CN106668857A - 抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂及其制备方法。该复合制剂，按照重量份由如下组分组成：抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体5‑10份、抗大肠杆菌卵黄抗体5‑10份、抗无乳链球菌卵黄抗体5‑10份、食品级果胶1‑5份、复合维生素1‑10份、去离子水45‑65份。本发明的复合制剂特异性强、纯度高，且对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌有较强的抑制作用，同时抗体制备成本低、方便简易，适于大规模生产，可用于由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌引起的奶牛乳腺炎的预防和治疗。本发明的复合制剂为膏状制剂，可以直接将膏剂注入病牛乳池中，可以比较长期的留存于病牛乳池中，从而达到缓释治疗的作用。

Description

抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术及应用领域，尤其是涉及一种抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂及其制备方法。

背景技术

奶牛乳腺炎也被称为奶牛乳房炎，是乳腺受到物理、化学、微生物刺激后，引起奶牛乳腺发生炎性反应的一类疾病，是奶牛养殖业最常见的疾病之一，也是给养殖业带来经济损失最严重的疾病。奶牛乳腺炎带来的主要影响为：奶牛产奶量的下降，改变的牛奶成分也会影响奶产品的品质，废弃牛奶、治疗奶牛乳腺炎的高额费用以及病牛的淘汰带来的巨大经济损失。1996年，据美国奶牛乳腺炎协会(NMC)报道，全球约有35％的奶牛患有乳腺炎，患病后的奶牛产奶量下降20％左右，严重影响了奶牛业的发展。截至2014年底，我国奶牛存栏1460万头(第六届中国奶业大会暨中国奶业展览会)，其中患有各种乳腺炎的奶牛为70％。尽管对奶牛乳腺炎的防治已经有一百多年的研究，但是实际生产中主要依靠抗生素的治疗，且随着耐药性的出现降低了治疗效果，同时抗生素的残留也危及着人类的健康。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致奶牛乳腺炎的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌”的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌可引起奶牛的“临床型乳腺炎”，其中，46.67％的病牛将面临死亡，或者被淘汰，26.67％的病牛会乳区萎缩或者病乳废弃，给养殖业带来巨大损失。

我国的牛场奶样取集发现，无乳链球菌和大肠杆菌也是主要致病菌，因此对于奶牛乳腺炎的治疗，考虑用多联卵黄抗体注射膏剂，效果会更加明显。

目前对于致病菌引起的疾病的防治手段主要有以下几种：抗生素和化学类药物、中草药、灭活疫苗和抗体等。其中使用最为普遍的即是抗生素和化学类药物。但随着抗生素和化学药物的长期滥用，带来了诸多弊端：①使病原菌产生耐药性，以致抗生素的作用效果显著下降，甚至无效；②造成严重的水体污染，并引发水环境微生态失衡；③在动物体内产生药物残留，影响产品的质量安全，并间接危害人体健康。因此，亟待寻求一种既能有效控制奶牛乳腺炎，又不会带来毒副作用的新技术、新产品，以部分或完全替代现有抗生素或化学药物，实现健康养殖，也已成为当前研究的热点和难点。

卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin，IgY)由于具有特异性强、高效性、无毒无副作用及对环境无害等特点，已经成为一种有效的抗生素和化学类药物替代品。而且卵黄抗体具有低成本、高效益，生产便利及产量高等特点，被作为疾病预防和控制的有效方法而受到广泛的关注。与传统的抗生素和化学药物相比，应用卵黄抗体具有以下几个优点：(1)特异性强；(2)易获取；(3)少量抗原就可以引发有效的免疫应答；(4)无残留；(5)研发周期短，成本低，可长期保存，便于运输和应用。美国食品和药品管理局(FDA)将卵黄抗体列入“公认安全使用物质(Generally Recognized As Safe,GRAS)，把卵黄抗体看作药效营养品(Nutraceuticals)。特异性卵黄抗体通过饲喂、注射等方式，对哺乳动物起到保护预防及疾病治疗作用，还可以应用于免疫学检测和疾病诊断等领域。但是目前使用的抗体制剂多数为单一病原抗体，对于混合感染的疾病不能很好控制。另一方面，应用卵黄抗体防治疾病也有不可避免的缺点，如可能带有蛋传染性疾病的病原，限制了卵黄抗体在养禽业上的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗奶牛乳腺炎的卵黄抗体复合制剂及其制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂，按照重量份由如下组分组成：

