CN107233568A - 一种免疫马用的免疫佐剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫马用的免疫佐剂，其含有马Interferon‑alpha‑1。本发明的免疫佐剂设计巧妙，应用方便，使用后可以较大幅度提高被免疫动物的抗体滴度水平，从而使抗血清产品质量明显提高，表现在抗血清的比活性高，杂蛋白减少，相应的副作用也可以降低，具有很大的实用价值，适于大规模推广应用。

Description

一种免疫马用的免疫佐剂
技术领域
本发明涉及用基因工程技术领域，具体涉及一种免疫佐剂，尤其涉及一种免疫马用的免疫佐剂。
背景技术
抗破伤风免疫球蛋白是治疗破伤风感染时能用的唯一有特效的解毒药物。抗破伤风免疫球蛋白通常是用大型家畜免疫破伤风类毒素，待抗破伤风免疫抗体达到一定滴度时采取血浆提取抗体成份制备而成。当这些抗体注射入破伤风感染病人体内时，抗毒素可以很快中和相应的破伤风毒素。在破伤风感染治疗中，抗破伤风免疫球蛋白发挥了无可替代的作用。抗破伤风免疫球蛋白是治疗破伤风毒素中毒的最快速、最有效的药物。
抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤时能用的唯一有特效的解毒药物。抗蛇毒血清通常是用大型家畜免疫相关的蛇毒，待蛇毒抗体达到一定滴度时采取血浆提取抗体成份制备而成。当这些抗蛇毒血清注射入被毒蛇咬伤病人体内时，抗血清可以很快中和相应的蛇毒。在蛇伤治疗中，马抗蛇毒血清发挥了无可替代的作用。马抗蛇毒血清是治疗蛇伤的最快速、最有效的药物。在我国每年有10万余人被毒蛇咬伤，临床上使用的抗蛇毒血清高达8万人份。
制备这些免疫球蛋白和抗血清每年需要上千万毫升高抗体滴度的马血浆，因此每年马匹的保有量达到数百匹。实际生产中，经常碰到免疫动物对抗原反应不一，有的马匹能产生高滴度的抗体；有些马匹对抗原刺激反应很弱，产生的中和抗体滴度很低甚至没有抗体，这部分马匹占整个免疫马群的30%左右。即使马匹能产生高效价的抗体，随着采血浆的次数增加，马匹体内的抗体滴度也会下降以致从这类马中采取的血浆无法用于抗毒素、抗血清的生产。这部分马匹无法用于生产，对产能影响很大。
免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时一般无免疫原性，但是与抗原物质协同使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答反应类型的物质。
细胞因子(cytokine)是一类机体在免疫反应时产生的免疫调节物质。机体的免疫系统在受到抗原和各种免疫佐剂的刺激后，产生的应答性物质，这类物质统称为细胞因子。天然的细胞因子为哺乳动物产生的蛋白质，多数为分子量较小的单体（1x104-2.5x104），也有天然状态为二体或三体的。免疫反应通常是由多种细胞因子参与调节的。细胞因子对抗原递呈细胞(APC)的作用有增加APC的数量和活化APC的功能两个方面。
Interferon-alpha-1（干扰素α1）是一种增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用的细胞因子。Interferon-alpha-1可以明显提高机体的体液免疫机能。我们在使用马Interferon-alpha-1预防马病毒性传染病时发现一群对抗原免疫反应差的、反复多次抗原免疫后血清抗体滴度低的马匹，在注射Interferon-alpha-1后抗体效价明显提高，这个发现提示Interferon-alpha-1可以作为一种免疫佐剂以提高马匹抗血清的产量和质量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种免疫马用的免疫佐剂。该免疫佐剂设计巧妙，应用方便，使用后可以较大幅度提高被免疫动物的抗体水平，具有很大的实用价值。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种免疫马用的免疫佐剂，含有马Interferon-alpha-1。
作为本发明优选的技术方案，所述的马Interferon-alpha-1采用基因工程重组表达方法制得，即重组马Interferon-alpha-1。所述的重组马Interferon-alpha-1是根据中国发明专利申请号201710147935.6的说明书中记载的方法制备，所述重组马Interferon-alpha-1的制备方法，包括如下步骤：
（1）将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；
（2）转入酵母细胞进行培养后诱导表达；
（3）进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1。
较佳地，步骤（1）中，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列；步骤（2）中，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞（即Pichia pastoris细胞），更佳地，所述毕赤酵母细胞（即Pichia pastoris细胞）是GS115细胞。
所述酵母细胞表达载体是毕赤酵母表达载体，载体转染入毕赤酵母细胞（Pichiapastoris细胞）后与酵母染色体重组整合入酵母染色体中。
所述的酵母表达载体是适合于毕赤酵母细胞（Pichia pastoris细胞）的表达载体。
