CN1332018C - 冻干母牛分枝杆菌制剂（微卡）及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)及其制备方法和用途，微卡制剂中含有母牛分枝杆菌菌体和保护剂，保护剂中含有谷氨酸钠或天门冬素，蔗糖，氯化钠或氯化钾，无水磷酸二氢钾，无水磷酸氢二钠和水。其制备方法是先培养菌种，分离出菌体，随后利用高压气流剪切技术对菌体进行无细胞处理，最后加入冻干保护剂经灭活，控制蛋白含量在45±10%μg/ml后，分装小瓶，半加塞后送冻干箱内进行冻干，轧盖后即成成品，用于治疗各种肿瘤、乙肝、艾滋病、皮肤病、皮炎、感冒、类风湿关节炎、哮喘等。本发明菌苗副作用小，安全性好，是治疗作用广，效果显著的生物制剂。

Description

冻干母牛分枝杆菌制剂（微卡）及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种生物菌苗制剂，更具体的说是一种关于具有免疫调节作用的母牛分枝杆菌菌苗制剂。

背景技术

母牛分枝杆菌是1964年Bonicke等从牛乳腺中分离得到的，1968年Tsukamura证实，该菌为快生长分枝杆菌，广泛分布于自然界，在草地、牧场、水塘中均有发现，该菌呈丰满短杆菌。长1.0～4.0微米，略弯曲，两端圆或偶尔粗大。分枝稀疏但偶尔观察到外型细胞，在鸡蛋培养基上2～3天通常可产生光滑湿润、发光、奶油状园丁型菌落，带有深黄色到橙色素，菌株对光照极为敏感，在完全黑暗生长1～2天为非产色素，但短暂曝光后，即黄色色素，该菌生长温度为22～40℃，17℃及42℃培养时，生长受到局限，及色素产生受到抑制。母牛分枝杆菌经培养、生物技术处理，菌液经高温灭活的液态菌苗临床研究证明其为双向免疫调节剂，目前主要用于结核病人治疗。

目前全世界已有17亿人感染了结核杆菌，每年新增病例800万，累计约有2000万结核病人，死于结核病的人数达300万人，居传染病死亡人数第一位。尤其在第三世界国家，结核病的流行情况更为严重。我国结核病的流行形势也十分严峻，据调查，我国感染结核杆菌的人数已超过3.3亿，约有600万结核闰人，每年约有26万人死于该病，是全世界结核病高负担国家之一。单一的化疗模式将难以阻挡结核病复燃及其所造成结核病死亡人数进一步增多。WHO在其90年代《结核病研究与发展战略规划白皮书》中提出了化学疗法与免疫疗法相结合的研究方案，在免疫疗法中所推荐的唯一免疫治疗剂即M.Vaccae菌苗即冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)。

母牛分枝杆菌菌苗制剂常见有皮内注射、肌肉注射两种途径及冻干、液体两种剂型，皮内注射由于注射部位接触外界环境易形成类似于BCG接种局部反应；而正确的菌苗肌肉注射一般异常反应较轻，此外，由于分枝杆菌外层存在腊质，在液体状态易聚成团，接种时易产生局部毒副反应。而冻干剂型的保护剂冻干后可在胞壁外层形成保护膜，防止相互沾连。

发明内容

本发明的目的是提供一种冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)及其制备方法和用途。本发明应用高压气流剪切技术制备以母牛分枝杆菌胞壁为为刺激剂、蛋白为诱导剂的无细胞菌苗，解决了国外相关制品副反应大，每隔半年注射一次，治疗效果差的难题。而且不引起细菌菌体及大菌体碎片导致的副作用；本发明选用冻干肌肉注射剂型取代国外液体皮内注射剂型。同时为保证菌体安全性，对冻干保护剂选择进行了研究，比较了不同类型保护剂冻干效果，最终优选出保护剂，使得菌苗制剂保护剂含量仅6-7mg/支，易溶而且成形美观，使用时以纯水稀释，通过以上各工序的改进，制品达到原实验设计的保留免疫原性减少毒副作用的设计要求。

本发明系统研究了冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)治疗结核病、哮喘、肿瘤、流行性感冒、皮肤病、乙肝等诸多新的治疗用途，使其成为安全性好，治疗作用谱广，效果显著的生物制剂。

本发明的技术方案如下：

一种冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其特征在于其中包含有全部或部分母牛分枝菌菌体。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其特征在于其中含有母牛分枝杆菌菌体和保护剂，保护剂中含有谷氨酸钠或天门冬素，蔗糖，氯化钠或氯化钾，无水磷酸二氢钾，无水磷酸氢二钠和水。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其特征在于其中含有母牛分枝杆菌菌体及精制部分和保护剂，菌体与保护剂的配比8～12mg/ml，保护剂是3.8～4.2倍量的甲液和2.8～3.2倍量的乙液的混合物，保护剂PH值为7.0～7.5，所述成份以蛋白为标示量，含0.5mg菌体含蛋白标示量为11～27μg；

