CN105198988A - 抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法。本发明的抗灿烂弧菌卵黄抗体由灿烂弧菌免疫产蛋母鸡而得，具有特异性好、效价高的特点，用于防治灿烂弧菌引起的疾病和免疫学检测具有良好的效果。本发明的抗灿烂弧菌卵黄抗体由灿烂弧菌免疫产蛋母鸡后，收集高免鸡蛋提取得到，无需采血，不损伤免疫动物，符合现代动物权益保护规则；每个鸡蛋大约含有100mg以上的抗灿烂弧菌卵黄抗体，一个月可达3g，相当于免疫兔子后从血液中提取抗体的10-20倍，安全、绿色、高效、高产和成本低等优点，易于产业化。

Description

抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术及应用领域，尤其是涉及一种抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术

灿烂弧菌(Vibriosplendidus)是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病性嗜盐细菌，隶属弧菌科中的弧菌属。灿烂弧菌是海水动物的重要致病菌，可引发刺参、大菱鲆、牙鲆、大西洋鲑鱼、鳟鱼、鲈鱼等水生动物的多种疾病。灿烂弧菌可引起刺参的“腐皮综合征”，死亡率高达90％以上，给养殖业带来巨大损失。

目前对于灿烂弧菌引起的疾病的防治手段主要有以下几种：抗生素和化学类药物、中草药、灭活疫苗和抗体等。其中使用最为普遍的即是抗生素和化学类药物。但随着抗生素和化学药物的长期滥用，带来了诸多弊端：①使病原菌产生耐药性，以致抗生素的作用效果显著下降，甚至无效；②造成严重的水体污染，并引发水环境微生态失衡；③在动物体内产生药物残留，影响产品的质量安全，并间接危害人体健康。因此，亟待寻求一种既能有效控制海水养殖动物疾病，又不会带来毒副作用的新技术、新产品，以部分或完全替代现有抗生素或化学药物，实现健康养殖，也已成为当前研究的热点和难点。

卵黄抗体(eggyolkimmunoglobulin，IgY)由于具有特异性强、高效性、无毒无副作用及对环境无害等特点，已经成为一种有效地抗生素和化学类药物替代品。而且卵黄抗体具有低成本、高效益，生产便利及产量高等特点，被作为疾病预防和控制的有效方法而受到广泛的关注。与传统的抗生素和化学药物相比，应用卵黄抗体具有以下几个优点：(1)特异性强。与广谱的抗生素不同，卵黄抗体只针对相应的致病菌，不会对其它菌群产生影响。(2)易获取。卵黄抗体可从免疫蛋鸡的鸡蛋中获取，无需宰杀大量动物且产生的抗体效价高，稳定性强，能够避免频繁注射。(3)于鸡类与哺乳动物间存在一定系统发育距离，少量抗原就可以引发有效的免疫应答。(4)无残留。由于卵黄抗体属于免疫球蛋白，发挥作用后会被机体作为营养物质消化吸收。(5)研制开发的周期短，成本低，可长期保存，便于运输和应用。自1898年由Klemperer首次发现以来，已广泛应用于动物疾病的防治和疾病诊断等方面。美国食品和药品管理局(FDA)将卵黄抗体列入“公认安全使用物质(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS)，把卵黄抗体看作药效营养品(Nutraceuticals)。特异性卵黄抗体通过饲喂、注射和浸浴等方式，对水产动物起到保护预防及疾病治疗作用，还可以应用于免疫学检测和疾病诊断等领域。目前，水产方面申请公开和授权的专利有抗对虾病毒病、抗贝氏隐孢子虫病、抗副溶血弧菌病、抗嗜水气单胞菌病以及抗鳗弧菌病的卵黄抗体，还没有关于抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用。本发明的抗灿烂弧菌卵黄抗体特异性强、纯度高，且对灿烂弧菌有较强的抑制作用，同时抗体制备成本低、方便简易，适于大规模生产，可用于由灿烂弧菌引起的疾病的预防和治疗上以及开发灿烂弧菌检测试剂盒免疫学反应及诊断。

