CN101035561A - 作为改善对疫苗的免疫反应的佐剂的组合物和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有抗原和TIM靶向分子的组合物。本发明另外提供了TIM靶向分子缀合物，例如，靶向治疗或诊断部分的TIM靶向分子。本发明另外提供了使用这样的组合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过施用组合物刺激个体中的免疫反应的方法，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用抗原和TIM靶向分子刺激个体中的免疫反应的方法，所述抗原和TIM靶向分子可以在单一组合物中一起施用，或分开施用。

Description

作为改善对疫苗的免疫反应的佐剂的组合物和使用方法

                    发明背景

身体对微生物的防御由先天性免疫系统的早期反应和获得性免疫系统的后期反应介导。先天性免疫包含识别这样的结构的机理，该结构例如是微生物病原体的特征，但是不存在于哺乳动物细胞上。这样的结构的实例包括细菌脂多糖(LPS)、病毒双链RNA和未甲基化的CpG DNA核苷酸。先天性免疫反应的效应细胞包含嗜中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。除了先天免疫外，脊椎动物，包括哺乳动物，具有进化的免疫学防御机制，其受向传染物的暴露的刺激，并在每次连续暴露于特定抗原后，增加量级和效力。由于它能适应特异性感染或抗原性损伤，已经将该免疫防御机制描述为获得性免疫。存在两种类型的获得性免疫反应，即所谓的包含由B淋巴细胞生成的抗体的体液免疫，和由T淋巴细胞介导的细胞介导的免疫。

已经描述了2大类T淋巴细胞：CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和CD4+T辅助细胞(Th细胞)。CD8+T细胞是效应细胞，其通过T细胞受体(TCR)，识别由例如病毒或细菌感染的细胞上的I类MHC分子呈递的外来抗原。在识别外来抗原后，CD8+T细胞经历激活、成熟和增殖过程。该分化过程产生CTL克隆，其具有破坏展示外来抗原的靶细胞的能力。T辅助细胞另一方面参与体液的和细胞介导的形式的效应物免疫反应。关于体液的或抗体的免疫反应，抗体由B淋巴细胞通过与Th细胞的相互作用来生成。具体地，胞外抗原，例如循环微生物，被专门化的抗原呈递细胞(APCs)摄入、加工并与II类主要组织相容性复合体(MHC)分子一起呈递给CD4+Th细胞。这些Th细胞又激活B淋巴细胞，从而导致抗体生成。细胞介导的或细胞的免疫反应，相反地，起中和位于细胞内位置的微生物的作用，例如在成功感染靶细胞后。外来抗原，例如微生物抗原，在感染的细胞内合成，并与I类MHC分子一起呈递到这样的细胞的表面。这样的表位的呈递，会导致上述的CD8+CTLs的刺激，即一个也由CD4+Th细胞刺激的过程。Th细胞由至少2个不同的亚群组成，称作Th1和Th2细胞。Th1和Th2亚型代表着Th细胞的极化群体，其在暴露于抗原后从普通前体分化而来。

每种T辅助细胞亚型都能分泌细胞因子，其能促进不同的彼此相反的免疫效应，并交叉调节彼此的扩增和功能。Th1细胞能分泌大量的细胞因子例如干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-12和小量的IL-4。Th1-相关的细胞因子能促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，且最频繁地伴有针对细胞内的病原体的细胞介导的免疫反应。相反地，Th2细胞能分泌大量的细胞因子，例如IL-4、IL-13和IL-10，但是小量的IFN-γ，并促进抗体反应。Th2反应与体液反应具体相关，例如保护免受炭疽，和消除蠕虫感染。

产生的免疫反应是Th1-还是Th2-驱动的，很大程度上依赖于涉及的病原体和细胞环境中的因子，例如细胞因子。不能激活T辅助反应或正确的T辅助亚型，不但不能产生足够的与特定病原体斗争的反应，还会导致较差的对再次感染的免疫。许多传染物是细胞内的病原体，其中预期细胞介导的反应，如Th1免疫所例证的，在保护和/或治疗中起重要作用。而且，对于许多这样的感染，已经证实不适当的Th2反应的诱导，会消极地影响疾病结果。实例包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、曼氏血吸虫(S.mansoni)以及利什曼虫。未治愈形式的人和鼠利什曼病源自强的、但是起反作用的Th2-样-显性的免疫反应。瘤型麻风也似乎表征了一种流行的、但是不合适的Th2-样反应。HIV感染代表着另一个实例。在这里，已经提出，Th1-样细胞对其它Th细胞亚群的比率的降低，可以在向疾病症状的进展中起关键作用。

作为对抗传染物的保护措施，已经开发了针对微生物的接种疫苗规程。针对感染性病原体的接种疫苗规程的常见障碍是：较差的疫苗免疫原性，不合适的反应类型(抗体对细胞介导的免疫)，缺少引起长期免疫记忆的能力，和/或不能产生针对给定病原体的不同血清型的免疫。现有的接种疫苗策略靶向对给定的血清型和许多普通病原体(例如，病毒血清型或病原体)特异性的抗体的引发。必须在复发的基础上作出努力，以监控哪种血清型在世界上是流行的。这方面的一个实例是，每年监控新出现的预期是主要的传染品系的流感A血清型。

为了支持接种疫苗规程，已经开发了能支持针对特定的传染病的免疫反应的产生的佐剂。例如，已经将铝盐用作相对安全的且有效的疫苗佐剂，以增强对某些病原体的抗体反应。这样的佐剂的一个缺点是，它们在刺激细胞介导的免疫反应方面相对地无效，并产生很大程度上偏向Th2的免疫反应。

为了增加获得性免疫反应的有效性，例如，在接种疫苗规程中或在微生物感染的过程中，因此重要的是，开发新的、更有效的疫苗佐剂。本发明满足了该需要，并还提供了相关的优点。

                    发明概述

本发明提供了含有抗原和TIM靶向分子或试剂的组合物。本发明另外提供了使用这样的组合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过施用组合物刺激个体中的免疫反应的方法，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用抗原和TIM靶向分子刺激个体中的免疫反应的方法，所述抗原和TIM靶向分子可以在单一组合物中一起施用，或分开施用。

                     附图简述

图1显示了小鼠C57BL/6TIM-1等位基因的846bp cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。信号序列标有下划线，编码粘蛋白结构域的序列为斜体，跨膜结构域标有下划线且为斜体。

图2显示了小鼠BALB/cTIM-1等位基因的915bp cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。信号序列标有下划线，编码粘蛋白结构域的序列为斜体，跨膜结构域标有下划线且为斜体。

图3显示了使用单字母氨基酸密码的小鼠C57B1/6(B6)(SEQ IDNO：3)和BALB/c(BALB)(SEQ ID NO：4)TIM-1等位基因的蛋白序列对比。用三角形标记单个的氨基酸取代，用星形标记潜在的N-糖基化位点。

图4显示了TIM-1/Fc融合蛋白的实例，即一种称作小鼠TIM-1 Ig Fc.nl蛋白的365氨基酸蛋白(SEQ ID NO：5)。给出的实例是前体多肽，其具有人CD5前导序列(标有下划线)，随后是TIM-1的Ig结构域(无格式文本)和点突变的非-裂解性的小鼠IgG2a Fc的Fc区(铰链、CH2和CH3结构域)(斜体)。IgG2a Fc结构域中的点突变的氨基酸有阴影。

图5显示了再次刺激后对抗原的增殖。给BALB/c小鼠注射对照(白色)，或接种单独的Engerix-B^TM(10微克(mcg))(浅灰色阴影)或单剂抗-TIM抗体(50mcg)(深灰色阴影)。在指定的时间，分析脾对乙型肝炎表面抗原的增殖(96小时测定)。

图6显示了用抗原再次刺激后细胞因子的生产。给BALB/c小鼠注射对照(白色)，或接种10mcg乙型肝炎疫苗(浅灰色阴影)，或含有抗-TIM-1抗体的10mcg疫苗(深灰色阴影)。在第7、14和21天，用乙型肝炎抗原体外地刺激脾细胞。96小时后，分别分析上清液的IFN-γ和IL-4生产。

图7显示了乙型肝炎特异性的抗体的生产。在免疫后第7天，通过ELISA，测试来自注射了对照(PBS+明矾：白色)或用有(浅灰色阴影)或没有(深灰色阴影)抗-TIM抗体的乙型肝炎疫苗接种(单剂；50mcg)的小鼠的血清样品是否存在对乙型肝炎表面抗原特异性的抗体。

图8显示了乙型肝炎表面抗原-特异性的脾细胞的与抗原刺激剂量依赖性关系的增殖。分离来自用有或没有100mcg TIM-1单克隆抗体(mAb)的10mcg Engerix-B^TM接种一次的小鼠的脾细胞，并在有或没有递增的乙型肝炎表面抗原浓度的情况下培养。培养4天后，使用Delfia细胞增殖测定，分析孔的增殖。与接种单独的Engerix-B^TM疫苗或同种型对照抗体的小鼠相比，接受有TIM-1 mAb的疫苗的小鼠生成了统计学上显著更高的针对特定抗原的增殖反应(p＜0.05)。

图9显示了在用特定抗原(乙型肝炎表面抗原)刺激后IFN-γ的生产。取出来自上述增殖测定孔的上清液，用于通过ELISA进行细胞因子分析。与接受单独的疫苗或有同种型对照抗体的疫苗的小鼠相比，接受有TIM-1 mAb的疫苗的小鼠生产了显著更高量的IFN-γ(p＜0.05)，作为对抗原刺激的反应。没有检测到IL-4。

图10表明，与同种型对照抗体或CpG寡核苷酸相比，用HIVp24抗原+TIM-1 mAb免疫的小鼠产生了显著更高的对抗原的增殖反应(p＜0.05，与CpG相比)。在第1和15天，给小鼠皮下接种单剂在PBS中的HIVp24抗原(25mcg)，并腹膜内地接种50mcg TIM-1mAb、同种型对照抗体或50mcg CpG(1826)寡脱氧核苷酸。然后，在第21天，处死小鼠，并收获脾细胞，以用于抗原增殖。

图11显示了脾细胞对流感抗原的增殖反应。用30mcg流感疫苗Fluvirin^TM或Fluvirin^TM+抗-TIM-1抗体(单剂；50mcg抗体)免疫BALB/c小鼠。10天后，在96小时增殖测定中，测量对病毒(H1N1)刺激的反应。单独的PBS和抗-TIM-1抗体为处理对照。(n＝4)

图12显示了流感免疫的小鼠的细胞因子生产。用30mcg流感疫苗Fluvirin^TM或Fluvirin^TM+抗-TIM抗体(单剂；50mcg抗体)免疫BALB/c小鼠。10天后，制备脾细胞，且在培养96小时后，测定用病毒(H1N1)再次刺激后Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子的生产。(n＝4)(N.D.＝未测定)。作为对灭活流感的刺激的反应，施用疫苗+TIM-1抗体的小鼠产生了显著更高量的IFN-γ。没有检测到IL-4。

图13证实了TIM-佐剂处理后的交叉品系反应。培养96小时后，通过Delfia增殖测定，测定北京-免疫的小鼠对北京病毒(Beijingvirus)(A)或基辅病毒(Kiev virus)(B)的刺激的增殖反应。在有或没有100mcgTIM-1mAb或同种型对照(大鼠IgG2b)存在的情况下，用10mcg灭活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收获脾，用于进行体外分析。使用TIM-1mAb增强了增殖，且对基辅刺激的反应证实了交叉品系免疫(p＜0.01)。

图14显示了北京-免疫的小鼠对北京病毒(A)或基辅病毒(B)的刺激的交叉品系细胞因子反应。在有或没有100mcg TIM-1mAb或同种型对照(大鼠IgG2b)存在的情况下，用10mcg灭活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收获脾，用于进行体外分析。分析来自增殖测定的上清液是否存在IFN-γ。小图A表明，TIM-1mAb的加入显著(p＜0.01)增强了北京病毒(H1N1)刺激引起的IFN-γ的生产。小图B表明，TIM-1mAb的加入也显著(p＜0.01)增强了用异源亚型(heterosubtypic)基辅品系(H3N2)刺激引起的IFN-γ的生产。

图15显示了北京-免疫的小鼠对北京病毒(A)或基辅病毒(B)的刺激的IL-4细胞因子生产。在有或没有100mcg TIM-1mAb或同种型对照(大鼠IgG2b)存在的情况下，用10mcg灭活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收获脾，用于进行体外分析。分析来自增殖测定的上清液是否存在IL-4。小图A表明，TIM-1mAb的加入显著(p＜0.01)增强了北京病毒(H1N1)刺激引起的IL-4的生产。小图B表明，TIM-1mAb的加入也显著(p＜0.01)增强了用异源亚型基辅品系(H3N2)刺激引起的IL-4的生产。

图16显示了接种疫苗后的抗-rPA抗体反应。用0.2ml AVA(炭疽疫苗吸附的)BioThrax^TM或BioThrax^TM+抗-TIM-1抗体免疫C57BL/6小鼠。7天后在ELISA中测量对rPA特异性的总血清抗体。单独的BioThrax^TM和BioThrax^TM+同种型匹配的抗体是处理对照。

图17显示了炭疽接种疫苗的抗-TIM佐剂作用。用重组的保护性抗原(rPA；40mcg)或rPA+抗-TIM-3抗体(单剂；50mcg)免疫C57BL/6小鼠。10天后，在96小时增殖测定中，测量脾细胞对rPA再次刺激的反应。PBS和rPA+同种型匹配的对照抗体是处理对照。

图18显示了示例性的TIM表达载体。

图19表明，TIM-3信号传导加速小鼠中的糖尿病，如Sanchez-Fueyo等，Nat.Immunol.4：1093-1101(2003)所述(取自Sanchez-Fueyo等的图)。

图20表明，用接种疫苗送递抗-TIM-1抗体会引起完全的肿瘤排斥。

图21表明，在用活肿瘤细胞攻击后，补加了抗-TIM-1抗体的疫苗会极大地抑制肿瘤生长。

图22表明，在用活肿瘤细胞攻击后，补加了抗-TIM-1抗体的疫苗会极大地抑制肿瘤生长。

图23表明，在活肿瘤细胞攻击前，用抗-TIM-1抗体预处理动物会显著抑制肿瘤生长。

图24表明，在活肿瘤细胞攻击前，用抗-TIM-1抗体预处理动物会显著限制肿瘤生长。

图25表明，抗-TIM-1抗体是有效的癌症疫苗佐剂。在该研究中，使用γ-照射的EL4细胞作为抗原来源，和抗-TIM-1抗体或rIgG2b同种型对照，针对EL4胸腺瘤肿瘤接种C57BL/6小鼠。初次接种疫苗后，给这些动物加强2次，随后用皮下注射活EL4肿瘤细胞进行攻击。在攻击后的观察阶段，接受作为肿瘤疫苗佐剂的抗-TIM-1抗体的小鼠的平均肿瘤尺寸小于接受同种型对照抗体的小鼠的平均肿瘤尺寸。另外，活肿瘤攻击后19天，8只接受抗-TIM-1抗体的动物中的4只已经完全排斥了肿瘤，而在8只接受同种型对照抗体的小鼠中没有观察到肿瘤排斥。

图26表明，用抗-TIM-1佐剂接种疫苗驱动保护性免疫的产生。从首先使用抗-TIM-1作为肿瘤疫苗佐剂针对EL4胸腺瘤接种的小鼠回收脾细胞，且所述脾细胞已经完全排斥了随后的活肿瘤攻击。体外红细胞去除后，将10⁷脾细胞过继性转移进首次用于实验的C57BL/6小鼠受体。其它的小鼠接受从首次用于实验的小鼠或在肿瘤接种疫苗和加强过程中接受rIgG2a的小鼠收获的脾细胞的过继性转移。转移后1天，通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，攻击所有的受体小鼠。从接受作为肿瘤疫苗佐剂的抗-TIM-1抗体的小鼠转移的脾细胞，能在受体小鼠中赋予针对随后的肿瘤攻击的保护。当从首次用于实验的小鼠或用γ-照射的EL4+rIgG2a接种的小鼠转移脾细胞时，都不能实现该保护。这些结果证实，当使用抗-TIM-1抗体佐剂完成接种疫苗时，能确立持久的且可转移的抗肿瘤的免疫。

图27表明，抗-TIM-1治疗能有效地预防肿瘤生长。抗-TIM-1抗体是有效的独立的治疗剂，其能减缓以前确立的EL4胸腺瘤肿瘤的生长。在该研究中，通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，攻击首次用于实验的C57BL/6小鼠，然后，在6天后，通过腹膜内注射100mcg抗-TIM-1抗体或100mcg rIgG2a对照抗体进行处理。在开始处理后的肿瘤生长后，向抗-TIM-1处理的小鼠中送递抗体后15天，观察到肿瘤生长的统计学显著的抑制。结果证实了抗-TIM-1抗体在确立肿瘤后作为治疗剂限制肿瘤生长的能力。

图28表明，当用作疫苗佐剂时，TIM-3-特异性的抗体减少肿瘤生长。为了评价TIM-3-特异性的抗体的潜在的佐剂作用，使用γ-照射的EL4细胞作为抗原来源和抗-TIM-3抗体或rIgG2a同种型对照，针对EL4胸腺瘤肿瘤接种小鼠。初次接种疫苗后，给这些动物加强一次，随后通过皮下注射活EL4肿瘤细胞进行攻击。随着时间的过去，接受作为肿瘤疫苗佐剂的抗-TIM-3抗体的小鼠中的攻击肿瘤的平均尺寸小于接受同种型对照抗体的小鼠中的平均尺寸。