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素  8～12g

蔗糖                8～12g

氯化钠              26～30g

无水磷酸二氢钾      16～19g

其余为纯水；

3000ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素  6～9g

蔗糖                6～9g

氯化钠            20～23g

无水磷酸氢二钠    53～56g

其余为纯水。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其更具体的配比中含有母牛分枝杆菌菌体和保护剂，菌体与保护剂的配比9～11mg/ml，保护剂是3.8～4.2倍量的甲液和3倍量的乙液的混合物，，保护剂PH值为7.0～7.2，所述菌体中蛋白含量为：0.5mg菌体含蛋白18～27μg；

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素    10g

蔗糖                  10g

氯化钾                28.8g

无水磷酸二氢钾        17.4g

其余为纯水；

3000ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素    7.5g

蔗糖                  7.5g

氯化钠                21.6g

无水磷酸氢二钠        54.9g

其余为纯水。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其更具体的配比中含有母牛分枝杆菌菌体和保护剂，菌体与保护剂的配比10mg/ml，保护剂是4倍量的甲液和3倍量的乙液的混合物，，保护剂PH值为7.2，所述菌体中蛋白含量为：0.5mg菌体含蛋白18～27μg；

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素    10g

蔗糖                  10g

氯化钠                28.8g

无水磷酸二氢钾        17.4g

其余为纯水；

300ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素    7.5g

蔗糖                  7.5g

氯化钠            21.6g

无水磷酸氢二钠    54.9g

其余为纯水。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其特征在于所述的菌体细胞结构破裂。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其特征在于制成冻干粉，注射液，片剂，糖丸，胶囊，气雾剂，喷雾剂。

本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的制备方法，其特征在于包括以下步骤；

(1)、低温下冷冻保藏母牛分枝杆菌菌种，在室温下溶解，接种于培养基，培养3～7天：

(2)、将培养物洗下，收集于离心桶，离心，除去上清液，收集菌体；再以灭菌生理盐水洗涤菌体，离心，除去上清液；称出菌体重量；用保护剂配成10mg/ml的菌悬液；

(3)、进行无细胞处理，对收集的菌体进行高压破碎，使菌体细胞破裂；

(4)、菌体中加入冻干保护剂制成原液，灭活，再加入冻干保护剂，配成指定浓度分装液；

(5)、分装成小瓶，送入冻干箱内进行冻干，轧盖。

上述冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的制备方法，其步骤为：

(1)、低温-70℃下冷冻保藏母牛分枝杆菌菌种，在室温下溶解，接种于罗氏培养基，于37～39℃下培养3～7天；

(2)、培养物洗下，收集于离心桶，离心，除去上清液，收集菌体；再以灭菌生理盐水洗涤菌体，离心40～50分钟，除去上清液；称出菌体重量；

(3)、菌体进行无细胞处理，利用高压匀质机对收集的菌体进行高压破碎，压力为40Mpa以上，处理10～15次，使菌体细胞破裂，并精制。

(4)、菌体中加入冻干保护剂制成原液，加热或辐射灭活，再加入冻干保护剂，控制菌体蛋白含量为45±10％μg/ml：

(5)、分装成小瓶，送入冻干箱内进行冻干，轧盖。

本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的用途，其特征在于用于治疗各种肿瘤、乙肝、艾滋病、皮肤病、皮炎、感冒、类风湿关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、前列腺疾病、各种结核。

本发明对母牛马分枝杆菌制剂(微卡)进行进行了大量的研究工作，研究结果报告如下：

一、微卡对机体免疫功能的影响

1.1对T淋巴功能的影响：

以氚标记胸腺吡啶核苷掺入法检测每分钟脉冲数比，比较M.Vaccae活菌。M.Vaccae菌苗对健康人外周血T淋巴细胞增殖反应的影响。以此作为评价治疗以细胞介导免疫为主的结核病菌免疫功能障碍免疫制剂效力的指标参数。在加入单一刺激因子实验中，对照组CPM为3721±1035，加入活菌BCG组CPM为6904±1216，，M.Vaccae活菌辐射灭活及高温灭活菌体的CPM分别为9544±1727、8530±744、8230±1035，这四种制剂刺激激指数均在2.0以上。其结果表明M.Vaccae三种制剂与BCG基本相似，在体外对T淋巴细胞增殖反应有明显促进作用，其中以活菌制剂和M.Vaccae菌苗更为明显；另一试验中以重组白细胞介素作对照，BCG，M.Vaccae三种制剂分别加入rlL-2，观察菌体抗原加rlL-2对T淋巴细胞有无增殖反应无协同效应，对照组CPM为，该结果说明：M.Vaccae三种制剂对T淋巴细胞增殖反应有明显协同促进作用，其效果优于BCG。