本发明的第一方面提供一种抗灿烂弧菌卵黄抗体，该抗灿烂弧菌抗体是用灭活灿烂弧菌为抗原对蛋鸡进行免疫，收集该被免疫的蛋鸡的鸡蛋，对鸡蛋卵黄中分离得到的水溶性组分，再进行分离纯化后得到的。

进一步地，所述的蛋鸡为20周龄的健康产蛋母鸡。

本发明的第二方面，提供一种上述所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)抗原的制备：将灿烂弧菌在液体培养基中扩增培养至菌液浓度10^7～10⁹CFU/mL，收集菌体，用PBS稀释后甲醛灭活，得到灭活的灿烂弧菌抗原；

(2)免疫蛋鸡：将步骤(1)得到的灭活的灿烂弧菌抗原与弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂按照等体积混合，乳化，制成弗式完全佐剂疫苗或弗式不完全佐剂疫苗；对蛋鸡进行免疫，共免疫三次，初免使用弗式完全佐剂疫苗，二免和三免使用弗式不完全佐剂疫苗；

(3)二免后每隔一周收集鸡蛋一次，将收集的鸡蛋，清洗、消毒后，收集卵黄液，卵黄液中加入6倍体积的去离子水稀释，调pH至5.0，-20℃冷冻过夜后，在4℃缓慢解冻，反复冻融2次后，离心，收集上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，得卵黄抗体粗提物；

(4)将步骤(3)所得卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗灿烂弧菌卵黄抗体。

在上述技术方案中，步骤(2)所述的对蛋鸡的免疫方法为：初免时使用的弗式完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡1mL，其中左右胸肌各注射0.2～0.4mL，颈后部皮下注射0.2～0.6mL；初免2周后进行二免，弗式不完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡1.5mL，其中左右胸肌和颈后部皮下各注射0.5mL；二免2周后进行三免，弗式不完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡2mL，其中左右胸肌各0.5～0.8mL，颈后部皮下注射0.4～1mL。

在上述技术方案中，步骤(4)所述的卵黄抗体粗提物的纯化方法为：向卵黄抗体粗提物中加入硫酸铵至饱和度为60％，充分搅拌均匀后4℃过夜，4℃下离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，充分搅拌均匀后室温过夜，室温离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，得到卵黄抗体提取液；卵黄抗体提取液用100kDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤后的卵黄抗体提取液在-70℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗灿烂弧菌卵黄抗体冻干粉。

在上述技术方案中，步骤(3)中得到的卵黄抗体的粗提物(水溶性组分)先进行卵黄抗体效价测定后，选取抗体效价在1:10000以上的卵黄抗体的粗提物，再经纯化得到抗灿烂弧菌卵黄抗体。其中所述的卵黄抗体的效价测定方法采用酶联免疫吸附法，具体方法为如下：用10⁹CFU/mL菌浓度的灿烂弧菌包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后，洗涤，加入含有1％牛血清白(1‰BSA)蛋白的封闭液37℃水浴2h，洗涤，然后每孔加入用含有1‰BSA的结合物稀释液稀释的卵黄抗体粗体物100μL，同时设置阴性对照和空白对照；每孔加入结合物稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体(IgG-HRP)100μL，37℃水浴1h，反应结束后洗涤，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色20min，加入H₂SO₄终止液50μL，用酶标仪检测OD_450/630nm。OD值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为卵黄抗体效价。

本发明的第三方面，提供上述所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体在制备预防和治疗灿烂弧菌引起的疾病的制剂中的应用。所述制剂优选为药物、保健品和饲料添加剂。具体为：将上述的方法制备得到的抗灿烂弧菌卵黄抗体的粗提物或经纯化得到的灿烂弧菌卵黄抗体纯品按一定比例与辅料配比，制成不同的制剂，包括液态制剂、颗粒制剂、膏剂、片剂或胶囊制剂等，可用于制备预防和治疗灿烂弧菌感染的疾病的药物、保健品，以及水产养殖中防治灿烂弧菌引起的疾病的药物或饲料添加剂。所述辅料及比例不予特别限定，可以采用本领域常规添加剂或比例。