较佳地，所述的酵母表达载体为Pichia pastoris分泌型载体。更佳地，所述的酵母表达载体为Pichia pastoris分泌型载体，其所用的启动子为AOX1启动子，能表达Interferon-alpha-1。
较佳地，所述诱导表达在培养液的OD600达到20-400时启动。更佳地，所述OD600为50-300。更进一步地，所述OD600为150-250。
较佳地，所述的表达载体是分泌型表达载体，更进一步地，所述诱导表达通过甲醇进行。
较佳地，所述纯化采用离子交换层析将所述重组马Interferon-alpha-1以单体形式分离。
重组Interferon-alpha-1纯化后可以进一步超滤浓缩然后添加保护剂和/或冷冻干燥保存。
制备的马Interferon-alpha-1用于配制免疫佐剂，免疫马匹，从而提高马匹对相应抗原产生的抗体的效价。
作为本发明优选的技术方案，所述的重组马Interferon-alpha-1蛋白溶液的浓度在0.01毫克/毫升和50毫克/毫升之间；较佳地，在0.01毫克/毫升和10毫克/毫升之间；更佳地，在0.02毫克/毫升和3毫克/毫升之间。
作为本发明优选的技术方案，所述免疫佐剂的每毫升免疫剂量中含有马Interferon-alpha-1的量为1-100微克；较佳地，为10-80微克；更佳地，为20-30微克。
作为本发明优选的技术方案，所述马Interferon-alpha-1为水溶液注射液。
作为本发明优选的技术方案，所述免疫佐剂用量及使用方法具体如下：所述免疫佐剂每次注射的免疫剂量为1毫升，注射部位为马的颈部或臀部，注射于皮下或肌肉内；抗原每2周免疫注射一次，动物注射抗原后的第一天开始每天注射一次所述免疫佐剂，连续注射七天，然后间隔1周，开始第二次抗原注射免疫，抗原注射的第一天开始，每天注射一次马Interferon-alpha-1，连续注射七天，然后间隔1周，开始第三次抗原注射免疫和马Interferon-alpha-1注射，这种序列的免疫程序依次循环。
作为本发明优选的技术方案，每毫升所述免疫佐剂含有1-100微克马Interferon-alpha-1、1毫克甘氨酸、0.8毫克氯化钠、1.6毫克醋酸钠。
作为本发明优选的技术方案，所述免疫佐剂的pH值为4.0-4.5。
本发明的有益效果在于：将具有高度生物学活性的重组马Interferon-alpha-1配制成一种免疫佐剂，这种佐剂用于免疫马匹时可以大幅度提高动物的抗体滴度，从而使抗血清产品质量明显提高，表现在抗血清的比活性高，杂蛋白减少，相应的副作用也可以降低。应用方便，使用后可以较大幅度提高被免疫动物的抗体水平，具有很大的实用价值，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是实施例1中毕赤酵母重组表达和纯化后的马Interferon-alpha-1在还原条件下的SDS-PAGE电泳结果示意图，从左到右：泳道1为蛋白分子量标准，从上到下分别为97、66、45、31、20、14kD；泳道2为SP-Sepharose离子交换层析获得的马Interferon-alpha-1；泳道3为SP-Sepharose离子交换层析获得的马Interferon-alpha-1经分排阻层析纯化的马Interferon-alpha-1。
图2是本发明实施例11中免疫蝮蛇毒抗原并采血浆3年以上马匹在免疫蝮蛇抗原的同时用不同量马Interferon-alpha-1注射动物获得的抗体滴度比较示意图，未用Interferon-alpha-1的免疫动物，抗体的滴度较低；使用含5微克Interferon-alpha-1，动物的免疫反应较前者高；使用含20-30微克Interferon-alpha-1的动物，免疫后抗体的滴度最佳。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特以重组马Interferon-alpha-1制剂用于马蝮蛇毒素免疫为例，列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：重组马Interferon-alpha-1制备
根据发明专利申请“一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法”(中国专利申请号201710147935.6)说明书中记载的方法，用基因工程的方法，在毕赤酵母中分泌表达，获得的细胞培养液经固液分离、离子交换层析、分子排阻层析、超过滤浓缩等方法制备而成，用此方法得到的重组马Interferon-alpha-1的纯度大于95%，蛋白浓度在0.1-10毫克/毫升范围，比活性等于或大于4 x 106unit/mg。
具体制备步骤如下：
1、表达序列获取和优化
为了达到使马Interferon-alpha-1在酵母细胞内高表达这个目的，通过查文献得到该完整基因的氨基酸序列（即SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列）。根据这个氨基酸序列，确定编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列（即SEQ ID NO:1所示的序列），经密码子优化设计了核苷酸序列（即SEQ ID NO:2所示的序列），将该核苷酸序列插入表达载体，然后转化酵母细胞。然后使用相应的诱导物进行诱导表达。可以使用毕赤酵母诱导表达系统。
