CN1522154A - 包含作为佐剂的i型ifn的疫苗和涉及它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及I型IFN在制备用来增强在体内保护性免疫接种处理中对疫苗的TH－1型体液免疫应答的无毒佐剂组合物中的应用，其中，每个疫苗剂量应用的IFN剂量大于或等于100.000U/ml。本发明进一步涉及一种分部分的试剂盒，它包括包含I型IFN的无毒佐剂组合物和含有至少一种抗原的疫苗，供预防或治疗与所述抗原的存在相关的疾病时分别、同时或依次使用。

Description

包含作为佐剂的I型IFN的疫苗 和涉及它们的方法
发明领域
本发明涉及疫苗，特别是亚单位疫苗。
发明背景
疫苗是本领域已知的。通常，它们包括灭活的或减毒的病原体和亚单位疫苗，施用它们是为了预防、减轻或治疗传染病。
具体地说，亚单位疫苗是基于来自病原体组分的抗原的疫苗，所述组分被认为是对于由宿主免疫系统介导的保护作用重要的靶。虽然证明是高度安全的，但亚单位疫苗通常因下列实事而导致不适当的免疫应答，即，作为它们的基础的抗原要么是差免疫原性的，要么是非免疫原性的。
于是，为了提高免疫原性，亚单位疫苗通常需要包含佐剂或者需要与佐剂一起施用。佐剂的定义是，它是这样一种物质，当该物质与抗原一起施用时，产生比单独的抗原更有效的免疫应答。
虽然已有很多类佐剂用于动物模型中，而且佐剂的典型实例包括，油乳液，铝盐或钙盐，皂苷和LPS衍生的产物，但目前，基于铝的无机盐是常规含于人用疫苗制剂中的仅有佐剂。虽然安全，但这样的盐是用于抗体诱导的弱佐剂，所以不能刺激典型的细胞介导的免疫应答。
需要诱导抗体和细胞介导的应答这两者来提供对入侵病原体高度有效的防御从而限制它们的扩散或消灭它们。疫苗需要提供或诱导2类信号以便激发强烈的、保护性的免疫应答。首先，疫苗需要输送抗原，后者触发T淋巴细胞和B淋巴细胞上的抗原特异性的受体。其次，有效的疫苗需要诱导通过呈递抗原细胞对共同刺激分子的表达，它们随后促进抗原触发的淋巴细胞的强烈应答。当应用含活病原体的疫苗时，所述第二种信号通常是由与感染相关的因子提供的，但是通常在亚单位疫苗中缺乏活病原体，导致它们的差免疫原性。添加可贡献所述第二种信号的佐剂将增强疫苗的效果，而且另外可决定激发的免疫应答的类别。
这些信号对宿主的免疫系统的指导作用能够随后发展效应机制，该机制可表征对给定的感染剂的总免疫应答的类别和功效。
细胞因子在对抗原和感染剂的免疫应答过程中代表T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞和其它免疫细胞之间的通讯所涉及的主要因子。一些对小鼠和人T辅助(Th)克隆的研究为Th细胞(称为Th1和Th2)表现的不同活性的存在提供了大量证据，这是从细胞因子分泌的分布图推导的。因此，IFN-γ或IL-4的产生分别被认为是Th1或Th2应答的典型标志。Th1型免疫应答通常与小鼠内IgG2a产生和细胞免疫的发生相关，而Th2型应答通常则与IgE产生，嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生相关。人们通常认为，Th1型免疫应答的诱导有助于对病毒和某些细菌感染产生保护性免疫应答。在这方面，值得一提的是，临床可获得的佐剂(例如，基于铝的无机盐)倾向于诱导Th2型免疫应答，而某些Th1促进佐剂的应用通常受毒性或安全问题的限制。
上述意义上高度有效的佐剂的缺乏对于成功开发疫苗(特别是针对需要细胞免疫的胞内病原体的那些疫苗)构成严重障碍。
因此，尽管可获得可能有效的重组抗原，但对于接种的弱反应性或没有反应性和患者顺应性仍保持对预防性或治疗性亚单位疫苗的较多关注。亚单位疫苗的弱免疫原性使得有必要多次接种这些疫苗以便激发令人满意的应答，使患者顺应性的缺乏成为严重问题。
所以，实际上长期感到需要这种佐剂，即，即使在一次剂量后，也可改善抗原免疫原性和一贯地促进强烈的免疫应答，减少诱导血清转变/血清保护率所需的疫苗剂量的数目。
在这方面，由于上文表现的性质，本领域中细胞因子被认为是可能的佐剂。其中特别是干扰素(IFN)受到一定的关注。
现在，人们公认IFNs是由各种细胞响应病毒感染或其它刺激而分泌的复杂的一族抗病毒蛋白质，它们表现多重生物活性。根据它们借以诱导它们的生物活性的受体系统将它们分为两大类：
i)I型IFNs，它们包括IFN-α，IFN-β和IFN-ω的至少13个功能亚类的IFN-α族；
ii)II型IFN，也称为IFN-γ。
最初被认为是简单的抗病毒物质，后来证实I型IFNs表现多种生物效应，包括在试验模型和患者中的抗肿瘤活性。早期研究报导了I型IFN对体外和体内免疫应答的几个效应。然而，有人对这些研究中的一些持有某些怀疑，因为在很多情况下IFN制剂仍然不纯。长期以来，人们通常认为I型IFN对免疫系统的效应就其重要性来说比不上II型IFN(被认为是保护性细胞介导的免疫应答的主要介体，这符合它的“免疫IFN”原始定义)表现的那些效应。
还证实I型IFNs对体外抗体产生和T细胞增殖发挥有效力的抑制效果，引起了这个问题，即，这些细胞因子在体内将以刺激方式还是抑制方式起作用？值得一提的是，一些作者最近强调I型IFN的可能的免疫抑制效应。该概念甚至导致在HIV-1感染的患者中的临床应用，它基于中和被认为是疾病进行中涉及的推定免疫抑制因子的内源性IFN这一基本原理。另一方面，在不同模型系统中获得的系综数据最近已经指出了I型IFN在如下方面的重要性，即，诱导Th1型免疫应答和支持某些T细胞亚群的增殖、机能活动和存活率(Belardelli F.和Gresser I.，I型干扰素在T细胞应答中的被忽视的作用：它的临床应用的意义，今日免疫学(Immunol Today)17：369～372，1996；以及Tough DF，Borrow P和Sprent J.，病毒和I型干扰素在体内诱导的在场T细胞增殖，科学(Science)272：1947～1950，1996)。
I型干扰素目前是临床实践中最常用的细胞因子。具体地说，在全世界40个以上的国家中应用IFN-α来治疗某些病毒病(特别是丙型肝炎)和人类各种癌症，包括一些血液恶性肿瘤(多毛细胞白血病、慢性髓细胞白血病、一些B细胞和T细胞淋巴瘤)和某些实体瘤，例如，黑素瘤、肾癌和卡波西肉瘤。反之，IFN-γ则遭遇了差临床应用情况，主要是由于毒性。在过去数年中，一些研究提供的证据说明，在不同试验模型中，I型和II型IFNs发挥的生物效应在活性类别方面可能基本不同。在某些情况下，例如，黑素瘤和多发性硬化，IFN-γ的临床应用导致了与I型IFN达到的那些效应相反的效应。
尽管它的广泛临床应用，但I型IFN还没有用作疫苗佐剂。这是由于，关于I型IFN在调节免疫应答中的作用和重要性的现有技术状况还使人糊涂和引起争议。
仅仅对于II型IFN(即，IFN-γ)显示了IFNs在体内作为疫苗中的佐剂的相关应用。具体在EP 0241725中，描述了一种含粗蛋白提取物的疫苗，来自感染了Plasmodium yoelii的致病性强的YM系的小鼠血细胞，它包含作为佐剂的IFN-γ。指出了疫苗中包含的IFN-γ的量在每剂量1.000～10.000U范围内，其中，指出产生辅助效果的IFN-γ的量在100～50.000U范围内。即使指出了低于200单位的剂量也是有效的，但应用的剂量是5.000U。
虽然一些现有技术文献展望了I型IFN作为佐剂的应用，但是没有证实或启示当用作疫苗佐剂时I型IFN在增强体内保护性Th-1型响应的任何功效的证据。
其实，在WO/8704076中，公开了通过用传染性牛鼻气管炎(IBR)病毒感染牛犊的研究提出了利用IFN-α间接增强免疫应答的可能性。
具体地说，按照WO/8704076，以不大于每天约5IU/磅体重的很低剂量(优选的剂量是1IU/磅体重)优选通过经口途径施用IFN-α。不但这些量太低而达不到本发明获得的效果，而且上述申请的实施例中报导的结果表明，IFN的量增大到5IU/磅的优选浓度以上导致降低免疫应答的相反效果。
Stǜrchler等[疫苗(Vaccine)，Vol 7，1989，pp457～461]描述了，用抗恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)疫苗免疫接种志愿者后，IFN-α对IgG和IgM抗体的产生发挥的普通佐剂(genericadjuvant)效应。然而，在体外观察到的IgG和IgM效价的适当增大不是体内保护效果的证据。于是，从该文献不能推断出体内保护效果。
此外，Stürchler等没有公开或者甚至启示IFN-α以选择性和无毒的方式诱导体内保护性Th-1型免疫应答的能力。
Anton P.等(癌症生物疗法和放射性药物(Cancer biotherapy andradiopharmaceuticals)，Liebert，US，Vol.11，No.5，1996，pp315～318)描述了含灭活的自体肿瘤细胞和重组IFN-α2a的抗肿瘤疫苗的试验。虽然该文献描述了免疫接种处理中的一些效果，但该文献没有区别由于自体细胞和由于IFN的贡献。因此，IFN的辅助效果仅仅是被宣称的，更不用说获得的免疫应答的类别了。因而不能从该文献推测I型IFN在本发明的含意中的辅助效果。
Grob P.J.等[欧洲临床微生物学杂志(Eur.J.Clin.Microbiol.)，1994，Vol.3，no.3，pp195～198]描述了，对于不响应在先免疫接种的患者施用重组IFN-α和商品化抗乙型肝炎疫苗。结果证明了血清转变发生率低，而IFN处理的患者中抗体效价增幅这样低，就不能期望体内保护效果。应强调的是，在该情况下，将IFN-α和疫苗分开施用。在构思上，该方法不同于利用任何物质作为佐剂的方法(该方法通常包括将佐剂与抗原结合)。
与前述现有技术相比，本发明的范围是，在体内保护性免疫接种处理中提供增强对疫苗的Th-1型体液免疫应答的安全而高效的方法，特别是关于包含灭活的病原体的疫苗，或者更具体地关于亚单位疫苗。
发明概述
本发明的目的是，I型IFN在制备用来增强在体内保护性免疫接种处理中对疫苗的Th-1型体液免疫应答的无毒佐剂组合物中的应用，其中，应用的IFN剂量大于或等于100.000 IU/疫苗剂量。
这种增强的体液免疫应答引起选择性诱导IgG1和/或IgG2a和/或IgG2b和/或IgG3和/或IgA和/或IgM产生。
所述无毒佐剂组合物特别适用于通过皮下、肌内或皮内注射或者经口或粘膜或鼻内施药而进行的体内保护性免疫接种。
具体地说，本发明的一个目的是I型IFN在制备上述目的的无毒佐剂组合物中的应用，其中，所述组合物是为了与疫苗同时送递到施药部位而配制的。优选将佐剂组合物与疫苗一起配制。
本发明的进一步目的是一种疫苗，它包含作为佐剂、剂量大于或等于100 000IU/疫苗剂量的I型IFN，用于可控、长期地释放抗原和佐剂还有任何所需的药物上可接受的载体或助剂。
本发明又一个目的是一种分部分的试剂盒，它含有供分别施用的上述含IFN的佐剂组合物和一种疫苗组合物。
本发明第一个优点是，由此制备的一种含佐剂的疫苗能改善Th-1型免疫应答的诱导，其特征在于，由总抗体产生的程度决定的长期抗体产生和免疫记忆。
本发明第二个优点是，一种以规定剂量的I型IFN组合物为佐剂的疫苗即使单一疫苗施用后，也能诱导特异性Th-1型体内保护性体液和细胞介导的免疫应答。
本发明第三个优点还有，迅速诱导Th-1型免疫保护的高效率，不存在任何毒性，特别是不存在对于已知可促进动物内Th-1型应答的目前可获得的佐剂(例如，CFA或IFA)来说典型的毒性和/或安全性忧虑。
由I型IFN诱导的免疫应答是Th-1型应答，其特征在于特别的Igs分布型，即，在小鼠中，IgG2a和/或IgA的特异性诱导，它赋予防御病原体攻击(例如，细菌或病毒)的保护作用。
在本发明的无毒佐剂组合物中，I型IFN可以是属于该族的任意干扰素，只要它以前述剂量包含于组合物中即可。在这方面，人体中最有效的剂量是在1×106～6×106IU范围内。
在一个优选的实施方案中应用了：来自健康供体的受刺激白细胞的天然IFN-α(不同的IFN-α亚类或各个IFN-α亚类的混合物)或者来自Namalwa细胞的类淋巴母细胞IFN-α，合成的I型IFN，例如，共有序列IFN(CIFN)和IFN-β，或者重组IFN-α亚类，例如，IFN-αa和IFN-αb，或IFN-ω ，或者通过DNA改组方法产生的新IFN分子，只要它们以上述每疫苗剂量指示的剂量应用即可。
可应用聚乙二醇处理过的I型IFN亚类，优点是注射后IFN在体内更高的半寿期，原则上有益于实现更显著的和迅速的免疫应答。
以融合了能靶向树突细胞的单克隆抗体的重组I型IFNs代表的融合杂合蛋白可能特别有效作为包含于疫苗制剂中的佐剂。
本发明的佐剂组合物可与一种或甚至多种来自一种感染剂或其它来源的抗原以含佐剂的疫苗形式结合。
抗原包括蛋白质、肽、碳水化合物或脂质抗原的纯化的或部分纯化的制剂，和/或与全细胞，特别是已经与抗原混合的树突细胞结合的抗原。总体说来，任何病原体都可看成与作为佐剂的I型IFN结合的可能的免疫原，并且可容易由本领域技术人员鉴定。
每个含佐剂的疫苗剂量中存在的抗原量选定为能在接种的受治疗者中诱导保护性免疫应答的量。该量将取决于特定的抗原和可能存在的其它典型佐剂，并且可由本领域技术人员确定。通常，每个剂量将含1～1000μg抗原，优选10～200μg。
在本发明的佐剂组合物或含佐剂的疫苗中还可有利地存在其它组分。具体地说，在一个优选的实施方案中，在所述组合物中包含其它佐剂，特别是铝盐。
至于剂型，本发明的佐剂组合物可配制成供同时送递所述佐剂和疫苗到施药部位。优选的是，将所述佐剂组合物和疫苗一起配制于一种含佐剂的疫苗形式的组合物。佐剂组合物或含佐剂的疫苗的制剂可呈适合将佐剂与抗原结合施用的本领域已知的任意形式。
在一些情况下，为了达到预期的效果和应用方便，可通过皮下或肌内注射所述佐剂组合物和疫苗或含佐剂的疫苗。对于某些疫苗可有效地进行皮内注射，还可考虑适合将相关数量的树突细胞募集到注射部位的其它送递系统。
尤其对于通过例如病毒的呼吸感染(例如，流感病毒感染)的这些感染途径传递的那些感染剂来说，还应包括鼻内和经口施药。
此外，鼻内、经口或任何其它粘膜施用所述佐剂组合物和疫苗或者直接含佐剂的疫苗体现了有价值的选择，这意外地和有利地通过利用很实际的疫苗送递感觉模式而引起诱导有效力的保护性局部和/或系统性免疫。
本领域技术人员可在这方面确定起接种所针对的抗原的作用的最适合制剂。
本发明的佐剂组合物或含佐剂的疫苗可按常规方法配制，作为药物组合物，它包含无菌的生理相容的载体(例如，生理盐水溶液)，赋形剂，其它佐剂(如果有的话)，防腐剂，稳定剂。
所述佐剂组合物或含佐剂的疫苗可呈液体或冻干的形式，在使用前溶于无菌载体。制剂中还可能存在alum或脂质体样的颗粒，因为它们适用于达到IFN和抗原两者的缓慢释放。本领域技术人员容易发现能缓慢释放IFN辅助的疫苗的其它措施，这些措施应包括在本发明的范围内。
药物上可接受的载体介质或辅助剂可容易由本领域技术人员根据各种制剂而确认。
在这方面，还作为本发明的一个目的包括一种制备本发明的含佐剂疫苗的方法，它包括如下步骤：
-将一种抗原与I型IFN一起配制，所述I型IFN的剂量大于或等于100.000IU/疫苗剂量。
上述含佐剂疫苗可用于传染病和癌症的预防性和治疗性处理。具体地说，本发明的佐剂组合物或含佐剂的疫苗可用于处理以防病毒性疾病和细菌性疾病(即，预防性疫苗)以及用于处理严重的慢性传染病(即，治疗性疫苗)。此外，当应用合适的抗原时，所述佐剂组合物或含佐剂的疫苗还可用于预防和治疗癌症。
这可通过应用下列抗原来实现，即，抗与人恶性肿瘤(EBV、HPV和幽门螺杆菌(H.pilori))相关的感染剂的抗原，或者明确定义的肿瘤相关的抗原，例如，特征在于人黑素瘤的那些(MAGE抗原，酪氨酸羟化酶gp100，MART)以及其它人体肿瘤中的那些。
具体地说，本发明的佐剂组合物或含佐剂的疫苗特别适合接种所谓的低反应或无反应的受试验者，例如，无免疫应答的受试验者，诸如维持血液透析和移植的患者。一般说来，本发明的佐剂组合物或含佐剂的疫苗有利地适合接种在任何情况下处于高危感染的个体，对他们来说需要早期血清转变/血清保护。
这些特征特别涉及接种抗乙型肝炎病毒。
作为另一个实例，所述佐剂组合物或含佐剂的疫苗可能特别有益于在对于标准的接种反应差的老年个体中诱导抗流感病毒的保护作用。
对于乙型肝炎病毒疫苗和其它病毒疫苗来说，皮下或肌内注射途径可能是优选的，而在其它情况下，从效率和/或患者顺应性考虑，鼻内施药可表现出优势，尤其对于能通过呼吸系统感染宿主的作用剂。
按第二方面，还可通过分开施用I型IFN和亚单位疫苗来获得本发明的I型IFN的辅助效果。
为了有效，应该通过允许在相同部位同时存在活性剂的感觉模式进行施药。实际上，当将I型IFN与剂量在100.000～200.000IU或者甚至更高剂量(1×106～2×106IU)范围内的疫苗一起注射时，在动物中实现了最佳效果。当首先同时施用疫苗和佐剂，然后在首次施用疫苗后的第1天或者第1和第2天每天单独施用一个附加剂量的佐剂，可获得甚至更强的免疫应答增强作用。当在相对于施用疫苗的第-1或+1天单独施用IFN时，观察到低得多的效果(图11C)。
因此，本发明还包括分部分的试剂盒，它包含：
-一种包含I型IFN和药物上可接受的载体的组合物；
-一种疫苗组合物，它包含一种抗原或者两种或更多种抗原(确定的蛋白质或肽)或者杀死的或灭活的病原体的组合，
供在治疗与所述抗原的存在相关的疾病时分别、同时或依次使用。
本发明试剂盒的组合物的配方、形式和施用途径都与上述相同。
借助于附图将更好地描述本发明。
对附图的描述
图1示出了聚肌胞苷酸[poly(IC)]对在体内对鸡丙种球蛋白(CGG)的初级抗体应答的影响效果。
A组示出了，用CGG单独注射或者CGG+聚肌胞苷酸注射(如图中X轴上所示)的B6小鼠血清中检测的CGG-特异性抗体的终点滴定度。每一幅单一图是用测定的终点滴定度涉及的亚类抗体(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
抗体应答以终点滴定度的平均值±SD表示。
B组示出了，在用CGG单独注射或者CGG+聚肌胞苷酸注射(如图中X轴上所示)的野生型129sv品系小鼠(白色条)或者I型IFN受体KO(I型IFNR KO)129sv小鼠(黑色条)中获得的抗体应答。每一幅单一图是用测定的终点滴定度涉及的亚类抗体(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
抗体应答以终点滴定度的平均值±SD表示。
图2A和B示出了，用卵清蛋白(OVA)+佐剂免疫接种的小鼠中的抗体应答。
A组示出了，在用生理盐水、OVA、OVA+IFA和OVA+CFA(如图中X轴上所示)处理的野生型(白色条)或I型IFNR KO C3H/HeJ(灰色条)小鼠中测定的特异性抗体水平。
在图I、图II和图III中分别报导了，通过对于OVA特异性总Igs或Ig亚类IgG2a和IgG1的标准酶联免疫吸附测定法测定的，免疫接种24天后小鼠的血清中存在的终点抗体滴定度。测定值以重复测定的三份单独的血清的终点稀释滴定度平均值表示。
B组示出了，在用生理盐水、卵清蛋白(OVA)、OVA+CpG和OVA+Alum(如图中X轴上所示)处理的野生型(白色条)或I型IFNR KOC3H/HeJ(灰色条)小鼠中的特异性抗体水平。
在图I、图II和图III中分别报导了，通过对于OVA特异性总Igs或Ig亚类IgG2a和IgG1的标准酶联免疫吸附测定法测定的，免疫接种25天后小鼠的血清中存在的终点抗体滴定度。测定值以重复测定的三份单独的血清的终点稀释滴定度平均值表示。
图3示出了I型IFN在聚肌胞苷酸增强对于CGG的体内T细胞应答的作用。
A组示出了，对于通过注射聚肌胞苷酸、CGG或CGG+聚肌胞苷酸(如图中X轴上所示)致敏的129小鼠或I型IFNR KO小鼠的T细胞的CGG的体外增殖应答。
白色条和窄条纹条指示，来自当存在(白色)或不存在(窄条纹)CGG时培养的129小鼠的引流淋巴结(DrLNs)细胞悬浮物的增殖。
黑色条和宽条纹条指示，来自当存在(黑色)或不存在(宽条纹)CGG时培养的I型IFNR KO小鼠的DrLNs细胞悬浮物的增殖。
B组示出了，对于通过注射聚肌胞苷酸、CGG或CGG+聚肌胞苷酸(如图中X轴上所示)致敏的129小鼠或I型IFNR KO小鼠的CD4+T细胞的IFN-γ分泌。
