CN108623679A

CN108623679A - 一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗流感产品及其应用

Info

Publication number: CN108623679A
Application number: CN201810501892.1A
Authority: CN
Inventors: 林小军
Original assignee: An Dikang Bio Tech Ltd Chengdu
Current assignee: An Dikang Bio Tech Ltd Chengdu
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明公开了一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗流感产品及其应用。包括以下步骤：四价流感疫苗H1N1、H3N2、B(Victoria)、B(Yamagata)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫蛋鸡；机械自动化分离鸡蛋获得卵黄，柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液稀释并稳定卵黄液pH值；加入干冰快速降低体系温度；连续高速低温离心，去除脂颗粒，获得卵黄抗体上清液；将卵黄抗体上清液依次通过2‑6μm和0.3‑0.8μm双层滤膜、截留分子量为300kD中空纤维超滤膜去除杂蛋白、最后通过截留分子量为100kD中空纤维超滤膜获得浓缩卵黄抗体液；添加辅料制成口、鼻腔黏膜喷雾剂。本方法具有自动化程度高、能耗低、产量大、绿色环保、可实现大规模产业化生产等优点。

Description

一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗流感产品及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是通过免疫、饲养技术获取抗体并制备成药品或保健品的生物技术，特别涉及一种快速提取卵黄抗体的方法、提取的卵黄抗体制备的抗流感产品及其应用。

背景技术

流感是一种由病毒引起急性呼吸道传染病，其特征表现为突然发烧，咳嗽，头痛，肌肉和关节疼痛，严重不适感，喉咙痛和流鼻涕等症状，主要通过接触及空气飞沫传播。目前，甲型流感病毒H1N1和H3N2亚型和乙型流感病毒B/Yamagata系和B/Victoria系为引起人类季节性流感的主要株型。目前通过接种疫苗进行预防，服用药物神经氨酸酶抑制剂和M2蛋白抑制剂进行治疗，由于现接种疫苗抗体不能识别新突变的病毒而使其效果降低，再者药物不良反应较多且易产生耐药性。

卵黄抗体(Immunoglobulin Y，IgY)是指鸟类、两栖动物以及爬行动物的主要血清抗体，与哺乳动物IgG和IgE具有共同的祖先，在功能上IgY类似于IgG，目前，鸡IgY是应用最广泛的IgY，鸡体内有IgA、IgM、IgY三种抗体，IgY占总免疫球蛋白的75％。由于卵黄膜上特异性受体的选择性透过作用，使得IgY成为唯一能透过该膜而运输至卵黄中的抗体，通过向鸡免疫特定灭活病原体，机体将会产相应特异性抗体，将其提取并制成各种制品可应用于相应疾病的预防和治疗。

IgY具有耐热、耐酸、抗离子强度的能力，自1980年起，IgY已在全球的各领域被应用，如医疗卫生、诊断试剂和生物标记物，尤其是在被动免疫方面的应用是最广泛的，目前IgY已成功应用于口腔疾病、咽喉炎、流感(H5N1)、鼻炎和鼻窦炎、非典型肺炎(SARS)、柯萨奇病毒性心肌炎、妇科感染、胃炎、艾滋病等粘膜性疾病的防治。通过向蛋鸡免疫四价流感病毒疫苗，便可从卵黄中分离出特异性IgY，用于季节性流感的防治。

IgY是一种存在于单个鸡蛋里面的免疫球蛋白，要制备高纯度、高活性的IgY，则需简化生产工艺、减少外源试剂、缩短生产时间，以获得高回收率、高活性的IgY。现阶段的IgY提取方法中，大多数适用于实验室的小量提取。如：采用手工打蛋的方式来收集卵黄，效率较低，不适合大规模使用，且易引入污染源，增加卵黄抗体受污染的风险；采用重复冷冻和解冻1-3次的方式，如果运用到生产操作，则费时费力；使用辛酸或氯仿等有机溶剂提取IgY，有机溶剂的应用使IgY的活性受到影响，且有毒、污染环境，操作不便；采用硫酸铵盐析沉淀法，存在离心收集沉淀和复溶沉淀等耗时操作；采用水稀释提取法提取IgY，虽然适用大规模的生产和保护IgY的活性，但是延长了提取时间，需将料液放置在低温环境下8h以上，才能使其温度降低至0-8℃，在实际生产中该生产工艺耗时耗能，大规模产业化生产效率低。

固体二氧化碳，俗称干冰，其温度可达-78.5℃，每单位体积具有相当于普通冰水3倍的冷却能量，在短时间内便可降低系统温度。干冰在常压下可由固态直接变为气态，而不经历液态，具有无残留性，目前已被成功应用于各行业，如：干冰清洁、干冰灭火、食品，医药冷冻运输以及制冷剂CFC的绿色替代物。