本发明的第四方面，提供上述所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体，在制备以灿烂弧菌为抗原的亲和纯化试剂或以灿烂弧菌为抗原的免疫检测试剂中的应用。其中，所述以灿烂弧菌为抗原的亲和纯化试剂中，本发明的抗灿烂弧菌卵黄抗体可以作为亲和配基，用于相应抗原的亲和纯化；所述以灿烂弧菌为抗原的免疫检测试剂中的应用，具体包括酶联免疫吸附法、免疫沉淀、免疫电镜、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析和免疫细胞学等一系列免疫诊断技术中的应用，用以检测相应的抗原。

本发明公开了一种抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用。该制备方法得到的卵黄抗体特异性高、纯度高，且对灿烂弧菌具有较强的抑制作用，同时抗体的制备方法简易方便，成本低、适于大规模生产，最后获得的高产、高效、高纯的卵黄抗体可用于由灿烂弧菌引起的疾病的预防和治疗上及开发灿烂弧菌检测试剂盒和免疫反应诊断。该效价检测方法，检测效率高，结果准确，操作简易方便。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述抗灿烂弧菌卵黄抗体由灿烂弧菌免疫产蛋母鸡而得，具有特异性强、效价高的特点，用于防治灿烂弧菌引起的疾病和免疫学检测具有良好的效果。

(2)本发明所述抗灿烂弧菌卵黄抗体由灿烂弧菌免疫产蛋母鸡后，收集高免鸡蛋提取得到，无需采血，不损伤免疫动物，符合现代动物权益保护规则；每个蛋大约含有100mg以上的卵黄抗体，一个月可达3g，相当于免疫兔子后从血液中提取抗体的10～20倍。安全、绿色、高效、高产和成本低等优点，易于产业化。

附图说明

图1为本发明抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体效价图；

图2为本发明抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体的非还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；其中，泳道M：蛋白Maker；泳道1：卵黄抗体粗提物；泳道2：硫酸铵盐析后所得溶液；泳道3：硫酸钠盐析后所得溶液；泳道4：超滤浓缩后所得溶液；泳道5：卵黄抗体冻干粉。

图3为本发明抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体的还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；其中，泳道M：蛋白Maker；泳道1：卵黄抗体粗提物；泳道2：硫酸铵盐析后所得溶液；泳道3：硫酸钠盐析后所得溶液；泳道4：超滤浓缩后所得溶液；泳道5：卵黄抗体冻干粉。

图4为本发明抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体的体外抑菌效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、方案、流程和优点更加清楚明晰，结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，值得注意的是，此处具体实施例仅作为解释说明本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1抗灿烂弧菌卵黄抗体的制备

(1)灿烂弧菌抗原的制备

灿烂弧菌AP622(Vibriosplendidus)由大连海洋大学李华教授惠赠，该菌保存于韩国典型菌种保藏中心(KoreanCollectionforTypeCultures)。将该菌于TSA固体琼脂培养基，28℃倒置培养24h后，挑取单菌落接种于2216E液体培养基中，在28℃，140rpm的条件下，摇床振荡培养12h后，培养至菌浓度为10⁸CFU/mL，然后离心分离得到含有灿烂弧菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌PBS混合得到10⁹CFU/mL灿烂弧菌的菌悬液。

(2)灿烂弧菌抗原的灭活

在菌悬液中加入甲醛，使甲醛体积终浓度为0.5％，37℃摇床灭活24h后，5000g/min离心10min，除去甲醛，用无菌PBS洗涤菌体沉淀3次，调整菌液浓度，即得到灭活的灿烂弧菌抗原。

(3)疫苗的制备及蛋鸡的免疫

对蛋鸡进行免疫，共免疫三次，初免(基础免疫)为：将灭活的灿烂弧菌抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合，并采用双推法乳化，乳化完全后对蛋鸡颈后皮下和左右胸肌进行3点注射免疫，其中左右胸肌各注射0.3mL，颈后皮下注射0.4mL。初免2周后依次进行二次和三次免疫，即加强免疫，具体方法为：将灭活灿烂弧菌抗原与弗氏不完全佐剂混合，采用双推法完全乳化，对蛋鸡进行3点注射免疫，每次免疫间隔2周，二次免疫时左右胸肌和颈后部皮下各注射0.5mL，三次免疫时左右胸肌各0.6mL，颈后部皮下注射0.8mL；第二次加强免疫后开始收集鸡蛋，于4℃冰箱中冷藏保存；

