CN103865934B - 银环毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及银环毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制备中的应用，本发明从银环毒素cDNA序列的α‑BGT的长链，β‑BGT的A、B链、κ‑BGT中分别取出2条代表序列，去除其信号肽、前肽部分，只留取成熟肽部分，用生物信息学方法分析得到10个抗原位点，人工合成含有这10个位点的一条基因序列，该序列连接真核表达载体pIRESneo中，作为基因基因疫苗免疫动物获得抗银环毒素的中和抗体；该序列也可连接原核表达载体PET‑28a后，转化至表达菌BL21诱导表达蛋白，并分离目的蛋白后作为免疫原免疫动物来获得抗银环毒素中核抗体。

Description

银环毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种基因及其疫苗的制备，特别是涉及一种从α、β和κ银环毒素中的多个抗原表位的人工合成多肽序列、基因及其应用，属于生物医学领域。

技术背景

毒蛇咬伤在亚洲和非洲国家农村地区一直以来是一个非常严重的公共卫生问题。蛇毒毒素按其性质可分为神经毒、血循毒、混合毒三大类。针对毒蛇咬伤最有效的治疗药物主要是抗蛇毒血清，但由于蛇毒本身成分复杂，含有数十甚至上百种功能各异的蛋白质，用全毒免疫马生产的抗蛇毒血清中，不仅含有能中和毒素成分的抗体，同时也含有大量针对蛇毒中其它非毒素成分的抗体，这不仅使得抗血清效价降低，也增加了使用抗血清的不良反应率。蛇毒毒素按其性质可分为神经毒、血循毒、混合毒三大类。蛇毒神经毒素(neurotoxin,N T)是毒蛇毒液中毒性最大的成分,它能使动物产生迟缓性麻痹和呼吸衰竭,导致动物死亡。蛇毒的神经毒素主要存在于眼镜蛇科的眼镜蛇属，环蛇属和曼巴属毒蛇中。金环蛇、银环蛇、海蛇等主要含神经毒。尖吻蝮蛇、蝰蛇、烙铁头蛇、竹叶青等主要含血循毒。中国常见陆生毒蛇中毒性最强的就是含有神经毒的银环蛇，而银环蛇毒的主要致死性毒素是α和β银环毒素，因而通过生物信息学和分子生物学获得广谱的、只含有银环蛇毒中主要毒素成分关键抗原位点的新型抗原，对实现银环蛇伤高危人群的基因免疫或制备新型免疫原以获得高效、广谱的新型抗蛇毒抗体提供了一种新的抗原和基因，也为利用基因工程实现抗蛇毒抗体的人源化奠定了基础。目前抗蛇毒血清的制备主要是采用传统的蛇毒全毒免疫马获得，随着分子生物学、免疫学和基因工程技术的发展，发展了一些特异性和效价更高的抗蛇毒血清提的新技术和新方法。国际上主要有采用生化和毒素学手段首先分析鉴定出蛇毒中最主要的毒性成分，再利用这些成分的cDNA进行动物免疫。相关报道如下：

1.Azofeifa-Cordero G,Arce-Estrada V,Flores-Díaz M,et al.Immunizationwith cDNA of a novel P-III type metalloproteinase from the rattlesnakeCrotalus durissus durissus elicits antibodies which neutralize69%of thehemorrhage induced by the whole venom[J].Toxicon2008,52:302-308.

2.Harrison RA,Moura-Da-Silva AM,Laing GD,et al.Antibody from miceimmunized with DNA encoding the carboxyldisintegrin and cysteine-rich domain(JD9)of the haemorrhagic metalloprotease,Jararhagin,inhibits the main lethalcomponent of viper venom[J].Clin.Exp.Immunol.,2000,121:358–363.

这些新的蛇毒抗血清的制备方法需首先从复杂的蛇毒中分离纯化出单一的毒素成分并进行鉴定后方能设计相应引物，再从毒腺中反转录出cDNA，而且由于针对的只是蛇毒中的单一一个毒素成分，因此对于含有多种致死性毒素成分的蛇毒往往不能达到良好疗效，同时对于不同蛇种的毒素由于存在种间差异，因此不能起到交叉中和作用。

利用含有多个毒素抗原表位进行基因免疫或新型抗原制备获得抗毒素血清的研究报道有：英国利物浦大学的Wagstaff教授利用非洲锯鳞蝰（Echis ocellatus）cDNA文库的表达序列标签数据库，得到了7个SVMP抗原位点，串联后人工合成这7个抗原位点序列并免疫小鼠，免疫后的小鼠对多种非洲锯鳞蝰的SVMP都具有中和作用，并且能够中和数种其它非洲蝰科蛇毒；发明人小组利用金属蛋白酶基因数据库，得到了6个抗原位点，串联后合成的序列免疫小鼠，能够使免疫小鼠抵抗致死性尖吻蝮蛇毒的攻击。除此之外目前未见其它相关报道。相关文献见下：

1.Wagstaff SC，Laing GD，Theakston RD，et al.Bioinformatics andmultiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom[J].PLoS Med，2006，3(6):e184.