2、表达细胞株的构建和表达克隆筛选
在优选实施方案中，含密码子优化的马Interferon-alpha-1的核苷酸序列（即SEQ IDNO:1所示的序列） 在5’端加上XhoI位点和AAA AGA核苷酸序列，在3’端加入EcoRI位点。选用pPIC9质粒（Invitrogen），用XhoI和EcoRI双酶切使之线性化。将具有XhoI和EcoRI酶切获得的马Interferon-alpha-1 DNA 与XhoI和EcoRI线性化的pPIC9质粒（Invitrogen）连接，然后转化大肠杆菌菌株DH5ɑ（Invitrogen）获得，名称定为pPIC9-Interferon-alpha-1。可理解，本发明不限于马Interferon-alpha-1因子，也涉及其它动物来源的（狗、羊、兔等）的Interferon-alpha-1。
pPIC9-Interferon-alpha-1用SalI酶切使之成线性，用苯酚：氯仿：异戊醇（phenol:chloroform:isoamyl alcohol）(25:24:1)抽提后，上清加乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA干燥去乙醇后加10微升TE缓冲液。
表达宿主细胞采用Pichia pastoris细胞株GS115。在长有GS115的YPD（YeastExtract Peptone Dextrose Medium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基）平板上挑取单克隆细胞接种到含5毫升YPD培养基的50毫升conical（圆锥形）管中，在28-30℃，250-300rpm条件下培养过夜。取0.5毫升过夜的培养细胞接种到含500毫升YPD培养基的2升三角烧杯中，在28-30℃，250-300rpm条件下培养至OD600=1.3-1.5。培养液1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于500毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于250毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于温度为2-8℃、20毫升1 M 山梨醇中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于温度为2-8℃、1毫升1 M 山梨醇中，此时重悬液的体积为1.5毫升左右。10微克线性化pPIC9-Interferon-alpha-1加入到80微升重悬的GS115细胞中混匀后转移到0.2cm的电转杯中，电转杯在冰浴中放置5分钟，在电转仪上脉冲电击细胞一次。电击后立即加入1毫升冰冻1 M 山梨醇，并转移到1.5毫升离心管中。取200微升涂布到RDB板（RDB培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；50mg/L L-谷氨酸；50mg/L L-甲硫氨酸；50mg/L L-赖氨酸；50mg/L L-亮氨酸；50mg/LL-异亮氨酸；20g/L琼脂）上，RDB板置28-30℃培养5-7天。挑取克隆，同时接种在MD培养板（MD培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，20g/L琼脂）和MM培养板（MM培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；5ml/L甲醇；20g/L琼脂）上，置28-30℃培养2天。两天后比较同一克隆在MD培养板和MM培养板上生长状况，在MD和MM培养板上生长正常的克隆为Mut+,在MD培养板上生长正常，在MM培养板上生长很慢或不生长的克隆为Muts。
挑取Mut+克隆接种在含5毫升YPD培养基（YPD培养基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖）的50毫升conical管中， 置28-30℃摇床200-250rpm生长2天。离心弃上清，添加含1%甲醇的YP培养基（YP培养基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨）5毫升，置28-30℃摇床200-250rpm生长72小时，在培养24小时和48小时时每管分别加甲醇25微升。72小时后取培养上清，用SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分析。SDS-PAGE参照Sambrook et al.,Molecular Biology: A Laboratory Method,1989上的方法进行。成层胶4%，分离胶12.5%。培养上清50微升和等量SDS-PAGE上样缓冲液混匀后取20微升上样。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，分析结果。GS115细胞诱导后无19KD处蛋白条带，而在无精氨酸培养板上生长的13克隆大部分在19KD处有蛋白条带，有的克隆表达量高，有的克隆仅微量表达。表达阳性的克隆，在19KD处可见一蛋白条带。
3、干扰素纯化
取50毫升SP-Sepharose FF装入2.6x10cm层析柱，凝胶先后用2体积1M NaCl, 2体积0.5 N NaOH清洗后用pH4.0、50 mM醋酸缓冲液平衡。