(4)卵黄抗体的粗分离

将得到的免疫鸡蛋用0.5％新洁尔灭溶液浸泡消毒。用卵黄分离器分离蛋黄，用无菌牙签刺破卵黄膜收集卵黄液于容器内，加入卵黄液体积6倍的去离子水稀释，调节pH至5.0，放入-20摄氏度冰箱冷冻过夜后，放在4℃冰箱中缓慢解冻，反复冻融2次后取上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到卵黄抗体水溶性组分，即卵黄抗体的粗提物，选取卵黄抗体效价在1:10000以上的卵黄抗体的粗提物，进行进一步的纯化；

(5)卵黄抗体粗提物的纯化

向卵黄抗体粗提物中加入硫酸铵至饱和度为60％，充分搅拌均匀后4℃过夜。4℃，10000g/min，离心15min，弃上清，将沉淀用去离子水稀释至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，充分搅拌均匀后室温过夜。室温，10000g/min，离心15min，弃上清，将沉淀用去离子水稀释至原体积，即得到IgY提取液。用100kDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，同时进一步纯化。将超滤后的卵黄抗体液在-70℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗灿烂弧菌卵黄抗体冻干粉。

实施例2卵黄抗体的效价检测

采用酶联免疫吸附法检测效价，用10⁹CFU/mL菌浓度的灿烂弧菌包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后，甩板，用洗涤液洗涤3次后，加入含有1％BSA的封闭液37℃水浴2h。水浴结束后甩板，洗涤3次，然后每孔加入含有1‰BSA的结合物稀释液稀释的抗灿烂弧菌卵黄抗体(或卵黄抗体粗提物)100μL，同时设置阴性对照和空白对照，37℃水浴2h。水浴结束后洗涤3次，每孔加入结合物稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体(IgG-HRP)100μL，37℃水浴1h。反应结束后洗涤5次，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色20min，显色结束后每孔加入H₂SO₄终止液50μL，用酶标仪检测OD_450/630nm。OD值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为卵黄抗体效价。抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体效价图如图1。图1中，A，B，C分别表示初次免疫、二次免疫和三次免疫的时间，图1可见，初次免疫后效价开始上升，7周达到峰值(1：320000)，持续4周时间后开始下降，第三次加强免疫后，效价再次升至峰值，并持续两周时间，然后逐步下降。

实施例3：卵黄抗体的纯度鉴定

取实施例1中步骤(4)步骤(5)中得到的产品进行卵黄抗体纯度鉴定，使用非还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图2，M：蛋白Maker；1：卵黄抗体粗提物；2：硫酸铵盐析后所得溶液；3：硫酸钠盐析后所得溶液；4：超滤浓缩后所得溶液；5：卵黄抗体冻干粉。用还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图3，其中M：蛋白Maker；1：卵黄抗体粗提物；2：硫酸铵盐析后所得溶液；3：硫酸钠盐析后所得溶液；4：超滤浓缩后所得溶液；5：卵黄抗体冻干粉。图2的结果显示，IgY的分子量为180kDa，由于非还原性SDS-PAGE的上样缓冲液中无β-巯基乙醇，因此IgY分子的二硫键未被破坏，保留了其四级结构，电泳结果显示会比本身分子量高。经凝胶分析软件分析可知，纯度达到83％。图3的结果显示，IgY分子由两条重链和两条轻链组成，重链约68kDa，轻链约28kDa。还原性SDS-PAGE的上样缓冲液中含有β-巯基乙醇，可以IgY分子间的二硫键断裂，使各亚基完全分开为两条重链和两条轻链。结果显示其重链约68kDa，轻链约28kDa与文献报道一致。