1.2对免疫功能低下动物的恢复作用

为验证M.Vaccae菌苗对免疫功能低下个体是否有恢复其免疫功能作用.选用环磷酰胺为免疫抑制剂，皮下注射小鼠，正常动物对照组注射生理盐水。注射免疫抑制剂小鼠随机分组分别注射BCG，M.Vaccae菌苗及盐水安慰剂，正常动物，免疫功能抑制安慰剂组，BCG以及M.Vaccae菌苗组实验结果分别为：以小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞吞噬指数为指标各组结果为：0.70±0.66；0.38±0.07；1.68±0.90；2.01±0.09；淋巴细胞转化率为指标各组结果分别为：31.4±2.90；13.5±2.80；31.6±3.30；35.6±3.85；小鼠血清中溶菌酶含量为指标各组结果为：271.5±89.6；233.8±105.0；293±109；340.0±125.1。实验结果证实：M.Vaccae菌苗可有效恢复免疫功能低下动物的免疫功能至正常或高于正常水平，其效果略高于BCG，但统计学无显著性差异。

1.3对结核病患者细胞免疫功能的影响：

本发明观察和评价母牛分枝杆菌制剂在结核病免疫辅助治疗对患者免疫功能及肺部病征的影响，免疗+化疗组：化疗+母牛分枝杆菌制剂治疗。化疗组：只用化疗，不用母牛分枝杆菌制剂治疗。T细胞亚群：APPAP桥联法(单克隆抗体碱性磷酸酶标记法)，CD3、CD4、CD8三个指标及CD4/CD8治前1次；治中第2、4、6个月月末各1次，观察对象分为初治患者及免疫功能低下难治结核病患者2组。

初治肺结核组中，免疫治疗组在制剂治疗6个月后，CD3和CD4均较制剂治疗前显著升高(P＜0.05，差别显著＝；CD8较苗苗治疗前显著降低(P＜0.001，差别非常显著＝CD4/CD8比值显著升高(P＜0.001，差别非常显著)。对照组T细胞亚群的变化与免疗组相近似，免疗组与对照组之间无显著差别(P＞0.05)。

难治性肺结核配对免疗组与化疗组T细胞亚群测定结果显示，免疗组制剂疗程结束后，CD3、CD4显著升高，与制剂治疗前比较差别非常显著(P＜0.001＝，CD8治疗后较治疗前显著降低(P＜0.001＝，CD4/CD8比值治疗后升高(P＜0.001)。免疗组各项指标与化疗组比较差别非常显著(P＜0.001)，免疫指标改善显著高于化疗(对照)组，提示制剂对免疫功能低下难治性肺结核的细胞免疫有显著改善调节作用。

二、微卡产生抗感染免疫效应因子

2.1对巨噬细胞产生下标H₂O₂的影响

巨噬细胞在抗感染免疫中起着重要作用，在结核病灶周围聚集和活化的巨噬细胞可控制已形成干酪样中心病灶的命运，如果这些巨噬细胞有足够杀伤细菌的能力，病灶将不会发展。如果细菌能在巨噬细胞内生长，病灶周围巨噬细胞将会死亡，病灶将扩大，因此巨噬细胞活化状态是评价免疫调理剂的一个重要指标。根据巨噬细胞，单核细胞，多形核白细胞在一定条件下可诱导产生超氧离子；及这些物质杀灭肿瘤细胞和微生物这一特性，选用为检测指标，探讨M.Vaccae菌苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生H₂O₂水平的影响。实验以M.Vaccae菌苗1mg/0.2ml/只，0.25mg/0.2ml/只剂量腹腔免疫BALB/C小鼠，阴性对照为PBS，免疫10天后检测小鼠腹腔巨噬细胞产生量，结果显示免疫小鼠腹腔产生水平明显高于未免疫小鼠.不同免疫剂量对产生量不受影响，M.Vaccae菌苗作为结核病免疫治疗剂其作用之一是通过活化巨噬细胞产生H₂O₂而达到杀菌效果

2.2对巨噬细胞产生NO的影响

NO在体内除了是一种重要的信号分子，还是一种有力的效应分子，NO水平的提高有利于机体对寄生在细胞内细菌、病毒的杀伤和清除作用，实验以M.Vaccae菌苗1mg/0.2ml/只，0.25mg/0.2ml/只剂量腹腔免疫BALB/C小鼠，阴性对照为PBS，免疫10天后检测小鼠腹腔巨噬细胞产生NO量，结果显示免疫小鼠腹腔产生水平明显高于未免疫小鼠。

