CN115252668B - 千里光水提取物作为唯一活性成分在制备防治鸡败血型大肠杆菌病口服药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了千里光水提取物作为唯一活性成分在制备防治鸡败血型大肠杆菌病口服药物中的应用，属于兽药领域，由于药物的药代动力学性质，具有体外抗菌效果的药物，并不一定能在体内起到作用，本发明经过筛选多种具有抗菌药材，发现千里光在内服防治鸡败血型大肠杆菌中有突出的优势，可以相对明显的降低败血型大肠杆菌病的鸡只死亡率，降低心包炎的比率，相对明显的提高养殖效益，且安全、有效。

Description

千里光水提取物作为唯一活性成分在制备防治鸡败血型大肠 杆菌病口服药物中的应用
技术领域
本发明涉及兽药技术领域，具体涉及千里光水提取物作为唯一活性成分在制备防治鸡败血型大肠杆菌病口服药物中的应用。
背景技术
鸡大肠杆菌病(Chicken Colibacillosis)是由某些血清型的鸡致病性大肠埃希氏菌(Avian pathogenic Escherichia coli)所引起的局部或全身性的传染病。临床表现为多种症型，较常见的有大肠杆菌性败血症、肉芽肿、心包炎、肝周炎、气囊炎、肠炎、脐炎、全眼球炎、卵黄性腹膜炎等。根据报道，在鸡生长发育的各日龄段，鸡大肠杆菌病是一种主要发生的疾病，该疾病引起感染鸡只的死亡以及生产性能的下降是导致世界养鸡业经济损失的主要原因。传染性法氏囊病、支原体病、球虫病、新城疫和传染性支气管炎，以及营养缺乏等疾病和因素都能导致该病的发生。除此之外，鸡蛋的粪便污染有可能使大肠杆菌通过鸡蛋壳进入到壳内，在孵化期间迅速传播蔓延，引起鸡胚的高死亡率或者是卵黄囊的感染。本病常见有心包炎，且是大肠杆菌型败血症的特征。在肉眼病变出现之前，常伴有心肌炎并导致心电图有明显的变化。心包囊澤浊，心外膜水肿，并覆有一层浅色渗出物。最典型的病变是心包囊内充满纤维素性滲出物。打开心包，发现心外膜上有渗出物松散黏附。随着病程进展，渗出增多，变得松软(嗜异性纤维蛋白)并有干酪样物质。慢性病程中，心包膜会黏附于心外膜。近年来，有不少文献报道，和引起人类败血症、脑炎的大肠杆菌有着不少相同的毒力基因。因此，也可能导致人类的疾病，是一种潜在的人畜共患病，具有重要的流行病学和公共卫生意义。
鸡大肠杆菌病严重危害我国的禽养殖业，而且伴随着西药抗生素的普遍应用，一些问题也凸显出来，细菌的耐药株的出现，抗生素疗效下降；动物产品抗生素残留超标等直接或间接危害着人类健康。这促使我们去寻找绿色、无公害的药品来保护动物的健康，而中草药具有安全性高、耐药性少及药物残留水平低等优点，在治疗细菌传染性疾病中发挥了积极的作用。因此，为了寻找更加安全、有效的防治鸡大肠杆菌病的中药方剂是临床养殖中的迫切需求之一。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供千里光水提取物作为唯一活性成分在制备防治鸡败血型大肠杆菌病口服药物中的应用。
由于药物的药代动力学性质，具有体外抗菌效果的药物，并不一定能在体内起到作用，本发明经过筛选多种具有抗菌药材，发现千里光在内服防治鸡败血型大肠杆菌中有突出的优势，可以相对明显的降低败血型大肠杆菌病的鸡只死亡率，降低心包炎的比率，相对明显的提高养殖效益，且安全、有效。
解决方案
为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供了千里光作为唯一活性成分在制备预防或防治鸡败血型大肠杆菌病药物中的应用。
败血型大肠杆菌病的典型特征是细菌入血，和一般的肠道炎症不一样，鸡败血型大肠杆菌病的典型临床症状是心包炎、肝周炎，临床一般说“包心包肝”，即纤维性渗出包住了心脏和肝脏。败血型大肠杆菌病对鸡能产生致命伤害，需要及时治疗。
但由于药物的药代动力学性质，具有体外抗菌效果的药物，并不一定能在体内起到作用，本发明经过筛选多种具有抗菌药材，发现千里光在内服防治鸡败血型大肠杆菌中有突出的优势，可以相对明显的降低败血型大肠杆菌病的鸡只死亡率，降低心包炎的比率，相对明显的提高养殖效益，且安全、有效。
进一步地，所述药物为口服药物。
进一步地，所述药物的剂型为注射剂、粉剂、胶囊剂、片剂、口服液中的任意一种，可选地为口服液。
进一步地，所述药物以千里光提取物为唯一活性成分。
进一步地，所述千里光提取物为千里光提取液。
进一步地，千里光提取液为千里光经过煎煮、浓缩而得。
进一步地，所述千里光提取物的制备方法为：每1000g千里光中加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
有益效果
由于药物的药代动力学性质，具有体外抗菌效果的药物，并不一定能在体内起到作用，本发明从千里光、茵陈、苍术、秦艽、紫草、野菊花、乌梅、赤芍等一系列对大肠杆菌具有抑制作用的中药材中进行筛选，发现仅千里光在内服防治鸡败血型大肠杆菌中有突出的优势。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1本发明测试例3中试验组的病鸡照片；
