WVSAISGSGGSTY(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列；(c)CDRL1包含X1ASQSVX2SSYLA(SEQ ID NO：52)之胺基酸序列，其中X1為R或G，且X2不存在或為S；(d)CDRL2包含X1ASX2RAT(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列，其中X1為D或G，且X2為N、S或T；並且(e)CDRL3包含QQYGSSPX1T(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列，其中X1為L或I。
在某些實施例中，CDRH1包含X1X2NAWS(SEQ ID NO：49)之胺基酸序列，其中：X1為R或A；且X2為Q或R。在某些實施例中，CDRH1包含X1X2GQX3S(SEQ ID NO：50)之胺基酸序列，其中：X1為K、M或G；X2為A或S；且X3為S或T。在某些實施例中，CDRH1包含X1X2QQAS(SEQ ID NO：51)之胺基酸序列，其中：X1為S、R、T或G；且X2為A、S、T或G。在某些實施例中，CDRH1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：1及4-12。
在某些實施例中，CDRL1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：13-16。在某些實施例中，CDRL2包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：17-21。在某些實施例中，CDRL3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：22及23。
在某些實施例中，CDRH1、CDRH2及CDRH3包含分別在以下各項中闡明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2及3；4、2及3；5、2及3；6、2及3；7、2及3；8、2及3；9、2及3；10、2及3；11、2及3；或12、2及3。
在某些實施例中，CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列：SEQ ID NO：13、17及22；14、17及22；15、18及22；14、19及22；14、20及22；14、21及22；16、20及22；或14、17及23。
在某些實施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、14、21及22；4、2、3、14、21及22；5、2、3、14、21及22；6、2、3、14、21及22；7、2、3、14、21及22：8、2、3、14、21及22；9、2、3、14、21及22；10、2、3、14、21及22；11、2、3、14、21及22；或12、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、 CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：9、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：9、2、3、14、21及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、15、18及22。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，以及含有 互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、15、18及22。
在某些實施例中，抗體在結合至表現人類TIM-3之細胞後內化。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其中該抗體在結合至表現人類TIM-3之細胞後內化。
在某些實施例中，在檢定中，與存在pab1944w(IgG1 N297A)之情況相比，在該抗體存在下，較低百分比的表現人類TIM-3之細胞存活，該檢定包括以下步驟：(a)將表現人類TIM-3之細胞以2x104個細胞/孔塗佈在組織培養板中；(b)以100μl/孔之最終體積添加1111ng/ml之αHFc-NC-DM1及1111ng/ml之抗體或pab1944w(IgG1 N297A)；(c)在37℃及5%CO2下培育72小時；(d)量測表現人類TIM-3之細胞之存活；以及(e)相對於表現人類TIM-3之未治療細胞，計算細胞存活百分比。在某些實施例中，與在pab1944w(IgG1 N297A)存在下的細胞存活百分比相比，在該抗體存在下的細胞存活百分比低至少50%。在某些實施例中，表現人類TIM-3之細胞為Kasumi-3細胞。在某些實施例中，表現人類TIM-3之細胞為Kasumi-3細胞(ATCC® CRL-2725TM)。在某些實施例中，表現人類TIM-3之細胞為經工程化以表現人類TIM-3 之Jurkat細胞。
在某些實施例中，在檢定中，與存在Hum11(IgG4 S228P)之情況相比，在該抗體之存在下，較低百分比之表現人類TIM-3之細胞存活，該檢定包括以下步驟：(a)將表現人類TIM-3之細胞以2x104個細胞/孔塗佈在組織培養板中；(b)以100μl/孔之最終體積添加1111ng/ml之αHFc-NC-DM1及1111ng/ml之抗體或Hum11(IgG4 S228P)；(c)在37℃及5%CO2下培育72小時；(d)量測表現人類TIM-3之細胞之存活；以及(e)相對於表現人類TIM-3之未治療細胞，計算細胞存活百分比。在某些實施例中，與在Hum11(IgG4 S228P)存在下的細胞存活百分比相比，在該抗體存在下的細胞存活百分比低至少50%。在某些實施例中，表現人類TIM-3之細胞為Kasumi-3細胞。在某些實施例中，表現人類TIM-3之細胞為Kasumi-3細胞(ATCC® CRL-2725TM)。在某些實施例中，表現人類TIM-3之細胞為經工程化以表現人類TIM-3之Jurkat細胞。
在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含含有胺基酸序列之重鏈可變區，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：24-35組成之群的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%相同。在某些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：24-35組成之群的胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含含有胺基酸序列之輕鏈可變區，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：36-47組成之群的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%相同。在某些實施例中，輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：36-47組成之群的胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。在某些實施例中，如本文描述之抗體之輕鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有選自由SEQ ID NO：24-35組成之群的胺基酸序列之重鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包 含含有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：70、71、72、73、74或75之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含含有選自由SEQ ID NO：24-35組成之群的胺基酸序列之重鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：70、71、72、73、74或75之胺基酸序列的重鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有選自由SEQ ID NO：36-47組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。在某些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：76或77之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，如本文描述之抗體之輕 鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含含有選自由SEQ ID NO：36-47組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。在某些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：76或77之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或分離抗體，其中重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：25及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：28及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：32及46。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈可變區的N末端麩胺酸(E) 殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基且/或抗體之輕鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在另一態樣中，本揭示案提供一種包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或分離抗體，其中重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：25及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：28及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：32及46。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47； 25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：25及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：28及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：32及46。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：25及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO： 28及46。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別由在以下各項中闡明之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：32及46。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，其包含含有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。
在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基且/或該抗體之輕鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在某些實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有衍生自人類IGHV3-23生殖系序列之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有衍生自選自由以下組成之群之人類生殖系序列的胺基酸序列：IGKV1-27、IGKV3-11、IGKV3-20及IGKV3D-20。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，該抗體包含具有衍生自人類IGHV3-23生殖系序列之胺基酸序列的重鏈可變區，及具有衍生自選自由以下組成之群之人類生殖系序列之胺基酸序列的輕鏈可變區：IGKV1-27、IGKV3-11、IGKV3-20及IGKV3D-20。
在某些實施例中，該抗體包含選自由以下組成之群之重鏈恆定區：人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。在某些實施例中，重鏈恆定區為IgG1。在某些實施例中，IgG1之胺基酸序列包含N297A突變，該突變係根據EU編號系統來編號。在某些實施例中，該抗體包含含有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，IgG1之胺基酸序列包含N297Q突變，該突變係根據EU編號系統來編號。在某些實施例中， IgG1為非岩藻糖化IgG1。在某些實施例中，重鏈恆定區為IgG4。在某些實施例中，IgG4之胺基酸序列包含S228P突變，該突變係根據EU編號系統來編號。在某些實施例中，該抗體包含含有SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施例中，抗體包含選自由以下組成之群的輕鏈恆定區：人類IgGκ及IgGλ。在某些實施例中，輕鏈恆定區為IgGκ。在某些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO：76之胺基酸序列的輕鏈恆定區。在某些實施例中，輕鏈恆定區為IgGλ。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本文揭示之抗體交叉競爭結合至人類TIM-3的抗體或分離抗體。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：55及56中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體交叉競爭結合至人類TIM-3。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：25及46中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體交叉競爭結合至人類TIM-3。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：28及46中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體交叉競爭結合至人類TIM-3。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：32及46中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體交叉競爭結合至 人類TIM-3。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本文揭示之抗體結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：55及56中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體結合至人類TIM-3之相同表位。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：25及46中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體結合至人類TIM-3之相同表位。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：28及46中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體結合至人類TIM-3之相同表位。在某些實施例中，本揭示案提供一種抗體或分離抗體，該抗體與包含分別在SEQ ID NO：32及46中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之抗體結合至人類TIM-3之相同表位。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其中與具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列之野生型TIM-3蛋白相比，該抗體以較低親和力特異性結合至具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之變異TIM-3蛋白。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在一實施例中，與具有SEQ ID NO：79之胺基 酸序列之野生型TIM-3蛋白相比，該抗體以較低親和力特異性結合至具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之變異TIM-3蛋白。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其中抗體不特異性結合至具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列的變異TIM-3蛋白。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在一實施例中，抗體不特異性結合至具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列的變異TIM-3蛋白。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其中相對於抗體與具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列之野生型TIM-3蛋白之間的結合，抗體與具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之變異TIM-3蛋白之間的結合大體上減弱。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在一實施例中，相對於抗體與具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列之野生型TIM-3蛋白之間的結合，抗體與具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之變異TIM-3蛋白之間的結合大體上減弱。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類TIM-3之抗體或分離抗體，其中如與結合至具有 SEQ ID NO：79之胺基酸序列之野生型TIM-3蛋白相比，抗體展現與具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之變異TIM-3蛋白的減少結合或不存在結合。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在一實施例中，如與結合至具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列之野生型TIM-3蛋白相比，抗體展現與具有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之變異TIM-3蛋白的減少結合或不存在結合。
在另一態樣中，本揭示案提供一種結合，例如，特異性結合至人類TIM-3之表位的抗體或分離抗體。在某些實施例中，抗體結合至SEQ ID NO：79之殘基40。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在某些實施例中，抗體結合至SEQ ID NO：79之殘基40。
在另一態樣中，本揭示案提供一種結合，例如，特異性結合至人類TIM-3之表位的抗體或分離抗體。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：93之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：94之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：95之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位 於由SEQ ID NO：96之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：97之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：98之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：99之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：100之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：93之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：94之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：95之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：96之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：97之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：98之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：99之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。在某些 實施例中，抗體結合至位於由SEQ ID NO：100之胺基酸序列組成的人類TIM-3之區域內的表位。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：93中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：93中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：94中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：94中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：95中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：95中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：96中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：96中闡明之胺基酸序列 組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：97中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：97中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：98中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時可減少由在SEQ ID NO：98中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在一些實施例中，使用例如在本文實例中所述的氫-氘交換(HDX)來量測氫/氘交換之減少。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體。在某些實施例中，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：93中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：93中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在某些實施例中，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：94中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：94中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在某些實施例中，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：95中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：95中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在某些實施例中，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：96中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：96中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在某些實施例中，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：97中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：97中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在某些實施例中，與不存在該抗體的情況下由在SEQ ID NO：98中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換相比，該抗體在結合至包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之人類TIM-3蛋白或其片段時減少由在SEQ ID NO：98中闡明之胺基酸序列組成之區域中的氫/氘交換，如藉由氫/氘檢定來判定。在一些 實施例中，使用例如在本文實例中所述的氫-氘交換(HDX)來量測氫/氘交換之減少。
在另一態樣中，本揭示案提供一種與本發明之任何抗體結合，例如，特異性結合至人類TIM-3之相同表位的抗體或分離抗體，其中表位藉由例如在實例中所述的氫-氘交換(HDX)、藉由例如在實例中所述的Pepscan分析或藉由例如在實例中所述的丙胺酸掃描來判定。
在某些實施例中，抗體包含作為野生型人類IgG重鏈恆定區之變異體的人類IgG重鏈恆定區，其中與野生型人類IgG重鏈恆定區結合至人類Fcγ受體相比，變異的人類IgG重鏈恆定區以較低親和力結合至人類Fcγ受體。在某些實施例中，人類Fcγ受體選自由以下組成之群：FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在某些實施例中，變異的人類IgG重鏈恆定區為包含N297A突變之IgG1恆定區。
在某些實施例中，抗體為人類抗體。在某些實施例中，抗體拮抗人類TIM-3。在某些實施例中，抗體去活化、降低或抑制人類TIM-3之活性。在某些實施例中，抗體抑制人類TIM-3結合至磷脂醯絲胺酸。在某些實施例中，抗體誘導經葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之末梢血單核細胞(PBMC)之IFNγ產生。在某些實施例中，抗體誘導經抗CD3及抗CD28抗體刺激之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之IFNγ或TNFα產生。
在某些實施例中，抗體在結合至表現人類TIM-3之細胞後內化。
在另一態樣中，本揭示案提供一種接合至細胞毒性劑的本文揭示之抗體或分離抗體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種接合至細胞生長抑制劑的本文揭示之抗體或分離抗體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種接合至毒素的本文揭示之抗體或分離抗體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種接合至放射性核素的本文揭示之抗體或分離抗體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種接合至可偵測標記的本文揭示之抗體或分離抗體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種包含本文揭示之抗體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示案提供一種編碼本文揭示之抗體之重鏈及/或輕鏈的多核苷酸或分離的多核苷酸。在另一態樣中，本揭示案提供一種包含多核苷酸之載體。在另一態樣中，本揭示案提供一種包含多核苷酸之重組宿主細胞。在另一態樣中，本揭示案提供一種包含載體之重組宿主細胞。在另一態樣中，本揭示案提供一種產生本文揭示之抗體的方法，該方法包括培養宿主細胞以便表現多核苷酸並且產生抗體。在一實施例中，該方法為活體外方法。
在一實施例中，本發明係關於本發明之抗體、或本發明之醫藥組合物、或本發明之多核苷酸、或本 發明之載體、或本發明之重組宿主細胞，其係用作藥劑。
在一實施例中，本發明係關於本發明之抗體、或本發明之醫藥組合物、或本發明之多核苷酸、或本發明之載體、或本發明之重組宿主細胞，其係用作診斷劑。
在另一態樣中，本揭示案提供一種增強受試者中響應於抗原之T細胞活化的方法，該方法包括向受試者投與有效量之如本文揭示之抗體或醫藥組合物。在另一態樣中，本揭示案提供一種治療受試者之癌症的方法，該方法包括向受試者投與有效量之如本文揭示之抗體或醫藥組合物。在前述方法之某些實施例中，皮下投與抗體或醫藥組合物。在前述方法之某些實施例中，靜脈內投與抗體或醫藥組合物。在前述方法之某些實施例中，瘤內投與抗體或醫藥組合物。在前述方法之某些實施例中，將抗體或醫藥組合物遞送至腫瘤引流淋巴結。在前述方法之某些實施例中，動脈內投與抗體或醫藥組合物。
在一態樣中，本發明係關於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物，其係用於增強響應於抗原之T細胞活化的方法中。
在一態樣中，本發明係關於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物，其係用於增強受試者中響應於抗原之T細胞活化的方法中。
在一態樣中，本發明係關於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物，其係 用於增強受試者中響應於抗原之T細胞活化的方法中，該方法包括向受試者投與有效量之本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物。
在一態樣中，本發明係關於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物，其係用於治療癌症之方法中。
在一態樣中，本發明係關於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物，其係用於治療受試者之癌症的方法中。
在一態樣中，本發明係關於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物，其係用於治療受試者之癌症的方法中，該方法包括向受試者投與有效量之本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物。
在用於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物之一實施例中，皮下或靜脈內投與抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物。在用於本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物之另一實施例中，瘤內或動脈內投與抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物。
在某些實施例中，前述方法進一步包括向受試者投與額外的治療劑。因此，在本發明之方法中使用的抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物 之一實施例中，該方法進一步包括向受試者投與額外的治療劑。
在一態樣中，本發明係關於(a)本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物以及(b)作為藥劑來使用之額外治療劑。
在一態樣中，本發明係關於(a)本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物以及(b)在治療癌症之方法中使用之額外治療劑。
在一態樣中，本發明係關於醫藥組合物、套組或部件套組，其包含(a)本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物以及(b)額外的治療劑。
在某些實施例中，額外的治療劑為化學治療劑。在某些實施例中，額外的治療劑為放射治療劑。
在某些實施例中，額外的治療劑為檢查點靶向劑。在某些實施例中，檢查點靶向劑選自由以下組成之群：拮抗劑抗-PD-1抗體、拮抗劑抗-PD-L1抗體、拮抗劑抗-PD-L2抗體、拮抗劑抗-CTLA-4抗體、拮抗劑抗-TIM-3抗體、拮抗劑抗-LAG-3抗體、拮抗劑抗-CEACAM1抗體、促效劑抗-CD137抗體、拮抗劑抗-TIGIT抗體、拮抗劑抗-VISTA抗體、促效劑抗-GITR抗體及促效劑抗-OX40抗體。在某些實施例中，額外的治療劑為抗-PD-1抗體。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為派姆單抗。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為妮威祿單抗。
在某些實施例中，額外的治療劑為吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。在某些實施例中，抑制劑選自由以下組成之群：epacadostat、F001287、indoximod及NLG919。在某些實施例中，抑制劑為epacadostat。在某些實施例中，抑制劑為F001287。在某些實施例中，抑制劑為indoximod。在某些實施例中，抑制劑為NLG919。
在某些實施例中，額外的治療劑為疫苗。在某些實施例中，疫苗包含熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，該複合物包含與抗原肽複合之熱休克蛋白。在某些實施例中，熱休克蛋白為hsc70並且與腫瘤相關抗原肽複合。在某些實施例中，熱休克蛋白為gp96蛋白並且與腫瘤相關抗原肽複合，其中HSPPC係衍生自從受試者獲得之腫瘤。在某些實施例中，額外的治療劑包含TCR。在某些實施例中，額外的治療劑為可溶性TCR。在某些實施例中，額外的治療劑為表現TCR之細胞。在某些實施例中，額外的治療劑為表現嵌合抗原受體之細胞。在某些實施例中，額外的治療劑為特異性結合至肽-MHC複合物之抗體。在某些實施例中，額外的治療劑為佐劑。在一態樣中，本發明係關於(a)本發明之抗體、多核苷酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物以及(b)作為藥劑來使用，例如，在治療癌症之方法中使用的疫苗，視情況其中該疫苗包含熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，該複合物包含與抗原肽複合之熱休克蛋白。在一態樣中，本發明係關於醫藥組合物、套組或部件套組，其包含(a)本發明之抗體、多核苷 酸、載體、重組宿主細胞及/或醫藥組合物以及(b)疫苗，視情況其中該疫苗包含熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，該複合物包含與抗原肽複合之熱休克蛋白。
圖1為展示抗-TIM-3抗體pab2085(IgG1)及pab2088(IgG1)或同種型對照抗體與野生型鼠科1624-5細胞或經工程化以表現人類TIM-3之1624-5細胞之結合的一組直方圖，如藉由流式細胞術所量測。
圖2A及2B為展示抗-TIM-3抗體pab2085(IgG1)(圖2A)及pab2088(IgG1)(圖2B)與重組人類TIM-1His(rhTIM-1 His)、重組人類TIM-4 His(rhTIM-4 His)、重組人類TIM-3His(rhTIM-3 His)、重組人類TIM-3 Fc(rhTIM-3 Fc)及重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(rcmTIM-3 Fc)之結合的一對圖表，如藉由Luminex檢定所量測。中值螢光強度(MFI)值係相對於抗體濃度來作圖。
圖3A、3B、3C及3D為展示抗-TIM-3抗體或同種型對照抗體與經工程化以表現人類TIM-3(圖3A及3B)或食蟹獼猴TIM-3(圖3C及3D)之鼠科1624-5細胞之結合的一組直方圖，如藉由流式細胞術所量測。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體包括pab2173、pab2174、pab2175、pab2176、pab2177、pab2178、pab2179、pab2180、pab2181、pab2182、pab2183、pab2184、pab2185、pab2186、pab2187、pab2188、pab2189、 pab2190、pab2191及pab2192，該等抗體都含有IgG1 Fc區。
圖4為展示抗-TIM-3抗體pab2085、輕鏈優化之變異體(pab2184、pab2186、pab2187、pab2188、pab2189、pab2190、pab2191及pab2192)或同種型對照抗體與經抗CD3及抗CD28抗體活化之初級人類CD8+T細胞之結合的圖表，如藉由流式細胞術所量測。輕鏈優化之變異體含有IgG1變異體Fc區。MFI值係相對於所測試的一系列抗體濃度來作圖。