三、微卡的免疫调控作用

3.1对迟发型超敏反应的调控作用：

迟发型超敏反应(DTH)超强常见于结核病初、中期患者，DTH是各类淋巴细胞及淋巴因子共同作用的细胞免疫反应，该指标超强可视为免疫功能亢进，此项研究以迟发型皮肤超敏反应检测指标，探讨M.Vaccae菌苗对结核菌感染豚鼠DTH抑制作用.以及DTH与抗结核保护力相关性.实验以攻击健康豚鼠，攻击后10天肌肉注射0.6mg/0.5ml和0.3mg/0.5mlM.Vaccae菌苗，阴性对照注射生理盐水.攻击后第2、5、8周各组豚鼠皮内注射120IU/0.2ml，攻击后13周解剖动物，分离活菌，3次皮试结果均显示治疗组皮肤变态反应明显小于对照组，脾菌分离数亦低于对照组，皮肤变态反应大小与疗效结果一致.该结果提示：注射M.Vaccae菌苗后机体有效抑制了体内结核杆菌繁殖数量，从而抑制及延缓迟发型变态反应的形成。此外，在对健康豚鼠注射M.Vaccae菌苗后，可诱导产生皮肤的变态反应达8-12mm.，而对已由H₃₇Rv活菌致敏豚鼠可抑制皮肤变态反应形成或反应减弱，该结果也证明M.Vaccae是一种双向的免疫调节制剂。

3.2通过NO进行免疫调节作用：

M.Vaccae通过NO进行免疫调节作用的研究，也得到类似的结果。在第一组实验中，用不同剂量M.Vaccae菌苗免疫BAIB/C小鼠，通过检测间接反应的NO的变化，结果显示免疫小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO水平明显高于未免疫小鼠，不同免疫剂量产生NO水平无显著性差异：在第二组实验中，用感染结核菌的豚鼠，10天后给受染豚鼠注射M.Vaccae菌苗，结果受染豚鼠经治疗后其NO水平明显低于未治疗对照组，以上结果表明NO作为一种新型的生物信使分子和细胞毒性因子，其作用是双向的。其一，M.Vaccae免疫小鼠使小鼠腹腔巨噬细胞产生高水平NO，通过细胞毒作用杀死结核杆菌；其二，结核杆菌致病性抗原在机体作用中，使淋巴细胞数量增加但活力减弱，而M.Vaccae菌苗使受染动物NO水平下降则有利于提高淋巴细胞抗感染能力，这与M.Vaccae菌苗治疗结核病患者使用后其淋巴细胞抗原反应较前者增殖明显增加，皮肤变态反应明显下降相一致.因此，M.Vaccae对感染机体有免疫调节作用，使机体更有利于适应外在变化，达到自我稳定的作用。

3.3 Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶表达影响

本发明从分子病理学角度探讨母牛分枝杆菌制剂的免疫调节机制。方法是将BALB/C小鼠随机分为3组：单纯攻毒(A)、母牛分枝杆菌制剂免疫攻毒(B)和正常对照组(N)。经尾静脉注射H37RV建立结核病小鼠模型，母牛分枝杆菌制剂由腹腔注射。肉眼观察肺脏病变指数并采用免疫组化学染色和常规HE染色，探讨IFN-r、IL-4、iNOS表达与肺脏组织损伤的类型和程度的关系。结核病小鼠病变弥漫，伴有灶性干酪坏死，免疫组织化学染色结果显示在炎性渗出及肉芽肿内IFN-r阳性细胞随时间推移逐渐增多，至第6周达到高峰，与正常对照组比较有非常显著性差异。此后为Tho平衡期，在肺损伤组织中IFN-r和IL-4阳性细胞基本相当。INOS表达在急性期增多慢性期减少。母牛分枝杆菌制剂免疫攻毒组小鼠肺组织病变，以增殖结节、淋巴样结节为主，未见坏死病变，免疫反应表现为：感染全过程中以Th1应答为主，即IFN-r阳性细胞逐渐增多，第8周达到高峰，IL-4阳性细胞一直维持在低水平，未出现THO平衡期。INOS表达一直维持在高水平。结论母牛分枝杆菌调节结核小鼠免疫的可能机制为：启动TH1应答，抑制TH2应答，激活iNOS活性，增强机体保护性免疫。

综上所述，微卡具有调节免疫功能，增强肺结核患者抗结核菌感染的细胞免疫能力，能加速初治、复治及难治肺结核短程化疗阴转的速度，加快病灶的吸收好转及空洞缩小，关闭的速度，4个月化疗加6个月免疫治疗疗效与6个月化疗疗效一致。缩短了初治肺结核短程化疗的疗程。提高难治性肺结核化疗的疗效。

