CN108330134A - 猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用。所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经原核表达系统表达得到的可溶性猪口蹄疫病毒O型Fc多肽。本发明通过对已经公开的编码猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的核苷酸序列进行了密码子优化，然后通过重新构建重组质粒、优化诱导及培养条件，实现了靶标蛋白的可溶性表达及纯化。可溶性蛋白最大程度模拟了天然抗原的特性，免疫原性更强，抗体水平更高。此外，本发明制备得到的疫苗成份更为简单，不含3D蛋白成份，降低了疫苗总蛋白含量，在提高免疫效力的同时降低了疫苗成本。本发明的提出对我国猪O型口蹄疫防控提供了物质储备和技术支撑，具有重要的意义。

Description

猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种猪口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。
背景技术
口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，影响恶劣。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国将其列为一类动物传染病。为了净化和消灭口蹄疫，我国制定了《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》和《国家口蹄疫防控计划(2016-2020)》，把FMD被列为优先解决的动物疫病之一。要实现此目标，必须要有安全、高效、可鉴别诊断的疫苗，而灭活疫苗始终存在病毒逃逸的生物安全隐患，多次免疫后难以区分免疫动物和感染动物，不利于口蹄疫净化，也不利于我国活畜及产品出口。因此，采用分子生物学技术研制安全、高效的FMD基因工程新型疫苗是实现国家口蹄疫防治规划的技术保障和物质基础，也是提高我国口蹄疫防控能力，保障我国畜牧业健康可持续发展，推动农业产业结构调整，促进农民增收，提高活畜及产品的出口能力，提升我国的政治声誉等的重要途径，符合国家兴农富国的战略需求。
利用反向疫苗学技术研制口蹄疫表位疫苗已成为可能，本发明发明人前期已经利用该技术研制出了多种口蹄疫表位疫苗均具有较好的免疫效果，并申请了专利保护。其中，公开号为CN102675471A，发明名称为“猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用”的专利申请中公开了一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原，以及由该抗原制备得到的疫苗。但该申请所公开的猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的缺点在于其在大肠杆菌中以包涵体形式表达，后期需要经变性处理，甚至还需要复性处理，工艺复杂，回收率低、损失大，成本较高。为了进一步提升表位疫苗的免疫效果，减小与灭活疫苗的差距，本发明充分利用了宿主动物免疫球蛋白(IgG)Fc能与免疫细胞表面的Fc受体结合或补体受体的细胞结合，激发免疫细胞产生免疫效应的免疫学功能，提升表位疫苗的免疫效果的特点，以猪IgG的Fc功能基因为骨架，结合我国O型口蹄疫流行现状和防控需求，利用分子生物学、生物信息学、生物化学结合蛋白质工程等多种技术对猪口蹄疫病毒O型广谱多表位基因进行改造和修饰，然后利用Fc基因展示其抗原表位；同时选择原核表达系统，优化表达条件，实现了猪口蹄疫病毒O型广谱多表位基因重组蛋白的高通量可溶性表达，通过亲和层析纯化技术获得了高纯度的靶标蛋白。
本发明用试制疫苗与CN102675471A专利申请中所公开的猪口蹄疫病毒广谱多表位疫苗同时免疫猪，通过口蹄疫特异性抗体效价和攻毒保护实验评价可溶性蛋白疫苗的免疫功效。结果显示，初免21天后，可溶性蛋白疫苗诱导机体产生的抗体水平明显高于CN102675471A专利申请中所公开的猪口蹄疫病毒广谱多表位疫苗，加强免疫后，两种疫苗的抗体水平均明显升高，但本发明的Fc多肽疫苗免疫猪的平均抗体水平更高，个体差异小，具有统计学差异；采用国家标准对免疫猪进行攻击，均5/5保护。这充分说明，与CN102675471A专利申请中所公开的猪口蹄疫病毒广谱多表位疫苗相比，经过密码子优化、表达系统筛选、表达条件优化的Fc多肽疫苗最大程度模拟了天然抗原的特性，免疫原性更强，抗体水平更高，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的猪口蹄疫病毒O型广谱多表位疫苗制备工艺复杂，成本较高等问题，提供一种经优化改进后的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人利用生物信息学密码优化软件结合免疫学和生物化学等多学科技术，对公开号为CN102675471A，发明名称为“猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用”的专利申请中公开的编码猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的核苷酸序列进行了密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对优化前后基因进行序列比对分析(Clustal W软件和DNAMEN Version 9)，结果显示，优化前后基因序列在1-684bp区域发生了较大的突变，IgG的Fc段基本上没有发生大的突变，整个基因同源性为77.26％，优化后GC％在基因中的分布和含量更趋于合理；整个基因核苷酸突变顺序由高到低依次是T→C为92个、A→G为60个、C→G为55个、A→C为43个、G→T为27个。编码的氨基酸序列优化前后没有发生任何的突变，同源性为100％，保证了其抗原性未发生改变。此外，本发明利用Fc基因展示优化后的抗原表位；同时选择原核表达系统，优化表达条件，实现了猪口蹄疫病毒O型广谱多表位基因重组蛋白的高通量可溶性表达，通过亲和层析纯化技术获得了高纯度的猪口蹄疫病毒O型Fc重组蛋白。与优化前的疫苗相比，本发明制备得到的Fc多肽疫苗免疫本动物后产生的抗体水平更高，个体间抗体水平差异小，总蛋白量少，成本低廉。