圖5為展示抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)或同種型對照抗體與初級食蟹獼猴CD11b+骨髓細胞之結合的圖表，如藉由流式細胞術所量測。MFI值係相對於抗體濃度來作圖。
圖6A及6B為展示在存在抗-TIM-3抗體或IgG1同種型對照抗體之劑量滴定的情況下經照射之表現磷脂醯絲胺酸的WR19L鼠科淋巴瘤細胞與重組人類TIM-3 Fc(圖6A)或重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(圖6B)之間的結合百分比的圖表。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體為pab2085(IgG1)及pab2188(IgG1變異體)。
圖7為展示在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之後的人類末梢血單核細胞(PBMC)中由抗-TIM-3抗體或IgG1同種型對照抗體以及抗-PD-1抗體派姆單抗所誘導之IFNγ產生的條形圖。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體包括輕鏈優化之變異體pab2175(IgG1)、pab2176(IgG1)、 pab2180(IgG1)、pab2182(IgG1)、pab2183(IgG1變異體)、pab2184(IgG1變異體)、pab2186(IgG1變異體)、pab2187(IgG1變異體)、pab2188(IgG1變異體)、pab2189(IgG1變異體)、pab2190(IgG1變異體)、pab2191(IgG1變異體)及pab2192(IgG1變異體)。
圖8A、8B、8C、8D、8E及8F為展示在SEA刺激之後來自六個不同供體之人類PBMC中由單獨或與抗-PD-1抗體派姆單抗組合的抗-TIM-3抗體pab2188w(IgG1 N297A)或IgG1N297A同種型對照抗體所誘導之IFNγ產生的一組條形圖。在圖8A-8F描繪之研究中使用的實驗程序係由圖7描繪之研究中使用的實驗程序修改而來。
圖9A、9B、9C、9D、9E及9F為展示抗-TIM-3抗體結合至表現TIM-3之細胞的圖表或直方圖。在圖9A、9B、9E及9F中，MFI值係相對於所測試的一系列抗體濃度來作圖。圖9C及9D為展示抗-TIM-3抗體結合至表現TIM-3之細胞的一組直方圖。所測試的抗-TIM-3抗體包括pab2188w(IgG1 N297A)、AM-1(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)、AM-3(IgG1 N297A)、AM-4(IgG1 N297A)、AM-5(IgG1 N297A)、AM-6(IgG1 N297A)、AM-7(IgG1 N297A)、AM-8(IgG1 N297A)及AM-9(IgG1 N297A)。所測試的細胞為異位表現人類TIM-3之Jurkat細胞(圖9A)、Kasumi-3(一種內源性表現TIM-3之人類急性骨髓性白血病細胞株)(圖9B)、經葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之人類CD8+T細胞(圖9C)、經SEA刺激之食 蟹獼猴CD8+T細胞(圖9D)、以及初級人類(圖9E)及食蟹獼猴(圖9F)CD14+骨髓細胞。
圖10A、10B、10C及10D為展示抗-TIM-3抗體或IgG1 N297A同種型對照抗體結合至重組人類TIM-3 His(rhTIM-3 His)、重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(rcmTIM-3 Fc)、重組小鼠TIM-3 Fc(rmTIM-3 Fc)、重組人類TIM-1 His(rhTIM-1 His)、重組人類TIM-4 His(rhTIM-4 His)、重組人類OX40 His(rhOX40 His)、重組人類GITR Fc(rhGITR Fc)、重組人類DR3 Fc(rhDR3 Fc)及重組人類CD137 Fc(rhCD137 Fc)之圖表，如藉由Luminex檢定所量測。MFI值係相對於抗體濃度來作圖。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體包括pab2188w(IgG1 N297A)(圖10B)、AM-2(IgG1 N297A)(圖10C)及AM-6(IgG1 N297A)(圖10D)。
圖11A及11B為展示在存在抗-TIM-3抗體或IgG1 N297A同種型對照抗體之劑量滴定的情況下重組人類TIM-3 Fc(圖11A)或重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(圖11B)與表現磷脂醯絲胺酸之WR19L細胞之間的結合百分比之圖表。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體包括pab2188w(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)及AM-6(IgG1 N297A)。
圖12A及12B為展示在SEA刺激之後來自兩個不同供體之人類PBMC中由單獨或與抗-PD-1抗體派姆單抗組合的抗-TIM-3抗體或IgG1 N297A同種型對照抗體所誘導之IFNγ產生的條形圖。所測試的抗-TIM-3抗體包 括pab2188w(IgG1 N297A)、AM-1(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)、AM-3(IgG1 N297A)、AM-4(IgG1 N297A)、AM-5(IgG1 N297A)、AM-6(IgG1 N297A)、AM-7(IgG1 N297A)及AM-8(IgG1 N297A)。
圖13A、13B、13C、13D、13E及13F為展示由單獨或與抗-PD-1抗體派姆單抗組合之抗-TIM-3抗體或IgG1 N297A同種型對照抗體所誘導的初級腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之IFNγ或TNFα產生的圖表。TIL係由非小細胞肺癌(NSCLC)(圖13A及13B)、膽囊腺癌(圖13C及13D)或乳腺癌(圖13E及13F)腫瘤分離並且用抗CD3/CD28微珠活化。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體包括pab2188w(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)及AM-6(IgG1 N297A)。
圖14A、14B及14C為展示相對於未治療的對照組，在與抗-TIM-3抗體或IgG1 N297A同種型對照抗體一起培育之後的細胞存活百分比之圖表。圖14A及14B展示使用所指示的抗體以及次級抗體藥物接合物αHFc-NC-DM1之治療。所測試的細胞為經工程化以過度表現TIM-3之Jurkat細胞(圖14A)或Kasumi-3細胞，亦即一種內源性表現TIM-3之急性骨髓性白血病細胞株(圖14B)。圖14C展示使用作為與單甲奧里斯他汀E(MMAE)之接合物的所指示抗體之治療。在此項研究中測試之抗-TIM-3抗體包括pab2188w(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)、AM-6(IgG1 N297A)及參考抗體Hum11(IgG4 S228P)及 pab1944w(IgG1 N297A)。
圖15為展示在與10μg/mL抗-TIM-3抗體AM-2或同種型對照抗體一起培育時表現HaloTag-TIM-3融合蛋白之Jurkat細胞中的TIM-3內化之一系列圖表，如在各個時間點(即，在0-3.5小時)藉由活細胞共焦螢光顯微術來判定。黑點指示在給定時間點對於每個條件所觀察到的平均螢光水準。
本揭示案提供特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且拮抗TIM-3功能，例如，TIM-3介導之免疫抑制的抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組合物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞、以及使用此等抗體來治療受試者之方法。本文揭示之抗體尤其適用於增強響應於抗原(例如，腫瘤抗原或感染性疾病抗原)之T細胞活化，由此治療受試者之癌症或者治療或預防受試者之感染性疾病。本文所述之「分離抗體」之所有實例另外設想為可但不必分離之抗體。本文所述之「分離多核苷酸」之所有實例另外設想為可但不必分離之多核苷酸。本文所述之「抗體」之所有實例另外設想為可但不必分離之抗體。本文所述之「多核苷酸」之所有實例另外設想為可但不必分離之多核苷酸。
5.1 定義
如本文使用，術語「約」及「近似」在用於修飾數值或數值範圍時指示高於該值或範圍5%至10%(例如，高達5%至10%)及低於該值或範圍5%至10%(例如，低達5%至10%)之偏差仍然在所列舉的值或範圍之期望含義內。
如本文使用，術語「TIM-3」係指T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3(亦稱為含有T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3之蛋白質或A型肝炎病毒細胞受體2(HAVCR2))，其在人類中係由HAVCR2基因編碼。Swiss-Prot登錄號Q8TDQ0-1提供示範性人類TIM-3胺基酸序列。人類TIM-3之未成熟胺基酸序列提供為SEQ ID NO：78。人類TIM-3之成熟胺基酸序列提供為SEQ ID NO：79。如本文使用，術語「人類TIM-3」係指包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列之TIM-3。
如本文使用，術語「抗體(antibody)」及「抗體(antibodies)」包括全長抗體、全長抗體之抗原結合片段，以及包含抗體CDR、VH區或VL區之分子。抗體之實例包括單株抗體、重組產生抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、內抗體、異源接合抗體、抗體-藥物接合物、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fvs(scFv)、駱駝化抗 體、親合體、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物-連接的Fvs(sdFv)、抗-獨特型(抗-Id)抗體(包括例如抗-抗-Id抗體)，以及上述抗體中之任一者之抗原結合片段。在某些實施例中，本文描述之抗體係指多株抗體群。抗體可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)，任何類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)，或任何子類(例如，IgG2a或IgG2b)之免疫球蛋白分子。在某些實施例中，本文描述之抗體為IgG抗體，或其類別(例如，人類IgG1或IgG4)或子類。在具體實施例中，抗體為人源化單株抗體。在另一具體實施例中，抗體為人類單株抗體。
如本文所用，術語「VH區」及「VL區」分別係指單一抗體重鏈及輕鏈可變區，其包含FR(構架區)1、2、3及4以及CDR(互補決定區)1、2及3(參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(NIH出版號91-3242,Bethesda)，其全部以引用方式併入本文)。
如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」意謂見於重鏈與輕鏈多肽之可變區內的非連續抗原結合位點。此等特定區域係由Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述，其全部以引用方式併人本文， 其中該等定義包括胺基酸殘基在彼此相比較時之重疊或子集。在某些實施例中，術語「CDR」為如由MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)及Martin A.「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,」in Antibody Engineering,Kontermann and Dübel編，第31章，第422-439頁，Springer-Verlag,Berlin(2001)定義之CDR。在某些實施例中，術語「CDR」為如由Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)定義之CDR。在某些實施例中，使用不同慣例來定義抗體之重鏈CDR及輕鏈CDR。舉例而言，在某些實施例中，重鏈CDR係根據MacCallum(上述)來定義，且輕鏈CDR係根據Kabat(上述)來定義。CDRH1、CDRH2及CDRH3表示重鏈CDR，且CDRL1、CDRL2及CDRL3表示輕鏈CDR。
如本文所用，術語「構架(FR)胺基酸殘基」係指免疫球蛋白鏈之構架區中的彼等胺基酸。如本文所用，如本文所用，術語「構架區」或「FR區」包括作為可變區之部分而非CDR(例如使用CDR之Kabat或MacCallum定義)之部分的胺基酸殘基。
如本文所用，術語「可變區」及「可變域」可互換使用並且在此項技術中係常見的。可變區通常係指抗體之一部分，一般而言輕鏈或重鏈之一部分，通常成熟重鏈中胺基末端約110至120個胺基酸或110至125個胺 基酸及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間在序列上廣泛不同並且用於特定抗體針對其特定抗原之結合及特異性中。序列之可變性集中在稱為互補決定區(CDR)之彼等區域中，而可變域中之更高度保守區係稱為構架區(FR)。不希望受任何特定機制或理論束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用及特異性。在某些實施例中，可變區為人類可變區。在某些實施例中，可變區包含齧齒動物或鼠科CDR及人類構架區(FR)。在具體實施例中，可變區為靈長類動物(例如，非人類靈長類動物)可變區。在某些實施例中，可變區包含齧齒動物或鼠科CDR及靈長類動物(例如，非人類靈長類動物)構架區(FR)。
術語「VL」與「VL域」可互換使用以指代抗體之輕鏈可變區。
術語「VH」與「VH域」可互換使用以指代抗體之重鏈可變區。
如本文所用，術語「恆定區」與「恆定域」可互換並且在此項技術中係常見的。恆定區為抗體部分，例如，輕鏈及/或重鏈之羧基末端部分，其不直接參與抗體與抗原之結合但可展現各種效應功能，諸如與Fc受體(例如，Fcγ受體)之相互作用。免疫球蛋白分子之恆定區一般相對於免疫球蛋白可變域具有更保守之胺基酸序列。
如本文所用，術語「重鏈」在關於抗體使用時可指代基於恆定域之胺基酸序列的任何不同類型，例 如，α、δ、ε、γ及μ，從而分別產生IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類別之抗體，包括IgG之子類，例如，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
如本文所用，術語「輕鏈」在關於抗體使用時可指代基於恆定域之胺基酸序列的任何不同類型，例如，κ或λ。輕鏈胺基酸序列在此項技術中為熟知的。在具體實施方案中，輕鏈為人類輕鏈。
如本文所用，術語「EU編號系統」係指抗體之恆定區之EU編號慣例，如在Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)及Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health and Human Services，第5版，1991中所描述，其各自全部以引用方式併入本文。
「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總強度。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對於其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD)表示。親和力可以此項技術中已知之許多方法來量測及/或表現，該等方法包括但不限於平衡解離常數(KD)及平衡締合常數(KA)。KD係由koff/kon之商數來計算，而KA係由kon/koff之商數來計算。kon係指例如抗體與抗原之締合速率常數，且koff係指例如抗體與抗原之解離速率常數。kon及koff可藉由普通熟習此項 技術者已知之技術，諸如BIAcore®或KinExA來判定。如本文所用，「較低親和力」係指較大KD。
如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」、「免疫特異性結合」及「免疫特異性識別」為在抗體情況下之類似術語並且係指結合至抗原(例如，表位或免疫複合物)之分子，此結合為熟習此項技術者所理解。舉例而言，特異性結合至抗原之分子一般可以較低親和力結合至其他肽或多肽，如藉由例如免疫檢定、BIAcore®、KinExA3000儀器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或在此項技術中已知之其他檢定來判定。在具體實施例中，特異性結合至抗原之分子以比分子非特異性結合至另一抗原時之KA大至少2個對數(例如，10之因素)、2.5個對數、3個對數、4個對數或更大的KA結合至抗原。
在另一具體實施例中，特異性結合至抗原之分子在類似結合條件下不與其他蛋白質交叉反應。在另一具體實施例中，特異性結合至TIM-3之分子不與其他非TIM-3蛋白交叉反應。在一具體實施例中，本文提供一種以與結合至另一無關抗原相比更高之親和力結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)的抗體。在某些實施例中，本文提供一種以與結合至另一無關抗原相比高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大之親和力結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體，如藉由例如放射免疫檢定、表面電漿子共振或動力排阻檢定所量測。在一具體實施例 中，本文所述之抗-TIM-3抗體與無關的非TIM-3蛋白結合之程度小於該抗體與TIM-3蛋白結合之10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫檢定所量測。
如本文所用，術語「非岩藻糖化作用」或「非岩藻糖化」在Fc之情況下係指直接或間接地共價連接至根據EU編號系統所編號之人類IgG1 Fc區之殘基297，或非IgG1或非人類IgG1免疫球蛋白中之相應殘基的岩藻糖之實質性缺乏。因此，在包含複數個非岩藻糖化抗體之組合物中，至少70%之抗體不會在抗體之Fc區之殘基297處直接或間接地(例如，經由介入糖)來岩藻糖化，並且在一些實施例中，至少80%、85%、90%、95%或99%不會在Fc區之殘基297處直接或間接地岩藻糖化。
如本文所用，「表位」為此項技術中之術語並且係指抗體可特異性結合至的抗原之局部區域。表位可為例如多肽之連續胺基酸(線性或連續表位)或表位可為例如來自一或多個多肽之兩個或兩個以上非連續區域之集合(構形、非線性、不連續或非連續表位)。在某些實施例中，抗體結合至之表位可藉由例如NMR光譜術、X射線繞射結晶學研究、ELISA檢定、與質譜術關聯之氫/氘交換(例如，液相層析電噴霧質譜術)、基於陣列之寡肽掃描檢定(例如，使用CLIPS(肽在支架上之化學鍵合)來限制肽以便映射非連續或構形表位)及/或誘變映射(例如，定點誘變映射)來判定。對於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中已知方法之任一者來實現(例如，Giegé R等人， (1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303，其各自全部以引用方式併入本文)。抗體：抗原晶體可使用熟知的X射線繞射技術來研究並且可使用電腦軟體諸如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.發售；參見例如Meth Enzymol(1985)第114 & 115卷，Wyckoff HW等人編；U.S.2004/0014194)，及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423,Carter CW；Roversi P等人編，(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323)來細化，其各自全部以引用方式併入本文。誘變映射研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現。關於誘變技術，包括丙胺酸掃描誘變技術的描述，參見例如Champe M等人，(1995)J Biol Chem 270：1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA(1989)Science 244：1081-1085，其各自全部以引用方式併入本文。CLIPS(肽在支架上之化學鍵合)係將一或多種肽以結構受限構型來呈現以便充當複雜蛋白質域之功能模擬物的一種技術。參見，例如，美國公開案第US 2008/0139407 A1號及第US 2007/099240 A1號，及美國專利第7,972,993號，其中每一者全部以引用方式併入本文。在一具體實施例中，抗體之表位係使用丙胺酸掃描誘 變研究來判定。在一具體實施例中，抗體之表位係使用與質譜術關聯之氫/氘交換來判定。在一具體實施例中，抗體之表位係使用來自Pepscan Therapeutics之CLIPS表位映射技術來判定。
如本文所用，術語由特定胺基酸序列或一組胺基酸殘基組成的「位於人類TIM-3之區域內之表位」係指包含指定區域之一或多個胺基酸殘基的表位，其中指定區域包括人類TIM-3之區域的第一個指定胺基酸殘基及最後一個指定胺基酸殘基。在某些實施例中，表位包含位於指定區域內的每一個胺基酸殘基。在某些實施例中，在指定區域外的人類TIM-3之一或多個額外胺基酸殘基與位於指定區域內的表位一起結合至抗體。
如本文所用，術語「T細胞受體」及「TCR」可互換使用並且係指全長異源二聚αβ或γδ TCR、全長TCR之抗原結合片段及包含TCR CDR或可變區之分子。TCR之實例包括但不限於全長TCR、全長TCR之抗原結合片段、缺乏跨膜及細胞質區之可溶性TCR、含有藉由可撓性連接子連接的TCR之可變區的單鏈TCR、藉由工程化二硫鍵連接之TCR鏈、單特異性TCR、多特異性TCR(包括雙特異性TCR)、TCR融合物、人類TCR、人源化TCR、嵌合TCR、重組產生的TCR及合成TCR。該術語包括野生型TCR及基因工程化的TCR(例如，嵌合TCR，其包含嵌合TCR鏈，該TCR鏈包括來自第一物種之TCR的第一部分及來自第二物種之TCR的第二部分)。
如本文所用，術語「主要組織相容性複合物」及「MHC」可互換使用並且係指MHC I類分子及/或MHC II類分子。
如本文所用，術語「肽-MHC複合物」係指MHC分子(MHC I類或MHC II類)，其中肽結合在MHC的此項技術中公認之肽結合袋中。
如本文所用，術語「治療」係指本文所述之治療或預防措施。「治療」方法採用將抗體投予患有疾病或病症之受試者或易患有該種疾病或病症之受試者，以便預防、治癒、延遲該疾病或病症或復發的疾病或病症、降低其嚴重程度或改善其一或多種症狀，或延長受試者存活使其超過不存在該種治療下之預期存活。
如本文所用，術語「有效量」在將療法投予受試者之情況下係指達成所需預防或治療效果的療法之量。
如本文所用，術語「受試者」包括任何人類或非人類動物。在一實施例中，受試者為人類或非人類哺乳動物。在一實施例中，受試者為人類。
兩個序列(例如，胺基酸序列或核酸序列)之間的「一致性百分比」之判定可使用數學演算法完成。用於比較兩個序列之數學演算法之一具體、非限制性實例為Karlin S & Altschul SF(1990)PNAS 87：2264-2268之演算法，該演算法如在Karlin S & Altschul SF(1993)PNAS 90：5873-5877中得以改良，其中各自全部以引用方式併 入本文。該種演算法係併入Altschul SF等人，(1990)J Mol Biol 215：403之NBLAST及XBLAST程式中，其全部以引用方式併入本文。可執行BLAST核苷酸搜索，其中NBLAST核苷酸程式參數設定為例如評分=100，字長=12以獲得與本文所述之核酸分子同源之核苷酸序列。可執行BLAST蛋白質搜索，其中XBLAST程式參數設定為例如評分50，字長=3以獲得與本文所述之蛋白質分子同源之胺基酸序列。為了便於比較而獲得間隙比對，可如在Altschul SF等人，(1997)Nuc Acids Res 25：3389-3402中所描述來利用Gapped BLAST，其全部以引用方式併入本文。或者，PSI BLAST可用於執行重複搜索，該搜索偵測分子之間的遠近關係(同上)。當利用BLAST、Gapped BLAST及PSI Blast程式時，可使用相應程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數(參見，例如，National Center for Biotechnology Information(NCBI)on the worldwide web,ncbi.nlm.nih.gov)。用於序列比較之數學演算法之另一具體、非限制性實例為Myers and Miller,1988,CABIOS 4：11-17之演算法，其全部以引用方式併入本文。此演算法係併入ALIGN程式(2.0版)中，該程式為GCG序列比對軟體套件之部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘餘表、12之間隙寬度罰分及4之間隙罰分。
兩個序列之間的一致性百分比可使用與如上所述技術類似之技術，在允許或不允許間隙的情況下來判 定。在計算一致性百分比時，通常僅計數精確匹配。
如本文所用，術語「內化」或「內化的」係指在抗體結合至細胞表面處表現的抗原後，抗體係吸收至細胞之細胞內區室中。
5.2 抗-TIM-3抗體
在一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且拮抗TIM-3功能之抗體。示範性抗體之胺基酸序列在本文表1-4中闡明。
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在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包 含VH域，該VH域包含在本文表1中闡明的VH域之一個、兩個或所有三個CDR。在某些實施例中，抗體包含表1中闡明之VH域中之一者的CDRH1。在某些實施例中，抗體包含表1中闡明之VH域中之一者的CDRH2。在某些實施例中，抗體包含表1中闡明之VH域中之一者的CDRH3。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含VL域，該VL域包含在本文表1中揭示的VL域之一個、兩個或所有三個CDR。在某些實施例中，抗體包含表1中闡明之VL域中之一者的CDRL1。在某些實施例中，抗體包含表1中闡明之VL域中之一者的CDRL2。在某些實施例中，抗體包含表1中闡明之VL域中之一者的CDRL3。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據MacCallum RM等人，(1996)J Mol Biol 262：732-745來判定，其全部以引用方式併入本文。亦參見例如Martin A.「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,」Antibody Engineering,Kontermann and Dübel編，第31章，第422-439頁，Springer-Verlag,Berlin(2001)，其全部以引用方式併入本文。在某些實施例中，抗體之重鏈CDR根據MacCallum來判定並且抗體之輕鏈CDR根據不同方法判定。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據Kabat 等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest(1991)來判定，其各自全部以引用方式併入本文。在某些實施例中，抗體之輕鏈CDR根據Kabat來判定並且抗體之重鏈CDR根據MacCallum(上述)來判定。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案來判定，該編號方案涉及免疫球蛋白結構環之位置(參見，例如，Chothia C & Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196：901-917；Al-Lazikani B等人，(1997)J Mol Biol 273：927-948；Chothia C等人，(1992)J Mol Biol 227：799-817；Tramontano A等人，(1990)J Mol Biol 215(1)：175-82；及美國專利第7,709,226號，其全部以引用方式併入本文)。通常，在使用Kabat編號慣例時，Chothia CDRH1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34處，Chothia CDRH2環存在於重鏈胺基酸52至56處，並且Chothia CDRH3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDRL1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDRL2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，並且Chothia CDRL3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDRH1環之末端視環之長度在H32與H34之間變化(此係由於Kabat編號方案將插入物置於H35A及H35B處；若35A或35B不存在，則環結束於32處；若僅35A存在，則環結束於33處；若35A及35B均存在，則環結束於34處)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含在本文表1中揭示之VH的Chothia VH CDR。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含在本文表1中揭示之VL的Chothia VL CDR。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含在本文表1中揭示之抗體的Chothia VH CDR及Chothia VL CDR。在某些實施例中，特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體包含一或多個CDR，其中Chothia及Kabat CDR具有相同胺基酸序列。在某些實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，該抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且包含Kabat CDR與Chothia CDR之組合。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據如在Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7：132-136及Lefranc M-P等人，(1999)Nucleic Acids Res 27：209-212中描述之IMGT編號系統來判定，其各自全部以引用方式併入本文。根據IMGT編號方案，CDRH1在位置26至35處，CDRH2在位置51至57處，CDRH3在位置93至102處，CDRL1在位置27至32處，CDRL2在位置50至52處且CDRL3在位置89至97處。
在某些實施例中，本揭示案提供抗體，該等抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且包含本 文表1中所揭示的抗體之CDR，如藉由IMGT編號系統來判定，例如如在Lefranc M-P(1999)上文及Lefranc M-P等人，(1999)上文中所述。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據涉及AbM高變區之AbM編號方案來判定，該編號方案代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，並且藉由Oxford Molecular之AbM抗體模型軟體(Oxford Molecular Group,Inc.)來使用，其全部以引用方式併入本文。在一特定實施例中，本揭示案提供抗體，該等抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且包含本文表1中所揭示的抗體之CDR，如藉由AbM編號方案來判定。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中抗體包含含有在SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中闡明的VH域之CDRH1、CDRH2及CDRH3區胺基酸序列的重鏈可變區，及包含在SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47中闡明的VL域之CDRL1、CDRL2及CDRL3區胺基酸序列的輕鏈可變區，其中每個CDR係根據MacCallum定義、Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義與Chothia定義之組合、IMGT編號系統或CDR之AbM定義來界定。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含： (a)CDRH1包含X1X2X3X4X5S(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列，其中X1為R、S、A、G、K、M或T，X2為Q、S、A、G、R或T，X3為N、Y、G或Q，X4為A或Q，且X5為W、M、A、S或T；及/或(b)CDRH2包含WVSAISGSGGSTY(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列；及/或(c)CDRH3包含AKGGDYGGNYFD(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；及/或(d)CDRL1包含X1ASQSVX2SSYLA(SEQ ID NO：52)之胺基酸序列，其中X1為R或G，且X2不存在或為S；及/或(e)CDRL2包含X1ASX2RAT(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列，其中X1為D或G，且X2為N、S或T；及/或(f)CDRL3包含QQYGSSPX1T(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列，其中X1為L或I。
