CN113265426A - 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用 - Google Patents

一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113265426A
CN113265426A CN202110564919.3A CN202110564919A CN113265426A CN 113265426 A CN113265426 A CN 113265426A CN 202110564919 A CN202110564919 A CN 202110564919A CN 113265426 A CN113265426 A CN 113265426A
Authority
CN
China
Prior art keywords
orf3
cell
pcv2
stably expressing
porcine circovirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110564919.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113265426B (zh
Inventor
陈洪博
陆灵光
邱龙新
段滇宁
邵丹
颜路琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Longyan University
Original Assignee
Longyan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Longyan University filed Critical Longyan University
Priority to CN202110564919.3A priority Critical patent/CN113265426B/zh
Publication of CN113265426A publication Critical patent/CN113265426A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113265426B publication Critical patent/CN113265426B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0684Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686Kidney cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851Quantitative amplification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/40Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00Genetically modified cells
    • C12N2510/02Cells for production
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/15011Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/10011Circoviridae
    • C12N2750/10022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011Details
    • C12N2750/10011Circoviridae
    • C12N2750/10051Methods of production or purification of viral material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10Plasmid DNA
    • C12N2800/106Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用,属于生物技术检测领域。构建方法包括以下步骤:(1)在pLVZG‑CMV‑copGFP‑Puro载体的NheI和BamHI多克隆位点插入PCV2 ORF3基因;(2)用构建好的pLVZG‑CMV‑ORF3‑copGFP‑Puro重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞,培养、出毒、收取病毒上清、过滤得重组慢病毒液;(3)将包装好的重组慢病毒感染PK‑15细胞,通过嘌呤霉素筛选及鉴定,得稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株。本发明利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达PCV2 ORF3蛋白的细胞株,该细胞株为研究PCV2致病机理研究提供平台,有利于猪圆环病毒2型的深层次的致病机制研究。

Description

一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用
技术领域
本发明属于生物技术检测领域,具体涉及一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒病(porcinecircovirus disease, PCVD)的病原,引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS),目前PMWS已成为全球范围内危害猪群健康的重要疾病。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属,病毒粒子大小为17 – 22 nm,呈对称的二十面体,无囊膜,基因组大小约1.7 kb,包含11个开放阅读框(open reading frames,ORFs),目前己报道5个ORF编码蛋白及其功能研究,即ORF1、ORF2、ORF3、ORF4和ORF5。PCV2感染导致PCVD的典型组织病理学症状是淋巴细胞损伤和组织细胞浸润,感染PCV2发病猪出现显著凋亡坏死的细胞是淋巴细胞,使机体出现免疫抑制状态,因此认为PCV2致病机制与其对免疫器官的损伤密切相关。研究发现ORF3的缺失并不能影响病毒的复制,而ORF3基因表达的细胞出现了与PCV2病毒感染类似的细胞凋亡现象。因此,ORF3诱导淋巴细胞凋亡造成体内淋巴细胞数量减少可能是PCV2引起猪机体免疫抑制的重要原因,但是ORF3如何诱导细胞凋亡有待验证。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用,利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达PCV2 ORF3蛋白的PK-15细胞株,该细胞株为研究PCV2 ORF3蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下;
