CN110452928A - 一株pk-15稳定细胞株的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物学、基因工程和兽用生物制品学技术领域，特别是涉及一株PK‑15稳定细胞株的构建方法及应用。本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)繁殖用细胞株的构建方法，包括如下步骤：1)将CD163基因和SBQ基因分别构建到慢病毒载体中，得重组慢病毒载体；2)将前述重组慢病毒载体和病毒拯救辅助质粒一起转入哺乳动物细胞，培养该细胞，得重组病毒；3)将步骤2)的重组病毒感染PK‑15细胞，即得。本发明还提供了前述细胞的用途。本发明得到的细胞遗传性状稳定，对PRRSV敏感，具有十分优良的应用前景。

Description

一株PK-15稳定细胞株的构建及应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学、基因工程和兽用生物制品学技术领域，特别是涉及一株PK-15稳定细胞株的构建方法及应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征病(porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)又名“蓝耳病”的病原。PRRSV具有典型的嗜单核细胞特性，在体内，主要感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage，PAM)，在体外，主要感染非洲绿猴肾细胞系Marc-145。因此，产业上主要使用Marc-145作为宿主，培养PRRSV，用于生产相关疫苗。
但Marc-145细胞内增殖PRRSV存在病毒含量不高的局限性，因此提高PRRSV在体外增殖的病毒含量，是提升相关疫苗产品质量的重要途径之一。
PK-15细胞是一种对PRRSV不敏感的细胞，PRRSV几乎无法在PK-15细胞内增殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的用于PRRSV增殖的稳定细胞株的构建方法。
本发明的技术方案如下：
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒繁殖用细胞株的构建方法，包括如下步骤：
1)将CD163基因的整个编码区(CDS)序列构建到PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO慢病毒载体中，将SBQ基因的整个编码区序列构建到PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP慢病毒载体中，得重组慢病毒载体；
2)将前述重组慢病毒载体和病毒拯救辅助质粒先后转入哺乳动物细胞，培养该细胞，得重组病毒；
3)将步骤2)的重组病毒感染PK-15细胞，即得；
步骤1)所述PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO慢病毒载体是在PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-PURO载体基础上将copGFP基因替换为MCHEERY改造得到；
所述PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP慢病毒载体是在PLVX-IRES-NEO载体和PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO载体基础上构建，具体的：以PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO载体为模板扩增EGFP和T2A序列，将EGFP和T2A序列通过酶切连接的方法嵌入到PLVX-IRES-NEO载体的WPRE和NEO元件之间，并在改造后的载体上将CBA启动子序列嵌合至CMV promoter之后；
步骤2)所述辅助质粒指的是慢病毒结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G，重组慢病毒载体、结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G的质量浓度比为4∶3∶1。
如前述的构建方法，步骤2)中，所述哺乳动物细胞是293T细胞。
由前述述构建方法所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒繁殖用细胞株。
前述细胞株在培养猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
进一步地，所述病毒是JXA1-R株。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的PK-15CD163+SBQ细胞株遗传稳定性强，传代30次仍能保留转入基因不丢失。
2)本发明的PK-15CD163+SBQ细胞株对PRRSV敏感性大大地高过PK-15细胞，甚至可以显著高于Marc-145对PRRSV的敏感性。实验表明，将PRRSV疫苗毒(JXA1-R株)接种到PK-15CD163+SBQ细胞株上，增殖的病毒含量比(传统的用于PRRSV繁殖的)Marc-145细胞增殖的病毒含量滴度高3～10倍。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：PK-15CD163+SBQ细胞株CD163和SBQ基因过表达检测。
图2：PK-15CD163+SBQ细胞株增殖到第30代荧光图片；A.绿色荧光代表SBQ基因表达；B.对应图A白光；C.红色荧光代表CD163基因表达；D.对应图C白光。
具体实施方式
实施例1一株PK-15稳定细胞株的构建
1重组慢病毒载体的构建
查阅美国国家生物技术信息中心(NCBI)中GenBank已报道的猪CD163(HM991330)和SBQ(Siglec10，KJ670156)基因序列，利用引物设计软件Premier 6及Oligo 7.57设计CD163和SBQ基因的引物序列，扩增CD163基因的第1～3348位碱基(整个编码区序列)和SBQ基因的第1～1860位碱基(整个编码区序列)。将CD163基因的扩增产物利用Nhe I和BamH I双酶切后连接到PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO载体上。SBQ基因的扩增产物利用EcoR I和BamH I双酶切后连接到PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP载体上，然后再将上述两个载体转化至DH5a感受态细胞中。提取质粒进行酶切鉴定和测序。构建正确的载体分别命名为PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO(CD163)和PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP(SBQ)。
前述的两种载体：
PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO是在PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(SBI公司)基础上将copGFP基因替换为MCHEERY改造得到；
PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP是在PLVX-IRES-NEO(clontech公司)和PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO(SBI公司)基础上构建，具体的：以PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO为模板扩增EGFP和T2A序列，将EGFP和T2A序列通过酶切连接的方法嵌入到WPRE和Neo元件之间，并在改造后的载体上将扩增得到的CBA(chicken β-actin promoter，CBA序列来源NCBI)启动子序列嵌合至CMV promoter之后。
所述载体中：PCDH表示慢病毒载体PCDH；CMV表示CMV启动子；MCS表示多克隆位点；EF1A表示EF1A启动子；MCHEERY表示荧光报告基因MCHEERY；T2A是一种基因转移工具，目的基因的运载体；PURO表示嘌呤霉素抗性基因；PLVX表示慢病毒载体PLVX；CBA表示CBA启动子；IRES表示内部核糖体进入位点序列；NEO表示新霉素抗性基因；EGFP表示荧光报告基因EGFP。
2重组慢病毒载体的包被
利用DMEM培养基(含体积分数8％胎牛血清FBS)培养293T细胞，再利用脂质体3000(Lipofectamine 3000)将慢病毒基因组质粒PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO(CD163)和PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP(SBQ)先后与慢病毒结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G均按照质量浓度比4∶3∶1的比例转染到1×106个/孔293T细胞，转染16小时后更换DMEM培养基(含体积分数2％FBS)继续培养48小时，收集包含慢病毒的细胞上清，测定其病毒滴度。
3PK-15CD163+SBQ稳定细胞株的筛选
将PK-15细胞按1×105个/ml的密度培养与96孔细胞板中，培养基为DMEM培养基(含体积分数8％FBS)，24小时后，弃掉培养基，加入包装好的慢病毒液，再加入Polybrene，每孔的终浓度为5μg/ml。病毒感染12～20小时后，更换新鲜的培养基继续培养48小时。将细胞消化后转至6孔细胞板中培养，72小时以后，加入终浓度10μg/ml嘌呤霉素(puromycin)和1mg/ml G418的培养基对转导的PK-15细胞株进行筛选。每培养24小时后，更换为正常培养基，培养至细胞汇合度30％以上，再更换为含10μg/ml嘌呤霉素(puromycin)和1mg/ml G418的培养基直到出现细胞克隆。通过显微镜观察，挑选细胞克隆，消化后利用有限稀释法在96孔细胞培养板中继续筛选，最后筛选到1株细胞生长状态良好且具有嘌呤霉素和G418抗性的PK-15CD163+SBQ细胞株。在整个克隆筛选过程中，对克隆细胞株进行荧光的观察。
4PK-15CD163+SBQ稳定细胞株的鉴定
根据CD163和SBQ基因序列，分别设计1对检测引物，用于PK-15CD163+SBQ稳定细胞株荧光定量RT-PCR检测。通过对PK-15CD163+SBQ稳定细胞株和PK-15对照组细胞提取RNA，利用荧光定量RT-PCR方法检测其转录水平，结果显示PK-15CD163+SBQ稳定细胞株的转录水平高于PK-15对照组细胞，且差异显著，如附图1所示。通过对PK-15CD163+SBQ稳定细胞株的连续传代，传到30代时，再在荧光显微镜下观察CD163所带的红色荧光信号和SBQ所带的绿色荧光信号，结果显示仍然可以观察到上述两种荧光，如附图2所示。因此，本发明成功构建了PK-15CD163 +SBQ稳定细胞株。
实施例2PK-15CD163+SBQ稳定细胞株的应用
1细胞传代培养方法
从液氮罐中取出盛装PK-15CD163+SBQ细胞株细胞管置37℃水浴中迅速融化，将PK-15CD163+SBQ细胞株F2移入装有15ml无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。利用DMEM培养基(含体积分数8％FBS)悬浮细胞，37℃培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1∶3～1∶4传代培养，同时培养未改造的PK-15细胞和Marc-145细胞作为对照。
2PK-15CD163+SBQ细胞株在生物反应器中的培养
将培养的PK-15CD163+SBQ细胞株消化传代，分成4个T25方瓶进行培养。PK-15细胞和Marc-145细胞同样分成4个T25细胞，当细胞长满单层后进行接毒。按照0.01MOI的接种剂量接种PRRSV(JXA1-R株)到相应的细胞培养瓶中，孵育1小时后，加入DMEM培养基(含体积分数2％FBS)7ml，每一种细胞接种3个重复样，然后放置到37℃、5％CO2培养箱中进行增殖培养，培养48小时后，收获病毒液，-80℃保存备用。
3病毒含量测定
将收获的病毒液用无血清DMEM细胞培养液稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，分别接种于已长成良好单层、弃去培养液的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照组。置37℃、含5％CO2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50，结果如表1所示。
表1 PRRSV(JXA1-R株)在细胞株上增殖的病毒含量
“/”：表示该病毒液在10-5稀释后，未观察到细胞病变。
综上，本发明的方法可以制备得到稳定的、对PRRSV高度敏感的细胞株，具有良好的应用前景。

Claims (5)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒繁殖用细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将CD163基因的整个编码区序列构建到
PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO慢病毒载体中，将SBQ基因的整个编码区序列构建到PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP慢病毒载体中，得重组慢病毒载体；
2)将前述重组慢病毒载体和病毒拯救辅助质粒先后转入哺乳动物细胞，培养该细胞，得重组病毒；
3)将步骤2)的重组病毒感染PK-15细胞，即得；
步骤1)所述PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO慢病毒载体是在PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-PURO载体基础上将copGFP基因替换为MCHEERY改造得到；
所述PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP慢病毒载体是在PLVX-IRES-NEO载体和PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO载体基础上构建，具体的：以PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO载体为模板扩增EGFP和T2A序列，将EGFP和T2A序列通过酶切连接的方法嵌入到PLVX-IRES-NEO载体的WPRE和NEO元件之间，并在改造后的载体上将CBA启动子序列嵌合至CMV promoter之后；
步骤2)所述辅助质粒指的是慢病毒结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G，重组慢病毒载体、结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G的质量浓度比为4∶3∶1。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述哺乳动物细胞是293T细胞。
3.由权利要求1或2所述构建方法所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒繁殖用细胞株。
4.权利要求3所述细胞株在培养猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述病毒是JXA1-R株。
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