CN1994470A

CN1994470A - 一种口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN1994470A
Application number: CN 200610147664
Authority: CN
Inventors: 郑兆鑫; 严维耀; 程功; 刘明秋
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: CN100548384C

Abstract

本发明属遗传工程技术领域，具体为一种口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂及其制备方法和应用。本发明涉及的佐剂是将家猪干扰素－α基因利用分子生物学技术克隆入真核表达载体获得的重组质粒。其中家猪干扰素－α基因是指家猪干扰素－α多基因家族中的任一亚型的基因；真核表达载体可以是具有真核启动子、原核复制子以及原核抗性基因为特征的任一种DNA表达载体。该重组质粒转入大肠杆菌扩增并通过碱裂解法获得大量质粒，并用PBS缓冲液稀释质粒到一定浓度，配制成本发明所述的多肽疫苗佐剂。动物试验证明，该佐剂安全性好，效果显著，与O型口蹄疫基因工程疫苗联用，一次免疫注射家猪后即可对口蹄疫病毒具有理想的预防效果，家畜受保护率达100％。

Description

一种口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属遗传工程技术领域，具体为一种口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是当今世界上最为严重的家畜传染病之一，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物，且爆发范围广，传播迅速，动物感染后死亡率高，给畜牧业造成巨大的经济损失，因而被国际兽医局列为A类传染病之首。

基因工程多肽疫苗由于安全性好，易于保存，效果理想等优点具有广阔的应用前景。然而基因工程疫苗免疫原性相对较弱，为了更好地激发机体的免疫系统，使其对口蹄疫病毒(FMDV)具有足够的抵抗力，有必要寻求更为简便有效的方法提高基因工程多肽疫苗的免疫活性。

增强疫苗免疫活性的方法不仅取决于改进疫苗中相关抗原组分的构成，还取决于添加合适的佐剂来刺激免疫系统，提高对抗原物质的免疫应答。一个理想的佐剂应该特异性的辅助疫苗刺激免疫系统，同时不会对动物产生副作用。干扰素-α(Interferon，IFN-α)是一类具有抗病毒作用的细胞因子家族，在正常生理条件下，它在动物体内仅有少量组成型表达；但是当病毒或细菌感染动物体时，该细胞因子被大量诱导表达用于机体细胞抵御病原入侵。近年来，IFN-α优良的免疫调节功能被发现并成为免疫学的研究热点。这包括激活B细胞并辅助B细胞快速产生针对病原的多克隆抗体；诱导NK细胞及T细胞的增值并增加其细胞毒活性；辅助CD8+记忆T细胞的生长，延长记忆T细胞的生存时间；并且对IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6等免疫刺激细胞因子具有表达上调作用。以上的研究成果表明，以IFN-α作为佐剂来提高基因工程多肽疫苗的免疫活性在理论上具有可行性。有文献表明国外已开展家猪IFN-α作为佐剂与疫苗联用预防口蹄疫的相关工作。其内容为将家猪IFN-α克隆入人重组腺病毒5(h-Ad5)真核表达载体中，与以h-Ad5为载体的A型口蹄疫重组DNA疫苗联用，免疫注射家猪后有对口蹄疫病毒有理想预防效果，家畜受保护率为80％。

发明内容

本发明的目的是提出一种以DNA真核表达载体为基础的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂及其制备方法，并将该佐剂应用于动物体评估其效果。

本发明提出的基因工程多肽疫苗佐剂，是由家猪干扰素-α基因通过分子生物学技术克隆入真核表达载体获得的重组质粒。其中，家猪干扰素-α功能基因是指家猪干扰素基因家庭中的任一亚型基因，真核表达载体可以是以具有真核启动子、原核启动子以及原核抗性基因为特征的任一DNA表达载体。

家猪干扰素-α基因家族一共有14条干扰素-α功能基因，该基因家族各亚型基因的核苷酸同源性达96％-100％。其中有8条功能基因是包括23个氨基酸的信号肽并且全长为189个氨基酸的完整基因，有6条功能基因是包括23个氨基酸的信号肽并且全长为181个氨基酸的完整基因。家族内的各功能基因均具有相似的刺激免疫、用作佐剂的功能。本发明涉及的干扰素-α基因可以是家猪干扰素-α多基因家族中任一亚型的基因。在应用实例中，家猪干扰素-α基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其核苷酸序列为SEQID NO.2。