在某些實施例中，CDRH1包含X1X2NAWS(SEQ ID NO：49)之胺基酸序列，其中：X1為R或A；且X2為Q或R。在某些實施例中，CDRH1包含X1X2GQX3S (SEQ ID NO：50)之胺基酸序列，其中：X1為K、M或G；X2為A或S；且X3為S或T。在某些實施例中，CDRH1包含X1X2QQAS(SEQ ID NO：51)之胺基酸序列，其中：X1為S、R、T或G；且X2為A、S、T或G。在某些實施例中，CDRH1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：1及4-12。在某些實施例中，CDRL1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：13-16。在某些實施例中，CDRL2包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：17-21。在某些實施例中，CDRL3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：22及23。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有分別在以下各項中闡明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH域：SEQ ID NO：1、2及3；4、2及3；5、2及3；6、2及3；7、2及3；8、2及3；9、2及3；10、2及3；11、2及3；或12、2及3。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有分別在SEQ ID NO：1、2及3中闡明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH域。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有分別在SEQ ID NO：5、2及3中闡明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH 域。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有分別在SEQ ID NO：9、2及3中闡明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH域。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有分別在以下各項中闡明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL域：SEQ ID NO：13、17及22；14、17及22；15、18及22；14、19及22；14、20及22；14、21及22；16、20及22；或14、17及23。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有分別在SEQ ID NO：14、21及22中闡明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL域。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有CDRH1、CDRH2及CDRH3區之重鏈可變區，以及含有CDRL1、CDRL2及CDRL3區之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、14、21及22；4、2、3、14、21及22；5、2、3、14、21及22；6、2、3、14、21及22；7、2、3、14、21及22；8、2、3、14、21及22；9、2、3、14、21及22；10、2、3、14、21及22；11、2、3、 14、21及22；或12、2、3、14、21及22。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有CDRH1、CDRH2及CDRH3區之重鏈可變區，以及含有CDRL1、CDRL2及CDRL3區之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區包含分別在SEQ ID NO：1、2、3、14、21及22中闡明之胺基酸序列。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有CDRH1、CDRH2及CDRH3區之重鏈可變區，及含有CDRL1、CDRL2及CDRL3區之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區包含分別在SEQ ID NO：5、2、3、14、21及22中闡明之胺基酸序列。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中該抗體包含含有CDRH1、CDRH2及CDRH3區之重鏈可變區，及含有CDRL1、CDRL2及CDRL3區之輕鏈可變區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區包含在SEQ ID NO：9、2、3、14、21及22中闡明之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例 如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有與在SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中闡明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)相同之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：24中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：25中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：26中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：27中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：28中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：29中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：30中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：31中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：32中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：33中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：34中 闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：35中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有與在SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46，或47中闡明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：36中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：37中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：38中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：39中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：40中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具 有在SEQ ID NO：41中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：42中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：43中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：44中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：45中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：46中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：47中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，如本文描述之抗體之輕鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈可變區，及含有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有與在SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中闡明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)相同之胺基酸序列的重鏈可變區，及含有與在SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47中闡明之胺基酸序列 至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有在SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區，及具有在SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47中闡明之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在以下各項中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及36中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及38中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：26及42中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及42中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及46中闡明之 胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及43中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：26及43中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：26及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：26及41中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及41中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及39中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：24及47中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及40中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：26及47中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及37中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及45中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及44中闡明之 胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及42中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及41中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及43中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：25及47中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：27及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：28及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：29及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：30及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：31及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：32及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：33及46中闡明之 胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：34及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含具有分別在SEQ ID NO：35及46中闡明之胺基酸序列的重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基且/或抗體之輕鏈可變區的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含具有衍生自人類IGHV3-23生殖系序列(例如，IGHV3-23*04，例如，具有SEQ ID NO：84之胺基酸序列)之胺基酸序列的重鏈可變區。選自構架1、構架2、構架3、CDRH1及CDRH2之一或多個區域(例如，此等區域中之兩者、三者、四者或五者)可衍生自人類IGHV3-23生殖系序列(例如，IGHV3-23*04，例如，具有SEQ ID NO：84之胺基酸序列)。在一實施例中，構架1、構架2、構架3、CDRH1及CDRH2全部衍生自人類IGHV3-23生殖系序列(例如，IGHV3-23*04，例如，具有SEQ ID NO：84之胺基酸序列)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含具有衍生自選自由以下組成之群的人類生殖系序列之胺基酸序列的輕鏈可變區：IGKV1-27(例如，IGKV1- 27*01，例如，具有SEQ ID NO：85之胺基酸序列)、IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01，例如，具有SEQ ID NO：86之胺基酸序列)、IGKV3-20(例如，IGKV3-20*01，例如，具有SEQ ID NO：87之胺基酸序列)以及IGKV3D-20(例如，IGKV3D-20*01，例如，具有SEQ ID NO：88之胺基酸序列)。選自構架1、構架2、構架3、CDRL1及CDRL2之一或多個區域(例如，此等區域中之兩者、三者、四者或五者)可衍生自選自由以下組成之群的人類生殖系序列：IGKV1-27(例如，IGKV1-27*01，例如，具有SEQ ID NO：85之胺基酸序列)、IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01，例如，具有SEQ ID NO：86之胺基酸序列)、IGKV3-20(例如，IGKV3-20*01，例如，具有SEQ ID NO：87之胺基酸序列)以及IGKV3D-20(例如，IGKV3D-20*01，例如，具有SEQ ID NO：88之胺基酸序列)。在一實施例中，構架1、構架2、構架3、CDRL1及CDRL2全部衍生自選自由以下組成之群的人類生殖系序列：IGKV1-27(例如，IGKV1-27*01，例如，具有SEQ ID NO：85之胺基酸序列)、IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01，例如，具有SEQ ID NO：86之胺基酸序列)、IGKV3-20(例如，IGKV3-20*01，例如，具有SEQ ID NO：87之胺基酸序列)以及IGKV3D-20(例如，IGKV3D-20*01，例如，具有SEQ ID NO：88之胺基酸序列)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包 含具有衍生自人類IGHV3-23生殖系序列(例如，IGHV3-23*04，例如，具有SEQ ID NO：84之胺基酸序列)之胺基酸序列的重鏈可變區，及具有衍生自選自由以下組成之群的人類生殖系序列之胺基酸序列的輕鏈可變區：IGKV1-27(例如，IGKV1-27*01，例如，具有SEQ ID NO：85之胺基酸序列)、IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01，例如，具有SEQ ID NO：86之胺基酸序列)、IGKV3-20(例如，IGKV3-20*01，例如，具有SEQ ID NO：87之胺基酸序列)及IGKV3D-20(例如，IGKV3D-20*01，例如，具有SEQ ID NO：88之胺基酸序列)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，該抗體與包含分別在以下各項中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體交叉競爭結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。
在某些實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，該抗體與本文所述之抗體，例如，包含分別在以下各項中闡明之胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區的抗體結合至TIM-3之相同或重疊表位(例如，人類TIM-3之表位)： SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。在某些實施例中，抗體之表位可藉由例如NMR光譜術、表面電漿子共振(BIAcore®)、X射線繞射結晶學研究、ELISA檢定、與質譜術關聯之氫/氘交換(例如，液相層析電噴霧質譜術)、基於陣列之寡肽掃描檢定及/或誘變映射(例如，定點誘變映射)來判定。對於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中之已知方法中之任一者來實現(例如，Giegé R等人，(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303，其全部以引用方式併入本文)。抗體：抗原晶體可使用熟知的X射線繞射技術來研究並且可使用電腦軟體諸如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.發售；參見例如Meth Enzymol(1985)第114 & 115卷，Wyckoff HW等人編；美國專利申請案第2004/0014194號)，及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423,Carter CW；RoversiP等人編， (2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323，其全部以引用方式併入本文)來細化。誘變映射研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現。關於誘變技術，包括丙胺酸掃描誘變技術的描述，參見例如Champe M等人，(1995)上述及Cunningham BC & Wells JA(1989)上述。在一具體實施例中，抗體之表位使用丙胺酸掃描誘變研究來判定。另外，識別並結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之相同或重疊表位之抗體可使用常規技術，諸如免疫檢定，例如藉由顯示一種抗體阻斷另一抗體與標靶抗原之結合的能力(亦即競爭性結合檢定)來鑒別。競爭結合檢定亦可用於判定兩個抗體是否具有針對表位之類似結合特異性。競爭性結合於檢定中測定，在該檢定中所測試之免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原諸如TIM-3(例如人類TIM-3)之特異性結合。許多類型之競爭性結合檢定為已知的，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)，固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)，夾心競爭檢定(參見Stahli C等人，(1983)Methods Enzymol 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland TN等人，(1986)J Immunol 137：3614-9)；固相直接標記檢定，固相直接標記夾心檢定(參見Harlow E & Lane D,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel GA等人，(1988)Mol Immunol 25(1)：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Cheung RC等人， (1990)Virology 176：546-52)；以及直接標記RIA(參見Moldenhauer G等人，(1990)Scand J Immunol 32：77-82)，其全部以引用方式併入本文。通常，該種檢定涉及使用與固體表面結合之經純化抗原(例如TIM-3，諸如人類TIM-3)，或帶有該等未標記之測試免疫球蛋白及經標記參考免疫球蛋白中任一者之細胞。競爭性抑制可藉由在測試免疫球蛋白存在下測定與固體表面或細胞結合的標記之量來量測。通常，測試免疫球蛋白過量存在。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合達至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更高。競爭結合檢定可以使用標記抗原或標記抗體的多種不同方式來組態。在此檢定之常見型式中，抗原係固定在96孔板上。接著，未標記之抗體阻斷標記抗體結合至抗原之能力係使用放射性或酶標記來量測。關於進一步詳情，參見，例如，Wagener C等人，(1983)J Immunol 130：2308-2315；Wagener C等人，(1984)J Immunol Methods 68：269-274；Kuroki M等人，(1990)Cancer Res 50：4872-4879；Kuroki M等人，(1992)Immunol Invest 21：523-538；Kuroki M等人，(1992)Hybridoma 11：391-407 and Antibodies：A Laboratory Manual,Ed Harlow E & Lane D編著上述，第386-389頁，其全部以引用方式併入本文。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包 含含有在以下各項中闡明之胺基酸序列的重鏈：SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：57中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：58中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：59中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：60中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：61中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：62中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：63中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：64中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：65中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：66中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：67中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含含有在SEQ ID NO：68中闡明之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pR)殘基。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有在SEQ ID NO：69中闡明之胺基酸序列的輕鏈。在 某些實施例中，如本文描述之抗體之輕鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：57之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有 SEQ ID NO：63之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，如本文描述之抗體之重鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基且/或抗體之輕鏈的N末端麩胺酸(E)殘基經置換成焦麩胺酸(pE)殘基。
任何Ig恆定區皆可用於本文揭示之抗體中。在某些實施例中，Ig區為人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何類別(例如，IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)、或任何子類(例如，IgG2a及IgG2b)之免疫球蛋白分子。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：70、71、72、73、74或75之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：76或77之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在某些實施例中，一個、兩個或兩個以上突變(例如，胺基酸取代)係引人本文所述之抗體之Fc區(例如，CH2域(人類IgG1之殘基231-340)及/或CH3域(人類IgG1之殘基341-447)及/或鉸鏈區，該等殘基根據EU編號系統來編號)中，以改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。
在某些實施例中，一個、兩個或兩個以上突變(例如，胺基酸取代)係引入Fc區之鉸鏈區(CH1域)中以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目改變(例如，增加或減少)，如例如美國專利第5,677,425號中所描述，其全部以引用方式併入本文。CH1域之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目可改變以便例如促進輕鏈及重鏈之組裝，或改變(例如，增加或減小)抗體之穩定性。
在一具體實施例中，一個、兩個或兩個以上 胺基酸突變(例如，取代、插入或缺失)係引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈--Fc域片段)中以便改變(例如，減小或增加)抗體在活體內之半衰期。關於改變(例如，減小或增加)抗體之活體內半衰期的突變之實例，參見，例如國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號；及美國專利第5,869,046號、第6,121,022、第6,277,375號及第6,165,745號，其全部以引用方式併入本文。在一些實施例中，一個、兩個或兩個以上胺基酸突變(例如，取代、插入或缺失)係引入IgG恆定域或其FcRn-結合片段(較佳Fc或鉸鏈-Fc域片段)中以便降低抗體在活體內之半衰期。在其他實施例中，一個、兩個或兩個以上胺基酸突變(例如，取代、插入或缺失)係引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈-Fc域片段)中以便增加抗體在活體內之半衰期。在一具體實施例中，抗體可在第二恆定(CH2)域(人類IgG1之殘基231-340)及/或第三恆定(CH3)域(人類IgG1之殘基341-447)中具有一或多個胺基酸突變(例如，取代)，該等結構域係根據EU編號系統來編號。在一具體實施例中，本文所述之抗體之IgG1的恆定區包含在位置252處甲硫胺酸(M)至酪胺酸(Y)的取代、在位置254處絲胺酸至酥胺酸(T)的取代及在位置256處酥胺酸(T)至麩胺酸(E)的取代，該等位置係根據EU編號系統來編號。參見美國專利第7,658,921號，其全部以引用方式併入本文。已證明與野生型之相同抗體相比，被稱為「YTE突變體」的此類型 之突變IgG顯示增加四倍之半衰期(參見Dall’Acqua WF等人，(2006)J Biol Chem 281：23514-24，其全部以引用方式併入本文)。在某些實施例中，抗體包含IgG恆定域，該恆定域包含位置251-257、285-290、308-314、385-389及428-436處之胺基酸殘基的一個、兩個、三個或三個以上胺基酸取代，該等殘基係根據EU編號系統來編號。
在一些實施例中，一個、兩個或兩個以上突變(例如，胺基酸取代)係引入本文所述之抗體之Fc區(例如，CH2域(人類IgG1之殘基231-340)及/或CH3域(人類IgG1之殘基341-447)及/或鉸鏈區，該等區域根據EU編號系統來編號)中，以便增加或減小抗體對於效應細胞表面上之Fc受體(例如，活化的Fc受體)之親和力。抗體之Fc區中降低或增加抗體對於Fc受體之親和力的突變以及將此等突變引入Fc受體或其片段中之技術為熟習此項技術者已知的。可在抗體之Fc受體中產生以便改變抗體對於Fc受體之親和力的突變之實例在例如Smith P等人，(2012)PNAS 109：6181-6186，美國專利第6,737,056號及國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號中描述，其全部以引用方式併入本文。
在另一實施例中，一個、兩個或兩個以上胺基酸取代係引入IgG恆定域Fc區中以改變抗體之效應功能。舉例而言，選自(根據EU編號系統編號之)胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多 個胺基酸可置換成不同胺基酸殘基以使得抗體具有針對效應配位體之改變的親和力但仍保留親本抗體之抗原結合能力。親和力得以針對性改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1成分。此方法在美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中進一步詳細地描述，其各自全部以引用方式併入本文。在一些實施例中，恆定區域之缺失或不活化(經由點突變或其他手段)可減少循環抗體之Fc受體結合，藉此增強腫瘤局部化。關於使恆定域缺失或不活化且由此增強腫瘤局部化之突變的描述，參見例如美國專利第5,585,097號及第8,591,886號，其各自全部以引用方式併入本文。在某些實施例中，一或多個胺基酸取代可引入本文所述之抗體之Fc區中以移除Fc區上之潛在糖基化位點，從而可減少Fc受體結合(參見，例如，Shields RL等人，(2001)J Biol Chem 276：6591-604，其全部以引用方式併入本文)。在各種實施例中，可產生本文所述抗體之恆定區中的以下突變中之一或多者：N297A取代；N297Q取代；L235A取代及L237A取代；L234A取代及L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；D265A取代；A327Q取代；或P329A取代，該等取代根據EU編號系統來編號。在某些實施例中，可在本文所述抗體之恆定區中產生選自由D265A、P329A及其組合組成之群的突變，該等突變根據EU編號系統來編號。
在一具體實施例中，本文所述之抗體包含具 有根據EU編號系統編號之N297Q或N297A胺基酸取代的IgG1恆定域。在一實施例中，本文所述之抗體包含具有選自由D265A，P329A及其組合組成之群之突變的IgG1恆定域，該突變根據EU編號系統來編號。在另一實施例中，本文所述之抗體包含具有選自由L234A、L235A及其組合組成之群之突變的IgG1恆定域，該突變根據EU編號系統來編號。在某些實施例中，本文所述之抗體之恆定區中的與人類IgG1重鏈之位置L234、L235及D265對應之位置中的胺基酸殘基分別不為L、L及D，該等位置根據EU編號系統來編號。此方法在國際公開案第WO 14/108483號中詳細描述，其全部以引用方式併入本文。在一特定實施例中，與人類IgG1重鏈之位置L234、L235及D265對應之胺基酸分別為F、E及A；或A、A及A，該等位置根據EU編號系統來編號。
在某些實施例中，選自本文所述之抗體之恆定區中的胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸可置換成不同胺基酸殘基以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)，該等殘基根據EU編號系統來編號。此方法在美國專利第6,194,551號(Idusogie等人)中進一步詳細描述，其全部以引用方式併入本文。在一些實施例中，本文所述之抗體之CH2域的N末端區中之胺基酸位置231至238內的一或多個胺基酸殘基經改變，由此更改抗體結合補體之能力，該等胺基酸位置根據EU編號系統來編號。此方法在國際公開案第 WO 94/29351號中進一步描述，其全部以引用方式併入本文。在某些實施例中，修飾本文所述抗體之Fc區以便藉由使以下位置處之一或多個胺基酸(例如，引入胺基酸取代)突變來提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力及/或增加抗體對於Fcγ受體之親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，該等位置根據EU編號系統來編號。此方法在國際公開案第WO 00/42072號中進一步描述，其全部以引用方式併入本文。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含IgG4抗體之恆定區並且根據EU編號系統來編號的重鏈之胺基酸殘基228處之絲胺酸由脯胺酸取代。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施例中，本文所述之恆定區突變或 修飾中之任一者可引入具有兩個重鏈恆定區的本文所述抗體之一個或兩個重鏈恆定區中。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且充當拮抗劑之分離抗體。
在某些實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下TIM-3(例如，人類TIM-3)活性相比，使TIM-3(例如，人類TIM-3)活性減小了至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文描述及/或熟習此項技術者已知的方法來評估。在某些實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下的TIM-3(例如，人類TIM-3)活性相比使TIM-3(例如，人類TIM-3)活性降低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述及/或熟習此項技術者已知的方法來評估。TIM-3(例如，人類TIM-3)活性之非限制性實例可包括TIM-3(例如，人類TIM-3) 傳訊、TIM-3(例如，人類TIM-3)與TIM-3(例如，人類TIM-3)配位體(例如，磷脂醯絲胺酸)的結合、以及細胞因子產生的抑制(例如，IFN-γ及/或TNF-α)。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且去活化、降低或抑制TIM-3(例如，人類TIM-3)活性之分離抗體。在具體實施例中，TIM-3(例如，人類TIM-3)活性之降低如以下實例中所描述來評估。
在具體實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下的TIM-3(例如，人類TIM-3)活性相比使TIM-3(例如，人類TIM-3)與其配位體(例如磷脂醯絲胺酸)的結合減少了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文描述(參見以下實例)及/或熟習此項技術者已知的方法來評估。在具體實施例中，本揭示案一種提供分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下TIM-3(例如，人類TIM-3)與其配位體(例如，磷脂醯絲胺酸)的結合相比使TIM-3(例如，人類TIM-3)與其配位體(例如，磷脂醯絲胺酸)的結合減少了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8 倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。
在具體實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下的細胞因子產生相比使細胞因子產生(例如，IFN-γ及/或TNF-α)增加了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。在具體實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下的細胞因子產生相比使細胞因子產生(例如，IFN-γ及/或TNF-α)增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。
在具體實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM- 3(例如人類TIM-3)之抗體)下的IFN-γ產生相比單獨或與抗-PD-1抗體(例如，派姆單抗或妮威祿單抗)組合使響應於葡萄球菌屬腸毒素A(SEA)刺激之人類末梢血單核細胞(PBMC)中的IFN-γ產生增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。
在某些實施例中，與在無任何抗體或有無關抗體(例如，不特異性結合至TIM-3(例如人類TIM-3)之抗體)下僅用SEA刺激之PBMC相比，在特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)的本文所述之抗體存在下用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之人類末梢血單核細胞(PBMC)使IFN-γ產生增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。
在具體實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，其特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且與在無特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體下的IFN-γ及/或TNFα產生相比單獨或與抗-PD-1抗體(例如，派姆單抗或妮威祿單抗)組合使響應於抗CD3抗體及抗 CD28抗體刺激之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中的IFN-γ及/或TNFα產生增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。在一實施例中，TIL來自非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤。在另一實施例中，TIL來自膽囊腺癌腫瘤。在另一實施例中，TIL來自乳腺癌腫瘤。
在某些實施例中，與在沒有特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體下僅用抗CD3及抗CD28抗體刺激之TIL相比，在特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之本文所述抗體的存在下用抗CD3及抗CD28抗體刺激之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)使IFN-γ及/或TNFα產生增加了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。在一實施例中，TIL來自非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤。在另一實施例中，TIL來自膽囊腺癌腫瘤。在另一實施例中，TIL來自乳腺癌腫瘤。
在某些實施例中，本揭示案提供一種分離抗體，該抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)並且 在結合至表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞後內化。 在具體實施例中，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%本文所述之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估。在某些實施例中，在包括以下步驟之檢定中，與在參考抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體存在下相比，在本文所述之抗體存在下，較低百分比之表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞存活：
