CN104147165A - 一种防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法，属于动物用中药领域。本发明的目的是提供一种现代中兽药新制剂，用于预防和治疗猪、鸡、牛、羊、马、犬、兔大肠杆菌病的防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法。本发明组方为：地锦草、黄连、白头翁。本发明以中兽医药学理论为指导，主要是针对家禽、家畜的大肠杆菌病因而组方，以减少或替代抗生素和其它化学抗菌药，解决大肠杆菌耐药性日趋严重与肉、蛋、奶等动物产品中药物残留超标影响食品安全等问题，更加安全、有效且质量可控的中药制剂用于动物大肠杆菌病的防治，对于促进动物养殖业发展，防控人畜共患病和维护食品安全均具有重大的现实意义。

Description

一种防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法

技术领域

本发明属于动物用中药领域。

背景技术

致病性大肠杆菌可引起多种动物和人感染发病，如猪的黄痢、白痢、水肿病，鸡的急性败血症、气囊炎、心包炎和肝周炎，牛、羊、马、犬、兔急性胃肠炎等，发病率和致死率均较高，给动物养殖业和人类健康带来严重威胁。当前对动物大肠杆菌病的防治还存在许多亟待解决的重大问题：一是致病性大肠杆菌血清型众多，迄今还没有研制出理想的菌苗来用于防控；二是动物饲养场综合防治措施不够完善，饲养管理水平还不够高，为大肠杆菌病的发生和传播提供了外部条件；三是由于抗生素和化学抗菌药物的大量使用，大肠杆菌产生了广泛的耐药性，使治疗效果不断下降，临床又不得不加大剂量并延长给药时间，大幅度提高了治疗难度与成本；四是抗生素和化学药物在动物体内及其产品中形成有害药物残留而危害食品安全。在现有文献资料中不乏采用中药防治动物大肠杆菌病的报道，但大多源于经验之谈，没有经过系统的药学研究去确认其药效与毒理，没有从现代药理学和传染病学角度去证明其安全性和有效性，且药物剂型在现代集约化饲养场不便使用。

中国专利201310406071.7（一种猪用止泻中药及制备方法），其方剂是由柴胡、白头翁、地锦草、黄连、甘草构成， 1、柴胡为解表药，能“发表和里，升举阳气，舒肝解郁（《中国兽药典》），主治感冒发热与寒热往来”，《伤寒论》的小柴胡汤（以柴胡为君药）是用来治疗半表半里证的；而猪的腹泻属于里证，用不好可能加重病情。

2、柴胡品种较多，临床容易混杂使用。例如药典就有柴胡Bupleurum chinense DC.和狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 两个种，大叶柴胡Bupleurum longiradiatum Turcz.是有毒的（《中国兽药典》）。日本人就因为用小柴胡汤不对症而引发了严重的毒性事件。

发明内容

本发明的目的是提供一种现代中兽药新制剂，用于预防和治疗猪、鸡、牛、羊、马、犬、兔大肠杆菌病的防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法。

本发明制成有效成分的重量份为：地锦草 40-80、黄连 20-40、白头翁 20-40。

本发明的制备方法是：将地锦草、白头翁和黄连3味，加10倍量50%乙醇浸润30min后，回流提取3次，每次90min ，滤过，收集醇提液，回收乙醇，继续浓缩至稠膏状，50～60℃干燥，制成细粉，加辅料，充分混匀，用70%乙醇制粒，60～80℃烘干，整粒，制成1000g，即得；其中辅料为：糊精：乳糖：蔗糖 =1:1:1。

本发明以中兽医药学理论为指导，主要是针对家禽、家畜的大肠杆菌病因而组方，以减少或替代抗生素和其它化学抗菌药，解决大肠杆菌耐药性日趋严重与肉、蛋、奶等动物产品中药物残留超标影响食品安全等问题，更加安全、有效且质量可控的中药制剂用于动物大肠杆菌病的防治，对于促进动物养殖业发展，防控人畜共患病和维护食品安全均具有重大的现实意义。

附图说明

图1是本发明制备工艺流程图；

图2是本发明抑菌试验效果图。

具体实施方式

本发明制成有效成分的重量份为：地锦草 40-80、黄连 20-40、白头翁 20-40。

本发明的制备方法是：将地锦草、白头翁和黄连3味，加10倍量50%乙醇浸润30min后，回流提取3次，每次90min ，滤过，收集醇提液，回收乙醇，继续浓缩至稠膏状，50～60℃干燥，制成细粉，加辅料，充分混匀，用70%乙醇制粒，60～80℃烘干，整粒，制成1000g，即得；其中辅料为：糊精：乳糖：蔗糖 =1:1:1。

