CN101385855A - 精制多价抗蛇毒冻干血清的方法 - Google Patents

Abstract

精制多价抗蛇毒冻干血清的方法，本发明属于含有针对两种以上抗原的抗体的免疫血清。它以五步蛇、蝮蛇、烙铁头、竹叶青、蝰蛇等毒液为免疫抗原，除菌透析后接种动物，用效价免疫血清纯化后收集抗体，脱盐、冻干；以小鼠实验评估蛇毒毒力半数死亡量LD₅₀和抗蛇毒血清效价；接种动物的抗原为毒素、类毒素或蛇毒之一或组合，毒素脱毒用戊二醛或甲醛；免疫前用人用抗破伤风类毒素浓缩抗原对动物进行微量渐进免疫，或用Emuade佐剂免疫。本发明经纯度及比活性、安全、热原、过敏、溶解等试验检验符合我国生物制品标准，能治疗各种毒蛇咬伤患者，且纯度高、易保存、溶解快、异物蛋白低。

Description

精制多价抗蛇毒冻干血清的方法

所属技术领域

本发明属于含有抗体的免疫血清，特别是含有针对两种以上抗原的抗体的免疫血清。

背景技术

我国有蛇类近200种，其中毒蛇有50多种，包括16种剧毒海蛇和近40种陆生剧毒和轻毒蛇。在我国分布广、危害大的有9种陆生剧毒蛇和2种海蛇。它们是：五步蛇(Agkistrodon acutusGuenther)；蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii boie)；烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatusCantor)；竹叶青(Trimeresurus stejnegeri Schmidt)；蝰蛇(Vipera russelli Siamensissmith)；银环蛇(Bungarus multicinctus Blyth)；金环蛇(Bungarus fasciatus Schneider)；眼镜蛇(Na ja na ja atra Cantor)；眼镜王蛇(Ophiophagus Hannah Cantor)；青环海蛇(HydrophisCyanocinctus Daudin)；长吻海蛇(Pelamis platurus Linnaeus)。在南方各省，每年约有数以万计的蛇伤病人。

抗蛇毒血清研制已有一百多年的历史，是目前国际上公认最有效的蛇伤治疗特效药.1955年以来我国相继研制包括抗蝮蛇毒血清、抗眼镜王蛇毒血清、抗金环蛇毒血清等浓缩或精制抗蛇毒血清，但多为只能中和一种蛇毒的单价血清，它对其它蛇毒没有疗效或疗效不显著。

根据1990年卫生部颁布的抗蛇毒血清生产规程规定，抗蛇毒血清的精制方法采用胃酶消化—硫酸铵盐析的工艺，这种工艺与以往的浓缩制品相比，由于采用了胃酶的消化切割，使抗体球蛋白(IgG)的结构分解为F(ab′)₂和Fc二部分，再以盐析收集F(ab′)₂片段，使得抗血清生物活性稳定，分子量减小，降低了对敏感人的抗原性，增加了安全性，从而提高了制品的质量。但是，制品还存在着纯度低，抗体效价低，无冻干工艺等问题。

发明内容

本发明目的是无须确定咬伤蛇种皆能治疗蛇伤，且蛋白质纯度高、便于保存、溶解时间短、临床使用方便、异物蛋白低的多价蛇毒抗血清的制备方法。

本发明通过以下方式实现：其特征在于称量五步蛇、蝮蛇、烙铁头、竹叶青、蝰蛇、银环蛇、金环蛇、眼镜蛇、眼镜王蛇毒液作为免疫抗原，用0.20μm-0.25μm滤膜过滤除菌透析后接种动物，以效价0.06mg/kg-4.5mg/kg免疫血清经胃酶消化—硫酸铵盐析疏水层析纯化后收集抗体，脱盐、冻干。

所述以小鼠实验评估蛇毒毒力半数死亡量LD₅₀和抗蛇毒血清效价。

所述疏水层析纯化采用phenyl-sephrose F.F(low sub)过柱分离去除杂蛋白，纯化后抗体效价为2.0mg/kg-10.0mg/kg。

所述接种动物的抗原可以是毒素、类毒素或蛇毒之一或组合，毒素脱毒可用戊二醛或甲醛，而银环蛇和金环蛇毒素未脱毒。

所述免疫前用人用抗破伤风类毒素浓缩抗原对动物进行微量渐进免疫，或用Emuade佐剂免疫。

在制备中，考虑不同地区同一蛇种蛇毒的差异，本发明采用毒力强，抗原谱广的南方毒蛇蛇毒作免疫抗原制备的抗血清，能够具有良好的免疫效果。

抗原必须除菌处理，否则，不但影响蛇毒的质量而且影响免疫动物的健康。在免疫时蛇毒中的非蛋白成分不产生抗体应答，在免疫前应当通过透析去掉。

一致选择小鼠评估可以取得客观指标，确定抗血清的效果。尤其是，抗血清检定方法除眼镜蛇以外，尚无国际标准，本发明蛇毒小鼠中和致死作用的测定，以及采用小鼠中和试验检测成品抗体效价，保证其具有稳定的质量。

毒素由于存在致死组分，免疫时难免毒杀动物，而类毒素比较安全。由于金环蛇和银环蛇蛇毒量少，价格昂贵，免疫前不再脱毒，而采用微量渐进免疫，虽免疫时间较长，但效价可达到预期的指标。

进行破伤风免疫易于避免动物在后期加大抗原量注射后发生的感染，而且，存在于抗蛇毒血清中的抗破伤风抗体对蛇伤病人也非常有益。

免疫中选用Emuade佐剂，它的浓度较稀，易于免疫。

本发明采集我国常发的九种毒蛇的蛇毒，采用不同的方法脱毒成为类毒素，加福氏佐剂进行基础免疫和超免疫，在免疫动物抗体效价符合标准后，采血并分离血清，采用胃酶消化、分段盐析、phenyl-sephrose F.F(low sub)过柱纯化脱盐精制冻干而成。产品经纯度及比活性检测、安全试验、无菌试验、热原试验、过敏试验、溶解试验等检验，符合我国规定的生物制品标准。与目前制品比较，本发明为九种毒蛇产生的多价抗血清，能够治疗任何一种毒蛇咬伤患者，能在不能确定咬伤蛇种时及时治疗皆有疗效，且抗血清中异物蛋白低，纯度成倍提高，药物安全性好。除外，本发明应用柱层析纯化冻干工艺，制品保存方便，且临床溶解时间不到1分钟。为此，使我国的抗蛇毒血清质量达到了国际水平。

附图说明

图1是本发明纯化的F(ab′)₂峰。

图2是本发明SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

(一)本发明抗血清的制备

1.制取抗原

分别以活蛇咬伤挤压法取得五步蛇；蝮蛇；烙铁头；竹叶青；蝰蛇；银环蛇；金环蛇；眼镜蛇；眼镜王蛇毒液。新鲜毒液立即以五氧化二磷或无水氯化钙真空干燥，将多批干燥蛇毒按蛇种分别进行混合，贮于棕色瓶冻存。

测定毒力：采用Blliss简化机率单位法测定蛇毒毒力，并以半数死亡量LD50表示.随机选择18～20克小鼠编成若干组，每组6只以上，经预试把剂量调节好，使最高剂量组的死亡率接近100％，最小剂量组之死亡率为0％，剂间比值恒定，注射后观察48小时。

蛇毒除菌：准确称取所需干燥蛇毒，用磷酸盐缓冲液溶解至所需浓度，在磷酸盐缓冲液中透析除去非蛋白的组胺部分，然后用0.22um滤膜过滤除菌冻存备用。

脱毒和免疫原配制：除金环蛇和银环蛇之外，其它蛇毒作脱毒处理，毒素脱毒用甲醛渐进法脱毒。

   表1：甲醛渐增法脱毒结果(蛇毒对小鼠LD50)

取液体石腊2份，加热熔化的无水羊毛脂1份于玻璃瓶中摇匀，15磅30分钟高温蒸汽灭菌制成油佐剂，置37℃温水中备用。将已除菌蛇毒与油佐剂等量混合于灭菌玻璃瓶中，用乳化器乳化合格，置4℃冰箱保存，其抗原浓度为0.2毫克/毫升、1毫克/毫升，前期免疫用低浓度免疫原，后期用高浓度免疫原.

2.免疫

选择3-10岁云南矮种健壮马匹检疫合格。在蛇毒免疫前用浓缩破伤风类毒素进行二次前期免疫，以防止在后期蛇毒免疫引起的破伤风。

每种蛇毒免疫数匹马，蛇毒免疫分为基础免疫和超免疫，基础免疫用0.1mg-0.5mg小剂量注射2针，间隔3周。待基免完成后测定免疫马的效价，有明显抗体应答反应的马匹再进行超免，超免剂量由小到大，由弱到强。免疫间隔为2周，免疫部位为皮下、肌肉穴位交替进行。

      表2：蛇毒免役程序及剂量                    单位mg

试血：一毫升血清与不同剂量蛇毒混合，于37℃感作1小时后，注射18～22克小白鼠腹腔，每只0.5毫升，每一剂量用2只，观察48小时，以2只小鼠均不死亡的最高蛇毒量为该血清之试血效价。结果见表2。

在试血效价合格后，在二次免疫中间进行采集抗凝血，离心分离血清，累积几次血浆后，混合并制备。

采用脱毒和不脱毒蛇毒对马进行免疫，达到较满意的结果，其结果见表2。一般超免疫腹亚科在6至8针即可达到采血要求，而眼镜蛇科要稍长一些，金环和银环蛇没有脱毒，抗原用量较少，通常需要10至12针，马匹免疫条件相同，抗体产生不一致，加强免疫后达到有效抗体浓度的成功率为70％左右。

(3)血清精制

马血清(含0.5％酚)加2倍蒸馏水稀释，调pH3.5，加胃蛋白酶(0.1g：1000ml)，0.2％甲苯，37℃，消化2-3h，加固态硫酸铵15g/dl，调pH5.2，加温至57℃，保持30分钟，然后冷却至45℃以下离心，4000rpm，30分钟，沉淀废弃，滤液调到pH7.2，加固态硫酸铵20g/dl，离心，4000rpm，30分钟滤液废弃，将沉淀溶于稀释血浆量1/2蒸馏水中，每100ml加入10％明矾液8ml，pH7.8，搅拌1小时，离心，4000rpm，30分钟沉淀废弃，滤液加固态硫酸铵38g/dl，离心，4000rpm，30分钟，滤液废弃，沉淀溶于生理盐水中。

纯化：System：AKTA explore，Column：XK50/60 phenyl-sephrose F.F(low sub)，BufferA：1mol/L(NH4)₂SO4+0.05M磷酸盐缓冲液，pH6.8；Buffer B：0.05M磷酸盐缓冲液，pH6.8，Flow：25ml/min，收集穿透峰后100％B洗脱，脱盐，除菌过滤。

如图1所示，纯化后F(ab′)₂峰。

如图2所示，纯化后成品蛋白能产生单一的主带，纯度在80％以上。

九种抗血清根据交叉免疫效价和蛇毒最高排毒量计算每人份用量，按比例混合，冻干呈白色疏松固体粉末，经理化测定和生物鉴定合格的为抗血清成品。

(二)免疫试血和成品效价结果

本发明采用小鼠中和试验的方法来表示抗体效价，血清精制后成品效价与血清精制前的对应蛇毒种类免疫血清试血效价逐一比较，并按表2结果保证每批成品具有稳定的质量。

根据我国毒蛇排毒量，对照上表以体重来折算人体的需用量，配制成多价抗血清。

(三)本发明多价抗蛇毒冻干血清对九种蛇毒中和小鼠作用及量效关系

受试小鼠随机分成对照组和多价血清给药组，每组6只以上。按九种蛇伤排毒量比例注射蛇毒，确认蛇毒进入小鼠体内后，多价抗血清给药组分别用不同剂量抗血清成品溶解后，一次注射给药。剂间比值恒定，注射后观察72小时。以不同剂量的多价抗血清对九种蛇毒中和后，对照组死亡率100％，最高剂量组之死亡率为0％。如表4。

表4：多价抗蛇毒血清对九种蛇毒中和小鼠实验及影响

(四)本发明血清的使用方法

本发明适用于我国常见的各种毒蛇咬伤后蛇毒已进入机体的患者。

注射前先做过敏试验，阴性者可全量注射。①过敏试验方法取0.1ml抗血清加1.9ml氯化钠注射液，即20倍稀释、在前臂掌侧皮内注射0.1ml，经20～30分钟，注射部位皮丘在2cm以内，且皮丘周围红晕及蜘蛛足者为阴性，可直接注射。若阳性可疑者，预先注射扑尔敏10mg(儿童剂量根据体重酌减)，15分钟后再注射本品。若阳性者应采用脱敏注射法。②脱敏注射法用氯化钠注射液将抗血清稀释20倍。分数次皮内注射，每次观察10～20分钟，第1次注射0.4ml。如无反应，可酌情增量注射。注射观察3次以上，无异常反应者，即可做静脉、肌内或皮内注射。注射前将制品在37℃水浴加温数分钟。注射时速度应慢，开始每分钟不超过1ml，以后亦不宜超过4ml。注射时，如有异常反应，应立即停止注射。

Claims (5)

1、精制多价抗蛇毒冻干血清的方法，其特征在于称量五步蛇、蝮蛇、烙铁头、竹叶青、蝰蛇、银环蛇、金环蛇、眼镜蛇、眼镜王蛇毒液作为免疫抗原，用0.20μm-0.25μm滤膜过滤除菌透析后接种动物，以效价0.06mg/kg-4.5mg/kg免疫血清经胃酶消化—硫酸铵盐析疏水层析纯化后收集抗体，脱盐、冻干。

2、根据权利要求1所述的精制多价抗蛇毒冻干血清的方法，其特征在于以小鼠实验评估蛇毒毒力半数死亡量LD₅₀和抗蛇毒血清效价。

3、根据权利要求1所述的精制多价抗蛇毒冻干血清的方法，其特征在于疏水层析纯化采用phenyl-sephrose F.F(low sub)过柱分离去除杂蛋白，纯化后抗体效价为2.0mg/kg-10.0mg/kg。

4、根据权利要求1所述的精制多价抗蛇毒冻干血清的方法，其特征在于接种动物的抗原可以是毒素、类毒素或蛇毒之一或组合，毒素脱毒可用戊二醛或甲醛，而银环蛇和金环蛇毒素未脱毒。

5、根据权利要求1所述的精制多价抗蛇毒冻干血清的方法，其特征在于免疫前用人用抗破伤风类毒素浓缩抗原对动物进行微量渐进免疫，或用Emuade佐剂免疫。

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