(a)在組織培養板中，以2 x 104個細胞/孔來塗佈表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞；
(b)以100μl/孔之最終體積添加相同濃度之αHFc-NC-DM1及本文所述之抗體或參考抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體(例如，1.5ng/ml、4.6ng/ml、13.7ng/ml、41.2ng/ml、123.5ng/ml、370ng/ml、1111ng/ml或3333ng/ml)。
(c)在37℃及5% CO2下培育72小時；
(d)量測表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞之存活；以及
(e)相對於表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之未治療細胞，計算細胞存活之百分比。
在某些實施例中，與在參考抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體存在下之細胞存活百分比相比，在本文所述之 抗體存在下之細胞存活百分比低了至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在某些實施例中，與在參考抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體存在下之細胞存活百分比相比，在本文所述之抗體存在下之細胞存活百分比低了至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些實施例中，參考抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體為pab1944w(IgG1 N297A)。在某些實施例中，參考抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體為Hum11(IgG4 S228P)。在某些實施例中，表現TIM-3(例如人類TIM-3)之細胞為Kasumi-3細胞。在某些實施例中，表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞為Kasumi-3細胞(ATCC® CRL-2725TM)。在某些實施例中，表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞為經工程化以表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之Jurkat細胞。
在某些實施例中，在包括以下步驟之檢定中，相對於表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之未治療細胞，至多50%表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞在本文所述之抗體存在下存活：(a)在組織培養板中，以2 x 104個細胞/孔來塗佈表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞； (b)以100μl/孔之最終體積來添加相同濃度之αHFc-NC-DM1及本文所述之抗體(例如，1.5ng/ml、4.6ng/ml、13.7ng/ml、41.2ng/ml、123.5ng/ml、370ng/ml、1111ng/ml或3333ng/ml)；(c)在37℃及5% CO2下培育72小時；(d)量測表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞之存活；以及(e)相對於表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之未治療細胞，計算細胞存活之百分比。
在某些實施例中，相對於表現TIM-3(例如人類TIM-3)之未治療細胞，至多10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%表現TIM-3(例如人類TIM-3)之細胞在本文所述之抗體存在下存活。在某些實施例中，αHFc-NC-DM1及本文所述之抗體以1111ng/ml之濃度添加並且相對於表現TIM-3(例如人類TIM-3)之未治療細胞，至多10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%表現TIM-3(例如人類TIM-3)之細胞在本文所述之抗體存在下存活。在某些實施例中，αHFc-NC-DM1及本文所述之抗體以1111ng/ml之濃度添加並且相對於表現TIM-3(例如人類TIM-3)之未治療細胞，至多50%表現TIM-3(例如人類TIM-3)之細胞在本文所述之抗體存在下存活。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少 約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有X1X2X3X4X5S(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列的CDRH1，其中X1為R、S、A、G、K、M或T，X2為Q、S、A、G、R或T，X3為N、Y、G或Q，X4為A或Q，且X5為W、M、A、S或T。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有X1X2NAWS(SEQ ID NO：49)之胺基酸序列的CDRH1，其中X1為R或A；且X2為Q或R。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性 結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有X1X2GQX3S(SEQ ID NO：50)之胺基酸序列的CDRH1，其中X1為K、M或G；X2為A或S；且X3為S或T。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有X1X2QQAS(SEQ ID NO：51)之胺基酸序列的CDRH1，其中X1為S、R、T或G；且X2為A、S、T或G。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少 約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有WVSAISGSGGSTY(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列的CDRH2。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性.結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有AKGGDYGGNYFD(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列的CDRH3。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有X1ASQSVX2SSYLA(SEQ ID NO：52)之胺基酸 序列的CDRL1，其中X1為R或G，且X2不存在或為S。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有X1ASX2RAT(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列的CDRL2，其中X1為D或G，且X2為N、S或T。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體包含含有QQYGSSPX1T(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列的CDRL3，其中X1為L或I。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中抗體與包含分別在以下各項中闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體交叉競爭結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中該抗體與本文所述之抗體，例如，與包含分別在以下各項中 闡明之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體結合至TIM-3之相同或重疊表位(例如，人類TIM-3之表位)：SEQ ID NO：24及36；24及38；26及42；24及42；24及46；24及43；26及43；26及46；26及41；24及41；25及39；24及47；25及40；26及47；25及37；25及45；25及44；25及46；25及42；25及41；25及43；25及47；27及46；28及46；29及46；30及46；31及46；32及46；33及46；34及46；或35及46。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之分離抗體，其中至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%之抗體在結合至表現TIM-3之細胞(例如，人類TIM-3)後內化，如藉由本文描述(參見下文實例)或熟習此項技術者已知的方法來評估，並且其中該抗體包含作為野生型人類IgG重鏈恆定區之變異體的人類IgG重鏈恆定區，其中與野生型人類IgG重鏈恆定區結合至人類Fcγ受體相比，變異的人類IgG重鏈恆定區以較低親和力結合至人類Fcγ受體。在某些實施例中，人類Fcγ受體選自由以下組成之群：FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在某些實施例中，變異的人類IgG重鏈恆定區為包含N297A突變之IgG1恆定區，該突變根據EU編號系統來編號。
5.3 醫藥組合物
本文提供組合物，其包含在生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑中的具有所需純度之本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)、氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride)、氯化苄甲乙氧銨(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇、對羥苯甲酸烷酯(諸如對羥苯甲酸甲酯或丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉離子；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子介面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一具體實施例中，醫藥組合物包含在醫藥學上可接受之載劑中的本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體及視情況一或多種額外預防或治療劑。在一具 體實施例中，醫藥組合物包含在醫藥學上可接受之載劑中的有效量之本文所述抗體及視情況一或多種額外預防或治療劑。在一些實施例中，抗體為包括在醫藥組合物中之唯一活性成分。本文所述之醫藥組合物可適用於抑制TIM-3(例如，人類TIM-3)活性並且治療病狀，諸如癌症或感染性疾病。在一實施例中，本發明係關於一種包含本發明之抗-TIM-3抗體的本發明之醫藥組合物，該組合物係用作藥劑。在另一實施例中，本發明係關於在治療癌症或感染性疾病之方法中使用的本發明之醫藥組合物。在另一實施例中，本發明係關於本發明之醫藥組合物用於製備供治療癌症或感染性疾病用之藥劑的用途。
用於非經腸製劑中之醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮及分散劑、乳化劑、螯合或鉗合劑及其他醫藥學上可接受之物質。水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、葡萄糖及乳酸鹽林格氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。細菌抑制或真菌抑制濃度下之抗微生物劑可添加至在多劑量容器中封裝之非經腸製劑中，該等製劑包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯代丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、乙汞硫柳酸鈉、苯紮氯銨及苄索氯銨。等滲劑包括氯化鈉及葡萄糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉 劑包括鹽酸普魯卡因。懸浮及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥基丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80(TWEEN® 80)。金屬離子之螯合或鉗合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括用於水溶性媒劑之乙醇、聚乙二醇及丙二醇；及用於pH值調節之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
醫藥組合物可經配製成以任何投藥途徑來向受試者投與。投藥途徑之具體實例包括鼻內、經口、肺部、經皮、皮內及非經腸。在本文中亦涵蓋藉由皮下、肌肉內或靜脈內注射來表徵之非經腸投藥。可注射劑可以習知形式來製備，作為液體溶液或懸浮液、適於在注射之前溶解或懸浮在液體中之固體形式、或作為乳液。可注射劑、溶液及乳液亦含有一或多種賦形劑。合適的賦形劑為例如水、鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇。另外，若需要，則有待投與之醫藥組合物亦可含有少量無毒輔助物質，諸如潤濕或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解性增強劑及其他此類試劑，例如乙酸鈉、山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。
用於非經腸投與抗體之製劑包括準備注射用之無菌溶液；準備恰好在使用之前與溶劑組合之無菌乾燥可溶性產品，諸如凍乾粉末，包括皮下錠劑；準備注射用之無菌懸浮液；準備恰好在使用之前與媒劑組合之無菌乾燥不溶性產品及無菌乳液。溶液可為水性或非水性的。
若靜脈內投與，則合適的載劑包括生理鹽水 或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及含有增稠及溶解劑之溶液，諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物。
包含抗體之外用混合物係如對於局部及全身投與所描述來製備。所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似物並且可經配製為乳霜、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊劑、發泡劑、氣溶膠、沖洗液、噴霧劑、栓劑、繃帶、皮膚貼片或適於表面投與之任何其他調配物。
本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可經配製為諸如藉由吸入來表面施用之氣溶膠(參見，例如，美國專利第4,044,126號、第4,414,209號及第4,364,923號，其描述用於遞送適用於治療炎症疾病，尤其哮喘之類固醇的氣溶膠並且全部以引用方式併入本文)。用於投與呼吸道之此等調配物可呈氣溶膠或霧化器之溶液形式，或呈用於吹入之超細粉末形式，單獨或與惰性載劑諸如乳糖組合。在此情況下，在一實施例中，調配物之顆粒具有小於50微米之直徑，在一實施例中小於10微米。
本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可經配製成用於局部或表面施用，諸如以凝膠、乳霜及洗劑形式來局部施用至皮膚及諸如眼睛中之黏膜，並且用於施用至眼睛或腦池內或脊椎內施用。表面投與預期用於經皮遞送以及向眼睛或黏膜投與，或用於吸入療法。亦可投與單獨或與其他醫藥學上可接受之賦形劑組合的抗體之經 鼻溶液。
經皮貼片，包括離子導入及電泳裝置係熟習此項技術者熟知的，並且可用於投與抗體。舉例而言，此類貼片在美國專利第6,267,983號、第6,261,595號、第6,256,533號、第6,167,301號、第6,024,975號、第6,010715號、第5,985,317號、第5,983,134號、第5,948,433號及第5,860,957號中揭示，其全部以引用方式併入本文。
在某些實施例中，包含本文所述抗體之醫藥組合物為凍乾粉末，其可經重構以便以溶液、乳液及其他混合物形式來投與。其亦可經重構並配製成固體或凝膠。凍乾粉末藉由將本文所述之抗體或其醫藥學上可接受之衍生物溶解於合適的溶劑中來製備。在一些實施例中，凍乾粉末為無菌的。溶劑可含有賦形劑，該賦形劑改良粉末或由粉末製備之重構溶液之穩定性或其他藥理學成分。可使用之賦形劑包括但不限於右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的試劑。溶劑亦可含有緩衝劑，諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或為熟習此項技術者已知的其他此類緩衝劑，在一實施例中，在約中性pH下。隨後對溶液進行無菌過濾，繼之在為熟習此項技術者已知的標準條件下進行凍乾提供所需調配物。在一實施例中，將所得溶液分配至小瓶中以便凍乾。每個小瓶含有單一劑量或多個劑量之化合物。凍乾粉末可儲存在合適條件，諸如約4℃至室溫下。以注射用水來重構此凍乾粉末提供用於非經腸投與之調配物。為了重 構，將凍乾粉末添加至無菌水或其他合適的載劑中。精確量視所選擇的化合物而定。此量可在經驗上判定。
本文描述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體及本文提供之其他組合物亦可經配製以靶向有待治療之受試者之身體的特定組織、受體或其他區域。許多此類靶向方法為熟習此項技術者熟知。所有此類靶向方法在本文中預期用於本發明組合物中。關於靶向方法之非限制性實例，參見例如美國專利第6,316,652號、6,274,552號、第6,271,359號、第6,253,872號、第6,139,865號、第6,131,570號、第6,120,751號、第6,071,495號、第6,060,082號、第6,048,736號、第6,039,975號、第6,004,534號、第5,985,307號、第5,972,366號、第5,900,252號、第5,840,674號、第5,759,542號及第5,709,874號，其全部以引用方式併入本文。在一具體實施例中，本文所述之抗體靶向腫瘤。
有待用於活體內投藥之組合物可為無菌的。此可藉由經例如無菌過濾膜過濾來輕易達成。
5.4 使用方法及用途
在另一態樣中，本揭示案提供一種使用本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體來治療受試者之方法。受試者中將受益於TIM-3(例如，人類TIM-3)功能之抑制的任何疾病或病症可使用本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體來治療。本文揭示之抗-TIM-3(例 如，人類TIM-3)抗體尤其適用於抑制腫瘤之免疫系統耐受性，且因此可用作患有癌症之受試者之免疫療法。舉例而言，在某些實施例中，本揭示案提供一種增強受試者中響應於抗原之T細胞活化的方法，該方法包括向受試者投與有效量的如本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其醫藥組合物。在某些實施例中，本揭示案提供一種治療受試者之癌症的方法，該方法包括向受試者投與有效量之如本文揭示之抗體或醫藥組合物。在某些實施例中，本揭示案提供一種如本文揭示之抗體或醫藥組合物，其係用於治療癌症或感染性疾病之方法中。在某些實施例中，本揭示案提供一種如本文揭示之抗體或醫藥組合物，其係用作藥劑。在另一實施例中，本揭示案提供一種如本文揭示之抗體或醫藥組合物用於製備供治療癌症或感染性疾病用之藥劑的用途。
可用本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或醫藥組合物治療之癌症包括但不限於實體腫瘤、血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤)及轉移性病變。在一實施例中，癌症為實體腫瘤。實體腫瘤之實例包括惡性腫瘤，例如，肉瘤及癌，例如，各種器官系統之腺癌，諸如累及肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃腸(例如，結腸)、肛門、生殖器及生殖泌尿道(例如，腎、尿道上皮、膀胱細胞、前列腺)、咽喉、CNS(例如，大腦、神經或神經膠質細胞)、頭及頸、皮膚(例如、黑素瘤)及胰腺的癌；以及腺癌，包括惡性腫瘤，諸如結腸 癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌或小細胞肺癌)、小腸癌及食道癌。癌症可為早期、中期、晚期或轉移性癌。在某些實施例中，癌症與升高的PD-1活性(例如，升高的PD-1表現)相關聯。
在一實施例中，癌症選自肺癌(例如，肺腺癌或非小細胞肺癌(NSCLC)(例如，具有鱗狀及/或非鱗狀組織學之NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑素瘤(例如，晚期黑素瘤)、腎癌(例如，腎細胞癌)、肝癌(例如，肝細胞癌)、骨髓瘤(例如，多發性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如，不表現雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu中之一者、兩者或所有的乳腺癌，例如，三陰性乳腺癌)、卵巢癌、結直腸癌、胰腺癌、頭及頸癌(例如，頭及頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、肛門癌、胃-食道癌(例如，食道鱗狀細胞癌)、間皮瘤、鼻咽癌、甲狀腺癌、宮頸癌、上皮癌、腹膜癌或淋巴增生性疾病(例如，移植後淋巴增生性疾病)。在一實施例中，癌症為NSCLC。在一實施例中，癌症為腎細胞癌。在一實施例中，癌症為卵巢癌。在一具體實施例中，卵巢癌為鉑難治性卵巢癌。
在一實施例中，癌症為血液癌症，例如，白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一實施例中，癌症為白血病，例如，急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性骨髓母細胞性白血病(AML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性髓單核球性白血病(CMML)、慢性淋巴細 胞白血病(CLL)或毛細胞白血病。在一實施例中，癌症為淋巴瘤，例如，B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化的B-細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤、胚芽中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、復發性非何傑金淋巴瘤、難治性非何傑金淋巴瘤、再發濾泡性非何傑金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤或結外邊緣帶淋巴瘤。在一實施例中，癌症為骨髓瘤，例如，多發性骨髓瘤。
在另一實施例中，癌症係選自癌瘤(例如，晚期或轉移性癌瘤)、黑素瘤或肺癌，例如，非小細胞肺癌。
在一實施例中，癌症為肺癌，例如，肺腺癌、非小細胞肺癌或小細胞肺癌。
在一實施例中，癌症為黑素瘤，例如，晚期黑素瘤。在一實施例中，癌症為對於其他療法無反應的晚期或不可切除的黑素瘤。在其他實施例中，癌症為具有BRAF突變(例如，BRAF V600突變)之黑素瘤。在其他實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或醫藥組合物在使用或不使用BRAF抑制劑(例如，威羅菲尼或達拉菲尼)的情況下用抗-CTLA-4抗體(例如，伊匹珠單抗)治療之後投與。
在另一實施例中，癌症為肝癌，例如，晚期肝癌，伴有或不伴有病毒感染，例如，慢性病毒性肝炎。
在另一實施例中，癌症為前列腺癌，例如，晚期前列腺癌。
在另一實施例中，癌症為骨髓瘤，例如，多發性骨髓瘤。
在另一實施例中，癌症為腎癌，例如，腎細胞癌(RCC)(例如，轉移性RCC、透明細胞腎細胞癌(CCRCC)或腎乳突細胞癌)。
在另一實施例中，癌症選自肺癌、黑素瘤、腎癌、乳腺癌、結直腸癌、白血病或癌症之轉移性病變。
在某些實施例中，本揭示案提供一種預防或治療受試者之感染性疾病之方法，該方法包括向受試者投與有效量的如本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其醫藥組合物。在一實施例中，本文提供預防及/或治療感染(例如，病毒感染、細菌感染、真菌感染、原蟲感染或寄生蟲感染)之方法。根據該等方法預防及/或治療之感染可由本文識別之傳染媒介物引起。在一具體實施例中，本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其組合物為向受試者投與之唯一活性劑。在一些實施例中，本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其組合物與用於治療感染性疾病之抗感染干預(例如，抗病毒藥、抗細菌藥、抗真菌藥或抗腸蟲藥)組合使用。因此，在一實施例中，本發明係關於本發明之抗體及/或醫藥組合物，其係用於預防及/或治療感染性疾病之方法中，視情況其中抗體或醫藥組合物為向受試者投與之唯一活性劑，或其 中抗體或醫藥組合物與抗感染干預組合使用。
可藉由本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或醫藥組合物治療及/或預防之感染性疾病由包括但不限於細菌、寄生蟲、真菌、原蟲及病毒之傳染媒介物引起。在一具體實施例中，藉由本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或醫藥組合物治療及/或預防之感染性疾病由病毒引起。可根據本文描述之方法來預防及/或治療的病毒疾病或病毒感染包括但不限於由以下引起之疾病或感染：A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感(例如，A型流感或B型流感)、水痘、腺病毒、單純性皰疹I型(HSV-I)、單純性皰疹II型(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道融合細胞病毒、乳突狀瘤病毒、乳突多瘤空泡病毒、巨細胞病毒、棘球絛蟲病毒、節肢足動物攜帶性病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、痘疹、埃-巴二氏病毒、人類免疫缺陷病毒I型(HIV-I)、人類免疫缺陷病毒II型(HIV-II)，以及病毒性疾病諸如病毒腦膜炎、腦炎、登革熱或痘疹之媒介物。
可預防及/或治療之細菌感染包括由以下引起之感染：大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、草綠色葡萄球菌及銅綠假單胞菌。可根據本文描述之方法來預防及/或治療的由細菌(例如，大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、草綠色葡萄球菌及銅綠假單胞菌) 引起之細菌性疾病包括但不限於分枝桿菌立克次體、支原體、奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌、勃氏疏螺旋體(萊姆病)、炭疽芽孢桿菌(炭疽)、破傷風、鏈球菌、葡萄球菌、分枝桿菌、百日咳、霍亂、瘟疫、白喉、衣原體、金黃色葡萄球菌及軍團菌。
可根據本文描述之方法預防及/或治療的由原蟲引起之原蟲疾病或原蟲感染包括但不限於利什曼原蟲、球蟲病、錐蟲屬血吸蟲或瘧疾。可根據本文描述之方法預防及/或治療的由寄生蟲引起之寄生蟲疾病或寄生蟲感染包括但不限於衣原體及立克次體。
可根據本文描述之方法預防及/或治療的真菌疾病或真菌感染包括但不限於由以下引起之疾病或感染：念珠菌感染、接合菌病、念珠菌乳腺炎、伴有潛伏的毛芽胞菌血症之進行性播散性毛芽胞菌病、播散性念珠菌病、肺副球黴菌病、肺曲黴菌病、卡氏肺囊蟲肺炎、隱球菌性腦膜炎、球蟲性腦膜腦炎及腦脊髓血管炎、黑曲黴菌感染、鐮孢角膜炎、鼻旁竇真菌病、菸麯黴心內膜炎、脛骨軟骨發育不全、光滑念珠菌陰道炎、口咽念珠菌病、X連鎖慢性肉芽腫病、足癬、皮膚念珠菌病、黴菌性胎盤炎、播散性毛芽胞菌病、過敏性支氣管肺麯黴病、黴菌性角膜炎、新型隱球菌感染、真菌腹膜炎、膝曲彎孢菌感染、葡萄球菌眼內炎、胞子絲菌病以及皮膚癬菌病。
在某些實施例中，此等方法進一步包括向受試者投與另一治療劑。在某些實施例中，額外治療劑為化 學治療劑、放射治療劑或檢查點靶向劑。在某些實施例中，化學治療劑為低甲基化劑(例如，阿紮胞苷)。在某些實施例中，檢查點靶向劑選自由以下組成之群：拮抗劑抗-CTLA-4抗體、拮抗劑抗-PD-L1抗體、拮抗劑抗-PD-L2抗體、拮抗劑抗-PD-1抗體、拮抗劑抗-TIM-3抗體、拮抗劑抗-LAG-3抗體、拮抗劑抗-CEACAM1抗體、促效劑抗-CD137抗體、拮抗劑抗-TIGIT抗體、拮抗劑抗-VISTA抗體、促效劑抗-GITR抗體及促效劑抗-OX40抗體。
在一實施例中，本發明係關於一種在本發明之方法中使用的本發明之抗體及/或醫藥組合物，其中該方法進一步包括向受試者投與另一治療劑。在一實施例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物以及(b)另一治療劑，其係用作藥劑。在一實施例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物以及(b)另一治療劑，其係用於治療癌症之方法中。在另一實施例中，本發明係關於一種醫藥組合物、套組或部件套組，其包含(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物以及(b)另一治療劑。在一實施例中，該另一治療劑為化學治療劑、放射治療劑或檢查點靶向劑。
在某些實施例中，抗-PD-1抗體在本文揭示之方法中使用。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為妮威祿單抗，亦稱為BMS-936558或MDX1106，其係由Bristol-Myers Squibb開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為派姆單抗，亦稱為lambrolizumab或MK-3475，其係由 Merck & Co開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為皮地利珠單抗，亦稱為CT-011，其係由CureTech開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為MEDI0680，亦稱為AMP-514，其係由Medimmune開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為PDR001，其係由Novartis Pharmaceuticals開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為REGN2810，其係由Regeneron Pharmaceuticals開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為PF-06801591，其係由Pfizer開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為BGB-A317，其係由BeiGene開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為TSR-042，其係由AnaptysBio及Tesaro開發。在某些實施例中，抗-PD-1抗體為SHR-1210，其係由Hengrui開發。
可用於本文揭示之治療方法中的抗-PD-1抗體之其他非限制性實例在以下專利及專利申請案中揭示，其出於所有目的全部以引用方式併入本文：美國專利第6,808,710號；美國專利第7,332,582號；美國專利第7,488,802號；美國專利第8,008,449號；美國專利第8,114,845號；美國專利第8,168,757號；美國專利第8,354,509號；美國專利第8,686,119號；美國專利第8,735,553號；美國專利第8,747,847號；美國專利第8,779,105號；美國專利第8,927,697號；美國專利第8,993,731號；美國專利第9,102,727號；美國專利第9,205,148號；美國公開案第US 2013/0202623 A1號；美國公開案第US 2013/0291136 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2014/0356363 A1號；美國公開案第US 2016/0075783 A1號；及PCT公開案第WO 2013/033091 A1號；PCT公開案第WO 2015/036394 A1號；PCT公開案第WO 2014/179664 A2號；PCT公開案第WO 2014/209804 A1號；PCT公開案第WO 2014/206107 A1號；PCT公開案第WO 2015/058573 A1號；PCT公開案第WO 2015/085847 A1號；PCT公開案第WO 2015/200119 A1號；PCT公開案第WO 2016/015685 A1號；及PCT公開案第WO 2016/020856 A1號。
在某些實施例中，抗-PD-L1抗體在本文揭示之方法中使用。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為阿特立單抗，其係由Genentech開發。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為durvalumab，其係由AstraZeneca、Celgene及Medimmune開發。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為avelumab，亦稱為MSB0010718C，其係由Merck Serono及Pfizer開發。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為MDX-1105，其係由Bristol-Myers Squibb開發。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為AMP-224，其係由Amplimmune及GSK開發。
可用於本文揭示之治療方法中的抗-PD-L1抗體之非限制性實例在以下專利及專利申請案中揭示，其出於所有目的全部以引用方式併入本文：美國專利第7,943,743號；美國專利第8,168,179號；美國專利第 8,217,149號；美國專利第8,552,154號；美國專利第8,779,108號；美國專利第8,981,063號；美國專利第9,175,082號；美國公開案第US 2010/0203056 A1號；美國公開案第US 2003/0232323 A1號；美國公開案第US 2013/0323249 A1號；美國公開案第US 2014/0341917 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2015/0203580 A1號；美國公開案第US 2015/0225483 A1號；美國公開案第US 2015/0346208 A1號；美國公開案第US 2015/0355184 A1號；及PCT公開案第WO 2014/100079 A1號；PCT公開案第WO 2014/022758 A1號；PCT公開案第WO 2014/055897 A2號；PCT公開案第WO 2015/061668 A1號；PCT公開案第WO 2015/109124 A1號；PCT公開案第WO 2015/195163 A1號；PCT公開案第WO 2016/000619 A1號；及PCT公開案第WO 2016/030350 A1號。
在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與靶向免疫調節酶諸如IDO(吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶)及/或TDO(色胺酸2,3-雙加氧酶)之化合物組合向受試者投與。因此，在一實施例中，額外治療劑為靶向免疫調節酶之化合物，諸如吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。在某些實施例中，此類化合物選自由以下組成之群：epacadostat(Incyte Corp；參見，例如，WO 2010/005958，其全部以引用方式併入本文)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、indoximod (NewLink Genetics)及NLG919(NewLink Genetics)。在一實施例中，化合物為epacadostat。在另一實施例中，化合物為F001287。在另一實施例中，化合物為indoximod。在另一實施例中，化合物為NLG919。在一具體實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與治療癌症之IDO抑制劑組合向受試者投與。如本文描述用於治療癌症之IDO抑制劑以諸如錠劑、丸劑或膠囊劑之醫藥組合物的固體劑型存在，其中醫藥組合物包含IDO抑制劑及醫藥學上可接受之賦形劑。因此，如本文描述之抗體及如本文描述之IDO抑制劑可作為獨立劑型來單獨地、依序或同時投與。在一實施例中，非經腸投與抗體，並且經口投與IDO抑制劑。在具體實施例中，抑制劑選自由以下組成之群：epacadostat(Incyte Corporation)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、indoximod(NewLink Genetics)及NLG919(NewLink Genetics)。Epacadostat在PCT公開案第WO 2010/005958號中描述，其出於所有目的全部以引用方式併入本文。在一實施例中，抑制劑為epacadostat。在另一實施例中，抑制劑為F001287。在另一實施例中，抑制劑為indoximod。在另一實施例中，抑制劑為NLG919。