实施例1：

本发明制成有效成分的重量份为：地锦草 40、黄连 20、白头翁 20；

制备方法同上。

实施例2：

本发明制成有效成分的重量份为：地锦草 60、黄连 30、白头翁 30；

制备方法同上。

实施例3：

本发明制成有效成分的重量份为：地锦草 80、黄连 40、白头翁 40；

制备方法同上。

提取配方中药有效成分加工制成口服液、颗粒剂或胶囊剂，含量规格：1g成品相当于生药1.2g。

用途：预防和治疗猪、鸡、牛、羊、马、犬、兔大肠杆菌病。

给药途径：内服（混饲、混饮、灌服）。

地锦草： 为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd. 或斑地锦Euphorbia maculata L. 的干燥全草，味辛性平，归肝与大肠经；具有清热解毒，凉血止血功效，主治动物下痢，肠炎，便血，尿血，咳血，跌扑损伤，痈肿恶疮和鱼烂鳃等病证，为君药。

白头翁：为毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis （Bge.） Regel 的干燥根，味苦性寒，归胃、大肠经，具有清热解毒，凉血止痢功效。主治动物热毒血痢，湿热肠炎，为臣药。辅助君药地锦草清热解毒，凉血止血作用；二药相须为用，能增强全方对动物大肠杆菌病的防治功效，为臣药。

黄连：为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall. 的干燥根茎，味苦性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经；具有清热燥湿，泻火解毒功效，主治动物湿热泻痢，心火亢盛，胃火炽盛，肝胆湿热，目赤肿痛，火毒疮痈以及鱼赤皮，白头白嘴，出血等病证；为佐使药。辅佐君臣药发挥作用，使方剂整体突显清热燥湿，泻火解毒功效；同时黄连归经较广，可引导药物多靶点发挥整体防治作用，为佐药。

以下通过实验对本发明进一步证明：（以下将本发明的方剂定名为地翁颗粒）

以打孔法证明本产品对动物致病性大肠杆菌具有显著地的抑菌作用：

将动物致病性大肠杆菌标准菌株（购自中国兽医药品检查所）接种于肉汤培养基37℃培养24 h，按比浊计数法计数，配制成菌浓度为10⁹个/ml的菌液。无菌条件下，用移液枪吸取供试菌液100μl滴入肉汤琼脂平板培养基表面，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面，用灭菌的打孔器（直径为6mm）在每个平板培养基上打上等距3孔，将药液滴满孔，每种药做3个样，作好标记，静置30 min后平稳转入37℃培养16h，取出测量抑菌直径，取平均值。

结果表明地翁颗粒对动物致病性大肠杆菌具有显著地的抑菌作用。

中药药理学研究证明本品能促进动物细胞免疫功能

采用³H法进行刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）诱导脾脏淋巴细胞增殖实验，ELISA方法检测ConA或金黄色葡萄球菌Cown株灭活菌体（SAC）刺激的脾淋巴细胞上清液IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的含量。结果显示，在安全浓度范围内，地翁颗粒能够明显促进T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖；能够促进ConA刺激的淋巴细胞分泌INF-γ；能够促进SAC刺激的淋巴细胞分泌IL-12、INF-γ和IL-6，并抑制IL-10的分泌。结果表明，地翁颗粒能够有效调节小鼠脾淋巴细胞的功能，促进细胞免疫。

安全药理学评价

急性毒性试验结果表明：内服地翁颗粒，剂量为5000 mg/kg生药的高剂量组，小鼠均健康成活。表明地翁颗粒的毒性较低，为实际无毒。以最大给药量和最高浓度的地翁颗粒灌胃小鼠，小鼠均健康成活，无一死亡病例，经剖检观察主要脏器发育正常，无明显病变。测定地翁颗粒的最大耐受量约为10000 mg/kg生药，证明本品经小鼠口服给药属于无毒性药品，可以作为一种安全可靠的药物使用。

长期毒性试验结果表明：给大鼠连续灌服地翁颗粒28天，外观体征、行为活动、大便性状、体重均未见任何不良影响。各剂量组的血液生理生化学指标和脏器指数在给药期间与空白对照组比较，均无显著性差异；停药14天后，给药组的各项指标与空白对照组相比，均无显著性差异（P > 0.05）。通过组织病理学剖检，大鼠主要脏器均发育正常，未见异常病变。结果表明，不同剂量的地翁颗粒对大鼠连续使用28天后，未见有明显的药物所致毒性反应及相关组织病理学改变。停药14天，亦未见药物引起的延迟性毒性反应。上述研究结果表明，地翁颗粒长期使用具有较高安全性。