因此在上述研究的基础上，本发明提出了一种编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了所述的核苷酸序列在表达获得猪口蹄疫病毒O型Fc多肽中的用途。
再进一步的，本发明提出了一种猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法。
其中，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经原核表达系统表达得到的可溶性猪口蹄疫病毒O型Fc多肽。
其中，优选的，所述的原核表达系统为大肠杆菌表达系统。
其中，优选的，所述的Fc多肽疫苗中还含有佐剂。
一种制备所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)获得SEQ ID NO.1所示的编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列；
(2)将获得的编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列插入原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态进行阳性筛选，得到阳性重组表达质粒，-20℃保存备用；
(3)将步骤(2)得到的阳性重组表达质粒转化大肠杆菌感受态，从LAB平板挑单克隆接种含卡那霉素的无菌LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物加入新制备的含卡那霉素的无菌LB培养液中，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，离心收获培养物；
(4)向原培养物中加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理，离心收集上清，弃沉淀；
(5)从收集的上清中获得纯化后的蛋白；
(6)将纯化后的蛋白加入油佐剂乳化成疫苗制剂。
其中，优选的，步骤(5)中使用Ni-NTA组氨酸纯化柱进行蛋白的纯化。
其中，优选的，步骤(6)中按照质量比1：1的比例加入油佐剂Montanide ISA206乳化成疫苗制剂，每头份1ml，其中含可溶性猪口蹄疫病毒O型Fc多肽200μg。
更进一步的，本发明还提出了所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗在制备预防猪口蹄疫药物中的用途。
相较于现有技术本发明的有益效果是：
1、本发明对公开号为CN102675471A，发明名称为“猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用”的专利申请中公开的编码猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的核苷酸序列进行了密码子优化，然后通过重新构建重组质粒、优化诱导及培养条件后，实现了靶标蛋白的可溶性表达及纯化。可溶性蛋白只需直接纯化就可以使用，且最大程度模拟了天然抗原的特性，免疫原性更强，抗体水平更高，具有良好的应用前景。而包涵体蛋白经变性处理，甚至还需要复性处理，工艺复杂，回收率低，损失大，成本高。
2、本发明制备得到的疫苗成份更为简单，即不含3D蛋白成份，降低了疫苗总蛋白含量，在提高免疫效力的同时降低了疫苗成本。此外，疫苗总蛋白含量降低有助于减轻副反应，即免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，提示改进后的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗，即猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗免疫原性更强，免疫猪后产生的特异性抗体效价更高，个体间差异最小，接种后对免疫动物安全无害。
3、本发明的提出对我国猪O型口蹄疫防控提供了物质储备和技术支撑，具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内
实施例1猪口蹄疫病毒O型广谱多表位融合基因的密码子优化
利用生物信息学密码优化软件结合免疫学和生物化学等多学科技术，对公开号为CN102675471A，发明名称为“猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用”的专利申请中公开的编码猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原的核苷酸序列进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对优化前后基因进行序列比对分析(Clustal W软件和DNAMEN Version 9)，结果显示，优化前后基因序列在1-684bp区域发生了较大的突变，IgG的Fc段基本上没有发生大的突变，整个基因同源性为77.26％，优化后GC％在基因中的分布和含量更趋于合理；整个基因核苷酸突变顺序由高到低依次是T→C为92个、A→G为60个、C→G为55个、A→C为43个、G→T为27个。编码的氨基酸序列优化前后没有发生任何的突变，同源性为100％，保证了其抗原性未发生改变。