在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與疫苗組合向受試者投與。疫苗可為例如肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。在某些實施例中，疫苗為基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗或基於熱休克蛋白 之病原體疫苗。在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與如WO 2016/183486(其全部以引用方式併入本文)所描述之疫苗(例如，包含含有癌症特異性突變之至少一種合成肽的疫苗，該癌症特異性突變存在於受試者之癌症中)組合向受試者投與。在一具體實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗組合向受試者投與。熱休克蛋白(HSP)為廣泛見於所有物種中之高度保守的蛋白質家族。其表現可由於熱休克或其他形式之應力，包括暴露於毒素、氧化應力或葡萄糖缺乏而強力地誘導至高得多的水準。五個家族已根據分子量來分類：HSP-110、-90、-70、-60及-28。HSP經由諸如巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)之抗原呈現細胞(APC)中之交叉呈現途徑來遞送免疫原性肽，從而造成T細胞活化。HSP充當腫瘤相關抗原肽之伴護載體，由此形成能夠誘導腫瘤特異性免疫力之複合物。一旦由垂死的腫瘤細胞中釋放，HSP-抗原複合物便被抗原呈現細胞(APC)接納，其中該等抗原被加工成肽，該等肽結合MHC I類及II類分子，從而導致抗腫瘤CD8+及CD4+T細胞之活化。由源自腫瘤製劑之HSP複合物引起的免疫力特異性地針對由每個受試者之癌症所表現的獨特抗原肽譜系。因此，在一實施例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物以及(b)疫苗，其係在例如治療癌症之方法中用作藥劑。在一實施例中，本發明係關於一種醫藥組合物、套組或部件套組，其包含(a)本發明之抗 體及/或醫藥組合物以及(b)疫苗。在一實施例中，疫苗為基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗。在一實施例中，疫苗為基於熱休克蛋白之病原體疫苗。
熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)為蛋白質肽複合物，該複合物係由與抗原肽非共價複合之熱休克蛋白組成。HSPPC引出先天性及適應性免疫反應兩者。在一具體實施例中，抗原肽顯示針對所治療癌症之抗原性。HSPPC經由膜受體(主要CD91)或藉由結合至Toll樣受體而有效地被APC獲取。HSPPC內化造成APC之功能性成熟以及趨化因子及細胞因子產生，從而導致自然殺傷細胞(NK)、單核細胞之活化以及Th1及Th-2介導之免疫反應。在某些實施例中，用於本文揭示之方法中的HSPPC包含來自應力蛋白之hsp60、hsp70或hsp90家族之一或多種熱休克蛋白，該等熱休克蛋白與抗原肽複合。在某些實施例中，HSPPC包含hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、鈣網蛋白或其兩者或兩者以上之組合。
在一具體實施例中，熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)包含與重組抗原肽複合之重組熱休克蛋白(例如，hsp70或hsc70)或其肽結合域。重組熱休克蛋白可例如使用如Dworniczak及Mirault,Nucleic Acids Res.15：5181-5197(1987)及GenBank登錄號P11142及/或Y00371所述之人類hsc70序列，藉由重組DNA技術而產生，其各自全部以引用方式併入本文。在某些實施例中，Hsp70序列如Hunt及Morimoto Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(19), 6455-6459(1985)及GenBank登錄號P0DMV8及/或M11717所述，其各自全部以引用方式併入本文。抗原肽亦可藉由此項技術中已知之重組DNA方法來製備。
在某些實施例中，抗原肽包含經修飾之胺基酸。在某些實施例中，經修飾之胺基酸包含轉譯後修飾。在某些實施例中，經修飾之胺基酸包含轉譯後修飾之模擬物。在某些實施例中，經修飾之胺基酸為Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His，其在側鏈羥基或胺上經磷酸化。在某些實施例中，經修飾之胺基酸為Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His胺基酸之模擬物，其在側鏈羥基或胺上經磷酸化。
在一具體實施例中，本文揭示之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)例如熱休克蛋白肽複合物-96(HSPPC-96)組合向受試者投與來治療癌症。HSPPC-96包含與抗原肽複合之96kDa熱休克蛋白(Hsp)，gp96。HSPPC-96為由受試者之腫瘤製得之癌症免疫治療劑並且含有癌症之抗原性「指紋」。在某些實施例中，此指紋含有僅存在於特定受試者之特定癌細胞中之獨特抗原並且注射該疫苗意欲刺激受試者之免疫系統識別並攻擊具有特定癌症指紋之任何細胞。因此，在一實施例中，本發明係關於與熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)組合之本發明之抗體及/或醫藥組合物，其係用作藥劑且/或用於治療癌症之方法中。
在某些實施例中，HSPPC，例如HSPPC-96係 由受試者之腫瘤組織中產生。在一具體實施例中，HSPPC(例如，HSPPC-96)由所治療之類型的癌症或其轉移灶之腫瘤中產生。在另一具體實施例中，HSPPC(例如，HSPPC-96)對於所治療之受試者而言為自體的。在某些實施例中，腫瘤組織為非壞死腫瘤組織。在某些實施例中，至少1克(例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10克)非壞死腫瘤組織用於產生疫苗方案。在某些實施例中，在手術切除之後，非壞死腫瘤組織在用於疫苗製備之前予以冷凍。在一些實施例中，HSPPC，例如HSPPC-96藉由純化技術由腫瘤組織中分離，過濾並且製備成可注射疫苗。在某些實施例中，向受試者投與6-12個劑量之HSPPC，例如，HSPCC-96。在此等實施例中，HSPPC，例如HSPPC-96劑量對於頭4個劑量可每週投與一次，接著對於2-8個額外劑量可每兩週投與一次。
可根據本文描述之方法使用之HSPPC之其他實例在以下專利及專利申請案中揭示，其全部以引用方式併入本文：美國專利第6,391,306號、第6,383,492號、第6,403,095號、第6,410,026號、第6,436,404號、第6,447,780號、第6,447,781號及第6,610,659號。
在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3抗體與佐劑組合向受試者投與。各種佐劑可視治療情況而使用。合適佐劑之非限制性實例包括但不限於完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、montanide ISA(不完全 Seppic佐劑)、Ribi佐劑系統(RAS)、Titer Max、胞壁醯基肽、Syntex佐劑調配物(SAF)、明礬(氫氧化鋁及/或磷酸鋁)、鋁鹽佐劑、Gerbu®佐劑、硝化纖維素吸收抗原、囊封或包埋抗原、3 De-O-醯化單磷醯脂質A(3 D-MPL)、免疫刺激寡核苷酸、toll樣受體(TLR)配位體、甘露聚糖結合凝集素(MBL)配位體、STING促效劑、免疫刺激複合物諸如皂角苷、Quil A、QS-21、QS-7、ISCOMATRIX及其他。其他佐劑包括CpG寡核苷酸及雙鏈RNA分子，諸如聚(A)及聚(U)。亦可使用以上佐劑之組合。參見，例如美國專利第6,645,495號；第7,029,678號；及第7,858,589號，其全部以引用方式併入本文。在一實施例中，本文使用之佐劑為QS-21 STIMULON。
在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3抗體與包含TCR之額外治療劑組合向受試者投與。在某些實施例中，額外治療劑為可溶性TCR。在某些實施例中，額外治療劑為表現TCR之細胞。因此，在一實施例中，本發明係關於與包含TCR之額外治療劑組合的本發明之抗體及/或醫藥組合物，其係用作藥劑及/或用於治療癌症之方法中。
在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3抗體與表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞組合向受試者投與。在某些實施例中，細胞為T細胞。
在某些實施例中，本文揭示之抗-TIM-3抗體與TCR模擬抗體組合向受試者投與。在某些實施例中， TCR模擬抗體為特異性結合至肽-MHC複合物之抗體。關於TCR模擬抗體之非限制性實例，參見，例如，美國專利第9,074,000號及美國公開案第US 2009/0304679 A1號及第US 2014/0134191 A1號，其全部以引用方式併入本文。
抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體及額外治療劑(例如，化學治療、放射治療、檢查點靶向劑、IDO抑制劑、疫苗、佐劑、可溶性TCR、表現TCR之細胞、表現嵌合抗原受體之細胞及/或TCR模擬抗體)可作為獨立劑型來單獨地、依序或同時投與。在一實施例中，非經腸投與抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體，並且經口投與IDO抑制劑。
本文所述之抗體或醫藥組合物可藉由多種途徑遞送至受試者。此等途徑包括但不限於非經腸、鼻內、氣管內、經口、皮內、局部、肌肉內、腹膜內、經皮、靜脈內、鞘內、瘤內、結膜、動脈內及皮下途徑。在某些實施例中，靜脈內遞送抗體或醫藥組合物。亦可使用肺部投與，例如，藉由使用吸入器或噴霧器，及具有作為噴霧來使用之霧化劑的調配物。在某些實施例中，皮下或靜脈內遞送本文所述之抗體或醫藥組合物。在某些實施例中，動脈內遞送本文所述之抗體或醫藥組合物。在某些實施例中，瘤內遞送本文所述之抗體或醫藥組合物。在某些實施例中，將本文所述之抗體或醫藥組合物遞送至腫瘤引流淋巴結中。
有效治療及/或預防病狀之抗體或組合物之量將視疾病之性質而定，並且可藉由標準臨床技術來判定。
有待用於組合物中之精確劑量亦視投藥途徑以及感染或由此所致之疾病的嚴重性而定，並且應根據開業醫師之判斷及每個受試者之情況來決定。舉例而言，有效劑量亦可視以下因素而變化：投藥手段、目標位點、患者之生理狀況(包括年齡、體重及健康情況)、患者為人類抑或動物、所投與之其他藥劑、或治療為預防性抑或治療性的。通常，患者為人類，然而，亦可治療包括基因轉殖哺乳動物之非人類哺乳動物。治療劑量經最佳滴定以優化安全性及功效。
本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體亦可用於使用為熟習此項技術者已知之經典免疫組織方法，包括免疫檢定，諸如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫沉澱反應或西方印漬術來分析生物樣品中之TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白水準。合適的抗體檢定標記在此項技術中為已知的並且包括酶標記，諸如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)及鍀(99Tc)；發光標記，諸如發光胺；以及螢光標記，諸如螢光素及若丹明，及生物素。此類標記可用於標記本文所述之抗體。或者，識別本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體的第二抗體可加以標記並且與抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體組合使用來偵測TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白水準。因此，在一實施例 中，本發明係關於本發明之抗體在活體外偵測生物樣品中之TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白的用途。在另一實施例中，本發明係關於本發明之抗-TIM-3抗體用於在活體外分析及/或偵測生物樣品中之TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白水準之用途，視情況其中抗-TIM-3抗體接合至放射性核素或可偵測標記，且/或攜帶本文所述之標記，且/或其中使用免疫組織方法。
分析TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白之表現水準意欲包括直接地(例如，藉由判定或估計絕對蛋白水準)或相對地(例如，藉由與第二生物樣品中之疾病相關蛋白水準進行比較)來定性或定量地量測或估計第一生物樣品中之TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白水準。可量測或估計第一生物樣品中之TIM-3(例如，人類TIM-3)多肽表現水準並且與標準TIM-3(例如，人類TIM-3)蛋白水準進行比較，該標準係獲自由不患病症之個體獲得之第二生物樣品或藉由將不患病症之個體群之水準取平均值來判定。如此項技術中應瞭解，一旦已知「標準」TIM-3(例如，人類TIM-3)多肽水準，便可將其重複地用作比較標準。因此，在另一實施例中，本發明係關於分析及/或偵測生物樣品中之TIM-3蛋白水準，例如人類TIM-3蛋白水準的活體外方法，該方法包括藉由免疫組織方法來定性或定量地量測或估計生物樣品中之TIM-3蛋白，例如人類TIM-3蛋白之水準。
如本文使用，術語「生物樣品」係指由潛在 表現TIM-3(例如，人類TIM-3)之受試者、細胞株、組織或其他細胞來源獲得的任何生物樣品。由動物(例如，人類)獲得組織生檢及體液之方法在此項技術中為熟知的。生物樣品包括末梢單核血細胞。
本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可用於預測、診斷、監測及篩選應用，包括熟習此項技術者所熟知及標準的並且基於本發明之活體外及活體內應用。用於活體外評估及評價免疫系統狀況及/或免疫反應之預後、診斷、監測及篩選檢定及套組可用於對患者樣品(包括已知患有或疑似患有免疫系統功能障礙之患者的樣品)或關於預期或所需免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應進行預測、診斷及監測以供評價。免疫系統狀況及/或免疫反應之評估及評價亦適用於與不同藥劑或抗體相比較來判定患者對於藥物之臨床試驗或投與特定化學治療劑、放射治療劑或抗體(包括其組合)的適合性。此類型之預測及診斷監測及評估在實務中利用針對乳腺癌中之HER2蛋白的抗體(HercepTestTM,Dako)，其中該檢定亦用於針對使用Herceptin®之抗體療法來評價患者。活體內應用包括定向細胞療法及免疫系統調節及免疫反應之射線成像。因此，在一實施例中，本發明係關於一種本發明之抗-TIM-3抗體及/或醫藥組合物，其係用作診斷劑。在一實施例中，本發明係關於一種本發明之抗-TIM-3抗體及/或醫藥組合物，其係用於對患有或疑似患有免疫系統功能障礙之受試者及/或關於預期或所需免疫系統反應、抗原反應或 疫苗反應進行預測、診斷及/或監測之方法中。在另一實施例中，本發明係關於使用本發明之抗-TIM-3抗體藉由在活體外分析及/或偵測受試者生物樣品中之人類TIM-3蛋白水準，對患有或疑似患有免疫系統功能障礙之受試者及/或關於預期或所需免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應進行預測、診斷及/或監測的用途。
在一實施例中，抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可用於生檢樣品之免疫組織化學中。在一實施例中，該方法為活體外方法。在另一實施例中，抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可用於偵測TIM-3(例如，人類TIM-3)之水準，或在其膜表面上含有TIM-3(例如，人類TIM-3)之細胞的水準，該等水準可與某些疾病症狀相關聯。本文描述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可攜帶可偵測或功能性標記及/或可接合至放射性核素或可偵測標記。當使用螢光標記時，目前可利用之顯微術及螢光活化細胞分選分析(FACS)或此項技術中已知的兩種方法程序之組合可用於識別及定量特異性結合成員。本文描述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可攜帶或可接合至螢光標記。示範性螢光標記包括例如反應性及接合探針，例如，胺基香豆素、螢光素及得克薩斯紅、Alexa Fluor染料、Cy染料及DyLight染料。抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體可攜帶或可接合至放射性標記或放射性核素，諸如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、 211At、213Bi、225Ac及186Re。當使用放射性標記時，在此項技術中已知之目前可利用之計數程序可用於識別及定量抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體與TIM-3(例如，人類TIM-3)之特異性結合。在標記為酶的情況下，偵測可藉由如在此項技術中已知之任何目前利用的比色、分光光度、螢光光度、電流定量或氣體定量技術完成。此可藉由在允許形成抗體與TIM-3(例如，人類TIM-3)之間的複合物之條件下使樣品或對照樣品與抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體接觸來達成。將在抗體與TIM-3(例如，人類TIM-3)之間形成之任何複合物予以偵測並且在樣品與對照中進行比較。鑒於本文描述之抗體對於TIM-3(例如，人類TIM-3)之特異性結合，該等抗體可用於特異性偵測細胞表面上之TIM-3(例如，人類TIM-3)表現。本文描述之抗體亦可用於經由免疫親和純化來純化TIM-3(例如，人類TIM-3)。本文中亦包括檢定系統，該檢定系統可以測試套組、套組或部件套組形式來製備以便定量分析例如TIM-3(例如，人類TIM-3)或TIM-3(例如，人類TIM-3)/TIM-3(例如，人類TIM-3)配位體複合物之存在程度。該系統、測試套組、套組或部件套組可包含經標記之組分，例如，標記抗體，及一或多種額外免疫化學試劑。
5.5 產生抗-TIM-3抗體之多核苷酸、載體及方法
在另一態樣中，本文提供包含編碼特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原之本文所述之抗體或 其片段(例如，輕鏈可變區及/或重鏈可變區)之核苷酸序列的多核苷酸，以及載體，例如，用於在宿主細胞(例如，大腸桿菌及哺乳動物細胞)中重組表現的包含此等多核苷酸之載體。本文提供包含編碼本文提供之任何抗體之重鏈及/或輕鏈之核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此等多核苷酸序列之載體，例如，用於其在宿主細胞，例如，哺乳動物細胞中之有效表現的表現載體。
如本文使用，「經分離之」多核苷酸或核酸分子為與存在於核酸分子之天然來源(例如，小鼠或人類)中的其他核酸分子分離的分子。此外，「經分離之」核酸分子，諸如cDNA分子，在藉由重組技術產生時可大體上不含其他細胞材料或培養基，或當化學合成時大體上不含化學前驅物或其他化學品。舉例而言，措辭「大體上不含」包括具有少於約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(尤其少於約10%)之其他材料，例如，細胞材料、培養基、其他核酸分子、化學前驅物及/或其他化學品的多核苷酸或核酸分子之製劑。在一具體實施例中，編碼本文所述抗體之核酸分子經分離或純化。
在具體態樣中，本文提供包含編碼抗體之核苷酸序列的多核苷酸，該等抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)多肽並且包含如本文描述之胺基酸序列，以及與此類抗體競爭結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)多肽(例如，以劑量依賴性方式)或結合至與此類抗體相同之表位的抗體。
在某些態樣中，本文提供包含編碼本文所述抗體之輕鏈或重鏈之核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可包含編碼包含本文描述之抗體(參見，例如，表1)之VL FR及CDR之輕鏈的核苷酸序列或編碼包含本文描述之抗體(參見，例如，表1)之VH FR及CDR之重鏈的核苷酸序列。
本文亦提供編碼例如藉由密碼子/RNA優化、用異源信號序列置換及消除mRNA不穩定元件來優化之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體的多核苷酸。藉由在mRNA中引入密碼子變化及/或消除抑制區產生編碼抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段(例如，輕鏈、重鏈、VH域或VL域)之優化核酸以便重組表現的方法可藉由調適在例如美國專利第5,965,726號；第6,174,666號；第6,291,664號；第6,414,132號；及第6,794,498號中描述之優化方法來執行，相應地，其全部以引用方式併入本文。舉例而言，RNA內之可能剪接位點及不穩定元件(例如，富含A/T或A/U之元件)可在不改變由核酸序列編碼之胺基酸的情況下突變以提高RNA對於重組表現之穩定性。該等改變利用遺傳密碼之簡並性，例如，使用相同胺基酸之替代密碼子。在一些實施例中，可能需要改變一或多個密碼子以編碼保守突變，例如，具有與原始胺基酸類似之化學結構及性質及/或功能的類似胺基酸。相對於由未經優化之多核苷酸編碼之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體的表現，此類方法可增加抗-TIM-3(例如，人 類TIM-3)抗體或其片段之表現至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更大。
在某些實施例中，編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段(例如，VL域及/或VH域)之經優化之多核苷酸序列可雜交至編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段(例如，VL域及/或VH域)之未經優化之多核苷酸序列之反義(例如，互補)多核苷酸。在具體實施例中，編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或片段之經優化之核苷酸序列在高嚴格性條件下雜交至編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段之未經優化之多核苷酸序列之反義多核苷酸。在一具體實施例中，編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段之經優化之核苷酸序列在高嚴格性、中等或較低嚴格性雜交條件下雜交至編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段之未經優化之核苷酸序列之反義多核苷酸。已描述關於雜交條件之資訊，參見，例如，美國專利申請公開案第US 2005/0048549號(例如，段落72-73)，其全部以引用方式併入本文。
可藉由此項技術中已知之任何方法獲得多核苷酸，並且可測定多核苷酸之核苷酸序列。編碼本文描述之抗體，例如，表1描述之抗體，及修飾型式之此等抗體的核苷酸序列可使用在此項技術中熟知之方法來測定，亦 即，已知編碼特定胺基酸之核苷酸密碼子以產生編碼該抗體之核酸的方式來組裝。編碼抗體之此種多核苷酸可由化學合成之寡核苷酸來組裝(例如，如Kutmeier G等人，(1994),BioTechniqucs 17：242-6中所述，其全部以引用方式併入本文)，簡言之，其涉及合成含有編碼抗體之序列之部分的重疊寡核苷酸，黏接並連接彼等寡核苷酸，隨後藉由PCR擴增經連接之寡核苷酸。
或者，編碼本文所述抗體之多核苷酸可由來自合適來源(例如，融合瘤)之核酸使用此項技術中熟知之方法(例如，PCR及其他分子選殖方法)產生。舉例而言，使用可雜交至已知序列之3’及5’末端的合成引子之PCR擴增可使用由產生所關注抗體之融合瘤細胞獲得的基因組DNA來進行。此類PCR擴增方法可用於獲得包含編碼抗體之輕鏈及/或重鏈之序列的核酸。此類PCR擴增方法可用於獲得包含編碼抗體之可變輕鏈區及/或可變重鏈區之序列的核酸。經擴增之核酸可選殖至載體中以便在宿主細胞中表現且進一步選殖以便例如生成嵌合及人源化抗體。
若含有編碼特定抗體之核酸之純系不可獲得，但抗體分子序列為已知的，則編碼免疫球蛋白之核酸可經化學合成或藉由使用可雜交至序列之3’及5’末端之合成引子的PCR擴增或藉由使用寡核苷酸探針的選殖由合適的來源(例如，由表現該抗體之任何組織或細胞，諸如被選擇來表現本文所述抗體之融合瘤細胞中產生的抗體cDNA文庫或cDNA文庫或由其中分離的核酸，較佳聚A+ RNA)獲得，該寡核苷酸探針對於特定基因序列具有特異性以便識別例如來自編碼該抗體之cDNA文庫的cDNA純系。隨後，藉由PCR生成之擴增核酸可使用此項技術中熟知之任何方法選殖至可複製的選殖載體中。
編碼本文描述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體之DNA可使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合至基因編碼抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體之重鏈及輕鏈之寡核苷酸探針)容易地分離並測序。融合瘤細胞可充當此DNA之來源。一旦分離，便可將DNA置於表現載體中，接著轉染至宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如，來自CHO GS SystemTM(Lonza)之CHO細胞)或不另外產生免疫球蛋白蛋白質之骨髓瘤細胞中，以獲得抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體在重組宿主細胞中之合成。
為了產生完整抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點及保護限制位點之側接序列的PCR引子可用於在scFv純系中擴增VH或VL序列。使用熟習此項技術者已知之選殖技術，PCR擴增VH域可選殖至表現重鏈恆定區，例如，人類γ4恆定區之載體中，並且PCR擴增VL域可選殖至表現輕鏈恆定區，例如，人類κ或λ恆定區之載體中。在某些實施例中，表現VH或VL域之載體包含EF-1α啟動子、分泌信號、可變區之選殖位點、恆定域及選擇標記諸如新黴素。VH及VL域亦可選殖至表現必要恆定區之一載體中。隨後，使用熟習此項技術者已知 之技術，將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中以產生表現全長抗體，例如，IgG之穩定或瞬態細胞株。
DNA亦可例如藉由替換編碼序列人類重鏈及輕鏈恆定域代替鼠科序列，或藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或一部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列來修飾。
亦提供在高嚴格性、中等或較低嚴格性雜交條件下雜交至編碼本文所述抗體之多核苷酸的多核苷酸。在具體實施例中，本文所述之多核苷酸在高嚴格性、中等或較低嚴格性雜交條件下雜交至編碼本文提供之VH域及/或VL域的多核苷酸。
雜交條件已在此項技術中描述並為熟習此項技術者所知。舉例而言，在嚴格條件下之雜交可涉及在約45℃下，雜交至6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中之過濾器結合DNA，繼之以在約50-65℃下，在0.2xSSC/0.1% SDS中之一或多次清洗；在高度嚴格條件下之雜交可涉及在約45℃下，雜交至6xSSC中之過濾器結合核酸，繼之以在約68℃下，0.1xSSC/0.2% SDS中之一或多次清洗。在其他嚴格雜交條件下之雜交為熟習此項技術者已知並且已有所描述，參見，例如，Ausubel FM等人編，(1989)Current Protocols in Molecular Biology，第I卷，Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,New York，第6.3.1-6.3.6及2.10.3頁，其全部以引用方式併入本 文。
在某些態樣中，本文提供表現(例如，重組性地)特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之本文描述之抗體的細胞(例如，宿主細胞)及相關多核苷酸及表現載體。本文提供包含含有編碼抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或片段之核苷酸序列之多核苷酸的載體(例如，表現載體)以便在宿主細胞，較佳哺乳動物細胞中重組表現。本文亦提供包含此等載體之宿主細胞以便重組表現本文描述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體(例如，人類或人源化抗體)。在一具體態樣中，本文提供產生本文所述抗體之方法，該等方法包括由宿主細胞中表現此抗體。
特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)的本文所述之抗體(例如，全長抗體、抗體之重鏈及/或輕鏈或本文所述單鏈抗體)之重組表現涉及構築含有編碼該抗體之多核苷酸的表現載體。一旦已經獲得編碼抗體分子或抗體重鏈或輕鏈或其片段(例如，重鏈及/或輕鏈可變區)之多核苷酸，用於產生抗體分子之載體便可藉由重組DNA技術使用此項技術中熟知之技術產生。因此，本文描述藉由表現含有抗體或抗體片段(例如，輕鏈或重鏈)編碼核苷酸序列之多核苷酸來製備蛋白質的方法。熟習此項技術者熟知之方法可用於構築含有抗體或抗體片段(例如，輕鏈或重鏈)編碼序列及合適的轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。亦提供可複製載體，該等載體包含可 操作地連接至啟動子之核苷酸序列，該核苷酸序列編碼本文所述之抗體分子、抗體之重鏈或輕鏈、抗體之重鏈或輕鏈可變區或其片段、或重鏈或輕鏈CDR。此類載體可例如包括編碼抗體分子之恆定區的核苷酸序列(參見，例如，國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；及美國專利第5,122,464號，其全部以引用方式併入本文)並且抗體之可變區可選殖至此類載體中以便表現整個重鏈、整個輕鏈或整個重鏈及輕鏈兩者。
表現載體可藉由習知技術轉移至細胞(例如，宿主細胞)且接著，所得細胞可藉由習知技術培養以產生本文所述之抗體或其片段。因此，本文提供含有編碼本文所述之抗體或其片段、或其重鏈或輕鏈或其片段、或本文所述之單鏈抗體的多核苷酸之宿主細胞，該多核苷酸可操作地連接至啟動子以便在宿主細胞中表現此等序列。在某些實施例中，為了表現雙鏈抗體，個別地編碼重鏈及輕鏈兩者之載體可在宿主細胞中共表現以便表現整個免疫球蛋白分子，如下詳述。在某些實施例中，宿主細胞含有包含多核苷酸之載體，該多核苷酸編碼本文所述抗體之重鏈及輕鏈兩者或其片段。在具體實施例中，宿主細胞含有兩個不同載體，第一載體包含編碼本文所述抗體之重鏈或重鏈可變區或其片段之多核苷酸，並且第二載體包含編碼本文所述抗體之輕鏈或輕鏈可變區或其片段之多核苷酸。在其他實施例中，第一宿主細胞包含含有編碼本文所述抗體之重鏈或重鏈可變區或其片段之多核苷酸的第一載體，並且 第二宿主細胞包含含有編碼本文所述抗體之輕鏈或輕鏈可變區之多核苷酸的第二載體。在具體實施例中，由第一細胞表現之重鏈/重鏈可變區與第二細胞之輕鏈/輕鏈可變區締合以形成本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體。在某些實施例中，本文提供包含此第一宿主細胞及此第二宿主細胞之宿主細胞群。
在一特定實施例中，本文提供載體群，其包含含有編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體之輕鏈/輕鏈可變區之多核苷酸的第一載體，以及含有編碼本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體之重鏈/重鏈可變區之多核苷酸的第二載體。
多種宿主表現載體系統可用於表現本文所述之抗體分子(參見，例如，美國專利第5,807,715號，其全部以引用方式併入本文)。此類宿主表現系統表示所關注之編碼序列可藉以產生且隨後得以純化之媒介物，而且亦表示可在用合適的核苷酸編碼序列轉化或轉染時原位表現本文所述抗體分子的細胞。此等宿主表現系統包括但不限於微生物，諸如細菌(例如，大腸桿菌及枯草桿菌)，該等細菌用含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉化；酵母(例如，畢赤酵母屬)，該酵母用含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉化；昆蟲細胞系統，該等系統用含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染；植物細胞系統(例如，綠藻，諸如萊茵衣藻)，該等系統用重組病毒表現載 體(例如，花椰菜嵌紋病毒，CaMV；菸草嵌紋病毒，TMV)感染或用含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉化；或哺乳動物細胞系統(例如，COS(例如，COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa及NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20及BMT10細胞)，該等系統容納含有源自哺乳動物細胞之基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)之啟動子的重組表現構築體。在一具體實施例中，表現本文描述之抗體之細胞為CHO細胞，例如來自CHO GS SystemTM(Lonza)之CHO細胞。在一特定實施例中，表現本文描述之抗體之細胞為人類細胞，例如，人類細胞株。在一具體實施例中，哺乳動物表現載體為pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一特定實施例中，細菌細胞諸如大腸桿菌，或真核細胞(例如，哺乳動物細胞)，尤其用於表現整個重組抗體分子的細胞，係用於表現重組抗體分子。舉例而言，哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，連同載體諸如來自人類巨細胞病毒之主要中間早期基因啟動子元件為抗體之有效表現系統(Foecking MK & Hofstetter H(1986)Gene 45：101-5；以及Cockett MI等人，(1990)Biotechnology 8(7)：662-7，其各自全部以引用方式併入本文)。在某些實施例中，本文描述之抗體係由CHO細胞或NS0細胞產生。在一具體實施例中， 編碼特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之本文所述抗體的核苷酸序列之表現藉由組成性啟動子、可誘導啟動子或組織特異性啟動子來調控。
在細菌系統中，表現載體之數目可取決於所表現抗體分子之預定用途來有利地選擇。舉例而言，在為了產生抗體分子之醫藥組合物而製造大量此抗體時，引導容易純化之大量融合蛋白產物之表現的載體可為合意的。此等載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2：1791-1794)，其中抗體編碼序列可單獨地與lacZ編碼區域同框地連接至載體中以使得產生融合蛋白；pIN載體(Inouye S & Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13：3101-3109；Van Heeke G & Schuster SM(1989)J Biol Chem 24：5503-5509)；及其類似載體，其全部以引用方式併入本文。舉例而言，pGEX載體亦可用於表現呈與麩胱甘肽5-轉移酶(GST)之融合蛋白形式的外源多肽。通常，此等融合蛋白為可溶的並且可藉由吸附並結合至基質麩胱甘肽瓊脂糖珠粒，隨後在自由麩胱甘肽存在下溶離來由裂解細胞中容易地純化。pGEX載體被設計成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點以使得選殖目標基因產物可從GST部分中釋放。
在昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)例如可用作表現外源基因之載體。病毒生長在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中。抗體編碼序列可個別地選殖入病毒之非必要區域(例如多角體基因)中且 置於AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)之控制下。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多病毒基表現系統。在腺病毒用作表現載體之情況下，所關注的抗體編碼序列可連接於腺病毒轉錄/轉譯控制複合體，例如晚期啟動子及三重前導序列。此嵌合基因可接著藉由活體外或活體內重組插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組之非必要區域(例如，區域E1或E3)將產生重組病毒，該病毒可存活並且能夠在感染宿主中表現抗體分子(例如，參見Logan J & Shenk T(1984)PNAS 81(12)：3655-9，其全部以引用方式併入本文)。亦可需要特定起始信號以便有效轉譯所插入之抗體編碼序列。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列之閱讀框架同相以確保整個插入物之轉譯。此等外源性轉譯控制信號及起始密碼子可有天然及合成之多種來源。表現效率可藉由納入合適的轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強(參見，例如，Bitter G等人，(1987)Methods Enzymol.153：516-544，其全部以引用方式併入本文)。
另外，可選擇調節插入序列之表現或以所需特定方式來修飾並加工基因產物的宿主細胞品系。蛋白質產物之此類修飾(例如，糖基化)及加工(例如，裂解)對於蛋白質之功能可為重要的。不同宿主細胞具有針對蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾的特徵性及特定機制。可選擇合適的細胞株或宿主系統以確保所表現之外來蛋白之正確修飾及加工。為此目的，可使用具有用於適當加工初 級轉錄物、基因產物之糖基化及磷酸化之細胞機制的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0(一種鼠科骨髓瘤細胞株，其不內源性地產生任何免疫球蛋白鏈)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10及HsS78Bst細胞。在某些實施例中，本文描述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體在哺乳動物細胞，諸如CHO細胞中產生。