靶动物安全性试验证明本品安全无毒副作用

将地翁颗粒以每1kg体重0.2g、0.6g、1.0g，相当于1倍、3倍和5倍于推荐剂量给猪灌服，连续用药7天，给药后详细观察受试猪的一般临床表现、采食量与体重变化、血液学及血清生化指标、剖检与病理组织学变化。结果显示1倍、3倍和5倍于临床推荐剂量的地翁颗粒未引起试验猪死亡和其它毒性反应。试验猪精神状态、饮食欲及粪便无异常，生长发育良好，红细胞数、血红蛋白含量、白细胞总数和分类计数以及各项血清生化指标均在正常范围。组织切片观察，各脏器组织结构形态未发现有任何异常病变。以上结果表明，地翁颗粒对猪具有较高的临床用药安全性。

实验临床试验证明其能有效治疗猪大肠杆菌病（仔猪白痢）

参照预备临床试验结果，将猪源致病性大肠杆菌O8株以2.5×10¹⁰ cfu/头的攻菌剂量给21日龄离乳仔猪灌服加腹腔注射，并模拟低温、潮湿和多重应激条件，使受试猪感染发病，待出现典型、稳定的临床症状并符合仔猪白痢疾病模型标准后用于临床试验。将中药制剂地翁颗粒以0.4g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg的剂量给患病仔猪灌服，每日1次，连服5d。选择白龙散为对照药物，同时设阴性和空白对照组，在预定时期内观测地翁颗粒对人工感染仔猪白痢的治疗效果、疗程和对患病猪生长发育情况的影响。结果证明：在多重应激存在的前提下，灌服加腹腔注射猪源致病性大肠杆菌O8株成功造成了仔猪白痢疾病模型，感染仔猪出现了较典型且稳定的临床症状，发病率100%。服用地翁颗粒高、中剂量（0.4 g/kg及0.2g/kg）组的仔猪临床症状得到较快改善并治愈，精神活泼，饮食欲增进迅速，排便逐渐恢复正常，体增重得到较快恢复；高、中剂量组疗效优于低剂量组和对照药物组，而且疗程较短，以其治疗的仔猪较快恢复了正常生长发育。由此得出结论：以每1kg 体重0.2g和0.4g剂量的地翁颗粒内服，可有效治疗人工感染致病性大肠杆菌O8株引发的仔猪白痢，其治愈率均为91.67%，有效率均为100%。用地翁颗粒（0.4 g/kg及0.2g/kg）内服治疗人工感染所致仔猪白痢，平均疗程为2.75和2.92天，病猪精神、饮食欲、粪便性状和体增重得到较快恢复。地翁颗粒高、中剂量（0.4 g/kg及0.2g/kg）间没有显著差异，建议以0.2g/kg体重为临床用药推荐剂量。高剂量0.4g/kg体重的地翁颗粒内服也没有发现明显的毒、副作用，表明该剂量地翁颗粒对猪临床用药也是安全的。

扩大临床试验证明其能有效治疗自然发生的猪大肠杆菌病（仔猪白痢）

以流行病学调查、临床检查、病理剖检和实验室检查确定诊断，随机分组后分别灌服地翁颗粒和白龙散进行治疗。通过观察排便次数、粪便形态、精神、食欲等临床症状和实验室指标变化，以及给药前和给药结束5天后体重等，综合判定地翁颗粒治疗仔猪白痢的有效性及安全性。结果表明：以0.2g/kg体重的剂量灌服地翁颗粒对仔猪白痢确有较好疗效。服用地翁颗粒的仔猪临床症状得到较快改善并治愈，精神渐显活泼，聚堆渐少，活动增多，口鼻润泽，饮食欲增进迅速，排便逐渐恢复正常，皮毛渐显亮泽，体增重得到较快恢复；与对照药物组相比，地翁颗粒治疗组症状恢复较快，疗程较短，仔猪较快恢复了正常生长发育。由此得出结论：地翁颗粒以0.2g/kg体重内服，连续给药5天，可有效治疗由猪致病性大肠杆菌引起的仔猪白痢，治愈率92.86%，有效率96.43%，平均疗程为3.02天，症状得道较快减轻或消失，治愈仔猪生长发育得到较快恢复。治疗期间未发现地翁颗粒明显的毒性或其他不良反应，证明以0.2g/kg体重内服是安全的。

中药地翁颗粒对小鼠脾淋巴细胞功能的影响。

受试药物的溶解 将地翁颗粒用适量1640培养液溶解，2500rpm离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤后，稀释为中药浓度400μg/ml、40μg/ml、4μg/ml 3个浓度。