实施例2编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的基因的克隆及其蛋白表达，纯化
为了保证定向插入，在SEQ ID NO.1所示的融合基因的5'-端和3'-端引入特异性酶切位点如BamHI和XhoI，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。将合成的编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的基因插入原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒pMEO-Fc，转化JM109感受态进行阳性筛选，通BamHI和XhoI双酶切和序列测定确定阳性重组子，-20℃保存备用。
重组蛋白的表达及其生物活性鉴定：将阳性重组表达质粒pMEO-Fc转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模表达重组蛋白，即从LAB平板挑单克隆接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物按1％(v/v)加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集上清(4℃)，弃沉淀。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白MEO-Fc大小与预期相符，能与FMDV(O型)灭活疫苗免疫牛阳性血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白，即猪口蹄疫病毒O型Fc多肽，具有生物活性。
实施例3疫苗制备以及免疫效力试验
1、疫苗制备
本发明的疫苗：实施例2得到的纯化蛋白经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，按照1:1(w/w)比例加入油佐剂Montanide ISA206(Seppic,France)乳化成疫苗制剂(W/O/W)，每头份1ml，其中含可溶性猪口蹄疫病毒O型Fc多肽200μg。
对照疫苗：按照CN102675471A公开的方法制备得到纯化后的重组抗原以及纯化后的3D蛋白全长，分别经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，纯化的3D蛋白片段与重组抗原按1：2(V/V)配置后，加入等体积的油佐剂Montanide ISA206(Seppic,France)乳化成疫苗制剂，每头份1ml，其中含重组抗原200μg，3D蛋白全长100μg。
2、免疫效力试验：
实验用猪为体重40kg左右，O型口蹄疫病毒抗体<1:4(液相阻断ELISA结果)，3ABC蛋白抗体阴性(3ABC抗体化学发光试剂盒结果)。本发明的疫苗按每头份1ml经肌肉途径接种5头猪(含200μg可溶性抗原)，对照疫苗免疫5头猪，按每头份1ml经肌肉途径接种5头猪(含200μg抗原+100μg 3D)。初免21天后，所有猪用同等剂量的疫苗加强免疫1次。加强免疫后14天，测定每头猪的抗体效价，连同条件相等3头空白对照猪在中国农业科学院兰州兽医研究所ABSL-3实验室，按照国家标准用O型口蹄疫病毒(O/Mya98/BY/2010毒株)对猪进行攻击，连续观察10天，统计保护率。
两种疫苗猪体免疫效力实验比对结果如表1所示。
表1两种疫苗猪体免疫效力实验比对结果
组别 免疫次数 免疫期(天) 抗体效价(LPB-ELISA) 保护率(％)
对照疫苗 2 35 1:360 1:90 1:90 1:128 >1:512 5/5(100％)
本发明疫苗 2 35 1:360 1:360 >1:512 >1:512 >1:512 5/5(100％)
空白对照 0 35 <1:4 <1:4 <1:4 0/3(0)
从上述结果可以看出，通过优化密码子、重新构建重组质粒、优化诱导及培养条件后，实现了靶标蛋白的可溶性表达及纯化。尽管两种疫苗均能保护免疫猪抵抗强毒攻击，5/5保护。与对照疫苗相比，用本发明的疫苗免疫猪后能够诱导更高水平的口蹄疫特异性抗体；而且成份更为简单，即不含3D蛋白成份，降低了疫苗总蛋白含量，在提高免疫效力的同时降低了疫苗成本。此外，可溶性蛋白只需直接纯化就可以使用，而包涵体蛋白经变性处理，甚至还需要复性处理，工艺复杂，回收率低、损失大，成本高。再者，疫苗总蛋白含量降低有助于减轻副反应，即免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，提示改进后的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗免疫原性更强，免疫猪后产生的特异性抗体效价更高，个体间差异最小，接种后对免疫动物安全无害。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用
<130> KLPI171090
<160> 1
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 1006
<212> DNA
<213> Foot and Mouth Disease Virus
<400> 1
aaatacgatg agagcccggt gaccaacgtg cgtggtgatc tgcaagttct ggcccagaaa 60