该口蹄疫基因工程多肽疫苗新型佐剂，是在真核表达载体的基础上构建而成。DNA真核表达载体可以是具有以下特征的任一种真核表达质粒：

(1)构建该真核表达质粒所用的真核表达载体同时带有原核复制子；

(2)该质粒带有真核启动子；

(3)该质粒具有原核选择抗性基因及合适的多克隆位点，便于基因插入及筛选。

本发明所应用的真核表达载体具体是以具有真核启动子、原核复制子以及原核抗性基因为特征的任一DNA载体。实施例中使用的pcDNA真核表达质粒(Invitrogen公司产品)，在带有SV40复制子和CMV启动子的同时带有pUC ori复制子和amp抗性基因。除pcDNA以外，其他系列具有该特征的真核表达载体均可以用作佐剂的构建。

实施例中我们通过RT-PCR的方法从家猪肝脏总RNA中获得包括23个氨基酸的信号肽并且全长为189个氨基酸的家猪IFN-α基因，以EcoRI和XhoI为酶切位点插入表达载体pcDNA3，并转化入大肠杆菌中。

本发明的佐剂的制备方法包括基因制备、重组、蛋白活性测定、质粒大规模抽提等步骤，具体如下：

(1)通过RT-PCR的方法从家猪肝脏总RNA中得到IFN-α完整基因，在实施中，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2；

(2)将上述基因插入原核克隆载体，并转化大肠杆菌，测序并与GenBank提供的家猪IFN-α序列进行对比，确定获得了正确的基因；

(3)上述基因插入真核表达载体构建重组质粒，并转化大肠杆菌，抽提质粒转染BHK-21细胞，继续培养细胞40-50小时，收集上清培养基利用WISH细胞/水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)活性测定系统和PK15细胞/伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)活性测定系统分别测定家猪IFN-α活性，确定构建的重组质粒可以表达活性的家猪IFN-α蛋白。

(4)阳性菌株在35-40℃发酵培养10-15小时，收集菌体；破碎菌体并用碱裂解法大规模制备表达载体质粒；利用PBS缓冲液稀释质粒到合适的浓度，配制成本发明所述的多肽疫苗佐剂。

本发明还提出所述佐剂的应用，具体是将其与口蹄疫基因工程多肽疫苗联合注射动物。证明该佐剂能有效辅助疫苗刺激动物体免疫应答。在实施例中该佐剂与O型口蹄疫基因工程多肽疫苗联用，一次免疫注射家猪后即可对口蹄疫病毒具有理想的预防效果。

本发明涉及的O型口蹄疫基因工程多肽疫苗(专利号：02137011.7)，是以家猪自体IgG为载体蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的C末端，构成一融合蛋白，其中抗原多肽采用口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段，并将其组成多拷贝的串联结构，在肽段连接处加入氨基酸多肽作为接头。

实施例中将口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的C端，构成融合蛋白。为了使抗原多肽表达成融合蛋白后能够更好地体现抗原性，我们适当选取了IgG重链恒定区作为载体蛋白，如后述实施例中采用猪IgG重链恒定区第30位至328位共299个氨基酸肽段作为载体蛋白；FMDV抗原多肽则采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中3个主要抗原表位，即21ヘ40、141ヘ160、200ヘ213三个氨基酸肽段，并将其组成141ヘ160AA-21ヘ40AA(或200ヘ213AA)-141ヘ160AA的串联结构，在肽段连接处加入适当氨基酸多肽作为接头，如后述实施例中采用141ヘ160AA(“Y”)-Pro-Gly(“M”)-21ヘ40AA(“X”)-Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg(“N”)-141ヘ160AA(“Y”)的抗原多肽结构，前后两个接头分别是2个和11个氨基酸。

其结构特征如下：

抗原基因的两端各有一个拷贝的编码141ヘ160位氨基酸的DNA序列，中间是一个拷贝的编码21ヘ40位氨基酸的DNA序列；连接这些序列的两个接头分别是2个和11个氨基酸。

在基因水平上将此串联结构连接在IgG重链恒定区的C末端，形成融合基因，表达获得融合蛋白。该融合蛋白具有下列特点：

(1)在基因水平上，载体蛋白基因大小约为900bp，抗原肽基因大小约为240bp，整个融合基因大小约为1.2kb。

(2)在蛋白水平上，载体蛋白只包含猪IgG重链恒定区第30位到第328位氨基酸肽段，即299个氨基酸；抗原多肽为上述的串联肽段，其中21ヘ40位氨基酸肽段是一T细胞表位，141ヘ160位氨基酸肽段是B细胞表位。整个融合蛋白分子量约为50kDa。

本发明还涉及到该佐剂的应用方法。本发明涉及的佐剂其优点在于与基因工程疫苗联用时可降低基因工程疫苗的用量，而且只须与多肽疫苗进行一次联合免疫即可使动物机体产生足够的免疫力，并且药效持久，使免疫的动物对口蹄疫病毒具有理想的预防效果。

本发明涉及的家猪IFN-α作为免疫刺激因子，不仅可以直接利用重组质粒作为疫苗佐剂，还可以将重组质粒转入猪减毒沙门氏菌或将家猪干扰素-α基因与重组腺病毒载体相连作为疫插佐剂。由于IFN-α刺激免疫系统具有广谱性的特点，因此本发明提出的新型佐剂不仅可与O型口蹄疫基因工程多肽疫苗联合使用，还可以与其他亚型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗联用，预防不同亚型的口蹄疫病毒。同时，我们也提出：该佐剂与某一型某一毒株的FMDV基因序列为依据构建的疫苗广泛适用于易感动物预防同型口蹄疫病毒的不同毒株，原因是同型口蹄疫病毒的不同毒株之间变异较小，以该佐剂和疫苗联合免疫的动物对这些毒株具有交叉免疫力。

对本发明提出的新型佐剂与O型口蹄疫基因工程多肽疫苗进行免疫效力检验。以一定量的该联合疫苗一次免疫未被自然感染过的猪，一定时间后以O型口蹄疫病毒进行攻击，结果显示，该佐剂与疫苗联用对实验动物具有十分理想的保护效果(见表1)。利用固相阻断ELISA检测病毒攻击后动物血清中病毒非结构蛋白抗体的结果表明，佐剂与疫苗联合免疫的动物在病毒攻击7天及14天以后体内无病毒复制(见表2)。

表1佐剂和疫苗联合免疫动物的免疫保护效果

疫苗	疫苗免疫剂量^注	病毒攻击剂量	攻击猪头数	发病猪头数	保护率
疫苗	疫苗免疫剂量^注	病毒攻击剂量	攻击猪头数	发病猪头数	保护率	免疫组对照组对照组对照组	佐剂+多肽疫苗多肽疫苗佐剂PBS	100 ID₅₀/2ml100 ID₅₀/2ml100 ID₅₀/2ml100 ID₅₀/2ml	3333	0333	100％0％0％0％

注：佐剂：干扰素DNA2mg；多肽疫苗：IgG-FMDV重组蛋白6mg

表2病毒攻击疫苗免疫动物后血清中病毒非结构蛋白抗体检测

疫苗	疫苗免疫剂量^注1	7天阻断率(％)^注2	14天阻断率(％)
疫苗	疫苗免疫剂量^注1	7天阻断率(％)^注2	14天阻断率(％)	免疫组	佐剂+多肽疫苗	5.61	1.45

对照组对照组对照组

多肽疫苗佐剂PBS

2.9811.7813.89

20.1027.5722.04

注1：佐剂：干扰素DNA 2mg；多肽疫苗：IgG-FMDV重组蛋白6mg

注2：利用固相阻断ELISA测定动物血清中非结构蛋白抗体，数据为三头动物阻断百分率率的平均值。当非结构蛋白阻断率≥20％时可判断动物感染病毒，说明病毒在动物体内复制。

具体实施方式

下面以猪口蹄疫O型基因工程多肽疫苗和本发明涉及的新型佐剂为例进一步具体描述本发明。

佐剂的构建过程。取得家猪肝脏样品并利用总RNA抽提试剂(Trizol，Invitrogen公司产品)抽提肝脏总RNA，通过RT-PCR的方法从家猪肝脏总RNA中获得包括23个信号肽并且全长为189个氨基酸的家猪IFN-α基因，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1，将上述基因插入原核克隆载体pMD18-T(TaKaRa公司产品)，并转化大肠杆菌TG1，挑取阳性克隆测序并与GenBank提供的家猪IFN-α序列进行对比，确定获得了正确的基因；将上述基因以EcoRI和XhoI为酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司产品)，并转化大肠杆菌，获得的阳性克隆命名为pcDNA-IFN。抽提pcDNA-IFN质粒转染BHK-21细胞，继续培养细胞40-50小时，收集上清培养基利用WISH细胞/水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)活性测定系统和PK15细胞/伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)活性测定系统分别测定家猪干扰素-α活性，确定构建的重组质粒可以表达活性的家猪IFN-α蛋白。