2.张志晓,郑颖,杨彦等.尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA序列抗原位点分析及免疫保护效果观察[J].第二军医大学学报,2010,31(4):364-368.

3.吴梦,叶锋平,张志晓,崔庆华,胡挺松,张富强,邱薇,郭平,范泉水,郑颖.蛇毒金属蛋白酶多表位抗原肽的原核表达和免疫原性研究[J].免疫学杂志,2013,29(9):809-814.

以上研究利用的是非洲锯鳞蝰和尖吻蝮蛇的出血毒素序列进行分析，得到抗多种出血毒素的抗原位点，再串联这些位点获得免疫原。由于该方法只针对金属蛋白酶，只能产生中和出血毒素的抗体，获得的序列也是金属蛋白酶的序列。对于眼镜蛇科的毒蛇，由于其主要致死性毒素为神经毒，因此，针对出血毒素的序列对眼镜蛇科毒蛇毒液中的致死性毒素完全无效（包括银环蛇、金环蛇）。

本发明采用Jameson-Wolf方法和Clustal X从α-银环毒素（BGT），β-BGT、κ-BGT中分别取出2条代表序列，共6条序列。去除其信号肽、前肽部分，只留取成熟肽部分，用生物信息学方法分析得到10个抗原位点，人工合成含有这10个位点的一条序列，并将其连接到真核表达载体获得免疫质粒以供动物进行基因免疫制备抗血清用；另将获得的该序列连接原核表达载体PET-28a后，转化至感受态细胞BL21诱导表达蛋白，并分离纯化表达的目的蛋白，供后期作为免疫源免疫动物制备抗神经毒的广谱蛇毒抗血清。

发明内容

为此，本发明提供一种SEQ ID NO：1的DNA序列，该序列含有多个银环毒素抗原位点。

gtgcggccgc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg 60

ttccactggt gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtaagaagc ctcctggtga 120

gaacctgtgt taccgcaaaa agaaacctca ccccaagcag agaccaggga agaaaggcgg 180

atcagggagg cccattgacg ctctcgaccg atgctgttat aaaaaggtgt gcgattgtga 240

caggaccaag aagcacaaga acatcgacac aaaaaaggac tgcgataaac ccccagataa 300

gaaaggaaac ggcaatcatt ttaaaaagaa gtctagtacc ccacagacct gtccaaaaaa 360

gttcaggagc aactaccgga aaaagactac ggataattgc aatcataaga agctggagtc 420

ccgcggcccc gtcggatccg c 441

其中，gtgcggccgc和ggatccgc为Not I和BamH I酶切位点，atg gag aca gac acactc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac gcg gcc cagccg gcc agg cgc gcg cgc cgt部分为Invitrogen公司pSexTag2表达载体的Ig-κ分泌前导序列。下划线部分为多个抗原位点DNA序列间的连接序列。上述DNA序列是人工合成的，其来源和设计如下：

通过NCBI Blast中的genbank从α-银环毒素（BGT）的长链，β-BGT的A链、β-BGT的B链、κ-BGT中分别取出的2条代表序列，它们在Genbank中的ID号分别为：AF056407、AF056407、AJ242012、AJ242011、Y12100、Y12101、Y12265、Y12266。这些序列在NCBI的genbank中是公开的，输入ID号即可获得详细序列去除其信号肽、前肽部分，只留取成熟肽部分进行分析。通过Jamson-Wolf方法和Clustal X软件的综合分析其保守位点、疏水性、抗原性，结果得到10个位点，这10个位点的氨基酸残基分别为：PPGENLCYK，长度为9个氨基酸残基，来自于α银环毒素；PHPKQRPG，长度为8个氨基酸残基，来自于α银环毒素；GGSGRPIDALDRCCY，长度为15个氨基酸残基，来自于β银环毒素；VCDCDRT，长度为7个氨基酸残基，来自于β银环毒素；HKNIDT，长度为6个氨基酸残基，来自于β银环毒素；DCDKPPD，长度为7个氨基酸残基，来自于β银环毒素；GNGNHFK，来自于β银环毒素；长度为7个氨基酸残基，SSTPQTCP，长度为8个氨基酸残基，来自于К银环毒素；FRSNYR，长度为6个氨基酸残基，来自于К银环毒素；TTDNCNH，长度为7个氨基酸残基，LESRGPV，长度为7个氨基酸残基，来自于К银环毒素。