四、微卡对肺部纤维化的影响

大鼠染尘2周后用母牛分支杆菌免疫，实验动物分①单纯染尘组；②染尘+母牛分支杆菌组；按五级分类分析矽结节。结核结节和矽结节的分布范围按如下方法统计：无病变为0；病变范围＜10％为+；10％-25％为++；＞25％-50％为+++；＞50％为++++。(7)统计：实验数据经新药统计程序软件(NDST)处理。单纯染尘组矽结节为：0，0，+++，++，+；染尘+母牛分支杆菌组矽结节为+，+++，+，0，0，染尘动物注射母牛分支杆菌后不仅没有加重尘肺纤维化进展，反而减轻尘肺纤维化。尘肺结核组结核病变以渗出、坏死为主，而母牛分支杆菌组、异烟肼组以及母牛分支杆菌并用异烟肼组中结核病变以增殖结核结节和淋巴样结节为主，结果提示母牛分支杆菌对尘肺纤维化有减轻作用。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)具有提高机体免疫功能改变肺部病变，安全可靠的双向免疫调节剂，可以用于SARS的治疗，并取得了明显效果。

五、微卡的哮喘毒理研究

1、致敏豚鼠抗原攻击后气道阻力(R_L)和肺动态顺应性(Cdyn)的影响：

致敏豚鼠抗原攻击后R_L增高，C_dyn降低。模型组R_L最大增幅为109％，C_dyn最大降幅为33％。冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)肌注2.25μg、7.5μg、22.5μg/只及气道给药2.25μg/只均可显著保护致敏豚鼠再次吸入卵白蛋白抗原后R_L的增高和C_dyn降低有明显保护作用。

2、冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)对致敏豚鼠抗原攻击后BALF中炎症细胞的影响；

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)2.25μg/只、7.5μg/只和22.5μg/只(im)能明显抑制致敏豚鼠抗原攻击后支气管肺泡灌流液中白细胞总数增加。冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)3个剂量的抑制嗜酸性粒细胞百分率分别为27.0％、62.3％和86.2％，ID₅₀(95％可信限)为14.5(11.6～18.0)μg/kg(以每只豚鼠350g计算)。

3、冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)对致敏豚鼠离体气道高反应性的影响：

致敏豚鼠在抗原攻击后，其离体气管平滑肌与正常豚鼠的离体气管平滑肌比较，对CCH的收缩作用反应性增高。冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)2.25μg/只、7.5μg/只、22.5μg/只肌肉注射呈剂量依赖抑制CCH引起的致敏豚鼠离体气管收缩反应，使CCH的收缩反应曲线右移。

4、冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)对致敏小鼠抗原攻击后BALF中IFN-γ和IL-4水平的影响：

致敏小鼠抗原攻击后引起的BALF中IFN-γ降低和IL-4水平的升高，与空白和致敏不攻击组比较(P＜0.05)；冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)肌肉注射(22.5μg/只)与模型组比较可明显抑制IFN-γ的降低1L-4水平的上升(P＜0.05)，与DXM腹腔注射0.5mg/kg组比较无差异(P＞0.05)。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)具有抗炎、抗气道高反应性和抗过敏性支气管收缩作用，其作用机理可能是通过纠正失调的Th1/Th2平衡，是一种有效的防治哮喘药物。

六、毒理学研究：

1、小鼠急性毒性试验：

Vaccae三个不同剂量，用肌肉注射、腹腔注射和皮下注射三种不同给药途径均未引起动物死亡及异常症状，根据人用剂量0.000375mg/kg计算这三个不同剂量均大于人用剂量的10000倍。Vaccae的最大注射剂量为1.2mg/0.2ml/只小鼠(im)和4mg/0.2ml/只小鼠(ip或sc)，可认为Vaccae肌肉、腹腔及皮下给药途径的小鼠最小致死量至少大于60mg/kg。

2、热原试验：

Vaccae0.2ml(1mg/ml)给家兔静脉注射后的4h内，未见体温有明显升高或降低。

3、全身过敏试验：

Vaccae对豚鼠全身主动性致敏试验呈阴性。

4、肌肉注射的局部刺激性试验：

给家兔肌肉注射Vaccae，48hr肉眼检查和病理切片检查注射局部的反应，未见注射部位有明显变化，反应级均为0级，病理检查除针迹部位少数肌纤维玻璃样变性，间质轻度水肿和炎症细胞浸润，其他未见异常病理改变。