在一具體實施例中，本文描述之抗體具有減少的岩藻糖含量或沒有岩藻糖含量。此類抗體可使用熟習此項技術者已知之技術產生。舉例而言，抗體可在缺乏或沒有岩藻糖化能力之細胞中表現。在一具體實例中，剔除α1,6-岩藻糖基轉移酶之兩個等位基因的細胞株可用於產生具有減少的岩藻糖含量之抗體。Potelligent®系統(Lonza)為可用於產生具有減少的岩藻糖含量之抗體的此類系統之一實例。
對重組蛋白質之長期、高產率生產而言，可產生穩定表現細胞。舉例而言，穩定表現本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體之細胞株可工程化。在具體實施例中，本文提供之細胞穩定表達輕鏈/輕鏈可變區及重鏈/重鏈可變區，其締合以形成本文所述抗體。
在某些態樣中，代替使用含有病毒複製起點 之表現載體，宿主細胞可用由合適的表現控制元件(例如，啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸位點等)及可選擇標記控制之DNA來轉化。在引入外來DNA/多核苷酸之後，可允許工程化細胞在富集培養基中生長1-2天，接著轉換至選擇性培養基。重組質體中之可選擇標記賦予選擇抗性並且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中並且生長以形成轉化灶，其進而可經選殖並擴增至細胞株中。此方法可有利地用於將表現本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體或其片段的細胞株工程化。此類工程化細胞株可尤其適用於篩選及評價直接或間接地與抗體分子相互作用之組合物。
可使用多種選擇系統，該等系統包括但不限於分別在tk-、hgprt-或aprt-細胞中之單純性皰疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人，(1977)Cell 11(1)：223-32)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska EH & Szybalski W(1962)PNAS 48(12)：2026-2034)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy I等人，(1980)Cell 22(3)：817-23)基因，其全部以引用方式併入本文。抗代謝物抗性亦可用作選擇以下基因之基礎：dhfr，其賦予甲胺蝶呤抗性(Wigler M等人，(1980)PNAS 77(6)：3567-70；O’Hare K等人，(1981)PNAS 78：1527-31)；gpt，其賦予麥可酚酸抗性(Mulligan RC & Berg P(1981)PNAS 78(4)：2072-6)；neo，其賦予胺基糖苷G-418抗性(Wu GY & Wu CH(1991)Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol 32： 573-596；Mulligan RC(1993)Science 260：926-932；以及Morgan RA & Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62：191-217；Nabel GJ & Felgner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5)：211-5)；及hygro，其賦予潮黴素抗性(Santerre RF等人，(1984)Gene 30(1-3)：147-56)，其全部以引用方式併入本文。在重組DNA技術中通常已知之方法可常規地用於選擇所需重組純系並且此類方法例如在Ausubel FM等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993)；Kriegler M,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；及第12及13章，Dracopoli NC等人(編)，Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994)；Colbère-Garapin F等人，(1981)J Mol Biol 150：1-14中描述，其全部以引用方式併入本文。
抗體分子之表現水準可藉由載體擴增來增加(關於評述，參見Bebbington CR & Hentschel CCG,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press,New York,1987)，其全部以引用方式併入本文)。當表現抗體之載體系統中之標記可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的水準之增加將增加標記基因之複本的數目。由於擴增區與抗體基因相關聯，因此抗體之產生亦增加(Crouse GF等人，(1983)Mol Cell Biol 3：257-66，其全部以引用方式併入本 文)。
宿主細胞可與本文所述之兩個或兩個以上表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈衍生多肽並且第二載體編碼輕鏈衍生多肽。兩個載體可含有實現重鏈及輕鏈多肽之相等表現的相同可選擇標記。宿主細胞可與不同量之兩個或兩個以上表現載體共轉染。舉例而言，宿主細胞可用以下比率中之任一者的第一表現載體及第二表現載體來轉染：1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：12、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45或1：50。
或者，可使用編碼並且能夠表現重鏈及輕鏈多肽兩者的單一載體。在此等情況下，輕鏈應置於重鏈之前以避免生成過量的有毒游離重鏈(Proudfoot NJ(1986)Nature 322：562-565；以及Köhler G(1980)PNAS 77：2197-2199，其各自全部以引用方式併入本文)。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。表現載體可為單順反子或多順反子。多順反子核酸構築體可編碼2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上或2-5、5-10或10-20個範圍內之基因/核苷酸序列。舉例而言，雙順反子核酸構築體可以如下順序包含啟動子、第一基因(例如，本文所述抗體之重鏈)及第二基因及(例如，本文所述抗體之輕鏈)。在此類表現載體中，兩個基因之轉錄可由啟動子來驅動，而來自第一基因之mRNA之轉譯可藉由帽依賴性掃描機制並且來自第二基因之mRNA之轉譯可藉由非帽 依賴性機制，例如，藉由IRES。
一旦本文所述之抗體分子藉由重組表現產生，其可藉由在此項技術中已知之純化免疫球蛋白分子之任何方法來純化，例如，藉由層析(例如，離子交換、親和力，尤其藉由蛋白A之後的針對特定抗原之親和力，及分級管柱層析)、離心、差異溶解性或純化蛋白質之任何其他標準技術。此外，本文描述之抗體可融合至本文所述或另外在此項技術中已知促進純化之異源多肽序列。
在具體實施例中，將本文所述抗體分離或純化。總體上，分離抗體為大體上不含具有與分離抗體不同抗原特異性之其他抗體的抗體。舉例而言，在一個特定實施例中，本文所述抗體之製劑大體上不含細胞材料及/或化學前驅物。措辭「大體上不含細胞材料」包括如下抗體製劑，其中抗體與抗體得以從其中分離或重組產生之細胞之細胞成分分離。因此，大體上不含細胞材料之抗體包括具有少於約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(乾重)異源蛋白(在本文中亦稱為「污染性蛋白」)之抗體製劑及/或抗體之變異體，例如，不同轉譯後修飾形式之抗體或其他不同型式之抗體(例如，抗體片段)。當抗體重組產生時，其亦總體上大體上不含培養基，即，培養基佔蛋白製劑之體積之約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%以下。當抗體藉由化學合成來產生時，其總體上大體上不含化學前驅物或其他化學品，即，其與涉及合成蛋白之化學前驅物或其他化學品分離。因此，除了所關注抗體 以外，此等抗體製劑具有少於約30%、20%、10%或5%(乾重)之化學前驅物或化合物。在具體實施例中，將本文描述之抗體分離或純化。
特異性結合TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體或其片段可藉由在此項技術中已知之合成抗體之任何方法，例如，藉由化學合成或藉由重組表現技術來產生。除非另外指示，否則本文描述之方法使用分子生物學、微生物學、遺傳分析、重組DNA、有機化學、生物化學、PCR、寡核苷酸合成及修飾、核酸雜交，及此項技術之技能範圍內之相關領域中之習知技術。此等技術例如在本文引用之參考文獻中描述並且在文獻中充分解釋。參見，例如，Maniatis T等人，(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人，(1989),Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987及每年更新)；Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons(1987及每年更新)Gait(編)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(編)(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach,IRL Press；Birren B等人(編)(1999)Genome Analysis：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，其全部以引用方式併入本文。
在一具體實施例中，本文所述之抗體為藉由涉及生成之任何手段，例如，經由DNA序列之合成、遺傳工程來製備、表現、生成或分離抗體(例如，重組抗體)。在某些實施例中，此類抗體包含不天然地存在於活體內動物或哺乳動物(例如，人類)之抗體生殖系譜內之序列(例如，DNA序列或胺基酸序列)。
在一態樣中，本文提供一種製造特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體的方法，該方法包括培養本文所述之細胞或宿主細胞。在一實施例中，該方法在活體外執行。在某一態樣中，本文提供一種製造特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之抗體的方法，該方法包括使用本文所述之細胞或宿主細胞(例如，包含編碼本文所述抗體之多核苷酸的細胞或宿主細胞)表現(例如，重組表現)抗體。在一特定實施例中，該細胞為經分離之細胞。在一特定實施例中，將外源性多核苷酸引入細胞中。在一特定實施例中，該方法進一步包括純化由細胞或宿主細胞獲得之抗體的步驟。
產生多株抗體之方法在此項技術中為已知的(參見，例如，第11章：Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版，Ausubel FM等人編，John Wiley and Sons,New York，其全部以引用方式併入本文)。
單株抗體可使用在本領域中已知的多種技術 包括使用融合瘤、重組體及噬菌體呈現技術或其組合來製備。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤技術來產生，包括在此項技術中已知並且例如在Harlow E & Lane D,Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling GJ等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier,N.Y.,1981)中教導之技術，其中之每一者全部以引用方式併入本文。如本文使用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。舉例而言，單株抗體可從外源性地表現本文所述抗體或其片段，例如，此抗體之輕鏈及/或重鏈的宿主細胞重組產生。
在具體實施例中，如本文使用之「單株抗體」為藉由單一細胞(例如，產生重組抗體之融合瘤或宿主細胞)所產生的抗體，其中抗體特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)，如例如藉由ELISA或此項技術中或本文提供之實例中已知之其他抗原結合或競爭性結合檢定所判定。在具體實施例中，單株抗體可為嵌合抗體或人源化抗體。在某些實施例中，單株抗體為單價抗體或多價(例如，二價)抗體。在具體實施例中，單株抗體為單特異性或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。本文描述之單株抗體可例如藉由如Kohler G & Milstein C(1975)Nature 256：495中所述之融合瘤方法製成，其全部以引用方式併入本文，或可例如使用如本文描述之技術由噬菌體文庫中分離。製備純系細胞株及由其表現之單株抗體的其他方法 在此項技術中為熟知的(參見，例如，第11章：Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版，Ausubel FM等人，上述)。
使用融合瘤技術產生並篩選特異性抗體之方法在此項技術中為常規並且熟知的。舉例而言，在融合瘤方法中，小鼠或其他合適的宿主動物，諸如綿羊、山羊、兔、大鼠、倉鼠或彌猴，經免疫接種以引起淋巴細胞產生或能夠產生用於免疫接種的特異性結合至蛋白質(例如，TIM-3(例如，人類TIM-3))之抗體。或者，可活體外使淋巴細胞免疫。接著，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞(Goding JW(Ed),Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,第59-103頁(Academic Press,1986)，其全部以引用方式併入本文)。另外，RIMMS(重複免疫接種多位點)技術可用於使動物免疫(Kilpatrick KE等人，(1997)Hybridoma 16：381-9，其全部以引用方式併入本文)。
在一些實施例中，小鼠(或其他動物，諸如大鼠、猴子、驢、豬、綿羊、倉鼠或犬)可用抗原(例如，TIM-3(例如，人類TIM-3))免疫接種並且一旦偵測到免疫反應，例如，在小鼠血清中偵測到對於抗原具有特異性之抗體，便收穫小鼠脾臟並且將脾細胞分離。隨後，藉由熟知技術將脾細胞融合至任何合適骨髓瘤細胞，例如可由美國菌種保藏中心(ATCC®)(Manassas,VA)獲得之細胞株SP20之細胞，以形成融合瘤。融合瘤藉由有限稀釋來選 擇並選殖。在某些實施例中，收穫免疫接種小鼠之淋巴結並且與NS0骨髓瘤細胞融合。
將由此製備之融合瘤細胞接種並在合適的培養基中生長，該培養基較佳含有抑制未融合、親本骨髓瘤細胞之生長或存活的一或多種物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤之培養基通常包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質防止HGPRT缺陷細胞之生長。
具體實施例使用骨髓瘤細胞，該等細胞有效地融合，藉由所選擇的產生抗體之細胞來支援抗體之穩定的高水準產生，並且對於培養基諸如HAT培養基為敏感的。鼠科骨髓瘤株在此等骨髓瘤細胞株之中，諸如NS0細胞株或衍生自可由Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,CA,USA獲得之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤的細胞株，及可由American Type Culture Collection,Rockville,MD,USA獲得之SP-2或X63-Ag8.653細胞。人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株亦已描述可產生人類單株抗體(Kozbor D(1984)J Immunol 133：3001-5；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)，其各自全部以引用方式併入本文)。
使融合瘤細胞生長之培養基針對TIM-3(例如 人類TIM-3)之單株抗體之產生來加以檢定。藉由融合瘤細胞所產生的單株抗體之結合特異性藉由此項技術中已知之方法來判定，例如，免疫沉澱反應或藉由活體外結合檢定，諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯免疫吸附檢定(ELISA)。
在鑒別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，該等純系可藉由限制稀釋程序進行次選殖並且且藉由標準方法(Goding JW(編)，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，上述)生長。用於此目的之合適培養基包括例如D-MEM或RPMI1640培養基。此外，該等融合瘤細胞可作為動物體內之腹水腫瘤活體內生長。
由亞純系分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序(例如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法)自培養基、腹水或血清中分離。
本文所述之抗體包括抗體片段，該等片段識別特異性TIM-3(例如，人類TIM-3)並且可藉由熟習此項技術者已知之任何技術產生。舉例而言，本文所述之Fab及F(ab’)2片段可藉由免疫球蛋白分子之蛋白裂解，使用酶諸如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab’)2片段)而產生。Fab片段對應於抗體分子之兩個相同臂中之一者並且含有與重鏈之VH及CH1域配對之完整輕鏈。F(ab’)2片段含有藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接的抗體 分子之兩個抗原結合臂。
此外，本文所述之抗體亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法生成。在噬菌體呈現方法中，功能性抗體域在攜帶多核苷酸序列之噬菌體顆粒之表面上呈現，該等多核苷酸序列編碼該等抗體域。具體而言，編碼VH及VL域之DNA序列係由動物cDNA文庫(例如，患病組織之人類或鼠科cDNA文庫)中擴增。藉由PCR將編碼VH及VL域之DNA與scFv連接子重組在一起並且選殖至噬菌質體載體中。將載體電穿孔至大腸桿菌中並且用輔助噬菌體感染大腸桿菌。用於此等方法中之噬菌體通常為包括fd及M13之絲狀噬菌體，並且VH及VL域通常重組融合至噬菌體基因III或基因VIII中。表現結合至特定抗原之抗原結合域之噬菌體可使用抗原來選擇或識別，例如，使用經標記抗原或結合或捕獲至固體表面或珠粒上之抗原。可用於製造本文所述之抗體的噬菌體呈現方法之實例包括以下文獻中揭示之方法：Brinkman U等人，(1995)J Immunol Methods 182：41-50；Ames RS等人，(1995)J Immunol Methods 184：177-186；Kettleborough CA等人，(1994)Eur J Immunol 24：952-958；Persic L等人，(1997)Gene 187：9-18；Burton DR & Barbas CF(1994)Advan Immunol 57：191-280；PCT申請案第PCT/GB91/001134號；國際公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/11236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號及 第WO 97/13844號；及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號，其全部以引用方式併入本文。
如以上參考文獻中所描述，在噬菌體選擇之後，來自噬菌體之抗體編碼區可經分離並且用於產生完整抗體，包括人類抗體或任何其他所需抗原結合片段，並且在任何所需宿主，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌中表現，例如如下所述。重組產生抗體片段諸如Fab，Fab’及F(ab’)2片段之技術亦可使用此項技術中已知之方法諸如在PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax RL等人，(1992)BioTechniques 12(6)：864-9；Sawai H等人，(1995)Am J Reprod Immunol 34：26-34；以及Better M等人，(1988)Science 240：1041-1043中揭示之方法來使用，其全部以引用方式併入本文。
在某些實施例中，為了產生完整抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點及保護限制位點之側接序列的PCR引子可用於自模板例如scFv純系來擴增VH或VL序列。使用熟習此項技術者已知之選殖技術，PCR擴增之VH域可選殖至表現VH恆定區之載體中，並且PCR擴增之VL域可選殖至表現VL恆定區，例如人類κ或λ恆定區之載體中。VH及VL域亦可選殖至表現必需 恆定區之一個載體中。隨後使用熟習此項技術者已知之技術，將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中以產生表現全長抗體之穩定或瞬態細胞株，例如，IgG。
嵌合抗體為其中抗體之不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。舉例而言，嵌合抗體可含有融合至人類抗體之恆定區的小鼠或大鼠單株抗體之可變區。產生嵌合抗體之方法在此項技術中為已知的。參見，例如，Morrison SL(1985)Science 229：1202-7；Oi VT & Morrison SL(1986)BioTechniques 4：214-221；Gillies SD等人，(1989)J Immunol Methods 125：191-202；以及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號、第4,816,397號及第6,331,415號，其全部以引用方式併入本文。
人源化抗體能夠結合至預定抗原並且包含具有大體上人類免疫球蛋白之胺基酸序列的構架區域及具有大體上非人類免疫球蛋白(例如，鼠科免疫球蛋白)之胺基酸序列的CDR。在具體實施例中，人源化抗體亦包含通常為人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。人源化抗體可選自任何免疫球蛋白類別，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同種型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人源化抗體可使用在本領域中已知的各種技術而產生，包括但不限於CDR移植(歐洲專利第EP 239400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539、第5,530,101號及第5,585,089號)，飾面或 表面再塑(歐洲專利第EP 592106號及第EP 519596號；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5)：489-498；Studnicka GM等人，(1994)Prot Engineering 7(6)：805-814；以及Roguska MA等人，(1994)PNAS 91：969-973)，鏈改組(美國專利第5,565,332號)，及在例如美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 93/17105；Tan P等人，(2002)J Immunol 169：1119-25；Caldas C等人，(2000)Protein Eng.13(5)：353-60；Morea V等人，(2000)Methods 20(3)：267-79；Baca M等人，(1997)J Biol Chem 272(16)：10678-84；Roguska MA等人，(1996)Protein Eng 9(10)：895 904；Couto JR等人，(1995)Cancer Res.55(23 Supp)：5973s-5977s；Couto JR等人，(1995)Cancer Res 55(8)：1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2)：409-10以及Pedersen JT等人，(1994)J Mol Biol 235(3)：959-73中揭示之技術，其全部以引用方式併入本文。亦參見美國申請案公開案第US 2005/0042664 A1號(2005年2月24日)，其全部以引用方式併入本文。
已經描述製造多特異性(例如，雙特異性抗體)之方法，參見，例如，美國專利第7,951,917號；第7,183,076號；第8,227,577號；第5,837,242號；第5,989,830號；第5,869,620號；第6,132,992號及第8,586,713號，其全部以引用方式併入本文。
單結構域抗體，例如，缺乏輕鏈之抗體可藉 由此項技術中熟知之方法產生。參見Riechmann L & Muyldermans S(1999)J Immunol 231：25-38；Nuttall SD等人，(2000)Curr Pharm Biotechnol 1(3)：253-263；Muyldermans S,(2001)J Biotechnol 74(4)：277-302；美國專利第6,005,079號；以及國際公開案第WO 94/04678號、第WO 94/25591號及第WO 01/44301號，其全部以引用方式併入本文。
此外，使用熟習此項技術者熟知之技術，特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原之抗體可進而用於產生「模擬」抗原之抗獨特型抗體。參見，例如，Greenspan NS & Bona CA(1989)FASEB J 7(5)：437-444；及Nissinoff A(1991)J Immunol 147(8)：2429-2438，其各自全部以引用方式併入本文。
在具體實施例中，與本文所述之抗-TIM-3(例如，人類TIM-3)抗體結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之相同表位的本文所述抗體為人類抗體。在具體實施例中，競爭性阻斷(例如，以劑量依賴性方式)本文描述之抗體中之任一者結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之本文所述抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之任何方法產生。舉例而言，可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白，但可表現人類免疫球蛋白基因的基因轉殖小鼠。具體而言，人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物可隨機地或藉由同源重組引入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除了人類重鏈及輕鏈基因以外，人類可變區、恆定區及多變區亦可 引入小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因可與藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座分開地或同時地變成非功能性的。具體而言，JH區之同型接合缺失防止內源性抗體產生。將經修飾之胚胎幹細胞擴增並且顯微注射至胚胞中以產生嵌合小鼠。接著，使嵌合小鼠繁殖以產生表現人類抗體之同型接合子代。將基因轉殖小鼠以正常方式用選定抗原，例如，抗原(例如，TIM-3(例如，人類TIM-3))之全部或一部分免疫接種。針對抗原之單株抗體可使用習知的融合瘤技術由經免疫接種之基因轉殖小鼠獲得。由基因轉殖小鼠載有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重新排列，隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此，使用此類技術，可能產生治療上適用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體。關於產生人類抗體之此項技術之概述，參見Lonberg N & Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13：65-93，其全部以引用方式併入本文。關於產生人類抗體及人類單株抗體之此項技術及產生此類抗體之實驗程序的詳細論述，參見，例如，國際公開案第WO 98/24893，第WO 96/34096及第WO 96/33735號；及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號，其全部以引用方式併入本文。能夠產生人類抗體之小鼠之實例包括XenomouseTM(Abgenix,Inc.；美國專利第6,075,181號及第6,150,184號)，HuAb-MouseTM(Mederex,Inc./Gen Pharm；美國專利第5,545,806 及5,569,825號)，Trans Chromo MouseTM(Kirin)以及KM MouseTM(Medarex/Kirin)，其全部以引用方式併入本文。
特異性結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)之人類抗體可藉由此項技術中已知之多種方法製成，包括如上所述使用衍生自人類免疫球蛋白序列之抗體文庫的噬菌體呈現方法。亦參見美國專利第4,444,887號、第4,716,111號及第5,885,793號；以及國際公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096號、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號，其全部以引用方式併入本文。
在一些實施例中，人類抗體可使用小鼠-人類融合瘤產生。舉例而言，用埃-巴二氏病毒(EBV)轉化之人類末梢血淋巴細胞可與小鼠骨髓瘤細胞融合以產生分泌人類單株抗體之小鼠-人類融合瘤，並且可對此等小鼠-人類融合瘤加以篩選以判定分泌特異性結合至目標抗原(例如，TIM-3(例如，人類TIM-3))之人類單株抗體的融合瘤。此等方法為已知的並且在此項技術中有所描述，參見，例如，Shinmoto H等人，(2004)Cytotechnology 46：19-23；Naganawa Y等人，(2005)Human Antibodies 14：27-31，其各自全部以引用方式併入本文。
5.6 套組
亦提供包含本文描述之一或多種抗體、或其醫藥組合物或接合物的套組。在一具體實施例中，本文提 供一種醫藥包裝或套組，該包裝或套組包括一或多個容器，該等容器填充有本文所述之醫藥組合物之一或多種成分，諸如本文提供之一或多種抗體。在一些實施例中，套組含有本文所述之醫藥組合物及任何預防或治療劑，諸如本文所述之預防或治療劑。在某些實施例中，套組可含有T細胞促分裂原，諸如，例如，植物血球凝集素(PHA)及/或佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)，或TCR複合刺激抗體，諸如抗CD3抗體及抗CD28抗體。視情況，此類容器可附有管理藥物或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式的須知，該須知反映了該機構對製造、使用或銷售以供人類投藥之批准。
亦提供可用於上述方法中之套組。在一實施例中，套組在一或多個容器中包含本文所述之抗體，較佳經純化之抗體。在一具體實施例中，本文所述之套組含有大體上分離之TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原作為對照。在另一具體實施例中，本文所述之套組進一步包含不與TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原反應之對照抗體。在另一具體實施例中，本文所述之套組含有用於偵測抗體結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原之一或多個要素(例如，該抗體可接合至可偵測受質，諸如螢光化合物、酶受質、放射性化合物或發光化合物，或識別第一抗體之第二抗體可接合至可偵測受質)。在具體實施例中，本文提供之套組可包括重組產生或化學合成之TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原。在套組中提供之TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原亦 可連接至固體支撐物。在一更具體實施例中，上述套組之偵測構件包括TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原所連接至的固體支撐物。此類套組亦可包括非連接的報道子標記之抗人類抗體或抗小鼠/大鼠抗體。在此實施例中，抗體結合至TIM-3(例如，人類TIM-3)抗原可藉由該報道子標記抗體之結合來偵測。在一實施例中，本發明係關於本發明之套組在活體外分析及/或偵測生物樣品中之TIM-3抗原(例如，人類TIM-3)中的用途。
6. 實例
在此部分(即，部分6)中之實例為了說明而提供，並且不具有限制性。
6.1 實例1：針對人類TIM-3之新穎抗體之產生及表徵
此實例描述結合至人類T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3(TIM-3)之抗體之產生及表徵。具體而言，此實例描述特異性結合至人類TIM-3並且抑制人類TIM-3之功能的人類抗體之產生。
在以下描述之一些研究中，將本發明之抗-TIM-3抗體之活性與參考抗-TIM-3抗體pab1944w或Hum11之活性相比較。抗體pab1944w係基於在美國專利第8,552,156號(全部以引用方式併入本文)中提供之抗體8213 HV0LV0之可變區產生。pab1944w之序列在表7中示出。抗體pab1944w表現為包含Fc區中之N297A突變 之IgG1抗體，根據EU編號系統來對其編號。抗體Hum11係基於在美國專利公開案第US 2015/0218274號(其全部以引用方式併入本文)中提供之抗體ABTIM3-hum11之可變區產生。Hum11之序列在表7中示出。抗體Hum11表現為包含Fc區中之S228P突變的IgG4抗體，根據EU編號系統來對其編號。
Figure 106117694-A0202-12-0169-16
6.1.1 使用Retrocyte DisplayTM技術之抗-TIM-3抗體的生成
本文描述Retroeyte DisplayTM文庫之生成。為了產生文庫插入物，經由苯酚/氯仿自FACS分選之CD19陽性人類B淋巴細胞提取總RNA。總RNA係用於使用來自Fermentas之RevertAid First Strand cDNA合成套組(目錄編號(Cat#)K1621及K1622)進行第一鏈cDNA合成。抗體可變區藉由PCR自cDNA擴增並且選殖至逆轉錄病毒表現載體(pCMA)中。隨後使用Retrocyte DisplayTM技術，將此等構築體用於轉導鼠科preB細胞以便在表面上表現抗體。
將如上所述生成之Retrocyte DisplayTM文庫針對重組人類TIM-3及重組食蟹獼猴TIM-3進行篩選，造成兩種抗體之鑒別，命名為pab2085及pab2088。pab2085及pab2088之可變區之序列資訊總結於表4中。抗體pab2085及pab2088表現為IgG1抗體並且在以下描述之檢定中分析。
6.1.2 抗-TIM-3抗體與表現TIM-3之細胞的結合
使用流式細胞術對抗體pab2085及pab2088與表現TIM-3之細胞的結合進行測試。簡言之，將野生型鼠科1624-5細胞或經工程化以表現人類TIM-3之1624-5細胞與小鼠Fc-受體阻斷劑(BD Pharmingen,Cat# 553142)一起培育以減少非特異性結合。在洗滌之後，將細胞用抗 -TIM-3抗體或同種型對照抗體染色並且使用FACSCalibur(BD Biosciences)來分析。pab2085及pab2088二者均展示結合至表現人類TIM-3之1624-5細胞但不結合至野生型1624-5細胞(圖1)。
6.1.3 抗-TIM-3抗體之選擇性檢定
使用懸浮陣列技術，將pab2085及pab2088對於TIM-3之選擇性針對家族成員TIM-1及TIM-4進行評估。經由與COOH珠粒表面之胺偶聯，將Luminex®微球與重組人類TIM-3 Fc(R&D Systems,Cat# 2365-TM)、重組人類TIM-3 His(Sino Biological,Cat# 10390-H08H)、重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(R&D Systems,Cat# 7914-TM)、重組人類TIM-1 His(R&D Systems,Cat# 1750-TM)或重組人類TIM-4 His(R&D,Cat# 2929-TM)偶聯。將經純化之pab2085、pab2088及IgG1同種型對照抗體在檢定緩衝液(Roche,Cat# 11112589001)中稀釋至10ng/ml、100ng/ml及1000ng/ml。在96半孔濾板(Millipore,Cat# MABVN1250)中，將各稀釋液(25μl)在黑暗中(20℃，650rpm)與5μl檢定緩衝液中之1500 Luminex®微球一起培育1小時。使用具有1：3稀釋系列(0.08-540ng/ml)之25μl人類IgG1κ標準(Sigma,Cat# I5154)的重複試驗生成標準曲線。使用60μl以R-PE(2.5μg/ml；Jackson ImmunoResearch,Cat# 109-116-097)標記之山羊抗人類IgG F(ab)2進行偵測並且再培育1小時(20℃，650rpm)。使用Luminex® 200系統 (Millipore)分析板。在48μl樣品體積中，每孔計數總共100個珠粒。PE MFI值係用於判定與以上提及之重組蛋白的特異性或非特異性結合。
pab2085(圖2A)及pab2088(圖2B)顯示特異性結合至人類及食蟹獼猴TIM-3，並且在所測試的濃度下未觀察到顯著結合至TIM-1或TIM-4。
6.1.4 使用Retrocyte DisplayTM技術之抗-TIM-3抗體之優化
