CN103860477B - 鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉 - Google Patents
鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉，发明人从马尾藻中制备了马尾藻多糖可溶性粉。试验证明，本发明马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病有预防和治疗作用：在易发病的时间针对性使用，可起到预防作用；在疾病发生时使用，可达到治疗效果。用法用量：马尾藻多糖可溶性粉按100～400mg/kg体重饮水给药，1次/d，连续给药5天。本发明可作为一种防治鸡大肠杆菌病的中药制剂，具有纯天然提取、低残留、无毒副作用、防治效果良好等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药提取物技术领域，尤其涉及一种鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉。
背景技术
禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌（E.Coli）引起禽类不同类型疾病的总称，包括急性败血症、肉芽肿、囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、眼球炎、关节炎、肠炎以及肺炎等，最常见的是急性败血症和卵黄性腹膜炎。近年来，随着我国集约化养鸡业的不断发展，饲养密度增加，大肠杆菌病的发生呈上升趋势，特别是雏鸡的发病率和病死率均较高，常常因败血症而急性死亡，给养鸡业带来巨大的经济损失。因大肠杆菌的血清型很多，菌苗的免疫效果尚不理想，药物防治仍然是控制该病的主要手段。目前，临床常用抗生素和其他化学抗菌药进行治疗，但病原产生耐药性日趋严重，药物残留亦带来食品安全问题，中草药提取物多糖因其作为纯天然提取药物，低残留，低耐药，无毒副作用，防治效果良好而越来越受到人们的关注，可作为未来畜禽疾病防治的一个重点研究方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纯天然提取、低残留、低耐药、无毒副作用、防治效果良好的鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉，按以下方法制备：将马尾藻多糖用蒸馏水配成质量浓度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min；取出冷却后，2000r/min离心10min，收集上清液；按质量比1:20在离心后残渣中加入蒸馏水，继续在沸水浴中水浴20min，冷却，2000r/min离心10min，收集上清液；合并两次上清液，过滤，充分溶解后使用喷雾干燥仪进行干燥，即得马尾藻多糖可溶性粉。
马尾藻多糖采用水煎醇沉法制备。
水提醇沉法按以下操作进行：称取马尾藻粉末，加20倍蒸馏水拌匀，浸泡过夜，于60～90℃水浴加热6～9h，提取液经3000r/min离心10min，所得上清液用真空旋转蒸发仪浓缩到1/4体积，加入3倍量体积95%乙醇，沉淀过夜，3000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物真空冷冻干燥即得马尾藻多糖。
上述马尾藻多糖可溶性粉在制备防治鸡大肠杆菌病药物方面的应用。
针对鸡大肠杆菌病缺乏安全有效药物的问题，发明人从马尾藻中制备了马尾藻多糖可溶性粉。纸层析证明，其中含有吡喃多糖、木聚糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖等；红外线光谱显示马尾藻多糖主要为吡喃多糖，其多糖分子结构中存在β-2糖苷键，还存在α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。试验证明，本发明马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病有预防和治疗作用：在易发病的时间针对性使用，可起到预防作用；在疾病发生时使用，可达到治疗效果。用法用量：马尾藻多糖可溶性粉按100～400mg/kg体重饮水给药，1次/d，连续给药5天。本发明可作为一种防治鸡大肠杆菌病的中药制剂，具有纯天然提取、低残留、无毒副作用、防治效果良好等优点。
具体实施方式
实施例1