本发明还提供制备抗奶牛乳腺炎的膏状复合制剂的方法，包括以下步骤：

(1)按照比例于容器中加入食品级果胶，再加入去离子水，搅拌均匀，加热至50℃-70℃，放置冷却；

(2)待步骤(1)的溶液冷却至40℃-50℃，按照比例依次加入抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体、抗大肠杆菌卵黄抗体、抗无乳链球菌卵黄抗体，搅拌均匀；

(3)添加复合维生素，搅拌均匀，得膏状复合制剂。

进一步地，本发明的上述技术方案中，在步骤(1)中，加入去离子水时，采用少量多次加入的方式。采用这种加入方式有利于果胶的溶解，使其更加均匀的进入制剂中，从而增加制剂的粘稠度，以保证在给药过程中，对于病灶部位起到缓释治疗的作用。

本发明中所述的抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体、抗大肠杆菌卵黄抗体和抗无乳链球菌卵黄抗体可以按照本领域常规方法将灭活菌与佐剂混合、乳化得到的佐剂疫苗对蛋鸡进行免疫，免疫方法优选强化免疫，三免后一周开始收集鸡蛋，通过水稀释法分离得到水溶性组分后，进一步分离纯化后得到卵黄抗体的冻干粉，抗体纯度85％以上。作为优选的技术方案，从免疫蛋鸡的鸡蛋中制备得到卵黄抗体的方法包括以下步骤：

(1)将鸡蛋清洗、消毒后，收集卵黄液，加入卵黄液6倍体积的去离子水稀释，调pH至5.0，-20℃冷冻过夜后，在4℃缓慢解冻，反复冻融2次后，离心，收集上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为得卵黄水溶性组分；

(2)向卵黄水溶性组分中加入硫酸铵至饱和度为60％，4℃下过夜后离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，搅拌均匀后室温过夜，室温离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，得到卵黄抗体提取液；卵黄抗体提取液用100kDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤后的卵黄抗体提取液在-70℃下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥。

本发明的有益效果：

本发明的复合制剂特异性强、纯度高，且对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌有较强的抑制作用，同时抗体制备成本低、方便简易，适于大规模生产，可用于由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌引起的奶牛乳腺炎的预防和治疗。本发明的复合制剂为膏状制剂，可以直接将膏剂注入病牛乳池中，可以比较长期的留存于病牛乳池中，从而达到缓释治疗的作用。

附图说明

图1为本发明三种致病菌特异性卵黄抗体效价图。

图2为本发明抗金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体的非还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；其中，泳道M：蛋白Maker；泳道1：卵黄抗体粗提物；泳道2：硫酸铵盐析后所得溶液；泳道3：硫酸钠盐析后所得溶液；泳道4：超滤浓缩后所得溶液；泳道5：标准IgY。

图3为本发明抗金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体的还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；其中，泳道M：蛋白Maker；泳道1：卵黄抗体粗提物；泳道2：硫酸铵盐析后所得溶液；泳道3：硫酸钠盐析后所得溶液；泳道4：超滤浓缩后所得溶液；泳道5：标准IgY。

图4为本发明抗金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体的体外抑菌效果。

图5为治疗前后奶牛乳腺外观形状的变化。

图6为治疗前后牛奶外观性状的变化。

图7为不同药物治疗临床型乳腺炎牛奶中体细胞数变化情况。

图8为不同药物治疗临床型乳腺炎牛奶中细菌计数变化。

具体实施方式

为了使本发明的目的、方案、流程和优点更加清楚明晰，结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，值得注意的是，此处具体实施例仅作为解释说明本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例所用的致病菌及其他原料：