将这10个位点串联，每个位点之间用KK间隔。经过密码子优化后的序列即为SEQID NO：1。

其合成可以使用现有常规技术进行或交由专业合成公司进行（如华大基因公司）本发明还提供按用SEQ ID NO：1DNA序列编码的蛋白，其含143个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，

其中MET DTL LLW VLL LWV PGS TGD AAQ PAR RAR RTK L部分为Invitrogen公司pSexTag2表达载体的Ig-κ分泌肽序列。

所述蛋白，可以使用现有常规技术进行或通过专业公司进行蛋白合成，也可通过原核或真核表达系统进行基因工程表达获得。

本发明还包括，用本发明的DNA序列SEQ ID NO：1在基因免疫中的应用，该应用是通过将其连接到真核表达载体，然后转化DH5α感受态细胞，经过扩大培养，提取质粒，该质粒作为免疫原可以用作疫苗预防和治疗银环蛇毒中毒。

如可以采用以下方法制备本发明疫苗：

1.将上述基因交由专业公司进行合成，并可根据表达质粒特点进行密码子优化。将含有合成基因的质粒及真核表达载体分别进行Not I/BamH I双酶切，酶切条件按照对应酶的说明书进行。

2.酶切产物经琼脂糖电泳确认大小后，切下目的片段，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收，并对回收产物再次电泳鉴定。

3.鉴定大小无误的回收产物与线性的真核表达载体按照相应的连接说明书进行连接。

4.连接产物转化DH5α感受态细胞。转化产物经菌落PCR和酶切鉴定后含有阳性重组质粒的菌落进行扩大培养，并按质粒提取说明书进行质粒提取。

5.将提取纯化后的质粒与等体积的Al(OH)3佐剂进行充分混匀后，按照5ug～10ug/Kg进行肌肉注射免疫动物，间隔两周后再次免疫，免疫剂量每次递增5ug～10ug/Kg，至最后剂量为50ug/Kg。完成最后一次免疫后2周进行采血。并进行ELISA效价检测。

6.经过三次免疫的动物免疫血清对银环蛇毒的效价为10³以上阳性，对金环蛇毒的效价为10²以上阳性，对马来环蛇的效价为10³以上阳性，对印度环蛇的效价为10³阳性以上。

为此，本发明还包括，包含本发明的DNA序列SEQ ID NO：1的载体，转化细胞，以及质粒。

另外，为优化本发明，本发明还提供一种含有多个银环毒素抗原位点的DNA原核表达序列，序列为SEQ ID NO：3，

gtaggatcca tgcctcctgg tgagaacctg tgttaccgca aaaagaaacc tcaccccaag 60

cagagaccag ggaagaaagg cggatcaggg aggcccattg acgctctcga ccgatgctgt 120

tataaaaagg tgtgcgattg tgacaggacc aagaagcaca agaacatcga cacaaaaaag 180

gactgcgata aacccccaga taagaaagga aacggcaatc attttaaaaa gaagtctagt 240

accccacaga cctgtccaaa aaagttcagg agcaactacc ggaaaaagac tacggataat 300

tgcaatcata agaagctgga gtcccgcggc cccgtctaag tcgacgta 348

其中，gtaggatcc和taagtcgacgta为BamH I和Sal I酶切位点。下划线部分为多个抗原位点DNA序列间的连接序列。

该序列的来源与设计和SEQ ID NO：1相同，只是将SEQ ID NO：1上的Not I和BamHI酶切位点序列置换为BamH I和SalI酶切位点序列。

其合成可以使用现有常规技术进行或交由专业合成公司进行（如上海生工或北京华大基因公司等）

该序列可用于原核表达载体的构建。

按SEQ ID NO：3序列编码的蛋白含107个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4；

所述蛋白，可以使用现有常规技术进行或可以交由专业公司进行全蛋白合成，也可利用下述方法利用原核表达系统进行表达来获得。

用本发明的DNA序列SEQ ID NO：3在基因免疫中的应用，该应用是通过将其连接到原核表达载体，然后转化BL21DE3或其它表达菌感受态细胞，经过扩大培养，提取蛋白，该蛋白作为免疫原可以用作疫苗预防和治疗银环蛇毒中毒。

