CN111620947B

CN111620947B - 一种二价抗海蛇毒血清的制备方法

Info

Publication number: CN111620947B
Application number: CN202010529996.0A
Authority: CN
Inventors: 杜宇; 林炽贤; 高建芳; 李佳颀; 吕金更; 梁丁文; 赵祖越; 陈忠荫; 刘其则; 计翔
Original assignee: Hainan Tropical Ocean University
Current assignee: Hainan Blue Shield Medical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111620947A

Abstract

本发明涉及抗蛇毒血清的制备技术领域，尤其涉及一种二价抗海蛇毒血清的制备方法。本发明提供的二价抗海蛇毒血清的制备方法，以青环海蛇和平颏海蛇的蛇毒为抗原,以羊为免疫对象，通过改进免疫方案与剂量，获得了二价抗海蛇毒血清。该血清能够对海蛇蛇毒起到良好的中和效果。该血清针对我国优势种海蛇蛇毒，有助于提高蛇伤治疗的成功率，降低致残率，减少血清过敏等并发症。该制备方法稳定有效在不同个体之间重现度良好，为完善海蛇咬伤的临床治疗及药物制备提供重要参考。

Description

一种二价抗海蛇毒血清的制备方法

技术领域

本发明涉及抗蛇毒血清的制备技术领域，尤其涉及一种二价抗海蛇毒血清的制备方法。

背景技术

我国境内毒蛇资源分布广泛，种类繁多，蛇伤危害较为严重，海蛇也不例外。随着人类海洋活动频率的增加，海蛇(特别是青环海蛇和平颏海蛇)咬伤的数量随之增加。在中国，医院治疗海蛇咬伤主要通过一些方法，如注射同科的抗银环蛇蛇毒血清或抗眼镜蛇蛇毒血清，但这两种抗蛇毒血清对海蛇毒液的中和能力较弱，通常需要增加注射剂量。还有的医院会采用中药与激素类药物结合或直接切开气管的方式来治疗海蛇咬伤。而抗蛇毒血清被认为是治疗蛇咬伤最有效的药物，因此有针对性的抗海蛇毒血清的生产是必要的。

我国广西医科大学李其斌教授2011年与日本蛇类学会合作开发了一种兔源性双价抗青环海蛇和平颏海蛇毒血清，曾在广西北海市等地用于临床急救海蛇咬伤，治疗效果明显，但是未在国内市场大规模推广上市。目前军队有关单位研制出了抗青环海蛇毒血清，但是其应用及治疗效果尚无消息报道。第二军医大学也正在进行抗海蛇毒血清制备的研究。尽管有些国家像澳大利亚已经开发出针对当地海蛇毒的单价抗裂颏海蛇毒血清，但其成本高并且对我国海蛇咬伤的治疗效果尚不清楚。因此，研制针对我国优势种海蛇的抗海蛇毒血清具有较高的应用价值。目前已经面市的抗蛇毒血清通常以马作为免疫动物生产的，但是马的养殖成本较高，且采血较为困难。

一般来说，蛇毒可以用同种或异种的抗蛇毒血清来中和，但是异种抗蛇毒血清的中和效果通常会下降。当无法识别哪种蛇咬伤时，往往很难决定使用哪种抗蛇毒血清，针对某一地区相关蛇类，特别是海蛇，可以直接使用针对该地区蛇类的多价抗蛇毒血清，而无需识别蛇种类。因此研制多价抗海蛇毒血清具有更高的应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种二价抗海蛇毒血清的制备方法，以羊为免疫动物，不仅降低成本，且能够快速达到效价要求。

本发明提供的二价抗海蛇毒血清的制备方法，包括：

步骤1：分别将青环海蛇和平颏海蛇的蛇毒冻干粉溶解于生理盐水，然后将二者混合制得蛇毒溶液，除菌后80～100℃灭活，再与佐剂混合，制得乳化抗原；

步骤2：采用上述乳化抗原对羊进行免疫，第一次免疫的剂量为0.02μg/g，此后分别于第2周、第3周、第5周、第7周、第9周、第14周和第17周加强免疫，免疫剂量依次为0.05μg/g、0.1μg/g、0.2μg/g、0.5μg/g、1μg/g、0.5μg/g、0.5μg/g；收集羊的血清获得为二价抗海蛇毒血清；所述剂量以青环海蛇和平颏海蛇的蛇毒冻干粉的质量之和计算。

在本发明中，所述蛇毒溶液中，青环海蛇毒的浓度为20μg/μL～30μg/μL；平颏海蛇毒的浓度为20μg/μL～30μg/μL。一些实施例中，所述蛇毒溶液中，青环海蛇毒的浓度为25μg/μL；平颏海蛇毒的浓度为25μg/μL。

本发明的方案中，采用高温水浴的方法对蛇毒进行灭活，避免了传统方法中甲醛的使用。一些实施例中，所述灭活的条件为90℃，30min。

在本发明中，所述乳化抗原中，佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；

所述第一次免疫的乳化抗原中佐剂为弗氏完全佐剂；

所述第2～8次免疫的乳化抗原中佐剂为弗氏不完全佐剂；

所述佐剂为弗氏完全佐剂，所述佐剂与蛇毒溶液的体积比为1:1；

所述佐剂为弗氏不完全佐剂，所述佐剂与蛇毒溶液的体积比为1:1。

本发明中，免疫周期与免疫剂量针对羊进行设置，在最初的免疫中，采用低剂量时使羊适应，在羊的适应范围内逐渐加大剂量，并延长免疫间隔时间。在免疫过程中，Elisa检测显示第七周和第九周免疫之后吸光度相差不大，说明免疫剂量到0.5μg/g之后不用再增大免疫剂量，之后的加强免疫剂量为0.5μg/g。第六次免疫之后血清吸光度下降，可以判断免疫的间隔时期为3～4周即可，因此第十四周免疫之后，在第十七周又进行了一次免疫。该免疫方案在大量对象中的尝试表明，重现性良好，在多个个体之间产生的免疫反应该高度相似。

在本发明中，所述羊为黑山羊；所述免疫的部位为腹股沟。实施例中，采用的羊为6月龄雌性黑山羊；所述雌性黑山羊体重15kg。

在本领域，抗蛇毒血清吸光度比阴性血清吸光度大三倍以上，抗蛇毒血清可以被认为有效，而抗蛇毒血清的滴度高于1×10⁵，则认为抗蛇毒血清制备成功。本发明实施例中，第1周抗蛇毒血清均为阴性血清，即未进行免疫时羊本身的血清。取完血后进行免疫，第2周的血清是第一次免疫一周后的血清，其吸光度与阴性血清相差不多，第2周的血清尚未体现阳性结果，所以继续免疫，第3周之后的血清均大于阴性血清三倍以上，被认为是有效血清。因此在本发明中，所述收集羊的血清的时间为第3周～第17周。

本发明所述制备方法制得的二价抗海蛇毒血清。

本发明所述制备方法制得的二价抗海蛇毒血清在制备治疗海蛇咬伤的药物中的应用。

本发明提供的方法，获得了二价抗海蛇毒血清的粗品，经过对其中的特异性抗体进行分离提纯，并进行安全性评估后，可以应用于海蛇咬伤的临床治疗。本发明提供的方法中以青环海蛇、平颏海蛇的蛇毒为抗原，进行抗蛇毒血清的制备，但在此前的研究中，同科、同属的蛇毒蛋白组分相似，因此，临床上，在没有特异性针对某种蛇毒的血清时，通常可以使用同属甚至同科的蛇毒进行治疗。因此，本发明提供的二价抗海蛇毒血清除应用于青环海蛇、平颏海蛇咬伤外，也可以应用于其他海蛇的咬伤。本发明所述海蛇包括青环海蛇和/或平颏海蛇。

本发明还提供了一种治疗海蛇咬伤的药物，其原料包括所述制备方法制得的二价抗海蛇毒血清。

本发明还提供了一种治疗海蛇咬伤的方法，其为给予本发明所述的药物。

本发明提供的二价抗海蛇毒血清的制备方法，以青环海蛇和平颏海蛇的蛇毒为抗原；以羊为免疫对象，通过改进免疫方案与剂量，获得了二价抗海蛇毒血清。该血清能够对海蛇蛇毒起到良好的中和效果。该血清针对我国优势种海蛇蛇毒，有助于提高蛇伤治疗的成功率，降低致残率，减少血清过敏等并发症。该制备方法稳定有效在不同个体之间重现度良好，为完善海蛇咬伤的临床治疗及药物制备提供重要参考。

附图说明

图1示实施例中免疫周期和剂量；

图2示实施例中二价抗海蛇毒血清分别与青环海蛇毒(Hcy)和平颏海蛇毒(Hcu)免疫反应：A图示1号羊的免疫反应，B图示2号羊的免疫反应；

图3示实施例中青环海蛇毒(Hcy)和平颏海蛇毒(Hcu)聚丙烯酰胺凝胶电泳；

图4示实施例中单价抗海蛇毒血清与二价抗海蛇毒血清蛋白免疫印迹检测的示意图：A、B分别是两只羊的二价抗海蛇毒血清与两种蛇毒的蛋白免疫印迹检测图；C是单价抗青环海蛇毒血清与两种蛇毒的蛋白免疫印迹检测图；D是单价抗平颏海蛇毒血清与两种蛇毒的蛋白免疫印迹检测图。

具体实施方式

本发明提供了一种二价抗海蛇毒血清的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1、实验动物选取。实验动物选用的是海南本地黑山羊，体重30斤左右的母羊，免疫前在其耳部作出明确的标记。

2、乳化抗原配制。称取整个免疫周期所需的两种海蛇毒冻干粉，分别溶于生理盐水中配成50μg/μl的蛇毒母液，震荡溶解至无白色粉末后放入离心机3000rpm快速离心15s，按照免疫阶段所需剂量，等量混合两种海蛇毒，过滤除菌，收集滤液至离心管，后于90℃水浴30分钟灭活。待冷却后将混匀的样品溶液与等体积的弗氏完全佐剂(仅用于第一次免疫)或弗氏不完全佐剂吸入注射器中，用静脉输液用软管连接注射器，双向回推至油液不分，配制为乳化抗原。

3、免疫剂量。免疫周期第1周，按照0.02μg/g的剂量对羊进行第一次免疫，每次注射体系平均分4-6次在羊腹股沟进行多点注射。在第2、3、5、7、9、14和17周进行加强免疫，免疫剂量分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、0.5和0.5μg/g(图1)。

4、羊抗蛇毒血清收集制备。在第一次免疫之前，用一次性使用静脉血样采集针轻轻刺入羊颈静脉，采集的血液装在一次性真空采血管中。待凝固后放入4℃冰箱中过夜，3000rpm离心15min，用移液枪取出上清液装在15ml的离心管中，56℃水浴1h，血清于-80℃冰箱中保存用于后期检测，该批次血清作为阴性样品。之后采集的血清，处理方式同前，作为阳性样品。如果抗蛇毒血清的效价高于1×10⁵，则一次可以采50ml血液而无需进一步免疫。

5、酶联免疫吸附实验(ELISA)。用包被液(15mM Na₂CO₃和30mM NaHCO₃)将两种海蛇毒样品分别稀释至2μg/ml。在96孔酶标板上每孔滴加100μl样品，4℃包被过夜。在洗板机中用PBST溶液洗去未结合的蛇毒样品，在每个孔中加入150μl的封闭液(含2％脱脂奶粉的PBST溶液)，37℃封闭1h，洗板。加入用PBST溶液稀释100000倍的二价抗海蛇毒血清，每个血清三个重复，37℃孵育1h，洗板。每个孔加入由PBST溶液稀释10000倍的HRP标记的兔抗羊IgG，37℃孵育1h，洗板。每孔中加入100μl显色液(1mg/ml TMB，30％H₂O₂和0.15M柠檬酸缓冲液)，在黑暗环境中反应20min后，每孔加入50μl的终止液(2.5mol/L硫酸)，在Multiskan FC酶标仪中测定并记录450nm下的吸光值。将二价抗海蛇毒血清稀释100000倍后用ELISA检测血清与蛇毒的免疫反应，以其中两只羊为例，两只羊均在第二次免疫后呈现了明显的免疫应答反应。随着免疫剂量的增大，血清与蛇毒的免疫反应效果更加明显。在第5次免疫后，测定的吸光度趋于稳定(图2)。1、2号羊在用青环海蛇蛇毒作为抗原时分别在第11周和第8周吸光值达到最大为2.15和2.32，当用平颏海蛇蛇毒作为抗原时分别在第6周和第8周吸光度达到最大为2.21和2.42。在第7周后吸光度的数值相差不大，在之后的实验中，可以将方案调整为在第5次免疫之后免疫剂量(0.5μg/g)不再增加。两只羊的血清与两种海蛇毒的免疫反应显示，吸光值比较相近，抗体与两种海蛇蛇毒结合能力相似(图2，A～B)。其他羊只免疫应答反应与此高度相似。

6.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)。使用Eco-Mini垂直电泳系统通过18％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛇毒。电泳后，凝胶上的蛋白条带用考马斯亮蓝R-250染色或转移到PVDF膜(0.45μm)上。将膜用含有5％的脱脂奶粉的TBST溶液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05％Tween-20，pH 8.0)配制的封闭液于4℃封闭过夜。用TBST洗涤后，将膜与用TBST稀释20000倍的二价抗海蛇毒血清在摇床上于37℃孵育1h。然后与TBST稀释10000倍的HRP标记的兔抗羊IgG在摇床上于37℃孵育1h。PVDF膜被发光液(ECL)浸没，然后在暗室曝光。用Tanon-3500R凝胶成像系统扫描分析。青环海蛇毒和平颏海蛇毒蛋白组分相似，多数分布在低分子量区域(5-25kDa)。选择两只羊的第10周的二价抗海蛇毒血清进行蛋白免疫印迹检测，结果显示低分子量区域条带较为密集，呈现了强烈的免疫原性，高分子量区域条带(45-60kDa)虽然在SDS-PAGE中的含量较少，但同样呈现了很强的免疫原性(图4，A～B)。单价抗青环海蛇毒血清(图4，C)和单价抗平颏海蛇毒血清(图4，D)与异种海蛇毒之间也存在着交叉中和反应，但是不如与同种蛇毒反应强烈。这两种单价抗海蛇毒血清对两种海蛇毒的免疫应答反应不如二价抗海蛇毒血清。当不能确定哪种蛇咬伤时，很难决定使用哪种抗蛇毒血清进行治疗。而制备的二价抗海蛇毒血清能有效地中和青环海蛇毒和平颏海蛇毒，可以在确定不了哪种毒蛇咬伤的情况下直接被利用，降低死亡率。本研究初步获得一种羊源性二价抗海蛇毒血清的粗制备方法，并证明该方法制备的二价抗海蛇毒血清能有效中和青环海蛇毒和平颏海蛇毒，表明二价抗海蛇毒血清制备成功。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.二价抗海蛇毒血清的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：分别将青环海蛇和平颏海蛇的蛇毒冻干粉溶解于生理盐水，然后将二者混合制得蛇毒溶液，除菌后80~100℃灭活，再与佐剂混合，制得乳化抗原；

步骤2：采用上述乳化抗原对羊进行免疫，第一次免疫的剂量为0.02 μg/g，此后分别于第2周、第3周、第5周、第7周、第9周、第14周和第17周加强免疫，免疫剂量依次为0.05 μg/g、0.1 μg/g、0.2 μg/g、0.5 μg/g、1 μg/g、0.5 μg/g、0.5 μg/g；收集羊的血清获得为二价抗海蛇毒血清；所述剂量以青环海蛇和平颏海蛇的蛇毒冻干粉的质量之和计算；

所述第一次免疫的乳化抗原中佐剂为弗氏完全佐剂；

所述第2~8次免疫的乳化抗原中佐剂为弗氏不完全佐剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛇毒溶液中，青环海蛇毒的浓度为20 μg/μL~30 μg/μL；平颏海蛇毒的浓度为20 μg/μL~30 μg/μL。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述灭活的条件为90℃，30min。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乳化抗原中，所述佐剂与蛇毒溶液的体积比为1:1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述羊为黑山羊；所述免疫的部位为腹股沟。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述收集羊的血清的时间为第3周~第17周。

7.权利要求1~6任一项所述制备方法制得的二价抗海蛇毒血清。

8.权利要求1~6任一项所述制备方法制得的二价抗海蛇毒血清在制备治疗海蛇咬伤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述海蛇包括青环海蛇和/或平颏海蛇。

10.一种治疗海蛇咬伤的药物，其特征在于，其原料包括权利要求1~6任一项所述制备方法制得的二价抗海蛇毒血清。