金黄色葡萄球菌(CVCC545)(Staphylococcus aureus)：购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

大肠杆菌(CVCC1450)(Escherichia coli E.coli)：购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

无乳链球菌(CVCC1886)(Streptococcus agalactiae)：购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

复合维生素：购自大连博诺生物化学试剂公司。

实施例1抗奶牛乳腺炎主要致病菌特异性卵黄抗体的制备

以抗金黄色葡萄球菌抗体的制备为例。

(1)金黄色葡萄球菌抗原的制备

将金黄色葡萄球菌于TSA固体琼脂培养基，37℃倒置培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，在37℃，140rpm的条件下，摇床振荡培养12h后，培养至菌浓度为10⁸CFU/mL，然后离心分离得到含有金黄色葡萄球菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌PBS混合得到10⁹CFU/mL金黄色葡萄球菌的菌悬液。

(2)金黄色葡萄球菌抗原的灭活

在菌悬液中加入甲醛，使甲醛体积终浓度为0.5％，37℃摇床灭活24h后，5000g/min离心10min，除去甲醛，用无菌PBS洗涤菌体沉淀3次，调整菌液浓度，即得到灭活的金黄色葡萄球菌抗原。

(3)疫苗的制备及蛋鸡的免疫

对蛋鸡进行免疫，共免疫三次，初免(基础免疫)为：将灭活的致病菌抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合，并采用双推法乳化，乳化完全后对蛋鸡颈后皮下和左右胸肌进行3点注射免疫，其中左右胸肌各注射0.3mL，颈后皮下注射0.4mL。初免2周后依次进行二次和三次免疫，即加强免疫，具体方法为：将灭活金黄色葡萄球菌抗原与弗氏不完全佐剂混合，采用双推法完全乳化，对蛋鸡进行3点注射免疫，每次免疫间隔2周，二次免疫时左右胸肌和颈后部皮下各注射0.5mL，三次免疫时左右胸肌各0.6mL，颈后部皮下注射0.8mL；第二次加强免疫后开始收集鸡蛋，于4℃冰箱中冷藏保存。

(4)卵黄抗体的粗分离

将得到的免疫鸡蛋用0.5％新洁尔灭溶液浸泡消毒。用卵黄分离器分离蛋黄，用无菌牙签刺破卵黄膜收集卵黄液于容器内，加入卵黄液体积6倍的去离子水稀释，调节pH至5.0，放入-20摄氏度冰箱冷冻过夜后，放在4℃冰箱中缓慢解冻，反复冻融2次后取上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到卵黄抗体水溶性组分，即卵黄抗体的粗提物，选取卵黄抗体效价在1:10000以上的卵黄抗体的粗提物，进行进一步的纯化。

(5)卵黄抗体粗提物的纯化

向卵黄抗体粗提物中加入硫酸铵至饱和度为60％，充分搅拌均匀后4℃过夜。4℃，10000g/min，离心15min，弃上清，将沉淀用去离子水稀释至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，充分搅拌均匀后室温过夜。室温，10000g/min，离心15min，弃上清，将沉淀用去离子水稀释至原体积，即得到IgY提取液。用100kDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，同时进一步纯化。将超滤后的卵黄抗体液在-70℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体冻干粉。