四个2000毫升三角烧瓶，每个含500毫升YPD培养基，均接种筛选到的最佳Interferon-alpha-1表达克隆，28-30℃摇床200-250rpm生长48小时，离心弃上清，在无菌条件下各加含0.5%（v/v）甲醇的YP培养基500毫升，28-30℃摇床200-250rpm生长72小时，每24小时各添加2.5毫升甲醇。72小时后离心取上清，上清用20%醋酸调pH至4.0，上已经平衡的SP-Sepharose FF离子交换层析柱。上样完毕，层析柱用pH4.0、50 mM醋酸缓冲液洗涤至OD280小于0.05，接着用pH4.0、50 mM醋酸、0.5 M氯化钠缓冲液洗脱，收集洗脱获得的蛋白峰，这个蛋白峰即为高纯度重组马Interferon-alpha-1。马Interferon-alpha-1的氨基酸序列（带有信号肽）如SEQ ID NO:3所示，重组表达马Interferon-alpha-1的氨基酸序列（无信号肽）如SEQ ID NO:4所示。
毕赤酵母重组表达和纯化后的马Interferon-alpha-1在还原条件下的SDS-PAGE电泳结果如图1所示，从左到右：泳道1为蛋白分子量标准，从上到下分别为97、66、45、31、20、14kD；泳道2为SP-Sepharose离子交换层析获得的马Interferon-alpha-1；泳道3为SP-Sepharose离子交换层析获得的马Interferon-alpha-1经分排阻层析纯化的马Interferon-alpha-1。
实施例2：5微克/ml浓度的马Interferon-alpha-1佐剂配制
于50毫升Falcon试管内先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化钠、80毫克醋酸钠，注射用水加至40毫升，加入250微克马Interferon-alpha-1，接着用2 M醋酸调pH至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌过滤膜除菌过滤后置2-8°C保存，在1周内使用完毕。
实施例3：10微克/ml浓度的马Interferon-alpha-1佐剂配制
于50毫升Falcon试管内先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化钠、80毫克醋酸钠，注射用水加至40毫升，加入500微克马Interferon-alpha-1，接着用2 M醋酸调pH至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌过滤膜除菌过滤后置2-8°C保存，在1周内使用完毕。
实施例4：20微克/ml浓度的马Interferon-alpha-1佐剂配制
于50毫升Falcon试管内先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化钠、80毫克醋酸钠，注射用水加至40毫升，加入1000微克马Interferon-alpha-1，接着用2 M醋酸调pH至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌过滤膜除菌过滤后置2-8°C保存，在1周内使用完毕。
实施例5：30微克/ml浓度的马Interferon-alpha-1佐剂配制
于50毫升Falcon试管内先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化钠、80毫克醋酸钠，注射用水加至40毫升，加入1500微克马Interferon-alpha-1，接着用2 M醋酸调pH至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌过滤膜除菌过滤后置2-8°C保存，在1周内使用完毕。
实施例6：40微克/ml浓度的马Interferon-alpha-1佐剂配制
于50毫升Falcon试管内先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化钠、80毫克醋酸钠，注射用水加至40毫升，加入2000微克马Interferon-alpha-1，接着用2 M醋酸调pH至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌过滤膜除菌过滤后置2-8°C保存，在1周内使用完毕。
实施例7：50微克/ml浓度的马Interferon-alpha-1佐剂配制
于50毫升Falcon试管内先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化钠、80毫克醋酸钠，注射用水加至40毫升，加入2500微克马Interferon-alpha-1，接着用2 M醋酸调pH至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌过滤膜除菌过滤后置2-8°C保存，在1周内使用完毕。
实施例8：干扰素活性测定
用rhIFN-ɑ2b作对照（人干扰素生物学活性测定的国家标准品），采用滤泡性口膜炎病毒（VSV）-人羊膜传代细胞（WISH）体系测定干扰素的抗病毒活性。系依据干扰素可以保护人羊膜细胞WISH免受VSV破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。
试剂:
1.细胞培养液：每升MEM培养基加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，除菌过滤，4℃保存。
2.完全培养液：量取新生牛血清10ml加MEM培养液90ml。4℃保存。
3.测定培养液：量取新生牛血清7ml加MEM或RPMI 1640培养液93ml, 4℃保存。
4.攻毒培养液：量取新生牛血清3ml加MEM培养液97ml,4℃保存。
5.消化液：取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g 加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。使用时加胰蛋白酶至0.25%（w/v）浓度。
6.染色液：取结晶紫50mg加无水乙醇20ml溶解后加水稀释至100ml即得。
7.脱色液：取无水乙醇50ml、乙酸0.1ml加水稀释至100ml。
8. PBS缓冲液：取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。
9. 标准品溶液的制备：取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔，在无菌条件下操作。
10. 供试品溶液制备：将供试品按标示量溶解后用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个孔，在无菌条件下操作。
具体实验如下：
使WISH细胞在含10%小牛血清的MEM培养基中贴壁生长。按1:3传代，每周2次于完全培养液中生长。弃去培养液用PBS洗贴壁细胞2次后，消化和收集细胞，用含10%小牛血清的MEM培养基配制成每1ml 含2.5×105-3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养6小时。弃去孔中细胞培养液，将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。弃去细胞培养板中的上清液。分别向每孔加100μl将配制好的水泡性口炎病毒（VSV）（-70℃保存）攻毒培养液。于37℃、5%二氧化碳培养24小时，镜检观察细胞状况后弃细胞培养板中的上清，每孔加入染色液50μl，室温放置30分钟后用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3-5分钟。混匀后用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，计算实验样品中的半效稀释倍数，然后按公式：待测样品效价=标准品效价x待测样品预稀释倍数/标准样品预稀释倍数x待测样品半效稀释倍数/标准样品半效稀释倍数。经测定，1毫克马Interferon-alpha-1活性为3.5x108，其活性与人α2b干扰素相似。
实施例9：蝮蛇毒素灭活
蝮蛇毒冻干粉加入PBS，使之溶解配成20毫克/毫升浓度，滤纸过滤除去不溶性颗粒后用0.22微米孔径的除菌过滤膜过滤除菌。除菌后的蝮蛇毒溶液边搅拌边滴加甲醛溶液，甲醛溶液加至最终甲醛浓度为0.2%，充分搅拌混匀后室温放置7天，使蛇毒完全灭活。
实施例10： 灭活蛇毒的LD50比较
LD50初步确定实验：
选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力初步确定试验。用生理盐水稀释蛇毒至不同的浓度，每个浓度取0.5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小时观测小鼠的成活状况。根据预初试验的结果，初步推断出蛇毒致死的剂量。
LD50试验：
选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力试验，每6只分成一组，所需组数则根据试验需要而定。采用Blliss简化几率单位法测定蛇毒毒力，以半数致死量LD50表示。未经灭活蛇毒、甲醛灭活蛇毒根据预初试验的结果把剂量调节至使用最高剂量时小鼠的死亡率接近100%，最小剂量时小鼠的死亡率接近0%，在最高剂量和最低剂量之间添加3－5个剂量组，各剂量组之间的比值衡定。注射蛇毒后观察48小时，记录小鼠的成活状况。未经处理的蝮蛇蛇毒的LD50为0.6mg蛇毒/kg小鼠体重；甲醛灭活蝮蛇蛇毒的LD50为196 mg蛇毒/kg小鼠体重。
免疫用的灭活蛇毒浓度为5毫克/毫升，与等体积的羊毛脂石蜡油佐剂（2份石蜡油，1份羊毛脂混匀后121度高温高压灭菌后制成）充分混匀乳化后背部皮下2点注射。
实施例11：重组马Interferon-alpha-1促进马抗体效价试验
本实验选择免疫蝮蛇毒、采血3年以上、血浆中和抗体效价低于100U/ml的马匹24匹，分8组，每组各3匹马。各组马匹均每两周背部皮下注射5毫克蝮蛇抗原；同时注射蝮蛇抗原后第一天开始每天肌肉注射马Interferon-alpha-1一次，共七次；第一组作为对照，用生理盐水代替马Interferon-alpha-1；第二、三、四、五、六、七、八组均注射马Interferon-alpha-1，使用的剂量分别为1、5、10、20、30、40、50微克/次。每次抗原免疫前4天，采血进行抗血清中和活性试验。