<1>制备马尾藻多糖
称取马尾藻粉末，加20倍蒸馏水拌匀，浸泡过夜，于80℃水浴加热8h，提取液经3000r/min离心10min，所得上清液用真空旋转蒸发仪浓缩到1/4体积，加入3倍量体积95%乙醇，沉淀过夜，3000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物真空冷冻干燥即得马尾藻多糖。
<2>制备马尾藻多糖可溶性粉
将步骤<1>制得的马尾藻多糖用蒸馏水配成质量浓度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min；取出冷却后，2000r/min离心10min，收集上清液；按质量比1:20在离心后残渣中加入蒸馏水，继续在沸水浴中水浴20min，冷却，2000r/min离心10min，收集上清液；合并两次上清液，过滤，充分溶解后使用喷雾干燥仪进行干燥，即得马尾藻多糖可溶性粉。
实施例2
基本同实施例1，仅步骤<1>中于70℃水浴加热9h。
实施例3
基本同实施例1，仅步骤<1>中于90℃水浴加热6h。
实施例4
基本同实施例1，仅步骤<1>中于75℃水浴加热8h。
将实施例1至4所得马尾藻多糖可溶性粉分别按100、200、300、400mg/kg体重饮水给药，1次/d，连续给药5天。结果：400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg组对人工感染鸡大肠杆菌肉鸡的保护率分别为80.0%、60%、50%；预防高、中、低三组的存活率依次为86.7%、70.0%、56.7%，与感染对照组相比，存活率和保护率均明显高于感染对照组的33.3%。雏鸡于攻毒发病后按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg体重的剂量，饮水给药，1次/d，连续5天，可使病情得到控制，并逐渐趋于缓解，48h后病鸡临床症状基本消失，食欲逐渐恢复正常，活动增加。3个剂量的治疗组对人工感染鸡大肠杆菌肉鸡的治愈率分别为86.7%、76.7%、66.7%，极显著优于感染对照组。
马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌肉鸡的防治试验
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1马尾藻多糖可溶性粉，由广西大学和广西北斗星动物保健品有限公司研制（按实施例1制备），广西北斗星动物保健品有限公司中试生产，经广西壮族自治区兽药监察所检验符合规定。主要成分：马尾藻多糖。批号：2011011601。规格：100g/包。
1.1.2氧氟沙星可溶性粉，由河北新世纪药业有限公司生产，批准文号：兽药字（2007）030292633；生产日期：2012年2月13日（有效期2年），批号：12021301，规格：100g，含氧氟沙星5g/瓶。
1.1.3菌株及标准血清
鸡大肠杆菌O2株(CVCC251)与大肠杆菌“O”抗原定型血清，购自中国兽药监察所。
1.1.4其它试剂
细菌微量生化反应管，购自杭州微生物试剂有限公司。普通琼脂、麦康凯琼脂、营养肉汤培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。鲜血琼脂平板，购自兰州麦迪生物科技公司。
1.1.5试验鸡种
未经鸡大肠杆菌疫苗免疫的1日龄健康岭南黄雏鸡300羽，雌雄兼有，由兰州华陇农牧生态科技有限公司提供。在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所大洼山动物实验场饲养观察12d，确认鸡群无任何大肠杆菌病症状和其它病症后用于试验。
1.1.6饲料及饲养管理
饲料为不含任何抗生素的肉用仔鸡全价可溶性粉料，购自兰州正大有限公司。实验鸡按常规饲养，自由采食、饮水，鸡舍保持通风。
1.2方法
1.2.1大肠杆菌O2株复壮
将冻存的大肠杆菌O2开启后接种于营养肉汤，经37℃培养20h后，取3只健康雏鸡，胸肌注射肉汤培养物1.0ml/只。无菌采集临床症状和病理变化典型的死亡鸡只的肝脏和心脏血，分别接种于普通琼脂、麦康凯琼脂和伊红-美兰琼脂上，经37℃培养20h后，观察培养的细菌菌落形态，对具有特征性的单个菌落进行革兰氏染色、镜检，最后将分离纯化的大肠杆菌接种于血斜面，37℃培养20h后作为母菌种，4℃冰箱保存备用。
1.2.2生化鉴定
将具有特征性形态和革兰氏染色阴性的菌落接种于营养肉汤，进行12项生化指标的鉴定。
1.2.3凝集试验
按照中国兽医药品监察所大肠杆菌O抗原定型血清使用说明书制备抗原和稀释血清进行凝集试验操作，明显凝集者记为阳性反应，以菌液与0.5石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。将鉴定正确的大肠杆菌O2株接种于血斜面，37℃培养20h后，置4℃冰箱保存备用。
1.3鸡大肠杆菌感染模型的建立
1.3.1预攻毒
调取斜面保存的大肠杆菌O2株，接种于营养肉汤，37℃培养20h，菌液浓度调整为5×108cfu/ml、1×108cfu/ml、0.2×108cfu/ml和0.04×108cfu/ml4个攻毒剂量组，每组10只雏鸡，胸肌注射攻毒菌液1.0ml。攻毒6h后，雏鸡开始出现精神不振、缩颈扎堆症状，12h开始有鸡只死亡，具体如下：5×108cfu/ml剂量组（12h死亡3只，24h全部死亡）、1×108cfu/ml（12h死亡2只，24h全部死亡）、0.2×108cfu/ml（12h死亡1只，24h死亡5只，存活4只，72h全部死亡），0.04×108cfu/ml（24h死亡2只，存活8只，其中濒死2只；48h存活8只，其中濒死5只；72h死亡3只，存活5只，其中濒死2只）。
1.3.2最佳攻菌量确定
将0.2×108cfu/ml至0.04×108cfu/ml之间的菌液浓度调整为5个浓度组，分别为15×106cfu/ml、12.5×106cfu/ml、10×106cfu/ml、7.5×106cfu/ml、5×106cfu/ml，每组10只雏鸡，胸肌注射攻毒菌液1.0ml。攻毒12h后，雏鸡开始出现精神不振、缩颈扎堆症状，100%发病，根据每组肉鸡发病和死亡情况确定最佳感染量，以0～72h内死亡率60-70%为最佳感染量，并将其作为判定标准。其次，结合生产实际中鸡大肠杆菌的死亡率，最终选择5.2×106cfu/ml作为建立鸡大肠杆菌感染模型的攻毒剂量。
1.4正式试验分组及方法
试验鸡除正常接种疫苗（大肠杆菌病疫苗除外），未用任何药物。在试验鸡舍饲养至7日龄，期间剔除弱雏，选择300羽健康供试鸡随机分为10组，每组30只，分组及处理方法见表1。
表1试验动物分组及处理方法
观察给药后、攻毒后的临床变化，每天记录各组鸡的临床症状和死亡率，对死亡鸡只进行尸体剖检，取病料进行病原分离培养和鉴定，并记录各组鸡的死亡率、治愈率和增重情况。
1.5临床判定标准
1.5.1感染发病
健康对照组鸡只精神活泼、饮食正常，而雏鸡接种大肠杆菌后，先后出现精神不振、被毛逆立、腿翅瘫软、蹲伏扎堆、食欲下降、眼睛浮肿等症状，部分鸡只拉黄绿色水样稀便。无菌采集心血或肝脏，分离到与攻毒菌株具有相同血清型的大肠杆菌，则判定为感染发病。
发病率（%）=组内发病数（只）/该组试验鸡数（只）×100%
保护率（%）=（感染对照组发病率—该给药组发病率）/感染对照组发病率×100%
1.5.2感染死亡
试验期间，鸡在接种大肠杆菌后突然死亡或出现明显大肠杆菌病临床症状后死亡，剖检可见多数内脏器官具有大肠杆菌病的典型病变，并从肝脏、心血分离出与接种菌相同血清型的大肠杆菌，则判定为感染死亡。
病死率=死亡数/感染发病数×100%
1.5.3治愈
发病鸡经药物治疗，鸡只精神状态、饮食、粪便恢复正常，其它临床症状消失，抽查剖检内脏器官正常，从肝脏、心血未分离到与接种菌相同血清型的大肠杆菌，则判定为治愈。
治愈率（%）=组内治愈数（只）/该组试验鸡发病数（只）×100%
存活率=存活数（只）/该组试验鸡总数（只）×100%
1.5.4增重
鸡只8日龄开始至试验结束，每天称量各组鸡体重，观察试验鸡体重变化情况。
增重率（%）=组内最终平均体重—初始平均体重/初始平均体重×100%
相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，以健康对照组增重为100%，各组增重与之相比得各组相对增重率。
1.6统计分析
试验数据以SPSS12.0软件进行统计处理，体重以均数±标准差（SD）表示，除体重用t检验进行显著性检验外，其它均为χ2检验；P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2.结果
2.1感染发病情况
感染后8～20h，各组鸡特别是感染对照组病鸡出现精神极度沉郁，羽毛松乱，缩颈闭眼，不愿走动，离群呆立或扎堆卧下，有些病鸡出现轻度腹泻并有陆续死亡等现象。24h后除空白对照组各组鸡大部分摄食量减少，很少饮水，有的鸡站立不稳，腿翅无力，瘫软卧地或昏睡，拉黄白稀粪，肛门及其周围羽毛粘附粪污。在35～48h出现死亡高峰，病死鸡死亡数增加，以后每天有零星死亡，10d后症状消失且停止死亡。各组鸡发病和死亡情况见表3、表4。
2.2病理变化
对急性死亡鸡（12～48h）剖检可见腹腔积液，肝脏有少量白色纤膜，十二指肠、小肠少量出血，脾脏肿大。对慢性死亡鸡（48～80h）剖检出现典型的心包炎、肝周炎、气囊炎及关节炎病变。可见心包膜有纤维素性伪膜，心包膜增厚，心脏肿大，心肌出现坏死灶，心包液增多且混浊；肝脏肿大，被膜增厚，表明覆盖灰黄色纤维素性渗出物，部分鸡被膜下散在大小不等的出血点和坏死灶；脾脏肿大；肾脏肿大充血；十二指肠、空肠、回肠肠壁严重充血，肠内容物呈水样、黄绿色，粘膜出血、脱落，肠系膜充血、出血，部分鸡有腹水；气囊壁混浊，不均匀增厚，被覆干酪样渗出物；腺胃、肌胃内容物有酸臭气味，肌胃角质层有斑点状出血。
2.3细菌分离、鉴定
2.3.1对死亡鸡只取肝脏、脾脏病料，进行肉汤培养20h，管液均匀混浊，管底有黏性沉淀。
2.3.2鲜血琼脂平板培养，形成圆形凸起、光滑湿润、灰白色菌落，直径1.5-2.5mm。
2.3.3麦康凯琼脂培养，形成粉红色隆起、边缘整齐、光滑、圆形、中等大小的菌落。
2.3.4纯培养物涂片镜检
典型菌落经革兰氏染色，镜检可见两端钝圆、散在或成对的革兰氏阴性小杆菌。
2.3.5生化鉴定
对病料中分离出的、镜检无杂菌且革兰氏染色阴性的细菌，进行12项生化指标的鉴定。生化鉴定结果如下：
表2大肠杆菌生化反应结果
2.3.6血清型鉴定：
大肠杆菌O2单因子血清玻片凝集反应，呈阳性。说明死亡鸡是由大肠杆菌O2感染所致。
2.4马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病的预防作用
由表3可以看出，试验结束时感染对照组病死率为66.7%，说明此次人工诱发大肠杆菌病的模型是成功的。提前5d按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg体重的剂量，饮水给药，1次/d，连续5天，对人工感染鸡大肠杆菌肉鸡的保护率分别为80.0%、60%、50%；预防高、中、低三组的存活率依次为86.7%、70.0%、56.7%，与感染对照组相比，发病率、存活率及保护率均有极显著差异（P＜0.01），存活率和保护率均明显高于感染对照组的33.3%。高剂量组未见不良反应，说明400mg/kg剂量浓度的马尾藻多糖可溶性粉鸡对大肠杆菌病有明显的预防效果，且达到与氧氟沙星预防组相近的效果。结果见表3。
表3马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病的预防作用
2.5马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病的治疗作用
由表4可知，雏鸡于攻毒发病后按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg体重的剂量，饮水给药，1次/d，连续5天，可使病情得到控制，并逐渐趋于缓解，48h后病鸡临床症状基本消失，食欲逐渐恢复正常，活动增加。3个剂量的治疗组对人工感染鸡大肠杆菌肉鸡的治愈率分别为86.7%、76.7%、66.7%，极显著优于感染对照组（P＜0.01），其中高剂量治疗组（400mg/kg）的治疗效果接近氧氟沙星治疗组。
推荐马尾藻多糖可溶性粉用于预防和治疗鸡大肠杆菌病的剂量为每公斤体重0.4g，饮水给药，每日1次，连用5天。根据鸡每天的实际饮水量推算，鸡混饮剂量为每1L饮水加马尾藻多糖可溶性粉3.5g。按400mg/kg体重的剂量，饮水给药，1次/d，连续5天，未见不良反应，表明这个剂量在临床上也是安全的。
表4马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病的治疗作用
2.6马尾藻多糖可溶性粉对试验鸡增重的影响
表5马尾藻多糖可溶性粉对试验鸡增重的影响
各组鸡在12日龄时平均体重差异不显著（P＞0.05）；各组鸡于17日龄停药后，感染对照组体重增长率显著低于其他各组（P＜0.05）；预防高、中、低剂量组相对增重率显著高于感染对照组，与氧氟沙星及健康对照组相比则差异不显著；治疗高、中、低剂量组相对增重率显著高于感染对照组，与氧氟沙星及健康对照组相比，治疗高剂量组则差异不显著，治疗中、低剂量组差异显著。
治疗高、中、低剂量组体重均低于预防高、中、低剂量组；从体重变化、增重程度上证实中药提取物马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病的预防效果优于治疗效果。
3.讨论
3.1人工感染造模
根据试验结果，对12日龄岭南黄雏鸡胸肌注射O2型经靶动物复壮的大肠杆菌，并选择5.2×106cfu/ml作为建立鸡大肠杆菌感染模型的最佳攻毒剂量，成功造就鸡大肠杆菌人工感染模型，发病率100%，致死率达66.7%。
感染后8～20h，各组鸡特别是感染对照组病鸡出现精神极度沉郁，羽毛松乱，缩颈闭眼，不愿走动，离群呆立或扎堆卧下，有些病鸡出现轻度腹泻并有陆续死亡等现象。24h后除空白对照组各组鸡大部分摄食量减少，很少饮水，有的鸡站立不稳，腿翅无力，瘫软卧地或昏睡，拉黄白稀粪，肛门及其周围羽毛粘附粪污。在35～48h出现死亡高峰，病死鸡死亡数增加，以后每天有零星死亡，10d后症状消失且停止死亡。
死亡鸡剖检后的病理变化符合大肠杆菌病的特征，可从濒死鸡内脏分离到典型的大肠杆菌，且O2单因子血清凝集反应呈阳性。证实本次人工感染鸡致病性大肠杆菌造模成功。
3.2马尾藻多糖可溶性粉的预防作用
攻毒前5d按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg体重的剂量饮水给药，1次/d，再以大肠杆菌O2株攻菌，预防组鸡只发病症状较轻微，保护率分别为90.0%、80%、60%。与感染对照组相比，发病率、存活率及保护率均有极显著差异（P＜0.01），存活率和保护率均明显高于感染对照组的33.3%，且高剂量组未见不良反应，说明400mg/kg剂量浓度的马尾藻多糖可溶性粉可用于鸡大肠杆菌病的预防。
3.3马尾藻多糖可溶性粉的治疗作用
人工感染发病后按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg体重的剂量，饮水给药，1次/d，连续5天，对人工感染鸡大肠杆菌肉鸡的治愈率分别为86.7%、76.7%、66.7%；其中400mg/kg剂量组的疗效接近氧氟沙星治疗组，极显著优于感染对照组（P＜0.01），可使病情得到控制，并逐渐趋于缓解，48h后病鸡临床症状基本消失，食欲逐渐恢复正常，活动增加，表明该剂量马尾藻多糖可溶性粉对鸡大肠杆菌病具有较好的治疗作用。
3.4马尾藻多糖可溶性粉对试验鸡的增重影响
试验鸡感染大肠杆菌后，生长发育受到严重影响，感染对照组的增重率为25.71%，极显著低于其他各组（P＜0.01）。饮水服用马尾藻多糖可溶性粉可在一定程度上抵抗大肠杆菌对鸡只生长发育的影响，其中预防高、中、低剂量组增重高于治疗高、中、低剂量组；健康对照组与氧氟沙星预防组和治疗组、预防高剂量组之间差异不显著（P＞0.05）。从体重变化、增重程度上证实中药提取物马尾藻多糖可溶性粉对人工感染鸡大肠杆菌病的预防和治疗作用。
4.结论
本发明的马尾藻多糖可溶性粉，可以作为一种防治鸡大肠杆菌病的中药制剂，具有低残留，低耐药，无毒副作用，防治效果良好等优点。
Claims (4)
1.一种鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉，其特征在于按以下方法制备：将马尾藻多糖用蒸馏水配成质量浓度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min；取出冷却后，2000r/min离心10min，收集上清液；按质量比1:20在离心后残渣中加入蒸馏水，继续在沸水浴中水浴20min，冷却，2000r/min离心10min，收集上清液；合并两次上清液，过滤，充分溶解后使用喷雾干燥仪进行干燥，即得马尾藻多糖可溶性粉。
2.根据权利要求1所述鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉，其特征在于：所述马尾藻多糖采用水煎醇沉法制备。
3.根据权利要求2所述鸡用防治大肠杆菌病的马尾藻多糖可溶性粉，其特征在于所述水提醇沉法按以下操作进行：称取马尾藻粉末，加20倍蒸馏水拌匀，浸泡过夜，于60～90℃水浴加热6～9h，提取液经3000r/min离心10min，所得上清液用真空旋转蒸发仪浓缩到1/4体积，加入3倍量体积95%乙醇，沉淀过夜，3000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物真空冷冻干燥即得马尾藻多糖。
4.权利要求1所述马尾藻多糖可溶性粉在制备防治鸡大肠杆菌病药物方面的应用。
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