采用相同的方法也可以得到抗大肠杆菌特异性卵黄抗体以及抗无乳链球菌特异性卵黄抗体。

实施例2卵黄抗体的效价检测

采用酶联免疫吸附法检测效价，用10⁹CFU/mL菌浓度的致病菌包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后，甩板，用洗涤液洗涤3次后，加入含有1％BSA的封闭液37℃水浴2h。水浴结束后甩板，洗涤3次，然后每孔加入含有1‰BSA的结合物稀释液稀释的致病菌卵黄抗体(或卵黄抗体粗提物)100μL，同时设置阴性对照和空白对照，37℃水浴2h。水浴结束后洗涤3次，每孔加入结合物稀释液稀释的过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体(IgG-HRP)100μL，37℃水浴1h。反应结束后洗涤5次，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色20min，显色结束后每孔加入H₂SO₄终止液50μL，用酶标仪检测OD_450/630nm。OD值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为卵黄抗体效价。抗三种致病菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、无乳链球菌(S.agalactiae)、大肠杆菌(E.coli))特异性卵黄抗体效价图如图1。图1可见，初次免疫后效价开始上升，7周后，抗金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体达到峰值，为32000；8周后，抗无乳链球菌特异性卵黄抗体达到峰值，为24000；8周后，抗大肠杆菌特异性卵黄抗体达到峰值，为32000；持续3-4周时间后开始下降，第三次加强免疫后，效价再次升至峰值，并持续两周时间，然后逐步下降。

实施例3卵黄抗体的纯度鉴定

取实施例1中步骤(4)步骤(5)中得到的产品进行卵黄抗体纯度鉴定，使用非还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图2，M：蛋白Maker；1：卵黄抗体粗提物；2：硫酸铵盐析后所得溶液；3：硫酸钠盐析后所得溶液；4：超滤浓缩后所得溶液；5：卵黄抗体冻干粉。用还原性SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图3，其中M：蛋白Maker；1：卵黄抗体粗提物；2：硫酸铵盐析后所得溶液；3：硫酸钠盐析后所得溶液；4：超滤浓缩后所得溶液；5：卵黄抗体冻干粉。图2的结果显示，IgY的分子量为180kDa，由于非还原性SDS-PAGE的上样缓冲液中无β-巯基乙醇，因此IgY分子的二硫键未被破坏，保留了其四级结构，电泳结果显示会比本身分子量高。经凝胶分析软件分析可知，纯度达到83％。图3的结果显示，IgY分子由两条重链和两条轻链组成，重链约68kDa，轻链约28kDa。还原性SDS-PAGE的上样缓冲液中含有β-巯基乙醇，可以IgY分子间的二硫键断裂，使各亚基完全分开为两条重链和两条轻链。结果显示其重链约68kDa，轻链约28kDa与文献报道一致。

实施例4体外抑菌实验

将金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤培养基中，28℃，140rpm摇床培养，待至对数期是接种于新鲜营养肉汤培养基，并调节菌浓度至10⁶CFU/mL，分装到6个三角瓶中并分别加入0.22μm过滤除菌后的1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml抗金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体、10mg/ml非特异性卵黄抗体(卵黄抗体均溶解于PBS中)、链霉素0.1mg/ml(图4中以抗生素0.1mg/ml表示)和无菌PBS(0.01mol/mL，pH 7.4)。将6个三角瓶28℃，140rpm摇床培养，每隔2小时取培养液，用稀释涂平板法计活菌数。结果证明(图4)，制备的抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体的浓度达到10mg/ml时，对金黄色葡萄球菌的生长繁殖有明显的抑制作用。

实施例5

一种抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂，按照质量百分比由如下组分组成：抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体8份、抗大肠杆菌卵黄抗体8份、抗无乳链球菌卵黄抗体8份、食品级果胶5份、复合维生素3份、去离子水50份.

利用复合制剂按照如下方法制备膏状复合制剂：

(1)按照比例加入食品级果胶，加入去离子水，搅拌均匀，加热至60℃，放置冷却；

(2)待步骤(1)的溶液冷却至40℃，按照比例依次加入抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体、抗大肠杆菌卵黄抗体、抗无乳链球菌卵黄抗体，搅拌均匀；

(3)添加复合维生素，搅拌均匀，得膏状复合制剂。

实施例6抗奶牛乳腺炎特异性卵黄抗体复合制剂治疗临床型奶牛乳腺炎的应用

将判定为临床型乳腺炎的奶牛24头随机分为空白对照组、青霉素对照组和IgY治疗组，分别将青霉素溶液(2mg/mL)、卵黄抗体复合制剂(实施例5制备得到)各10mL注入乳池中，空白对照组不作任何处理。每天早10点、晚6点挤奶后注射，连续给药6天。治疗前和治疗期间每天早晨挤奶时采集样品，取样后4℃保存，送样上机检测。