白色条和窄条纹条指示，通过从存在(白色)或不存在(窄条纹)CGG时培养的免疫接种129小鼠的DrLNs纯化的CD4+T细胞与来自培养的非免疫接种同系小鼠的T缺失型脾细胞分泌的IFN-γ。
黑色条和宽条纹条指示，通过从存在(黑色)或不存在(宽条纹)CGG时培养的免疫接种I型IFNR KO小鼠的DrLNs纯化的CD4+T细胞与来自培养的非免疫接种同系小鼠的T缺失型脾细胞分泌的IFN-γ。
图4示出了内源性I型IFN在致敏用于体外增殖的T细胞和接种了OVA+佐剂的小鼠中的DTH应答中的作用。
A组示出了，用生理盐水、卵清蛋白和CFA(如图中X轴上所示)处理的正常小鼠(白色条)或I型IFNR KO C3H/HeJ(灰色条)小鼠的T细胞摄取的特异性3H胸苷。
B组示出了，用生理盐水、卵清蛋白和卵清蛋白+CpG或Alum(如图中X轴上所示)处理的正常小鼠(白色条)或I型IFNR KO C3H/HeJ(灰色条)小鼠的T细胞摄取的特异性3H胸苷。
C组示出了，用生理盐水、卵清蛋白和卵清蛋白+IFA或CFA(如图中X轴上所示)处理的野生型(白色条)或I型IFN受体KO C3H/HeJ(灰色条)小鼠中的特异性DTH响应。
D组示出了，用生理盐水、卵清蛋白和卵清蛋白+CpG或Alum(如图中X轴上所示)处理的野生型(白色条)或I型IFN受体KO C3H/HeJ(灰色条)小鼠中的特异性DTH响应。
图5通过注射IFN-I增强对CGG的初级抗体应答。
全部小鼠接受CGG的一次注射。还接受可溶性IFN-α/β或IFN-β的那些小鼠或者仅在免疫接种时(1X)被注射有关的IFN，或者在1天后(2X)或者1天和2天后(3X)被另外注射IFN。
A组示出了，单独用CGG免疫接种或者用CGG免疫接种并用IFN-α/β处理(如图中X轴上所示)的B6小鼠中的抗体应答。
每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。抗体应答以终点滴定度的平均值±SD表示。
B组示出了，单独用CGG免疫接种或者用CGG免疫接种并用IFN-β处理的B6小鼠中的抗体应答。每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。抗体应答以终点滴定度的平均值±SD表示。
图6示出了通过IFN-α/β+alum增强对CGG的初级抗体应答。
数据(黑色条)示出了，在通过一次皮下注射单独的CGG或者与可溶性IFN-α/β、alum或IFN-α/β+alum结合的CGG(如图中X轴上所示)对B6小鼠免疫接种10天后，通过酶联免疫吸附测定法检测的CGG-特异性抗体。符号3X指示免疫接种1天和2天后可溶性IFN-α/β的另外注射。
每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
数据代表终点滴定度±SD(每组3只小鼠)。
图7示出了由I型IFN和油基佐剂增强的抗体应答的对比。
数据(黑色条)示出了，在通过皮下注射CGG、CGG+IFN-α/β(在第0天与CGG一起注射IFN-α/β，然后在第1和2天单独注射)、在IFA中乳化的CGG(在第0天与CGG一起注射IFA，然后在第1和2天单独注射)或者在TiterMax中乳化的CGG(在第0天与CGG一起注射TiterMax，然后在第1和2天单独注射)(如图中X轴上所示)对B6小鼠免疫接种10天后，通过酶联免疫吸附测定法检测的CGG-特异性抗体。
结果以终点滴定度的平均值±SD表示(每组3只小鼠)。每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
图8示出了可溶性IFN-α/β增强抗体应答到与CFA相似的程度，它的佐剂活性取决于内源性I型IFN。
在通过皮下注射单独的CGG、CGG+IFN-α/β(在免疫接种后第1和2天又注射两次IFN-α/β)或者CGG+CFA(如图中X轴上所示)进行免疫接种后的WT 129小鼠(白色条)或IFN-IR KO小鼠(黑色条)中比较了抗体应答。免疫接种10天后通过酶联免疫吸附测定法检测CGG-特异性抗体。结果以终点滴定度的平均值±SD表示(每组3只小鼠)。每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
图9示出了I型IFN刺激长期抗体产生和免疫记忆。
A组示出了6个月前通过注射单独的CGG或者CGG+IFN-α/β免疫接种的B6小鼠中的终点抗体滴定度。
数据(黑色条)示出了，在通过皮下注射单独的CGG或者CGG+IFN-α/β(在免疫接种后第1和2天又注射两次IFN-α/β)对B6小鼠免疫接种6个月后，通过酶联免疫吸附测定法检测的CGG-特异性抗体。
结果以终点滴定度的平均值±SD表示(每组3只小鼠)。每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
B组示出了，在首次用于试验的小鼠(No)内以及在如A组那样在6个月前用单独的CGG或者CGG+IFN-α/β免疫接种的小鼠内，用单独的CGG处理6天后的特异性抗体应答。
结果表示攻击前(白色条)和攻击6天后(黑色条)的抗体终点滴定度，以终点滴定度的平均值±SD表示(每组3只小鼠)。每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
图10示出了，对I型IFN的DC反应性足以增强抗体产生和通过I型IFN的同种型转换。
数据示出了，在免疫接种10天后，通过酶联免疫吸附测定法检测的CGG-特异性抗体。脾DC是从下列小鼠纯化的：129小鼠(wt)或者I型IFNR KO小鼠(如图中X轴上所示)，短暂地与CGG一起培养并且对I型IFNR KO小鼠经皮下注射了(黑色条)或者没有注射(白色条)IFN-α/β(在后一种情况下在免疫接种后第1和2天又注射两次IFN-α/β)。
结果以终点滴定度的平均值±SD表示(每组3只小鼠)。每一幅图是用测得的终点滴定度涉及的抗体亚类(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)标记的。
图11I型IFN对用流感疫苗免疫接种小鼠的抗体应答的佐剂活性。
标准免疫接种方案如下：用0.2ml含15μg纯化的流感疫苗和2×105U的鼠I型IFN的制剂、作为对比的单独的疫苗或生理盐水对7～8周龄的C57BL/6小鼠进行肌内注射。14天后，将小鼠抽血并通过标准酶联免疫吸附测定法检测血清而测定流感特异性抗体水平。测定值表示5份单独的血清平均值±SD。
A组示出了剂量/响应试验，其中，用包含与I型IFN log10稀释物(2×105，2×104或2×103单位)混合的疫苗或者单独的疫苗或生理盐水(作为负对比)的不同制剂对小鼠进行肌内处理。免疫接种7天后测定抗体滴定度。
B组示出了对用疫苗以及一次或重复剂量的I型IFN处理过的小鼠中抗体应答的佐剂效果。用与IFN混合的流感疫苗对小鼠进行肌内处理，或者用与IFN混合的流感疫苗对小鼠进行肌内处理，接着在首次接种后在相同部位再次注射IFN达两天。将单独的流感疫苗或生理盐水用作对比。
C组示出了同时或者在施用流感疫苗前后不同时间施用I型IFN的佐剂效果。在施用疫苗前或后2天或1天或者与疫苗同时，在相同的部位用IFN对小鼠进行肌内注射。将单独的流感疫苗或生理盐水用作对比。
图12：A组示出了对小鼠鼻内施用I型IFN和流感疫苗的抗体应答。
将7～8周龄的C57BL/6小鼠麻醉，在小鼠鼻内(i.n.)滴注一滴(50μl)含5×104单位I型IFN的流感疫苗(15μg)制剂。14天后，进行重复处理，又过了7天后，抽取血样，根据酶联免疫吸附测定法检测不同流感特异性抗体亚类的存在。将单独的流感疫苗或生理盐水用作对比。结果以每组5只小鼠的终点滴定度平均值±SD表示。
B组示出了含IFN佐剂的疫苗在接种了活流感病毒的小鼠中的保护作用。
用0.2ml含单独的或者与I型IFN(5×105U)结合的流感疫苗(15μg)的溶液或者用生理盐水(作为对比)对7～8周龄的C57BL/6小鼠进行肌内接种。在第0和14天施用疫苗。开始接种50天后，对小鼠鼻内滴注一滴(50μl)10 LD50活流感病毒(A/Beijing/262/95(A/H1N1))。随后每天对全部小鼠称重。结果以每组5只小鼠的平均重量表示。指示了每组中全体小鼠中存活的小鼠数。
图13：用单独的或者混合了作为佐剂的I型IFN的FLU(流感)疫苗进行肌内免疫接种的对比小鼠和IFN-IR KO小鼠中的FLU特异性抗体同种型分析。
在第0天和14天，用单独的FLU疫苗、FLU疫苗+I型IFN或者FLU疫苗+MF59佐剂对对比(野生型)小鼠和IFN-IR KO C3H/HeN小鼠进行肌内注射。第一次接种后13天和第二次接种后19天(分别在第13天和33天)采集血清并分析FLU特异性抗体应答。数据表示每个试验组重复测定的5份血清的特异性抗体滴定度的平均值±s.e.。
*p＜0.002；**p＜0.05对于IFN-IR KO小鼠；NS，不显著。白色条：对比野生型小鼠黑色条：IFN-IR KO小鼠
图14：当与FLU疫苗一起鼻内(i.n.)施用时I型IFN的强烈佐剂效果。
a组：用单独的或者混合了I型IFN的FLU疫苗进行鼻内免疫接种的C57/BL6小鼠的FLU特异性HAI滴定度、血清抗体同种型和支气管-肺泡灌洗(BAL)IgA的分析。在第0天和14天，在小鼠鼻内滴注50μl单独的或者混合了I型IFN(105U)的FLU疫苗。第一次接种14天后采集血清(左图)。第二次接种14天后(右图)，杀死小鼠，取血样和支气管-肺泡灌洗液(BAL)进行Ig分析。数据表示每个试验组重复测定的5份样品的特异性抗体滴定度的平均值±s.e.。**p＜0.002对于单独的FLU疫苗；NS，不显著。
白色条：单独的疫苗
黑色条：疫苗+IFN
b组：经过下列处理的C57/BL6小鼠的生存时间：两次鼻内施用单独的或者混合了I型IFN(105U)的FLU疫苗或者用作为对比的生理盐水进行免疫接种，38天以后用10 LD50的FLU病毒攻击。数据表示了感染的小鼠的平均重量变化过程(±s.e.)和存活小鼠相对于动物总数的百分数。每组有5只小鼠。
实心圆：生理盐水处理的小鼠
空心圆：用FLU疫苗鼻内滴注的小鼠
空心方块：用FLU疫苗+IFN鼻内滴注的小鼠
c组：在第0和14天用单独的FLU疫苗、FLU疫苗+I型IFN或者FLU疫苗+MF59佐剂将对比小鼠和IFN-IR KO C3H/HeN小鼠进行鼻内滴注。第一次接种13天后(上组)和第二次接种19天后(下组)，取血清分析FLU特异性抗体应答。数据表示每个试验组重复测定的5份样品的特异性抗体滴定度的平均值±s.e.。*p＜0.004对于IFN-IRKO小鼠；NS，不显著。
白色条：对比野生型小鼠
黑色条：IFN-IR KO小鼠
图15：一次免疫接种后用FLU疫苗进行肌内(系统性的)或鼻内(粘膜的)接种的C5 7BL/6小鼠中I型IFN的佐剂效应。
a组示出了免疫接种14天后的抗体滴定度和一次肌内接种后的小鼠存活率。肌内免疫接种是按前述方法进行的。在免疫接种38天后进行了病毒攻击。
B组示出了免疫接种14天后的抗体滴定度和一次鼻内接种后的小鼠存活率。粘膜免疫接种是按前述方法进行的。在免疫接种38天后进行了病毒攻击。
实心圆：生理盐水处理的小鼠
空心三角：用FLU疫苗在肌内注射或鼻内滴注的小鼠
空心圆：用FLU疫苗+IFN在肌内注射的或者用FLU疫苗+IFN鼻内
    滴注的小鼠
对本发明的详细描述
适用于本发明的I型IFN是属于该族的任意IFN，可作为单独的重组分子，或者作为天然的或重组的分子的集合体，或者是共有序列IFN(CIFN)。
就人体应用来说，人I型IFN是优选的佐剂。该佐剂可以是重组IFN-α或IFN-β或IFN-ω，来自健康捐献者的受激白细胞的天然IFN-α(不同的IFN-α亚类或各个IFN-α亚类的混合物)，或是来自Namalwa细胞的类淋巴母细胞IFN-α，或是CIFN，或是通过DNA改组法在体外产生的并赋予生物活性的新IFN分子。
就兽医应用来说，I型IFN包括天然见于为其制备疫苗的物种或与该物种密切相关的那些；再一次，这些I型IFN可以是重组体或者从相关动物细胞天然产生的。这些类型的干扰素具有大致相同的佐剂活性。
达到最佳佐剂活性所需干扰素的量取决于抗原类别(即，它的免疫原性)，但通常应该大于100.000IU/疫苗剂量。在小鼠中，最佳效果是通过注射高剂量的I型IFN(2×105～106IU)获得的。预计人体中最佳剂量在106～6×106IU/疫苗剂量的范围内。聚乙二醇处理过的I型IFN亚类具有在注射后允许IFN的体内半寿期更高这一优点，它可能有益于实现更显著而迅速的免疫应答。
由与能靶向树突细胞的单克隆抗体融合的重组I型IFNs所代表的融合杂合蛋白(例如，抗-DEC-205或抗-CD11c抗体)作为包含于所述佐剂组合物或含佐剂的疫苗中的佐剂可能特别有效。
除了IFN蛋白的施用以外或者作为施用IFN蛋白的替代方式，所述佐剂还可作为核酸序列给予，为它的正确表达提供合适的调节区，编码I型IFN的一员或多员(即，一种含I型IFN编码基因的质粒，受合适的启动子和转录终止信号序列的控制，用于在真核细胞体系中表达)。
佐剂活性涉及能增强抗原特异性免疫应答的干扰素的任意部分。
本发明的组合物应当优选包含抗原和佐剂两者，它们是在相同的小瓶内在生理相容的载体(例如，缓冲到生理pH值的无菌生理盐水溶液)中掺和的。
在这方面，本发明含佐剂的疫苗可包含一种或多种来自一种感染剂或其它来源的抗原以及与有效量的生物活性I型IFN结合的杀死的或减毒的病原体。所述含佐剂的疫苗还可包含全细胞，以及(特别是)自体树突细胞。
用于这类制剂中的抗原可以是任意类别天然或重组纯化的抗原，它们可能包括，来自胞内或胞外病原体(包括病毒、细菌、原生动物和真菌)的蛋白质、肽、脂质或碳水化合物抗原，以及和肿瘤结合的细胞抗原。
将每个含佐剂的疫苗剂量中存在的抗原量选定为能诱导接种的受试验者中免疫保护性应答的量。该量将取决于所述特异性抗原和可能存在的其它典型佐剂。通常，每个剂量将含1～1000μg抗原，优选含10～200μg。
抗原可以是任意类别的天然或重组抗原或其部分，它们来自胞内或胞外病原体，以及病原体自身，包括：病毒[细小核糖核酸病毒、杯状病毒、冠形病毒、沙粒病毒、细小病毒、披膜病毒、黄病毒、冠形病毒、弹状病毒、线状病毒、正粘病毒(ortomixovirus)、副粘病毒(paramixoviruses)、本雅病毒(buniaviruses)、反转录病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病病毒、嗜肝DNA病毒]，细菌[链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、螺旋体属(Spirochetes)、梭菌属(Clostridia)、科里氏杆菌属(Corynebacteria)、利斯特氏菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、炭疽(Anthrax)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、肠杆菌科(Ehterobacteriaceae)、弧菌属(Vibrio)、弯曲杆菌属(Campyiobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血菌属(Haemophilus)、博德特氏菌属(Bordetella)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、衣原体属(Chlamydia)、立克次氏体属(Rickettsiae)以及其它非发酵革兰氏阴性菌]，枝原体属(Mycoplasma)和军团菌属(Legionella)，原生动物[肉足总纲(Sarcodina)、纤毛虫(Ciliophora)、鞭毛纲(Mastigophora)、孢子纲(Sporozoa)、隐孢壳属(Cryptosporodium)、肺囊虫属(Pneumocystis)]，真菌[球孢子菌属(Coccidioides)、组织孢浆菌属(Histoplasma)、芽生菌属(Blastomycoses)、隐球酵母属(Cryptoccus)、假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉目(Mucorales)、接合菌纲(Zygomyces)]。
肿瘤相关的抗原包括，黑素瘤抗原(MART-1、gp100、MAGE抗原)以及本领域已知的其它肿瘤抗原。
本发明的佐剂组合物或含佐剂的疫苗可利用下列物质按常规方法配制：无菌生理相容的载体(例如生理盐水溶液)，赋形剂，其它佐剂(如果合适的话)，防腐剂，稳定剂。它们可呈液体或冻干的形式，供使用前用无菌载体溶解。
另一方面，本发明提供了一种配制含佐剂的疫苗的方法，该疫苗包含来自病原体的抗原或它们的部分，结合了有效量生物活性的I型IFN(起佐剂作用)，用来将抗原和佐剂二者同时送递到施用部位。IFN的量必须足够高而在局部起作用达足够长的时间以便发挥它的佐剂效果。
这是含佐剂的疫苗的一个重要方面，既保持抗原和佐剂在注射后以相同的相对浓度混合，又将它们同时暴露于处于注射部位的呈递抗原细胞4，抗原和佐剂在所述细胞上发挥它们的机能活动。
除了与预防性疫苗的领域相关的应用之外，由于I型IFN不但对体液免疫而且对细胞介导的免疫应答有充当有效佐剂的能力，本发明还转向开发用来治疗慢性病(例如，病毒慢性感染)和癌症的治疗疫苗。
在该情况下，这种新型含佐剂的疫苗制剂包含肿瘤相关的抗原或相关的病毒抗原(或编码该抗原的DNA序列)，它与有效量I型IFN结合而对患者施用，用来治疗癌症或慢性病毒病。
皮下注射所述佐剂组合物和疫苗或含佐剂的疫苗是优选的，这是由于它的使用简便。然而，可采用任何其它施用途径，包括肌内、皮内和粘膜(例如，鼻内和经口)途径。对于某些病毒感染，鼻内施用可代表有价值的选择，它导致通过利用很实际的疫苗送递感觉模式而诱导有效力的保护性局部的和/或系统性的免疫。
本发明还涉及作为强有效的粘膜佐剂的I型IFN。
粘膜佐剂的鉴定是疫苗研究的一个重要任务，因为保护性粘膜免疫的诱导对于在病原体进入部位实现局部免疫保护很重要。
当I型IFN用作粘膜接种的佐剂时，可将所述组合物与合适的抗原混合，而且可例如通过在口腔粘膜或鼻粘膜上滴注来施用。已经在第一次免疫接种后，粘膜施药通常增大抗体产生，特别是IgG2a和/或IgA(图14a和b)。对粘膜施用本发明的佐剂组合物与疫苗在体内诱导防止病原体攻击的充分的局部(粘膜免疫)和/或系统保护。值得注意的是，通过纯化在1995年流行的H1N1流感病毒(A/Beijing/262/95(A/H1N1))获得的可商购的疫苗，证实当注入小鼠时表现为差免疫原性。其实，稳定数量的小鼠即使在三次疫苗注射后也没有发生任何显著的抗体应答。当将疫苗与I型IFN一起在肌内施用时，100％的小鼠在一次免疫接种后就出现血清转变，而且在第二次注射后抗体滴定度显著增大了。
剂量响应曲线表明，在IFN剂量和抗体滴定度之间存在线性关系(图11)。流感特异性抗体的同种型分析表明，IgG2a抗体亚类增加了，这是小鼠中保护性Th-1免疫应答的一个典型标志(没有示出)。有趣的是，经鼻内施用50μl含疫苗和I型IFN的制剂的小鼠显示系统的和粘膜的抗体应答，而单独的疫苗却完全无效(图12a)。值得注意的是，证实了用含佐剂的疫苗免疫接种的小鼠的抗体应答在体内具有抗致死病毒攻击的保护作用(图12b)。更重要的是，已经免疫接种一次后，观察到抗致死剂量的病毒的体内保护作用，不论免疫接种方式如何。此外，还证明受攻击的动物存活率完全与IgG滴定度的增大无关。其实，如图15中所示，单独用疫苗免疫接种，虽然导致IgG滴定度的显著增大，但确实引起存活率的任何显著增大。
这些鼻内施用所需干扰素的量与皮下途径所需的量相当。例如，从小鼠中的流感疫苗的结果可推测，I型IFN的一个合适剂量可足以激发相当水平的特异性免疫应答。然而，在第一个含IFN佐剂的疫苗剂量后的一天或两天，施用一个附加剂量的佐剂改善了免疫应答的总体强度。
尤其，在注射以前将I型IFN与相关的抗原和alum混合可能是有利的(图6)。
其实，当预先吸附在alum上时，在小鼠内一次注射IFN使抗原特异性抗体应答增强到与3次注射可溶性IFN相似或更大的程度(图6)。alum预吸附的加强效果对于IgG2a产生来说最显著，说明了Th-1型优先响应。