如图2所示，该实施例11的实验结果显示，第一组不用重组马Interferon-alpha-1的免疫马匹，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒83 LD50（±14）。第二组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射1微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒75 LD50（±0）。第三组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射5微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒108 LD50（±14）。第四组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射10微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒158 LD50（±14）。第五组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射20微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒250 LD50（±39）。第六组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射30微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒250 LD50（±43）。第七组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射40微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒225 LD50（±25）。第八组在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射50微克重组马Interferon-alpha-1，经5次免疫后获得的抗血清混合后测得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒225 LD50（±43）。
这个实验表明重组马Interferon-alpha-1可以提高动物对抗原的免疫反应，使得抗体的滴度增高。如图2所示，在Interferon-alpha-1和抗血清滴度的量效关系上，显示：未用Interferon-alpha-1的免疫动物，抗体的滴度较低；使用含5微克Interferon-alpha-1，动物的免疫反应较前者高；在5-50微克Interferon-alpha-1时都能使动物的抗体滴度提高，但是使用含20-30微克Interferon-alpha-1的动物，免疫后抗体的滴度最佳。
实施例12：重组马Interferon-alpha-1促进马抗体效价持续性试验
本实验选择免疫蝮蛇毒、采血3年以上、血浆中和抗体效价低于100U/ml的马匹5匹，每两周背部皮下注射5毫克蝮蛇抗原，注射抗原后的前七天，每天肌肉注射30微克重组马Interferon-alpha-1，每隔一次抗原免疫前4天采血进行抗血清中和活性试验，如血清中和活性大于125个ED50，则采血浆3000毫升，接着进行下一轮免疫。免疫持续进行52周。
该实施例12中，3匹马免疫后血清效价与采血浆量见下表1：
表1
实施例12的结果表明应用长期马Interferon-alpha-1作为佐剂，能持续获得高效价的抗血清，对抗血清的生产有明显的增产效果。
实施例13： 抗血清中和活性试验（ED50）
一、抗血清ED50范围初步测定试验：
抗血清的效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验，其方法是把抗原和特异性抗体作用一定时间后，再给动物注射，借助动物体的反应情况来判定抗血清的效价。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以小白鼠注射抗蛇毒血清与蛇毒混合液后，动物的生存死亡情况，确定血清的效价。
为了确定抗血清的中和剂量范围，5LD50的蝮蛇毒与不同浓度的抗血清混合成1毫升体积后在37 ℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射一只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这种预初试验获得小鼠100%存活和100%死亡所用的抗血清的浓度范围。如样品批号为610号马血清，其5.2倍稀释后按上述方法处理小鼠，所有小鼠都存活，当稀释倍数为14.8倍时所有小鼠都死亡。
二、中度有效剂量（The medium effective dose, ED50）试验：
根据抗血清ED50范围初步测定试验获得的小鼠100%存活和100%死亡所用的抗血清的浓度，将ED50所用的抗血清浓度在这个范围进行分组，每组试验的小鼠为5只，体重在18－20克之间。免疫血清效价的测定采用固定蛇毒剂量、改变血清剂量的方法，即取1毫升浓度蝮蛇毒溶液(蛇毒以LD50为单位)加入1毫升含不同血清，混合后置37℃1小时，取0.4毫升注射小白鼠腹腔内作中和反应测定之，以含抗血清最低浓度量动物不死亡为中和终点，计算1毫升血清中和蛇毒数量。一个ED50的抗体可以中和1个LD50的蝮蛇毒。试验结果见下表2：
表2
样品 ED50的计算：