所述细胞株购买于中国典型培养物保藏中心,购买的细胞株编号为:CCTCC NO:GDC0061,本发明所提供的稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株的构建方法,包括如下步骤:
(1)PCV2 ORF3基因的扩增;
(2)将PCV2 ORF3基因与载体pLVZG-CMV-copGFP-Puro双酶切后连接,构建重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro;
(3)将重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro与慢病毒包装质粒(三种辅助质粒)共转染293T细胞,48 h后,收集细胞上清液,并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基,72 h再次收集一次细胞上清液,将收集的细胞上清液用0.45 μm 滤器过滤,4℃储存;然后将收集的细胞上清液,4°C ,3000 rpm ,离心20 min,去除细胞碎片;然后收集上清液置于新的离心管中,加入适量慢病毒浓缩液,4°C沉淀4 h, 8000 × g ,离心30min,去上清,PBS洗涤沉淀,最后加入5 mL PBS溶解;将溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化,5000× g,离心15 min,获得小于1 mL的病毒浓缩液,用PBS补足至5 mL,再次离心置换缓冲液,此步骤重复3次,最后在病毒浓缩液中加入适量病毒稀释液(DMEM培养液)稀释至1.2 mL;-80°C冰箱保存,备用;
(4)将包装好的重组慢病毒转染PK-15细胞,通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株,对阳性细胞株进行细胞免疫荧光和qPCR鉴定,获得稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株。
进一步地,所述的步骤(1)设计PCV2 ORF3-F和PCV2 ORF3-R为特异性引物,添加酶切位点NheI和BamHI,以感染PCV2的PK-15细胞DNA为模板,进行PCR扩增;所述的特异性引物PCV2 ORF3-F的序列见序列表SEQ ID 1,PCV2 ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 2。
进一步地,所述的步骤(1)PCR扩增体系为:模板1 μl,Primer F(10 μM) 1 μL,Primer R(10 μM) 1 μl,PCR Mix(2×)25 μl,ddH2O 补充至 50 μl;PCR反应程序:95℃预变性5min,95℃变性30 s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共循环35次,最后72℃再延伸10min;PCR结束后,取10μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳,分离、回收纯化。
进一步地,步骤(2)中链接体系为:目的基因 13 μL,载体DNA 4 μL,T4 DNALigase 1 μL,10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL,16℃过夜连接过夜。
进一步地,步骤(3)中,所述的慢病毒包装质粒是pMDLg/pRRE,pRSV-Rev,pMD2.G。
进一步地,步骤(4)中所述的qPCR鉴定的特异性检测引物ORF3-F和ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 4和SEQ ID 5,特异性检测引物GAPDH-F和GAPDH-R的序列见序列表SEQ ID6和SEQ ID 7。
本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理地构建了插入PCV2 ORF3基因的慢病毒系统表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro,之后将该质粒转化入Stbl2感受态细胞大量扩增,与pMDLg/pRRE,pRSV-Rev,pMD2.G三种辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒的包装,用收集的慢病毒感染PK-15细胞,成功感染的话,慢病毒载体会将携带的PCV2 ORF3基因和载体上的嘌呤霉素抗性基因一起整合入PK-15细胞基因组,经一定浓度的嘌呤霉素加压筛选,并通过克隆纯化获得稳定表达PCV2 ORF3蛋白的带有嘌呤霉素抗性的重组细胞系,可用于PCV2 ORF3蛋白功能检测。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
1.本发明以重组慢病毒为载体,将其感染PK-15细胞,筛选获得能稳定表达PCV2ORF3蛋白的PK-15细胞株,所述PCV2 ORF3蛋白融合表达Flag标签,方便PCV2 ORF3蛋白表达的检测。
2.本发明建立了一种带有标签的能稳定表达PCV2 ORF3蛋白的PK-15细胞株,为PCV2 ORF3蛋白生物学特性及功能的研究提供一个良好的工具,为进一步深入研究PCV2ORF3蛋白的生物学特性和感染途径及为阐明PCV2的免疫抑制机理垫定理论基础。
附图说明
图1是本发明构建的重组表达载体pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro结构示意图。
图2是重组表达载体pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro经Nhe I和BamH I双酶切鉴定电泳图(M:DNA Marker;泳道1:pLVZG-CMV-copGFP-Puro空载体酶切后仅观察到8kb大小左右的载体条带;泳道2:重组表达载体pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro酶切后可产生8kb大小的载体条带和315bp大小的目的条带)。
图3 PK15-ORF3稳转株细胞荧光显微镜下观察结果(100×)(A:白光下细胞形态;B:绿色荧光下细胞形态)。
图4 PK15-ORF3稳转株细胞ORF3 mRNA相对表达量。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述,但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1 PCV2 ORF3基因扩增
