CN105481953B - 作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物 - Google Patents

作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物。该靶细胞特异性融合蛋白是由N‑端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列和抗原的氨基酸序列组成，所述抗原的氨基酸序列包括猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列、膜蛋白M protein部分序列和膜蛋白GP5部分序列；所述抗原的氨基酸序列位于所述N‑端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列的N‑端。本发明的融合蛋白可成功诱发动物体的细胞免疫反应及抗体生产，未来将在应用BPAC‑CM5RM5融合蛋白及载体或佐剂组成的医药组合物进行疫苗的生产领域中产生巨大的作用，并进一步预防猪繁殖与呼吸综合征的发生。

Description

作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合 蛋白和疫苗组合物
技术领域
本发明涉及具备诱发猪体内产生猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞免疫及中和抗体反应的靶细胞特异性融合蛋白亚单位疫苗。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)感染后导致母猪繁殖障碍，并对不同日龄猪以呼吸道感染为主的急性传染病。该病毒为单股正链RNA病毒，其容易感染T-细胞、树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。猪群一旦受PRRSV感染后，会破坏其肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)和肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophages，PIMs)，从而造成巨噬细胞的数量减少，减弱宿主免疫系统并增加机会性病原入侵宿主的机会；此外，受感染的单核细胞和巨噬细胞可携带病毒扩散至各个器官，并透过感染的单核细胞经由乳汁或精液将病毒传给哺乳仔猪与配种母猪，以垂直及平行传染的方式扩散病毒传播。
PRRSV能诱导感染猪周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的抗发炎细胞激素IL-10基因表现量显着上升。显示PRRSV可能经由诱导IL-10基因表现来抑制炎症反应，使感染猪更容易遭到二次感染而造成更严重的损失。另有研究指出于PRRSV感染细胞前先投予IFN-γ，能有效抑制PRRSV的复制，且抑制效果与投予剂量有正相关性，若改投予猪IL-12重组蛋白，亦有类似结果，同时还发现IFN-γ被大量诱导而IL-10却相对减少。由此显示IL-12可加强抗原特异性细胞免疫并促进Th1免疫反应，产生大量的IFN-γ及抑制IL-10产生来拮抗PRRSV的感染与复制。MLV疫苗(Modified Live Virus，MLV)已被证实疫苗产生的细胞免疫反应与保护力是具有关联性的，而且疫苗的保护力并非依靠体液免疫反应所产生的抗体；反而仰赖是细胞免疫反应所诱发的IFN-γ。
虽然市面上已有PRRSV疫苗销售，但有研究报告表明某些疫苗免疫计划完整的猪场仍会爆发PRRS疫情，显示出现有疫苗可能无法提供交叉保护力以抵抗PRRSV野毒株的感染。此外，PRRSV又有抗体依赖性增强作用(antibody dependent enhancement，ADE)的现象存在，使得传统灭活疫苗产生的非中和性抗体非但无保护效果反而使感染更加剧而引发更严重的感染，通常被PRRSV感染的动物无明显症状，但被感染动物的免疫力降低而容易造成二次感染，导致生产性能下降与死亡率升高。
目前虽然已有PRRSV的减毒活疫苗问世，然而因PRRSV为一种RNA病毒，减毒活疫苗效力常随着野毒株的突变而失去保护效力。因为PRRSV易破坏宿主免疫系统的特性，而现行疫苗又无法安全有效且稳定的控制疫情，所以减少发生ADE效应以提升抗体保护力与细胞免疫反应是未来PRRSV疫苗的开发重点。
发明内容
[要解决的技术问题]
本发明的目的是解决上述现有技术存在的问题，提供一种作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物及其应用。
[技术方案]
为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：
一种作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，该靶细胞特异性融合蛋白的氨基酸序列包括以下序列：
(a)N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列；
(b)抗原的氨基酸序列，其氨基酸序列是由
序列Ⅰ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列，相应于第65～123氨基酸、
序列Ⅱ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列，相应于第2～26氨基酸、
序列Ⅲ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列，相应于第31-63氨基酸、
其中，所述抗原的氨基酸序列位于所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列的N-端。
本发明更进一步的技术方案，所述抗原的氨基酸序列还包括：
序列Ⅳ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸复制酶部分序列，相应于第1049-1213氨基酸。
本发明更进一步的技术方案，所述抗原的氨基酸序列还包括：
序列Ⅴ：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列，相应于第1-28氨基酸、
序列Ⅵ：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列所组成，相应于第31-64氨基酸。
本发明更进一步的技术方案，所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。
本发明更进一步的技术方案，所述抗原的氨基酸序列是由序列Ⅰ～序列Ⅵ组成，其氨基 酸序列如SEQ ID NO：2。
一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括上述所述的作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，还包括免疫学和药学上接受的载体或佐剂。
本发明更进一步的技术方案，所述免疫学和药学上接受的载体为通过疏水非共价相互作用结合多肽的聚合物或共价结合多肽的聚合物。
本发明更进一步的技术方案，所述佐剂为溴化二甲基双十八烷基铵、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、单磷酰基脂A、海藻糖二霉菌酸酯、海藻糖二山嵛酸酯、胞壁酰基二肽、ISA201佐剂或ISA206佐剂。
本发明更进一步的技术方案，所述疫苗组合物用于引发动物体内免疫应答以对抗PRRSV感染。
本发明更进一步的技术方案，与所述抗原的氨基酸序列向对应的核酸序列，是通过化学方法进行全基因合成得到的。
下面将详细地说明本发明。
本发明中，由于博得特氏菌的腺苷酸环化酶是一种毒素，它是双官能蛋白，其包括N-端的催化区和C-端，对博得特氏菌的腺苷酸环化酶N-端酶结构域缺失，可合成一种无活性的原毒素。本发明中使用的腺苷酸环化酶的氨基酸序列保留了C-端的作用，即所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列作用于将插入到该氨基酸序列N-端的抗原多肽即所述的靶细胞特异性融合蛋白向细胞胞质溶胶内的转运。并且为了将该氨基酸序列的对应核酸序列插入到质粒中，本发明对所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的核酸序列(GenBank核酸序列数据库登录码第GQ370813号第1114～5121核酸序列)的5’端和3’端分别引入了KpnⅠ位点和NheⅠ位点，得到BPAC核酸序列如SEQ IDNO：5。根据选择的质粒的不同，可以向5’端和3’端分别引入不同的酶切位点，而不仅限于上述的酶切位点。
本发明优选质粒pAmp-LacZ作为靶细胞特异性融合蛋白的重组表现质粒，其核酸序列如SEQ ID NO：13。亦可选择pKan-LacI作为靶细胞特异性融合蛋白的重组表现质粒，其核酸序列如SEQ ID NO：17。
为了保证本发明靶细胞特异性融合蛋白制备的疫苗组合物免疫接种后，能针对几乎所有猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫应答，而选择序列Ⅰ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AAC98536号)，选取C-端序列转换成合适于大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：7；保守型较高的序列Ⅱ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第 AIP91957号)，选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：8；序列Ⅲ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第ACG50943号)，选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：9作为抗原多肽的核酸序列。
更进一步的，由于PPRSV分为北美株和欧洲株，因此为了保证本发明靶细胞特异性融合蛋白制备的疫苗组合物免疫接种后，产生针对所有北美株和欧洲株病毒的免疫应答，本发明在膜蛋白M protein和膜蛋白GP5基因序列的选择上，选择了相对北美株和欧洲株两种病毒株来说较保守的基因序列。本发明进一步选用了以下组合：序列Ⅰ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AAC98536号)，选取C-端序列转换成合适于大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：7；序列Ⅱ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AIP91957号)，选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：8；序列Ⅲ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第ACG50943号)，选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：9；序列Ⅳ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸复制酶部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AAO13192号)，选取C-端序列转换成合适于大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：10；序列Ⅴ：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AET99123号)，选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：11；序列Ⅵ：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列所组成(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AWG23407号)，选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID NO：12。
本发明首先利用引物将N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列的对应核酸序列以PCR的方式自博得特氏菌基因组DNA中选殖扩增后，并在其5’端和3’端分别引入KpnⅠ位点和NheⅠ位点，得到BPAC核酸序列如SEQ ID NO：5，根据选择的质粒的不同，可以向5’端和3’端分别引入不同的酶切位点；然后将该BPAC核酸序列通过KpnⅠ位点和NheⅠ位点亚克隆至重组表现质粒中；再以PCR的方式将起始密码子ATG、AflⅡ、SpeⅠ和HindⅢ位点插入到已亚克隆至重组表现质粒的BPAC核酸序列5’端中，得到融合蛋白表现质粒；接着将抗原的氨基酸序列选择好后，通过设计序列的排列顺序，将排列好的氨基酸序列转换为相应的核酸序列，并在核酸序列两端的设计AflⅡ和HindⅢ酶切位点，然后利用化学方法进行全基因合成，得到CM5RM5核酸序列。该全基因合成由生物公司完成。接着利 用AflⅡ和HindⅢ酶切位点将所需抗原的核酸序列CM5RM5核酸序列亚克隆至融合蛋白表现质粒中得到pBPAC-CM5RM5，其核酸序列如SEQ ID NO：16。
将上述pBPAC-CM5RM5质粒转化入原核表达细胞中、筛选、扩大培养、蛋白质收集，然后利用SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质检测和定量。得到所述靶细胞特异性融合蛋白BPAC-CM5RM5。该靶细胞特异性融合蛋白再通过与免疫学和药学上可接受的载体或佐剂共同制备得到疫苗组合物。
所述免疫学和药学上可接受的载体选自通过疏水非共价相互作用结合多肽的聚合物，如塑料聚苯乙烯；或者共价结合多肽的聚合物，如多糖或多肽，具体如牛血清白蛋白、卵清蛋白或者匙孔槭血蓝蛋白。
所述的佐剂优选ISA201佐剂或ISA206佐剂。
[有益效果]
本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：
本发明作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白可成功诱发动物体的细胞免疫反应及抗体生产，未来可应用该靶细胞特异性融合蛋白与载体或佐剂组成的医药组合物，进行疫苗的生产。本发明进一步的为预防PPRS的发生做出了贡献。
附图说明
图1本发明BPAC-CM5RM5融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图2本发明实施例1制备的疫苗组合物诱发专一性抗体反应结果柱状图；
图3本发明实施例1制备的疫苗组合物诱发专一性干扰素反应结果柱状图；
图2和图3中所述的BPAC-CM5RM5疫苗即为实施例1制备的疫苗组合物；
含有pBPAC-CM5RM5质粒的大肠杆菌BL21菌株的保藏说明：
保藏日期：2015年11月16日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.11666。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。
实施例：
一，靶细胞特异性融合蛋白表达质粒的构建，即pBPAC-CM5RM5
本发明首先利用正向引物F1如SEQ ID NO：3及反向引物R1如SEQ ID NO：4，将N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列的对应核酸序列以PCR的方式自博得特氏菌基因组DNA中选殖扩增后，并在其5’端和3’端分别引入KpnⅠ位点和NheⅠ位点，得到BPAC核酸序列如SEQ ID NO：5；
然后将该BPAC核酸序列通过KpnⅠ位点和NheⅠ位点亚克隆至重组表现质粒pAmp-LacZ(购自昊珉生物科技股份有限公司)中，该质粒pAmp-LacZ的核酸序列如SEQ ID NO：13；过程中可通过正向引物F1和反向引物反向引物R1进行PCR验证。再利用正向引物F2如SEQID NO：14和反向引物R2如SEQ ID NO：15，以PCR的方式将起始密码子ATG、AflⅡ、SpeⅠ和HindⅢ位点插入到该重组表现质粒中BPAC核酸序列的5’端中，得到融合蛋白表现质粒；
接着将抗原的氨基酸序列选择好后，通过设计序列的排列顺序，即依次按照序列Ⅰ～序列Ⅵ顺序排列，将排列好的氨基酸序列转换为核酸序列，并在核酸序列两端的设计AflⅡ和HindⅢ酶切位点，然后利用化学方法进行全基因合成，得到抗原的核酸序列CM5RM5核酸序列如SEQ ID NO：6。该CM5RM5全基因合成是由生物公司完成。接着利用AflⅡ和HindⅢ酶切位点将CM5RM5核酸序列亚克隆至融合蛋白表现质粒中得到pBPAC-CM5RM5，其核酸序列如SEQ ID NO：16。该pBPAC-CM5RM5质粒可利用酶切位点酶切并进行凝胶电泳检测或者过程中可通过正向引物F2和反向引物反向引物R2进行PCR验证。
二，靶细胞特异性融合蛋白的表达与纯化
首先，将pBPAC-CM5RM5质粒以热休克的方式转化到大肠杆菌BL21细胞中，然后将转化后的细胞在37℃下培养于含有100μg/mL的Ampicillin的LB培养液中，待大肠杆菌培养达到对数前期及A600在0.8～1的范围内时，向培养物中加入终浓度为1mM的异丙基-Ⅰ-硫代-P-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)以发挥诱发作用。诱发十六小时后离心收获细胞。
将含有pBPAC-CM5RM5质粒的大肠杆菌BL21菌株于2015年11月16日以登记号CGMCCNo.11666保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC。
接着利用8M尿素萃取及溶出包涵体内的靶细胞特异性融合蛋白即BPAC-CM5RM5融合蛋白，其具体方法如下所示：
以冷冻解冻反复操作3次的方式使带有目标蛋白质的细胞的细胞膜破裂，再利用超声波震荡机使细胞完全破碎释出包涵体，接着以TNE缓冲溶液反复萃洗3次后离心，接着以TNET缓冲溶液反复萃洗3次后离心，再以lM的尿素进行清洗，离心前置于室温下30分钟之后，以12000g离心10分钟收集蛋白质，最后将所收集到的包涵体溶于8M尿素中，利用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析及coomasie blue染色法得到如图1所示的结果，结果显示，经诱导的含有pBPAC-CM5RM5质粒的大肠杆菌与未经诱导的相比，其在200kDa左右有一条很明显的蛋白带。该蛋白带大小与靶细胞特异性融合蛋白BPAC-CM5RM5融合蛋白的蛋白大小一致。也就是说经诱导后产生了试验所需的BPAC-CM5RM5融合蛋白。
利用标准BSA蛋白进行定量分析并以密度计量(densitometer)测电泳条带的密度，以进行BPAC-CM5RM5融合蛋白抗原溶液的蛋白质定量。得到靶细胞特异性融合蛋白的浓度为0.1mg/ml，含量约为70％。
三，疫苗组合物的制备
疫苗组合物的制备主要是将靶细胞特异性融合蛋白和免疫学及药学上可接受的载体或佐剂作用，辅以常规手段及试剂进行制备。
所述疫苗组合物是将30μg/dose/0.1mL的BPAC-CM5RM5融合蛋白取0.05mL乳化于0.05mL ISA201(SEPPIC，法国)，然后就是疫苗组合物的构建；
四，由疫苗组合物诱发PRRSV专一性细胞免疫及抗体免疫反应
在免疫小鼠实验模型中，将6～8周大的雌性小鼠C57BL/6J以皮下注射方式免疫接种0.1ml疫苗组合物，所述疫苗组合物含有0.05mL乳化于0.05mL ISA201(SEPPIC，法国)的浓度为30μg/dose/0.1mL的BPAC-CM5RM5融合蛋白，得到BPAC-CM5RM5疫苗。
其对照试验为将疫苗组合物中的BPAC-CM5RM5融合蛋白换成0.05ml乳化于0.05mlISA201(SEPPIC，法国)中的浓度为6.5μg/dose/0.1mlL的CM5RM5融合蛋白，得到CM5RM5疫苗。
其阴性对照试验为将疫苗组合物中的BPAC-CM5RM5融合蛋白换成0.05ml乳化于0.05ml ISA201(SEPPIC，法国)中的生理食盐水。
试验期间每周抽血分离血清，以酵素免疫吸附法(Enzyme-linkedImmunoabsorbent Assay，ELISA)进行血清中CM5RM5专一性抗体的检测。在96孔盘上覆上一层CM5RM5融合蛋白(50ng/well)，于4℃下培养隔夜；再以含5％脱脂牛奶的PBS阻覆于培养孔中，于37℃中培养1小时；将老鼠血清以含1％脱脂牛奶的PBS进行200倍稀释，接着加入培养孔中，于37℃中培养2小时；再以含有0.1％Tween20的PBS清洗培养孔后，加入1：2000的过氧化酶标记的兔抗老鼠IgG抗体(peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgGantibody，Zymed，San Francisco，CA)于培养孔内，再于37℃下培养0.5小时；之后冲洗培养盘，并加入TMB(Invitrogen,Carlsbad，CA)使颜色展开，最后以1M的H2SO4终止反应；利用ELISA酶标仪于450nm的吸收光谱下进行结果的判读，具体结果如表1所示。
表1 本发明BPAC-CM5RM5融合蛋白免疫产生的专一性抗体的量
其专一性抗体效价的检测结果显示：经过BPAC-CM5RM5融合蛋白免疫过后老鼠的血清，检测到所产生的CM5RM5专一性抗体高过于CM5RM5融合蛋白组老鼠血清的量(P<0.01，one-way ANOVA)。由此结果发现，BPAC-CM5RM5融合蛋白可诱发出动物体较高的抗体反应，显示BPAC可促进抗体反应，BPAC-CM5RM5融合蛋白的接受者可在临床上产生较高的抗体作用，而具有保护接受者的效果。
上述试验的免疫小鼠经人为处死后，分离免疫小鼠脾脏细胞进行PRRSV专一性细胞免疫反应的检测。将脾脏细胞以5x105细胞/well的浓度加入96孔盘培养孔中，加入PRRSV(m.o.i＝0.1)处理72小时。在培养后，收取培养液进行IFN-γ浓度检测(Mouse IFN-γAntibody Pair，Invitrogen)。在96孔盘上覆上一层Mouse IFN-γCoatingAntibody(0.3ug/well)，于4℃下培养隔夜；再以Assay Buffer阻覆于培养孔中，于室温中培养1小时；将IFN-γ标准品、培养液及Mouse IFN-γDetectionAntibody(0.5μg/ml)加入培养孔中，于室温中培养2小时；再以含有0.1％Tween20的PBS清洗培养孔后，加入streptavidin-HRP(0.4μg/ml)于培养孔内，再于室温下培养0.5小时；之后冲洗培养盘，并加入TMB(Invitrogen,Carlsbad，CA)使颜色展开，最后以1M的H2SO4终止反应；利用ELISA酶标仪于450nm的吸收光谱下进行吸光值的判读,以IFN-γ标准品吸光值制订检量线后，计算各组培养液IFN-γ浓度如表2所示：
表2 本发明PRRSV专一性细胞免疫反应后的IFN-γ的浓度
其PRRSV专一性细胞免疫反应的检测结果显示：经过BPAC-CM5RM5融合蛋白免疫过后老鼠的免疫细胞群(脾脏细胞)，再次遭遇PRRSV时所产生的IFN-γ量高于CM5RM5融合蛋白组老鼠的免疫细胞群所产生的量(P<0.01，one-way ANOVA)。由此结果发现，BPAC-CM5RM5融合蛋白可诱发出动物体较高的细胞免疫反应，显示BPAC可促进BPAC-CM5RM5融合蛋白的接受者在临床上产生较强烈的病毒清除效果，而具有减少PRRSV病毒血症的效果。
综上所述，本发明BPAC-CM5RM5融合蛋白可成功诱发动物体的细胞免疫反应及抗体生产，未来将在应用BPAC-CM5RM5融合蛋白及载体或佐剂组成的医药组合物进行疫苗的生产领域中产生巨大的作用，本发明的BPAC-CM5RM5融合蛋白进一步有利于预防猪繁殖与呼吸综合征的发生。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (6)

1.一种作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，其特征在于该靶细胞特异性融合蛋白的氨基酸序列是由以下序列组成：
(a)N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列；和
(b)抗原的氨基酸序列，其氨基酸序列为：
序列Ⅰ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列，相应于第65～123氨基酸；
序列Ⅱ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列，相应于第2～26氨基酸；
序列Ⅲ：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列，相应于第31-63氨基酸；
序列Ⅳ：猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸复制酶部分序列，相应于第1049-1213氨基酸；
序列Ⅴ：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列，相应于第1-28氨基酸；
序列Ⅵ：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列，相应于第31-64氨基酸；
所述序列Ⅰ的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列为GenBank氨基酸序列数据库登录码第AAC98536号；
所述序列Ⅱ的北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列为GenBank氨基酸序列数据库登录码第AIP91957号；
所述序列Ⅲ的北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列为GenBank氨基酸序列数据库登录码第ACG50943号；
所述序列Ⅳ的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸复制酶部分序列为GenBank氨基酸序列数据库登录码第AAO13192号；
所述序列Ⅴ的欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列为GenBank氨基酸序列数据库登录码第AET99123号；
所述序列Ⅵ的欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列为GenBank氨基酸序列数据库登录码第AWG23407号；
其中，所述抗原的氨基酸序列位于所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列的N-端。
2.根据权利要求1所述的作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，其特征在于所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求1所述的作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，其特征在于所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。
4.一种疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包括如权利要求3所述作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，还包括免疫学和药学上接受的载体或佐剂。
5.根据权利要求4所述的一种疫苗组合物，其特征在于所述免疫学和药学上接受的载体为通过疏水非共价相互作用结合多肽的聚合物或共价结合多肽的聚合物。
6.根据权利要求4所述的一种疫苗组合物，其特征在于所述佐剂为溴化二甲基双十八烷基铵、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、单磷酰基脂A、海藻糖二霉菌酸酯、海藻糖二山嵛酸酯、胞壁酰基二肽、ISA 201佐剂或ISA 206佐剂。
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