(1)乳腺外观变化

奶牛患乳腺炎后，乳腺的主要外观表现是乳头、乳腺红肿(图5B)，甚至坏死(图5C)。抗体或青霉素治疗后乳腺外观症状改善，恢复正常(图5A)。

(2)牛奶性状变化

①颜色改变

临床型乳腺炎组在治疗前牛奶的颜色为肉色(III级)甚至血红色(IV级)(图6)，治疗后得到明显改善。临床型乳腺炎组在抗体或青霉素治疗后72h牛奶颜色明显改善(p<0.05)，在144h内经抗体治疗有3个奶样恢复正常，青霉素治疗后2个奶样恢复正常(I级)。无药物治疗时牛奶颜色未得到改善(表1)。

表1临床型乳腺炎奶牛在不同治疗作用下牛奶颜色的改变

^*p<0.05，相对于0h处理组；^#p<0.05，相对于未处理组。

②凝结状况改变

临床型乳腺炎组在治疗前牛奶中有大量凝块(III级)甚至分层(IV级)。临床型乳腺炎组在抗体或青霉素治疗后48h牛奶中凝块明显减少(p<0.05)。治疗后120h各有3个奶样恢复正常，无药物治疗时牛奶凝结状况未得到改善(表2)。

表2临床型乳腺炎奶牛在不同治疗作用下牛奶凝块的改变

^*p<0.05，相对于0h处理组；^#p<0.05，相对于未处理组。

③体细胞数变化

临床型乳腺炎组，注射抗体复合制剂或青霉素24h后牛奶中SCC均明显低于未治疗组(p<0.05)，抗体对SCC的降低作用强于青霉素(p<0.05)(图7)。

(3)细菌计数变化

由图8可见，经IgY或青霉素治疗后临床型乳腺炎组的细菌计数明显降低(p<0.05)。IgY的抑菌作用强于青霉素(p<0.05)。

(4)治愈率

表3的结果显示，临床型奶牛乳腺炎患病奶牛在经青霉素和IgY治疗后，IgY治疗组治愈率为75％，与青霉素治疗组相当。

表3临床型奶牛乳腺炎的治愈率

Claims (5)

1.一种抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂，其特征在于，按照重量份由如下组分组成：

2.一种如权利要求1所述的抗奶牛乳腺炎卵黄抗体复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照比例容器中加入食品级果胶，再加入去离子水，搅拌均匀，加热至50℃-70℃，放置冷却；

(2)待步骤(1)的溶液冷却至40℃-50℃，按照比例依次加入抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体、抗大肠杆菌卵黄抗体、抗无乳链球菌卵黄抗体，搅拌均匀；

(3)添加复合维生素，搅拌均匀，得膏状复合制剂。

3.根据权利要求2所述的复合制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，加入去离子水时，采用少量多次加入的方式。

4.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述的抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体、抗大肠杆菌卵黄抗体和抗无乳链球菌卵黄抗体是将灭活的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌分别作为抗原对蛋鸡进行免疫，收集免疫后的鸡蛋，提取鸡卵黄中的水溶性组分后，进一步分离纯化后得到的。

5.根据权利要求4所述的复合制剂，其特征在于，从收集得到的免疫后的鸡蛋中制备得到卵黄抗体的方法包括以下步骤：

(1)将鸡蛋清洗、消毒后，收集卵黄液，加入卵黄液6倍体积的去离子水稀释，调pH至5.0，-20℃冷冻过夜后，在4℃缓慢解冻，反复冻融2次后，离心，收集上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为得卵黄水溶性组分；

(2)向卵黄水溶性组分中加入硫酸铵至饱和度为60％，4℃下过夜后离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，搅拌均匀后室温过夜，室温离心，将沉淀用去离子水稀释至原体积，得到卵黄抗体提取液；卵黄抗体提取液用100kDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤后的卵黄抗体提取液在-70℃下预冻2h，然后在真空度20Pa下，冷冻干燥。