图2本发明测试例3中试验组的患有鸡败血型大肠杆菌病的病鸡和健康鸡的解剖照片，其中A～D中显示的病鸡的心包炎或肝周炎图片，E为健康鸡的心肝照片；
图3为本发明测试例3中实验室诊断结果，其中，A为显色培养基，B为伊红美蓝培养基，C为SS培养基，D、E是革兰氏染色的显微镜图片。
图4本发明测试例3中患有鸡败血型大肠杆菌病的病鸡进行药物治疗后的鸡群死淘变化曲线；
图5本发明测试例3中患有鸡败血型大肠杆菌病的病鸡进行药物治疗后的鸡群采食量曲线；
图6本发明测试例3中患有鸡败血型大肠杆菌病的病鸡进行药物治疗后的鸡群照片；其中，A为试验组(内服千里光口服液)，B为对照组(内服抗生素氟苯尼考)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
秤取千里光1000g，粉碎，过80目筛。
实施例2
秤取千里光1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例3
秤取茵陈1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例4
秤取苍术1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例5
秤取秦艽1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例6
秤取紫草1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例7
秤取野菊花1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例8
秤取乌梅1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
实施例9
秤取赤芍1000g，加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
测试例1
本发明对实施例2-9的提取液在体外抑制鸡败血型大肠杆菌的效果。
1.1试验材料
大肠杆菌标准菌株：O78株，编号：GDMCC 1.739，购自广东省微生物菌种保藏中心。
MTT(噻唑蓝)，双倍普通肉汤培养基，1.5mL离心管，96孔细胞培养板，酶标仪，离心机。
1.2培养基配置
将实施例2～9的提取药液，生理盐水，双倍普通肉汤培养基按表1的混合方法分别制备分别含50％、25％、12.5％、6.25％、3.12％浓度实施例2～9的提取药液的细菌培养基：
表1不同浓度的药液配制方法
浓度 提取药液 生理盐水 双倍普通肉汤培养基
含50％提取药液的培养基 16mL 0 16mL
含25％提取药液的培养基 8mL 8mL 16mL
含12.5％提取药液的培养基 4mL 12mL 16mL
含6.25％提取药液的培养基 2mL 14mL 16mL
含3.12％提取药液的培养基 1mL 15mL 16mL
1.3MTT的配制
取MTT(噻唑蓝)0.5g，加入到100mL的生理盐水中，0.22μm滤膜过滤。分装成5mL的小包装，保存于-20℃冰箱中，待用。
1.4菌悬液的制备
取1支灭菌的20ml试管，加入10ml细菌培养基，接种100μL大肠杆菌O78株，于37℃培养24小时，取出，作为试验用菌悬液，备用。
1.5MTT法抗菌实验步骤：
1)取1.5mL离心管，加入含有不同浓度的实施例2-9的提取药液的培养基，分别为50％，25％，12.5％，6.25％，3.12％(配制方法如1.2所示)；吸取20μL菌悬液，加入混合液中；另取不加提取药液的培养液(将1.2中的双倍普通肉汤培养基加入生理盐水稀释2倍)，加入20μL菌悬液作为阳性对照。37℃培养16-18小时。
2)离心培养液(8000r/min)，弃去上清。
3)加入1mL灭菌生理盐水，加入100μL的MTT溶液，充分混匀(用手指用力弹开沉淀)，37℃反应4小时。
4)离心，弃去上清，加入1mL二甲基亚枫(DMSO)，振荡使沉淀充分溶解(用手指用力弹开沉淀)。
5)吸取200μL至96孔板，492nm观察OD值。
1.6根据1.5的方法进行的实验结果如表2：
表2MTT法检测不同实施例的抑菌效果OD值
注：“＊”代表和阳性对照有显著性差异，代表有明显抗菌效果。
由表2可见，实施例2-9均有不同程度的体外抗大肠杆菌效果，在浓度12.5％时，实施例2～4、6、8、9均有显著的体外抑菌效果。各实施例中尤其是实施例8的乌梅的体外抑菌效果优于实施例2的千里光的体外抑菌效果。
测试例2
本发明通过实验性临床效果验证试验说明实施例2-9的防治鸡败血型大肠杆菌病效果。