发明内容

本发明目的是提供一种高自动化、高效率、高纯度、高活性的卵黄抗体提取工艺，并将提取的特异性IgY在制备治疗或预防抗流感产品中应用，制备成口、鼻腔黏膜喷剂。

本发明通过以下技术方案实现：

卵黄抗体的提取方法，包括以下工艺方法：

卵黄抗体的提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：

蛋鸡免疫：将灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；

卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。

所述四价流感病毒疫苗是H1N1、H3N2、B(Victoria)和B(Yamagata)，浓度比为1:1:1:1d混合疫苗,细菌疫苗为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浓度比为1:1的混合疫苗。

所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浓度是0.01-0.05M，pH值＝4.5-5.5，其加入量按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10加入进行稀释。

所述干冰为加入卵黄缓冲混合液重量0.1-1％的固态干冰，然后静止1-3h，保持温度0-8℃。

本发明卵黄抗体的提取方法具体步骤如下：

蛋鸡免疫：

选用流感株型H1N1、H3N2、B(Victoria)和B(Yamagata)疫苗免疫一批蛋鸡，甲醛灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制备全菌疫苗免疫另一批蛋鸡。

卵黄抗体IgY的提取：

分别提取灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗免疫的母鸡蛋；

选用上述免疫抗原免疫的母鸡蛋，用75％乙醇喷洒鸡蛋表面进行消毒，送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集分离卵黄液并按下述步骤进行提取：

(1)溶解，按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10进行混合并充分搅匀，获得卵黄酸化液；

(2)降温，向步骤(1)的混合液中，加入其重量0.1-1％固态干冰，静止1-3h，保持温度0-8℃；

(3)去杂，连续高速低温离心，通过乙二醇冷媒系统对离心系统降温，保持离心温度0-8℃，转速14,000r/min，离心分离酸化液，去除脂颗粒，收集离心后上清液；

(4)膜过滤，将收集的上清液依次通过孔径2-6μm和孔径0.3-0.8μm的双层滤膜，收集过滤液；

(5)一级超滤，将步骤(4)得到的过滤液通过截留分子量为300kD的中空纤维超滤膜，收集透析端透析液，

(6)二级超滤，将步骤(5)得到的透析液通过截留分子量为100kD的中空纤维超滤膜进行浓缩，获得浓度为透析液15-20倍的卵黄抗体IgY浓缩液。

本发明将上述提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液应用于制备治疗和预防抗流感产品中。

本发明所述卵黄抗体制备的抗流感产品，包含上述提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液；包括四价流感病毒特异性卵黄抗体IgY、抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体IgY，上述病毒、细菌提取得到的卵黄抗体IgY按照质量比3:1进行混合，卵黄抗体IgY总浓度为1200-2000ug/mL。

上述产品是包含甜味剂、食用香精和蛋白质稳定剂的喷雾剂。

所述甜味剂是蔗糖、三氯蔗糖、甜菊糖中的一种或多种；食用香精是西瓜香精、草莓香精和薄荷香精中的一种或多种。

所述蛋白质稳定剂是甘氨酸，添加量为总重量的0.05-0.5％。

本发明得到的是超浓缩的卵黄抗体液，蛋白含量(4-7mg/mL)，可直接或进一步处理添加到食品或药品中进行使用。

与现有“卵黄抗体流感产品”不同，本发明为四价流感病毒抗体，相对市场供应的三价疫苗，本发明抗病毒类型更广，此外本发明产品中包含抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特异性IgY，可抑制流感继发的细菌性上呼吸道感染。

与现有技术“人工分离蛋清蛋黄”相比，本发明采用“机械自动化分离蛋清蛋黄”，提高了生产效率，缩短了卵黄的收集时间，减少了手工劳动量，降低了人为污染机会；

与现有技术“水稀释卵黄液”相比，本发明采用“0.01-0.05M柠檬酸-磷酸氢二钠(pH值＝5.0±0.5)”缓冲液稀释卵黄，pH值严格控制在IgY等电点(pH值＝5.7-7.6)以下，IgY可极大限度地溶于该缓冲液，并且在该缓冲液中IgY具有稳定的生物活性；

另外，与现有技术不同，本发明采取向卵黄液里加入固态干冰的方式，使得混合液温度迅速降低，溶液里的脂质等杂质快速凝结析出。本发明不需长时间放入低温环境降温，因而缩短了生产工期，提高了生产效率，降低了制冷成本；