用序列SEQ ID NO：3制备免疫源的方法可以采用以下方法：

1.将SEQ ID NO：3交由专业公司进行合成，也可通过相应引物设计从SEQ ID NO：1获得，将含有SEQ ID NO：3序列的质粒和原核表达质粒进行SalⅠ/BamH I双酶切，酶切条件按照对应酶的说明书进行。

2.酶切产物经琼脂糖电泳确认大小后，按胶回收试剂盒使用说明对目的片段（大小为350bp左右）进行回收，并对回收产物再次电泳鉴定。

3.鉴定无误的回收目的片段与线性的原核表达载体按照相应的连接说明书进行连接。

4.连接产物转化BL21DE3或其它表达菌感受态细胞。转化产物经菌落PCR和酶切鉴定后含有阳性重组质粒的菌落进行扩大培养。

5.阳性菌的诱导表达及表达产物纯化：阳性菌培养至OD600在0.6～0.8时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达后离心收集菌体，菌体冻融3～5次。然后将得到的菌体悬于TE缓冲液，冰浴超声破碎。离心沉淀1：300（w/v）加入到洗涤液中，洗涤2h。离心，弃去上清。将洗涤后的包涵体加入到含8～10mol/L尿素的裂解液中，过夜。离心，取上清，用Ni²⁺亲和层析柱进行纯化。纯化后的蛋白即为表达的含有多个银环神经毒素抗原表位的新型抗原。

6.动物免疫：取纯化后的蛋白溶液测定蛋白浓度后，加入适量弗氏不完全佐剂，利用无菌注射器进行乳化，首次免疫蛋白剂量为0.5～1.0mg/Kg，取0.3～0.5mL左右乳化后的免疫原等量分4点进行动物皮内注射，2点位于背部，2点位于后肢。间隔2周后进行再次免疫，免疫剂量每次递增0.5～1mg/Kg，剂量最终增至10mg/Kg或动物抗体效价不再升高时的剂量为最终免疫剂量。

7.免疫动物的血清经ELISA方法检测对银环蛇毒的效价在10^-4以上阳性即可采血用于进一步纯化制备抗环蛇毒血清制品，

8.该方法获得的免疫血清酶联免疫法（ELISA）方法检测对银环蛇毒的效价在10⁴以上，对金环蛇毒的效价为10²以上阳性，对马来环蛇的效价为10⁴以上阳性，对印度环蛇的效价为10⁴阳性以上。

本发明进一步提供疫苗制剂，所述制剂包括本发明的基因。所述疫苗还可包括本发明方法获得的质粒，以及本发明方法获得的蛋白。

本发明的疫苗，其优点在于：质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输，使用方便。而且制备简单，容易大量生产，成本低；质粒DNA在宿主体内可较长时间存在，抗原基因在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠；本疫苗本身无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应；同时由于本发明的疫苗只含有刺激机体产生中和抗体的主要抗原表位，本身不再具有神经毒性，因此对机体无毒；同时只刺激机体产生针对银环蛇毒中的致死性的银环毒素的中和抗体，从而比全蛇毒免疫的抗体效价更高。

附图说明

图1α-BGT的长链抗原位点

图2.β-BGT的A链抗原位点

图3.β-BGT的B链抗原位点

图4.酶切电泳图谱，其中

1.含有SEQ ID NO：1的Puc57质粒双酶切后;2.DL5000DNA Marker;3.pIRESneo空质粒单酶切后;4.pIRESneo空质粒双酶切后;5.含有SEQ ID NO：1的pIRESneo质粒经双酶切后;

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围包括但不限于以下实施例。

实施例1

（一）SEQ ID NO：1的获得

（1）生物信息学方法分析得到的抗原位点

从α-银环毒素（BGT）的长链，β-BGT的A、B链、κ-BGT类中分别取出的2条代表序列：AF056407、AF056407、AJ242012、AJ242011、Y12100、Y12101、Y12265、Y12266（以上为NCBIGenbank中的ID号）。