2.1试验材料
试验用药：实施例2-9；阳性药物为恩诺沙星溶液。
大肠杆菌标准菌株：O78株，编号：GDMCC 1.739，购自广东省微生物菌种保藏中心。
试验鸡只：AA肉鸡，1日龄购进。
饲料及饲养：试验鸡均饲养在标准鸡舍，自由采食与饮水。饲喂无抗生素添加的全价饲料。
2.2半数致死量的测定结果
大肠杆菌的培养：试验前5天从-80℃取出冻存的标准菌株O78复苏、培养16h，并细菌计数。细菌计数的结果为47.5亿/mL
半数致死量的测定结果：鸡只饲养至9日龄时随机抽取50只鸡，分为5组，每组10只，分别注射0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL上述的大肠杆菌菌液，测定药物的半数致死量，测试结果如表3。
表3半数致死量的测定结果
分组 鸡只数 死亡数 死亡率
0.9mL 10 10 100％
0.8mL 10 9 90％
0.7mL 10 7 70％
0.6mL 10 6 60％
0.5mL 10 3 30％
参考LD50(％)计算结果，最终确定使用0.6mL攻毒剂量开展正式试验攻毒。
2.3内服防治试验：将12日龄的实验鸡只随机分12个组，每组30只鸡。采用胸肌注射菌液的方式攻毒，注射剂量0.6mL。试验动物分组的内服药物情况见表4，内服防治后的试验效果见表5。
表4试验动物分组及处理
表5内服药物或清水后的试验结果
从表5可以看出，在体外抑菌试验中效果显著的实施例8的乌梅在内服防治实验中的效果并不显著，说明具有良好体外抗菌效果的药物不一定具有良好的内服治疗效果。而超出发明人意料的是，实施例2的死亡率和心包炎比例均有明显降低，相对其它7个具有体外抗大肠杆菌药材，具有更为突出的体内抗败血型大肠杆菌病的作用，且治疗效果趋近恩诺沙星组，说明千里光作为唯一活性成分的制剂对抗败血型大肠杆菌病具有明显的防治效果。
测试例3
下面通过大区临床效果实验验证实施例2的防治鸡败血型大肠杆菌病的效果。
3.1试验背景
本试验场为笼养肉鸡养殖小区，每栋养殖30000羽左右，共计五栋。鸡群在20日龄开始出现呼吸道症状和打蔫鸡只。试验组为第1栋鸡舍，当前剩余28000只左右；选择同一雏源、同一日龄的第2栋同期发病鸡舍作为对照组，当前剩余28200只左右。
3.2临床症状
大群采食略有减少，大群中可见明显打蔫鸡只，病鸡体温升高，羽毛松乱，缩颈闭目；粪便以黄白绿色稀便为主。(临床照片见图1)
3.3剖检症状
剖检病死鸡，可见病死鸡鸡爪灰白色，眼睑出血，严重的包心、包肝，气囊炎，腹膜炎，胸腔壁可见出血，肠道可见卡他性炎症。(剖检照片见图2)
3.4初步诊断
结合临床症状和剖检症状，初步诊断为败血型大肠杆菌病。
3.5实验室诊断
现场采集病料，通过实验室病原检测和细菌鉴别培养结果如表6和图3，无论是在显色培养基、伊红美蓝培养基、SS培养基中培养结果均显示为大肠杆菌，最终确诊为：败血型大肠杆菌病。
表6细菌鉴别培养结果
编号 显色培养基 伊红美蓝 SS 革兰氏染色 结果
1号 蓝色 金属光泽 玫红 G-杆菌 大肠杆菌
2号 蓝色 金属光泽 玫红 G-杆菌 大肠杆菌
注：显色培养基：大肠杆菌菌落为蓝色，沙门氏菌为红色，其它均无色。伊红美蓝培养基：大肠杆菌有典型金属光泽；SS培养基：沙门氏菌菌落中心呈黑色。
3.6用药方案：
根据初步诊断结果，22日龄试验组和对照组开始给药控制大肠杆菌病，给药方法如表7。
表7实验用药方案
3.7试验结果：
从20日龄发现症状，22日龄按照上述3.6的给药方案进行治疗5天，鸡群死淘变化和恢复情况的结果如表8和图4～6所示。
表8鸡群死淘变化和恢复情况
试验结果表明，在22日龄开始治疗后，试验组1栋的临床用药效果在控制鸡群死淘和提升鸡群采食量方面均和对照组2栋接近；说明千里光能防治具有耐药性的败血型大肠杆菌病，具有和抗生素一样的效果，而且千里光试验组相对抗生素治疗对照组的死淘数更低(发明人猜测可能是病菌耐药性导致的抗生素的治疗效果低于千里光)，说明以千里光作为唯一活性成分的中药制剂中对耐药性的败血型大肠杆菌病具有显著的治疗效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.千里光水提取物作为唯一活性成分在制备防治鸡败血型大肠杆菌病口服药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述千里光水提取物为千里光经过煎煮、浓缩而得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述千里光水提取物的制备方法为：每1000g千里光中加10倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩至1L。
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