图29表明，抗-TIM-3抗体是有效的独立的治疗剂，其能减缓以前确立的EL4胸腺瘤肿瘤的生长。在该研究中，通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，攻击首次用于实验的C57BL/6小鼠，然后，在9天后，通过3次每周一次的腹膜内注射100mcg抗-TIM-3抗体或100mcg rIgG2a同种型对照抗体的第一次，进行处理。在开始处理后的肿瘤生长后，在初次给药的一周内，在抗-TIM-3处理的小鼠中鉴别出了受抑制的进展。该作用随着时间的过去而继续，在第17天发展为统计学上显著的肿瘤生长的抑制。结果证实了抗-TIM-3抗体的限制预确立的肿瘤的肿瘤生长的能力。

图30显示了示例性的疾病，与Th1/Th2反应的关系，和使用含有TIM靶向分子的本发明的组合物时希望的Th1和Th2的量的变化。

图31显示了来自BALB/c小鼠的小鼠TIM-2的cDNA序列(SEQ ID NO：6)。该cDNA序列包括信号序列、Ig、粘蛋白、跨膜和胞内结构域。

图32显示了各种小鼠和人TIM分子的核苷酸和氨基酸序列，如WO 03/002722所述。显示的序列是小鼠TIM-1 BALB/c等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：7和8)；小鼠TIM-1 C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO：9和10)；小鼠TIM-2BALB/c等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NOS：11和12)；小鼠TIM-2 C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：13和14)；小鼠TIM-3 BALB/c等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO：15和16)；小鼠TIM-3 C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：17和18)；TIM-4 BALB/c等位基因(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：19和20)；TIM-4小鼠C.D2 ES-HBA和DBA/2J(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO：21和22)；人TIM-1等位基因1(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：23和24)；人TIM-1，等位基因2(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：25和26)；人TIM-1等位基因3(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：27和28)；人TIM-1等位基因4(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：29和30)；人TIM-1等位基因5(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：31和32)；人TIM-1等位基因6(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：33和34)；人TIM-3等位基因1(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：35和36)；人TIM-3等位基因2(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：37和38)；人TIM-4等位基因1(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO：39和40)；人TIM-4等位基因2(分别是氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：41和42)。

图33表明，小鼠肾腺癌细胞系RAG在它的细胞表面上表达TIM-1。与未染色的对照或用对照抗体染色的细胞(空心的)相比，TIM-1抗体(实心的)特异性地结合RAG细胞。

图34表明，人肾腺癌细胞系769-P在它的细胞表面上表达TIM-1。与未染色的对照或用对照抗体染色的细胞(空心的)相比，TIM-1抗体(实心的)特异性地结合769-P细胞。

图35表明，小鼠肿瘤细胞系EL4(一种胸腺瘤)和11PO-1(一种转化的肥大细胞)在它们的细胞表面上表达TIM-3。与未染色的对照或用对照抗体染色的细胞(空心的)相比，TIM-3抗体(实心的)特异性地结合各肿瘤细胞。

图36显示了用于测试TIM-3和TIM-3配体(TIM-3L)的表达的小鼠肿瘤细胞系的总结。鉴定了表达TIM-3和TIM-3配体的肿瘤细胞系。使用TIM-3单克隆抗体，监控了TIM-3表达。通过测量TIM-3/Fc融合蛋白与各细胞的特异性结合，证实了TIM-3配体表达。

                  发明详述

本发明提供了含有抗原和TIM靶向分子的组合物，和使用这样的组合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过施用组合物刺激个体中的免疫反应的方法，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用抗原和TIM靶向分子刺激个体中的免疫反应的方法，所述抗原和TIM靶向分子可以在单一组合物中一起施用，或分开施用。本发明的组合物和方法可以用于靶向TIM信号传导，从而调节Th1和Th2辅助细胞的水平。本发明的组合物和方法可以有利地用于调节Th1和Th2的水平，以增加合适的和更有效的免疫反应。

针对感染性病原体的接种疫苗规程的常见障碍是：较差的疫苗免疫原性，不合适的反应类型(抗体对细胞介导的免疫)，缺少长期记忆，和/或不能产生针对给定病原体的不同血清型的免疫。佐剂例如铝盐已经用于疫苗制剂超过70年，并较好地确定了它们对某些适应症的安全性和功效(Baylor等，Vaccine 20 Suppl 3，S18-23(2002))。使用铝盐作为细胞内病原体的疫苗佐剂的一个潜在的缺点是IgG1和IgE抗体反应的诱导。而且，铝盐不能刺激Th1免疫，也不能促进CD8⁺T细胞的诱导(Newman等J.Immunol.148：2357-2362(1992)；Sheikh等Vaccine 17：2974-2982(1999))。迄今为止，没有佐剂或生物制剂能随意改变Th1/Th2平衡。在美国，尚未许可含有铝盐之外的其它佐剂的疫苗。

近年来，已经表征了一个新的分子家族，现在称作TIM(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白)，其在调节激活的Th1或Th2T辅助细胞的反应中起重要作用(Monney等，Nature 415：536-541(2002)；McIntire等，Nat.Immunol.2：1109-1116(2001))。具体地，已经将TIM-3鉴定为在终末分化的Th1细胞上表达的细胞表面分子。相反地，TIM-1在分化的Th2细胞上表达(Kuchroo等，Nat.Rev.Immunol.3：454-462(2003))。本发明提供了抗-TIM抗体和TIM融合蛋白作为增强免疫反应的疫苗佐剂和刺激剂的用途，例如，其由与免疫球蛋白Fc结构域相融合的胞外TIM结构域(TIM/Fc)组成。本发明的分子可以用作治疗传染病和治疗恶性肿瘤(例如肿瘤)的疫苗佐剂。

针对传染物的保护需要诱导针对病原生物的特异性的获得性免疫反应。获得性免疫反应的效应阶段受到CD4⁺T辅助细胞向Th1或Th2亚型的成熟的关键影响。每种亚型都分泌细胞因子，后者促进不同的彼此相反的免疫作用，并交叉调节彼此的扩增和功能。Th1细胞分泌大量的细胞因子例如干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-12和小量的IL-4(Mosmann等，J.Immunol.136：2348-2357(1986))。Th1-相关的细胞因子促进CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，且在小鼠中，促进有效地裂解感染了细胞内病原体的细胞的IgG2a抗体(Allan等，J.Immunol.144：3980-3986(1990)。相反地，Th2细胞分泌大量的细胞因子例如IL-4、IL-13和IL-10，但是较少的IFN-γ，并促进抗体反应，在小鼠中，通常是IgG1非-裂解性的同种型。Th2反应与体液反应具体相关，例如在免受炭疽的保护中(Leppla等，J.Clin.Invest.110：141-144(2002))，且与蠕虫感染的消除具体相关(Yoshida等，Parasitol.Int.48：73-79(1999))。

产生的免疫反应是Th1-还是Th2-驱动的很大程度上依赖于涉及的病原体和细胞环境中的因子，例如细胞因子。不能激活T辅助反应或正确的T辅助亚型，不但不能产生足够的与特定病原体斗争的反应，还会导致较差的对再次感染的免疫。许多传染物是细胞内的病原体，其中预期细胞介导的反应，如Th1免疫所例证的，在保护和/或治疗中起重要作用。而且，不适当的Th2反应的诱导，会消极地影响针对细胞内病原体的疾病结果，所述病原体例如结核分枝杆菌(Lindblad等，Infect.Immun.65：623-629(1997))，或利什曼虫，或曼氏血吸虫(Scott等，Immunol.Rev.112：161-182(1989))。未治愈形式的人和鼠利什曼病源自强的、但是起反作用的Th2-样-显性的免疫反应。瘤型麻风也似乎表征了一种流行的、但是不合适的Th2-样反应。HIV感染代表着另一个实例。在这里，已经提出，Th1-样细胞时其它Th细胞亚群的比率的降低，可以在向疾病症状的进展中起关键作用。

许多病毒感染的清除，依赖于CD8⁺T细胞的功能，后者又被Th1-引发的细胞因子环境所增强。而且，需要针对一种病毒血清型的Th1反应，以便能诱导针对不同血清型的病毒的保护性免疫，这是一种称作异源亚型免疫的现象。现有的接种疫苗策略靶向对给定的病毒血清型特异性的抗体的引发。但是，该策略的一个缺点是，抗体是非常特异性的，且对通过改变表面蛋白氨基酸序列产生的不同血清型的病毒没有保护，所述表面蛋白氨基酸序列在流感的实例中是血凝素和神经氨酸酶的序列。这些突变可以是次要的(抗原性漂移)或主要的(抗原性转变)。对于许多普通的病毒病原体，必须在复发的基础上作出努力，以监控哪种血清型在世界上是流行的。这方面的一个实例是，每年监控新出现的预期是主要的传染品系的流感血清型。在流感的小鼠模型中，也已经观察到诱导异源亚型免疫的失败。在该模型中，灭活的病毒疫苗的应用不能促进Th1谱(profile)。这使得小鼠不能进行有效的病毒清除，且对血清学不同的病毒的再次感染易感(Moran等，J.Infect.Dis.180：579-585(1999))。相反地，在接种疫苗的过程中，用IL-12和抗-IL-4抗体与灭活的病毒联合处理小鼠，产生了特征在于Th1细胞因子的生产的免疫反应。这些小鼠能针对随后的血清学不同的病毒的攻击，启动异源亚型细胞免疫反应。综合考虑关于Th1/Th2引发环境已知的方面，数据表明，T辅助刺激和/或向Th1细胞因子反应的背离，可以产生针对由抗原性漂移或抗原性转变导致的各种血清型的广谱免疫。因而，TIM-介导的Th1反应的诱导，可以是改善现有的疫苗和TIM靶向试剂(例如TIM蛋白或TIM抗体)的可行策略，可以用于刺激交叉品系或异源亚型免疫。

已经将铝盐用作相对安全的且有效的疫苗佐剂，以增强对某些病原体的抗体反应。这样的佐剂的一个缺点是，它们在刺激细胞介导的免疫反应方面相对地无效(Grun和Maurer，Cell Immunol.121：134-145(1989))。具有低毒性和/或精确控制和刺激细胞免疫的能力的其它佐剂的开发仍然是个挑战。为了增加获得性免疫反应的有效性，例如在接种疫苗规程中或在微生物感染过程中，本发明提供了靶向TIM-1、-2、-3或-4信号传导途径的试剂作为有效地保护宿主的佐剂的用途。

刺激免疫系统的反应的接种疫苗规程可以用于预防和治疗传染病，例如由病毒、寄生物、细菌、古细菌、支原体和朊病毒造成的感染。接种疫苗规程也可以用于预防和治疗增生和恶性肿瘤，例如肿瘤，和其中免疫系统的刺激是有益的预防或治疗措施的任何其它疾病。这样的其它疾病的实例包括自身免疫病，例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病和其它自身免疫病。自身免疫病的一个性质是，针对自身表位的自身反应性抗体的产生。这样的自身反应性抗体在自身免疫病的发展、进展和长期性质中起非常重要的作用。可以使用疫苗，所述疫苗例如导致中和这样的自身反应性抗体的抗独特型的抗体的产生。

如本文所公开的，靶向TIM-1信号传导途径的试剂可以用作有效的疫苗佐剂(见实施例)。这样的试剂包括抗TIM-1的抗体，抗TIM-1配体的抗体，重组TIM-1蛋白，包括TIM-1融合蛋白，和TIM-1配体蛋白，包括TIM-1配体融合蛋白。因而，本发明提供了能起有效的疫苗佐剂作用的TIM-1靶向分子。本发明另外提供了类似类型的分子，其能靶向其它的TIM，包括但不限于TIM-3，以及TIM-2和TIM-4。

本发明提供了能靶向TIM信号传导途径和用作有效的疫苗佐剂的试剂。如本文所使用的，当用于提及TIM信号传导途径时，术语“试剂”指能调节由TIM介导的信号传导途径的分子。TIM靶向试剂在本文中也称作TIM靶向分子或试剂。这样的试剂包括，如关于TIM-1所示例的，抗TIM-1的抗体，抗TIM-1配体的抗体，重组TIM-1蛋白，包括TIM-1融合蛋白，和TIM-1配体蛋白，包括TIM-1配体融合蛋白。类似类型的试剂可以用于调节其它的各TIM信号传导途径，包括TIM-2、-3或-4。融合蛋白包括，例如，TIM-1或TIM-1配体与蛋白或蛋白片段的融合体，例如与免疫球蛋白的Fc区、与清蛋白、与运铁蛋白、与Myc标记、与多组氨酸标记或其它需要的蛋白或蛋白片段的融合体。本发明的试剂也包括化学修饰的试剂，例如PEG化(pegylated)的TIM或TIM配体或其它需要的化学修饰。应当理解，当提及特定的TIM时，包括该TIM的多态的和剪接变体。本发明的试剂也可以是小分子，肽，多肽，多核苷酸，包括反义和siRNA，碳水化合物，包括多糖，脂类，药物，及其模仿物、衍生物和组合，其能刺激或抑制特定TIM(例如，TIM-1、-2、-3或-4)与它的配体的相互作用，或刺激或抑制TIM或TIM配体信号传导。应当理解，本文中关于靶向TIM-1信号传导途径的试剂的用途的任何描述，都是示例性的，且可以类似地应用于靶向其它TIM信号传导途径(包括TIM-2、TIM-3和TIM-4)的试剂。本发明的试剂可以用作刺激身体的免疫反应的佐剂，例如在接种疫苗中。这些试剂作为佐剂的用途不限于任何特定类型的免疫刺激治疗或接种疫苗，且可以包括，但不限于，任何上述的接种疫苗规程的实例。

本发明提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子或试剂。如本文所使用的，“TIM靶向分子”指能结合TIM或TIM配体的分子。示例性的TIM靶向分子包括，但不限于，抗TIM的抗体，抗TIM-1配体的抗体，重组TIM蛋白，TIM融合多肽，TIM配体，包括TIM配体融合多肽。如本文所公开的，抗原和TIM靶向分子或试剂可以在单一组合物中或作为分开的组合物施用。

各种TIM是本领域的技术人员众所周知的，包括TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。在例如WO 03/002722；WO 97/44460；1997年4月22日授权的美国专利号5,622,861；和美国公开号2003/0124114中，教导了各种TIM，其中的每一篇在这里引作参考。示例性的TIM序列显示在图31和32中。依赖于所需用途，在本发明的组合物和方法中，可以使用来自不同物种的多种TIM。来自特定物种的TIM，可以用于特定用途，例如，如果需要，人TIM可以用于人类。如果需要，也可以使用来自其它物种的TIM。

在一个实施方案中，TIM靶向分子可以是，例如具有TIM(例如，TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4)的融合蛋白，且可以包含TIM的胞外区的至少一个结构域或其部分和免疫球蛋白的恒定重链或其部分。在一个具体的实施方案中，可溶性TIM融合蛋白指包含TIM的胞外结构域的至少一个结构域和另一种多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，可溶性TIM可以是融合蛋白，其包含共价连接(例如，通过肽键)到免疫球蛋白例如IgG的Fc片段上的TIM的胞外区；这样的融合蛋白一般是同型二聚体。在另一个实施方案中，可溶性TIM融合体可以是融合蛋白，其仅仅包含共价连接(例如，通过肽键)到免疫球蛋白例如IgG的Fc片段上的TIM的胞外区的Ig结构域；这样的融合蛋白一般是同型二聚体。如本领域众所周知的，Fc片段是2个部分恒定重链的同型二聚体。每个恒定重链包含至少CHI结构域、铰链和CH2和CH3结构域。这样的Fc融合蛋白的每个单体包括连接到免疫球蛋白的恒定重链或其部分(例如，铰链、CH2、CH3结构域)上的TIM的胞外区。在某些实施方案中，恒定重链可以包括在免疫球蛋白铰链区的N-末端的CHI结构域的部分或全部。在其它实施方案中，恒定重链可以包括铰链结构域，但不包括CH1结构域。在另一个实施方案中，恒定重链排除铰链和CH1结构域，例如，它仅仅包含IgG的CH2和CH3结构域。

在一个实施方案中，TIM靶向分子可以是TIM抗体，例如，对TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4特异性的抗体。也可以使用对其它TIM的抗体。在另一个实施方案中，TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽，例如，与Fc融合的TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4。本领域的技术人员可以容易地制备与Fc或其它需要的多肽的各种TIM融合多肽，包括含有需要的结构域的TIM多肽片段。在另一个实施方案中，本发明的TIM靶向分子或试剂可以是小分子，肽，多肽，多核苷酸，包括反义和siRNA，碳水化合物，包括多糖，脂类，药物，及其模仿物、衍生物和组合，其能刺激或抑制特定TIM与它的配体的相互作用，或刺激或抑制TIM或TIM配体信号传导。

当试剂或TIM靶向分子以能影响TIM或TIM配体的活性的方式，直接或间接结合TIM或TIM配体或TIM或TIM配体信号传导途径的组分，或与其相互作用时，发生靶向作用。利用常规实验室方法，本领域的普通技术人员可以评价活性(见，例如，Reith，ProteinKinase Protocols Humana Press，Totowa NJ(2001)；Hardie，ProteinPhosphorylation：A Practical Approach second ed.，Oxford UniversityPress，Oxford，United Kingdom(1999)；Kendall和Hill，SignalTransduction Protocols：Methods in Molecular Biology Vol.41，Humana Press，Totowa NJ(1995))。例如，人们可以评价信号转导的强度，或受体结合后发生或通常会发生的另一个下游生物学事件。靶向TIM或TIM配体的试剂产生的活性可以，但不必定，与当天然产生的TIM或TIM配体结合天然产生的TIM或TIM配体时产生的活性不同。例如，如果试剂产生与天然产生的TIM-1配体结合受体时产生的活性基本上相同的活性，则靶向TIM-1的试剂或TIM靶向分子在本发明的范围内。另外，试剂或TIM靶向分子可以是拮抗剂，其通过天然产生的TIM配体抑制信号传导。