1、PCV2 ORF3基因PCR扩增根据NCBI中PCV2 ORF3基因序列(No:AY686763),利用软件primer 5设计PCV2 ORF3基因的特异性引物PCV2 ORF3-F和PCV2 ORF3-R,添加酶切位点NheI和BamH I,为方便后续的鉴定,在基因3'末端添加Flag标签序列(序列见列表SEQ ID3)。以感染PCV2的PK-15细胞DNA为模板,进行PCR扩增,PCR扩增体系为:模板 1 μl,PrimerF(10 μM) 1 μL,Primer R(10 μM) 1 μl,PCR Mix(2×) 25 μl,ddH2O up to 50 μl;PCR反应程序:95℃预变性5min,95℃变性30 s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共循环35次,最后72℃再延伸10min。PCR结束后,取10μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收。
实施例2重组表达载体pLVZG-CMV-copGFP-Puro的构建
重组慢病毒表达质粒的构建:将实施例1中得到的PCR产物与pLVZG-CMV-copGFP-Puro分别进行NheI和BamHI酶切,酶切体系于37℃水浴过夜,电泳,将正确的目的条带进行凝胶回收。酶切体系如下:ddH2O:11ul;NheI:1.5ul;BamH I:1.5ul;DNA:1ul(1ug/ul);Enzyme Buffer:5ul;总体系:20ul,温度37℃,反应时间:30min。在16℃反应24h,构建重组慢病毒表达质粒,构建重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro(见图1)。重组载体经NheI和BamHI双酶切之后经琼脂糖凝胶电泳鉴定可观察到8kb大小的载体条带和305bp大小的目的条带,而pLVZG-CMV-copGFP-Puro空载体双酶切后仅观察到8kb大小的载体条带(见图2)。重组质粒转化感受态大肠杆菌E.coli DH 5α,质粒提取试剂提取重组质粒,用NanoDrop测定OD 260及OD 280,计算质粒纯度及浓度。
实施例3重组慢病毒CMV-ORF3-copGFP-Puro的获得
1.慢病毒包装
293T细胞种于10cm培养皿中,置于37°C,5 % CO2的培养箱中,传代12h后细胞融合度达到80%左右。质粒共转体系:pMDLg/pRRE 6 μg,pRSV-Rev 3 μg,pMD2.G 2 μg,穿梭质粒9 μg,Lipo3000 40 μL。转染前1h,更换不含双抗,含10%FBS的培养基;转染后6 h,更换含10% FBS的新鲜培养基。转染后48h,收集细胞上清液,并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基,72h再次收集一次细胞上清液;将收集的细胞上清液(DMEM培养液)用0.45 μm 滤器过滤,4℃储存备用;
2.病毒浓缩和纯化
将收集的细胞上清液,4°C ,3000 rpm ,离心20 min,去除细胞碎片;然后收集上清液置于新的离心管中,加入适量慢病毒浓缩液,4°C沉淀4 h,8000 × g,离心30 min,去上清,PBS洗涤沉淀,最后加入5 mL PBS溶解;将溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化,5000× g,离心15 min,获得小于1 mL的病毒浓缩液,用PBS补足至5mL,再次离心置换buffer,此步骤重复3次,最后在病毒浓缩液加入适量病毒稀释液稀释至1.2 mL; -80°C冰箱保存,备用。
3.慢病毒滴度检测
将生长状态良好的293T细胞消化后,按1.5×104/孔,加入96孔板中,置于37°C,5% CO2培养箱中培养。24 h后准备8个1.5 mL EP管,每管加入216 μL完全培养基,第一个EP管中加入24 μL病毒液(冻融一次),然后做10倍梯度稀释,共8个稀释度。48 h后,加入完全培养基100 μL,避免吹起细胞。72 h后,用荧光显微镜对阳性细胞进行计数,数出最后两个稀释度能观察到荧光的孔内荧光细胞数,计算每个稀释度2个复孔内的平均荧光细胞数,设为X(倒数第二个稀释度孔的荧光细胞平均数)和Y(倒数第一个稀释度孔的荧光细胞平均数)。
慢病毒滴度 (TU/mL) = {[(X+Y×10)/2] /X孔病毒量}×1000
滴度单位:TU/mL,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
实施例4稳定转染细胞株的筛选
1.嘌呤霉素筛选浓度的确定:
在24孔板内接种PK-15细胞,共11孔,传代12 h细胞融合度至80%~90%,依次给每孔换上加入了嘌呤霉素的完全培养基(10%FBS-DMEM),分别为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/mL的浓度梯度,每隔2天观察细胞存活状态(细胞飘起即为死亡),每隔2天更换0.75mL含相应浓度嘌呤霉素的培养基。筛选5~7天内使细胞全部死完的最低嘌呤霉素浓度,即为筛选浓度。第5天,含有5μg/mL嘌呤霉素的孔内的PK-15细胞死完,确定含有5μg/mL的嘌呤霉素完全培养基为之后的筛选培养基。
2.稳定转染细胞株筛选
在24孔板内接种PK-15细胞,传代12 h细胞融合度至80%~90%,接种病毒,病毒液滴度5× 107TU/mL,病毒量15μL。在感染细胞72小时后,通过加入并维持5μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞;每隔2-3天换一次新鲜培养基;倒置荧光显微镜下观察,进行亚克隆筛选,挑选出正常生长细胞群传代,逐步放大培养;从而在嘌呤霉素的维持下筛选阳性细胞株。
3、阳性细胞株的检测
用荧光显微镜对阳性细胞进行免疫荧光鉴定,观察到明显绿色荧光(见图3),该结果显示细胞系PK-ORF3可以成功表达ORF3蛋白。重组细胞系的qPCR鉴定:使用RNA提取试剂盒提取细胞系PK-ORF3的RNA,反转录为cDNA,采用SYBR Green染料检测ORF3的表达,用特异性引物(ORF3检测引物见SEQ ID 4和5,GAPDH检测引物见SEQ ID 6和7)进行qPCR扩增,结果显示重组细胞系PK-ORF3在转录水平成功表达ORF3基因(见图4)。
序列表
<110> 龙岩学院
<120> 一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用
<130> 2021
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctagcatgg taaccatccc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccttac tgatcgaatg t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttgtcgtca tcgtctttgt agtc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacgcttct gcattttccc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaacggag tgacctgtct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggagtgaa cggatttggc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgacaagctt cccgttctcc 20