抗體pab2085及pab2088共用同一重鏈。為了獲得額外的抗-TIM-3抗體，基於pab2085及pab2088之重鏈生成重鏈Retrocyte DisplayTM子文庫並且與更多樣之輕鏈文庫組合。將此新穎Retrocyte DisplayTM文庫針對重組人類TIM-3及重組食蟹獼猴TIM-3進行進一步篩選，造成輕鏈優化之變異體之識別：pab2173、pab2174、pab2175、pab2176、pab2177、pab2178、pab2179、pab2180、pab2181、pab2182、pab2183、pab2184、pab2185、pab2186、pab2187、pab2188、pab2189、pab2190、pab2191及pab2192。此等輕鏈優化之變異體之可變區之序列資訊在表4中列出。輕鏈優化之變異體表現為含有野生型IgG1 Fc區或IgG1變異體Fc區之抗體。此IgG1變異體Fc區不影響Fc區之效應功能。
輕鏈優化之抗體pab2188抗體為在輕鏈恆定域中含有根據Kabat編號之T109S取代(即，相對於野生 型序列，在位置109處，用絲胺酸取代酥胺酸)從而促進可變區同框選殖至恆定區中的抗體。此突變為不影響抗體結合或功能之保守修飾。亦生成在根據Kabat編號之輕鏈之位置109處含有酥胺酸的野生型對應物，命名為pab2188w。抗體pab2188w表現為含有IgG1 N297A Fc區之抗體。
6.1.5 抗-TIM-3抗體結合至TIM-3-表現細胞
在與如上所述之檢定類似的流式細胞術檢定中，輕鏈優化之變異體針對結合至表現人類或食蟹獼猴TIM-3之細胞來進行評估。所有變異體展示結合至經工程化以表現人類TIM-3(圖3A及3B)或食蟹獼猴TIM-3(圖3C及3D)之鼠科1624-5細胞，但不結合至野生型鼠科1624-5細胞(資料未展示)。
將輕鏈優化之變異體結合至初級人類T細胞與親本抗體pab2085之結合比較。簡言之，使用基於磁性之分離(Miltenyi Biotec)，經由聚蔗糖梯度由健康供體膚色血球層(Research Blood Components,LLC)分離之末梢血單核細胞(PBMC)針對原樣全T細胞進行富集。隨後，在37℃及5% CO2下，在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中，將T淋巴細胞之富集群用板結合之抗CD3抗體(SP34，3μg/ml)及可溶性抗CD28抗體(CD28.1，2μg/ml)活化3天。活化之後，在室溫下，將細胞與人類Fc受體阻斷劑一起培育15分鐘以減少非特異性結合(FcR阻斷 劑，Biolegend)。將抗-TIM-3或IgG同種型對照抗體(12點劑量滴定，10,000ng/ml至0.06ng/ml)添加至個別樣品中並且在4℃下培育30分鐘。將樣品洗滌兩次並且含有全部為2.5μg/ml之FITC接合抗-κ抗體以及抗CD3(BV711,OKT3)、抗CD4(BV605,OKT4)及抗CD8a(PE,RPA-T8之抗體混合物在緩衝液(PBS,2mM EDTA,0.5% BSA,pH 7.2)中稀釋，添加至每個樣品並且在4℃下培育30分鐘。將樣品洗滌兩次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)來分析。使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合分析流式細胞術圖表。
如圖4示出，與親本抗體pab2085相比，在此項研究中測試之所有輕鏈優化之變異體顯示更強結合至活化人類CD8+ T細胞。
隨後，抗-TIM-3抗體pab2188針對其結台至初級食蟹獼猴細胞來進行檢查。將從食蟹獼猴(Worldwide Primates,Inc.)分離之冷凍保存的PBMC解凍、洗滌，然後經受流式細胞儀分析。在抗體培育之前，在室溫下將細胞用10%食蟹獼猴血清(Abcam)處理15分鐘以減少非特異性結合。將抗-TIM-3或IgG同種型對照抗體(10點劑量滴定，20,000ng/ml至0.6ng/ml)添加至個別樣品中並且在4℃下培育30分鐘。將樣品洗滌兩次並且將在緩衝液(PBS,2mM EDTA,0.5% BSA,pH 7.2)中稀釋的含有2.5μg/ml之FITC-偶聯之抗-κ抗體以及抗-CD11b(BV785,M1/70)的抗體混合物添加至各樣品中並且在4℃下培育30 分鐘。將樣品洗滌兩次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)進行分析。流式細胞術圖表使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合進行分析。
如圖5示出，抗-TIM-3抗體pab2188以劑量依賴性方式結合初級食蟹獼猴骨髓細胞。
6.1.6 抗-TIM-3抗體之配位體阻斷活性
將抗-TIM-3抗體針對其阻斷重組人類或食蟹獼猴TIM-3結合至由經照射之WR19L鼠科淋巴瘤細胞表現之磷脂醯絲胺酸的能力來進行測試。在室溫下，將抗-TIM-3或IgG同種型對照抗體(對於人類，9點劑量滴定，20,000ng/ml至70ng/ml；或對於食蟹獼猴，6點劑量滴定，20,000ng/ml至625ng/ml)與在1X膜聯蛋白-V結合緩衝液(調整至pH 7.4之10mM Hepes、140mM NaCl及2.5mM CaCl2)中製備之重組人類TIM-3 Fc(R&D Systems,# 2365-TM)或重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(R&D Systems,# 7914-TM)(10,000ng/ml)一起培育30分鐘。將在20Gy下照射並重新懸浮在1X膜聯蛋白-V結合緩衝液中之WR19L細胞在1 x 106個細胞/毫升之最終密度下添加至抗-TIM-3：TIM-3-Fc混合物中並且在室溫下培育45分鐘。將樣品洗滌一次並且將含有在1X膜聯蛋白-V結合緩衝液中稀釋之PE-接合抗-Fc抗體(1：100稀釋)以及活力染劑(Biolegend,NIR通道；1：1000稀釋)的抗體混合物添加至各樣品中並且在室溫下培育20分鐘。隨後將樣品在1X膜 聯蛋白-V結合緩衝液中洗滌一次，重新懸浮在150μl緩衝液(PBS,2mM EDTA,0.5% BSA,pH 7.2)中並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)進行分析。使用FACS DIVA分析流式細胞術圖。
抗-TIM-3抗體pab2085及pab2188阻斷重組人類TIM-3(圖6A)及重組食蟹獼猴TIM-3(圖6B)結合至磷脂醯絲胺酸。
6.1.7 抗-TIM-3抗體對於葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之後的人類PBMC之作用
在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之後，評估輕鏈優化之變異體對於初級人類PBMC之功能活性。簡言之，在96孔NUNCLON δ平板(NUNCTM)中，將冷凍保存的人類PBMC(Research Blood Components)以1 x 105個細胞/孔塗佈在補充有NormocinTM(Invivogen #ant-nr)及10%熱滅活FBS(Gibco,Invitrogen Corporation)之RPMI1640中。在37℃及5% CO2下，細胞在5μg/ml之抗-PD-1抗體派姆單抗(批料7002688300，Myoderm)、抗-TIM-3抗體(10μg/ml)及SEA超抗原(100ng/ml,Toxin Technologies)存在下培養6天。收集無細胞上清液並儲存在-80℃下直至分析為止。使用AlphaLISA(Perkin Elmer)測定IFNγ水準。
當與抗-PD-1抗體派姆單抗組合時，輕鏈優化之變異體在此初級人類PBMC檢定(圖7)中增強IFNγ產 生。
將pab2188w之功能活性在SEA刺激檢定中使用修改的實驗程序來分析。在96孔NUNCLON δ平板(NUNCTM)中，將冷凍保存的人類PBMC(Research Blood Components)以1 x 105個細胞/孔塗覆在補充有NormocinTM(Invivogen #ant-nr)及10%熱滅活FBS(Gibco,Invitrogen Corporation)之RPMI1640中。在37℃及5% CO2下，細胞在5μg/ml之抗-PD-1抗體派姆單抗(批料7002688300，Myoderm)、抗-TIM-3抗體(10μg/ml)及SEA超抗原(100ng/ml,Toxin Technologies)存在下培養9天。接著將細胞洗滌一次並且用新鮮SEA及抗體再刺激2天。收集無細胞之上清液並儲存在-80℃下直至分析為止。使用AlphaLISA(Perkin Elmer)測定IFNγ水準。
如圖8A-8F示出，單獨或與抗-PD-1抗體派姆單抗組合的抗-TIM-3抗體pab2188w(IgG1 N297A)在此SEA刺激檢定中增強來自多個供體之人類PBMC中之IFNγ產生。
6.2 實例2：使用CDR誘變來優化抗-TIM-3抗體
為了改良結合親和力，使用重鏈及輕鏈可變區之CDR殘基的定向誘變來修飾抗-TIM-3抗體pab2188w。簡言之，基於親本抗體pab2188w來產生六個Fab噬菌體呈現文庫，各自含有使用NNK簡並密碼子隨機化來修飾之CDRH或CDRL區域。Fab噬菌體文庫經受 相對於重組人類及食蟹獼猴TIM-3抗原之親和力驅動選擇。基於結合及解離速率量測結果來選擇稱為AM-1、AM-2、AM-3、AM-4、AM-5、AM-6、AM-7、AM-8及AM-9之九個純系。此九個純系之可變區之序列資訊在總結於表4中。所有此等變異體共用pab2188w之輕鏈但含有突變重鏈CDR1。AM-1至AM-9表現為含有IgG1 N297A Fc區之全長抗體並且在以下描述之實驗中分析。
6.2.1 抗-TIM-3抗體結合至TIM-3-表現細胞
在流式細胞術分析中，將抗體AM-1至AM-9結合至異位表現人類TIM-3之Jurkat細胞與親本抗體pab2188w之結合進行比較。如圖9A示出，結合至TIM-3-表現Jurkat細胞之所有變異體及AM-2及AM-6顯示比親本抗體pab2188w更強的結合。AM-2及AM-6之結合藉由流式細胞術使用Kasumi-3(ATCC® CRL-2725TM)，內源性表現TIM-3之人類急性骨髓性白血病細胞株(圖9B)，以及用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之人類CD8+T細胞(圖9C)及用SEA刺激之食蟹獼猴CD8+T細胞(圖9D)來進一步分析。對於結合至人類CD8+T細胞，在37℃及5%CO2下，在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中，將經由聚蔗糖梯度自健康供體膚色血球層(Research Blood Components,LLC)分離之人類PBMC用SEA(100ng/ml)活化8天。活化之後，在室溫下，將細胞與人類Fc受體阻斷劑一起培育15分鐘以減少非特異性結合(FcR阻斷劑， Biolegend)。將抗-TIM-3或IgG同種型對照抗體(12點劑量滴定，10,000ng/ml至0.06ng/ml)添加至個別樣品中並且在4℃下培育30分鐘。類似地，對於結合至食蟹獼猴CD8+T細胞，將分離的食蟹獼猴PBMC由冷凍基料(Worldwide Primates Inc.)解凍並且在37℃及5% CO2下，在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中，用SEA(100ng/ml)活化五天。在室溫下，活化食蟹獼猴PBMC與人類Fc-受體阻斷劑(FcR阻斷劑，Biolegend)及食蟹獼猴血清(Abcam)之組合一起培育15分鐘以減少非特異性結合。將藻紅蛋白偶聯之AM-2抗體或同種型對照抗體(Biolegend PE偶聯，6點劑量滴定，10,000ng/ml至41ng/ml)及各自2.5μg/ml之抗CD4抗體(BV605，OKT4)及抗CD8a抗體(PE，SK1)之混合物在緩衝液(PBS,2mM EDTA,0.5% BSA,pH 7.2)中稀釋，添加至每個樣品，並且在4℃下培育30分鐘。將樣品洗滌兩次並且含有全部為2.5μg/ml之FITC偶聯抗-κ抗體以及抗CD3(BV711,OKT3)、抗CD4(BV605,OKT4)及抗CD8a(PE,RPA-T8之抗體混合物在緩衝液(PBS,2mM EDTA,0.5% BSA,pH 7.2)中稀釋，添加至各樣品中並且在4℃下培育30分鐘。將樣品洗滌兩次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)來分析。使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合來分析流式細胞術圖。AM-2及AM-6展示結合至Kasumi-3細胞(圖9B)及活化人類CD8+T細胞(圖9C)。AM-2亦展示結合至活化食蟹獼猴CD8+T細胞(圖9D)。
隨後，在類似檢定中，結合至初級人類及食蟹獼猴CD14+骨髓細胞藉由流式細胞術使用藻紅蛋白(PE)偶聯之pab2188w、AM-2或同種型對照抗體來分析。簡言之，將由人類或食蟹獼猴(Worldwide Primates,Inc.)中分離之冷凍保存的PBMC解凍、洗滌，隨後經受流式細胞儀分析。在抗體培育之前，在室溫下將細胞用10%食蟹獼猴血清(Abcam,Cat# ab155109)處理15分鐘以減少非特異性結合。在含有抗CD14抗體(APC,M5E2)及Zombie GreenTM可固定生存力標記之抗體混合物中，將PE偶聯之抗-TIM-3或IgG同種型對照抗體(12點劑量滴定，對於人類PBMC為10,000ng/ml至0.05ng/ml並且對於食蟹獼猴PBMC為100,000ng/ml至0.5ng/ml)添加至個別樣品，隨後在4℃下培育30分鐘。留出額外樣品用於單一染色補償控制(CD45-FITC、CD45-PE及CD45-APC；純系MB4-6D6，Miltenyi)。將樣品在緩衝液中洗滌兩次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)來分析。流式細胞術圖表使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合來分析。與親本抗體pab2188w相比，AM-2顯示更強的結合至人類(圖9E)及食蟹獼猴(圖9F)CD14+骨髓細胞。
6.2.2 抗-TIM-3抗體之選擇性檢定
將AM-2及AM-6對於TIM-3之選擇性使用懸浮陣列技術來評估。經由與COOH珠粒表面之胺偶聯，Luminex®微球與重組人類TIM-3 His(Sino Biological,# 10390-H08H)、重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(Sino Biological,# 90312-C02H)、重組小鼠TIM-3 Fc(R&D Systems,# 1529-TM)、重組人類TIM-1 His(R&D Systems,# 1750-TM)、重組人類TIM-4 His(R&D,# 2929-TM)、重組人類OX40 His(Sino Biological,# 10481-H08H)、重組人類GITR Fc(R&D Systems,# 689-GR)、重組人類DR3 Fc(R&D Systems,# 943-D3)及重組人類CD137 Fc(室內生產材料)偶聯。純化pab2188w(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)、AM-6(IgG1 N297A)及IgG1N297A同種型對照抗體在檢定緩衝液(Roche 11112589001)中稀釋至10000ng/ml至0.1ng/ml之劑量滴定。在96半孔濾板(Millipore,MABVN1250)中，每個稀釋液(25μl)在黑暗中(20℃,650rpm)與5μl檢定緩衝液中之1500 Luminex®微球一起培育1小時。使用以R-PE(2.5μg/ml；JIR 109-116-097)標記之60μl山羊抗人類IgGF(ab)2及再培育1小時(20℃,650rpm)來執行偵測。板使用Luminex®200系統(Millipore)來分析。在48μl樣品體積中，每孔計數總共100個珠粒。將PE MFI值用於判定特異性或非特異性結合至重組蛋白。
抗-TIM-3抗體pab2188w(圖10B)、AM-2(圖10C)及AM-6(圖10D)顯示特異性結合至人類及食蟹獼猴TIM-3，並且在所測試的濃度下，未偵測到顯著結合至小鼠TIM-3、人類TIM-1、人類TIM-4、人類OX40、人類GITR、人類DR3或人類CD137。
6.2.3 抗-TIM-3抗體之配位體阻斷活性
將抗-TIM-3抗體AM-2及AM-6針對其阻斷磷脂醯絲胺酸結合至人類或食蟹獼猴TIM-3之能力來進一步分析。在室溫下，將抗-TIM-3或IgG同種型對照抗體(10點劑量滴定，40,000ng/ml至1000ng/ml)與在1X膜聯蛋白-V結合緩衝液(調整至pH 7.4之10mM Hepes、140mM NaCl及2.5mM CaCl2)中製備之重組人類TIM-3 Fc(R&D Systems,# 2365-TM)或重組食蟹獼猴TIM-3 Fc(R&D Systems,# 7914-TM)(10,000ng/ml)一起培育30分鐘。將在20Gy下照射並重新懸浮於1X膜聯蛋白-V結合緩衝液中之WR19L細胞在1 x 106個細胞/毫升之最終密度下添加至抗-TIM-3：TIM-3-Fc混合物並且在室溫下培育45分鐘。將樣品洗滌一次並且將含有在1X膜聯蛋白-V結合緩衝液中稀釋之PE-偶聯抗-Fc抗體(1：100稀釋)以及生存力染劑(Biolegend,NIR通道；1：1000稀釋)的抗體混合物添加至各樣品中並且在室溫下培育20分鐘。然後將樣品在1X膜聯蛋白-V結合緩衝液中洗滌一次並且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)來分析。流式細胞術圖表使用FACS DIVA來分析。
如圖11A及11B示出，抗-TIM-3抗體pab2188w、AM-2及AM-6有效地阻斷人類或食蟹獼猴TIM-3結合至磷脂醯絲胺酸表現細胞。
6.2.4 抗-TIM-3抗體對於葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之後的人類PBMC之作用
將pab2188w之變異體之功能活性使用藉由葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之初級人類PBMC來分析。簡言之，在96孔NUNCLON δ平板(NUNCTM)中，將冷凍保存的人類PBMC(Research Blood Components)以1 x 105個細胞/孔塗覆在補充有NormocinTM(Invivogen #ant-nr)及10%熱滅活FBS(Gibco,Invitrogen Corporation)之RPMI1640中。在37℃及5% CO2下，將細胞在5μg/ml之抗-PD-1抗體派姆單抗(批料7002688300，Myoderm)、抗-TIM-3抗體(10μg/ml)及SEA超抗原(100ng/ml,Toxin Technologies)存在下培養9天。然後將細胞洗滌一次並且用新鮮SEA及抗體再刺激2天。收集無細胞上清液並儲存在-80℃下直至分析為止。使用AlphaLISA(Perkin Elmer)測定IFNγ水準。
如圖12A及12B示出，單獨或與抗-PD-1抗體派姆單抗組合的pab2188w之許多變異體增強來自兩個不同供體之人類PBMC中之IFNγ產生。
6.2.5 抗-TIM-3抗體對於腫瘤浸潤淋巴細胞之細胞因子產生的作用
將抗-TIM-3抗體針對其單獨或與抗-PD-1抗體組合來刺激活化初級腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之細胞因子產生的能力進行進一步評估。來自新鮮非小細胞肺癌 (NSCLC)(階段II)、膽囊腺癌(階段IV)或乳腺癌(階段II)腫瘤(UMass Medical School,Worcester,MA)之單細胞懸浮液經由機械顯微解剖來分離。在一些情況下，視纖維化水準而定，酶消化為必需的(Liberase and DNAseI,Roche)。在96孔NUNCLON δ平板(NUNCTM)中，細胞以5 X 104個細胞/孔在補充有NormocinTM(Invivogen #ant-nr)、重組人類IL-2(20U/ml,R&D Systems)及10%熱滅活FBS(Gibco,Invitrogen Corporation)之RPMI1640中靜置1天。第二天，將樣品離心並且將含有所關注抗體(20μg/ml之抗-TIM-3抗體及5μg/ml之抗-PD-1抗體派姆單抗)及抗CD3/CD28微珠(1：1珠粒：細胞比率)之新鮮培養基以100μl之最終體積添加並且允許在37℃及5% CO2下培育3天。收集無細胞上清液並儲存在-80℃下直至分析為止。使用AlphaLISA(Perkin Elmer)測定IFNγ及TNFα水準。
如圖13A-13F示出，抗-TIM-3抗體增強來自NSCLC、膽囊腺癌或乳腺癌腫瘤之活化初級TIL之IFNγ及TNFα產生。
6.2.6 抗-TIM-3抗體在結合之後的內化
在此實例中，對抗-TIM-3抗體向細胞中之內化進行分析。在第一組實驗中，使用αHFc-NC-DM1(藉由不可裂解連接子來接合至美登醇DM1之抗人類IgG Fc抗體，Moradec LLC)評估抗-TIM-3抗體內化。此次級抗體藥物接合物αHFc-NC-DM1結合至測試抗體(例如，抗- TIM-3抗體)並且導致在內化之後，細胞毒性酬載DM1釋放至細胞之胞質中。在第二組實驗中，使用直接接合至單甲奧里斯他汀E(MMAE)之抗-TIM-3抗體pab2188w(IgG1 N297A)及Hum11(IgG4 S228P)評價內化。各抗體展示類似藥物-抗體比率(DAR；同種型對照=3.5，pab2188w=4.0，Hum11=3.0)，從而在內化之後，支援相等水準之抗體-藥物接合物(ADC)遞送。在第三組實驗中，藉由用細胞不可滲透性螢光染料來標記之TIM-3蛋白之亞細胞定位評估內化。
簡言之，Kasumi-3(ATCC® CRL-2725TM)，一種內源性表現TIM-3之急性骨髓性白血病細胞株，以及經工程化以過度表現TIM-3之Jurkat細胞株以2 x 104/孔之密度塗覆在白底組織培養板中。對於使用次級抗體藥物接合物αHFc-NC-DM1之第一組實驗，將8點劑量滴定(3,333ng/ml至1ng/ml)的與αHFc-NC-DM1(與初級抗體1：1)一致之抗-TIM-3抗體或IgG同種型對照抗體以100μl/孔之最終體積添加至細胞。在37℃及5% CO2下，將細胞與初級抗體及次級抗體藥物接合物一起培育72小時。
在αHFc-NC-DM1實驗中，與參考抗-TIM-3抗體Hum11(IgG4 S228P)及pab1944w(IgG1 N297A)相比，抗-TIM-3抗體pab2188w(IgG1 N297A)、AM-2(IgG1 N297A)及AM-6(IgG1 N297A)更有效地內化在Jurkat細胞(圖14A)及Kasumi-3細胞(圖14B)上表現之TIM-3，如在廣泛範圍之抗體濃度下細胞存活之較大減少所證明。
對於第二組實驗，將抗體pab2188w(IgG1 N297A)及Hum11(編號IgG4 S228P)直接接合至類似濃度之MMAE以考慮到次級藥物接合物(αHFc-NC-DM1)結合抗體之不同Fc區之傾向的可能差異。將9點劑量滴定(6,666ng/ml至1ng/ml)之MMAE接合的抗-TIM-3抗體或MMAE接合的IgG同種型對照抗體以100μl/孔之最終體積添加至細胞中。在37℃及5% CO2下，將細胞與接合抗體一起培育72小時。培育之後，將90μl之重構Cell Titer Glo(Promega)添加至各孔中並且在室溫下培育細胞5分鐘。使用Envision儀器(Perkin Elmer)記錄所得螢光。
如圖14C示出，抗體pab2188w(IgG1 N297A)比抗體Hum11(編號IgG4 S228P)誘導細胞存活之更大減少，指示對於次級抗體藥物接合物所觀察到的作用(例如在圖14A中示出)可歸因於每個TIM-3抗體之內化潛力。
在第三組實驗中，藉由活細胞之共焦螢光顯微術分析抗-TIM-3抗體之內化。在37℃及5% CO2下，將表現HaloTag-TIM-3融合蛋白之Jurkat細胞首先與1μMViolet Proliferation Dye 450(BD)一起培育30分鐘。培育之後，在PBS中洗滌細胞並且重新懸浮於細胞培養基中。為了偵測TIM-3之細胞外域，在37℃及5% CO2下，將Jurkat HaloTag-TIM-3細胞用膜不可滲透性HaloTag Alexa Fluor 488配位體(Promega，1μM)染色15分鐘。接著，將細胞重新懸浮於新鮮培養基中並且與抗-TIM-3抗體AM-2(IgG1 N297A)或同種型對照(每個抗體為 10μg/ml)一起塗於384孔顯微板中(15,000個細胞/孔)中。在環境控制(37℃及5% CO2)下，使用ImageXpress Micro Confocal High-Content顯微鏡(Molecular Devices)收集現場影像並且在3.5小時期間每30分鐘獲取影像。使用MetaXpress分析軟體(Molecular Devices)執行影像分析。Jurkat細胞係由DAPI通道(Violet Proliferation Dye 450)中識別並且由FITC通道(HaloTag Alexa Fluor 488)針對每個細胞定量內化的TIM-3信號之量。
如圖15示出，相對於與同種型對照抗體一起培育之細胞，對於與抗-TIM-3抗體AM-2一起培育之細胞，觀察到隨著時間推移的TIM-3內化之增加。具體而言，在3.5小時之後，與用同種型對照抗體處理之TIM-3-陽性細胞相比，AM-2抗體處理導致兩倍百分比之TIM-3-陽性細胞展示TIM-3內化(即，相應地15.1%內化相較於7.2%內化)。此外，在3.5小時，與用同種型對照抗體處理之細胞相比，對於AM-2抗體處理之細胞所觀察到的內化信號顯著更高(p=0.00027，單尾T測試)。在0小時時間點，沒有統計上的顯著差異(p=0.91，單尾T-測試)。
6.3 實例3：抗-TIM-3抗體之表位映射
在此實例中，抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)、pab2187(IgG1變異體)及AM-2(IgG1 N297A)之表位得以表徵。
6.3.1 使用丙胺酸掃描之抗-TIM-3抗體之表位映射
藉由丙胺酸掃描評估抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)及pab2187(IgG1變異體)之結合特徵。簡言之，將來自Agilent Technologies之QuikChange HT蛋白質工程系統(Cat# G5901A)用於生成在細胞外域中具有丙胺酸取代之人類TIM-3突變體。使用逆轉錄病毒轉導將人類TIM-3突變體在鼠科1624-5前B細胞之表面上表現。表現人類TIM-3之細胞之轉導效率或百分比保持在低於5%以確保大多數細胞不表現兩種或兩種以上不同的TIM-3突變體。
如在流式細胞術中藉由結合至多株抗-TIM-3抗體(R&D Systems,Cat# AF2365)所證明，表現正確折疊之人類TIM-3突變體之細胞進一步被選擇用於亞群，該亞群表現不結合單株抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)或pab2187(IgG1變異體)之人類TIM-3突變體。藉由製備型高速FACS(FACSAriaII,BD Biosciences)將展示特異性抗體結合之細胞自非結合細胞群中分離。將抗體反應性或非反應性細胞池在組織培養物中再次擴增並且重複抗體指導之細胞分選及組織培養擴增之循環直至獲得明確可偵測之抗-TIM-3抗體(pab2188(IgG1變異體)或pab2187(IgG1變異體))非反應性細胞群為止。此抗-TIM-3抗體(pab2188(IgG1變異體)或pab2187(IgG1變異體))非反應性細胞群經受最終的單細胞或整體分選步驟。在幾天細胞擴增之後，使用流式細胞術，將單細胞或整體分選細胞再次針對結合至多 株抗-TIM-3抗體以及不結合至單株抗體pab2188(IgG1變異體)或pab2187(IgG1變異體)進行測試。
為了將表型與基因型相關聯，對於表現人類TIM-3突變體之整體分選細胞執行NGS測序。序列分析顯示對於多株抗-TIM-3抗體具有反應性但不對單株抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)或pab2187(IgG1變異體)具有反應性之細胞表現一種人類TIM-3突變體，其中位置40由Phe突變為Ala，根據SEQ ID NO：79所編號。
6.3.2 使用氫-氘交換(HDX)質譜術之抗-TIM-3抗體之表位映射
在第一研究中，使用氫-氘交換(HDX)質譜術來研究pab2188(IgG1變異體)與人類TIM-3之相互作用。
對於去糖基化處理，在37℃下將250μg之重組人類TIM-3/Fc嵌合體(R&D Systems,Cat# 2365-TM)與4μl之PNG酶F一起培育3小時。人類TIM-3/Fc嵌合體包含融合至人類IgG1之SEQ ID NO：102之胺基酸序列。
對於胃蛋白酶消化，將115μl對照緩衝液(50mM磷酸鹽，100mM氯化鈉，pH 7.4)中之6.9μg天然或去糖基化之人類TIM-3/Fc嵌合體藉由添加115μl之4M鹽酸胍、0.85M TCEP緩衝液(最終pH 2.5)並且在10℃下培育混合物3分鐘來變性。接著，使混合物經受使用內部填充胃蛋白酶管柱之管柱上胃蛋白酶消化並且將所得肽使用包含耦接至Q ExactiveTM Hybrid Quadrupole-Orbitrap 質譜儀(Thermo)之Waters Acquity UPLC的UPLC-MS系統來分析。該等肽在具有2-32%溶劑B之20.5分鐘梯度(乙腈中之0.1%甲酸)的50mm x 1mm C8管柱上分離。經由使用Mascot軟體對人類TIM-3序列搜索MS/MS資料進行肽識別。前驅物及產物離子之質量容差分別為20ppm及0.05Da。
將10μl天然或去糖基化之人類TIM-3/Fc嵌合體(6.9μg)、10μl天然人類TIM-3/Fc嵌合體及抗體混合物(6.9μg：12.9μg)或10μl去糖基化之人類TIM-3/Fc嵌合體及抗體混合物(6.9μg：12.9μg)與105μl氧化氘標記緩衝液(50mM磷酸鹽，100mM氯化鈉，pD 7.4)一起培育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒、14400秒及28800秒。在10℃下，對於天然人類TIM-3/Fc嵌合體及其與抗體之複合物進行氘交換，或在4℃下對於去糖基化之人類TIM-3/Fc嵌合體及其與抗體之複合物進行氘交換。藉由添加115μl之4M鹽酸胍、0.85M TCEP緩衝劑(最終pH 2.5)中止氘交換。後來，中止樣品經受管柱上之胃蛋白酶消化及如上所述之LC-MS分析。僅在MS模式下記錄質譜。為了計算氘併入，在所提取之離子層析峰中，將給定肽之質譜加以組合，並且計算加權平均m/z。自天然肽之質量(0分鐘)至加權平均質量之質量增加對應於氘併入水準。
對於天然及去糖基化之人類TIM-3所達成的序列覆蓋率分別為71.6%及98.4%。雖然在具有及不 具有抗人類TIM-3抗體的情況下，大多數人類TIM-3肽展示相同或類似氘水準，但發現多個肽區段在抗體結合之後具有顯著減少之氘併入。在由SEQ ID NO：94(VCWGKGACPVFECGNVVL)之胺基酸序列組成的區域及由SEQ ID NO：95(RIIPGIMND)之胺基酸序列組成之區域處結合至抗人類TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)之後，天然及去糖基化之人類TIM-3顯示氘吸收之顯著減少。在由SEQ ID NO：93(PVFECGN)之胺基酸序列組成之區域處，觀察到氘吸收之最強減少。
隨後，在與如上所述之研究相似的HDX質譜術研究中，研究AM-2(IgG1 N297A)與人類TIM-3之相互作用。簡言之，在氧化氘中，單獨或與抗人類TIM-3抗體AM-2(IgG1 N297A)組合培育去糖基化之人類TIM-3/Fc嵌合體。氘交換在10℃下進行0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒及14400秒。交換反應藉由低pH來中止並且中止樣品經受管柱上之胃蛋白酶/蛋白酶XIII或蛋白酶XVIII消化及如上所述之LC-MS分析。原始MS資料係使用HDX WorkBench(一種用於分析H/D交換MS資料之軟體)來處理(J.Am.Soc.Mass Spectrom.2012,23(9),1512-1521，其全部以引用方式併入本文)。使用氘化肽與其天然形式之間之平均質量差異(t0)計算氘水準。
對於去糖基化之人類TIM-3達成百分之百序列覆蓋率。抗-TIM-3抗體AM-2(IgG1 N297A)顯示與pab2188(IgG1變異體)展示之結合模式相似的結合模式。 當去糖基化之人類TIM-3結合至抗-TIM-3抗體AM-2(IgG1 N297A)時，兩個區域，亦即由SEQ ID NO：94(VCWGKGACPVFECGNVVL)之胺基酸序列組成的一個區域以及由SEQ ID NO：96(RIPGIMNDEKFNLKL)之胺基酸序列組成的另一個區域經歷強有力的氘保護。在由SEQ ID NO：93(PVFECGN)之胺基酸序列組成之區域處，觀察到最強減少。
6.3.3 使用Pepscan分析之抗-TIM-3抗體之表位映射
抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)之結合係針對作為晶片結合肽陣列所製備之合成TIM-3相關肽片段進行量測。藉由Pepscan Presto BV,Lelystad,the Netherlands執行分析。簡言之，為了重構人類TIM-3之表位，合成肽文庫。藉由以下過程獲得胺基官能化之聚丙烯支撐物：用專有親水性聚合物調配物接枝，繼之使用二環己基碳二亞胺(DCC)與N-羥基苯并三唑(HOBt)來與第三丁氧羰基-己二胺(BocHMDA)反應，隨後使用三氟乙酸(TFA)裂解Boc基團。藉由定製經改良之JANUS液體處置站(Perkin Elmer)，將標準Fmoc-肽合成用於在胺基官能化之固體支撐物上合成肽。結構模擬物之合成使用Pepscan之專有支架化學鍵合肽(CLIPS)技術來進行。CLIPS技術允許將肽結構化成單環、雙環、三重環、薄片樣折疊、螺旋樣折疊及其組合。抗體與合成肽中之每一者之結合在基於PEPSCAN之ELISA中測試。在4℃下，肽陣列與初級 抗體溶液一起培育隔夜。洗滌之後，在25℃下，肽陣列與山羊抗人類HRP接合物(Southern Biotech,Cat# 2010-05)一起培育1小時。洗滌之後，添加過氧化物酶受質2,2’-次偶氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯(ABTS)及2μl/ml之3% H2O2。1小時之後，量測顯色並且使用電荷耦合裝置(CCD)-攝影機及影像處理系統來量化。
Pepscan研究顯示抗-TIM-3抗體pab2188(IgG1變異體)識別人類TIM-3之片段，包括由SEQ ID NO：99(GKGACPVFE)之胺基酸序列組成之區域及由SEQ ID NO：100(DFTAAFPR)之胺基酸序列組成之區域。
* * *
本發明在範疇上不受本文所述之具體實施例的限制。實際上，除本文所述之修改外，熟習此項技術者亦將由以上描述及隨附圖式而顯而易知本發明之各種修改。此類修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
本文引用之所有參考(例如，公開案或專利或專利申請案)全部並且出於所有目的以引用方式併入本文，其引用程度如同每個個別參考(例如，公開案或專利或專利申請案)特定地及個別地指示出於所有目的全部以引用方式併入一般。
其他實施例在以下申請專利範圍內。
<110> 艾吉納斯公司(Agenus Inc.)
<120> 抗-TIM-3抗體及其使用方法
<140> TW 106117694
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<160> 102
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD456-2919 CDRH1
<400> 1
Figure 106117694-A0202-12-0194-18
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD456-2919 CDRH2
<400> 2
Figure 106117694-A0202-12-0194-17
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD456-2919 CDRH3
<400> 3
Figure 106117694-A0202-12-0195-22
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-1 CDRH1
<400> 4
Figure 106117694-A0202-12-0195-21
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-2 CDRH1
<400> 5
Figure 106117694-A0202-12-0195-20
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-3 CDRH1
<400> 6
Figure 106117694-A0202-12-0195-19
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-4 CDRH1
<400> 7
Figure 106117694-A0202-12-0196-23
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-5 CDRH1
<400> 8
Figure 106117694-A0202-12-0196-24
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-6 CDRH1
<400> 9
Figure 106117694-A0202-12-0196-25
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-7 CDRH1
<400> 10
Figure 106117694-A0202-12-0196-26
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-8 CDRH1
<400> 11
Figure 106117694-A0202-12-0197-30
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-9 CDRH1
<400> 12
Figure 106117694-A0202-12-0197-29
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD197-1181 CDRL1
<400> 13
Figure 106117694-A0202-12-0197-28
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD412-2513 CDRL1
<400> 14
Figure 106117694-A0202-12-0197-27
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106117694-A0202-12-0198-31
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3169 CDRL1