5、大鼠长期毒性试验：

分3组实验，第1组为对照组，皮内注射生理盐水0.2ml/只；第2组为低剂量组，皮内注射Vaccae0.2mg/只，推算相当于人用剂量的78倍；第3组为离剂量组，皮内注射Vaccae4mg/只，推算相当于人用剂量的1560倍。注射后间隔2周，即第3周按上述剂量再重复给药一次。整个试验过程共给药2次，观察从第1次给药后到3个月(90天)内大鼠的各项指标，包括一般观察、生化(10项)、血液(5项)和病理学切片观察。结果显示：除Vaccae给药2组(低、高剂量)的体重均比对照组明显增加外，其他一般症状无明显改变。10项生化指标，包括血清总蛋白、白蛋白、总胆固醇、尿素氮、肌酐、AST、ALT、ALP、总胆红素和血糖；5项血液学指标，包括血红蛋白、血小板、白细胞总数、白细胞分类和凝血时间；Vaccae低剂量组、高剂量与对照组比较无明显差异，均在正常范围之内。脏器与体重重量百分比(脏器系数)组间也无差异。系统尸检以及肝、脾、肾、心、肺、睾丸、子宫、脑组织细胞学检查未见异常病理改变。以上结果表明：Vaccae给药2次，观察的3个月内，没有明显的毒性反应。

6、狗长期毒性试验：

分3组实验，第l组为对照组，皮内注射生理盐水0.2ml/只；第2组为低剂量组，皮内注射Vaccae 1mg/只，推算相当于人用剂量的4倍；第3组为高剂量组，皮内注射Vaccae 25mg/只，推算相当于人用剂量的100倍。注射后间隔2周，即第3周按上述剂量再重复给药一次。整个试验过程共给药2次，观察从第1次给药后到2.5个月(75天)、3个月(90天)和3.5个月(105天)内大鼠的各项指标，包括一般观察、生化(10项)、血液(5项)和病理学切片观察。结果显示：上述3组狗的生化指标、血液学指标均在正常范围内。心电图检查、尿液常规分析也未见异常变化，系统尸检以及肝、脾、肾、心、肺、睾丸、子宫、脑组织细胞学检查未见异常病理改变。一般症状，组间比较无明显差异。上述结果显示，Vaccae给药2次，观察的3.5个月内，没有明显的毒性反应。

本发明微卡通过对肿瘤、流行性感冒、皮肤病、乙肝、类风湿关节炎、过敏性鼻炎、爱滋病、哮喘、慢性阻塞性肺病、前列腺疾病、各种结核等进行临床实验，有效率在70％～95％之间，效果显著，其使用方法为每一周或二周肌肉深部注射一次，有效剂量为22.5μg，一般二至三个月为一个疗程，对于慢性疾病可以治疗6～12个月。

本发明也可以采用片剂或糖丸等口服，根据治疗需要确定剂量。

综上所述，本发明的冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，由于采用了高压气流剪切细胞技术，优选了冻干保护剂，提高了治疗效果，减轻其注射的副作用，开辟了冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)治疗结核病、哮喘、肿瘤、流行性感冒、皮肤病、乙肝、类风湿关节炎、过敏性鼻炎等诸多新的治疗用途，使其成为安全性好，治疗作用谱广，效果显著的生物制剂。

具体实施方式

例1：

1、冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，其中含有母牛分枝杆菌菌体和保护剂，菌体与保护剂的配比10mg/ml，保护剂是4倍体积量的甲液和3倍体积量的乙液的混合物，，保护剂PH值为7.2：

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素    10g

蔗糖                  10g

氯化钠                28.8g

无水磷酸二氢钾        17.4g

其余为纯水：

3000ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素    7.5g

蔗糖                  7.5g

氯化钠                21.6g

无水磷酸氢二钠        54.9g

其余为纯水。

甲液和乙液混合后再加入菌体。

所述菌体中蛋白含量为：0.5mg菌体含蛋白20～22.5μg。

2、本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)制成冻干粉，使用时用纯水稀释，肌肉注射。

3、冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的制备方法，包括以下步骤：

(1)、低温-70℃下冷冻保藏母牛分枝杆菌菌种，在室温下溶解，接种于罗氏培养基，于37～39℃下培养3～7天；

(2)、培养物洗下，收集于离心桶，离心，除去上清液，并精制，收集菌体；再以灭菌生理盐水洗涤菌体，离心40～50分钟，除去上清液；称出菌体重量；用保护剂配成10mg/ml的菌悬液；

(3)、菌体进行无细胞处理，利用高压匀质机对收集的菌体进行高压破碎，压力为40Mpa以上，处理10～15次，使菌体细胞破裂；

(4)、菌体中按配比加入冻干保护剂制成原液，物理方法灭活，再加入冻干保护剂，控制菌体蛋白含量为45±10％μg/ml

(5)、分装成小瓶，送入冻干箱内进行冻干，轧盖。

4、本发明母牛分枝杆菌制剂(微卡)在结核方面的临床试验如下

本发明选取568例活动性肺结核，是目前国内外规模最大的结核免疫治疗研究，其中，初治肺结核380例，(配对免疫组171例，配对化疗组171例，开放免疫组38例)：复治肺结核98例(配对免疫组37例，配对化疗组37例，开放免疫组24例)：难治性肺结核90例(配对免疫组28例，配对化疗组28例，开放免疫组34例)。接受冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)菌苗治疗的各类肺结核总计332例。