Claims (8)

1.一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)PCV2 ORF3基因的扩增;
(2)将PCV2 ORF3基因与载体pLVZG-CMV-copGFP-Puro双酶切后连接,构建重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro;
(3)将重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,48 h后,收集细胞上清液,并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基,72 h再次收集一次细胞上清液,将收集的细胞上清液用0.45 μm 滤器过滤,4℃储存;再将收集的细胞上清液离心,去除细胞碎片;然后收集上清液置于新的离心管中,加入适量慢病毒浓缩液,4°C沉淀4 h, 8000 × g ,离心30 min,去上清,PBS洗涤沉淀,最后加入5 mL PBS溶解;将溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化,5000× g,离心15min,获得小于1 mL的病毒浓缩液,用PBS补足至5 mL,再次离心置换缓冲液,此步骤重复3次,最后在病毒浓缩液中加入适量病毒稀释液稀释至1.2 mL;-80°C冰箱保存,备用;
(4)将包装好的重组慢病毒转染PK-15细胞,通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株,对阳性细胞株进行细胞免疫荧光和qPCR鉴定,获得稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株。
2.根据权利要求1所述一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于:步骤(1)设计PCV2 ORF3-F和PCV2 ORF3-R为特异性引物,添加酶切位点NheI和BamHI,以感染PCV2的PK-15细胞DNA为模板,进行PCR扩增; 特异性引物PCV2 ORF3-F的序列见序列表SEQ ID 1,PCV2 ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 2。
3.根据权利要求4所述一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于,PCR扩增体系为:模板 1 μL,Primer F(10 μM) 1 μL,Primer R(10 μM) 1 μL,PCRMix(2×) 25 μL,ddH2O up to 50 μL;PCR反应程序:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共循环35次,最后72℃再延伸10 min;PCR结束后,取10μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳,分离、回收纯化。
4.根据权利要求1所述一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于,步骤(2)中链接体系为:目的基因 13 μL,载体DNA 4 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL,16℃连接过夜。
5.根据权利要求1所述一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于:步骤(3)中,所述的慢病毒包装质粒是pMDLg/pRRE,pRSV-Rev,pMD2.G。
6.根据权利要求1所述一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于:步骤(3)中,所述的病毒稀释液是DMEM培养液。
7.根据权利要求1所述一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法,其特征在于:步骤(4)中qPCR鉴定的引物为特异性检测引物ORF3-F、ORF3-R以及特异性检测引物GAPDH-F、GAPDH-R,所述特异性检测引物ORF3-F和ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 4和SEQID 5,特异性检测引物GAPDH-F和GAPDH-R的序列见序列表SEQ ID 6和SEQ ID 7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法得到的细胞株在PCV2 ORF3蛋白功能检测中的应用。
CN202110564919.3A 2021-05-24 2021-05-24 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用 Active CN113265426B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110564919.3A CN113265426B (zh) 2021-05-24 2021-05-24 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110564919.3A CN113265426B (zh) 2021-05-24 2021-05-24 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113265426A true CN113265426A (zh) 2021-08-17
CN113265426B CN113265426B (zh) 2023-10-31

Family

ID=77232385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110564919.3A Active CN113265426B (zh) 2021-05-24 2021-05-24 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113265426B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181973A (zh) * 2021-12-10 2022-03-15 大连大学 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法