多肽疫苗的构建过程(专利号：02137011.7)。用化学方法合成VP1基因中编码200ヘ213、141ヘ160位氨基酸片段的DNA序列和接头DNA序列，在基因水平上串联成为141ヘ160AA-200ヘ213AA-141ヘ160AA的一级结构，并将其插入克隆载体pBluescriptIIKS。取1ug pBluescriptIIKS用EcoRI和BamHI双酶切，于37℃反应两小时，电泳割胶回收大片段。将此大片段DNA与上述串联片段混合，在T4 ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA转化大肠杆菌感受态细胞，培养于氮苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。挑取白色转化子，以BstEII单酶切、EcoRI和BamHI双酶切、PCR扩增、DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。用EcoRI和BamHI双切上述阳性克隆，电泳割胶回收小片段。同样用这两个限制性内切酶双切表达质粒载体pTrcHisA，电泳割胶回收大片段。与上述同理连接、转化与筛选，最终获得阳性克隆，命名为pXZ860。

将pXZ860和pcDNA-IFN以LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度6000rpm通气培养。PXZ860在培养2小时(OD值约0.8)后加入终浓度1mM的IPTG诱导，继续培养8小时收集菌体，再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟；超声后5000rpm离心20分钟收集抗原蛋白，将其配成油乳剂即可获得多肽疫苗。pcDNA-IFN培养过夜并收集菌体，以碱裂解法大规模抽提质粒DNA，利用PBS将质粒稀释到1mg/ml即可获得所述多肽疫苗的新型佐剂。

最后将上述疫苗及佐剂用于免疫口蹄疫易感动物。有关动物抗病毒能力检测实验结果见表1及表2。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO.1：

MAPTSAFFTALVLLSCNAICSLGCDLPQTHSLAHTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGFPQEALGGNQVQKAQAM

ALVHEMLQQTFQLFSTEGSAAAWDESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEVGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHRLTLYL

QEKNYSPCAWEIVRAEVMRVFSSSRNLQDRLRKKE

SEQ ID NO.2：

ATGGCCCCAACCTCAGCCTTCTTCACAGCCCTGGTGCTACTCAGCTGCAATGCCATCTGCTCTCTGGGCTGTGACCT

GCCTCAGACCCATAGCCTGGCGCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCCCCCTTCTCCT

GCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATG

GCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAG

CCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGTGGGGC

TGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTG

CAAGAAAAGAACTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCAGAAA

CCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGA

Claims

1、一种口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂，其特征在于是由家猪干扰素-α基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒，家猪干扰素-α功能基因是指家猪干扰素基因家庭中的任一亚型基因，真核表达载体可以是以具有真核启动子、原核启动子以及原核抗性基因为特征的任一DNA表达载体。

2、根据权利要求1所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂，其特征在于所述家猪干扰素-α完整基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

3、一种口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂，其特征在于由权利要求1中所述的重组质粒转入猪减毒沙门氏菌或将家猪干扰素-α基因与重组腺病毒载体相连而获得。

4、一种如权利要求1所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂的制备方法，包括基因制备、重组、蛋白活性测定及表达载体质粒的大规模抽提，其特征在于具体步骤如下：

(1)通过RT-PCR的方法从家猪肝脏总RNA中得到家猪干扰索-α完整基因；

(3)上述基因插入真核表达载体构建重组质粒，并转化大肠杆菌，抽提质粒转染BHK-21细胞，收集上清培养基利用WISH细胞/水疱性口炎病毒活性测定系统和PK15细胞/伪狂犬病毒活性测定系统分别测定家猪干扰素-α活性，确定构建的重组质粒可以表达活性的家猪IFN-α蛋白；

(4)阳性菌株在35-40℃发酵培养10-15小时，收集菌体；破碎菌体并大规模制备表达载体质粒；利用PBS缓冲液稀释质粒到合适的浓度，配制得本发明所述的多肽疫苗佐剂。

5、如权利要求1或4所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗佐剂的应用，其特征在于该佐剂与O型、Asia I型、A型或C型几种不同血清型的多肽疫苗联用，用于预防该型口蹄疫，或者以某一型某一毒株的FMDV基因序列为依据构建的疫苗与该佐剂联用，用于预防同型口蹄疫病毒不同毒株的感染。