脾细胞悬液的制备 无菌取出小鼠脾脏，用毛玻璃片将小鼠脾脏磨碎，制成脾细胞悬液。裂解红细胞后，用PBS洗涤三次，计数（活细胞在95％以上）。用含10%FBS的RPMI 1640培养液将脾细胞浓度调为4×10⁶细胞/ml。

淋巴细胞毒性实验（MTT法） 于96孔培养板中每孔加入100μl的细胞悬液，50μl的中药样品（阴性对照组加50μl的培养液），总体积150μl。每实验组设3个孔。置5%CO₂培养箱内37℃温育48h，培养终止前4h加5 mg/ml MTT（20μl/孔），终止培养后，离心，弃去上清，每孔加DMSO 150μl，摇床震荡10min，用酶标仪于570nm处测定每孔OD值。结果表明，地翁颗粒对小鼠淋巴细胞无毒（见表1）。

表1  地翁颗粒对淋巴细胞的毒性实验

 1.4 ConA、LPS诱导脾淋巴细胞增殖实验（ ³ H法）  于96孔板中加入100μl的细胞悬液，50μl的中药样品（ConA组、LPS组和阴性对照组分别加50μl含10％血清的培养液），50μl ConA（20 μg/ml）或LPS（20μg/ml）（阴性对照组加50μl培养液）总体积为200μl。每实验组设3个孔。细胞于含5%CO₂的37℃培养箱中培养，培养结束前12h，每孔加入25μl ³H-胸腺嘧啶核苷酸（1.9×10⁴Bq），继续培养至实验结束。然后将培养板冻存于－80℃冰箱，测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪（MicroBeta Trilux,PerkinElmer Life Sciences）上读取掺入细胞DNA的³H-胸腺嘧啶核苷量，以CPM值代表细胞增殖的情况。结果表明，地翁颗粒能够明显促进小鼠的T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖（见表2和表3）。

表2  地翁颗粒对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

 表3  地翁颗粒对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响

 注： ^##表示与对照组相比差异极显著（P＜0.01），^#表示与对照组相比差异显著（P＜0.05）；^**表示与对阴性照组相比差异极显著（P＜0.01）。

、SAC刺激脾淋巴细胞分泌细胞因子的实验   取小鼠脾细胞，调至4×10⁶/ml，加入24孔板中，100μl/孔；药物各样品每个浓度分别加于24孔板50μl/孔（SAC组、LPS组和阴性对照组分别加50μl含10％血清的培养液）；加刺激物ConA（20ug/ml）或SAC（1∶2500）50μl/孔（阴性对照组加50μl培养液）。37℃ CO₂培养箱中培养24h，离心，收取培养上清液。ELISA方法检测ConA组上清液IL-2和IFN-γ的含量，ELISA方法检测SAC组上清液IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的含量。低剂量地翁颗粒能够有效促进ConA诱导的脾淋巴细胞分泌IFN-γ；地翁颗粒能够有效促进SAC诱导的脾淋巴细胞分泌IL-6、IL-12和IFN-γ，并抑制IL-10的分泌（见表4和表5）。

IL-12和IFN-γ属于Th1细胞因子，IL-6和IL-10属于Th2细胞因子。Th1细胞参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症反应，Th2细胞可辅助B细胞分化为抗体分泌细胞，与体液免疫应答有关。地翁颗粒能够有效调节小鼠脾淋巴细胞的功能，明显促进细胞免疫。

表4  地翁颗粒对ConA刺激淋巴细胞产生细胞因子的影响

表5  地翁颗粒对SAC刺激淋巴细胞产生细胞因子的影响

对感染大肠杆菌的腹泻小鼠的疗效观察实验证实地翁颗粒的有效性

1.1 小鼠感染大肠杆菌的腹泻模型的建立健康的昆明小鼠40只，雌雄对半，随机分为2组，分别为攻毒组和生理盐水组。挑取致病性大肠杆菌K99与新鲜的LB培养基，37℃水平摇床过夜，调整细菌浓度为5×10⁸CUF/ml，攻毒组小鼠分别腹腔注射0.7ml菌液，生理盐水组小鼠分别腹腔注射0.7ml新鲜LB培养基。48h内观察小鼠状态。