利用SignalP软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）进行分析以上8条序列的信号肽、前肽序列，去除信号肽和前肽序列留取成熟肽序列进行分析。通过Jameson-Wolf方法结合Gamier-Robson和Chou-Fasman方法预测氨基酸序列的二级结构，通过Kyte-Doolittle方法分析疏水性，通过Karplus-Schulz法分析柔韧性，通过Emini法分析位点表面可能性，最后采用Jameson-Wolf方法和Clustal X软件结合进行以上四个方面综合分析以上8条序列中的抗原位点序列。结果得到10个位点，如图1-3所示。

这10个位点的氨基酸残基分别为：PPGENLCYK，长度为9个氨基酸残基，PHPKQRPG，长度为8个氨基酸残基，GGSGRPIDALDRCCY，长度为15个氨基酸残基，VCDCDRT，长度为7个氨基酸残基，HKNIDT，长度为6个氨基酸残基，DCDKPPD，长度为7个氨基酸残基，GNGNHFK，长度为7个氨基酸残基，SSTPQTCP，长度为8个氨基酸残基，FRSNYR，长度为6个氨基酸残基，TTDNCNH，长度为7个氨基酸残基，LESRGPV，长度为7个氨基酸残基。

（2）将这10个位点串联，每个位点之间用KK间隔。经过密码子优化后的序列即为SEQ ID NO：1。斜体部分为Not I和BamH I酶切位点，atg gag aca gac aca ctc ctg ctatgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc aggcgc gcg cgc cgt部分为Invitrogen公司pSexTag2表达载体的Ig-κ分泌前导序列。

（二）SEQ ID NO：1在基因免疫中的应用

（1）将含有通过公司合成序列SEQ ID NO：1的pUC57质粒和真核表达pIRESneo空质粒分别进行Not I/BamH I双酶切，体系为

表1载体双酶切

37℃酶切16h，放置-20℃备用。酶切产物经1%琼脂糖电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收。

（2）将酶切后线性化的pIRESneo与SEQ ID NO：1片段的连接

反应体系为

SEQ ID NO：1片段胶回收产物 4μL

pIRESneo胶回收产物 1μL

Solution I 5μL

将反应体系于16℃连接过夜。

（3）转化DH5α感受态细胞

从-80℃冰箱中取出保存的DH5α感受态细胞100ul，放于冰上，使之慢慢融化，10min。加入全量连接产物10ul，冰浴30min。将eppendorf管置于42℃水浴中90s，立即冰浴1-2min。加入300u1的LB液体培养基，37℃摇床摇动培养30min。12000rpm离心1min后取出约150ul，上清弃之，剩余的培养物，轻轻混匀，涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养14-16h。挑取单个菌落，用菌落PCR和BamH I、Not I双酶切重组质粒pIRESneo-SEQ ID NO：1进行鉴定，双酶切电泳条带长度分别为5.3Kbp左右和450bp左右,说明质粒构建成功。挑取鉴定为阳性的重组菌放大培养。

（4）按照质粒大提说明进行质粒大提并纯化。

（5）重组质粒体外转染

按照Lipofectamine TM2000转染试剂盒说明书将脂质体-DNA的混合物（总体积1000μL）加到培养24小时的293T细胞的表面，摇匀后37℃培养5h，去掉转染混合物，加入含氨苄和卡那霉素的细胞培养基，37℃培养48h，收集上清和细胞，以未转染pIRESneo-Anti的细胞和上清作为对照，用间接ELISA测定上清和细胞中的抗原表达量。结果：上清和细胞中的OD492值均大于对照组2倍以上，说明重组质粒在293T细胞中获得了表达。

表2重组质粒在293T细胞中的表达（OD492）

（6）重组质粒的小鼠免疫

将80只成年昆明鼠随机分为8组，各组分别编号为A1、A2、A3、A4；B1、B2、B3、B4。每组各10只小鼠，将pIRESneo空质粒和含有SEQ ID NO：1序列的pIRESneo质粒辅以等体积的Al(OH)3佐剂进行充分混匀后作为免疫原，质粒浓度为2ug/uL，A组全部接种含有SEQ IDNO：1序列的pIRESneo质粒，B组全部接种pIRESneo空质粒，每只接种于后大腿，间隔两周再次免疫，共免疫3次。

(7)免疫后的抗体水平检测及攻毒保护实验

3次免疫完成后2周，以银环蛇毒、金环蛇毒、马来环蛇和印度环蛇包板，取A1和B1组小鼠血清用ELISA方法进行抗体检测，结果含有SEQ ID NO：1序列的pIRESneo质粒免疫组小鼠血清稀释10⁴倍对银环蛇毒为阳性，稀释10²倍对金环蛇毒阳性，稀释10³倍对马来环蛇阳性，稀释10³倍对印度环蛇阳性。