配对两组病例的性别、年龄、病情轻重程度基本一致，耐药情况、化疗方案及药物剂量、用法相同。有良好可比性。免疫组治疗方式化疗+冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)，化疗组只用化疗。由卫生部临床药物基地抗结核药专业基地，重庆医科大学附属第一医院牵头，组织北京胸科医院，武汉铁路结防院等10个结核病防治研究单位完成初治、复治和难治肺结核总计568例，均为痰菌阴性，初步结果令人鼓舞。

(1)初治肺结核：免疗组zHRZE/zHR方案4个月，冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)治疗6个月，化疗组zHRZE/4HR化疗6个月，不用菌苗，治疗第1、2个月痰菌(-)转率，免疗组明显高于化疗组(免疗组分别为46.8％、86％，化疗组分别为20.1％、68.6％，P＝0.01)，第6个月免疗组痰菌阴转率100％，对照组98.7％，达到相同水平，病灶吸收、空洞关闭速度免疗组优于对照组，免疫指标治疗后较治疗前显著改善。

(2)难治性肺结核：6个月痰菌(-)转率免疗组为46.4％，显著高于化疗组的17.9％，免疗组免疫指标改善较对照组更为显著。一年随访细菌学复发率，免疗组为7.7％，化疗组为20％。

(3)复治性肺结核：试验组的疗效优于对照组。

冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)观察结果表明，冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)是较好的结核病免疫制剂，可作为结核病化疗的辅助治疗，特别对耐药结核病例的免疫治疗提供了又一有力武器。

例2：

本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的配方和制备方法同例1。

以下是其用于SARS方面的临床研究结果：

本发明选取63例SARS患者，其中男性31例，女性33例，最大年龄74例，最小年龄14岁，平均年龄39.75±17.97岁。观察病例每周1支冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)深部注射共注射3-5周，部分病人同时应用激素(甲基强的松龙160-500mg/日)。由中国人民解放军309医院完成临床，其中重症患者(为48小时内，胸片显示病灶进展超过50％，病灶占5-6个肺野同时有持续高热，平静状态下呼吸频率30次/分以上，氧气指数小于300，伴有其他重要并发症)13例，治愈9例，无效死亡4例，无效者均为重症患者，由于并发其他严重并发症死亡，死亡者中有1人有效，SARS病情明显好转，但死于其他疾病，中度患者(胸片显示病灶占3-4个肺野，无其他重要并发症)12例.轻度病例(胸片显示病灶占1-2个肺野，无其他重要并发症)38例全部治愈。观察结果说明，冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)(冻干治疗用母牛分枝杆菌菌苗)加上有效的全身综合治疗，呼吸机辅助呼吸，适量激素等，对SARS包括重症SARS的治疗可以取得较好的疗效，总有效率达92.5％，治疗过程中未见过敏、发热等不良反应。

由于SARS的肺部病变其病理基础可能是ARDS，SARS本身为冠状病毒感染，两者之间在治疗原则上有些矛盾，前者需要激素甚至需要大剂量激素抑制免疫治疗，后者需要增强免疫治疗，禁用激素。因此对于激素的使用时机和激素剂量的调整都有种种限制，对免疫调节剂的种类应有所选择。冻干母牛分支杆菌制剂实验室结果表明，该制剂能有效刺激提高机体T淋巴细胞功能，能明显提高免疫力低下动物的细胞免疫水平；而对动物免疫功能亢进有抑制作用，避免免疫系统损伤；另外，矽肺病理病变系典型的免疫损伤，实验室研究结果证实，该菌苗可明显减轻矽肺动物模型大鼠肺部的免疫损伤导致纤维化。临床研究结果也证实，该制剂对浸润性肺结核有加快病灶吸收与空洞的愈合作用，明显提高肺结核患者的CD4水平；因此利用冻干母牛分支杆菌制剂双向调节免疫作用，使用得当，有利于对SARS疾病的治疗。

例3

本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的配方和制备方法同例1。

对微卡胸腔内灌注免疫治疗癌性胸液40例，结果完全有效率60％(12/20)，有效率90％(18/20)，均显著高于对照组(P小于0.05)。

将微卡用于治疗前列腺癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌和间皮瘤病人等，也显示了较好效果。患者普遍生活质量提高，痛苦减轻，生存时间明显延长。

例4

本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的配方和制备方法同例1。

微卡用于哮喘、过敏性鼻炎、COPD患者的治疗，发现微卡有明显的免疫调节作用，患难与共者症状明显改善。

例5

本发明冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)的配方和制备方法同例1，也可以是说明书的介绍的其它组方和工艺。