如上所述，本发明的试剂可以含有2个功能部分：将试剂靶向携带TIM或TIM配体的细胞(例如TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4)的靶向部分，和例如二聚化和/或靶细胞去除部分，其例如裂解或导致携带TIM或TIM配体的细胞的去除，如本文所讨论的。因而，试剂可以是嵌合多肽，其包括TIM多肽和异源多肽，例如IgG和IgM亚类抗体的Fc区。Fc区可以包括突变，其能抑制补体结合和Fc受体结合，或它可以是裂解性的或靶细胞去除性的，也就是说，能通过结合补体或通过另一种机理，例如抗体依赖性的补体裂解，破坏细胞。因此，Fc可以是裂解性的，且可以激活补体和Fc受体-介导的活性，从而导致靶细胞裂解，造成表达TIM或TIM配体的所需细胞的去除。

可以从天然产生的来源分离、重组生产或使用众所周知的肽合成方法化学合成Fc区。例如，通过用木瓜蛋白酶消化IgG，可以生产与IgG C末端结构域同源的Fc区。IgG Fc具有约50kDa的分子量。本发明的多肽可以包括整个Fc区，或保留裂解细胞的能力的更小的部分。另外，全长或片段化的Fc区可以是野生型分子的变体。也就是说，它们可以含有会或不会影响多肽的功能的突变。Fc区可以源自IgG，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或类似的哺乳动物IgG，或IgM，例如人IgM或类似的哺乳动物IgM。在一个具体的实施方案中，Fc区包括人IgG1或鼠IgG2a的铰链、CH2和CH3结构域。

可以作为本发明的TIM靶向分子或试剂的部分的Fc区可以是“靶细胞去除性的”，在本文中也称作裂解性的，或“非靶细胞去除性的”，在本文中也称作非裂解性的。非靶细胞去除性的Fc区一般缺少高亲和力Fc受体结合位点和C′1q结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点包括在IgG Fc的位置235处的Leu残基。因而，通过突变或缺失Leu 235，可以破坏鼠Fc受体结合位点。例如，用Glu取代Leu 235，会抑制Fc区结合高亲和力Fc受体的能力。通过突变或缺失IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基，可以在功能上破坏鼠C′1q结合位点。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322，会使IgG1 Fc不能指导抗体-依赖性的补体裂解。相反地，靶细胞去除性的IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和C′1q结合位点，且可以减少靶细胞的量，例如，通过Fc裂解活性或其它机理，如本文所公开的。高亲和力Fc受体结合位点包括在IgG Fc的位置235处的Leu残基，且C′1q结合位点包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。靶细胞去除性的IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。靶细胞去除性的IgG Fc可以将细胞靶向依赖抗体的细胞毒性或补体指导的细胞裂解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(见，例如，Morrison等，The Immunologist 2：119-124(1994)；和Brekke等，The Immunologist 2：125，1994)。本领域的技术人员可以容易地确定其它物种的Fc区的类似残基，以产生靶细胞去除性的或非靶细胞去除性的与TIM靶向分子或试剂的融合体。

在本发明的组合物中可以使用多种抗原。示例性的抗原包括，但不限于，病毒、细菌、寄生物和肿瘤相关抗原。抗原可以是多种形式，包括但不限于，完整的灭活的生物，从其衍生的蛋白抗原或肽抗原，或适用于引起针对生物或细胞类型的免疫反应的其它抗原分子。抗原也可以是能编码抗原的核酸的形式，例如在核酸疫苗中使用的。如本文所公开的，与缺少TIM靶向分子或试剂的组合物相比，本发明的组合物在有TIM靶向分子或试剂存在下，可以用于增强免疫反应(见实施例)。对于乙型肝炎病毒、炭疽、流感病毒和HIV，观察到了增强的免疫反应(见实施例VI-X)。在癌症模型中，也观察到了增强的免疫反应(见实施例XII)。

可以在本发明的组合物中使用的示例性的抗原包括，但不限于，乙型肝炎病毒，流感病毒，炭疽，利斯特氏菌(Listeria)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，结核，尤其是广谱抗药品系，兔热病，大天花(天花)，病毒性出血热，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(鼠疫)，HIV，和与传染物有关的其它抗原。其它示例性的抗原包括与肿瘤细胞有关的抗原，针对与自身免疫病有关的抗原的抗原或抗体，或与变态反应和哮喘有关的抗原。这样的抗原可以包含在本发明的组合物中，后者含有用作针对各疾病的疫苗的TIM靶向分子或试剂。

在一个实施方案中，通过包含来自传染物的抗原，本发明的方法和组合物可以用于治疗感染或处于感染的危险中的个体。感染指可归因于在宿主中存在可在宿主中繁殖的外来生物或因子的疾病或状况。感染一般包含传染性生物或因子对粘膜或其它组织屏障的破坏。感染的受试者是具有存在于受试者的身体中的可客观测量的传染性生物或因子的受试者。处于感染的危险中的受试者是易于发展感染的受试者。这样的受试者可以包括，例如，已知或怀疑暴露于传染性生物或因子的受试者。处于感染的危险中的受试者也可以包括具有与受损的启动对传染性生物或因子的免疫反应的能力有关的状况的受试者，例如，具有先天性或获得性免疫缺陷的受试者，经历放射治疗或化疗的受试者，具有烧伤的受试者，具有外伤性损伤的受试者，经历外科手术或其它侵入性医学或牙齿手术的受试者，或类似的无免疫应答的个体。

基于包含的传染性生物或因子的种类，将感染概括地分为细菌、病毒、真菌或寄生物性的。本领域也知道其它不太常见类型的感染，包括，例如，包含立克次氏体、支原体和会造成瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)和朊病毒病(例如，库鲁病和Creutzfeldt-Jacob病)的因子的感染。会造成感染的细菌、病毒、真菌和寄生物的实例是本领域众所周知的。感染可以是急性的、亚急性的、慢性的或潜伏的，且它可以是局部化的或全身的。而且，在传染性生物或因子在宿主中的生命周期的至少一个阶段的过程中，感染可以主要是细胞内的或细胞外的。

细菌包括革兰氏阴性的和革兰氏阳性的细菌。革兰氏阳性细菌的实例包括，但不限于巴斯德氏菌属(Pasteurella)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)物种和链球菌属(Streptococcus)物种。革兰氏阴性细菌的实例包括，但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种和沙门氏菌属(Salmonella)物种。传染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、侵肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属物种(Mycobacteria spp.)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)、链球菌(绿色链球菌组(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧物种(anaerobic spp.))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病的弯曲杆菌属物种(Campylobacterspp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属物种(Corynebacteriumspp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属物种(Bacteroides spp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体属(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)。

已经发现会在人类中造成感染的病毒的实例包括但不限于：反录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称作HTLV-III)、HIV-2、LA V或IDLV-III/LA V或HIV-III，和其它分离物，例如HIV-LP；小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、欧可病毒)；Calciviridae(例如，会造成胃肠炎的品系)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，欧鲍拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；Bungaviridae(例如，汉坦病毒、bunga病毒、白蛉热病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠病毒、环状病毒和轮状病毒)；Bimaviridae；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；小DNA病毒科(Parvovirdae)(小DNA病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原学因子，丁型肝炎的因子(认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星病毒)，非甲型、非乙型肝炎的因子(1类＝肠传播的；2类＝肠胃外传播的(也就是说，丙型肝炎)；诺沃克和有关的病毒和星状病毒)。

真菌的实例包括：曲霉属物种(Aspergillus spp.)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、其它假丝酵母属物种(Candida spp.)、粗球孢菌(Coccidioides immitis)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、诺卡氏菌属物种(Nocardia spp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)。

寄生物包括但不限于血液传播的和/或组织寄生物例如果氏巴贝虫(Babesia microti)、分离巴贝虫(Babesia divergens)、痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、表吮贾第虫(Giardia lamblia)、热带利什曼虫(Leishmania tropica)、利什曼原虫属物种(Leishmania spp.)、巴西利什曼虫(Leishmania braziliensis)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、恶性疟虫(Plasmodium falciparum)、三日疟虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟虫(Plasmodium ovale)、间日疟虫(Plasmodium vivax)和鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗得西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)、克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(Chagas氏病)和鼠弓形虫、扁形动物、线虫。

本发明另外提供了使用本发明的组合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过施用组合物刺激个体中的免疫反应的方法，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子或试剂。这样的TIM靶向分子可以是TIM抗体，例如抗TIM-1、-2、-3或-4的抗体。

如本文所公开的，本发明的组合物可以用在刺激或增强对抗原的免疫反应的方法中。本发明提供了通过施用本发明的含有TIM靶向分子或试剂和抗原的组合物刺激免疫反应的方法。与缺少TIM靶向分子或试剂的组合物相比，TIM靶向分子或试剂的包含可以起增强免疫反应的佐剂的作用(见实施例)。

本发明的组合物和方法可以用于刺激免疫反应，以预防和/或治疗多种疾病。这样的疾病包括传染病，包括，但不限于，由下述病原体造成的疾病：病毒、细菌或寄生生物，例如乙型肝炎病毒，流感病毒，炭疽，利斯特氏菌，肉毒梭菌，结核，尤其是广谱抗药品系，兔热病，大天花(天花)，病毒性出血热，鼠疫耶尔森氏菌(鼠疫)，HIV，和其它传染物，如本文所公开的。

另外，本发明的组合物和方法可以用于治疗患有癌症或处于患癌症危险中的受试者。癌症是妨碍身体器官和系统的正常功能发挥的细胞的失控生长的状况。患有癌症的受试者是具有存在于受试者身体中的可客观地测量的癌细胞的受试者。处于患癌症危险中的受试者是易于发展为癌症的受试者。这样的受试者可包括，例如，具有发展为癌症的家族史或遗传倾向的受试者。处于患癌症危险中的受试者也可以包括已知或怀疑暴露于致癌剂的受试者。

从它们的原始位置和种子活力器官迁移的癌症最终可以通过受影响的器官的功能恶化，导致受试者的死亡。造血癌症，例如白血病，能胜过受试者中的正常的造血区室，从而导致造血障碍(以贫血、血小板减少症和嗜中性白细胞减少症的形式)，最终造成死亡。

转移是癌细胞的一个区域，它与原发肿瘤位置不同，源自癌细胞从原发肿瘤向身体的其它部分的传播。在诊断原发肿瘤块时，可以监控受试者是否存在转移。最经常通过单一地或组合地使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机化断层显象(CT)扫描、血液和血小板计数、肝功能研究、胸部X-射线和骨扫描以及监控特定症状，来检测转移。

通过在组合物中包含肿瘤相关抗原，本发明的组合物和方法也可以用于治疗多种癌症或处于发展为癌症的危险中的受试者。如本文所使用的，“肿瘤相关抗原”是在肿瘤细胞中表达的肿瘤抗原。本领域众所周知，许多肿瘤相关抗原与特定的肿瘤细胞相关，其可以包含在本发明的组合物中，以治疗多种癌症，包括但不限于，乳腺癌，前列腺癌，结肠癌，和血液癌，包括白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)等。本发明的方法可以用于刺激免疫反应，以通过抑制或减缓肿瘤的生长或减小肿瘤的大小来治疗肿瘤(见实施例XII)。肿瘤相关抗原也可以是肿瘤特异性的抗原，因为该抗原主要(尽管不必定是排它地)在癌细胞上表达。在这样的情况下，应当理解，可以有利地靶向肿瘤特异性的抗原，从而允许选择性地靶向肿瘤细胞。

其它癌症包括，但不限于，基层细胞癌，胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统(CNS)癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头和颈癌；胃癌；上皮内的肿瘤；肾癌；喉癌；肝癌；肺癌(例如，小细胞和非-小细胞)；淋巴瘤，包括何杰金氏和非-何杰金氏淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、嘴和咽)；卵巢癌；胰腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌，以及其它癌和肉瘤。

目前使用的或处于开发中的癌症免疫疗法的实例包括但不限于Rituxan^TM、IDEC-C2B8、抗-CD20Mab、Panorex^TM、3622W94、抗-EGP40(17-1A)、腺癌上的pancarcinoma抗原、Herceptin^TM、抗-Her2、抗-EGFr、BEC2、抗独特型-GD3表位、Ovarex^TM、B43.13、抗独特型CA125、4B5、抗-VEGF、RhuMAb、MDX-210、抗-HER-2、MDX-22、MDX-220、MDX-447、MDX-260、抗-GD-2、Quadramet^TM、CYT-424、IDEC-Y2B8、Oncolym^TM、Lym-1、SMART M195、ATRAGEN^TM、LDP-03、抗-CAMPATH、ior t6、抗-CD6、MDX-11、OV1I03、Zenapax^TM、抗-Tac、抗-IL-2受体、MELIMMUNE-1和-2、CEACIDE^TM、Pretarget^TM、NovoMAb-G2、TNT、抗-组蛋白、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、ior egf/r3、iorc5、抗-FLK-2、SMART 1D1O、SMART ABL 364和ImmuRAIT-CEA。

癌症疫苗是用于刺激针对癌细胞的内源免疫反应的药物。目前生产的疫苗主要激活体液免疫系统，即抗体依赖性的免疫系统。目前处于开发中的其它疫苗集中在激活细胞介导的免疫系统，包括细胞毒性T淋巴细胞，其能杀死肿瘤细胞。癌症疫苗通常能增强癌症抗原向抗原呈递细胞(APC)(例如巨噬细胞和树突细胞)和/或其它免疫细胞(例如T细胞、B细胞和NK细胞)的呈递。尽管癌症疫苗可以采取几种形式中的一种，如本文所讨论的，但它们的目的是，将癌症抗原和/或癌症相关抗原送递给APC，以促进APC对这样的抗原的内源加工及最终在MHC I类分子环境中抗原在细胞表面上的呈递。癌症疫苗的一种形式是全细胞疫苗，它是癌细胞的制剂，所述癌细胞已经被从受试者中取出，离体(ex vivo)处理，通常是杀死癌细胞或阻止它们增殖，然后作为全细胞重新导入受试者中。肿瘤细胞的裂解物也可以用作癌症疫苗，以引起免疫反应。癌症疫苗的另一种形式是肽疫苗，它使用癌症-特异性的或癌症-相关的小蛋白，以激活T细胞。癌症-相关蛋白是非排它地由癌细胞表达的蛋白，也就是说，其它正常的细胞也可以表达这些抗原。但是，癌症-相关抗原的表达通常恒定地受特定类型的癌症的上调。癌症疫苗的另一种形式是树突细胞疫苗，它包括已经体外地暴露于癌症抗原或癌症-相关抗原的全树突细胞。树突细胞的裂解物或膜级分也可以用作癌症疫苗。树突细胞疫苗能直接激活APC。其它癌症疫苗包括神经节苷脂疫苗、热激蛋白疫苗、病毒和细菌疫苗和核酸疫苗。

另外，本发明的组合物和方法可以用于治疗自身免疫病，例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病或其它自身免疫性障碍。自身免疫病是一类疾病，其中受试者自己的抗体与宿主组织反应，或其中免疫效应T细胞能与内源的自身肽发生自身反应，并造成组织的破坏。因而，免疫反应是针对受试者自身的抗原(称作自身抗原)引发的。自身免疫病包括上述的实例，以及克罗恩病和其它炎性肠病，例如溃疡性结肠炎、全身性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本甲状腺炎、Goodpasture氏综合征、天疱疮(例如，寻常天疱疮)、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗-胶原抗体的硬皮病、混合型结缔组织病、多肌炎、恶性贫血、特发性阿狄森病、自身免疫-相关的不育症、肾小球肾炎(例如，新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、Sjogren氏综合征、银屑病关节炎、胰岛素耐受性、自身免疫性糖尿病(I型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)和Guillain-Barré综合征。近年来，已经认识到自身免疫病也包括动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病。自身抗原指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因而，在自身免疫病的情况下，针对自身抗原引发的免疫反应是不希望的免疫反应，且会导致正常组织的破坏和损害，而针对癌症抗原引发的免疫反应是希望的免疫反应，且会导致肿瘤或癌症的破坏。

如图19所示，TIM-3信号传导会加速小鼠的糖尿病(见Sanchez-Fueyo等，Nat.Immunol.4：1093-1101(2003))。NOD-SCID小鼠接受来自糖尿病小鼠的T细胞，并用对照Ig或抗-TIM-3处理(100μg，在实验持续阶段每周2次)。抗-TIM-3的施用加速了糖尿病发展，即一种Th1-介导的疾病，从而证明TIM-3在调节Th1功能中起作用。因此，使用TIM-3靶向分子干扰一种或多种TIM-3信号传导途径，可以用于治疗糖尿病。

本发明的组合物和方法也可以用于治疗哮喘和变态反应。哮喘是一种呼吸系统障碍，其特征在于气道的炎症和狭窄和提高的气道对吸入物的反应性。哮喘经常(尽管非排它地)伴有特应性的或变应性的症状。变态反应是获得的对物质(变应原)的超敏反应。变应性的状况包括湿疹、变应性鼻炎或鼻炎、枯草热、支气管哮喘、荨麻疹(荨麻疹)和食物变态反应和其它特应性的状况。“患有变态反应的受试者”是患有或处于发展为对变应原的反应的变态反应的危险中的受试者。“变应原”指可以在易感受试者中诱导变应性的或哮喘性的反应的物质。存在许多变应原，包括花粉、昆虫毒液、动物头皮屑、粉尘、真菌孢子和药物(例如，青霉素)。