A2、A3、A4、B2、B3、B4组小鼠分别腹腔注射2LD50银环蛇蛇毒、金环蛇蛇毒和马来环蛇毒后，观察各组小鼠24小时死亡情况。结果注射空质粒的B2、B3、B4组小鼠在24小时内全部死亡，而注射银环蛇毒的A2组小鼠死亡2只，保护率为80%；注射金环蛇毒的A3组小鼠死亡5只，保护率为50%，注射马来环蛇毒的A4组小鼠死亡7只，保护率为70%。

实施例2

（三）SEQ ID NO：3在原核表达制备抗原中的应用

SEQ ID NO：3的设计

在SEQ ID NO：1的基础上将SEQ ID NO：1上的Not I（gtg cgg ccg c）和BamH I（gga tcc gc）酶切位点序列置换为BamH I（gta gga tcc）和SalI（taa gtc gac gta）酶切位点序列后交由专业公司进行全基因合成。

（1）将SEQ ID NO：3交由北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成。将含有合成基因的pUC57质粒和原核表达质粒pET-28a(+)分别进行SalⅠ/BamH I双酶切，酶切条件按照对应酶的说明书进行。

（2）酶切产物经琼脂糖电泳确认大小为350bp左右，切下目的片段，随后按胶回收试剂盒（Promaga公司）使用说明进行回收，并对回收产物再次电泳鉴定。

（3）鉴定大小无误的回收产物与线性的原核表达载体按照相应的连接说明书进行连接。反应体系见下：

将反应体系至16℃连接过夜。

（4）连接产物转化BL21DE3感受态细胞。

转化产物涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12～16h；挑取单个菌落加入含有卡那霉素的4mL液体LB试管中，37℃150x g摇床培养12～16h。经菌落PCR和酶切鉴定含有阳性重组质粒的菌落，挑取表达量较高的菌落进行扩大培养。

（5）阳性菌的诱导表达及表达产物纯化

阳性菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基（卡那霉素浓度为50mg/mL）中，培养至OD600在0.6～0.8时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为1mmol/L）进行诱导表达，诱导表达后3小时，离心收集菌液，并用适量水洗涤菌体1次后，再次离心收集菌体并称重。菌体至-40℃冻融3次。然后将得到的菌体按1：10（w/v）悬于TE缓冲液，冰浴超声破碎（功率400W，超声3sec，间隔6sec，共计工作90次）。离心取沉淀按1：300（w/v）加入4mol/L尿素，50mol/L Tris-HCl pH8.0的洗涤液，洗涤2次。离心，沉淀即为含有目的产物的包涵体粗品。将洗涤后的包涵体加入到10m L含8mol/L尿素、50mmol/LTris、1mol/L EDTA和10mmol/LDTT的裂解液中（pH11.0），磁力搅拌过夜。12000rpm，离心30min，取上清，用Ni²⁺-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化，操作按说明书进行。收集洗脱液即为表达的含有多个银环神经毒素抗原表位的新型抗原。

（6）马匹免疫：取目的蛋白溶液加入等量弗氏不完全佐剂（sigma，10mL/瓶），利用无菌注射器进行充分乳化后作为免疫原备用。马匹首次免疫剂量为含有抗原蛋白1mg/Kg，取0.5mL左右乳化后的免疫原等量分4点进行动物皮内注射，2点位于背部，2点位于后肢。间隔2周后进行再次免疫，免疫剂量每次递增1mg/Kg，剂量最终增至6mg/Kg后马匹抗体效价不再升高。

（7）末次免疫后两周，经ELISA方法测定马匹免疫血清对银环蛇毒抗体效价为10^-5阳性，对金环蛇毒的效价为10^-3阳性，对马来环蛇的效价为10^-5阳性，对印度环蛇的效价为10^-4阳性。

（8）采集马匹免疫血清（采血量10mL/kg），该免疫血清用于进一步纯化制备抗环蛇毒血清制品。

Claims (5)

1.一种DNA序列，该序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3，其含有多个银环毒素抗原位点。

2.权利要求1的DNA序列在制备预防和治疗银环蛇咬伤的疫苗中的应用。

3.一种含有SEQ ID NO：1的DNA序列的pIRESneo真核表达质粒。

4.含有权利要求3所述质粒的疫苗制剂。

5.一种含有SEQ ID NO：3的DNA序列的pET-28a原核表达质粒。