微卡用于乙肝的治疗，采用微卡+乙肝疫苗+潘生丁三联疗法，治疗时间为半年，微卡每二周用药一次，22.5μg/支，用1ml注射用水稀释，于臀部作肌肉深部注射；基因乙肝疫苗30μg/支，1次/月，三角肌皮内注射0.1ml，余下的作皮下注射：潘生丁：14周岁以下口服75mg/日，每日三次，每次一片，14周岁以下每日口服25～50mg，分二次服。

可以预防肝癌，改善症状，有效率82％。

Claims (6)

1、一种冻干母牛分枝杆菌制剂微卡，其特征在于其中含有母牛分枝杆菌菌体的精制成份和保护剂，菌体与保护剂的配比8～12mg/ml，保护剂是3.8～4.2倍量的甲液和2.8～3.2倍量的乙液的混合物，保护剂PH值为7.0～7.5，所述菌体中蛋白含量为：所述成份以蛋白为标示量，0.5mg菌体蛋白标示量为11～27μg：

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素  8～12g

蔗糖  8～12g

氯化钠  26～30g

无水磷酸二氢钾  16～19g

其余为纯水；

3000ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素  6～9g

蔗糖  6～9g

氯化钠  20～23g

无水磷酸氢二钠  53～56g

其余为纯水。

2、根据权利要求1所述的冻干母牛分枝杆菌制剂微卡，其特征在于其中含有母牛分枝杆菌菌体及精制成份保护剂，菌体与保护剂的配比9～11mg/ml，保护剂是3.8～4.2倍量的甲液和3倍量的乙液的混合物，保护剂PH值为7.0～7.2，所述菌体中蛋白含量为：0.5mg菌体含蛋白18～27μg；

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素  10g

蔗糖  10g

氯化钾  28.8g

无水磷酸二氢钾  17.4g

其余为纯水；

3000ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素  7.5g

蔗糖  7.5g

氯化钠  21.6g

无水磷酸氢二钠  54.9g

其余为纯水。

3、根据权利要求1所述的冻干母牛分枝杆菌制剂微卡，其特征在于其中含有母牛分枝杆菌菌体及精制成份保护剂，菌体与保护剂的配比10mg/ml，保护剂是4倍量的甲液和3倍量的乙液的混合物，保护剂PH值为7.2，所述菌体中蛋白含量为：0.5mg菌体含蛋白18～27μg；

4000ml甲液配比如下：

谷氨酸钠或天门冬素  10g

蔗糖  10g

氯化钠  28.8g

无水磷酸二氢钾  17.4g

其余为纯水；

3000ml乙液的配比为：

谷氨酸钠或天门冬素  7.5g

蔗糖  7.5g

氯化钠  21.6g

无水磷酸氢二钠  54.9g

其余为纯水。

4、根据权利要求1所述的冻干母牛分枝杆菌制剂微卡的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、低温下冷冻保藏母牛分枝杆菌菌种，在室温下溶解，接种于培养基，培养3-7天：

(2)、将培养物洗下，收集于离心桶，离心，除去上清液，收集菌体：再以灭菌生理盐水洗涤菌体，离心，除去上清液；称出菌体重量；用保护剂配成10mg/ml的菌悬液；

(3)、进行无细胞处理，对收集的菌体进行高压破碎，使菌体细胞破裂；

(4)、菌体中加入冻干保护剂制成原液，灭活，再加入冻干保护剂，配成指定浓度分装液；

(5)、分装成小瓶，送入冻干箱内进行冻干，轧盖。

5、根据权利要求4所述的冻干母牛分枝杆菌制剂微卡的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、低温-70℃下冷冻保藏母牛分枝杆菌菌种，在室温下溶解，接种于罗氏培养基，于37～39℃下培养3-7天；

(2)、培养物洗下，收集于离心桶，离心，除去上清液，收集菌体；再以灭菌生理盐水洗涤菌体，离心40～50分钟，除去上清液；称出菌体重量；用保护剂配成10mg/ml的菌悬液；

(3)、菌体进行无细胞处理，利用高压匀质机对收集的菌体进行高压破碎，压力为4Mpa以上，处理10～15次，使菌体细胞破裂并精制；

(4)、菌体中加入冻干保护剂制成原液，加热或辐射灭活，再加入冻干保护剂，控制菌体蛋白含量为45±10％μg/ml；

(5)、分装成小瓶，送入冻干箱内进行冻干，轧盖。

6、根据权利要求1所述的冻干母牛分枝杆菌制剂微卡在制备用于治疗肿瘤、乙肝、爱滋病、皮肤病、皮炎、感冒、类风湿关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、前列腺疾病、结核的生物菌苗制剂中的用途。