CN114480503A (zh) * 2021-12-20 2022-05-13 北京镁伽科技有限公司 用dna标签标记的基因过表达慢病毒质粒文库及其制备方法和应用
CN115947794A (zh) * 2022-07-19 2023-04-11 沈阳农业大学 一种pcv2 orf3特异性多肽及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180305410A1 (en) * 2015-10-16 2018-10-25 Kansas State University Research Foundation Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
CN109943590A (zh) * 2019-04-18 2019-06-28 西南大学 一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用
CN110129272A (zh) * 2019-03-29 2019-08-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
CN110452928A (zh) * 2019-08-13 2019-11-15 成都天邦生物制品有限公司 一株pk-15稳定细胞株的构建及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180305410A1 (en) * 2015-10-16 2018-10-25 Kansas State University Research Foundation Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
CN110129272A (zh) * 2019-03-29 2019-08-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
CN109943590A (zh) * 2019-04-18 2019-06-28 西南大学 一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用
CN110452928A (zh) * 2019-08-13 2019-11-15 成都天邦生物制品有限公司 一株pk-15稳定细胞株的构建及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李鑫鑫等: "猪圆环病毒2型ORF3蛋白的原核表达及抗体检测ELISA方法的建立", 《中国兽医杂志》 *
陈洪博等: "猪圆环病毒2型感染PK-15细胞中外泌体的鉴定 及其对细胞增殖和凋亡的影响", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181973A (zh) * 2021-12-10 2022-03-15 大连大学 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法
CN114480503A (zh) * 2021-12-20 2022-05-13 北京镁伽科技有限公司 用dna标签标记的基因过表达慢病毒质粒文库及其制备方法和应用
CN115947794A (zh) * 2022-07-19 2023-04-11 沈阳农业大学 一种pcv2 orf3特异性多肽及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113265426B (zh) 2023-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113265426B (zh) 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用
CN109762792B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用
CN101457215B (zh) 重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用
CN109937879B (zh) 一种温山药转基因毛状根的诱导方法
WO2017049759A1 (zh) 一种重组杆状病毒及其应用
CN113684190B (zh) 一种圆圈病毒3型双拷贝全长基因感染性克隆质粒及其构建方法和应用
CN104152416A (zh) 伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用
CN116463297A (zh) 一种表达鸡传染性贫血病病毒vp1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN109320594B (zh) 一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用
CN117511888A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN117286111B (zh) 牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒n蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用
CN112661819A (zh) 新型冠状病毒rbd的重组病毒样颗粒及其构建方法
CN109055432B (zh) 慢病毒感染试剂及其制备方法与应用
CN111973600A (zh) 霉酚酸或其衍生物在制备犬瘟热病毒抑制剂中的用途
CN109536464B (zh) 一种缺失衣壳蛋白基因的基孔肯雅病毒感染性克隆及构建方法和在制备减毒疫苗中的应用
CN108676780B (zh) 一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法
CN117025640A (zh) 一种稳定表达犬细小病毒衣壳蛋白vp1与vp2的细胞系及其制备方法
CN114058646B (zh) 一种表达PCV2d cap蛋白的载体及方法
CN114432435B (zh) 一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗及其制备方法和应用
CN104694561B (zh) 表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的prrsv重组质粒的构建方法以及应用
CN103305534A (zh) 一种水貂肠炎病毒反向遗传学操作系统及其应用
CN113980916A (zh) 一种慢病毒的纯化方法
CN103436498A (zh) 一种猪圆环病毒ⅱ型毒株
CN112143713A (zh) 表达猪δ冠状病毒S1基因的重组腺病毒和制备方法
CN1139656C (zh) 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant