CN110078824B - 一种白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法。对白色霞水母毒素进行减毒处理，减毒处理后白色霞水母毒素的与弗氏佐剂混合进行动物免疫，免疫后采血，分离抗血清后纯化，即得白色霞水母毒素抗毒血清。同时由动物体内解毒实验显示该本发明制备的白色霞水母毒素抗毒血清具有效价高、纯度好和解毒效果强等特点，为白色霞水母毒素抗毒血清以及抗体的深入研究和应用奠定了重要的基础。

Description

一种白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法。
背景技术
水母(Jellyfish)是一种胶质状的浮游动物，主要包括四大类群：刺胞动物门的水螅水母类、管水母类、钵水母类以及栉水母门的栉水母类。水母种类繁多，分布广泛，世界上已记录的水母种类大约有1000种左右，其中我国海域已知的约有400种。
白色霞水母，拉丁名为Cyanea nozakii Kishinouye，是大型钵水母，伞径40-60cm，其触手长达2米至数米。近年来，全球水母暴发现象逐年加重，引起了社会的广泛关注。水母暴发不但给海洋渔业生产、生态环境、海滨旅游以及海军训练等涉海活动带来巨大的影响，而且还造成频繁的水母蜇伤，对游客、渔民、海军等涉海人员的健康和生命安全构成极大威胁。水母蜇伤轻者皮肤出现皮疹、红肿、瘙痒，令被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。据报道，全球每年水母蜇伤案例可达1.5亿人次，并造成许多蜇伤蜇伤事件。其中，仅箱水母就至少造成5568例蜇伤致死事件(1954年至今)。我国也是水母爆发重灾区，白色霞水母是我国海域主要伤人水母之一，每年造成的水母蜇伤患者不计其数，起了社会的关注，水母蜇伤已成为严重的公共健康与安全问题。水母之所以能够给造成人类蜇伤，最根本原因是水母含有毒性剧烈的毒素，它主要存在于水母触手上表面的刺丝囊细胞，是一类蛋白类物质，具有多种不同毒性，如溶血活性、肌肉毒性、肾脏毒性、心脏血管毒性、肝脏毒性和致死毒性等；不但能够造成皮肤、脏器损伤，还可导致被蜇伤者死亡。
但是，到目前为止我国尚无治疗水母蜇伤的专用药物，更无应对重症水母蜇伤的特效急救药。针对水母蜇伤患者，只能对症采取措施，例如：水母蜇伤引起皮炎，则使用抗皮炎药物；肺水肿患者，则进行插管救治等。这些措施虽然可能有一定效果，但是并未从根本上将体内毒素消灭，体内毒素则继续对身体造成破坏，最终造成严重后果。
抗毒血清是目前全世界治疗有毒动物咬伤或蜇伤的最有效的首选急救药物，如抗蛇毒血清等；患者如果可以在第一时间及时注射抗毒血清，其生存的可能性将大大增加，同时为后续抢救和治疗赢得宝贵时间。但是，目前我国尚无白色霞水母毒素抗毒血清，有效的白色霞水母毒素抗毒血清的制备研究也是一片空白；并且，由于水母种类的不同，其毒素组成也存在很大差异，水母毒素抗毒血清具有很强的特异性，一种水母毒素的抗毒血清对其他水母蜇伤的解毒效果并不理想；白色霞水母毒素毒性非常强，如何将其制备成合适的抗原进行动物免疫，既可以产生较好的免疫效果，又不至于毒死动物；此外，白色霞水母毒素成分十分复杂，分子量分布非常广，从数千到数十万道尔顿均有分布，造成并非所有毒素蛋白有具有较好的免疫原性，从而可能无法产生相应抗体，因此选用合适佐剂也至关重要。所以，制备白色霞水母毒素抗毒血清，尤其是效价高、纯度好的白色霞水母抗毒血清工作具有很大难度和挑战。
发明内容
本发明的目的是一种有效白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法，对白色霞水母毒素进行减毒处理，减毒处理后白色霞水母毒素的与弗氏佐剂混合进行动物免疫，免疫后采血，分离抗血清后纯化，即得白色霞水母毒素抗毒血清。
所述白色霞水母毒素采用甲醛进行减毒，减毒处理后白色霞水母毒素与弗氏佐剂混合进行动物免疫，期间不断进行效价检测，免疫后采血，离心获得兔血清；然后采用白色霞水母毒素特异偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料进行亲和层析纯化，获得纯净白色霞水母毒素特异性抗体，即白色霞水母毒素抗毒血清。
所述减毒处理为向白色霞水母毒素中加入浓度为35-40％甲醛并于37℃恒温箱中恒温反应5-7天；而后再加入浓度为35-40％甲醛，再于37℃恒温反应5-7天；随后透析除去甲醛，高速离心、过滤后将上清液保存于-80℃待用；所述透析液为pH7.0，浓度为20-50mMPBS；35-40％甲醛与毒素的体积比值(v:v)为0.45％-0.55％。
所述动物免疫为使用新西兰大白兔作为免疫动物，采用减毒后的白色霞水母毒素抗原与弗氏完全佐剂混合进行初免，初免后进行三次加强免疫，分别于初次免疫后2周、4周、6周免疫三次；所述减毒后的白色霞水母毒素抗原与弗氏不完全佐剂体积比为1:1-1.2。
所述初免的免疫剂量为0.35-0.45mg/kg；初次免疫3周后进行第二次免疫，免疫剂量为0.175-0.225mg/kg；2周后进行第三次免疫，免疫量剂量为0.175-0.225mg/kg，2周后进行第四次免疫，免疫剂量为0.175-0.225mg/kg；免疫结束后采全血制备血清，测定其效价。
所述离心获得抗毒血清使用白色霞水母毒素特异偶联的CNBr-activatedAgarose 4B亲和层析填料亲和层析纯化，进而得到白色霞水母毒素蛋白特异性免疫球蛋白抗体。
所述特异亲和纯化填料制备，先使用1-3mM HCl活化CNBr-activated Agarose 4B填料，再将其与白色霞水母毒素在碱性条件下(20-50mM Na2CO3)，于4℃偶联8-12h，即得到白色霞水母毒素偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料。
所述亲和层析为使用pH7.0,20-50mM Na2PO4冲洗层析填料，加入所述获得的兔血清，于4℃摇床过夜，弃上清液，最后使用pH＝2.0-3.0,20-50mM甘氨酸洗脱填料，从而得到含白色霞水母毒素特异性免疫球蛋白抗体的抗毒血清。
一种白色霞水母毒素抗毒血清，按所述方法制备获得白色霞水母毒素抗毒血清。
本发明的优点：
本发明白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法，为研制水母蜇伤治疗药物提供了重要方法指导；具体：
本发明采用减毒白色霞水母毒素免疫实验动物制备抗毒血清，然后采用偶联的白色霞水母毒素的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料特异性纯化粗血清制品中毒素抗体，可有效除去非特异性杂蛋白，制备更纯净的毒素抗体蛋白，具有特异性好和分辨率高等特点，只经过一步亲和层析分离就能够得到较纯的抗体蛋白，有效地缩短了分离时间，减少了抗体蛋白的活性损失。本发明制备的抗毒血清具有效价高、纯度好和解毒效果强等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的免疫结束后白色霞水母毒素抗毒血清的效价检测图；其中，1—12分别代表阴性对照(1)、空白(2)以及稀释1000-5.12 x105倍的血清(3-12)；
图2为本发明实施例1提供的亲和层析纯化后得到纯净白色霞水母毒素抗毒血清效价检测图；其中，1—12分别代表阴性对照(1)、空白(2)以及稀释1000-5.12 x105倍的血清(3-12)；
图3为本发明实施例1提供的亲和层析纯化后得到纯净白色霞水母毒素抗毒血清的非还原SDS-PAGE电泳图；M:标准分子量蛋白，AV：纯化后抗毒血清；
图4为本发明实施例1提供白色霞水母毒素抗毒血清体内解毒实验结果。
具体实施例
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1：
(1)白色霞水母毒素的减毒：向100ml白色霞水母毒素中加入0.4mL40％甲醛,于37℃恒温箱中恒温反应1周；1周后再次加入0.4mL 40％甲醛，37℃恒温反应1周；随后2L,20mMpH7.0PBS透析48h，10000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤，上清液即为减毒后白色霞水母毒素，可作为抗原进行下一步动物免疫。
(2)动物免疫：使用新西兰大白兔作为免疫动物，期间不断进行效价检测，第一次免疫用抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏完全佐剂，免疫剂量为0.35mg/kg；初次免疫3周后进行第二次免疫，免疫抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射剂量为0.175mg/kg；2周后进行第三次免疫，免疫抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射量剂量为0.175mg/kg，2周后进行第四次免疫，减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射剂量为0.175mg/kg，其中，上述各免疫过程中白色霞水母毒素：免疫佐剂比例＝1:1(v:v)，免疫结束后采用ELISA法测定抗毒血清效价，具体如下：
①包被抗原：将抗原用50mM Na2CO3pH＝9.6,按0.2ug/孔包板，100ul/孔，4℃孵育过夜；②洗板：取出用0.05％Tween-20，20Mm NaH2PO4,pH7.4(PBST)洗涤三次，3分钟/次；③封闭：每孔加入5％脱脂奶粉150ul封闭液，37℃封闭60分钟；④洗板：取出用PBST洗涤三次，3分钟/次；⑤加一抗：将兔子的血清分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时；⑥洗板：取出用PBST洗涤三次，3分钟/次；⑦加二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，1:8000稀释，37℃孵育45min；⑧洗板：取出用PBST洗涤五次，3分钟/次；⑨显色：加入底物溶液100ul/孔，反应15min，最后加入100ul 2mol/L硫酸终止反应；⑩测OD值：用酶标仪在450nm波长下测定OD值。
由图1可见，亲和纯化后的白色霞水母毒素抗毒血清在稀释5.12x105倍后，其450nm波长下测定OD值为0.199，仍大约2.5倍的阴性对照值0.033，说明纯化后的白色霞水母毒素抗毒血清的效价高；
(3)白色霞水母毒素抗毒血清的纯化：
①制备特异性亲和纯化填料：取1ml CNBr-activated Agarose 4B填料，使用1mMHCl活化1min，后使用pH7.0,20mM Na2PO4冲洗后加入Na2CO3和白色霞水母毒素4℃偶联8h；
②抗毒血清的纯化：使用pH7.0,20mM Na2PO4冲洗CNBr-activated Agarose 4B，加入上述获得抗毒血清，于4℃摇床过夜，随后去除含有非特异性杂抗体的上清液，最后使用pH＝3.0甘氨酸洗脱填料，即得到毒素蛋白相应抗体，然后再采用上述ELISA法测定其效价(参见图2)，以及非还原SDS-PAGE电泳纯度检测(参加图3)。
由图2可见，亲和纯化后的白色霞水母毒素抗毒血清在稀释5.12x105倍后，其450nm波长下测定OD值为0.161，仍大约2.5倍阴性对照值0.033，说明纯化后的白色霞水母毒素抗毒血清的效价非常高；
此外，由图3可见亲和纯化后的白色霞水母毒素抗毒血清在非还原SDS-PAGE电泳中显示为单一条带，分子量大约在110kDa左右，说明纯化后的白色霞水母毒素抗毒血清的纯度非常高。因此，该方法制备得到了高效价、高纯度的白色霞水母毒素抗毒血清。
(4)抗毒血清的毒素中和效果测定
使用1g左右健康小草鱼作为动物模型检测上述纯化后抗毒血清对白色霞水母毒素的中和效果，实验设置三组，分别为空白对照组、毒素组和毒素+抗毒血清组；每组使用12条小草鱼进行实验，分别向其中注入空白30μL pH7.0,20mM Na2PO4缓冲液、毒素组30μL毒素和毒素+抗毒血清组30μL的毒素与抗毒血清，其中，毒素：抗毒血清1:4(m:m)，观察2h后小草鱼的存活状况(参见图4)。
由图4可见，该方法制备的白色霞水母抗毒血清使动物中毒死亡率显著降低，可有效中和白色霞水母毒素，具有很好的动物体内解毒效果。
实施例2：
(1)白色霞水母毒素的减毒：向100ml白色霞水母毒素中加入0.5mL40％甲醛,于37℃恒温箱中恒温反应1周；1周后再次加入0.5mL 38％甲醛，37℃恒温反应1周；随后3L,30mMpH7.0PBS透析48h，12000rpm离心15min，0.45μm滤膜过滤，上清液即为减毒后白色霞水母毒素，可作为抗原进行下一步动物免疫。
(2)动物免疫：使用新西兰大白兔作为免疫动物，期间不断进行效价检测，第一次免疫用抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏完全佐剂，免疫剂量为0.4mg/kg；初次免疫3周后进行第二次免疫，免疫抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射剂量为0.2mg/kg；2周后进行第三次免疫，免疫抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射量剂量为0.2mg/kg，2周后进行第四次免疫，减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射剂量为0.2mg/kg；其中，上述各免疫过程中白色霞水母毒素：免疫佐剂＝1:1.1；免疫结束后采用ELISA法测定抗毒血清效价，结果显示血清稀释5.12x105倍后，其OD450＞2.5倍阴性值，所得抗毒血清的效价高。
(3)白色霞水母毒素抗毒血清的纯化：
①制备特异性亲和纯化填料：取1ml CNBr-activated Agarose 4B填料，使用2mMHCl活化1min，后使用pH7.0,30mM Na2PO4冲洗后加入Na2CO3和白色霞水母毒素4℃偶联10h；
②抗毒血清的纯化：使用pH7.0,30mM Na2PO4冲洗CNBr-activated Agarose 4B，加入上述收集获得洗脱液，于4℃摇床过夜，随后去除含有非特异性杂抗体的上清液，最后使用pH＝2.5甘氨酸洗脱填料，即得到毒素蛋白相应抗体，然后再采用上述ELISA法测定其效价。
(4)抗毒血清的毒素中和效果测定
使用1g左右健康小草鱼作为动物模型检测上述纯化后抗毒血清对白色霞水母毒素的中和效果，实验设置三组，分别为空白对照组、毒素组和毒素+抗毒血清组；每组使用12条小草鱼进行实验，分别向其中注入空白30μL pH7.0,30mM Na2PO4缓冲液、毒素组30μL毒素和毒素+抗毒血清组30μL的毒素与抗毒血清，其中，毒素：抗毒血清1:3(m:m)，观察2h后小草鱼的存活状况。观测可见，该方法制备的白色霞水母抗毒血清使动物中毒死亡率显著降低，可有效中和白色霞水母毒素，具有很好的动物体内解毒效果。
实施例3：
(1)白色霞水母毒素的减毒：向100ml白色霞水母毒素中加入0.6mL 40％甲醛,于37℃恒温箱中恒温反应1周；1周后再次加入0.6mL 35％甲醛，37℃恒温反应1周；随后4L,50mM pH7.0PBS透析48h，15000rpm离心20min，0.45μm滤膜过滤，上清液即为减毒后白色霞水母毒素，可作为抗原进行下一步动物免疫。
(2)动物免疫：使用新西兰大白兔作为免疫动物，第一次免疫用抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏完全佐剂，免疫剂量为0.45mg/kg；初次免疫3周后进行第二次免疫，免疫抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射剂量为0.225mg/kg；2周后进行第三次免疫，免疫抗原为减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射量剂量为0.225mg/kg，2周后进行第四次免疫，减毒后的白色霞水母毒素+弗氏不完全佐剂，注射剂量为0.225mg/kg；其中，上述各免疫过程中白色霞水母毒素：免疫佐剂＝1：1.2；每次免疫后进行效价检测；由检测结果血清稀释5.12x显示血清效价值≥2.5×阴性值，所得抗毒血清的效价高。
(3)白色霞水母毒素抗毒血清的纯化：
①制备特异性亲和纯化填料：取1ml CNBr-activated Agarose 4B填料，使用3mMHCl活化1min，后使用pH7.0,50mM Na2PO4冲洗后加入Na2CO3和白色霞水母毒素4℃偶联12h；
②抗毒血清的纯化：使用pH7.0,50mM Na2PO4冲洗CNBr-activated Agarose 4B，加入抗毒血清于4℃摇床过夜，随后去除含有非特异性杂抗体的上清液，最后使用pH＝2.0甘氨酸洗脱填料，即得到毒素蛋白相应抗体，然后再采用上述ELISA法测定其效价，结果显示血清稀释5.12x105倍后，其OD450＞2.5倍阴性值，所得抗毒血清的效价高。
(4)抗毒血清的毒素中和效果测定
使用1g左右健康小草鱼作为动物模型检测上述纯化后抗毒血清对白色霞水母毒素的中和效果，实验设置三组，分别为空白对照组、毒素组和毒素+抗毒血清组；每组使用12条小草鱼进行实验，分别向其中注入空白30μL pH7.0,50mM Na2PO4缓冲液、毒素组30μL毒素和毒素+抗毒血清组30μL的毒素与抗毒血清，其中，毒素：抗毒血清1:2(m:m)，观察2h后小草鱼的存活状况。
观测可见，该方法制备的白色霞水母抗毒血清使动物中毒死亡率显著降低，可有效中和白色霞水母毒素，具有很好的动物体内解毒效果。

Claims (5)

1.一种白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法，其特征在于：
白色霞水母毒素采用甲醛进行减毒，减毒处理后白色霞水母毒素与弗氏佐剂混合进行动物免疫，期间不断进行效价检测，免疫后采血，离心获得兔血清；然后采用白色霞水母毒素特异偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料进行亲和层析纯化，获得纯净白色霞水母毒素特异性抗体，即白色霞水母毒素抗毒血清；
所述减毒处理为向白色霞水母毒素中加入浓度为35-40%甲醛并于37℃恒温箱中恒温反应5-7天；而后再加入浓度为35-40%甲醛，再于37℃恒温反应5-7天；随后透析除去甲醛，高速离心、过滤后将上清液保存于-80℃待用；所述透析液为pH7.0，浓度为20-50 mM PBS；35-40%甲醛与毒素的体积比值（v:v）为0.45%-0.55%；
所述离心获得抗毒血清使用白色霞水母毒素特异偶联的CNBr- activated Agarose4B亲和层析填料亲和层析纯化，进而得到白色霞水母毒素蛋白特异性免疫球蛋白抗体；
所述白色霞水母毒素特异偶联的CNBr- activated Agarose 4B亲和层析填料的制备方法为先使用1-3mM HCl活化CNBr-activated Agarose 4B填料，再将其与白色霞水母毒素在20-50 mM Na2CO3的碱性条件下，于4°C偶联 8-12h，即得到白色霞水母毒素偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料。
2.按权利要求1所述的白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法，其特征在于：所述动物免疫为使用新西兰大白兔作为免疫动物，采用减毒后的白色霞水母毒素抗原与弗氏完全佐剂混合进行初免，初免后进行三次加强免疫，分别于初次免疫后 2 周、4 周、6 周免疫三次。
3.按权利要求2所述的白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法，其特征在于：所述初免的免疫剂量为0.35-0.45mg/kg；初次免疫3周后进行第二次免疫，免疫剂量为0.175-0.225mg/kg；2周后进行第三次免疫，免疫量剂量为0.175-0.225mg /kg ，2周后进行第四次免疫，免疫剂量为0.175-0.225mg /kg；免疫结束后采全血制备血清，测定其效价。
4.按权利要求1所述的白色霞水母毒素抗毒血清的制备方法，其特征在于：所述亲和层析纯化为使用pH7.0, 20-50mM Na2PO4冲洗层析填料，加入所述获得的兔血清，于4°C摇床过夜，弃上清液，最后使用pH=2.0-3.0,20-50mM甘氨酸洗脱填料，从而得到含白色霞水母毒素特异性免疫球蛋白抗体的抗毒血清。
5.一种权利要求1所述方法制备获得的白色霞水母毒素抗毒血清。
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