因此，长期存在I型IFN确实增大了它的佐剂活性。在这方面，聚乙二醇处理过的I型IFN可能由于它们在注射后的高半寿期而具有一定的优势。此外，特征在于可控、长期释放抗原和佐剂两者的适合人体应用的疫苗组合物也是预期的。这类组合物涉及用来通过缓释制剂改善治疗蛋白的机能活动的常用方法。这些方法使用这样的制剂，其中，蛋白质被包封于由生物可降解的聚合物或脂质体制备的微球体中，蛋白质从微球体中被缓慢地释放。
如果需要的话，在施用第一个疫苗剂量后，可对受试验者施用加强剂量，这取决于所用抗原的免疫原性和特异性接种方案确定的参数免疫接种作用范围。
即使较不显著，IFN的佐剂效果还可通过下述方法获得，即，作为分部分的试剂盒，与抗原分开地施用I型IFN，但很靠近抗原注射部位并且同时施用。皮下注射疫苗是优选的(在分部分的试剂盒组合物中也一样)，这是由于它们的使用简便。但是，也可应用任何其它施用途径，包括肌内、皮内、鼻内和经口途径。这些施用方法所需干扰素的量与皮下途径所需的量相似。
本发明基于下列意外的主要发现：
i)在小鼠内同时注射与适当量的I型IFN混合的明确规定的抗原导致有效地诱导与典型Th-1型免疫应答相关的初次抗体应答(图5、6、9)，它优于利用通常可获得的佐剂观察到的应答(图7)，但不导致任何毒性；
ii)当与参比抗原一起注射时，内源性I型IFN是通过佐剂(例如，IFA、CFA、CpG)诱导的Th-1促进免疫应答的主要介体(图1～4，8)(所有这些佐剂用于人体时引起相关安全性问题)；
iii)当在小鼠内与适当量I型IFN一起肌内或鼻内施用可商购的流感疫苗时，疫苗对病毒攻击变成高度免疫原性和保护性的(图11，12)。
下文报导的实施例中阐明了这些发现的重要性和细节。
实施例
原料和方法
小鼠
小鼠购自Charles River-UK(Margate，Kent，UK)，Charles River-Italy(Calco，Italy)或者来自the Institute for Animal Health的SPF单位(Compton，UK)。C3H/HeJ小鼠购自Harlan UKLtd(Blackthorn，UK)。129 SvEv(129)小鼠购自the Institute forAnimal Health的SPF单位。缺乏I型IFN受体功能的129背景小鼠(I型IFNR KO)最初购自B&K Universal(North Humberside，UK)，放在the Institute for Animal Health的SPF单位保存和喂养。
干扰素
按Tovey等采用的方法(Tovey MG，Begon-Lours J和Gresser I，一种大规模生产强有效的干扰素制剂的方法，实验生物学与实验医学学会会报(Proc Soc Exp Biol Med)146：809～815，1974)用C243-3细胞系制备了高滴定度IFN-α/β×107U/mg的蛋白质。简单地说，通过添加10U/ml处于富含10％ FCS和1mM丁酸钠的MEM中的IFN而致敏汇合的细胞。在37℃下培养16小时后，用处于MEM+0.5％ FCS+5mM茶碱中的新城疫病毒感染C243-3细胞(感染复数为1)。感染18小时后，收集培养物上清液，在1500rpm下离心10min。在IFN滴定前，将上清液调节到pH2.0并在0℃下保持6天。通过抑制水泡性口炎病毒对Falcon微量培养板中单层培养物中的L细胞的致细胞病变效应来检测IFN。通过离心除去在pH2.0时处理和对PBS透析的过程中沉淀的污染蛋白质以后，这些IFN制剂的比活是2×106U/mg蛋白质。本文中的单位以国际小鼠参考单位表示。将IFN浓缩并通过硫酸铵沉淀和对PBS透析而部分纯化。在测试所有IFN制剂对于抗IFN的L1210细胞系的任何可能的残余毒性以前，它们都在4℃下进一步经历先后对0.01M高氯酸和PBS的透析达24小时。这些部分纯化的IFN制剂滴定度至少是2×107U/mg蛋白质并且不含内毒素(利用鲎变形细胞溶解物试验测定的)。通过利用mAbs对IFNs的中和试验评估，证实它们包含约75％ IFN-β和25％IFN-α，如Belardelli F等在下列文献中详细描述，“利用抗小鼠干扰素的单克隆抗体对小鼠腹膜巨噬细胞内自发、诱导的干扰素的表达的研究”，普通病毒学杂志(J GenVirol)，68：2203～2212，1987。通过在偶联了抗IFN-β的大鼠单克隆抗体的琼脂糖柱上的亲和层析制备了高滴定度纯化的IFN-β(2×109U/mg蛋白质)(Kawade Y和Watanabe Y，抗小鼠干扰素α和β的大鼠单克隆抗体的表征。关于干扰素体系的生物学的第三次国际TNO会议会议录。In the Biology of the Interferon System，Dordrecht，197～202，1987)。
抗原和佐剂
分别从Stratech Scientific Ltd，Luton，UK和Sigma Chemical Co获得了鸡丙种球蛋白(CGG)和卵清蛋白(OVA)。流感疫苗是亚单位X-127单价疫苗，是从A/Beijing/262/95(H1/N1)流感病毒株制备的，由Chiron Corporation(Emeryville，CA)友好提供。
将抗原溶于PBS并过滤灭菌。利用两支玻璃注射器和Luer锁紧套口噬菌体颈圈，将不完全弗氏佐剂(IFA)和完全弗氏佐剂(CFA)(SigmaChemical Co)各自与抗原溶液以1∶1v/v比率混合并乳化，直到形成稳定的乳液。将alum(氢氧化铝凝胶，Sigma Chemical Co)以1∶20 w/v的比率溶于抗原溶液并调节pH到6.5。在室温下保温1h后，将溶液离心，将离心片重悬浮于先前体积的生理盐水中。通过RocheDiagnostic Milan，Italy合成了CpG ODN(CpG)。将200μg CpG溶于1ml最终体积含200μg OVA的溶液。用于该研究的CpG是用硫代磷酸酯主链(backbone)制备的，它具有如下序列：TsGsAsCsTsGsTsGsAsAsCsGsTsTsCsGsAsGsAsTsGsA。将聚肌胞苷酸(poly(I：C)(Sigma Chemical Co))以10mg/ml的浓度溶于生理盐水。就在每次试验以前将冷冻的等分试样融化，将0.15mg溶于0.15ml体积生理盐水的poly(I:C)在腹膜内注射。将MF59与抗原溶液以1∶1(v/v)比率混合并通过吸移乳化。
用CGG免疫接种的方案
所有的免疫接种都是通过皮下注射100μg CGG完成的。当单独施用时或者与100μg poly IC(Sigma Chemical Co.Ltd，Dorset，UK)、105U IFN-αβ或105U所示纯化过的IFN-β混合施用时，施用呈溶解的形式(溶于PBS中)的CGG。当与Titermax(CytRx Corporation，Norcross，GA)、IFA(Sigma)或CFA(Sigma)一起注射时，在注射以前用佐剂乳化等体积溶于PBS的CGG。在某些试验中，将I型IFN、Titermax或IFA施用数次。所有情况下，在初次注射部位对小鼠皮下注射。当测试记忆反应时，就在用CGG攻击前将小鼠抽血以确定攻击前的抗体水平。在CGG攻击6天后，将相同的小鼠抽血。
用OVA免疫接种的方案
除了Poly(I:C)以外，全部佐剂都总是以50μl/小鼠的体积(含有或未含OVA)经皮内注射。OVA浓度总是10μg/小鼠。应用了两个不同的免疫接种方案。为了达到良好的抗体应答和增殖反应，在第0天用OVA+佐剂注射小鼠，在10天和17天后，单独用OVA加强。反之，对于被选定用于迟发型超敏反应(DTH)测定的小鼠在第0天以及10和17天都用OVA+佐剂注射小鼠。全部免疫接种试验都包括用单独的OVA和作为对比的生理盐水处理的前肢。就在随后的抗原注射以前，从后眶静脉丛抽取血样。采集血清，在进一步检测以前贮存于-20℃。
用流感(FLU)疫苗免疫接种的方案
对于肌内(i.m.)免疫接种来说，用最终体积为200μl、包含疫苗(15μg)和生理盐水、或者疫苗(15μg)和IFN(2×105U)的溶液、或者单独的生理盐水注射小鼠。对于鼻内(i.n.)免疫接种来说，用一滴(50μl)含相同量的疫苗和生理盐水、或者疫苗和IFN的溶液、或者单独的生理盐水滴注轻度麻醉的小鼠。在初次免疫接种后14天，施用包含相同量的疫苗和IFN的加强剂量。
通过酶联免疫吸附测定法检测血清抗体
在室温下的96孔Flexible小平板(Falcon，Becton Dickinson，Oxford，UK)内涂布CGG(5μg/ml于碳酸盐缓冲液中-pH9.6)一夜。在37℃下用含有4％奶粉的PBS封阻平板1小时，再用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。在室温下往孔中添加血清在PBS-1％牛奶中的12倍系列稀释液达1小时。洗涤3次后，在室温下往孔中添加生物素化大鼠抗小鼠抗体[抗小鼠IgM(R6-60.2)、IgG1(A85-1)、IgG2a(R19-15)、IgG2b(12-3)、IgG3(R40-82)或IgE(R35-72)(Becton Dickinson)]达1小时。洗涤3次后，在室温下添加链霉抗生物素-HRP(BectonDickinson)达1小时。将OPD片(Sigma)用作过氧化物酶底物。在最高滴定度血清的最高稀释度升到高于背景以前，通过添加50μg 3M HCl终止反应。在SPECTRAmax(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上492nm处读取光密度。结果以终点滴定度的倒数表示，它们是利用Excel上设计的自动化程序测定的。简单地说，对每种抗体同种型计算了关于OD值的正性阈值，以3只对比小鼠血清(来自未处理的小鼠或者用IFN-α/β或单独的poly IC处理的小鼠的血清)的所有稀释液平均值+3 SD表示。全部稀释液的背景水平都很低(通常约为0.08)并且在试验之间没有显著变化。对于给定的血清样品，终点滴定度确定为低于正性阈值的第一次稀释。由于终点滴定度是任意的单位，所以必须在相同分析中考虑测定结果而且在试验之间不能直接比较。为此，在每次试验中同时检测所有的样品。