gccgcccgca cactgccggg tggtcctagc ggcggtaaat atgccggcgg tagcctgccg 120
aatgttcgcg gtgacctgca agtgctggcc cagaaagcag cacgcccgtt accgggtggt 180
agtagcggcg gtaaatatag cgatgcacgc gtgagcaacg tgcgcggtga tctgcaggtg 240
ctggcccaaa aagccgaacg tgcactgcct ggtggcagta gtggcggccg ccataaacag 300
aaaatcgtgg ccccggtgaa acagttactg accgcagcac gtgcaaccga attcaagtac 360
gacgagagtc cggtgaccaa tgtgcgcggt gacctgcaag ttctggcaca aaaagcagca 420
cgtaccctgc cgggtggtag tagcggcggc aaatacgcag gtggcagctt accgaacgtg 480
cgcggtgacc tgcaagttct ggcacaaaaa gccgcccgtc ctttacctgg tggcagcagc 540
ggtggcaaat acagtgatgc ccgcgtgagc aatgtgcgtg gcgacctgca agttctggca 600
caaaaagccg agcgtgcact gccgggcggc agtagtggtg gtcgccacaa acagaagatc 660
gtggcaccgg tgaagcagct gctgaaatta ggtggtagca gcggcggtgg cccgagcgtg 720
ttcattttcc cgccgaaacc taaggacacc ctgatgatca gccagacccc ggaagtgacc 780
tgcgttgtgg ttgacgttag caaagagcac gccgaagtgc agttcagttg gtatgtggat 840
ggtgtggagg tgcacaccgc agaaacacgc ccgaaagaag aacagtttaa cagcacctac 900
cgcgtggtta gcgtgctgcc gatccagcac caggattggc tgaaaggcaa agaatttaaa 960
tgcaaagtga ataatgtgga tctgccggcc ccgattacac gcacca 1006

Claims (9)

1.一种编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的核苷酸序列在表达获得猪口蹄疫病毒O型Fc多肽中的用途。
3.一种猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗，其特征在于，所述的多肽疫苗中含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经原核表达系统表达得到的可溶性猪口蹄疫病毒O型Fc多肽。
4.如权利要求3所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗，其特征在于，所述的原核表达系统为大肠杆菌表达系统。
5.如权利要求3所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗，其特征在于，所述的多肽疫苗中还含有佐剂。
6.一种制备权利要求3-5任一项所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得SEQ ID NO.1所示的编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列；
(2)将获得的编码猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列插入原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态进行阳性筛选，得到阳性重组表达质粒，-20℃保存备用；
(3)将步骤(2)得到的阳性重组表达质粒转化大肠杆菌感受态，从LAB平板挑单克隆接种含卡那霉素的无菌LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物加入新制备的含卡那霉素的无菌LB培养液中，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，离心收获培养物；
(4)向原培养物中加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理，离心收集上清，弃沉淀；
(5)从收集的上清中获得纯化后的蛋白；
(6)将纯化后的蛋白加入油佐剂乳化成疫苗制剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)中使用Ni-NTA组氨酸纯化柱进行蛋白的纯化。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(6)中按照质量比1：1的比例加入油佐剂Montanide ISA206乳化成疫苗制剂，每头份1ml，其中含可溶性猪口蹄疫病毒O型Fc多肽200μg。
9.权利要求3-5任一项所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽疫苗在制备预防猪口蹄疫药物中的用途。
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