待检品效价= 待检品ED50×5U（1个U相当于1个蝮蛇毒LD50）。
序列表
<110>上海赛伦生物技术股份有限公司
<120>一种免疫马用的免疫佐剂
<130>HJ17-13343
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> 马Interferon-alpha-1
<400> 1
atggctttgc cagtttcttt gttgatggct ttggttgttt tgtcttgtca ctctatctgt 60
tctttgggtt gtgacttgcc acacactcac tctttgggta acactagagt tttgatgttg 120
ttgggtcaaa tgagaagaat ctctccattc tcttgtttga aggacagaaa cgacttcggt 180
ttcccacaag aagttttcga cggtaaccaa ttcagaaagc cacaagctat ctctgctgtt 240
cacgaaacta tccaacaaat cttccacttg ttctctactg acggttcttc tgctgcttgg 300
gacgaatctt tgttggacaa gttgtacact ggtttgtacc aacaattgac tgaattggaa 360
gcttgtttgt ctcaagaagt tggtgttgaa gaaactccat tgatgaacga agactctttg 420
ttggctgtta gaagatactt tcagagaatc gcgttgtact tgcaagagaa gaagtactct 480
ccatgtgctt gggaaatcgt tagagctgaa atcatgagat cgttctcttc ttctactaac 540
ttgccacaat ct 552
<210> 2
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggctttgc cagtttcttt gttgatggct ttggttgttt tgtcttgtca ctctatctgt 60
tctttaggtt gtgacttacc acacactcac tctttgggta acactagagt tttgatgttg 120
ttaggtcaaa tgagaagaat ctctccattc tcttgtttga aggacagaaa cgacttcggt 180
ttcccacaag aggttttcga cggtaaccaa ttcagaaagc cacaagctat ctctgctgtt 240
cacgaaacta tccaacaaat cttccacttg ttctctactg acggttcttc tgctgcttgg 300
gacgaatctt tgttagacaa gttgtacact ggtttgtacc aacaattgac tgaattagag 360
gcttgtttgt ctcaagaagt tggtgttgaa gagactccat tgatgaacga agactctttg 420
ttagctgtta gaagatactt tcagagaatc gcattgtact tacaagagaa gaagtactct 480
ccatgtgctt gggaaatcgt tagagctgag atcatgagat cgttctcttc ttctactaac 540
ttaccacaat ct 552
<210> 3
<211> 553
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
METALALEUP ROVALSERLE ULEUMETALA LEUVALVALL EUSERCYSHI SSERILECYS 60
SERLEUGLYC YSASPLEUPR OHISTHRHIS SERLLEUGLY ASNTHEARGV ALLEUMETLE 120
ULEUGLYGLN METARGARGI LESERPROPH ESERCYSLEU LYSASPARGA SNASPPHEGL 180
YPHEPROGLN GLUVALPHEA SPGLYASNGL NPHEARGLYS PROGLNALAI LESERALAVA 240
LHISGLUTHR ILEGLNGLNI LEPHEHISLE UPHESERTHR ASPGLYSERS ERALAALATR 300
PASPGLUSER LEULEUASPL YSLEUTYRTH RGLYLEUTYR GLNGLNLEUT HRGLULEUGL 360
UALACYSLEU SERGLNGLUV ALGLYVALGL UGLUTHRPRO LEUMETASNG LUASPSERLE 420
ULEUALAVAL ARGARGTYRP HEGLNARGIE UALALEUTYR LEUGLNGLUL YSLYSTYRSE 480
RPROCYSALA TRPGLUILEV ALARGALAGL UILEMETARG SERPHESERS ERSERTHRAS 540
NLEUPROGLN SER 553
<210> 4
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
CYSASPLEUP ROHISTHRHI SSERLLEUGL YASNTHEARG VALLEUMETL EULEUGLYGL 60