为了测定小鼠血清中存在的CGG特异性抗体的大致浓度，以半定量方法通过与小鼠Ig标准比较而进行了酶联免疫吸附测定。如上述那样测定了CGG特异性抗体，不同的是利用与碱性磷酸酶(AP)缀合的同种型特异性多克隆山羊抗小鼠抗体(都来自Southern BiotechnologyAssociates Inc，Birmingham，AL，USA)显示抗体。为了建立标准，将小平板涂布未标记的同种型特异性多克隆山羊抗小鼠抗体(5μg/ml)(Southern Biotechnology)。如上述那样封阻平板，然后以已知浓度添加纯化过的小鼠抗体(小鼠Ig标准组来自SouthernBiotechnology)。洗涤后，利用与AP缀合的同种型特异性山羊抗小鼠抗体揭示标准物。将p-NPP片(Sigma)用作AP底物。通过添加3M NaOH终止酶反应。在405nm处读取OD。应用SoftmaxPro(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)，我们为各同种型建立了标准曲线并计算了CGG特异性抗体的量。
为了测定OVA特异性抗体水平，进行了标准的、直接的酶联免疫吸附测定。简单地说，用100μg 1μg/ml(对于总IgG测定)或4μg/ml(对于IgG2a和IgG1测定)在pH9.6的NaHCO3缓冲液(涂布缓冲液)中稀释的卵清蛋白溶液(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)涂布96孔平底微量培养板(DYNEX Immulon 4MBX)。在4℃下保温一夜后，用PBS+0.01％ Tween 20(洗涤溶液)洗涤平板三次，在室温下用含5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)的PBS封阻达2hr。然后在每个孔中添加100μl预先稀释的(以1∶2的比率)血清样品，在37℃下保温1小时30分。洗涤后，在37℃下将平板与100μl过氧化物酶缀合的次级抗体一起保温1h。应用了下列次级抗体：抗总小鼠IgG(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)，在含5％ BSA的PBS中稀释1∶1000；抗小鼠IgG2a(Cappel ResearchProducts，Durham，NC)，稀释1∶200；抗小鼠IgG1(Cappel ResearchProducts，Durham，NC)，稀释1∶400。在保温结束时，将平板洗涤三次，在每个孔内添加100μl酶底物溶液(4 mg邻苯二胺，溶于20ml 0.1M含0.001％H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中)，在暗处放置约20min。用50μl 4N H2SO4终止酶反应，在微量培养板自动读数器上450nm处读取平板。结果以每个试验条件三份血清的终点稀释平均值表示，其中，终点是以导致吸光度值高于包括于每次检测中的三个负对比样品的平均值±2s.d.的最终血清稀释确定的。
DC制备和注射
DC是利用以前描述的方法[Vremec D等，“从小鼠胸腺和脾纯化的树突细胞的表面表型：对于树突细胞的亚群表达CD8的研究”，实验医学杂志(J Exp Med)，176：47～58，1992]从脾分离的。简单地说，将得自129小鼠或I型IFNR KO小鼠的脾切成小片并消化，即，在搅拌下，在含5％FCS、胶原酶III(1mg/ml，Lorne Laboratories，Reading，UK)和脱氧核糖核酸酶I(0.6mg/ml，Sigma，St Louis，MO)的RPMI中在37℃消化5min，接着在室温下消化15min。利用Nycodenz(Life Technology Paisley，UK)梯度获得了富含DC的细胞群体。然后，在冰上用处于PBS-EDTA-FCS中的抗CD11c-FITC(BectonDickinson，Oxford，UK)标记低密度细胞级分达20min。洗涤后，将细胞过滤(70μm细胞滤过器，Falcon)并在MoFlow流式细胞器(Cytomation，Fort Collins，CO)上分选CD11c+细胞，所得群体是＞98％CD11c+。用PBS洗涤两次后，在37℃下，将纯化后的DC在单独的PBS或者在含100μg CGG的PBS中保温30min。将5～7×105包含或不含CGG的纯化过的DC经皮下注入I型IFNR KO小鼠±105UIFN-α/β。1天和2天后，对于接受CGG+DC+IFN-α/β的小鼠另外经皮下注射105UIFN-α/β。
T细胞增殖和细胞因子检测
CGG特异性增殖检测。
将DrLNs切割成小片，在室温和频繁混合下，在含5％FCS、胶原酶III(1mg/ml)和脱氧核糖核酸酶I(0.6mg/ml)的RPMI中消化20min。然后过滤(70μm)细胞悬浮物，洗涤，在1500rpm下离心10min。就增殖分析来说，将没有分离的细胞(每孔5×105)置于96孔板的一式三份孔中的完全培养基[RPMI 1640，增补了10％热灭活的FCS(PAALaboratories)，50μM 2-ME(Sigma)，10mM HEPES，5％ NCTC培养基，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和250μg/ml艮他霉素(都来自Life Technologies)]±CGG(20μg/孔)中培养。在培养的第4天，用1μCi[3H]-胸苷使孔脉冲8小时。然后收获平板并利用MicroBeta TRILUX计数器(Wallac，Turku，Finland)测定掺入的[3H]-胸苷。对于细胞因子检测，将DrLN细胞与anti-ClassII(TIB120)、anti-CD8(3155)和anti-CD11b(M1/70)在冰上保温15min。洗涤后，应用绵羊抗大鼠IgG和抗小鼠IgG磁性Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)通过负选择纯化CD4+T细胞。在96孔板的一式三份孔内完全培养基中，将2×104纯化过的CD4+T细胞与5×105来自未处理同源小鼠的T-缺失的脾细胞一起培养。T-缺失的脾细胞是这样制备的，即，在37℃下将脾细胞与大鼠抗小鼠-Thy-1抗体(T24)和豚鼠补体(VHBIO Ltd，Gosford，UK)一起保温45min。在培养前，在37℃下将T-缺失的脾细胞预先保温±CGG(20μg/孔)达1小时，并在3000拉德下辐照。培养3天后，收获上清液，利用关于小鼠IFN-γ和来自R&D(Abingdon，Oxon，UK)的IL-4的Quantikine M试剂盒按生产商的指示测定细胞因子。
OVA特异性增殖检测
为了测定抗原诱导的增殖反应，在第一次免疫接种32～35天后杀死小鼠。在平底96孔浅盘中以5×105于0.2ml/孔含不同浓度OVA(0、50、100和200μg/ml)的10％ FCS RPMI培养基中的浓度培养来自每只小鼠脾的单脾细胞悬浮物的细胞。在37℃下5％ CO2的湿润培养箱中保温4天后，添加0.5μCi的3H胸苷(Dupont-NEN，Boston，MA)。进一步保温18小时后，在助滤器(filtermate)A(Wallac，Turku，Finland)上收获细胞并在闪烁计数器(Betaplate，Wallac，Turku，Finland)上读出放射性活度。结果以一式三份测试的三只小鼠的平均cpm±SD.表示。
CGG特异性Elispot检测
用CGG以20μg/ml于pH9.6的碳酸盐缓冲液中的浓度涂布Multi-Screen-IP无菌Elispot平板(Millipore，Walford，UK)一夜。用PBS洗涤5次后，在37℃下用4％奶的PBS溶液将平板封阻2小时并用PBS洗涤5次。如上述那样从DrLNs制备细胞悬浮物，洗涤，在1500rpm下离心10min，重悬浮于增补了15％ FCS的完全培养基中。将全部样品一式三份以数个不同的细胞浓度(2×104～5×105个细胞/孔)铺板。在37℃下5％CO2中培养一夜后，再用PBS-Tween(0.05％)彻底洗涤平板。通过在室温下与缀合了AP的同种型特异性多克隆山羊抗小鼠抗体(Southern Biotechnology)保温2小时而揭示CGG特异性抗体。洗涤后，将以1mg/ml在(0.1M Tris/HCl，pH9.5；10％二乙醇胺；0.1M NaCl，5mM MgCl2)中稀释的BCIP(Sigma)用作AP的底物。通过用自来水洗涤平板而终止反应。在显微镜下数斑点。
实施例1.在用CGG+poly IC免疫接种的小鼠内的抗体应答：
I型IFN的重要性
首先通过应用聚肌胞苷酸(poly IC)，一种合成的双链RNA，在体内诱导I型IFN的产生而测试了I型IFN作为佐剂的能力。通过皮下注射鸡丙种球蛋白(CGG)的PBS溶液将C57BL/6(B6)小鼠免疫接种，并检验了一起注射poly IC的效果。(通过皮下注射100μg鸡丙种球蛋白(CGG)的PBS溶液，或者皮下注射与100μg poly IC混合的相同量CGG的PBS溶液，将C57BL/6(B6)小鼠免疫接种)。免疫接种10天后，通过酶联免疫吸附测定法检测血清以确定各种同种型的CGG特异性抗体的存在。
图1A中报导了相关结果。单独的CGG免疫原性差，而且响应主要局限于IgG1亚类的抗体；检测到IgM、IgG2b、IgG2a和IgG3抗体都在很低水平。一起注射poly IC刺激了CGG特异性抗体滴定度的明显增大，它适用于IgG的所有亚类(图1A)。这包括IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3抗体的滴定度分别增大3-、4.2-、9-和8.4-倍。
虽然已知poly IC是I型IFN的有效诱导物，但它还诱导其它细胞因子。因此，重要的是确定polyIC的佐剂活性实际上是否依赖于I型IFN。为此，我们比较了poly IC在缺乏I型IFN功能受体的小鼠(I型IFNR KO小鼠，它们都基于129背景)中与在对比(129)小鼠中增强抗体应答的能力(免疫接种是按前述那样进行的)。