天然的动物和植物变应原的实例包括对下述属特异性的蛋白：犬的(狗(Canisfamiliaris))；嗜皮螨属(Dermatophagoides)(例如，粉尘螨(Dermatophagoides farinae))；猫属(Felis)(猫(Felis domesticus))；豚草属(Ambrosia)(豚草(Ambrosia artemiisfolia)；Lotium(例如，Lotiumperenne或Lotium multiflorum)；柳杉属(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))；链格孢属(Alternaria)(互格链格孢(Alternariaalternata))；Alder；桤木属(Alnus)(欧洲桤木(Alnus gultinosa))；桦木属(Betula)(Betula verrucosa)；栎属(Quercus)(Quercus alba)；木犀榄属(Olea)(油橄榄(Olea europa))；蒿属(Artemisia)(艾蒿(Artemisiavulgaris))；车前草属(Plantago)(例如，长叶车前(Plantagolanceolata))；墙草属(Parietaria)(例如，Parietaria officinalis或Parietaria judaica)；姬蠊属(例如，德国姬蠊(Blattella gennanica))；蜜蜂属(Apis)(例如，Apis multiflornm)；柏木属(Cupressus)(例如，地中海柏木(Cupressus sempervirens)、绿干柏(Cupressus arizonica)和大果柏木(Cupressus macrocarpa))；刺柏属(Juniperus)(例如，Juniperussabinoides、Juniperus virginiana、欧洲刺柏(Juniperus communis)和阿希刺柏(Juniperus ashei))；Thuya(例如，Thuya orientalis)；扁柏属(Chamaecyparis)(例如，日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))；大蠊属(Periplaneta)(例如，美洲大蠊(Periplaneta americana))；冰草属(Agropyron)(例如，偃麦草(Agropyron repens))；黑麦属(Secale)(例如，黑麦(Secale cereale))；小麦属(例如，普通小麦(Triticum aestivum))；鸭茅属(Dactylis)(例如，鸭茅(Dactylis glomerata))；羊茅属(Festuca)(例如，牛尾草(Festuca elatior))；早熟禾属(Poa)(例如，草地早熟禾(Poapratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa))；燕麦属(Avena)(例如，燕麦(Avena sativa))；绒毛草属(Holcus)(例如，绒毛草(Holcus lanatus))；黄花茅属(Anthoxanthum)(例如，黄花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麦草属(Arrhenatherum)(例如，燕麦草(Arrhenatherum elatius))；小糠草属(Agrostis)(例如，小糠草(Agrostis alba))；梯牧草属(Phleum)(例如，梯牧草(Phleum pratense))；

草属(Phalaris)(例如，

草(Phalarisarundinacea))；雀稗属(Paspalum)(例如，Paspalum notatum)；蜀黍属(Sorghum)(例如，石茅高粱(Sorghum halepensis))；和雀麦属(Bromus)(例如，无芒雀麦(Bromus inermis))。

而且，通过影响炎性细胞因子，本发明的组合物和方法可以用于移植以抑制器官排斥和用于心脏病。在图19和实施例VI-XII中阐述了各种TIM靶向分子在各种疾病模型中的作用。用TIM或抗-TIM抗体处理，会促进更强的接种疫苗诱导的免疫反应。

本发明的方法可以用于增加Th1或Th2，作为特定适应症的优点。例如，Th1细胞因子适用于细胞内的病原体例如细菌或病毒、癌症和迟发型超敏反应。Th2细胞因子适用于细胞外的蠕虫寄生物例如绦虫和线虫，和抗体反应的形成，以中和循环病毒和细菌。相反地，不适当的Th1反应会导致自身免疫性障碍，例如，多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和I型糖尿病和移植体排斥；Th1细胞因子的缺乏会导致不能与细胞内的病原体例如病毒和细菌斗争。不适当的Th2反应会导致哮喘、变应性的障碍、不能清除细胞内的感染和对HIV易感；Th2细胞因子的缺乏会导致不能中和侵入的病毒和细菌。

本发明的方法是有利的，因为它们可以根据需要，用于增加Th1或Th2反应。在免疫反应进展时，TIM分子被表达，并辅助指导适当的细胞因子信使的分泌。TIM-1在刺激Th2中起作用，而TIM-3在刺激Th1中起作用。因而，可以使用具体的TIM靶向分子调节Th1或Th2的相对量，如对于特定的希望的免疫反应有用的。在图30中，描述了示例性的疾病和TIM靶向分子的所需作用如何可以用于增强治疗各种疾病的免疫反应。

应当理解，本发明的组合物和方法可以与治疗特定状况的其它疗法相组合。例如，本发明的组合物作为癌症疫苗的用途，可以任选地与其它癌症疗法(例如众所周知的化疗或放疗)组合使用。类似地，本发明的组合物在治疗自身免疫病中的用途，可以任选地与用于治疗特定自身免疫病的疗法相组合。同样地，用于治疗哮喘或变应性的状况的本发明的组合物可以任选地与用于治疗各状况的疗法相组合。

本发明的组合物和方法可以用于治疗和/或诊断目的，其可以用于人类或兽医应用。例如，本发明的组合物可以用于靶向治疗或诊断部分。在治疗性部分的情况下，该部分可以是药物，例如化疗剂、细胞毒性的试剂、毒素等。例如，细胞毒性的试剂可以是放射性核素或化合物。示例性的用作治疗剂的放射性核素包括，例如，X-射线或γ-射线发射体。另外，部分可以是药物送递载体，例如分室的微型装置(microdevice)、细胞、脂质体或病毒，其可以含有试剂例如药物或核酸。

示例性的治疗剂包括，例如，已经连接到抗体上的蒽环霉素阿霉素，且抗体/阿霉素缀合物已经治疗上有效地用于治疗肿瘤(Sivam等，Cancer Res.55：2352-2356(1995)；Lau等，Bioorg.Med.Chem.3：1299-1304(1995)；Shih等，Cancer Immunol.Immunother.38：92-98(1994))。类似地，其它蒽环霉素，包括伊达比星和柔红霉素，已经被化学地缀合到抗体上，其已经给肿瘤送递有效剂量的试剂(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.37：195-202(1993)；Aboud-Pirak等，Biochem.Pharmacol.38：641-648(1989))。

除了蒽环霉素外，烷化剂例如美法仑和苯丁酸氮芥已经被连接到抗体上，以生产治疗上有效的缀合物(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.37：195-202(1993)；Smyth等，Immunol.Cell Biol.65：315-321(1987))，长春花生物碱例如长春地辛和长春碱也这样(Aboud-Pirak等，同上，1989；Starling等，Bioconj.Chem.3：315-322(1992))。类似地，抗体和抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷和其衍生物)的缀合物已经有效地用于治疗肿瘤(Krauer等，Cancer Res.52：132-137(1992)；Henn等，J.Med.Chem.36：1570-1579(1993))。当作为与各种不同抗体的缀合物施用时，其它化疗剂，包括顺铂(Schechter等，Iht.J.Cancer 48：167-172(1991))、甲氨蝶呤(Shawler等，J.Biol.Resp.Mod.7：608-618(1988)；Fitzpatrick和Garnett，Anticancer Drug Des.10：11-24(1995))和丝裂霉素-C(Dillman等，Mol.Biother.1：250-255(1989))也是治疗上有效的。治疗剂也可以是毒素，例如蓖麻毒蛋白。

治疗剂也可以是物理的、化学的或生物的材料，例如脂质体、微囊、微泵(micropump)或其它分室的微型装置，其可以用作例如药物送递系统。通常，这样的微型装置应当是无毒性的，且如果需要，是可生物降解的。各种部分，包括微囊，其可以含有试剂，和用于将部分(包括分室的微型装置)连接到本发明的TIM靶向分子或试剂上的方法，是本领域众所周知的和可商业上得到的(见，例如，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第18版(Mack PublishingCo.1990)，第89-91章；Harlow和Lane，Antibodies：A laboratorymanual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996))。

对于诊断目的，TIM靶向分子或试剂还可以包含检测部分。检测部分可以是，例如，放射性核素、荧光的、磁的、比色的部分等。对于体内诊断目的，可以将部分，例如发射γ射线的放射性核素，例如，铟-111或technitium-99，连接到本发明的抗体上，并在施用给受试者后，可以使用固体闪烁检测器检测到。类似地，可以将能发射正电子的放射性核素例如碳-11或顺磁的自旋标记例如碳-13连接到分子上，并在施用给受试者后，可以分别使用正电子发射轴向断层显象或磁共振成像，检测该部分的定位。这样的方法可以鉴定原发肿瘤以及转移病灶。

对于诊断目的，TIM靶向分子或试剂可以用于体内诊断，或用于从个体得到的组织样品的体外诊断，例如，通过组织活组织检查。示例性的体液包括，但不限于，血清、血浆、尿、滑液等。

通过许多众所周知的偶联或缀合部分的方法中的任一种，可以将治疗或检测部分偶联到TIM靶向分子或试剂上。应当理解，这样的偶联方法允许附着治疗或检测部分，而不干扰或抑制TIM靶向分子或试剂的结合活性。将部分缀合到本发明的TIM靶向分子或试剂上的方法，是本领域的技术人员众所周知的(见，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996))。还应当理解，可以将治疗或检测部分非共价地缀合到TIM靶向分子或试剂上，只要非共价地结合的缀合物具有对于希望的目的足够的结合亲和力。例如，通过将生物素或抗生物素蛋白缀合到各部分和TIM靶向分子上，和使用生物素-抗生物素蛋白来非-共价地缀合部分和TIM靶向分子，可以将治疗或检测部分缀合到TIM靶向分子上。可以类似地使用其它类型的众所周知的结合分子对，包括，例如，麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、谷胱甘肽-S转移酶/谷胱甘肽等。

因而，在本发明的一个实施方案中，TIM靶向分子或试剂，例如，抗-TIM抗体或TIM蛋白，可以用作将毒性的放射性同位素或毒素特异性地靶向癌细胞或在细胞表面上表达适当的TIM分子(由抗-TIM抗体靶向)或TIM配体分子(由TIM蛋白靶向)的自身反应性B和T细胞的送递系统。可以将抗体或重组蛋白，例如TIM蛋白，例如，具有Fc尾巴的TIM蛋白，缀合到植物毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、gelonin等，或细菌毒素如假单胞菌外毒素、白喉毒素，或化学毒素例如加利车霉素和esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法仑、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶或阿糖胞苷(ARA-C)、长春地辛、顺铂、依托泊苷、博来霉素、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶；或放射性同位素如碘-131或钇-90。

在一个实施方案中，可以将本发明的组合物共价地或非共价地缀合到毒性分子上，包括化学、细菌或植物毒素和放射性同位素。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗癌症或自身免疫病的方法，其中将TIM靶向分子或试剂，例如，抗-TIM抗体或TIM蛋白，共价地或非共价地缀合到治疗部分，例如毒性分子，包括用作治疗模态的化学、细菌或植物毒素和放射性同位素。也可以将各种毒素的组合偶联到一个抗体分子上。其它化疗剂是本领域的技术人员已知的，如本文所公开的。

在另一个实施方案中，本发明提供了组合物在生产用于治疗受试者中的自身免疫性障碍的药物中的用途，该组合物包含缀合到治疗部分例如免疫毒素上的TIM靶向分子或试剂。在另一个实施方案中，本发明提供了缀合到治疗部分上的TIM靶向分子或试剂的用途，其中自身免疫性障碍是选自下述的障碍：类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、全身性红斑狼疮、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)等。

在另一个实施方案中，本发明提供了TIM靶向分子或试剂在治疗受试者中的癌症的用途。例如，癌症可以是癌、肉瘤或淋巴瘤或其它癌症类型。TIM靶向分子或试剂可以用于治疗表达适当的TIM或TIM配体的肿瘤。在肿瘤活组织检查样品中，可以鉴定TIM或TIM配体。如本文所公开的，已经显示各种细胞系会表达TIM或TIM配体，包括肾腺癌、胸腺瘤和淋巴瘤(见实施例XV和图33-36)。如果肿瘤活组织检查样品是TIM表达阳性的，那么缀合了细胞毒性的试剂的TIM靶向分子例如抗-TIM抗体可以用于靶向肿瘤细胞。另一方面，如果肿瘤表达TIM分子的适当配体，那么适当的TIM分子自身或作为缀合到细胞毒性的试剂上的融合蛋白，可以用于靶向表达TIM配体的肿瘤。类似地，TIM靶向分子或试剂或其与治疗或诊断部分的缀合物，可以用于靶向表达TIM或TIM配体的各种细胞类型或组织。

本发明提供了一种组合物，其包含缀合到治疗或诊断部分上的TIM靶向分子。治疗部分可以是化疗剂、细胞毒性的试剂或毒素。细胞毒性的试剂可以是，例如，放射性核素或化合物，包括但不限于化合物加利车霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法仑、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、长春地辛、顺铂、依托泊苷、博来霉素、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶或放射性核素碘-131或钇-90。在一个具体的实施方案中，毒素可以是植物或细菌毒素，包括但不限于植物毒素蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素或gelonin或细菌毒素假单胞菌外毒素或白喉毒素。

制备和施用作为疫苗的组合物的方法，是本领域的技术人员众所周知的。可以以经验为主地，但是可基于例如在动物模型中的免疫有效量，确定组分的免疫有效量。要考虑的因素包括抗原性，制剂，施用途径，要施用的免疫剂量的次数，个体的身体状况、体重和年龄等。这样的因素是本领域众所周知的，且可以由本领域的技术人员容易地确定(见，例如，Paoletti和McInnes，编，Vaccines，from Concept toClinic：A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccinesfor Human Use CRC Press(1999)。如本文所公开的，TIM靶向分子或试剂可以用作佐剂(见实施例)。应当理解，本发明的TIM靶向分子或试剂可以单独用作佐剂，或者如果需要，可以与其它众所周知的佐剂相组合。

通过任意的本领域已知的方法，包括，但不限于，肌内的、皮内的、静脉内的、皮下的、腹膜内的、鼻内的、经口的或其它粘膜途径，可以局部地或全身地施用本发明的组合物。其它途径包括颅内的(例如，脑池内的或心室内的)、眶内的、眼的、囊内的、椎管内的和局部的施用。本发明的组合物可以在合适的、无毒性的药物载体中施用，或可以配制在微囊中，或配制成持续释放的植入物。如果需要，可以多次施用本发明的免疫原性组合物，以维持需要的免疫反应。本领域的技术人员可以确定合适的途径、剂型和免疫接种方案。

在本发明的一种方法中，可以施用本发明的组合物，从而使得抗原和TIM靶向分子处于施用的单一组合物中，以便共同施用抗原和TIM靶向分子。或者，可以执行本发明的一种方法，从而使得抗原和TIM靶向分子作为分开的组合物施用，例如，分开的药物组合物。可以同时地，通过将组合物混合到一起或将它们在相同部位注射，施用这样的分开的含有抗原和TIM靶向分子的组合物，或可以在相同的或不同的位置，分开地施用组合物。可以在与抗原相同的部位或不同的部位，施用TIM靶向分子，且可以同时或先后经历几分钟或几天的时间施用。本领域的技术人员可以容易地确定为所需作用施用抗原和TIM靶向分子的所需方案。在已有抗原存在的情况下，例如，对于发展中的感染或疾病，其中疾病-相关的抗原被暴露于免疫系统，可以施用TIM靶向分子，以刺激针对已经在个体中表达的抗原的免疫反应。

可以以一种或多种不同的形式施用TIM靶向分子。如果TIM靶向分子是肽或多肽，例如抗-TIM抗体或TIM融合蛋白，则施用模式包括，但不限于，施用纯化的肽或多肽，施用表达肽或多肽的细胞，或施用编码肽或多肽的核酸。

本发明的方法和用于实现它们的治疗组合物，含有“基本上纯的”试剂。例如，在TIM靶向分子或试剂是多肽的情况下，相对于多肽的原始来源中的其它多肽或不需要的组分，该多肽可以是至少约60％纯的。例如，如果多肽纯化自天然来源、重组表达或化学合成，则纯度是相对于原始来源、重组来源或合成反应中的其它组分的。本领域的技术人员可以容易地确定本发明的多肽试剂或其它试剂的适当的众所周知的纯化方法。具体地，试剂可以是至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％纯度。本领域的技术人员可以容易地确定适用于特定所需应用的纯度。通过任意的合适的标准方法，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析，且可以基于需要的定量标准，例如紫外吸光度、染色或类似的依赖于试剂的化学性质测量量的方法，可以测量纯度。应当理解，当本发明的试剂与作为佐剂的其它组分相组合时，例如在疫苗中，可以以特定的纯度，例如95％纯度，但是不需要占疫苗中的组分(例如抗原、缓冲剂等)的95％，施用TIM靶向分子或试剂，本领域的技术人员可以容易地确定TIM靶向分子或试剂相对于本发明的组合物中的其它需要的组分的合适的纯度和合适的量。

尽管可以从天然产生的来源得到在本发明的方法中使用的试剂，但也可以合成它们，或通过例如表达编码TIM靶向分子或试剂的重组核酸分子来生产它们。重组表达多肽的方法是本领域的技术人员众所周知的(Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 56)，John Wiley & Sons，New York(2001)；Sambrook和Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor(2001))。肽合成方法也是本领域的技术人员众所周知的(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1964)；Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag(1984))。可以将从天然来源(例如，从真核生物)纯化的多肽，纯化成基本上没有它们的天然伴随组分。类似地，可以将在真核或原核细胞(例如，大肠杆菌或其它原核生物)中重组表达的或化学合成的多肽，纯化至需要的纯度水平。在多肽是嵌合体的情况下，它可以由杂合核酸分子编码，该杂合核酸分子含有一个编码该试剂的全部或部分的序列，例如，编码TIM多肽的序列和编码IgG的Fc区的序列。