实施例4体外抑菌实验

将灿烂弧菌接种于2216E培养基中，28℃，140rpm摇床培养，待至对数期是接种于新鲜2216E培养基，并调节菌浓度至10⁶CFU/mL，分装到6个三角瓶中并分别加入0.22μm过滤除菌后的1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml特异性卵黄抗体、10mg/ml非特异性卵黄抗体(卵黄抗体均溶解于PBS中)、链霉素0.1mg/ml和无菌PBS(0.01mol/mL，pH7.4)。将6个三角瓶28℃，140rpm摇床培养，每隔2小时取培养液，用稀释涂平板法计活菌数。结果证明(图4)，制备的抗灿烂弧菌卵黄抗体的浓度达到10mg/ml时，对灿烂弧菌的生长繁殖有明显的抑制作用。

实施例5抗灿烂弧菌卵黄抗体在治疗海水养殖刺参中由灿烂弧菌引起的腐皮综合征的应用

刺参腐皮综合征，经检测为感染灿烂弧菌。将抗灿烂弧菌卵黄抗体，通过饲喂和浸浴等方式给患病刺参施用后，症状明显减轻。对未患病刺参饲喂和浸浴等方式施用抗灿烂弧菌卵黄抗体后，再进行攻毒实验，发现攻毒致死率明显下降，说明抗灿烂弧菌卵黄抗体对其具有良好的预防作用。具体实验如下：

1.半数致死量的确定

表1.半数致死量测定试验

表1中：将健康的海水养殖刺参进行腹腔注射，设4个实验组和1个对照组，每组20头。实验组使用10⁴、10⁵、10⁶和10⁷CFU/mL浓度的灿烂弧菌进行攻毒实验，每头刺参腹腔注射0.1mL，共1次，对照组注射PBS。记录各组刺参死亡数，计算各组死亡率。最后计算得到灿烂弧菌的半数致死量LD₅₀＝3.5×10⁵CFU/mL。表1的结果可见，在腹腔注射攻毒实验中，随着菌浓度的增加死亡率显著增加，死亡率与灿烂弧菌浓度有剂量依赖性。

2.饲喂保护实验：

饲喂治疗实验先以半数致死量浓度的菌液对刺参注射攻毒，再饲喂添加0.1％和1％特异性IgY粉的饲料和添加1％非特异IgY粉的饲料，以未添加卵黄抗体的商业饲料为空白对照，考察口服特异性卵黄抗体对刺参的治疗作用。饲喂预防实验则先饲喂添加0.1％和1％特异性IgY粉的饲料和添加1％非特异IgY粉的饲料，未添加卵黄抗体的商业饲料为空白对照，再以半数致死量浓度对刺参进行攻毒。结果显示，将抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体，通过饲喂方式给患病刺参施用后，症状明显减轻，刺参死亡率显著降低。对未患病刺参饲喂抗灿烂弧菌卵黄抗体后，再进行攻毒实验，发现攻毒致死率明显下降，说明抗灿烂弧菌卵黄抗体对其具有良好的保护作用。具体如表2：

表2.口服治疗组

3.浸浴保护实验：

浸浴治疗实验以半数致死量浓度菌液对刺参腹腔注射攻毒，再将实验组刺参浸浴于含有0.01g/L和0.1g/L的特异性IgY灭菌海水中1h，总共1次，同时，以0.1g/L非特异IgY、0.05g/L链霉素和PBS分别作为阴性、阳性和空白对照。考察特异性IgY的浸浴给药方式对刺参的治疗作用。浸浴预防实验是先将实验组刺参浸浴于含有0.01g/L和0.1g/L的特异性IgY灭菌海水中1h，总共1次，同时，以0.1g/L非特异IgY、0.05g/L链霉素和PBS分别作为阴性、阳性和空白对照，再以半数致死量浓度对刺参进行攻毒。考察特异性IgY的浸浴给药方式对刺参的预防作用。结果显示，通过浸浴方式将抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体使用后，刺参死亡率显著降低。将未患病刺参浸浴抗灿烂弧菌卵黄抗体后，再进行攻毒实验，发现攻毒致死率明显下降，说明抗灿烂弧菌卵黄抗体对其具有良好的保护作用。具体如表3：