象在B6小鼠中那样，poly IC显著增强了对比129小鼠中对CGG的抗体应答(图1B)。反之，poly IC在I型IFNR KO小鼠中大为降低了这种能力。在I型IFNR KO小鼠中观察到IgM、IgG1和IgG2b滴定度的小幅升高，说明poly IC能不依赖于I型IFN而增强这些同种型的产生。然而，poly IC的大部分效果依赖于I型IFN，因为在I型IFNR KO小鼠中这些抗体的滴定度比在对比小鼠中低得多。
此外，在I型IFNR KO小鼠中，IgG2a和IgG3抗CGG抗体的产生根本不受poly IC的刺激。总之，这些信息表明，诱导I型IFN在宿主中的表达刺激了对可溶性蛋白质抗原的抗体应答的显著增大，它包括所有IgG亚类的抗体。
实施例2.用OVA+佐剂免疫接种的小鼠中的抗体应答：I型IFN 的重要性
用首次皮内注射OVA、OVA+IFA、OVA+CFA、OVA+CpG或OVA+alum来处理小鼠。对于抗原，应用了10μg于50μl中的剂量，将IFA和CFA与抗原以1∶1v/v比率混合并乳化直到获得稳定的乳液，以10μg的量应用CpG并与抗原混合，而应用的alum量是吸附OVA的足够量。在首次免疫接种后，用单独的OVA进行了第二次(第10天)和第三次(第17天)处理。用生理盐水处理对比小鼠。结果表明，单独的OVA免疫原性差，激发很低的抗体应答，而佐剂的一起注射导致OVA特异性抗体应答的增大(图2)。在IFA、CFA、或CpG的情况下，这种增强作用特别显著，而对于alum则较不显著。IgG亚类表征说明了，IFA和CFA对IgG1和IgG2a亚类这两者(通常分别与Th-2和Th-1型的抗体应答相关)起有效的佐剂作用(图2A)，而CpG对IgG2a(Th-1型)以及alum对IgG1(Th-2型)的特异性更大(图2B)。为了确定佐剂活性是否由I型IFN介导，我们比较了所有这些佐剂在缺乏I型IFN的功能受体的小鼠(I型IFNR KO小鼠C3H/HeJ)内增强抗体应答的能力。结果表明，与对比小鼠相比，I型IFNR KO小鼠内的OVA特异性IgG2a和IgG1亚类仅仅稍微增大了(图2A和2B)。这证实了I型IFN在增强由典型Th-1促进佐剂激发的抗体应答中所起的功能作用。
实施例3.来自用CGG+poly IC免疫接种的小鼠的T细胞的体外 增殖和IFN-γ产生：I型IFN的重要性
还估测了I型IFN对T细胞致敏的影响。这最初是通过测定LN T细胞在体外受CGG再刺激时增殖的能力而进行的。在免疫接种(如实施例1中所述)10天后除去导流LNs(DrLNs)并将形成的细胞悬浮物在存在或不存在CGG时培养。将poly IC与CGG一起注入对比(129)小鼠导致比单独用CGG免疫接种高得多的CGG特异性体外增殖反应(图3A)；用BrdU进行脉冲处理说明了，体外增殖的大部分细胞都是CD4+(没有示出数据)。T细胞致敏的增强部分地不依赖于I型IFN，因为I型IFNRKO小鼠的polyIC处理也导致体外增殖反应的一定增大(图3A)。但是，来自CGG+poly IC注射的I型IFNR KO小鼠的细胞的增殖比来自CGG+poly IC注射的对比小鼠的低得多，说明I型IFN实际上强烈地增强了体内T细胞响应。当检验体外再刺激的CD4+T细胞的细胞因子产生时，这也是明显的(图3B)。
因此，虽然当通过CGG体外刺激时来自单独用CGG免疫接种的小鼠的CD4+DrLN细胞分泌很少(如果有的话)IFN-γ，但是来自poly IC+CGG注射的小鼠的CD4+细胞产生的IFN-γ量显著更高。重要的是，polyIC增强IFNγ-分泌CD4+T细胞的致敏的程度在对比小鼠中比I型IFNRKO小鼠中要大得多。反之，在所有的组中(它们并非彼此显著不同)从CD4+细胞分泌少量IL-4。因此，I型IFN的体外诱导增强了T细胞致敏，促进IFN γ-分泌CD4+T细胞的产生。
实施例4.内源性I型IFN在用OVA+佐剂免疫接种的小鼠内的体 外T细胞增殖和DTH响应中的作用
在实施例2中所述的免疫接种结束时，杀死小鼠并取出脾进行对OVA的增殖检测。在图4中，示出了用含100μg OVA的培养基培养的脾细胞的3H胸苷摄取结果。在该试验中，来自用OVA、OVA+CFA(图4A)或者OVA、OVA+CpG、或OVA+alum(图4B)接种的I型IFN R+/+小鼠的所有脾细胞与生理盐水处理的对比物相比显示了显著的增殖(OVA+alum例外)，而在任意I型IFNR KO小鼠处理组内没有检测到增殖。在平行试验中，用稍微不同的方案接种了一些正常小鼠和I型IFNR KO小鼠，其中，还在第二次和第三次免疫接种中施用了佐剂，随后用OVA攻击脚垫(footpad)以测定DTH响应(图4C和4D)。与对比物相比，在I型IFNR KO小鼠中观察到的缺损性DTH响应说明了，佐剂诱导的DTH响应由内源性I型IFN介导。在这方面，值得一提的是，能诱导DTH的所有佐剂在小鼠内注射后也刺激I型IFN产生(没有示出)。
实施例5.通过用I型IFN处理来刺激初级抗体应答
起初利用部分纯化的鼠I型IFN的高滴定度制剂(它包含IFN-α和IFN-β)研究了外源性I型IFN对抗体应答的影响。对B6小鼠皮下注射100μg单独的CGG或相同剂量的CGG+105U IFN-α/β(IFN 1X)。此外，用CGG+IFN-α/β注射的不同组小鼠在1天后接受了单独的IFN-α/β(105U)第二次皮下注射(IFN 2X)，或者在1天和2天后接受了IFN-α/β(105U)皮下注射(IFN 3X)。如图5A中所示，用IFN-α/β处理小鼠强烈地增大了CGG特异性抗体应答；在接受3次注射I型IFN的小鼠中效果最显著，并且关于IgG的所有亚类都是明显的。在任意小鼠组内都检测不出CGG特异性IgE(没有示出数据)。用IFN-α/β处理同样增强了LPS无反应的C3H/HeJ小鼠中的抗体应答，不考虑内毒素污染的可能性(没有示出数据)。
利用亲和纯化的IFN-β进行了同样的试验(图5B)。在该情况下，一次注射IFN-β足以增强初级抗体应答，不过，至于部分纯化的IFN-α/β，最高抗体滴定度是在三次注射IFN-β后达到的。一次、两次或三次注射IFN-β后，抗体滴定度分别增大：5，6和8倍(对于IgM)；6.4，8.5和12.8倍(对于IgG1)；13.3，16和26.6倍(对于IgG2b)；25.6，32和153.6倍(对于IgG2a)；16.6，64和117.3倍(对于IgG3)。与利用部分纯化的IFN-α/β的试验一起考虑，这些结果清楚地表明，在免疫应答早期施用I型IFN显著增大了对可溶性蛋白质抗原的初级抗体应答。
实施例6.用CGG+预先吸附在alum上的I型IFN接种的小鼠中的 抗体应答
为了确定延长I型IFN的半寿期是否增强它作为佐剂的能力，在皮下注射以前将I型IFN-α/βU)与CGG(100μg)和饱和量的alum混合；证实了这种策略大为增强了IL-12(24)的佐剂活性。意外地，当预先吸附到alum上时，一次注射I型IFN使CGG特异性抗体应答增强到与3次注射可溶性I型IFN相似的或更大的程度(图6)。
alum预先吸附的增强效果对于IgG2a产生来说最为显著。该结果启示，延长I型IFN的存在确实增大了它的佐剂活性并且可能具有关于利用I型IFN为佐剂的实际意义。
实施例7.I型IFN和其它佐剂的比较
为了进一步估测I型IFN作为佐剂的效率，我们比较了它们与商品化佐剂增强初级抗体应答的能力。用两种油基佐剂进行了初始比较，即，不完全弗氏佐剂(IFA)和Titermax。
将这些佐剂与含有100μg CGG的抗原溶液以1∶1 v/v比率混合并乳化直到形成稳定的乳液。然后，将小鼠免疫接种，分析血清中抗CGG抗体的存在。虽然IFA和Titermax刺激了更高水平的IgG1抗体，但I型IFN诱导IgM和IgG2b抗体的能力相当于这些佐剂，而且在增大IgG2a和IgG3抗体的产生方面远远优于这些佐剂(图7)。
作为佐剂活性的更严谨的试验，比较了I型IFN与完全弗氏佐剂(CFA)。人们长期认为CFA是对小鼠的佐剂活性的“黄金标准”，而且已知它增强所有同种型的抗体的产生。所以，我们比较了免疫接种10天后，用单独的CGG、CGG+CFA或CGG+IFN-α/β注射的对比小鼠(WT 129)和IFN-IR KO小鼠中CGG特异性抗体的滴定度(图8)。
在对比小鼠中，用CGG+IFN-α/β或CGG+CFA注射的小鼠内的抗体滴定度比用单独的CGG免疫接种的那些小鼠中的更高。显著的是，IFN-α/β的佐剂活性比CFA更有利。其实，虽然CFA诱导更高滴定度的IgM抗体(仅仅在129背景上)，但IFN-α/β刺激了相似滴定度的IgG1和IgG2b抗体的产生。此外，IFN-α/β比CFA诱导了更高水平的IgG2a和(至少对129sv背景)IgG3抗体。因此，这些结果表明，IFN-α/β确实具有强有效的佐剂活性。
当考虑下列情况时效果特别显著，即，被比较的响应是针对可溶性蛋白质+可溶性IFN-α/β的那些，它们可能被迅速清除，以及针对CFA的油性乳液，它能长时间保留在注射部位。
实施例8.内源性I型IFN在CFA的佐剂活性中与在刺激对单独蛋 白质的响应中的作用
CFA和IFA或Titermax的佐剂活性之间一个值得注意的差异是，只有前者能诱导显著滴定度的IgG2a或IgG3抗体。因为这是I型IFN享有的性质，它引起了这个问题，即，CFA这样的能力是否涉及通过该佐剂诱导内源性I型IFN。由CFA诱导的I型IFN似乎有可能，假定CFA的关键组分是热杀死的分枝杆菌，而已知像CpG DNA这样的细菌组分可刺激I型IFN的产生。
为了检验这个假设，我们比较了IFN-α/β和CFA在I型IFNR KO小鼠与对比小鼠中增强对CGG的抗体应答的能力(图8)。正如所料，IFN-α/β在I型IFNR KO小鼠中完全不能增强对CGG的响应。重要的是，在I型IFNR KO小鼠中还高度缺乏CFA促进抗体应答的能力。虽然CFA在I型IFNR KO小鼠中仍然诱导高滴定度的IgG1抗体，但与单独用CGG免疫接种相比，不再有IgM、IgG2b、IgG2a或IgG3抗体的任何增强。这些结果阐明了I型IFN在CFA的佐剂活性中的重要作用。
实施例9.通过I型IFN诱导长期抗体产生和记忆