可以将本发明的试剂，具体地，重组表达的多肽，融合到亲和标记上，以促进该多肽的纯化。在一个实施方案中，亲和标记可以是相对较小的分子，其不会妨碍多肽的功能，例如，TIM靶向分子或试剂的结合。或者，可以利用允许从重组表达的多肽上去除亲和标记的蛋白酶切割位点，将亲和标记融合到多肽上。如果亲和标记相对较大，且会潜在地妨碍多肽的功能，则蛋白酶切割位点的包含是特别有用的。示例性的亲和标记包括多组氨酸标记，其通常含有约5-约10个组氨酸，或血凝素标记，其可以用于促进重组表达的多肽从原核或真核细胞的纯化。其它示例性的亲和标记包括麦芽糖结合蛋白或凝集素，二者都结合糖、谷胱甘肽-S转移酶、抗生物素蛋白等。其它合适的亲和标记包括可以得到它的特异性抗体的表位。表位可以是，例如，约3-5个或更多个氨基酸的短肽、碳水化合物、小有机分子等。表位标记已经被用于亲和纯化重组蛋白，且可以在商业上得到。例如，抗表位标记的抗体，包括myc、FLAG、血凝素(HA)、绿色荧光蛋白(GFP)、polyHis等，可以在商业上得到(见，例如，Sigma，St.LouisMO；PerkinElmer Life Sciences，Boston MA)。

在治疗应用中，本发明的试剂可以与生理上可接受的载体例如生理盐水一起施用。本发明的治疗组合物也可以含有载体或赋形剂，其中的许多是本领域的普通技术人员已知的。可以使用的赋形剂包括缓冲剂，例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂；氨基酸；脲；醇；抗坏血酸；磷脂；蛋白，例如，血清清蛋白；乙二胺四乙酸(EDTA)；氯化钠或其它盐；脂质体；甘露糖醇、山梨糖醇、甘油等。根据对应的施用途径，可以以多种方式配制本发明的试剂。例如，可以制备液体溶液用于摄食或注射；可以制备凝胶或粉末用于摄食、吸入或局部应用。制备这样的制剂的方法是众所周知的，且可以参见，例如，“Remington′s PharmaceuticalSciences，”第18版，Mack Publishing Company，Easton PA(1990)。

如上所述，通过在合适的真核或原核表达系统中表达一种或多种核酸分子，并随后纯化多肽试剂，可以得到本发明的多肽试剂，包括是融合蛋白的那些。另外，借助于合适的能体内或离体编码一种或多种核酸分子的治疗表达载体，也可以将本发明的多肽试剂施用给患者。而且，在移植物的移植之前，可以将核酸导入移植物的细胞中。因而，编码上述试剂的核酸分子也在本发明的范围内。

正如可以根据它们与野生型多肽的同一性来描述本发明的多肽，编码它们的核酸分子会与编码对应的野生型多肽的那些具有某种同一性。例如，编码TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4的核酸分子可以与编码天然的或野生型TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4的核酸具有至少约50％、至少约65％、至少约75％、至少85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％同一性。类似地，TIM多肽可以与天然的或野生型TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4多肽具有至少约50％、至少约65％、至少约75％、至少85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％同一性。应当理解，与对应的野生型分子具有小于100％同一性的多肽或编码核酸，仍然保留需要的TIM多肽的功能。

编码本发明的试剂的核酸分子可以含有天然产生的序列，或与天然产生的那些不同、但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA组成，例如，基因组DNA、cDNA或合成的DNA，例如通过基于亚磷酰胺的合成生产的那些，或在这些核酸类型内的核苷酸的组合或修饰。另外，核酸分子可以是双链的或单链的，有义链或反义链。本领域的技术人员能够理解，基于所需用途，例如，使用单链的或双链的和有义或反义的病毒载体进行表达，可以选择合适形式的核酸。

在本发明的天然产生的核酸分子的情况下，可以从生物的天然产生的基因组“分离”核酸分子，因为可以将它们与它们在基因组中紧密邻接的5′或3′编码序列分离。因而，核酸分子包括编码多肽的序列，且可以包括位于编码序列的上游或下游的非编码序列。本领域的普通技术人员熟知分离核酸分子的常规操作(见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Press，Plainview，New York(1989)；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(Supplement 56)，John Wiley & Sons，New York(2001)；和Sambrook和Russel，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor(2001))。例如，通过用限制性内切核酸酶处理基因组DNA，或使用众所周知的方法，通过聚合酶链反应(PCR)来扩增基因组DNA或cDNA的所需区域，可以产生核酸(见，例如，Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1995))。在核酸分子是糖核酸(RNA)的情况下，可以通过体外转录生产分子。

本发明的分离的核酸分子可以包含在天然状态中不会发现的片段。因而，本发明包括重组分子，例如这样的重组分子，其中核酸序列，例如，编码TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4的序列，整合进载体中，例如，质粒或病毒载体，或整合进异源细胞的基因组或同源细胞的基因组中，在天然的染色体位置以外的位置处。

如上所述，本发明的试剂可以是融合蛋白。除了上述的异源多肽之外，或作为替代，编码本发明的试剂的核酸分子可以含有编码“标记”或“报道分子”的序列。标记或报道分子基因的实施例包括β内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo^r、G418^r)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。关于与实践本发明有关的许多标准操作，本领域的普通技术人员能够认识到，其它有用的试剂，例如其它序列，可以起标记或报道分子的功能。

通过将突变导入从任何生物细胞(例如哺乳动物细胞)得到的或通过常规克隆方法生产的本发明的试剂，例如，TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4分子，可以得到本发明的核酸分子。因而，本发明的核酸可以是小鼠、大鼠、豚鼠、母牛、羊、马、猪、兔、猴、狒狒、狗或猫的。在一个具体的实施方案中，核酸分子可以编码人TIM。

本文所述的本发明的核酸分子可以包含在载体中，后者能指导它的表达，例如，在已经用该载体转导的细胞中。因此，除了多肽试剂外，还提供了含有编码这些试剂的核酸分子的表达载体和用这些载体转染的细胞。

适用于本发明的载体包括在细菌中使用的基于T7的载体(见，例如，Rosenberg等，Gene 56：125-135(1987)，在哺乳动物细胞中使用的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263：3521-3527(1988)，酵母表达系统，例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)，例如PICZ家族的表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)和杆状病毒衍生的载体，例如在昆虫细胞中使用的表达载体pBacPAK9(Clontech，Palo Alto，CA)。可以将在这样的载体中编码目标多肽的核酸插入序列可操作地连接到基于例如该核酸要在其中表达的细胞类型选择的启动子上。例如，T7启动子可以用于细菌中，多角体蛋白启动子可以用于昆虫细胞中，且巨细胞病毒或金属硫蛋白启动子可以用于哺乳动物细胞中。同样，在高等真核生物的情况下，可以广泛地得到组织特异性的和细胞类型特异性的启动子。这些启动子是根据它们指导核酸分子在身体内的给定组织或细胞类型中的表达的能力而命名的。本领域的普通技术人员可以容易地确定合适的启动子和/或可以用于指导核酸在所需细胞或生物中的表达的其它调节元件。

除了能促进插入的核酸分子转录的序列外，载体可以含有复制起点，和编码选择标记的其它基因。例如，新霉素-抗性(neo^r)基因将G418抗性赋予它在其中表达的细胞，并从而允许转染的细胞的表型选择。允许细胞的表型选择的其它可行的选择标记基因包括各种荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(GFP)和其变体。本领域的技术人员可以容易地确定给定的调控元件或选择标记是否适用于特定用途。在图18中显示了示例性的载体。

可以在本发明中使用的病毒载体包括，例如，逆转录病毒、腺病毒、和腺伴随载体、疱疹病毒、猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(见，例如，Gluzman(Ed.)，Eukaryotic Viral Vectors，CSHLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

还提供了含有编码本发明的试剂的核酸分子且表达由核酸分子编码的蛋白的原核或真核细胞。本发明的细胞是转染的细胞，即其中已经通过重组DNA技术导入了一种或多种核酸分子，例如编码TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4多肽的核酸分子，或例如编码抗-TIM抗体的重链和轻链的核酸。认为这样的细胞的后代也在本发明的范围内。可以使用多种表达系统。例如，可以在原核宿主，例如细菌大肠杆菌，或真核宿主例如昆虫细胞(例如，Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如，COS细胞、CHO细胞、293细胞、PER.C6细胞、NIH3T3细胞、HeLa细胞等)中生产TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4或抗-TIM多肽。这些细胞可以从许多来源得到，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。本领域的技术人员可以容易地选择适用于特定表达系统的组分，包括适用于所需细胞或生物的如上所述的表达载体、启动子、选择标记等。各种表达系统的应用的选择可参见例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology.JohnWiley and Sons，New York，NY(1993)；和Pouwels等，CloningVectors：A Laboratory Manual，1985 Suppl.1987)。还提供了真核细胞，其含有编码本发明的试剂的核酸分子，且表达由这样的核酸分子编码的蛋白。

而且，本发明的真核细胞可以是作为细胞移植物、组织或器官移植物的部分的细胞。这样的移植物可以包含从供体生物取出的原代细胞或在移植到受体生物之前体外培养、修饰和/或选择的细胞，例如，真核细胞系，包括干细胞或祖细胞。如果在移植进受体生物后，发生细胞增殖，则认为这样的细胞的后代也在本发明的范围内。可以用编码TIM或抗-TIM多肽的核酸转染作为细胞、组织或器官移植物的部分的细胞，且随后将所述细胞移植进受体生物，在其中进行多肽的表达。而且，这样的细胞可以含有一种或多种其它的核酸构建体，从而允许在移植进受体生物之前应用例如特定的细胞谱系或细胞类型的选择操作。这样的移植的细胞可以用于治疗应用。例如，如果TIM靶向分子或试剂是多肽，则可以使用众所周知的基因送递方法和合适的载体(见，例如，Kaplitt和Loewy，Viral Vectors：Gene Therapy andNeuroscience Applications Academic Press，San Diego(1995))，移植表达TIM靶向分子的细胞，以提供TIM靶向分子的来源。

在细胞移植物的情况下，可以通过植入操作，或穿过血管壁的导管-介导的注射操作，施用细胞。在有些情况下，可以通过释放进脉管系统来施用细胞，细胞随后从该脉管系统被血流分布，和/或迁移进周围组织。

在另一个实施方案中，通过基因送递方法，可以将起免疫抑制剂作用的TIM靶向分子导入器官的细胞。在这样的情况下，供体器官自身会提供免疫抑制剂，以促进器官移植和抑制移植物排斥。

本发明另外提供了一种试剂盒，其含有包含抗原和TIM靶向分子或试剂的组合物。本发明还提供了一种试剂盒，其含有包含抗原的组合物和包含TIM靶向分子或试剂的组合物。如上面关于施用本发明的组合物所讨论的，可以在相同位置或不同位置，共同地施用或分开地施用含有抗原和TIM靶向分子的分开的组合物的试剂盒。如本文所公开的，可以同时或在不同的时间，施用含有分开的抗原和TIM靶向分子组合物的试剂盒。

如本文所使用的，以最广泛的含义使用术语“抗体”，以包括多克隆和单克隆抗体，以及这样的抗体的抗原结合片段。对抗原特异性的抗体或这样的抗体的抗原结合片段的特征在于，具有至少约1×10⁵M^-1的对抗原或其表位的特异性结合活性。因而，保留对抗原的特异性的结合活性的对抗原特异性的抗体的Fab、F(ab′)₂、Fd和Fv片段，包含在抗体的定义内。本领域的技术人员可以容易地确定对抗原(例如TIM)的特异性的结合活性，例如，通过对比抗体对它各自的抗原和非-抗原对照分子相对的结合活性。本领域的技术人员能容易地理解具有对特定抗原(例如TIM)的特异性的结合活性的抗体的含义。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。制备多克隆或单克隆抗体的方法是本领域的技术人员众所周知的(见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1988))。当使用多克隆抗体时，可以使用抗原亲和纯化多克隆血清，以产生单-特异性的抗体，其具有减小的背景结合和更高比例的抗原-特异性的抗体。

另外，如本文使用的术语“抗体”包括天然产生的抗体以及非-天然产生的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合的、双功能的和人源化的抗体及其抗原-结合片段。人源化的抗体意在包括通过使人免疫球蛋白序列(例如，人构架序列)与源自提供抗原特异性的互补性决定区(CDR)的非-人免疫球蛋白序列相组合产生的重组抗体。从适用于抗体生产的各种非-人生物，包括但不限于大鼠、小鼠、兔子、山羊等，可以得到非-人免疫球蛋白序列。人源化的抗体也意在包括完全人抗体。得到完全人抗体的方法，例如使用例如噬菌体展示文库系统或人MHC基因座转基因小鼠，是本领域众所周知的(见，例如，美国专利号5,585,089；5,530,101；5,693,762；6,180,370；6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422；5,565,332；5,837,243；6,500,931；6,075,181；6,150,584；6,657,103；6,162,963)。这样的非-天然产生的抗体可使用固相肽合成构建，可以重组生产，或可以如Huse等(Science 246：1275-1281(1989))所述，通过例如筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库来得到。这些和其它的制备例如嵌合的、人源化的、CDR-移植的、单链和双功能的抗体的方法，是本领域的技术人员众所周知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14：243-246(1993)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，同上，1988；Hilyard等，Protein Engineering：A practical approach(IRLPress 1992)；Borrabeck，Antibody Engineering，第2版(OxfordUniversity Press 1995))。

使用免疫原，例如分离的TIM多肽或其片段，其可以从天然来源制备或重组生产，或能起表位作用的抗原的抗原性部分，可以得到对抗原特异性的抗体。如果表位可以用于产生对抗原特异性的抗体，则这样的表位是功能性的抗原片段。通过将半抗原偶联到载体分子例如牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)，可以将非-免疫原性的或弱免疫原性的抗原或其部分变成免疫原性的。各种其它的载体分子和将半抗原偶联到载体分子上的方法，是本领域众所周知的(见，例如，Harlow和Lane，同上，1988)。通过将肽部分表达为融合蛋白，例如，与谷胱甘肽S转移酶(GST)、polyHis等的融合蛋白，也可以产生抗原的免疫原性的肽片段。表达肽融合体的方法是本领域的技术人员众所周知的(Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 47)，John Wiley & Sons，New York(1999))。

如本文所公开的，可以将TIM靶向分子重组地表达为多肽，具有需要的活性的多肽的功能片段，或融合多肽。制备和表达重组形式的TIM靶向分子的方法是本领域的技术人员众所周知的，如在例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，New York(1989)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 56)，JohnWiley & Sons，New York(2001)；和Sambrook和Russel，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor(2001)中所教导的。这样的方法示例在实施例中，且图18显示了TIM靶向分子构建体的示例性的表达载体。本领域的技术人员可以容易地确定需要的片段，例如，具有需要的功能的TIM的功能片段，例如，用作TIM靶向分子的胞外结构域或其片段，例如Ig结构域和/或粘蛋白结构域。

如上所述，TIM靶向分子或试剂可以是小分子，肽，多肽，多核苷酸，包括反义和siRNA，碳水化合物，包括多糖，脂类，药物，以及模仿物，等。产生这样的分子的方法是本领域的技术人员众所周知的(Huse，美国专利号5,264,563；Francis等，Curr.Opin.Chem.Biol.2：422-428(1998)；Tietze等，Curr.Biol.，2：363-371(1998)；Sofia，Mol.Divers.3：75-94(1998)；Eichler等，Med.Res.Rev.15：481-496(1995)；Gordon等，J.Med.Chem.37：1233-1251(1994)；Gordon等，J.Med.Chem.37：1385-1401(1994)；Gordon等，Acc.Chem.Res.29：144-154(1996)；Wilson和Czarnik，编，Combinatorial Chemistry：Synthesis and Application，John Wiley &Sons，New York(1997))。选择和制备反义核酸分子的方法是本领域众所周知的，且包括硅片上(in silico)方法(Patzel等，Nucl.Acids Res.27：4328-4334(1999)；Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8502-8507(1996)；Lebedeva和Stein，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.41：403-419(2001)；Juliano和Yoo，Curr.Opin.Mol.Ther.2：297-303(2000)；和Cho-Chung，Pharmacol.Ther.82：437-449(1999))。以前已经描述了生产siRNA和使用RNA干扰的方法(Fire等，Nature391：806-811(1998)；Hammond等Nature Rev.Gen.2：110-119(2001)；Sharp，Genes Dev.15：485-490(2001)；和Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genetics & Development 12：225-232(2002)；Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genetics & Development 12：225-232(2002)；Bernstein等，Nature 409：363-366(2001)；(Nykanen等，Cell 107：309-321(2001))。

本发明还提供了通过给个体施用组合物，其包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子或试剂，预防性治疗疾病的方法。因而，本发明的组合物可以用作疫苗，以预防疾病的发作，或降低疾病的严重性。该方法可以用于多种疾病，包括但不限于传染病或癌症。

本发明另外提供了通过给个体施用组合物，其包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子或试剂，改善与疾病有关的病征或症状的方法。该方法可以用于降低疾病的严重性。因而，本发明的组合物可以在治疗上用于治疗疾病。本领域的技术人员可以容易地确定与特定疾病有关的病征或症状和有关的病征或症状的改善。该方法可以用于多种疾病，包括但不限于传染病或癌症。在传染病的情况下，该方法可以用于减少感染的个体中传染物的量。