<400> 16
Figure 106117694-A0202-12-0198-32
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD197-1181 CDRL2
<400> 17
Figure 106117694-A0202-12-0198-33
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD456-2928 CDRL2
<400> 18
Figure 106117694-A0202-12-0198-34
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3165 CDRL2
<400> 19
Figure 106117694-A0202-12-0199-38
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3166 CDRL2
<400> 20
Figure 106117694-A0202-12-0199-37
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3167 CDRL2
<400> 21
Figure 106117694-A0202-12-0199-36
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD197-1181 CDRL3
<400> 22
Figure 106117694-A0202-12-0199-35
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD392-2234 CDRL3
<400> 23
Figure 106117694-A0202-12-0200-39
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD456-2919 VH
<400> 24
Figure 106117694-A0202-12-0200-40
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3162 VH
<400> 25
Figure 106117694-A0202-12-0201-41
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3163 VH
<400> 26
Figure 106117694-A0202-12-0201-42
Figure 106117694-A0202-12-0202-43
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-1-VH
<400> 27
Figure 106117694-A0202-12-0202-44
Figure 106117694-A0202-12-0203-45
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-2-VH
<400> 28
Figure 106117694-A0202-12-0203-46
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-3-VH
<400> 29
Figure 106117694-A0202-12-0204-47
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-4-VH
<400> 30
Figure 106117694-A0202-12-0204-48
Figure 106117694-A0202-12-0205-49
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-5-VH
<400> 31
Figure 106117694-A0202-12-0205-50
Figure 106117694-A0202-12-0206-51
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-6-VH
<400> 32
Figure 106117694-A0202-12-0206-52
Figure 106117694-A0202-12-0207-53
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-7-VH
<400> 33
Figure 106117694-A0202-12-0207-54
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-8-VH
<400> 34
Figure 106117694-A0202-12-0208-55
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-9-VH
<400> 35
Figure 106117694-A0202-12-0208-56
Figure 106117694-A0202-12-0209-57
<210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD197-1181 VL
<400> 36
Figure 106117694-A0202-12-0209-58
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD412-2513 VL
<400> 37
Figure 106117694-A0202-12-0210-59
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD456-2928 VL
<400> 38
Figure 106117694-A0202-12-0210-60
Figure 106117694-A0202-12-0211-61
<210> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3164 VL
<400> 39
Figure 106117694-A0202-12-0211-62
Figure 106117694-A0202-12-0212-63
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3165 VL
<400> 40
Figure 106117694-A0202-12-0212-64
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3166 VL
<400> 41
Figure 106117694-A0202-12-0212-65
Figure 106117694-A0202-12-0213-66
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3167 VL
<400> 42
Figure 106117694-A0202-12-0213-67
Figure 106117694-A0202-12-0214-68
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3168 VL
<400> 43
Figure 106117694-A0202-12-0214-69
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3169 VL
<400> 44
Figure 106117694-A0202-12-0215-71
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3170 VL
<400> 45
Figure 106117694-A0202-12-0215-70
Figure 106117694-A0202-12-0216-72
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3171 VL
<400> 46
Figure 106117694-A0202-12-0216-73
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3172 VL
<400> 47
Figure 106117694-A0202-12-0217-74
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1共有序列1
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> Arg、Ser、Ala、Gly、Lys、Met或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (2)..(2)
<223> Gln、Ser、Ala、Gly、Arg或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (3)..(3)
<223> Asn、Tyr、Gly或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (4)..(4)
<223> Ala或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (5)..(5)
<223> Trp、Met、Ala、Ser或Thr
<400> 48
Figure 106117694-A0202-12-0218-75
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1共有序列2
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> Arg或Ala
<220>
<221> 變異體
<222> (2)..(2)
<223> Gln或Arg
<400> 49
Figure 106117694-A0202-12-0218-76
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1共有序列3
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> Lys、Met或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (2)..(2)
<223> Ala或Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Thr
<400> 50
Figure 106117694-A0202-12-0219-79
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1共有序列4
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> Ser、Arg、Thr或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (2)..(2)
<223> Ala、Ser、Thr或Gly
<400> 51
Figure 106117694-A0202-12-0219-77
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XASQSVXSSYLA
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> Arg或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (7)..(7)
<223> 不存在或為Ser
<400> 52
Figure 106117694-A0202-12-0220-80
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2共有序列
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> Asp或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (4)..(4)
<223> Asn、Ser或Thr
<400> 53
Figure 106117694-A0202-12-0220-81
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3共有序列
<220>
<221> 變異體
<222> (8)..(8)
<223> Leu或Ile
<400> 54
Figure 106117694-A0202-12-0221-83
<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH共有序列
<220>
<221> 變異體
<222> (15)..(15)
<223> Gly或Arg
<220>
<221> 變異體
<222> (30)..(30)
<223> Arg、Ser、Ala、Gly、Lys、Met或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (31)..(31)
<223> Gln、Ser、Ala、Gly、Arg或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (32)..(32)
<223> Asn、Tyr、Gly或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (33)..(33)
<223> Ala或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (34)..(34)
<223> Trp、Met、Ala、Ser或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (39)..(39)
<223> Arg或Gln
<400> 55
Figure 106117694-A0202-12-0221-82
Figure 106117694-A0202-12-0222-84
<210> 56
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL共有序列
<220>
<221> 變異體
<222> (9)..(9)
<223> Ala或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (24)..(24)
<223> Arg或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (30)..(30)
<223> 不存在或為Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (43)..(43)
<223> Gln或Leu
<220>
<221> 變異體
<222> (51)..(51)
<223> Asp或Gly
<220>
<221> 變異體
<222> (54)..(54)
<223> Asn、Ser或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (61)..(61)
<223> Ala或Asp
<220>
<221> 變異體
<222> (62)..(62)
<223> Ser或Arg
<220>
<221> 變異體
<222> (78)..(78)
<223> Arg或Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (97)..(97)
<223> Leu或Ile
<220>
<221> 變異體
<222> (106)..(106)
<223> Glu或Lys
<400> 56
Figure 106117694-A0202-12-0223-85
Figure 106117694-A0202-12-0224-86
<210> 57
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab2188全長IgG1重鏈
<400> 57
Figure 106117694-A0202-12-0224-87
Figure 106117694-A0202-12-0225-88
Figure 106117694-A0202-12-0226-89
<210> 58
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab2188全長IgG1 N297A重鏈
<400> 58
Figure 106117694-A0202-12-0226-90
Figure 106117694-A0202-12-0227-91
Figure 106117694-A0202-12-0228-92
<210> 59
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab2188全長IgG4 S228P重鏈
<400> 59
Figure 106117694-A0202-12-0228-93
Figure 106117694-A0202-12-0229-94
Figure 106117694-A0202-12-0230-95
<210> 60
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-1全長IgG1 N297A重鏈
<400> 60
Figure 106117694-A0202-12-0231-96
Figure 106117694-A0202-12-0232-97
Figure 106117694-A0202-12-0233-98
<210> 61
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-2全長IgG1 N297A重鏈
<400> 61
Figure 106117694-A0202-12-0233-99
Figure 106117694-A0202-12-0234-100
Figure 106117694-A0202-12-0235-101
<210> 62
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-3全長IgG1 N297A重鏈
<400> 62
Figure 106117694-A0202-12-0235-102
Figure 106117694-A0202-12-0236-103
Figure 106117694-A0202-12-0237-104
<210> 63
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-4全長IgG1 N297A重鏈
<400> 63
Figure 106117694-A0202-12-0238-105
Figure 106117694-A0202-12-0239-106
Figure 106117694-A0202-12-0240-107
<210> 64
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-5全長IgG1 N297A重鏈
<400> 64
Figure 106117694-A0202-12-0240-108
Figure 106117694-A0202-12-0241-109
Figure 106117694-A0202-12-0242-110
<210> 65
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-6全長IgG1 N297A重鏈
<400> 65
Figure 106117694-A0202-12-0242-111
Figure 106117694-A0202-12-0243-112
Figure 106117694-A0202-12-0244-113
<210> 66
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-7全長IgG1 N297A重鏈
<400> 66
Figure 106117694-A0202-12-0244-114
Figure 106117694-A0202-12-0245-115
Figure 106117694-A0202-12-0246-116
<210> 67
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-8全長IgG1 N297A重鏈
<400> 67
Figure 106117694-A0202-12-0247-117
Figure 106117694-A0202-12-0248-118
Figure 106117694-A0202-12-0249-119
<210> 68
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AM-9全長IgG1 N297A重鏈
<400> 68
Figure 106117694-A0202-12-0249-120
Figure 106117694-A0202-12-0250-121
Figure 106117694-A0202-12-0251-122
<210> 69
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BADD466-3171全長輕鏈序列
<400> 69
Figure 106117694-A0202-12-0251-123
Figure 106117694-A0202-12-0252-124
<210> 70
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 G1m3同種異型(沒有C-端離胺酸)
<400> 70
Figure 106117694-A0202-12-0253-125
Figure 106117694-A0202-12-0254-126
<210> 71
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 G1m3同種異型
<400> 71
Figure 106117694-A0202-12-0254-127
Figure 106117694-A0202-12-0255-128
Figure 106117694-A0202-12-0256-129
<210> 72
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 N297A(沒有C-端離胺酸)
<400> 72
Figure 106117694-A0202-12-0256-130
Figure 106117694-A0202-12-0257-131
<210> 73
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 N297A
<400> 73
Figure 106117694-A0202-12-0258-132
Figure 106117694-A0202-12-0259-133
<210> 74
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 S228P(沒有C-端離胺酸)
<400> 74
Figure 106117694-A0202-12-0259-134
Figure 106117694-A0202-12-0260-135
Figure 106117694-A0202-12-0261-136
<210> 75
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 S228P
<400> 75
Figure 106117694-A0202-12-0261-137
Figure 106117694-A0202-12-0262-138
Figure 106117694-A0202-12-0263-139
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類κ輕鏈恆定區IGKC*01 Km3同種異型
<400> 76
Figure 106117694-A0202-12-0263-140
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類κ輕鏈恆定區IGKC*01 Km3同種異型(具有T109S突變)
<400> 77
Figure 106117694-A0202-12-0263-141
Figure 106117694-A0202-12-0264-142
<210> 78
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 106117694-A0202-12-0264-143
Figure 106117694-A0202-12-0265-144
<210> 79
<211> 280
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 106117694-A0202-12-0266-145
Figure 106117694-A0202-12-0267-147
<210> 80
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab1944w VH
<400> 80
Figure 106117694-A0202-12-0267-148
Figure 106117694-A0202-12-0268-149
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab1944w VL
<400> 81
Figure 106117694-A0202-12-0268-150
<210> 82
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hum11 VH
<400> 82
Figure 106117694-A0202-12-0269-151
<210> 83
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hum11 VL
<400> 83
Figure 106117694-A0202-12-0269-152
Figure 106117694-A0202-12-0270-153
<210> 84
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 106117694-A0202-12-0270-154
<210> 85
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 106117694-A0202-12-0271-155
<210> 86
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 106117694-A0202-12-0271-156
Figure 106117694-A0202-12-0272-157
<210> 87
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 106117694-A0202-12-0272-158
<210> 88
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 106117694-A0202-12-0272-159
Figure 106117694-A0202-12-0273-160
<210> 89
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab1944w(IgG1 N297A)全長重鏈
<400> 89
Figure 106117694-A0202-12-0273-161
Figure 106117694-A0202-12-0274-162
Figure 106117694-A0202-12-0275-163
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pab1944w(IgG1 N297A)全長輕鏈
<400> 90
Figure 106117694-A0202-12-0275-164
Figure 106117694-A0202-12-0276-165
<210> 91
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hum11(IgG4 S228P)全長重鏈
<400> 91
Figure 106117694-A0202-12-0276-166
Figure 106117694-A0202-12-0277-167
Figure 106117694-A0202-12-0278-168
<210> 92
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hum11(IgG4 S228P)全長輕鏈
<400> 92
Figure 106117694-A0202-12-0279-169
Figure 106117694-A0202-12-0280-170
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 106117694-A0202-12-0280-174
<210> 94
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 106117694-A0202-12-0280-171
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 106117694-A0202-12-0280-172
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 106117694-A0202-12-0280-173
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 106117694-A0202-12-0281-175
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 106117694-A0202-12-0281-176
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Figure 106117694-A0202-12-0281-178
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Figure 106117694-A0202-12-0281-179
<210> 101
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TIM-3 F40A
<400> 101
Figure 106117694-A0202-12-0282-180
Figure 106117694-A0202-12-0283-181
<210> 102
<211> 179
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Figure 106117694-A0202-12-0283-182
Figure 106117694-A0202-12-0284-183

Claims (15)

  1. 一種特異性結合人類TIM-3之分離抗體，該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3且該輕鏈可變區包含互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含如SEQ ID NO：1、2、3、14、21及22；4、2、3、14、21及22；5、2、3、14、21及22；6、2、3、14、21及22；7、2、3、14、21及22；8、2、3、14、21及22；9、2、3、14、21及22；10、2、3、14、21及22；11、2、3、14、21及22；或12、2、3、14、21及22所示之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之分離抗體，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含如SEQ ID NO：5、2、3、14、21及22所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之分離抗體，其中(a)該重鏈可變區包含(i)SEQ ID NO：55之胺基酸序列；(ii)與選自由SEQ ID NO：24至35組成的群之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%相同之胺基酸序列；或(iii)選自由SEQ ID NO：24至35組成的群之胺基酸序列；及/或(b)該輕鏈可變區包含(i)SEQ ID NO：56之胺基酸序列； (ii)與選自由SEQ ID NO：42、43、45及46組成的群之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%相同之胺基酸序列；或(iii)選自由SEQ ID NO：42、43、45及46組成的群之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之分離抗體，其中(a)該重鏈可變區和該輕鏈可變區分別包含如SEQ ID NO：26和42；24和42；24和46；24和43；26和43；26和46；25和45；25和46；25和42；25和43；27和46；28和46；29和46；30和46；31和46；32和46；33和46；34和46；或35和46所示之胺基酸序列；或(b)該抗體包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：58、61或65之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之分離抗體，其中該抗體包含選自由以下組成的群之重鏈恆定區：人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
  6. 如請求項5之分離抗體，其中該重鏈恆定區係：(a)IgG1重鏈恆定區；(b)IgG1重鏈恆定區，其中(i)該IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列包含根據EU編號系統編號的N297A突變；(ii)該IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列包含根據EU編號 系統編號的N297Q突變；或(iii)該IgG1重鏈恆定區係非經岩藻糖化；(c)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈恆定區；(d)IgG4重鏈恆定區；(e)IgG4重鏈恆定區，其中該IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列包含根據EU編號系統編號的S228P突變；或(f)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  7. 如請求項1之分離抗體，其中該抗體包含：(a)人類κ輕鏈恆定區；(b)人類λ輕鏈恆定區；或(c)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
  8. 如請求項1之分離抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和該輕鏈分別包含如SEQ ID NO：61和69所示之胺基酸序列。
  9. 如請求項1之分離抗體，其中該抗體(a)為人類抗體；(b)對人類TIM-3具有拮抗性；(c)去活化、降低或抑制人類TIM-3之活性；(d)抑制人類TIM-3結合磷脂醯絲胺酸；及/或(e)在與表現人類TIM-3之細胞結合後內化。
  10. 如請求項1之分離抗體，其接合至細胞 毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核素或可偵測標記。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  12. 一種如請求項1至10中任一項之抗體或如請求項11之醫藥組合物於製造藥物之用途，該藥物係用於(a)治療有其需要的受試者之癌症；(b)增強受試者響應抗原之T細胞活化；或(c)治療有其需要的受試者之感染性疾病。
  13. 一種分離之多核苷酸，其編碼(a)如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區；(b)如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈及輕鏈；(c)如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該多核苷酸包含於載體內；或(d)如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈及輕鏈，其中該多核苷酸包含於載體內。
  14. 一種重組宿主細胞，其包含(a)多核苷酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區或重鏈和輕鏈；(b)第一多核苷酸和第二多核苷酸，該第一多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區或重鏈且該第二多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的 輕鏈可變區或輕鏈；(c)載體，該載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區或重鏈和輕鏈；或(d)第一載體和第二載體，該第一載體包含第一多核苷酸且該第二載體包含第二多核苷酸，該第一多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區或重鏈且該第二多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的輕鏈可變區或輕鏈。
  15. 一種產生結合人類TIM-3之抗體之方法，該方法包含培養宿主細胞，該宿主細胞包含(a)多核苷酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區或重鏈和輕鏈；(b)第一多核苷酸和第二多核苷酸，該第一多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區或重鏈且該第二多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的輕鏈可變區或輕鏈；(c)載體，該載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區或重鏈和輕鏈；或(d)第一載體和第二載體，該第一載體包含第一多核苷酸且該第二載體包含第二多核苷酸，該第一多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的重鏈可變區或重鏈且該第二多核苷酸編碼如請求項1至10中任一項之抗體的輕 鏈可變區或輕鏈，使得該抗體產生。
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