已经证实了I型IFN增强初级抗体应答，有意义的是确定该应答是否是长久的。最初，通过检测一次注射CGG或者CGG+3次IFN-α/β注射(如实施例5中所述)6个月后小鼠的血清，我们检验了长期抗体产生(图9A)。单独用CGG致敏的小鼠在6个月后具有极低水平的CGG特异性抗体。
反之，用CGG+IFN-α/β致敏的小鼠在其血清中仍然具有显著滴定度的CGG特异性抗体。IgG3例外(对于它来说，滴定度很低并且没有显著不同于单独用CGG致敏的小鼠中的那些)，所有试验的同种型抗体都存在。因此，在致敏过程中注射I型IFN允许长期抗体产生。
仍有争议的是，长期抗体产生是通过长寿命浆细胞保持的还是通过补充来自记忆B细胞的抗体产生细胞保持的。因此，有趣的是研究记忆是否也是通过在I型IFN存在下的免疫接种诱导的。为此，我们检验了6个月前致敏的小鼠以建立对CGG的再次应答的能力。因此，再次单独用CGG(100μg)注射已经在6个月前被注射单独的CGG或CGG+3次IFN-α/β注射的小鼠。为了将对CGG的初次应答产生的贡献减到最小，在攻击后第6天研究了再次应答，将首次用于实验的未致敏的小鼠用作对比。比较了再次注射CGG前后同样的小鼠内CGG特异性抗体滴定度(图9B)。
在6个月前单独用CGG致敏的小鼠中，对CGG攻击的响应与首次用于实验的小鼠中的应答区分不开，说明了单独用CGG致敏6个月后对CGG没有记忆。然而，在鲜明的对比中，6个月前用CGG+IFN-α/β致敏的小鼠确实建立了对CGG迅速的再次应答。不过，该再次应答似乎局限于IgG2b和IgG2a抗体同种型，尽管实际上高滴定度的IgG1抗体持久存留在这些小鼠中。这些结果清楚地说明了，在一次注射可溶性蛋白质抗原后，I型IFN促进了长寿命记忆的产生。
实施例10.通过I型IFN刺激树突细胞而发生抗体应答和同种型 转换的增强
虽然I型IFN明显能显著增强抗体应答的强度和向各种IgG亚类的转换，但还不知它们的体内作用机制。我们设计了一个采用的转换模型，其中，DC是能响应IFN-α/β的仅有细胞。在这些试验中，将5～7×105来自野生型129小鼠或I型IFNR KO小鼠的高度纯化的脾DC和100μg CGG短暂地保温，然后与或者不与IFN-α/β(105U)一起皮下注入I型IFNR KO受体。接受CGG+DC+IFN-α/β的小鼠如前述那样进一步接受两次注射IFN-α/β。随后在免疫接种后第10天测定CGG特异性抗体滴定度(图10)。
正如所料，接受CGG+I型IFNR KO DC的小鼠的IFN-α/β处理没有增强抗体应答，因为这些小鼠中没有能响应I型IFN的细胞。相反，与仅仅注射CGG+野生型DC相比，在接受CGG+野生型DC的小鼠内注射IFN-α/β导致对全部四个IgG亚类的抗体滴定度的增大。因此，不但由I型IFN刺激DC确实增强了对一起注射的蛋白质的抗体应答，它还足以引起同种型转换。
实施例11.接种了型IFN为佐剂的流感疫苗的小鼠的抗体应答
我们用15μg单独的或者与2×105UI型IFN结合的纯化过的亚单位流感疫苗经肌内或鼻内注射C57BL/6(B6)小鼠。在免疫接种7天或14天后，通过酶联免疫吸附测定法分析流感特异性抗体的存在。一起注射I型IFN导致对流感特异性抗体应答的强烈剂量依赖性佐剂效果(图11A)。图11B示出了，在抗原注射后长时间施用I型IFN两天进一步增大了流感特异性抗体应答。
值得注意的是，含IFN佐剂的疫苗在所有处理的小鼠中引起相似的应答，而单独的疫苗即使在反复免疫接种后也只在有限数量的小鼠(约30％)中引起抗体应答。图11C示出了，应用I型IFN为佐剂在疫苗之前、以后或与疫苗同时的不同时间施用时的不同效果。最佳佐剂效果是在将IFN与疫苗一起共同注射时观察到的。图12a示出了，用含I型IFN佐剂的疫苗进行的鼻内接种使流感疫苗高度免疫原性。有趣的是，流感特异性抗体同种型的分析显示了通常与Th-1型免疫应答相关的IgG2a抗体亚类的诱导。值得注意的是，含IFN佐剂的疫苗比单独的疫苗导致更强的抗病毒攻击的保护作用(图12B)。
实施例12.I型IFN是流感疫苗的异常有效的粘膜佐剂
在第一组试验中，通过给予2次相隔14天的鼻内施用单独的或与I型IFN混合的流感疫苗而对C57BL/6小鼠免疫接种；每次接种两周后测定了抗体水平(图14a)。在第一次接种后在IFN处理过的动物中可检测到抗体产生(特别是IgG2a)的普遍增多。第二次接种后两周，与仅仅注射疫苗的动物相比，IFN处理过的小鼠中抗体滴定度进一步增大了。特别是在此时间点，与仅仅注射疫苗的小鼠相比，在用与IFN混合的疫苗接种的动物中观察到IgG2a和IgA滴定度的剧增(分别增大1000倍和100倍)。用IFN为佐剂接种的小鼠还比对比动物显示更高水平的分泌性肺IgA。有趣的是，由攻击后的存活率数值和小鼠重量没有减轻揭示了，经鼻内施用含IFN佐剂的疫苗的所有小鼠都受到防止流感病毒感染的保护，而在仅仅用疫苗接种的动物中只发现部分的保护作用(图14b)。在一个对IFN-IR KO小鼠和对比C3H/HeN小鼠进行的类似免疫接种试验中，证实了I型IFN在两个时间点在对比动物内诱导IgG2a和IgA这个方面优于MF59，而MF59在两次免疫接种后诱导IgG1抗体方面更有效(图14c，底部)。不出所料，在用IFN为佐剂经鼻内接种的IFN-IR KO动物中观察到对所有Ig亚类都没有显著的抗体应答。反之，MF59仍然能在IFN-IR KO小鼠中诱导IgG1抗体，但是，与在对比动物中检测的响应相比，IgG2a和IgA的诱导基本上被消除了(图14c)。
实施例13.病毒攻击后的小鼠存活率和IgG滴定度的增大没有紧 密的关联
如前述那样用FLU疫苗对C57BL/6小鼠进行一次肌内(系统性的)或鼻内(粘膜的)免疫而进行接种，而且在14天后测定了IgG滴定度。
从图15可见，证实了一次施用含佐剂的疫苗足以引起对受攻击的动物的完全保护。
此外，病毒攻击后小鼠的存活率与IgGs的增大没有紧密联系。实际上，用不含佐剂的疫苗获得的IgG滴定度的显著增大没有引起存活率的任何显著增大：约10％小鼠在病毒攻击后存活了。
另一方面，I型IFN佐剂与疫苗结合的效果，虽然比起单一的疫苗效应来导致IgG滴定度的适当增大，但是即使在一次免疫接种处理后也导致病毒攻击后的小鼠存活率惊人的增大(约100％)。

Claims (30)

1.I型IFN在制备用来增强在体内保护性免疫接种处理中对疫苗的Th-1型体液免疫应答的无毒佐剂组合物中的应用，其中，其中应用的IFN剂量大于或等于100.000IU/疫苗剂量。
2.权利要求1的应用，其中，增强的体液免疫应答引起选择性诱导IgG1和/或IgG2a和/或IgG2b和/或IgG3和/或IgA和/或IgM产生。
3.权利要求1或2的应用，其中，所述保护性免疫接种处理是通过皮下、肌内或皮内注射或者经口或粘膜施用而进行的。
4.权利要求3的应用，其中，粘膜施用是鼻内或经口施用并且导致局部的和/或系统性的保护性免疫。
5.权利要求1～4任一项的应用，其中，配制所述组合物和疫苗供同时送递所述佐剂和疫苗到施用部位。
6.权利要求1～5任一项的应用，其中，所述体内保护作用是在一次免疫接种后实现的。
7.权利要求1～5任一项的应用，其中，所述体内保护作用是这样实现的：首先同时施用疫苗和佐剂组合物，然后在疫苗注射后第1天或者第1天和第2天单独施用一个附加剂量的佐剂组合物。
8.权利要求1～7任一项的应用，其中，所述I型IFN是天然IFN-α、合成的重组I型IFN、重组IFN-α亚类、IFN-β、IFN-ω、或者编码I型IFN的一员或多员的核酸序列。
9.权利要求8的应用，其中，所述I型IFN是聚乙二醇处理过的I型IFN亚类。
10.权利要求1～9任一项的应用，其中，所述I型IFN剂量在1×106～6×106IU范围内。
11.权利要求1～10任一项的应用，其中，所述I型IFN是与能靶向树突细胞的单克隆抗体融合的重组I型IFN。
12.权利要求1～11任一项的应用，其中，所述疫苗包含一种或多种来自一种感染剂或来自其它来源的抗原。
13.权利要求12的应用，其中，所述疫苗包含一种或多种来自肿瘤的抗原。
14.权利要求11或13的应用，其中，所述抗原的量是1～1000μg。
15.权利要求14的应用，其中，所述抗原的量是10～200μg。
16.一种疫苗，它包含作为佐剂、剂量大于或等于100.000IU/疫苗剂量的I型IFN，用于可控、长期释放抗原和佐剂。
17.供皮下、肌内或皮内注射或者经口或粘膜施用的权利要求16的疫苗。
18.权利要求17的疫苗，其中，粘膜施用是鼻内或经口施用。
19.权利要求16～18任一项的疫苗，其中，所述I型IFN是天然IFN-α、合成的重组I型IFN、重组IFN-α亚类、IFN-β、IFN-ω、或者编码I型IFN的一员或多员的核酸序列。
20.权利要求16～19任一项的疫苗，其中，所述I型IFN是聚乙二醇处理过的I型IFN亚类。
21.权利要求16～20任一项的疫苗，其中，所述I型IFN剂量在1×106～6×106IU范围内。
22.权利要求16～21任一项的疫苗，其中，所述I型IFN是与能靶向树突细胞的单克隆抗体融合的重组I型IFN。
23.权利要求16～22任一项的疫苗，其中，所述疫苗包含一种或多种来自一种感染剂或来自其它来源的抗原。
24.权利要求16～23任一项的疫苗，其中，所述疫苗包含一种或多种来自肿瘤的抗原。
25.权利要求16～24任一项的疫苗，其中，所述抗原的量是1～1000μg。
26.权利要求25的疫苗，其中，所述量是10～200μg。
27.权利要求16或26任一项的疫苗，其中，所述I型IFN剂量在1×106～6×106IU范围内。
28.权利要求16～27任一项的疫苗，它进一步包含铝盐。
29.分部分的试剂盒，它包含：
含有剂量大于或等于100.000IU的I型IFN的无毒佐剂组合物；以及
一种疫苗，它包含至少一种抗原和药物上可接受的载体，介质或助剂；
在预防或治疗与所述抗原的存在相关的疾病中用于分别，同时或依次使用。
30.制备权利要求16～28任一项的疫苗的方法，它包括这一步骤，即，将一种抗原和剂量大于或等于100.000IU/疫苗剂量的I型IFN一起配制于可控、长期释放组合物中。
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