本发明另外提供了靶向肿瘤的方法。该方法可以包括向受试者施用TIM靶向分子的步骤，其中所述肿瘤表达TIM或TIM配体。肿瘤可以是，例如，癌、肉瘤和淋巴瘤。在另一个实施方案中，本发明提供了通过向受试者施用TIM靶向分子抑制肿瘤生长的方法，其中所述肿瘤表达TIM或TIM配体。在另一个实施方案中，本发明提供了通过给受试者施用缀合到诊断部分上的TIM靶向分子，检测肿瘤的方法，其中所述肿瘤表达TIM或TIM配体。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过给受试者施用TIM靶向分子，改善与自身免疫病有关的病征或症状的方法，如本文所公开的。自身免疫病可以是，例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、全身性红斑狼疮、银屑病、银屑病关节炎、炎性肠病、例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、重症肌无力和自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)以及动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病，或如本文所公开的其它自身免疫病。自身免疫性障碍由细胞效应物介导，例如，T细胞、巨噬细胞、B细胞和它们生产的抗体，和其它细胞。这些细胞会表达如本文所公开的一种或多种TIM或TIM配体。通过消除参与自身免疫反应的细胞，例如，使用抗体或融合蛋白中的裂解性的Fc，或通过使用毒性的缀合物，可以在这样的自身免疫性障碍中实现治疗益处。

在本发明的方法中，可以单独施用TIM靶向分子，或任选地与抗原一起施用。在本发明的刺激免疫反应的方法中，TIM靶向分子可以增强针对一种或多种内源性抗原或针对一种或多种与TIM靶向分子一起施用的外源性抗原的免疫反应，如本文所公开的。例如，在靶向肿瘤的方法中，抗原可以是肿瘤抗原。类似地，如果需要，可以与TIM靶向分子或其缀合物一起施用与介导自身免疫病的细胞有关的抗原。也可以使TIM靶向分子缀合治疗部分。另外，TIM靶向分子或TIM靶向分子缀合物可以是TIM-Fc融合多肽。这样的TIM-Fc融合多肽可以是靶细胞去除性的(裂解性的)或非-靶细胞去除性的(非-裂解性的)。

应当理解，在本文提供的本发明的定义内，也提供了基本上不会影响本发明的各种实施方案的活性的改进。因此，下面的实施例意在解释而不是限制本发明。

                实施例I

          抗-TIM-1抗体的纯化

在细胞培养瓶中，初始培养分泌小鼠抗-人TIM-1抗体或大鼠抗-小鼠TIM-1抗体的杂交瘤，并随后转移到Bioperm细胞培养反应器。每隔48小时，收获含有分泌的抗体的培养物上清液，澄清，并在4℃保藏。合并收集的上清液，通过G蛋白琼脂糖亲和色谱，从上清液纯化抗-TIM-1抗体，并使用甘氨酸pH 2.5-3.5从柱洗脱。对洗脱物进行pH中和，并对磷酸缓冲盐水(PBS)进行渗析。将纯化的抗体在-80℃保藏，直到进一步使用。

                 实施例II

用于鼠和人TIM-1/Fc融合蛋白表达的DNA载体的构建

设计并构建了用于克隆TIM-1/Fc融合蛋白基因片段的穿梭质粒载体(pTPL-1)。基础载体pTPL-1携带细菌和真核抗性基因以及侧接CMV增强子和β-珠蛋白聚腺苷酸位点的多克隆位点(也见图18，TIM-3融合体)。通过寡核苷酸定点诱变，产生了小鼠非-裂解性的IgG2a/Fc片段(铰链、CH2和CH3结构域)，以替代C1q结合基序和灭活FcγR1结合位点(Zheng等，J.Immunol.154：5590-5600(1995))。

可以作为本发明的试剂的部分的Fc区，可以是“裂解性的”或“非-裂解性的”。非-裂解性的Fc区一般缺少高亲和力Fc受体结合位点和C′1q结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点包括在IgG Fc的位置235处的Leu残基。因而，通过突变或缺失Leu235，可以破坏鼠Fc受体结合位点。例如，用Glu取代Leu 235，会抑制Fc区结合高亲和力Fc受体的能力。通过突变或缺失IgG的Glu318、Lys 320和Lys 322残基，可以在功能上破坏鼠C′1q结合位点。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322，会使IgG Fc不能指导抗体-依赖性的补体裂解。相反地，裂解性的IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和C′1q结合位点。高亲和力Fc受体结合位点包括在IgG Fc的位置235处的Leu残基，而C′1q结合位点包括IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。裂解性的IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。裂解性的IgG Fc可以将细胞靶向依赖抗体的细胞毒性或补体指导的细胞裂解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(见，例如，Morrison等，TheImmunologist 2：119-124(1994)；和Brekke等，The Immunologist2：125，1994))。

通过PCR分别扩增野生型和点突变的IgG2a Fc片段，并克隆进pTPL-1，以产生pTPL-1/mFc2a和pTPL-1/mFc2a/nl(nl，非裂解性的)。随后，使用下面的两个寡核苷酸(基因座：NM_014207，正向寡核苷酸：5′-TGGCACCGGTGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGG  -3′，SEQ IDNO：43；和反向寡核苷酸：5′-TAGGAGATCTCCTAGGCAGGAAGCGACCAGCATCCCCAGCAGGTACAAGGTGGCCAGCGG-3′，SEQ IDNO：44)，通过退火和补平反应，合成人CD5信号序列基因片段。正向寡核苷酸含有在CD5信号序列的起始ATG(标有下划线)之前的合适的限制位点和Kozac共有序列和该序列的5′末端。反向寡核苷酸由源自CD5信号序列的3′末端的序列和合适的限制位点组成。消化合成的基因片段，并克隆进pTPL-1/Fc载体。这会生成质粒pTPL-1/CD5/mFc2a和pTPL-1/CD5/mFc2a/nl。最后，PCR-扩增小鼠TIM-1的各胞外结构域，并克隆进pTPL-1/CD5/mFc2a和pTPL-1/CD5/mFc2a/nl载体，在人CD5信号序列和Ig Fc区之间。该克隆步骤产生最终的表达质粒pTPL-1/TIM-1Fc和pTPL-1/TIM-1Fc/nl。通过DNA测序，证实质粒构建体的准确度。构建了下面的小鼠TIM-1/Fc表达载体：(1)单独融合到非-裂解性的和裂解性的小鼠IgG2a Fc上的TIM-1的免疫球蛋白(Ig)结构域。图1和2给出了Ig结构域的各核苷酸序列。(2)融合到非-裂解性的和裂解性的小鼠IgG2a Fc上的小鼠TIM-1(BALB/c或C57B1/6等位基因)的全长胞外结构域。图1和2给出了胞外结构域(Ig结构域+粘蛋白结构域)的序列。图2给出了蛋白序列。图4给出了示例性的TIM-1/Fc融合蛋白的蛋白序列。

以类似于上述的小鼠TIM-1/Fc表达载体的方式，还生成了表达人TIM-1/Fc的载体。为此，通过PCR扩增了人IgG1 Fc或人IgG4Fc(各免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域)，并克隆进pTPL-1。然后，如上所述插入CD5前导序列，并且最后，如美国专利申请20030124114所述，将不同的TIM-1等位基因克隆进表达载体。另外，使用只含有TIM-1的Ig结构域或含有TIM-1的Ig和粘蛋白结构域的载体来生成TIM-1/Fc表达载体。为TIM-3和TIM-4以及小鼠TIM-2，制备类似的构建体。

                   实施例III

         TIM/Fc融合蛋白在293细胞中的瞬时表达

为了测试产生的表达载体的功能性，在293细胞中进行了瞬时转染。简而言之，根据生产商的说明书(InvitroGen，Carlsbad，CA)，使用Lipofectamine 2000系统，转染了无血清的生长培养基(293-SFMII；InvitroGen，Carlsbad，CA)中的80-90％汇合的293细胞。常规地，使用1μg质粒DNA/10⁵细胞。转染后1天，将生长培养基替换为新鲜培养基，且培养细胞至最多7天。通过离心，澄清细胞培养物上清液，并通过G蛋白琼脂糖亲和色谱，纯化TIM-1/Fc或TIM-3/Fc融合蛋白。从G蛋白珠子低pH洗脱后，对PBS渗析纯化的蛋白，并在-80℃保藏。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和银或考马斯染色、蛋白印迹和ELISA，分析生产的蛋白的同一性、纯度和完整性。

                实施例IV

       稳定表达TIM-1/Fc、TIM-3/Fc和TIM-4/Fc的

                  CHO细胞系的生成

如下生成了稳定表达各种TIM-1/Fc融合蛋白的CHO细胞系：使用可商业上得到的试剂盒(Lipofectamine 2000，InvitroGen，Carlsbad，CA)并根据生产商的说明书或通过电穿孔，用适当的表达质粒(pTPL-l；TIM-1/Fc系列)转染了贴壁的(CHO-K1)或悬浮-生长CHO-S细胞(InvitroGen，Carlsbad，CA)。使转染的细胞在生长培养基(CHO-SFM II；InvitroGen，Carlsbad，CA；或DMEM，10％胎牛血清)中恢复1天，然后转移进含有抗生素G418(0.5mg/ml至1mg/ml)的选择培养基中。通过单细胞有限稀释克隆(悬浮系)或“克隆挑取(clone picking)”(贴壁细胞系)，生成单个的克隆，并进一步繁殖。使用ELISA测定培养基上清液是否存在分泌的TIM-1/Fc蛋白。进一步亚克隆高产克隆，并扩增以用于蛋白生产。使用基本上相同的规程，生成稳定表达TIM-3/Fc和TIM-4/Fc融合蛋白的CHO细胞系。

                  实施例V

     小鼠TIM/Fc融合蛋白的生产和纯化

在无血清的生长培养基(CHO-SFM II；InvitroGen，Carlsbad，CA)或DMEM，5％胎牛血清中，扩增表达TIM-1/Fc融合蛋白的稳定的CHO细胞系。收集培养基，通过离心和/或过滤进行澄清，通过超滤(Pall Ultrasette^TM，Ann Arbor，MI)进行浓缩，并通过A或G蛋白固定化。洗涤蛋白-结合的树脂，并通过低pH洗脱TIM-1/Fc融合蛋白。收集级分，并调节至中性pH。如果需要，通过离子交换色谱和大小排阻色谱，进一步纯化洗脱的TIM-1/Fc蛋白。对合适的生理缓冲液例如PBS渗析纯化的蛋白，并在-80℃保藏等分试样。使用基本上相同的规程，生产和纯化TIM-3/Fc和TIM-4/Fc融合蛋白。

                     实施例VI

         作为乙型肝炎疫苗的佐剂的抗-TIM-1

给BALB/c小鼠接种单剂(10微克，“mcg”)的有或没有50mcg/ml抗-TIM-1抗体的Engerix-B^TM疫苗(Glaxo SmithKline)。在注射前，将抗体与疫苗(疫苗含有作为佐剂的0.5mg/ml氢氧化铝)相混合。用溶于PBS中的氢氧化铝、单独的PBS或含有同种型匹配的抗体对照的载体，处理对照小鼠。在免疫接种后第7、14和21天，从每组取出小鼠进行分析。简而言之，收获脾和血清，处理成在补加了β-巯基乙醇、10％胎牛血清(FBS)和抗生素(青霉素、链霉素、两性霉素)的RPMI培养基中的单细胞悬浮液。在有纯化的乙型肝炎表面抗原(5mcg/ml，Research Diagnostics，Inc.，Flanders，NewJersey)存在下，培养处理的脾细胞(3×10⁵细胞)。在37℃、5％CO₂培养96小时后，通过WST-细胞增殖试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)分析总的活细胞。另外，在96小时后，从这些实验孔收获上清液，并根据生产商的说明书，使用商业的细胞因子ELISA试剂盒(R&D Systems；Minneapolis MN)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。将血清样品稀释至1∶200，并在能检测对乙型肝炎表面抗原特异性的抗体的ELISA中分析。

在其它实验中，以上述的方式，使从接种疫苗的动物分离的脾细胞与0.3、1.0或3.0mcg/ml乙型肝炎表面抗原温育。使用Delfia增殖测定试剂盒(Perkin Elmer，Boston，MA)，测量抗原引起的细胞增殖。简而言之，给BALB/c小鼠(每组6只小鼠)接种用明矾和100mcgTIM-1抗体佐剂化的Engerix-B^TM。在总体积为0.2ml的完全培养基(RPMI 10％胎牛血清、青霉素-链霉素、β-巯基乙醇)中，在有或没有抗原存在的情况下，通过温育淋巴细胞制剂4天，测量乙型肝炎表面抗原-特异性的脾细胞的增殖。在每个增殖时间点结束之前的24小时，用0.02ml 5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)标记溶液标记在96-孔平底组织培养平板中的细胞。24小时后，离心平板，并取出培养基。将孔中的核酸内容物固定到塑料上，并加入用铕标记的抗-BrdU抗体，以结合整合的BrdU。洗涤孔并加入荧光诱导物后，使用Wallac Victor 2多标记分析仪分析铕荧光，并表达为相对荧光单位(RFU)。测定对照包括没有细胞的孔，没有BrdU的细胞，和没有抗原刺激的细胞。

实验结果表明，商业的乙型肝炎疫苗(Engerix-B^TM，GlaxoSmithKline)的施用，在小鼠中仅仅是较差免疫原性的。该疫苗不能在小鼠中引起细胞介导的免疫反应，且仅仅在免疫接种后3周，检测到针对乙型肝炎抗原的抗体。在接种乙型肝炎疫苗时施用作为佐剂的抗-TIM-1抗体，会在接种疫苗后7天内，导致针对乙型肝炎抗原的抗原-特异性的细胞介导的免疫反应的产生。通过监控再次暴露于抗原的免疫细胞增殖，并通过测量T辅助细胞因子的生产，已经测定了细胞介导的免疫。在接种疫苗时施用作为佐剂的抗-TIM-1抗体，还会在接种疫苗后7天内，导致针对乙型肝炎抗原的抗体的产生。

图5显示了再次刺激后抗原的增殖。给BALB/c小鼠接种单独的Engerix-B^TM(10mcg)或单剂的抗-TIM抗体(50mcg)。在指定的时间，分析脾对乙型肝炎表面抗原的增殖(96小时测定)。尽管单独的疫苗刺激较少的抗原引起的脾细胞和T细胞增殖，但抗-TIM-1抗体极大地增强了对抗原的细胞增殖反应，从而表明增加了细胞免疫。这些结果表明，抗-TIM-1抗体改善了对乙型肝炎疫苗的反应。

图6显示了用抗原再次刺激后细胞因子的生产。用10mcg乙型肝炎疫苗，或用10mcg含有抗-TIM抗体的疫苗，免疫BALB/c小鼠。在第7、14和21天，用乙型肝炎抗原体外刺激脾细胞。96小时后，分别分析上清液中的IFN-γ和IL-4。尽管单独的疫苗刺激较少的抗原引起的IFN-γ生产(一种Th1细胞因子)，但抗-TIM-1抗体极大地增强了该细胞因子的生产，从而表明增加了Th1反应。相反地，IL-4(一种Th2细胞因子)的表达，在所有的时间点都是在背景水平。这些结果表明抗-TIM-1抗体佐剂对干扰素-γ生产起作用。

图7显示了乙型肝炎特异性的抗体的生产。在免疫接种后第7天，测试来自用含有或没有抗-TIM抗体的乙型肝炎疫苗(单剂；50mcg)接种的小鼠的血清样品是否存在对乙型肝炎表面抗原特异性的抗体。尽管在免疫接种后早期，单独的疫苗刺激较少的针对乙型肝炎抗原的抗体反应，但抗-TIM-1抗体会刺激强的抗体反应。这些结果表明，与乙型肝炎疫苗一起使用抗-TIM-1抗体的处理，会诱导针对乙型肝炎抗原的抗体。

图8显示了乙型肝炎表面抗原-特异性的脾细胞的与抗原刺激的剂量依赖性关系的增殖。从用10mcg Engerix-B^TM(含有或没有100mcg TIM-1mAb)接种一次的小鼠分离脾细胞，并在有或没有递增的乙型肝炎表面抗原浓度的情况下培养。培养4天后，使用Delfia细胞增殖测定，分析各孔的增殖。与接种单独的Engerix-B^TM疫苗或同种型对照抗体相比，接受含有TIM-1mAb的疫苗的小鼠产生了统计学上显著的针对特定抗原的反应(p＜0.05)。这些结果表明，抗-TIM-1能增强针对乙型肝炎表面抗原的脾细胞的增殖。

图9显示了用特定抗原刺激后IFN-γ的生产。在针对乙型肝炎表面抗原(HepBsAg)的完整脾细胞中测量了干扰素-γ表达。从上述的增殖测定孔中取出上清液，用于通过ELISA进行的细胞因子分析。与接受单独的疫苗或含有同种型对照抗体的疫苗的小鼠相比，抗原刺激使接受含有TIM-1 mAb的疫苗的小鼠产生了显著更高量的IFN-γ(p＜0.05)。没有检测到IL-4。这些结果表明，作为对乙型肝炎表面抗原的反应，抗-TIM-1能增强IFN-γ表达。

                 实施例VII

         作为HIV抗原的佐剂的抗-TIM-1

在第1和15天，给6-8周龄的C57BL/6小鼠(每组4只)皮下接种单剂的溶于PBS中的HIV p24抗原(25或50mcg)，并腹膜内接种50或100mcg TIM-1mAb、同种型对照抗体或50或100mcg CpG1826(由Invitrogen Corporation；Carlsbad CA合成)寡脱氧核苷酸。CpG 1826寡核苷酸(oligo)是

     TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO：45)