与现有技术“硫酸铵沉淀IgY”相比，本发明采用“双层膜过滤”结合“两级超滤”的方式提取IgY，减少了外源试剂的使用和除盐步骤。本发明成功组合孔径2-6μm和孔径0.3-0.8μm的双层滤膜过滤系统，使得大分子脂颗粒杂质被拦截，IgY通过滤膜。在功能方面，该双膜系统既分离了IgY，又保护了下游的中空纤维超滤系统。进一步，IgY滤液通过两级超滤系统，让IgY被再次纯化浓缩，其中，一级超滤膜(截留分子量为300kD)拦截大分子蛋白，IgY通过滤膜；二级超滤膜(截留分子量为100kD)拦截IgY进行浓缩，让低分子量杂质通过滤膜，最后获得高纯度IgY(约180kD)。

采用本工艺制备IgY，可大大缩短生产时间，减少外源试剂的使用和除杂步骤，提高生产效率，由于整个工艺中无冷冻-解冻反复操作和有机试剂的使用，极大地保留了IgY的活性，为IgY的下游应用提供了有利保障。

本发明工艺，通过连续机械自动化分蛋，固液快速降温，连续高速离心，双层膜过滤，两级超滤工艺提取IgY，整个工艺耗时短，可实现IgY的连续化生产，适宜现阶段IgY的大规模工业化生产。

附图说明

图1是纯化IgY的SDS-PAGE电泳图；

图2是本发明IgY提取工艺流程图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。

病毒疫苗

本工艺选择病毒、细菌组合抗原免疫蛋鸡。病毒种选择WHO推荐流感病毒株H1N1、H3N2、Bv、By作为生产用毒株，经病毒培养、超滤、纯化、裂解处理后获得单型抗原，用于一批蛋鸡免疫。

全菌疫苗

菌种为大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC8099)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC6538。平板划线培养上述菌株，挑取单克隆菌落，接种于适宜液体培养中进行扩大培养，离心(5,000rpm，5min)收集菌体，灭菌生理盐水洗涤菌体沉淀3-5次(去除培养基)。离心(5,000rpm，5min)收集菌体沉淀，向其中加入重量百分比浓度为0.3-0.5％甲醛生理盐水30mL，放置于4℃，灭活24h。离心(5,000rpm，5min)收集菌体沉淀，生理盐水洗涤3-5次(去除甲醛)，向菌体沉淀中加入灭菌PBS，调节菌体浓度2×10⁹CFU/mL，于-20℃分装保存。

将上述灭活全菌疫苗，按照浓度比大肠杆菌：金黄色葡萄球菌＝1:1混合，作为另一批蛋鸡免疫用抗原。

疫苗的乳化

病毒乳化和细菌乳化分开进行，用于两批鸡的免疫。预先将H1N1、H3N2、Bv、By四型疫苗进行等浓度混合，用无菌PBS分别调节每型的血凝素含量为6μgHA/mL。用无菌PBS调节全菌疫苗总浓度为1.0×10⁹CFU/mL，再加入等体积弗氏完全佐剂(初免)或不完全弗氏佐剂(次免)混合，最后使用高剪切分散乳化均质器进行充分震荡乳化，直至水乳相不再分离，即可免疫蛋鸡(4℃保存备用)。

鸡的免疫

选择18周龄罗曼粉蛋鸡，分别于第0周、第4周、第8周、第12周进行免疫；免疫部位为鸡翅根肌和胸肌皮下各两点进行皮下注射，次免由皮下注射换为肌肉注射；免疫剂量为四型流感病毒抗原，每型3μg，免疫1ml。全菌疫苗0.5×10⁹CFU/只，免疫1ml。首免用弗氏完全佐剂，次免用弗氏不完全佐剂；第10周开始收集鸡蛋，用于IgY提取。

蛋的预处理：

选用经过抗原免疫母鸡所产的蛋1000枚，用75％的消毒乙醇喷洒在鸡蛋表面进行消毒10分钟，然后送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集卵黄得到卵黄液13.5kg；

IgY的提取：

先配制0.01M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：柠檬酸100g，磷酸氢二钠146g，调节pH值＝5.0，加水至200L。

(1)稀释，按照卵黄液：缓冲液重量比1：9，加入缓冲液121.5kg，充分搅拌混匀；

(2)降温，向混合液中加入1.2kg干冰，搅拌均匀，静置1h，保持温度0-8℃；

(3)去杂，通过乙二醇冷媒系统对离心系统进行降温，保持离心工作温度为0-8℃，设置连续高速离心机转速为14,000r/min，启动离心程序，分离酸化液，去除脂颗粒，收集离心后上清液118kg；