表3.浸浴实验分组

实施例6制备检测灿烂弧菌的双抗夹心ELISA试剂盒

卵黄抗体具有良好的特异性和敏感性，是优良的免疫学检测工具。下面是一种利用卵黄抗体作为捕获抗体，用双抗夹心ELISA检测灿烂弧菌的方法：

将纯化的抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体溶于包被液(0.05mol/mL，pH9.6碳酸盐缓冲液)，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后，甩板洗涤3次后，每孔加入100μL待测样品，37℃水浴2h。水浴结束后洗涤3次，每孔加入100μL抗灿烂弧菌特异性兔IgG，37℃水浴2h，洗涤3次，每孔加入结合物稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(IgG-HRP)100μL，37℃水浴1h。反应结束后洗涤5次，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色20min，显色结束后每孔加入H₂SO₄终止液50μL终止反应，用酶标仪检测OD_450nm吸光值。以待测样品和阴性对照的OD_450nm值之比大于2.1，判断为阳性。

同理也可建立以抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体为检测抗体，抗灿烂弧菌特异性兔IgG为捕获抗体的双夹心ELISA。

在其他一系列免疫诊断技术中用以检测相应的灿烂弧菌抗原的应用，例如免疫沉淀、免疫电镜、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析和免疫细胞学等，不一一实施例赘述。

上述实施例中所述的特异性IgY是指抗灿烂弧菌特异性卵黄抗体，由本发明方法制备得到的纯化的抗灿烂弧菌卵黄抗体冻干粉用PBS、饲料或灭菌海水稀释至实验浓度后使用。所述的非特异IgY是指抗灿烂弧菌非特异性卵黄抗体，由市售的普通鸡蛋中提取得到。

Claims (8)

1.一种抗灿烂弧菌卵黄抗体，其特征在于，该抗灿烂弧菌卵黄抗体是用灭活灿烂弧菌为抗原对蛋鸡进行免疫，收集该被免疫蛋鸡的鸡蛋，对鸡蛋卵黄中分离得到的水溶性组分，进行分离纯化后得到的。

2.根据权利要求1所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体，其特征在于，所述的蛋鸡为20周龄的健康产蛋母鸡。

3.权利要求1或2所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗原的制备：将灿烂弧菌在液体培养基中扩增培养至菌液浓度10⁷～10⁹CFU/mL，收集菌体，用PBS稀释后甲醛灭活，得到灭活的灿烂弧菌抗原；

(2)免疫蛋鸡：将步骤(1)得到的灭活的灿烂弧菌抗原与弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂按照等体积混合，乳化，制成弗式完全佐剂疫苗或弗式不完全佐剂疫苗；对蛋鸡进行免疫，共免疫三次，初免用弗式完全佐剂疫苗，二免和三免用弗式不完全佐剂疫苗；

(3)二免后每隔一周收集鸡蛋一次，将收集的鸡蛋，清洗、消毒后，收集卵黄液，卵黄液中加入6倍体积的去离子水稀释，调pH至5.0，-20℃冷冻过夜后，在4℃缓慢解冻，反复冻融2次后，离心，收集上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，得卵黄抗体粗提物；

(4)将步骤(3)所得卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗灿烂弧菌卵黄抗体。

4.权利要求3所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的对蛋鸡的免疫方法为：初免时使用的弗式完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡1mL，其中左右胸肌各注射0.2～0.4mL，颈后部皮下注射0.2～0.6mL；初免2周后进行二免，弗式不完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡1.5mL，其中左右胸肌和颈后部皮下各注射0.5mL；二免2周后进行三免，弗式不完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡2mL，其中左右胸肌各0.5～0.8mL，颈后部皮下注射0.4～1mL。

5.根据权利要求3所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述卵黄抗体粗提物的纯化方法为：向卵黄抗体粗提物中加入硫酸铵至饱和度为60％，搅拌均匀后4℃过夜，4℃下离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，搅拌均匀后室温过夜，室温离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，得到卵黄抗体提取液；卵黄抗体提取液用100kDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤后的卵黄抗体提取液在-70℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗灿烂弧菌卵黄抗体冻干粉。

6.权利要求1或2所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体在制备预防和治疗灿烂弧菌引起疾病的制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制剂为药物、保健品和饲料添加剂。

8.权利要求1或2所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体在以灿烂弧菌为抗原的亲和纯化试剂或以灿烂弧菌为抗原的免疫检测试剂的制备中的应用。