     ZOOFZEFOEZZOOZEFOEZT

第一行是以标准的单字母缩写命名法表示的核苷酸序列。所有的碱基，除了最后的T以外，都被硫代磷酸化修饰。第二行是使用硫代磷酸化的碱基的单字母缩写的序列。代码是F＝A-硫代磷酸化，O＝c-硫代磷酸化，E＝g-硫代磷酸化，Z＝T-硫代磷酸化。然后，在第21天处死小鼠，并收获脾细胞，以测量对抗原的增殖。简而言之，通过在有或没有HIV p24抗原存在的情况下，在总体积为0.2ml的完全培养基(RPMI 10％胎牛血清、青霉素-链霉素、β-巯基乙醇)中培养淋巴细胞制剂4天，测量脾细胞。使用Delfia细胞增殖测定(PerkinElmer)，测定细胞增殖。在培养阶段结束之前24小时，用0.02ml BrdU标记溶液，标记96-孔圆底组织培养平板中的细胞。24小时后，离心平板，并取出培养基。将孔中的核酸内容物固定到塑料上，并加入用铕标记的抗-BrdU抗体，以结合整合的BrdU。使用荧光分析仪，将BrdU的整合表达为铕的相对荧光单位(RFU)。测定对照包括没有细胞的孔、没有BrdU的细胞和单独的载体(磷酸缓冲盐水，PBS)。

图10表明，与同种型对照抗体或CpG寡核苷酸相比，用HIV p24抗原+TIM-1mAb免疫的小鼠产生了显著更高的对抗原的增殖反应(与CpG相比，p＜0.05)。在第1和15天，给小鼠皮下接种单剂的溶于PBS中的HIV p24抗原(50mcg)，并腹膜内地接种100mcg TIM-1mAb、同种型对照抗体或100mcg CpG(1826)寡脱氧核苷酸。然后，在第24天处死小鼠，并收获脾细胞，以测定对抗原的增殖。这些结果表明，抗-TIM-1会增强对HIV p24抗原的增殖反应。

                  实施例VIII

        作为流感接种疫苗的佐剂的抗-TIM-1

给BALB/c小鼠接种含有或没有50mcg/ml抗-TIM-1抗体的单剂(30mcg)的Fluvirin^TM疫苗(Evans Vaccines，Ltd)。在即将注射之前，将抗体与疫苗相混合。用单独的PBS或含有同种型匹配的抗体对照的PBS，处理对照小鼠。在免疫接种后第10天，从每组取小鼠进行分析。简而言之，收获脾和血清，并处理成在补加了β-巯基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、链霉素、两性霉素)的RPMI培养基中的单细胞悬浮液。在有灭活的完整的流感(1mcg/ml，北京品系，H1N1；Research Diagnostics，Inc.，Flanders，New Jersey)存在下，培养处理的脾细胞(3×10⁵细胞)。在37℃、5％CO₂培养96小时后，通过WST-细胞增殖试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，分析活细胞。在96小时后，从这些实验孔收获上清液，并根据生产商的说明书，使用商业的细胞因子ELISA试剂盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。将血清样品稀释至1∶200，并在能检测对流感病毒特异性的抗体的ELISA中分析。

图11显示了脾细胞对流感抗原的增殖反应。用流感疫苗Fluvirin^TM或Fluvirin^TM+抗-TIM-1抗体(单剂；50mcg)免疫了BALB/c小鼠。10天后，在96小时增殖测定中，测量对病毒(H1N1)刺激的反应。单独的PBS和抗-TIM-1抗体是处理对照。尽管作为对抗原的反应，单独的疫苗刺激较少的脾细胞和T细胞增殖，但抗-TIM-1抗体极大地增强了对抗原的细胞增殖反应，从而表明增加了细胞免疫。这些结果显示了抗-TIM-1抗体对流感疫苗接种的佐剂作用。

图12显示了流感免疫的小鼠的细胞因子生产。用30mcg流感疫苗Fluvirin^TM或Fluvirin^TM+抗-TIM抗体(单剂；50mcg)免疫BALB/c小鼠。10天后，制备脾细胞，且在培养(在图12中，从左向右显示了PBS、Fluvirin^TM、抗-TIM-1和Fluvirin^TM+抗-TIM-1)96小时后，测定用病毒(H1N1)再次刺激后Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子的生产。尽管作为对抗原的反应，单独的疫苗刺激较少的IFN-γ生产(一种Th1细胞因子)，但抗-TIM-1抗体极大地增强了该细胞因子的生产，从而表明增加了Th1反应。IL-4生产处于或低于背景。因而，与IFN-γ相反，IL-4(一种Th2细胞因子)的表达处于背景水平。这些结果表明，抗-TIM-1佐剂会引起流感-特异性的Th1细胞因子反应。

                     实施例IX

        抗-TIM-1作为佐剂以产生针对不同流感品系的

                  异源亚型免疫反应

用含有或没有100mcg/ml抗-TIM-1抗体的单剂(10mcg)的北京流感病毒(A/北京/262/95，H1N1)，接种BALB/c小鼠(每组3只)。在即将注射之前，将抗体与抗原相混合。用单独的PBS或含有同种型匹配的(大鼠IgG2b)抗体对照的抗原，处理对照小鼠。在免疫接种后第21天，从每组取小鼠进行分析。简而言之，收获脾和血清，并处理成在补加了β-巯基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、链霉素、两性霉素)的RPMI培养基中的单细胞悬浮液。在有灭活的完整的流感(1mcg/ml、北京品系、H1N1或A/基辅-样301/94-约翰内斯堡/33/94、H3N2；Research Diagnostics，Inc.，Flanders，New Jersey)存在下，培养处理的脾细胞(3×10⁵细胞)。在37℃、5％CO₂培养96小时后，通过Delfia增殖试剂盒(PerkinElmer)，分析活细胞。在培养阶段结束之前24小时，用20μl BrdU标记溶液标记96-孔圆底组织培养平板中的细胞。24小时后，离心平板，并取出培养基。将孔中的核酸内容物固定到塑料上，并加入用铕标记的抗-BrdU抗体，以结合整合的BrdU。使用荧光分析仪，将BrdU的整合表达为铕的相对荧光单位(RFU)。测定对照包括没有细胞的孔、没有BrdU的细胞和没有抗原性刺激的细胞。在96小时后，从这些实验孔收获上清液，并根据生产商的说明书，使用商业的细胞因子ELISA试剂盒(R&DSystems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。

图13显示了针对北京病毒(A)或基辅病毒(B)的刺激的北京-免疫的小鼠的增殖反应。在有或没有100mcg TIM-1mAb或同种型对照(大鼠IgG2b)存在的情况下，用10mcg灭活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收获脾，以进行体外分析。使用TIM-1mAb增强了增殖，且对基辅刺激作出的响应证实了交叉品系免疫(p＜0.01)。这些结果表明，抗-TIM-1会增强针对流感A的脾细胞增殖，并刺激交叉品系免疫。

图14显示了北京-免疫的小鼠针对北京病毒(A)或基辅病毒(B)的刺激的细胞因子反应。在有或没有100mcg TIM-1mAb或同种型对照(大鼠IgG2b)存在的情况下，用10mcg灭活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收获脾，用于进行体外分析。分析来自增殖测定的上清液是否存在IFN-γ。小图A表明，TIM-1mAb的加入显著(p＜0.01)增强了北京病毒(H1N1)刺激引起的IFN-γ的生产。小图B表明，TIM-1mAb的加入也显著(p＜0.01)增强了用异源亚型基辅品系(H3N2)刺激引起的IFN-γ的生产。这些结果表明，抗-TIM-1会增强交叉品系免疫。

图15显示了北京-免疫的小鼠针对北京病毒(A)或基辅病毒(B)的刺激的IL-4细胞因子生产。在有或没有100mcg TIM-1mAb或同种型对照(大鼠IgG2b)存在的情况下，用10mcg灭活的北京流感病毒免疫BALB/c小鼠。21天后，收获脾，用于进行体外分析。分析来自增殖测定的上清液是否存在IL-4。小图A表明，TIM-1mAb的加入显著(p＜0.01)增强了北京病毒(H1N1)刺激引起的IL-4的生产。小图B表明，TIM-1mAb的加入也显著(p＜0.01)增强了用异源亚型基辅品系(H3N2)刺激引起的IL-4的生产。这些结果表明，在流感A刺激的脾细胞中，抗-TIM-1增强了IL-4表达。

                    实施例X

    作为炭疽接种疫苗的佐剂的抗-TIM-1和抗-TIM-3

给C57BL/6小鼠接种单剂(40mcg)的含有或没有50mcg/ml抗-TIM-3抗体的重组保护性抗原(rPA，List Biological Laboratories；Campbell CA)。在即将注射前，将抗体和抗原和作为佐剂的1.2mg/ml氢氧化铝相混合。用溶于PBS中的氢氧化铝或含有同种型匹配的抗体对照的介质处理对照小鼠。在免疫接种后第10天，从每组取小鼠进行分析。简而言之，收获脾和血清，并处理成在补加了β-巯基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、链霉素、两性霉素)的RPMI培养基中的单细胞悬浮液。在有rPA(1mcg/ml，Research Diagnostics，Inc.，Flanders，New Jersey)存在下，培养处理的脾细胞(3×10⁵细胞)。在37℃、5％CO₂培养96小时后，通过WST-细胞增殖试剂盒(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)，分析活细胞。另外，在96小时后，从这些实验孔收获上清液，并根据生产商的说明书，使用商业的细胞因子ELISA试剂盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。将血清样品稀释至1∶200，并在能检测对rPA抗原特异性的抗体的ELISA中分析。

或者，给C57BL/6小鼠接种单剂(0.2ml)的含有或没有50mcg/ml抗-TIM-1抗体的BioThrax^TM(AVA；Bioport，Lansing，MI)。在即将注射前，将抗体和抗原和作为佐剂的1.2mg/ml氢氧化铝相混合。用单独的BioThrax^TM疫苗或含有同种型匹配的抗体对照的BioThrax^TM疫苗处理对照小鼠。在免疫接种后第7天，从每组取小鼠进行分析，并收集血清样品。将血清样品稀释至1∶200，并在能检测对rPA抗原特异性的抗体的ELISA中分析。另外，在第15天收获脾，处理成在补加了β-巯基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、链霉素、两性霉素)的RPMI培养基中的单细胞悬浮液。在有rPA(1mcg/ml，Research Diagnostics，Inc.，Flanders，New Jersey)存在下，培养处理的脾细胞(3×10⁵细胞)。在37℃、5％CO₂培养96小时后，通过WST-细胞增殖试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，分析活细胞。另外，在96小时后，从这些实验孔收获上清液，并根据生产商的说明书，使用商业的细胞因子ELISA试剂盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。

图16显示了接种疫苗后的抗-rPA抗体反应。用0.2ml AVA(炭疽疫苗吸附的)BioThrax^TM或BioThrax^TM+抗-TIM-1抗体免疫C57BL/6小鼠。7天后，在ELISA中，测量对rPA特异性的总血清抗体。单独的BioThrax^TM和BioThrax^TM+同种型匹配的抗体是处理对照。尽管单独的疫苗刺激较少的针对炭疽抗原的抗体反应，但抗-TIM-1抗体刺激了显著升高的抗体反应。这些结果表明，BioThrax^TM+抗-TIM-1会增加抗体生产。

图17显示了炭疽接种疫苗的抗-TIM佐剂作用。用重组的保护性抗原(rPA；40mcg)或rPA+抗-TIM-3抗体(单剂；50mcg)免疫C57BL/6小鼠。10天后，在96小时增殖测定中，测量脾细胞对rPA再次刺激的反应。PBS和rPA+同种型匹配的对照抗体是处理对照。这些结果显示了对炭疽接种疫苗的抗-TIM-3佐剂作用。

                      实施例XI

        作为利斯特氏菌接种疫苗的佐剂的抗-TIM-1

给C57BL/6小鼠接种单剂的含有或没有50mcg/ml抗-TIM-1抗体的热杀死的单核细胞增生利斯特氏菌(HKLM)。在注射前，将抗体与抗原和氢氧化铝(作为佐剂)相混合。用溶于PBS中的氢氧化铝、单独的PBS或含有同种型匹配的抗体对照的载体处理对照小鼠。在免疫接种后第10天，从每组取小鼠进行分析。简而言之，收获脾和血清，处理成在补加了β-巯基乙醇、10％FBS和抗生素(青霉素、链霉素、两性霉素)的RPMI培养基中的单细胞悬浮液。在有1mcg/mlHKLM存在下，培养处理的脾细胞(3×10⁵细胞)。在37℃、5％CO₂培养96小时后，通过WST-细胞增殖试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，分析活细胞。在96小时后，从这些实验孔收获上清液，并根据生产商的说明书，使用商业的细胞因子ELISA试剂盒(R&D Systems)，分析是否存在IFN-γ和IL-4。将血清样品稀释至1∶200，并在能检测对HKLM特异性的抗体的ELISA中分析。

                  实施例XII

    作为癌症疫苗的佐剂且作为治疗肿瘤的治疗剂的

         TIM-1/Fc、TIM-4/Fc和抗-TIM-1

给C57BL/6或BALB/c小鼠皮下注射10⁶γ-照射的或丝裂霉素-处理的B16.F10(黑素瘤)、EL4(胸腺瘤)或p815(肥大细胞瘤)细胞。在用灭活的肿瘤细胞接种疫苗时，还用0.1mg大鼠抗-小鼠TIM-1或TIM-l/Fc皮下地或腹膜内地处理动物。用等量的大鼠或小鼠IgG2a处理对照小鼠。14天后，重复该接种疫苗规程。在第20天，用10⁵-10⁶活肿瘤细胞(为每种肿瘤类型进行滴定，以在没有处理时产生100％肿瘤发病率：B16.F10：5×10⁵细胞；P815和EL4：10⁶细胞)攻击小鼠，并每2天一次监控肿瘤发病率和大小。

在实验中采用的小鼠和细胞系是在送递时8-10周龄的C57BL/6、DBA/2或BALB/c雌性小鼠。EL4胸腺瘤、B16F10黑素瘤和P815肥大细胞瘤肿瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并如ATCC所推荐的，在补加了10％(v/v)热灭活的胎牛血清(Gemini Bio-Products，Woodland，CA)和1000mcg/ml青霉素G钠、1000mcg/ml硫酸链霉素和2.5mcg/ml两性霉素B(抗生素-抗真菌剂，Gibco Invitrogen Corp.)的DMEM或RPMI 1640培养基(Gibco Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中培养。当标明时，用Model C-188钴-60源(MDS-Nordion，Ottawa，ON，加拿大)发射的20,000拉德γ-放射线照射肿瘤细胞。

对于动物处理，首先剪掉小鼠右侧皮肤上的毛，然后注射单独的磷酸缓冲盐水(PBS，Sigma，St.Louis，MO)、100mcg克隆1或克隆2抗-TIM-1抗体或10⁶γ-照射的EL4、B16F10或P815细胞+100mcg溶于PBS载体中的克隆1或克隆2抗体。在给动物注射各自数目的从对数生长期的培养物新鲜制备的活肿瘤细胞(见上)前10、17和32天，进行这些注射。在剪毛的左侧皮肤施用肿瘤攻击注射。通过皮下途径，在100μl体积中，使用26-号、5/8-英寸皮下斜角皮下注射针(BD Medical Systems，Franklin Lakes，NJ)完成送递所有攻击和攻击前(pre-challenge)注射。

对于肿瘤测量和统计学分析，皮下送递肿瘤攻击细胞后10、13、17、23和26天，用数字测径器(Mitutoyo America Corp.，Aurora，IL)测量在肿瘤-攻击的小鼠的左侧皮肤下生长的肿瘤。在3个大致垂直的轴上，收集以毫米为单位的肿瘤测量值，代表肿瘤长度(L)、宽度(W)和距离周围身体轮廓的高度(H)。使用式：体积＝[(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)]，计算肿瘤体积。使用Microsoft Excel软件，确定平均值的标准误(SEM)和斯氏t检验概率(p)值。

如图20所示，用接种疫苗送递抗-TIM-1抗体，会引起完全的肿瘤排斥。在肿瘤攻击前10、17和32天，给小鼠注射标示的材料。以每次注射10⁶细胞，送递γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞。以每次注射100mcg，送递抗-TIM-1抗体。通过皮下送递100μl体积到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右侧皮肤，完成所有注射。在第0天，在100μl体积的PBS中送递，皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞到剪毛的左侧皮肤攻击小鼠。显示了攻击后第26天的数据。这些结果表明，用接种疫苗送递抗-TIM-1抗体，会引起完全的肿瘤排斥。

如图21所示，在用活肿瘤细胞攻击后，补加了抗-TIM-1抗体的疫苗会极大地抑制肿瘤生长。在用标示的材料进行肿瘤攻击前10、17和32天，注射小鼠。以每次注射10⁶细胞，送递γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞。以每次注射100mcg，送递抗-TIM-1抗体。通过皮下送递100μl体积到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右侧皮肤，完成所有注射。在第0天，在100μl体积的PBS中送递，皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞到剪毛的左侧皮肤攻击小鼠。经26天后，测量肿瘤体积，并使用不配对的、双尾斯氏t检验(unpaired，two-tailedStudent’s t test)计算，确定统计学显著性。这些结果表明，在用活肿瘤细胞攻击后，补加了抗-TIM-1抗体的疫苗会极大地抑制肿瘤生长。

如图22所示，在用活肿瘤细胞攻击后，补加了抗-TIM-1抗体的疫苗会极大地抑制肿瘤生长。在用标示的材料进行肿瘤攻击前10、17和32天，注射小鼠。以每次注射10⁶细胞，送递γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞。以每次注射100mcg，送递抗-TIM-1抗体。通过皮下送递100μl体积到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右侧皮肤，完成所有注射。在第0天，在100μl体积的PBS中送递，皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞到剪毛的左侧皮肤攻击小鼠。26天后，测量肿瘤体积，并使用不配对的、双尾斯氏t检验计算，确定统计学显著性。显示了攻击后第26天的数据。这些结果表明，在用活肿瘤细胞攻击后，补加了抗-TIM-1抗体的疫苗会极大地抑制肿瘤生长。