NMETARGARG ILESERPROP HESERCYSLE ULYSASPARG ASNASPPHEG LYPHEPROGL 120
NGLUVALPHE ASPGLYASNG LNPHEARGLY SPROGLNALA ILESERALAV ALHISGLUTH 180
RILEGLNGLN ILEPHEHISL EUPHESERTH RASPGLYSER SERALAALAT RPASPGLUSE 240
RLEULEUASP LYSLEUTYRT HRGLYLEUTY RGLNGLNLEU THRGLULEUG LUALACYSLE 300
USERGLNGLU VALGLYVALG LUGLUTHRPR OLEUMETASN GLUASPSERL EULEUALAVA 360
LARGARGTYR PHEGLNARGI EUALALEUTY RLEUGLNGLU LYSLYSTYRS ERPROCYSAL 420
ATRPGLUILE VALARGALAG LUILEMETAR GSERPHESER SERSERTHRA SNLEUPROGL 480
NSER 484

Claims (14)

1.一种免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，含有马Interferon-alpha-1。
2.根据权利要求1所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述的马Interferon-alpha-1采用基因工程重组表达方法制得，即重组马Interferon-alpha-1。
3.根据权利要求2所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述重组马Interferon-alpha-1蛋白溶液的浓度在0.01毫克/毫升和50毫克/毫升之间。
4.根据权利要求3所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述重组马Interferon-alpha-1蛋白溶液的浓度在0.01毫克/毫升和10毫克/毫升之间。
5.根据权利要求4所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述重组马Interferon-alpha-1蛋白溶液的浓度在0.02毫克/毫升和3毫克/毫升之间。
6.根据权利要求1所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述免疫佐剂的每毫升免疫剂量中含有马Interferon-alpha-1的量为1-100微克。
7.根据权利要求6所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述免疫佐剂的每毫升免疫剂量中含有马Interferon-alpha-1的量为10-80微克。
8.根据权利要求7所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述免疫佐剂的每毫升免疫剂量中含有马Interferon-alpha-1的量为20-30微克。
9.根据权利要求1所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述马Interferon-alpha-1为水溶液注射液。
10.根据权利要求1所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于， 所述免疫佐剂每次注射的免疫剂量为1毫升，注射部位为马的颈部或臀部，注射于皮下或肌肉内；抗原每2周免疫注射一次，动物注射抗原后的第一天开始每天注射一次所述免疫佐剂，连续注射七天，然后间隔1周，开始第二次注射抗原免疫，依次循环。
11.根据权利要求1所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，每毫升所述免疫佐剂含有1-100微克马Interferon-alpha-1、1毫克甘氨酸、0.8毫克氯化钠、1.6毫克醋酸钠。
12.根据权利要求1或9或11所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述免疫佐剂的pH值为4.0-4.5。
13.根据权利要求2所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，所述重组马Interferon-alpha-1的制备方法，包括如下步骤：
（1）将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；
（2）转入酵母细胞进行培养后诱导表达；
（3）进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1。
14.根据权利要求13所述的免疫马用的免疫佐剂，其特征在于，步骤（1）中，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列；步骤（2）中，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞。
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