(4)将收集的上清液依次通过膜孔径2-6μm和孔径0.3-0.8μm的双层聚醚砜材质滤膜，收集过滤液115kg；

(5)将步骤(4)得到的过滤液通过截留分子量为300kD的中空纤维超滤膜，控制超滤系统的流动速度，收集透析端透析液115kg；

(6)将步骤(5)得到的透析液通过截留分子量为100kD的中空纤维超滤膜进行浓缩，得到浓度为透析液15-20倍的IgY浓缩液5.75kg。

IgY的分析与鉴定：

(1)浓度分析，采用Lowry法测定IgY浓缩液的浓度，结果显示：采用实施例1(6)制备得到的IgY总含量为75000mg，以每枚鸡蛋含100mg IgY计算，本工艺的得率为75％；

(2)纯度分析，先将IgY纯化液经变性上样buffer预处理后，SDS-PAGE电泳检测其纯度；IgY，由两条重链(H)和轻链(L)组成，重链(υ)由一个可变区(V)和4个恒定区(C)组成，没有铰链结构。完整分子量为180KDa(7.8S)，重链为67－70KDa，轻链为25Kda；结果显示：根据不同分离级分的蛋白条带显示，采用实施例1(6)制备得到的IgY纯度高，杂蛋白含量低，如图1所示，重链为67－70KDa，轻链为25KDa的显示较重；

(3)效价测定，采用间接ELISA法检测特异性IgY的效价，结果显示：采用实施例1(6)中制备得到的IgY(IgY浓度稀释至1mg/mL)效价≥1：512。

本发明的提取工艺缩短了生产制备时间，不需长时间冷藏降温即可进行高速离心分离脂颗粒，提纯IgY。与现有方法对比得出，本发明工艺在IgY提取量及纯度上没有变化，但是在生产时间上具有优势，本工艺极大地缩短了生产时间，提高了生产效率，如下表1，工艺比较：

抗流感IgY产品配方：加入甜味剂、食用香精、蛋白质稳定剂、柠檬酸-磷酸氢二钠水溶液而制成。

缓冲液：柠檬酸1g，磷酸氢二钠1.46g，调节pH值＝5.52，补水至1000mL。

喷雾剂：以上制备的抗流感IgY 300mg，三氯蔗糖0.005g，薄荷香精1g，甘氨酸3g，磷酸氢二钠/柠檬酸调节pH值＝5.4-5.6，加入缓冲液定容至1000mL。分装于10ml和18ml规格喷瓶制成抗流感喷雾剂。

Claims

1.一种卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：

蛋鸡免疫：将甲醛灭活的四价流感病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；

2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述四价流感病毒灭活疫苗是H1N1、H3N2、B(Victoria)和B(Yamagata)，浓度比为1:1:1:1混合疫苗，细菌疫苗为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浓度比为1:1的混合疫苗。

3.根据权利要求2所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浓度是0.01-0.05M，pH值＝4.5-5.5，其加入量按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10加入进行稀释。

4.根据权利要求3所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述干冰为加入卵黄缓冲混合液重量0.1-1％的固态干冰，然后静止1-3h，保持温度0-8℃。

5.根据权利要求4所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于具体步骤包括：

蛋鸡免疫：

选用株型H1N1、H3N2、B(Victoria)、B(Yamagata)疫苗免疫一批蛋鸡，甲醛灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制备全菌疫苗免疫另一批蛋鸡。

卵黄抗体IgY的提取：

分别提取灭活四价流感病毒疫苗、细菌疫苗免疫的母鸡蛋；

6.一种卵黄抗体在制备抗流感产品中的应用，其特征在于：所述卵黄抗体IgY是权利要求1至5任一项提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液，该卵黄抗体IgY浓缩液在制备治疗和预防流感产品中的应用。

7.一种卵黄抗体制备的抗流感产品，其特征在于；所述卵黄抗体IgY是权利要求1至5任一项提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液，产品包含四价流感病毒特异性卵黄抗体IgY、抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体IgY，按照质量比3:1进行混合，卵黄抗体IgY总浓度为1200-2000ug/mL。

8.根据权利要求7所述的卵黄抗体制备的抗流感产品，其特征在于；所述产品是包含防腐剂、甜味剂、食用香精和蛋白质稳定剂的喷雾剂。

9.根据权利要求8所述的卵黄抗体制备的抗流感产品，其特征在于；所述甜味剂是蔗糖、三氯蔗糖、甜菊糖中的一种或多种；食用香精是西瓜香精、草莓香精和薄荷香精中的一种或多种。

10.根据权利要求8所述的卵黄抗体制备的抗流感产品，其特征在于；所述蛋白质稳定剂是甘氨酸，添加量为总重量的0.05-0.5％。