如图23所示，在活肿瘤细胞攻击前，用抗-TIM-1抗体预处理动物，会显著抑制肿瘤生长。在肿瘤攻击前10、17和32天，注射小鼠，每次注射100mcg抗-TIM-1抗体。通过皮下送递100μl体积到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右侧皮肤，完成所有注射。在第0天，在100μl体积的PBS中送递，皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞到剪毛的左侧皮肤攻击小鼠。经26天后，测量肿瘤体积，并使用不配对的、双尾斯氏t检验计算，确定统计学显著性。这些结果表明，在活肿瘤细胞攻击前，用抗-TIM-1抗体预处理动物，会显著抑制肿瘤生长。

如图24所示，在活肿瘤细胞攻击前，用抗-TIM-1抗体预处理动物，会显著限制肿瘤生长。在肿瘤攻击前10、17和32天，给小鼠注射100mcg抗-TIM-1抗体。以每次注射10⁶细胞，送递γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞。通过皮下送递100μl体积到C57BL/6雌性小鼠的剪毛的右侧皮肤，完成所有注射。在第0天，在100μl体积的PBS中送递，皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞到剪毛的左侧皮肤攻击小鼠。26天后，测量肿瘤体积，并使用不配对的、双尾斯氏t检验计算，确定统计学显著性。显示了攻击后第26天的数据。这些结果表明，在活肿瘤细胞攻击前，用抗-TIM-1抗体预处理动物，会显著限制肿瘤生长。

如图25所示，抗-TIM-1会增强肿瘤疫苗有效性。C57BL/6小鼠接受通过皮下注射送递的含有10⁶γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞的初次接种疫苗。同时，腹膜内地送递100μl磷酸缓冲盐水(PBS)载体对照或溶于100μl PBS载体中的100mcg抗-TIM-1抗体或100mcg rIgG2b同种型对照抗体。初次接种疫苗后3周，小鼠接受用相同制剂的首次加强。2周后，进行第二次相同加强。第二次加强后11天，通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，送递到接种疫苗和加强给药的对侧位点，来攻击小鼠。在所有情况下，在攻击后10天，接受活肿瘤细胞的小鼠发展了可测量的肿瘤块。在活肿瘤细胞攻击后19天期间，使用数字测径器在几个点测量肿瘤直径。在每个时间点，记录每个肿瘤的3个大致垂直的轴的直径：长度(L)、宽度(W)和高度(H)。使用式：体积(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，计算肿瘤体积。使用Microsoft Excel，计算治疗组平均肿瘤体积。通过斯氏t检验确定P值，其使用Microsoft Excel计算。抗-TIM-1单克隆抗体购自R&D Systems Inc.(Minneapolis MN)(mAb AF1817)。这些结果表明，抗-TIM-1会增强肿瘤疫苗有效性。

如图26所示，接种抗-TIM-1佐剂会驱动保护性免疫的产生。通过皮下注射送递，给首次用于实验的C57BL/6小鼠接种单独溶于100μl磷酸缓冲盐水(PBS)中的10⁶γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞，或与溶于100μl PBS中的100mcg抗-TIM-1抗体或100mcgrIgG2a同种型对照抗体的混合物。15天后，使用相同的方法进行加强。在第一次之后7天，通过相同方法进行第二次加强。该第二次加强后10天，用皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，送递到接种疫苗和加强给药的对侧位点，来攻击小鼠。在用活肿瘤细胞攻击后31天，从排斥EL4肿瘤攻击的小鼠回收脾细胞。类似地，还从rIgG2a对照组小鼠和年龄匹配的首次用于实验的C57BL/6小鼠，回收脾细胞。体外红细胞去除后，通过尾静脉注射，将来自抗-TIM-1、rIgG2a或首次用于实验的小鼠的10⁷脾细胞过继性转移进首次用于实验的C57BL/6受体动物。转移后1天，通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞攻击受体小鼠。过继性转移后18天，评价小鼠在以前的皮下活肿瘤攻击位点的皮肤下是否存在可触知的肿瘤块。将没有呈现可检测的肿瘤块的动物视作没有肿瘤，并表示为接受相同的过继性转移处理的全部动物的百分比。这些结果表明，过继性转移会诱导肿瘤排斥。

如图27所示，抗-TIM-1治疗会减缓肿瘤生长。通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，来攻击首次用于实验的C57BL/6小鼠，然后在6天后，用腹膜内注射一次100mcg抗-TIM-1抗体，或100mcgrIgG2a对照抗体，进行处理。送递抗-TIM-1或对照抗体处理后15天，测量各动物肿瘤。为每个肿瘤的3个大致垂直的轴，记录肿瘤直径：长度(L)、宽度(W)和高度(H)。使用式：体积(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，计算肿瘤体积。使用MicrosoftExcel软件，计算组平均肿瘤体积和每个计算的平均值的标准误(SEM)。通过斯氏t检验确定P值，其使用Microsoft Excel计算。这些结果表明，抗-TIM-1治疗会减缓肿瘤生长。

已经证实，抗-TIM-1和TIM-4/Fc二者都能增强Th1免疫(见实施例XIV)。因此，TIM-4/Fc能起肿瘤疫苗佐剂和治疗肿瘤的治疗剂的作用，如实施例XII所示的实验研究所证实的。

               实施例XIII

    作为癌症疫苗的佐剂且作为治疗肿瘤的治疗剂的

             TIM-3/Fc和抗-TIM-3

本实施例描述了TIM-3/Fc和抗-TIM-3对于癌症疫苗和肿瘤的治疗性治疗的佐剂活性。

如图28所示，当用作疫苗佐剂时，TIM-3-特异性的抗体会减少肿瘤生长。首次用于实验的C57BL/6小鼠接受用单独溶于100μl磷酸缓冲盐水(PBS)载体中的10⁶γ-照射的(20,000拉德)EL4肿瘤细胞，或与溶于PBS中的100mcg抗-TIM-3抗体或100mcg rIgG2a同种型对照抗体的混合物的初次接种。初次接种后2周，小鼠接受与初次接种相同的加强注射。该加强后10天，通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，送递到接种疫苗和加强给药的对侧位点，来攻击小鼠。在所有情况下，在攻击后10天，接受活肿瘤细胞的小鼠发展了可测量的肿瘤块。在肿瘤攻击后36天期间，使用数字测径器测量肿瘤直径。在几个时间点，记录每个肿瘤的3个大致垂直的轴的肿瘤直径：长度(L)、宽度(W)和高度(H)。使用式：体积(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，计算肿瘤体积。使用MicrosoftExcel，计算治疗组平均肿瘤体积。这些结果表明，在有抗-TIM-3存在下，肿瘤接种疫苗会抑制肿瘤生长。

如图29所示，抗-TIM-3治疗会限制肿瘤生长。通过皮下注射10⁶活EL4肿瘤细胞，来攻击首次用于实验的C57BL/6小鼠，然后在9天后，通过腹膜内注射一次100mcg抗-TIM-3抗体或100mcgrIgG2a同种型对照抗体，进行处理。在用抗-TIM-3或对照抗体处理后的几个时间点，使用数字测径器，在治疗时测量各动物肿瘤。记录每个肿瘤的3个大致垂直的轴的肿瘤直径：长度(L)、宽度(W)和高度(H)。使用式：体积(V)＝(4/3)·π·(L/2)·(W/2)·(H/2)，计算肿瘤体积。使用Microsoft Excel，计算治疗组平均值和每个计算平均值的标准误(SEM)。通过双向(two-way)ANOVA统计学分析确定P值，其使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software；San Diego CA)计算。这些结果表明，抗-TIM-3治疗会限制肿瘤生长。

已经证实，抗-TIM-3和TIM-3/Fc二者都能增强Th1免疫，并加剧Th1疾病模型中的疾病(Monney等，Nature 415：536-541(2002)；Sabatos等，Nature Immunol.4：1102-1110(2003))。因此，TIM-3/Fc能起肿瘤疫苗佐剂和治疗肿瘤的治疗剂的作用，如图28和29所示的实验研究所证实的。

                     实施例XIV

      抗-TIM-1和TIM-4/Fc都会刺激对小鼠中Th1驱动的

         免疫反应的免疫反应

用100mcg在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的PLP139-151肽，免疫6-8周龄的雌性SJL/J小鼠(Jackson Laboratories)的右侧和左侧，以刺激针对该肽的Th1免疫反应。注射溶于CFA中的PLP139-151后，静脉内地(i.v.)(尾静脉)注射100ng百日咳毒素。48小时后，施用100ng百日咳毒素的第二次给药。用PLP免疫接种后，腹膜内地(i.p.)施用IgG2a同种型对照抗体(100mcg/小鼠)、TIM-1单克隆抗体(100mcg)或TIM-4/Fc。监控动物对抗原的免疫学反应的发展。结果表明，TIM-1抗体和TIM-4/Fc都会刺激针对PLP肽的免疫反应，如通过测量再次暴露于PLP肽引起的T细胞增殖和通过IL-4和IFN-γ细胞因子ELISA所监控到的。

这些结果表明，TIM靶向分子，例如抗-TIM-1抗体，可以用于抑制肿瘤生长。

                     实施例XV

表达TIM-1和TIM-3以及TIM配体的小鼠和人肿瘤细胞系

通过荧光激活细胞分类术(FACS)分析，分析了小鼠和人肿瘤细胞系的TIM-1和TIM-3表达。在有对照、TIM-1或TIM-3单克隆抗体存在下，温育培养的肿瘤细胞系，并通过使用荧光标记直接缀合TIM抗体或通过使用荧光标记的第二抗体，检测TIM-特异性的抗体的结合。在人肾腺癌细胞系769-P(图33)以及人肝细胞癌HepG2上，检测到TIM-1表达。还在小鼠肾腺癌RAG上检测到TIM-1表达。在几种不同的肿瘤，包括胸腺瘤和淋巴瘤上，检测到TIM-3表达，如图35所示，并总结在图36中。使用TIM-3/Fc，还分析了肿瘤细胞系上的TIM-3配体的表达。如图36所总结的，鉴定了表达TIM-3配体(TIM-3L)的各种肿瘤，包括胸腺瘤、淋巴瘤和肥大细胞瘤。

贯穿本申请中，已经参考了各种出版物。这些出版物的公开内容，在本申请中整体引作参考，以更完整地描述本发明所属领域的状态。尽管已经参考上面提供的实施例描述了本发明，应当理解，可以进行各种修改，而不脱离本发明的精神。

Claims (122)

1.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。

2.权利要求1的组合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

3.权利要求2的组合物，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

4.权利要求1的组合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

5.权利要求4的组合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

6.权利要求4的组合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

7.权利要求4的组合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

8.权利要求1的组合物，其中所述抗原选自病毒、细菌、寄生物和肿瘤相关抗原。

9.一种组合物，其包含缀合到治疗或诊断部分上的TIM靶向分子。

10.权利要求9的组合物，其中所述治疗部分选自化疗剂、细胞毒性的试剂和毒素。

11.权利要求10的组合物，其中所述细胞毒性的试剂是放射性核素或化合物。

12.权利要求11的组合物，其中所述化合物选自加利车霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法仑、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、长春地辛、顺铂、依托泊苷、博来霉素、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶。

13.权利要求11的组合物，其中所述放射性核素是碘-131或钇-90。

14.权利要求10的组合物，其中所述毒素是植物或细菌毒素。

15.权利要求14的组合物，其中所述植物毒素选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。

16.权利要求14的组合物，其中所述细菌毒素选自假单胞菌外毒素和白喉毒素。

17.权利要求9的组合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

18.权利要求17的组合物，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

19.权利要求9的组合物，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

20.权利要求19的组合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

21.权利要求19的组合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

22.权利要求19的组合物，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

23.刺激个体中的免疫反应的方法，其包含施用一种组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。

24.权利要求23的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

25.权利要求24的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

26.权利要求23的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

27.权利要求26的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

28.权利要求23的方法，其中所述抗原选自病毒、细菌、寄生物和肿瘤相关抗原。

29.权利要求28的方法，其中所述抗原是肽。

30.预防性治疗疾病的方法，其包含给个体施用组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。

31.权利要求30的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

32.权利要求31的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

33.权利要求30的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

34.权利要求33的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

35.权利要求30的方法，其中所述疾病是传染病。

36.权利要求35的方法，其中所述抗原选自病毒、细菌和寄生物抗原。

37.权利要求30的方法，其中所述疾病是癌症。

38.权利要求37的方法，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。

39.改善与疾病有关的病征或症状的方法，其包含给个体施用组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的抗原和TIM靶向分子。

40.权利要求39的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

41.权利要求39的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

42.权利要求39的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

43.权利要求42的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

44.权利要求39的方法，其中所述疾病是传染病。

45.权利要求44的方法，其中所述抗原选自病毒、细菌和寄生物抗原。

46.权利要求39的方法，其中所述疾病是癌症。

47.权利要求46的方法，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。

48.靶向肿瘤的方法，其包含给受试者施用TIM靶向分子，其中所述肿瘤表达TIM或TIM配体。

49.权利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子与抗原一起施用。

50.权利要求49的方法，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。

51.权利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

52.权利要求51的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

53.权利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

54.权利要求53的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

55.权利要求53的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

56.权利要求53的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

57.权利要求48的方法，其中所述肿瘤选自癌、肉瘤和淋巴瘤。

58.权利要求48的方法，其中所述的TIM靶向分子缀合到治疗部分上。

59.权利要求58的方法，其中所述治疗部分选自化疗剂、细胞毒性的试剂和毒素。

60.权利要求59的方法，其中所述细胞毒性的试剂是放射性核素或化合物。

61.权利要求60的方法，其中所述化合物选自加利车霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法仑、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、长春地辛、顺铂、依托泊苷、博来霉素、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶。

62.权利要求60的方法，其中所述放射性核素是碘-131或钇-90。

63.权利要求59的方法，其中所述毒素是植物或细菌毒素。

64.权利要求63的方法，其中所述植物毒素选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。

65.权利要求63的方法，其中所述细菌毒素选自假单胞菌外毒素和白喉毒素。

66.权利要求58的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

67.权利要求66的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

68.权利要求58的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

69.权利要求68的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

70.权利要求68的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

71.权利要求68的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

72.抑制肿瘤生长的方法，其包含给受试者施用TIM靶向分子，其中所述肿瘤表达TIM或TIM配体。

73.权利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子与抗原一起施用。

74.权利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

75.权利要求74的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

76.权利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

77.权利要求76的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

78.权利要求76的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

79.权利要求76的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

80.权利要求72的方法，其中所述肿瘤选自癌、肉瘤和淋巴瘤。

81.权利要求72的方法，其中所述的TIM靶向分子缀合到治疗部分上。

82.权利要求81的方法，其中所述治疗部分选自化疗剂、细胞毒性的试剂和毒素。

83.权利要求82的方法，其中所述细胞毒性的试剂是放射性核素或化合物。

84.权利要求83的方法，其中所述化合物选自加利车霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法仑、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、长春地辛、顺铂、依托泊苷、博来霉素、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶。

85.权利要求83的方法，其中所述放射性核素是碘-131或钇-90。

86.权利要求82的方法，其中所述毒素是植物或细菌毒素。

87.权利要求86的方法，其中所述植物毒素选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。

88.权利要求86的方法，其中所述细菌毒素选自假单胞菌外毒素和白喉毒素。

89.权利要求81的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

90.权利要求89的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

91.权利要求81的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

92.权利要求91的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

93.权利要求91的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

94.权利要求91的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

95.检测肿瘤的方法，其包含给受试者施用缀合到诊断部分上的TIM靶向分子，其中所述肿瘤表达TIM或TIM配体。

96.权利要求95的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

97.权利要求96的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

98.权利要求95的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

99.权利要求98的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

100.改善与自身免疫病有关的病征或症状的方法，其包含给受试者施用TIM靶向分子。

101.权利要求100的方法，其中所述的自身免疫病选自类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、全身性红斑狼疮和自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)。

102.权利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子与抗原一起施用。

103.权利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

104.权利要求103的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

105.权利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

106.权利要求105的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

107.权利要求105的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是非靶细胞去除性的。

108.权利要求105的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

109.权利要求100的方法，其中所述的TIM靶向分子缀合到治疗部分上。

110.权利要求109的方法，其中所述治疗部分选自化疗剂、细胞毒性的试剂和毒素。

111.权利要求110的方法，其中所述细胞毒性的试剂是放射性核素或化合物。

112.权利要求111的方法，其中所述化合物选自加利车霉素、esperamicin、倍癌霉素、阿霉素、美法仑、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、阿糖胞嘧啶、长春地辛、顺铂、依托泊苷、博来霉素、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶。

113.权利要求111的方法，其中所述放射性核素是碘-131或钇-90。

114.权利要求110的方法，其中所述毒素是植物或细菌毒素。

115.权利要求114的方法，其中所述植物毒素选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素和gelonin。

116.权利要求14的方法，其中所述细菌毒素选自假单胞菌外毒素和白喉毒素。

117.权利要求109的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM抗体。

118.权利要求117的方法，其中所述的TIM抗体对选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的TIM是特异性的。

119.权利要求109的方法，其中所述的TIM靶向分子是TIM-Fc融合多肽。

120.权利要求119的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分是靶细胞去除性的。

121.权利要求119的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的Fc部分非靶细胞去除性的。

122.权利要求119的方法，其中所述的TIM-Fc融合多肽的TIM部分选自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4。

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