攻毒组小鼠有半数死亡，死亡小鼠均出现腹泻现象。解剖死亡小鼠，有明显的肠道积液。生理盐水组小鼠均精神状态良好，没有死亡。

对感染大肠杆菌的腹泻小鼠的疗效观察健康的昆明小鼠90只，雌雄对半，随机分为三组，分别为地翁颗粒组、白龙散组和生理盐水组。地翁颗粒组小鼠分别注射细菌浓度为5×10⁸CUF/ml的菌液0.7ml，2h后按250mg/kg生药的剂量灌服生理盐水溶解的地翁颗粒，再隔24小时灌服一次等量地翁颗粒。白龙散组小鼠分别注射细菌浓度为5×10⁸CUF/ml的菌液0.7ml，2h后2h后按250mg/kg生药的剂量灌服生理盐水溶解的白龙散，再隔24小时灌服一次等量白龙散。生理盐水组小鼠分别注射细菌浓度为5×10⁸CUF/ml的菌液0.7ml，2h后按250ml/Kg的量灌服生理盐水，再隔24小时灌服一次等量生理盐水。60h后统计各组小鼠的死亡量和腹泻情况。治愈的判定标准：小鼠存活，精神状态良好，无腹泻情况，为治愈。

结果显示地翁颗粒对感染大肠杆菌的腹泻小鼠有良好的保护作用（见表6）。

表6  地翁颗粒对感染大肠杆菌的腹泻小鼠的疗效观察

组别	存活只数	存活率	治愈只数	治愈率	无效率
						地翁颗粒组	29	97%	29	97%	0%
白龙散组	29	97%	27	90%	0%
						生理盐水组	13	43%	0	0%	100%

 地翁颗粒的毒理实验

1.1地翁颗粒的急性毒性试验研究以生药5000 mg/kg体重的剂量进行预试验，没有得出地翁颗粒一次灌胃引起小鼠死亡的剂量，即测不出半数致死量（LD50），故采用最大耐受剂量法。20只健康昆明小鼠，雌雄对半，随机分为2组，分别为地翁颗粒组和生理盐水组。地翁颗粒组小鼠给予最大体积（0.8ml/20g体重）的地翁颗粒水溶液，生理盐水组小鼠按0.8ml/20g体重灌服生理盐水。一日灌胃2次，给药后连续观察7天，记录小鼠的死亡情况、精神状态、采食饮水、行为活动等临床表现。试验结束后，脱颈椎处死小鼠，肉眼观察主要脏器的病理变化。

预试验结果显示，剂量为5000 mg/kg生药的高剂量组，小鼠均健康成活。表明地翁颗粒的毒性较低，为实际无毒物质。以最大给药量（0.8ml/20g体重）的地翁颗粒灌胃小鼠，小鼠均健康成活，无一死亡病例，经剖检观察主要脏器发育正常，无明显病变。证明本品经小鼠口服给药属于无毒性药品，可以作为一种安全可靠的药物使用。

地翁颗粒的长期毒性试验研究 80只健康大鼠，雌雄各半，随机分为4组，分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组和生理盐水组，分别灌服灌服浓度为1000mg/kg、500mg/kg、250mg/kg的地翁颗粒和等体积的生理盐水。连续灌服28天，停药后继续观察14天。观察记录各组大鼠的体重变化、外观、行为、采食量、粪便、死亡情况等。每周称量体重一次，在试验期的第28天和第42天每组分别处死10只大鼠，做血液学指标、血液生化指标、主要脏器指数和病理学检查。

大鼠连续灌服地翁颗粒28天，外观体征、行为活动、大便性状、体重均未见任何不良影响。各剂量组的血液生理生化学指标和脏器指数在给药期间与生理盐水组比较，均无显著性差异；停药15天后，给药组的各项指标与生理盐水组相比，均无显著性差异（P > 0.05）。通过组织病理学剖检，大鼠主要脏器均发育正常，未见异常病变。结果表明，不同剂量的地翁颗粒对大鼠连续使用28天后，未见有明显的药物所致毒性反应及相关组织病理学改变。停药14天，亦未见药物引起的延迟性毒性反应。上述研究结果表明，地翁颗粒长期使用具有较高安全性。

Claims (2)

1.一种防治动物大肠杆菌病的中药，其特征在于：制成有效成分的重量份为：地锦草 40-80、黄连 20-40、白头翁 20-40。

2.权利要求书1所述的防治动物大肠杆菌病的中药的制备方法，其特征在于：将地锦草、白头翁和黄连3味，加10倍量50%乙醇浸润30min后，回流提取3次，每次90min ，滤过，收集醇提液，回收乙醇，继续浓缩至稠膏状，50～60℃干燥，制成细粉，加辅料，充分混匀，用70%乙醇制粒，60～80℃烘干，整粒，制成1000g，即得；其中辅料为：糊精：乳糖：蔗糖 =1:1:1。